JPH0246898B2 - Amiraazeoryoshitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、例えば血清、尿などに含まれる薬物
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。

血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多種多様の成分
が含まれており、そのなかには、分子量の近似し
た物質、生理活性の似た物質あるいは構造の近似
した物質なども含まれていることも多い。そこ
で、この分析法は特異性が高く、かつ微小量まで
定量しうることが要求される。さらに、日常検査
として利用されるために、簡便かつルーチン化し
うることが望ましい。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） このような条件を備えた分析法として免疫学的
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
新和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。

ラジオイムノアツセイは、感度はすぐれている
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ていた。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ｎｇ〜ｐｇのような極微量を測定する
ことは困難である。

本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分
子物質を基質とする酵素に測定対象たる抗原決定
基具有物質に対する抗体を結合させてこの結合物
の抗体に測定対象の抗原決定基具有物質を反応さ
せ、その後この結合物の酵素活性を測定すると測
定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵素
活性が顕著に低下することを見出し、この方法を
用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前
述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうるこ
とを見出してその内容を特許出願（特願昭58−
231241号（特開昭60−123767号））した。そして、
さらに研究を進め、酵素としてアミラーゼを用い
た場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で測定
できることを見出したが、ヒト血清等の高等動物
由来の検体には通常アミラーゼが含まれているた
め測定におけるブランク値が高くなつて測定誤差
が大きくなるという問題を生じた。そこで、この
ブランク値を低下させるために検体中のアミラー
ゼを予め失活させる方法及び検体を希釈する方法
を検討したが、前者の場合にはアミラーゼを失活
させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処理等
する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変性あ
るいは分解されてしまうことがあり、後者の場合
には感度が低下してしまうためこれらの方法はい
ずれも不適当であつた。さらに、これらの方法
は、操作が繁雑であるため、簡便な測定法の開発
を目指す本発明者らの意図にそぐわないものであ
つた。

そこで、本発明者らは、簡便さと高感度を損な
わずにこのブランク値を低下させる方法を開発す
べくさらに検討の結果、高等動物由来のアミラー
ゼを特異的に阻害するアミラーゼインヒビターを
使用することによつてこの目的を達成しうること
を見出し、このアミラーゼインヒビターを利用し
た２種の抗原決定基具有物質の測定方法を案出し
てその内容も既に特許出願（特願昭59−27709号
（特開昭60−171460号））、特願昭59−27710号（特
開昭60−171461号））した。

（問題点を解決するための手段） 本発明はこのアミラーゼインヒビターを利用す
る方法のひとつを改良するものであり、前回測定
対象の抗原決定基具有物質に抗体とアミラーゼの
結合物を作用させていたところを、今回この抗体
と異なる抗原決定基に作用する別異の抗体を新た
に加えることによつて測定感度が１桁ないし２桁
高まることを見出し、この知見に基いて本発明を
完全するに至つた。

すなわち、本発明は、高等動物由来のアミラー
ゼを含有している検体中の２以上の抗原決定基を
具有する物質を測定する方法において、該抗原決
定基具有物質に、この抗原決定基具有物質に一の
抗原決定基に対する抗体と検体に実質的に含まれ
ていないアミラーゼとの結合物及び他の抗原決定
基に対する抗体を接触せしめて反応させ、前記の
高等動物由来のアミラーゼには、このアミラーゼ
の活性を阻害する程度が前記の結合物に結合され
ているアミラーゼの活性を阻害する程度より大き
いアミラーゼインヒビターを接触せしめて反応さ
せ、さらに、前記の結合物に結合されているアミ
ラーゼが作用しうる水に不溶性の高分子物質に前
記の結合物を接触せしめて酵素反応させ、アミラ
ーゼ活性を測定することを特徴とする、抗原決定
基具有物質の測定方法に関するものである。

本発明の方法で測定される検体は高等動物由来
のアミラーゼを含有するものである。高等動物由
来のアミラーゼとは例えば膵臓アミラーゼ、唾液
アミラーゼなどであり、このようなアミラーゼを
含有する検体も通常は高等動物由来のものであ
る。検体の種類は限定されないが、例えば血清、
尿などである。血清、尿などの場合には、通常は
特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行な
うことができる。

抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）
は抗原決定基を二以上有しているものであり、例
えば、各種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫
グロブリン、アルブミン、フエリチン等の血漿蛋
白質、HB抗原等のウイルス、バクテリア類、α
−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の各種臓器
あるいは血中、尿中に存在する抗原などである。

結合物を構成している抗体はリガンドと反応す
るものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）₂、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれ
る。

抗体の製造方法としては、リガンド又はリガン
ドと蛋白との結合物を兎、山羊、馬、モルモツ
ト、ニワトリなどの温血動物に体重１Kgあたり
0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、フツトパツド、
大腿筋等にアジユバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。この抗体は各種の抗原決
定基を認識する抗体の混合物であるからこれを分
離して用いる。分離方法にはアフイニテイークロ
マトグラフイーを用いるのがよく、例えば、リガ
ンドを酵素あるいは化学試薬により分解してゲル
過、イオン交換クロマトグラフイーなどで分離
し、この各抗原フラクシヨンを不溶化したアフイ
ニテイーカラムを作製し、このカラムを用いて前
記の抗体混合物を分離することができる。また、
この抗体は市販品も存在する。本発明の方法にお
いては、抗体は単一抗体に分離しなくともよく、
少なくと２群に分割すれば足りる。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバンドとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。

結合物を構成しているアミラーゼはα−アミラ
ーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどで
あり、検体中に実質的に含まれていないものであ
つて、かつ後述するアミラーゼインヒビターの阻
害活性が検体中のアミラーゼに対する阻害活性よ
りも低いものである。このようなアミラーゼは検
体の種類及びアミラーゼインヒビターの種類など
に応じて異なるが、例えば麦芽由来のジアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ、糸状菌由来のタカジアス
ターゼ、バチルス層細菌由来のアミラーゼ、など
から適宜選択すればよい。

アミラーゼと抗体との結合方法は双方の官能基
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakane法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。

この結合物の抗体とともにリガンドに作用させ
る抗体は結合物の抗体が反応する抗原決定基と異
なる抗原決定基に対して反応するものである。こ
の抗体はIgG、IgMあるいはIgAであり、Ｆ
（ab′）₂、Fabなどのフラグメントであつてもよ
く、また、例えばDND化、アセチル化、ビオチ
ニル化、ニトロ化などの化学修飾が施されたもの
であつてもよい。この抗体は１種類に限られるも
のではなく、２種類以上あつてもよい。

この異なる抗原決定基を認識する抗体は前述の
細胞融合法によるモノクローナル抗体を製造する
方法により容易に取得することができる。また、
前述の温血動物を利用して抗体群を産生させ、こ
れを分離してもよい。その場合には単一抗体まで
分離しなくともよく、例えば２群に分割してその
一方を前述のアミラーゼと結合させ、もう一方を
この抗体に利用してもよい。また、この抗体は完
全に分離しなくてもよく、測定を阻害しない程度
に他方の抗体が混入していてもよい。

この抗体には水溶性高分子を結合させたほうが
感度を高める点で好ましい場合がある。水溶性高
分子は分子量が1000以上のものであり、例えばア
ルブミン、ヘモシアニン等の蛋白質、ポリサツカ
ライド、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオ
チド等である。結合方法は前述のアミラーゼに抗
体を結合させる方法のなかから適宜選択すればよ
い。

同様に、この抗体にさらにこの抗体に対する抗
体を反応させて高分子化してもよい。この第２抗
体は例えばヤギIgGに対するウサギIgGなどであ
り、第１抗体あるいは第１抗体とリガンドの結合
物を抗原として前述の抗体の取得方法に準じて取
得することがきる。この第２抗体を接触させる時
期は第１抗体をリガンドに接触させる前であつて
も後であつてもよいが、同時に加えることが操作
上簡便である。

検体に含まれるリガンドに、前記の一の抗原決
定基に対する抗体とアミラーゼとの結合物及び他
の抗原決定基に対する抗体を溶液中で接触させ
る。その際、溶液の温度は20〜45℃程度、そして
PHは通常４〜8.5程度が適当である。PHを一定に
保つために、必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩
衝液などの緩衝液を用いてもよい。その際、結合
物及び抗体の適当な量は、その種類、リガンドの
種類、あるいは接触時の条件などによつて異なる
ので予め試験をして定めるのがよい。リガンドへ
の結合物及び抗体の接触順序は問うところではな
く、いずれが先であつてもまた両方同時であつて
もよい。接触時間は通常は分に反応しうる程度が
よく、例えば37℃の場合には20〜60分間程度が適
当である。

一方、検体に含まれている高等動物由来のアミ
ラーゼには、このアミラーゼを阻害する程度が前
記の結合物に結合されているアミラーゼの活性を
阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビター
を接触させる。

このアミラーゼインヒビターは検体に含まれて
いるすべてのアミラーゼを失活させかつ結合物に
結合されているアミラーゼを全く阻害しないもの
が最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は検体中の主たるアミラーゼを失活させうるもの
であれば足りる場合が多い。この失活な要は測定
時においてブランク値を上昇させなければよく、
測定後にアミラーゼインヒビターが失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。この
アミラーゼインヒビターの作用が問題になるもう
一方の、検体に実質的に含まれていないアミラー
ゼは抗体に結合されている状態のものであり、遊
離状態ではアミラーゼインヒビターによつて失活
するものであつてもよい。このようなアミラーゼ
インヒビターの例としては、唾液アミラーゼ及び
膵臓アミラーゼの両方を阻害する小麦由来のアミ
ラーゼインヒビター（M.D.O′Donnell et al、
Biochim.Biophys.Acta、Vol422、pp159−169
（1976））、唾液アミラーゼを優先的に阻害する小
麦由来のアミラーゼインヒビターSain（特開昭58
−85899号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に
阻害するストレプトミセス属の放線菌が産生する
アミラーゼインヒビターAI−Ｂ（特開昭57−2684
号公報）などがある。そのほか、検体に含まれて
いる高等動物由来のアミラーゼを異種動物に投与
してその抗体を取得し、これをアミラーゼインヒ
ビターとして用いることもできる。抗体の取得方
法は前述のリガンドに対する抗体の取得方法と同
様にして取得することができる。これらは単独で
用いてもよく、併用してもよい。

検体中のアミラーゼにこのようなアミラーゼイ
ンヒビターを接触させる際の溶液の温度及びPHは
通常の前述のリガンドを結合物に接触させる条件
と同一でよい。また、アミラーゼインヒビターの
添加量もその種類、検体中のアミラーゼの種類と
量、結合物の構成しているアミラーゼの種類、あ
るいは接触させる条件などによつて異なるので予
め試験をして定めるのがよい。アミラーゼインヒ
ビターの添加時期は、検体中のアミラーゼによる
後述する水に不溶性の高分子物質の分解を実質的
に防止できればよく、通常はこの高分子物質の添
加前に添加すればよい、しかしながら一般にアミ
ラーゼインヒビターによるアミラーゼ阻害作用は
アミラーゼによる基質の分解速度よりもはるかに
はやいのでアミラーゼインヒビターを高分子物質
と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。

リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接
触させて反応させる。

高分子物質と接触させる結合物は反応物から分
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。

この高分子物質は結合物のアミラーゼが反応し
うるものであり、通常はアミラーゼの基質である
が、水に不溶性であるところに特徴がある。すな
わち、高分子物質が不溶性であるために結合物の
アミラーゼ部分との接触の大部分が固−液間にな
り、その結果、アミラーゼの高分子化による立体
障害が大きく現われる。本発明者らはこのことを
確認するためにペンタオースを用いて測定を行な
い、不溶性デンプンを用いた場合と比較したとこ
ろ前者の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとん
ど認められなかつたのに対し、後者の場合にはア
ミラーゼ活性が顕著に低下した。高分子物質の例
としては不活性デンプンなどがある。この高分子
物質はそれ自身が可溶性であつても、不溶性の担
体に固定化するとか重合させるなどして不溶化し
て用いることもできる。この方法の例としては、
アガロースゲルに包活させる方法がある。

高分子物質に結合物のアミラーゼを作用させる
条件はこのアミラーゼの理化学的性質などに応じ
て適当になるように定めればよい。

アミラーゼを作用させたのちはアミラーゼの活
性を求める。この活性は、この酵素反応による分
解物の増加、原料である高分子物質の減少、その
他、この酵素反応による系の変化を追跡すればよ
い。

（作用及び発明の効果） 本発明の方法は、ヒト血清などの高等動物由来
のアミラーゼを含む検体中のリガンドを特異性高
くかつ極めて高感度で測定できる。この本発明の
方法は先願（特願昭59−27710号）の方法に比し、
感度をさらに１桁ないし２桁向上させることがで
きる。また、操作が簡単であり、安価かつ容易に
リガンドを定量することが可能である。本発明の
方法はリガンドの種類を問わず測定できるが比較
的高分子の測定に威力を発揮する。本発明の方法
に用いる試薬にはリガンドを直接使用せず、リガ
ンドは抗体の製造に用いられるだけであるから微
量で足りるという利点も有する。従つて、本発明
の方法は測定対象と同じリガンドが入手しにくい
場合とか、高価な場合に特に有効である。

（実施例） 実施例 １ CHM化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５mgを10ｍ
MO−フエナトロリンを含有するPH6.3の0.1M
グリセロリン酸緩衝液１mlに溶かし、４−（マ
レイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン
酸）サクシンイミドエステル（CHMS）２
mg／mlのジメチルホルムアミド（DMF）溶液
100μを加えて室温で１時間放置して反応さ
せた。この反応液をセフアデツクスＧ−25のカ
ラムに入れ、PH6.3の0.1Mリン酸緩衝液を流し
てゲル過を行ない、素通り分画を分取した。

抗ヒトフエリチンマウスモノクローナルIgG
Ｆ（ab′）₂の調製 抗ヒトフエリチンマウスモノクローナル
IgG10mgを0.1M酢酸緩衝３ｍＭ EDTA溶液
（PH5.5）２mlにパパイン300μｇを加え、37℃で
18時間撹拌した。0.1NNaOHを加えてPHを6.0
に調節しこの反応液を予め0.1Mリン酸緩衝１
ｍＭ EDTA溶液（PH6.3）で緩衝化したセフ
アクリルＳ−300ゲルカラムに入れ、上記のリ
ン酸緩衝液で溶出した。分子量約10万付近に溶
出されたピーク部分を集めて１mlに濃縮し、目
的の抗ヒトフエリチンマウスモノクローナル
IgGF（ab′）₂を得た。

α−アミラーゼ−抗ヒトフエリチンマウスモ
ノクローナルIgG Fab′結合物の調製 で調製した抗ヒトフエリチンマウスモノク
ローナルIgG Ｆ（ab′）₂を６mgを含む0.1Mリン
酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液（PH6.0）１mlに10
mg／mlの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水
溶液100μを加え、37℃で90分間撹拌した。
この反応液を予め0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で緩衝化したセフアデツクスＧ−25カラムでゲ
ル過して未反応の２−メルカプトメチルアミ
ンを除去し、HS−Fab′を得た。これにで調
製したCHM化α−アミラーゼ１mgを加え、37
℃で90分間反応させた。次にこの反応液液を
0.1M酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（PH
6.0）で緩衝化したセフアクリルＳ−300カラム
でゲル過して分子量20万以上の分画を集め、
これを濃縮して目的の結合物を得た。

ヒト血清のフエリチンの測定 ヒトフエリチンを含むヒト血清100μをと
り、ヤギ血清で希釈して3ⁿ希釈剤を調製した。
各々100μを小試験管にとり、これにで調
製された結合物溶液にストレプトミセス・ビリ
ドスポラスNo.297−A2FERM−P5405の産生す
るアミラーゼインヒビター100μｇ／ml結合物
の抗体と認識部位の異なる２種の抗ヒトフエリ
チンモノクローナル抗体10μｇ／ml及びポリエ
チレングリコール6000 ７％を含有せしめた溶
液100μを加えて37℃で30分間加温した。続
いて、ブルースターチ1.0mlを加えて37℃で30
分間加温後0.5N NaOH1mlを加えて反応を停
止させた。撹拌後、3500rpmで２分間遠心し、
上清の620nｍにおける吸光度を測定した。得
られた結果を第１図に示す。図中、白丸は結合
物の抗体と認識部位の異なる２種の抗ヒトフエ
リチンモノクローナル抗体を加えた場合を表わ
し、黒丸は加えなかつた場合を表わしている。
図に示す如く、結合物の抗体と認識部位の異な
る２種の抗ヒトフエリチンモノクローナル抗体
を加えた場合は加えなかつた場合に比べて測定
感度が約10倍になつている。

実施例 ２ CHM化アミラーゼの調製 バチルス−ズブチリスアミラーゼ１mgを実施
例１の場合と同様に処理してCHM化アミラ
ーゼ１mgを得た。

抗ヒトIgG Fc特異ヤギIgG Ｆ（ab′）₂の調製 抗ヒトIgGヤギＦ（ab′）₂（カツペル社）を20ｍ
Ｍリン酸緩衝0.15M NaCl溶液（PH7.0）で緩衝
化したヒトIgG結合セフアロース−4B−カラム
に通し、上記の緩衝液で洗浄後、20ｍＭリン酸
緩衝3M NaSCN溶液（PH7.0）で溶出した。次
に、この溶出液を0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ
EDTA溶液（PH6.0）に透析した後濃縮し、目
的の抗ヒトIgG Fc特異ヤギIgG Ｆ（ab′）₂を得
た。

α−アミラーゼ−抗ヒトIgG Fc特異ヤギ
IgG Fab′結合物の調製 で調製した抗ヒトIgG Fc特異ヤギIgG Ｆ
（ab′）₂6mgを含む0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ
EDTA溶液（PH6.0）１mlに10mg／mlの２−メ
ルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液100μを
加え、37℃で90分間撹拌した。この反応液を予
め0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で緩衝化したセ
フアデツクスＧ−25カラムでゲル過して未反
応の２−メルカプトエチルアミンを除去し、
HS−Fab′を得た。これにで調製したCHM
化α−アミラーゼ１mgを加え37℃で90分間反応
させた。次に、この反応液を0.1M酢酸緩衝５
ｍＭ塩化カルシウム溶液（PH6.0）で緩衝化し
たセフアクリルＳ−300カラムでゲル過して
分子量20万以上の分画を集め、これを濃縮して
目的の結合物を得た。

ヒトIgGの測定 濃度０〜1000nｇ／mlのヒトIgG溶液100μ
にで調製した結合物溶液にポリエチレングリ
コール6000 ７％を含有せしめた溶液100μを
加え、37℃で30分間反応させた。次に、抗ヒト
IgG Fab特異ヤギIgG（10μｇ含有）溶液50μ
を加え37℃で30分間反応させた。この反応液に
ブルースターチ懸濁液1.0mlを加えて37℃で30
分間さらに反応させ、0.5N NaOH1mlを加え
て反応を停止させた。これを撹拌後、3500rpm
で２分間遠心し、得られた上清の620nｍにお
ける吸光度を測定した。

得られた吸光度とヒトIgGの濃度との関係を
示す検量線を第２図に示す。図中、黒丸は抗ヒ
トIgG Fab特異ヤギIgGを加えない場合を表わ
し、白丸は加えた場合を表わしている。図に示
すごとく、抗ヒトIgG Fab特異ヤギIgGを加え
た場合、加えない場合に比べて測定感度は約10
倍ほど良くなつている。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトフエリチンについて、そして第２
図はヒトIgGについて、いずれも本発明の方法
（白丸）及び先願の方法（黒丸）で測定して得ら
れた検量線を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 高等動物由来のアミラーゼを含有している検
   体中の２以上の抗原決定基を具有する物質を測定
   する方法において、 該抗原決定基具有物質に、この抗原決定基具有
   物質の一の抗原決定基に対する抗体と検体に実質
   的に含まれていないアミラーゼとの結合物及び他
   の抗原決定基に対する抗体を接触せしめて反応さ
   せ、 前記の高等動物由来のアミラーゼには、このア
   ミラーゼの活性を阻害する程度が前記の結合物に
   結合されているアミラーゼの活性を阻害する程度
   より大きいアミラーゼインヒビターを接触せしめ
   て反応させ、 さらに、前記の結合物に結合されているアミラ
   ーゼが作用しうる水に不溶性の高分子物質に前記
   の結合物を接触せしめて酵素反応させ、アミラー
   ゼ活性を測定することを特徴とする 抗原決定基具有物質の測定方法。 ２ 他の抗原決定基に対する抗体が水溶性高分子
   が結合されたものである特許請求の範囲第１項記
   載の測定方法。 ３ 他の抗原決定基に対する抗体にこの抗体に対
   する抗体をさらに接触せしめることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項又は第２項記載の測定方
   法。