JPH0377462B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えば血液に含まれる薬物あるいは
各種疾患に由来する微量成分などを測定する方法
に関するものである。

血清、尿等の体液成分の微量分析は、病気の診
断や治療経過の判定などの有力な手段となつてい
る。そこで、体液成分を分析する種々の方法が開
発され、それらのなかで免疫学的な分析法が感度
及び特異性にすぐれているところから日常の検査
に多用されている。

抗原と抗体との間の非常に高い親和力を利用し
たこの免疫学的分析法には、標識物質として放射
性同位元素を用いたラジオイムノアツセイ、酵素
を用いた酵素免疫法等がある。しかしながら、こ
のうちラジオイムノアツセイは放射性同位元素を
用いるところから、限られた施設での使用、廃液
の処理、短かい有効期間など様々な問題を有して
いる。そこで酵素免疫法が注目を集めているが、
操作性及び感度などの面でラジオイムノアツセイ
に劣つていた。

本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、測定目的物である
抗原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対する
抗体との共有結合物に、測定目的物である抗原決
定基具有物質と、前記の酵素に対する抗体と反応
する酵素とを接触させると、抗原決定基具有物質
の量に応じて酵素活性が変化することを見出し
た。そして、この反応を利用して、抗原決定基具
有物質を高感度で、かつ前述の分離操作を行なわ
ないで、簡便に測定しうる全く新規な方法を完成
した。その後、本発明者らはさらに研究を進め、
新たに前記の抗原決定基具有物質に対する抗体を
抗原とする第２抗体又は前記の酵素に対する抗体
を抗原とする第２抗体を反応系に加えれば、抗原
決定基具有物質の量に応じて酵素活性がより鋭敏
に変化するようになることを見出し、これに基い
て本発明の完成するに至つた。

すなわち本発明は、検体に含まれる抗原決定基
具有物質と、酵素又は酵素と高分子化合物との共
有結合物と、該抗原決定基具有物質の抗体に対す
る第２抗体又は該酵素の抗体に対する第２抗体と
を、溶液中で該抗原決定基具有物質の抗体と該酵
素の抗体との共有結合物又は該抗原決定基具有物
質の抗体と該酵素の抗体と高分子化合物との共有
結合物に接触せしめ、その後前記酵素の活性を測
定することを特徴とする抗原決定基具有物質の測
定方法に関するものである。

本発明方法における測定対象は検体に含まれる
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合には、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。

抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリ
ア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の
各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。リガンドは、後述する抗体共有結合物に
結合したときにその後測定する酵素活性に与える
影響の大きなものがよく、その点で分子量が10万
ダルトン以上のものが本発明の方法に特に好適で
ある。

酵素はその抗体が得られるものであればよい。
大部分の酵素は動物体に投与することによつてそ
の体内に抗体を形成するから本発明の方法に使用
できる。動物由来の酵素であつても、異種動物に
投与することによつて通常抗体を得ることが出来
るから例外ではない。酵素は、活性の測定方法が
容易なもののほうが好都合である。酵素の例とし
ては、グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレ
ートデヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスフアター
ゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
クレアチンキナーゼ、リボヌクレアーゼ、ペニシ
リダーゼなどを挙げることができる。

酵素を後述する抗体の共有結合物と反応させて
も活性があまり変らないときは、酵素を予め高分
子化合物と結合させて高分子化してから用いるの
がよい。高分子化合物は、分子量が10万ダルトン
以上でかつ水溶性のものが適当である。高分子化
合物の例としては、可溶性デキストラン、カルボ
キシメチル化デキストラン、アミノ化デキストラ
ン、アミロース等の多糖類、及びその誘導体ゼラ
チン、ヘモシアニン、フエリチン等の蛋白質、ポ
リエチレングリコールなどを挙げることができ
る。これらは、酵素と結合させた状態で所定の条
件を具備していればよく、例えば牛血清アルブミ
ンのような比較的低分子のものであつても、それ
を自家重合させるなどして高分子化したものであ
つてもよい。

高分子化は、酵素以外に後述する抗体共有結合
物について行なつてもよく、また、酵素及び抗体
共有結合物の両方とも高分子化してもよい。

酵素と高分子化合物との結合方法は双方の官能
基を考慮して下記の共有結合法のなかから選択し
て適用することができる。官能基は、アミノ基、
カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾ
ール基、フエニル基などを利用することができ、
例えばアミノ基相互間を結合させる場合には、ジ
イソシアネート法、グルタルアルデヒド法、ジフ
ルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知ら
れている。また、アミノ基とカルボキシル基との
間を結合させる方法としては、カルボキシル基を
サクシンイミドエステル化する方法のほかカルボ
ジイミド法、ウツドワード試薬法等が知られてお
り、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法
（Nakane法）もある。チオール基を利用する場
合には、例えばもう一方の側のカルボキシル基を
サクシンイミドエステル化してこれにシステイン
を反応させてチオール基を導入し、チオール基反
応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することが
できる。フエニル基を利用する方法としてはジア
ゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこ
れらの例示に限られるものではなく、このほか例
えば「Method in Immunochemistry」あるいは
「酵素抗体測定法」等の成書に記載されている方
法のなかから適宜選択して利用することができ
る。結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意
の比率をとることができることはいうまでもな
い。反応後は、ゲル過法、イオン交換クロマト
グラフイー、アフイニテイークロマトグラフイー
などを適宜組み合わせて精製を行ない、必要によ
り凍結乾燥法等で乾燥する。

リガンドに対する抗体（以下、抗リガンド抗体
という。）、酵素に対する抗体（以下、抗酵素抗体
という。）及びこれらの第２抗体はいずれも抗体
を取得する公知の方法に準じて取得することがで
きる。例えば兎、山羊、馬、モルモツト、ニワト
リなどの温血動物に、リガンドあるいは酵素を注
射する場合には体重１Kg当り0.3〜２mg程度、そ
して抗リガンド抗体あるいは抗酵素抗体を注射す
る場合には体重１Kg当り0.3g〜２mg程度を１〜数
回背中皮下、フツトパツド、大腿筋等にアジユバ
ントとともに注射して当該動物の体内に抗体を形
成させればよい。この抗体はIgG、IgM、IgA等
のみでなく、ペプシン等の蛋白分解酵素でＦ
（ab′）₂、Fab′、Fabなどに分解して用いてもよ
い。抗酵素抗体及びその第２抗体は、酵素と反応
することによつて、酵素活性を完全に阻害するも
の、一部阻害するもの、あるいは全く阻害しない
ものがあるがそのいずれであつても本発明の方法
に使用することができる。これらの抗体は、前記
のフラグメントであると否とを問わず、血清から
IgGを取得する公知の方法、例えば硫安沈澱法、
イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、アフ
イニテイークロマトグラフイーなどを適宜精製し
てから用いる。

一方、これらは抗体はモノクローナル抗体とし
て取得することもできる。その場合には、マウス
に前記のリガンドあるいは酵素をアジユバントと
ともに数回腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出し
てポリエチレングリコール等を用いてマウスミエ
ローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生するものをクローニン
グによつてモノクローン細胞として増殖させ、得
られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖さ
せることによつてモノクローナル抗体を大量に製
造することができる。

抗リガンド抗体と抗酵素抗体との共有結合方法
は前述の酵素と高分子化合物の共有結合方法のう
ち、蛋白質相互を結合させる方法をすべて利用で
きる。例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素
酸酸化法、マレイミド法、ジイソシアネート法、
ベンゾキノン法、カルボジイミド法などを利用で
きる。このほか、NH₂基とSH基を結合する
SPDP法、IgGの糖鎖と結合性をもつプロテイン
Ａ等のレクチンを使つた方法、還元剤存在下にお
ける２種のＦ（ab′）₂のSH基の組替方法なども利
用できる。共有結合物は抗リガンド抗体と抗酵素
抗体各１単位のもののみに限らず、各々が数単位
づつ共有結合したもの、あるいはさらに共有結合
して高分子化したものであつてもよい。その場
合、比率も目的に応じ任意のものであつてよいこ
とはいうまでもない。

この抗体共有結合物は、前述の酵素と同様、高
分子化合物に結合させて高分子化したほうがよい
場合もある。その場合は、高分子化合物には前述
のもののなかから適宜用いればよく、結合方法も
前述と同様でよい。この高分子化は抗体間の共有
結合を行なう前に一方あるいは両方の抗体に対し
て行なつてもよく、また、抗体間の共有結合も行
なつた後に行なつてもよい。

抗体共有結合物及びその高分子化物は、ゲル
過、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂などを
用いたイオン交換クロマトグラフイー、アフイニ
テイークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせ
て精製を行ない、必要により凍結乾燥する。

検体に含まれるリガンドと、酵素又はその高分
子化物と、抗リガンド抗体の第２抗体又は抗酵素
抗体の第２抗体とを、溶液中で前記の抗体共有結
合物又はその高分子化物と接触させる。その際、
溶液の温度は20〜45℃程度、そしてPHは通常４〜
8.5程度が適当である。PHを一定に保つために、
必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩
衝液を用いてもよい。酵素又はその高分子化物、
抗リガンド抗体の第２抗体又は抗酵素抗体の第２
抗体及び抗体共有結合物又はその高分子化物の適
当な量は、それらの種類、リガンドの種類、ある
いは接触時の条件などによつて異なるので予め試
験をして定めるのがよい。第２抗体は、抗リガン
ド抗体の第２抗体又は抗酵素抗体の第２抗体の一
方のみを添加してもよく、また両方添加してもよ
い。第２抗体の添加量は、酸素活性を適当に変化
させるのに必要な量であり、これも酵素、抗体共
有結合物、リガンドの種類、あるいは接触時の条
件などによつて異なるので予め試験をして定める
のがよい。抗体共有結合物とリガンド、酵素及び
第２抗体との接触時間はいずれも、通常は充分に
反応しうる程度がよく、例えば37℃の場合には20
〜60分間程度が適当である。共有結合物に対する
リガンド、酵素及び第２抗体の接触順序は問うと
ころではなく、いずれが先であつてもよく、ある
いは同時であつてもよい。

本発明の方法の場合には、各構成要素がある程
度高分子化されていることが適度の酵素活性変化
を確保する点で好ましく、そのために第２抗体を
使用している。この第２抗体を添加することによ
つて抗体−酵素のマトリツクスが形成され、リガ
ンドの量の増加にともなつて２次的立体障害が強
まつてそのためにマトリツクスにまき込まれた酵
素活性が低く現われるものと思われる。この効果
は酵素あるいは共有結合物の高分子化と組み合わ
せると一層大きくあらわれる。

これらの接触を行なわせたのちには酵素活性を
測定して検体中のリガンドの量を算出する。酵素
活性の測定方法は公知の方法に従つて行なえばよ
い。例えば、酵素にグルコース−６−リン酸脱水
素酵素を用いた場合には、上記の接触を行なわせ
た反応系にグルコース−６−リン酸及びNADP⁺
を含む基質溶液を加えて反応させ、生成する
NADPHを波長340nmの吸光度の増加から求めれ
ばよい。また、ヘキソキナーゼを用いた場合に
は、反応系にグルコース、ATP、NADP⁺及びグ
ルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素を含む基質溶液
を加えて反応させ、やはりNADPHの生成量を
測定することによつて求めればよい。

本発明の方法は、リガンドを特異性高くかつ極
めて高感度で測定できる。そして、操作が簡単で
あり、安価かつ容易にリガンドを定量することが
可能である。本発明の方法は、先発明の方法の感
度を高めることによつて実用的価値をさらに高め
たものである。

以下、実施例を示す。

実施例 １ 抗ヒトIgGモルモツトIgG（α−hIgG）と抗
ヘキソキナーゼモルモツトIgG（α−HKIgG）
との結合物の調製 α−hIgG5mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH6.3）１
mlに溶解し、２mg／mlの４−（マレイミドメチル
シクロヘキサン−１−カルボン酸）サクシンイミ
ドエステル（CHMS）のジオキサン溶液100μ
を加えて室温で１時間反応させた。反応液をセフ
アデツクスＧ−25のカラムに入れ、1mM EDTA
を含PH6.5の0.1Mリン酸緩衝液でゲル過を行な
つて未反応のCHMSを除き、得られた４−マレ
イミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸と
α−hIgGとの共有結合物（CHM化α−hIgG）
の溶液を１mlに濃縮した。

α−HKIgG5mgを5mM EDTAを含むPH7.5の
0.1Mリン酸緩衝液に溶かし、これにmg／mlのＳ
−アセチルメルカプトコハク酸無水物のジメチル
スルホキシド溶液100μを加えて37℃で１時間
加温した。続いて、PH7.5の1Mヒドロキシルアミ
ン溶液110μを加えて37℃で30分間放置して反
応させた。この反応液をセフアデツクスＧ−25を
用いてゲル過し、未反応のＳ−アセチルメルカ
プトコハク酸を除去した。このSH化−α−
HKIgGを１mlまで濃縮し、これに前記のCHM化
α−hIgGの濃縮液１mlを加え、４℃で１晩反応
させた。この反応液をセフアクリルＳ−300でゲ
ル過してα−HKIgGとα−hIgGの共有結合物
（４mg含有）分画を得た。

ヒトIgGの定量 各種濃度のヒトIgG溶液各50μに前記のα−
HKIgG−α−hIgG共有結合物50μを加え、さ
らにα−モルモツトIgG−IgG血清の１／100希釈
液100μを加えてから25℃で１時間加温した。
これに、ヘキソキナーゼ25μ（0.4μg含有）を加
え、25℃で30分間反応させてから、反応液に
0.1Mグルコース、0.5mM ATP、0.2mM
NADP、3U／mlグルコース６リン酸脱水素酵素
及び13.3mM MgCl₂を含むPH8.0の50mMトリス
緩衝溶液３mlを基質溶液として加え、25℃で波長
340nmにおける吸光度の増加を求めたところ、下
表に示す結果が得られた。ヒトIgG （ΔA_340on／min）×1000 0.6μg／ml 19.5 2.0 17.0 5.0 14.1 20.0 11.3 100 8.5 ヒト血清５検体について、各1000倍希釈血清各
50μを用い、上記と同様に測定した。そして、
上表の結果を検量線に用いてIgGの濃度を求め
た。一方、これに並行して従来法であるSRID法
で同じ血清のIgG濃度を測定した。

得られた結果を下表に示す。

IgG濃度 血清 本発明法 SRID法 Ａ 8.4mg／ml 9.1mg／ml Ｂ 16.1 17.2 Ｃ 11.5 10.3 Ｄ 12.1 11.8 Ｅ 7.5 8.1 実施例 ２ 抗グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲ
ナーゼマウスIgG（α−G6PDH IgG）の調製 抗原として酵母由来のG6PDH（オリエンタル
酵母工業(株)製）を用いた。このG6PDHの１mg／
mlの溶液をフロイントの完全アジユバントと等容
混合してエマルジヨンとし、その0.1mlを８週令
のBALB／Ｃマウスの腹腔に１週間おきに３回
注射した。これからさらに１週間後に尾静脈に
50μg／0.1mlのG6PDH溶液を注射し、３日後に脾
臓を摘出した。

この脾臓を摩砕して脾臓細胞を分離し、ポリエ
チレングリコール1500を用いてマウスミエローマ
P3U1と細胞融合させた。

得られた融合細胞を96ウエルのプレートに分注
し、HAT培地で培養した。各ウエルの細胞を
G6PDHを固相に固定化したプレートを用いた
ELISA法で調べて、G6PDHに反応性を有るマウ
スIgGを含むと思われる５ウエルを見出した。こ
の５ウエルの細胞を限界希釈法で希釈してクロー
ニングし、ELISA法を応用した阻害測定法で調
べて、G6PDHの異なる抗原決定基を認識してい
ると思われる２つの細胞株を得た。

この細胞株をそれぞれ10％FCS−RPMI培地で
増殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを注射
したBALB／Ｃマウスの腹腔へ10⁷個づつ注入し
て、２週間後に腹水約10mlを採取した。

この腹水を45％飽和の硫安で塩析し、生成した
沈澱物を分離した。この沈澱物を少量のリン酸緩
衝液PH7.0で溶解し、同緩衝液で平衡化したセフ
アクリルＳ−300カラムでゲル過してIgG分画
を分取した。

こうして得られた異なる抗原決定基を認識して
いる２細胞株から得た各IgGを等量づつ混合し
て、α−G6PDH IgGとした。

抗ヒトα−フエトプロテインマウスIgG（α
−AFP IgG）の調製。

上記と同様の操作により、ヒトα−フエトプロ
テイン（AFP）に対するマウスのモノクローナ
ル抗体を２種類得た。各抗体をIgGまで精製し、
２種類を混ぜ合わせてα−AFP IgGとして使用
した。

α−AFPIgGとα−G6PDHIgGとの共有結
合物の調製 デキストランT500（フアルマシア社製、平均分
子量50万）50mgを１mlの水に溶解し、この溶液に
0.1M過ヨウ素酸ナトリウム水溶液0.2mlを加えて
４℃で一夜反応させた。これに0.15mlのエチレン
グリコールを加えて５分間反応させた後1mM酢
酸ナトリウム緩衝液（PH5.0）で平衡化したセフ
アデツクスＧ−25カラムでゲル過し、素通り分
画を集めた。この分画にα−AFP IgGとα−
G6PDH IgGとの混合物20mgを10mM炭酸緩衝液
（PH9.5）に溶解した溶液を加え、PHを9.5に調整
してから室温で２時間反応させた。0.4％水素化
ホウ素ナトリウム水溶液0.5mlを加えてさらに４
℃で２時間反応させ、この反応物を20mMリン酸
緩衝液PH7.0に対して透析した。透析物をセフア
クリルＳ−300カラムでゲル過して高分子部分
を分画し、AFP IgGとα−G6PDH IgGとの共
有結合物分画を得た。

α−フエトプロテイン（AFP）の定量 各種濃度のヒトAFP溶液各50μに前記のα−
AFP IgG−α−G6PDHIgG共有結合物分画50μ
を加え、さらにG6PDHを含む家兎抗マウス
IgGIgG分画100μを加えてから25℃で30分間加
温して反応させた。

反応液にG6PDHの基質として、0.5mMグルコ
ース−６−リン酸、0.5mM NADP及び20mM
MgCl₂を含む0.1Mグリシルグリシン緩衝液（PH
8.5）を加え、25℃で波長340nmにおける吸光度
の増加を求めたところ、下表に示す結果が得られ
た。AFP量 （ΔAOD_340on／min）×1000 0ng 36.5 50 28.1 100 22.3 200 19.8 400 16.9 800 15.1 ヒト血清５検体について、各50μを用いて上
記と同様に測定を行ない、上表の結果を検量線に
用いてAFPの濃度を求めた。尚、これと並行し
て従来法であるRIA法で同じ血清のAFPの濃度
を測定した。

得られた結果を下表に示す。

血清 本発明法 RIA法 Ａ 200ng 187ng Ｂ 60 53 Ｃ 320 334 Ｄ 530 551 Ｅ 105 112

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 検体に含まれる抗原決定基具有物質と、酵素
   又は酵素と高分子化合物との結合物と、該抗原決
   定基具有物質の抗体に対する第２抗体又は該酵素
   の抗体に対する第２抗体とを、溶液中で該抗原決
   定基具有物質の抗体と該酵素の抗体との共有結合
   物又は該抗原決定基具有物質の抗体と該酵素の抗
   体と高分子化合物との共有結合物に接触せしめ、
   その後前記酵素の活性を測定することを特徴とす
   る抗原決定基具有物質の測定方法。