JPS6180049A - 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 血清、尿などの液体に含まれる薬物あるいは各種疾患に
由来する微量成分の分析は病気の診断あるいは治療経過
の判定などに非常に有意義であり、日常の臨床検査に活
用されている。本発明はこの微量成分を測定する方法に
関するものである。

（従来の技術） 血液等の体液には多種多様の成分が含まれており、その
なかには、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質
あるいは構造の近似した物質なども含まれていることも
多い。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少最
まで定量しうろことが要求される。さらに、日常検査と
して利用されるために、簡便かつルーチン化しうろこと
が望ましい。

血液のこれらの微量成分を検出する方法が種々開発され
ているが、感度、特異性、大量検体の短時間処理などの
点にすぐれる酵素免疫測定法が賞月されている。しかし
ながら、従来の酵素免疫測定法の場合には、未だ感度が
充分とはいえず、また洗浄操作が繁雑であったり、チュ
ーブの移しかえが必要であったりして正確な濃度を求め
ることが容易でなかった。

そこで、本発明者らはさらに感度を高めかつ繁雑な操作
の少ない分析方法を開発ナーるべく検討を行ない、測定
対象の抗原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対する
抗体との結合物を利用する方法を開発した。この方法は
、この結合物に対して測定対象の抗原決定基具有物質と
酵素を競争反応させその後この酵素の活性を測定するこ
とによって抗原決定基具有物質を定量する方法（特開昭
５９−　　　　　　号公報）である。その際、この抗原
決定基具有物質に対する抗体と反応する抗体あるいは酵
素に対する抗体と反応する抗体をさらに競争反応させる
方法（特願昭５８−５１４９４号）、あるいは抗原決定
基具有物質と高分子化合物との結合物又は抗原決定基具
有物質の重合物を競争反応させる方法（特願昭５８−５
１４９５号）も併せて開発した。そして、その後さらて
検討を進め、この技術に近縁の種々の抗原決定基具有物
質測定法を次々と開発して特許出願を行なったが、その
ひとつに、測定対象の抗原決定基具有物質にその抗体と
水に不溶性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物を
作用させてその後結合物の酵素活性を測定する方法（特
願昭５８−２３１２４１号）があった。

（発明が解決しようとする問題点） この方法は、他の方法と同様、抗原決定基具有物質を特
異性高くかつ極めて高感度で測定できるばかりでなく、
他の方法に比べ、操作がさらに簡略になり、また、抗原
決定基具有物質を抗体の製造に使用するだけであるとこ
ろからほとんど消費しないで済むという利点があったが
低分子の抗原決定基具有物質に対する測定感度が低いと
いう問題があった。

（問題点を解決するための手段） 本発明はこのような問題点を解決した抗原決定基具有物
質の測定方法を提供するものであり、前記の方法に加え
て測定対象の抗原決定基具有物質と少なくとも一の抗原
決定基を共通にする抗原決定基具有物質と高分子化合物
との結合物を新に導入して競争反応させるようにしたこ
とを特徴としている。

すなわち本発明は、測定対象の抗原決定基具有物質（１
）と、この抗原決定基具有物質α）と少なくとも一の抗
原決定基を共通にする抗原決定基具有物質（２）と高分
子化合物との結合物を、この共通の抗原決定基と反応す
る抗体と水に不溶性の高分子物質に作用しうる酵素との
結合物に水溶液中で接触せしめて反応させ、その後この
抗体と酵素との結合物に前記の高分子物質を接触せしめ
て酵素反応させ、酵素活性を測定することを特徴とする
抗原決定基具有物質の測定方法に関するものである。

本発明方法における測定対象は検体に含まれる抗原決定
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿などである。血清、尿などの場合には、通常
は特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうこ
とができる。

抗原決定基具有物質（１）（以下リガンド１という。）
は抗原決定基を−又は二以上有しているものであす、例
としては、ノボキシン、テオフィリン、フェノバルビタ
ール、フェニトイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物
、グロスタグランノン、テストステロン、プログ９ステ
ロン、サイロキシン等のホルモンなどを挙げることがで
きる。本発明の方法は特に低分子のもの、例えば分子量
２万以下のものの測定に威力を発揮する。

抗原決定基具有物質■）（以下、リガンド２という。）
はりガント１と少なくとも一の抗原決定基が共通してい
なければならない。リガンド２の抗原決定基は１以上が
リガンド１と共通であればよく、全てが共通であっても
よい。従って、リガンド２はリガンド１と同一であって
もよい。

リガンド２と結合している高分子化合物は、分子量が１
０万ダルトン以上でかつ水溶性のものが適当である。高
分子化合物の例としては、可溶性デキストラン、カルボ
キシメチル化デキストラン、アミン化デキストラン、ア
ミロース等の多糖類及びその誘導体、ゼラチン、ヘモシ
アニン、フェリチン等の蛋白質、ポリエチレングリコー
ルなトラ挙げることができる。これらは、リガンド２と
結合させた状態で所定の条件を具備していればよく、例
えば牛血清アルブミンのような比較的低分子のものであ
っても、それを自家重合させるなどして高分子化したも
のであってもよい。− リがノド２自身を重合することによって高分子化しても
よい。重合方法は、下記のリガンド２と高分子化合物と
の結合方法のなかから適宜選択すればよく、例えば、カ
ルボジイミド、グルタルアルデヒド等の二価性架橋剤で
高分子化すればよい。

＋）ｆ７ド２と高分子化合物との結合方法は双方の官能
基を考慮して決定すればよい。官能基は、アミン基、カ
ルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、
フェニル基などを利用することができ、例えばアミノ基
相互間を結合させる場合には、ツインシアネート法、グ
ルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキ
ノン法等数多く知られている。また、アミノ基とカルボ
キシル基との間を結合させる方法としては、カルボキシ
ル基をサクシンイミドエステル化する方法のほか力ルビ
ジイミド法、ウッドワード試薬法等が知られており、ア
ミノ基と糖鎖な架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎ
ｅ法）もある。チオール基を利用する場合には、例えば
もう一方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステ
ル化してこれにシスナインを反応させてチオール基を導
入し、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結
合することができる。フェニル基を利用する方法として
はジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこ
れらの例示に限られるものではなく、このほか例えば「
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊあるいは「酵素免疫
測定法ｊ等の成書に記載されている方法のなかから適宜
選択して利用することができる。結合比は１：１に限ら
ず、目的に応じて任意の比率をとることができることは
いうまでもない。反応後は、ダル濾過法、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍結
乾燥法等で乾燥する。

結合物を構成している抗体はリガンド１とリガンド２の
共通の抗原決定基と反応するものでなければならない。

この抗体にはＦ（ａｂ’）２ｒ　Ｆａｂ’　＊　Ｆａｂ
などのフラグメントも含まれる。

抗体の製造方法としては、リガζド１もしくはすがンド
２又はこのいずれかのりがンドと蛋白との結合物を兎、
山羊、馬、モルモット、ニワトリなどの混血動物に体重
１ｋｌ？あたり０３〜２〜を１〜数回背中皮下、フット
・やラド、大腿筋等にアノユパントとともに注射して当
該動物の体内に形成させる。この抗体は血清をそのまま
用いてもよく、血清から抗体すなわち免疫グロブリンを
採取する公知の方法によって精製してから用いてもよい
。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアノユバントとともに数回腹腔等に注射し、牌臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等ヲ用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。

結合物を構成している酵素は水に不溶性の高分子化合物
に作用しうるものであるが、そのなかでは活性の測定方
法が容易なものがよい。このような酵素は、例えばアミ
ラーゼ、デキストラナーゼ、セルラーゼ、コラ−ゲナー
ゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、リパー
ゼ、などである。

酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決定
すればよい。官能基は、アミノ基、カルボキシル基、水
酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル基などを
利用することができ、結合方法は前記のリガンド２と高
分子化合物との結合方法のなかから適宜選択すればよい
。反応後はダル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わ
せて精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾燥する。

検体に含まれるりがンドｌとリガンド２と高分子化合物
との結合物（以下、高分子化リガンド２という。）を、
前記の抗体と酵素との結合物に溶液中で接触させる。そ
の際、溶液の温度は２０〜４５℃程度、そしてＰＨは通
常４〜８．５程度が適当である。Ｐｆ（を一定に保つた
めに、必要により、すン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩
衝液を用いてもよい。その際、抗体と酵素との結合物の
適当な量は・その種類１　リガンドの種類、あるいは接
触時の条件などによって異なるので予め試験をして定め
るのがよい。抗体と酵素との結合物に対するリガンド１
及び高分子化リガンド２の接触順序は問うところではな
く、いずれが先であってもあるいは同時であってもよい
＠ リガンド１及び高分子化リガンド２と反応させた抗体と
酵素との結合物は高分子物質に接触させて反応させる。

高分子物質と接触させる抗体と酵素との結合物は反応物
から分離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。

この高分子物質は結合物中の酵素が酵素反応しうるもの
であり、通常は基質であるが、水に不溶性のものである
。高分子物質の例としては、α−アミラーゼの場合には
不溶性デンプン、セルラーゼの場合にはセルロース、コ
ラーデナーゼの場合にはコラーゲン、マンナーゼの場合
にはマンナン、プロテアーゼの場合には不溶性蛋白質、
エラスターゼの場合にはエラスチン、そしてリパーゼの
場合には各種油脂類を挙げることができる。この高分子
物質はそれ自身が可溶性であっても、不溶性の担体に結
合させるとか、重合させるなどして不溶化して用いるこ
ともできる。

酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になるように定
めればよい。

一方、結合物の酵素と同種の酵素が検体に含まれている
場合には、この検体中の酵素を阻害する程度が前記の結
合物に結合されている酵素の活性を阻害する程度より大
きい酵素阻害物質を接触させるのがよい。

この酵素阻害物質は検体に含まれている酵素を完全に失
活させかつ結合物に結合されている酵素を全く阻害しな
いものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は要は測定時においてブランク値を上昇させなければよ
く、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵素
活性が回復してもよい。この酵素阻害物質の作用が問題
になるもう一方の、酵素は抗体に結合されている状態の
ものであり、遊離状態では酵素阻害物質によって失活す
るものであってもよい。この酵素阻害物質にはこのよう
な特異性を有する公知の酵素阻害物質を利用すればよい
が、そのほか、検体に含まれている酵素を温血動物に投
与してその抗体を取得し、これを酵素阻害物質として用
いることもできる。抗体の取得方法は前述のりガントに
対する抗体の取得方法と同様でよい。酵素阻害物質の添
加時期は、検体中の酵素による後述する水に不溶性の高
分子物質の分解を実質的に防止できればよく、通常はこ
の高分子物質の添加前に添加する。しかしながら、一般
に酵素阻害物質による阻害作用は酵素による基質の分解
速度よりもはるかにはやいので酵素阻害物質を高分子物
質と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。

酵素反応後は酵素活性を求める。酵素活性は、この酵素
反応（よる分解物の増加、原料である高分子物質の減少
、その他、酵素反応による系の変化を追跡すればよい。

（作用） 本発明の方法において、ば、リガンド１が結合物の抗体
部分に結合することによってその後の酵素反応に立体障
害を生じさせることを利用している。

酵素反応させる高分子物質が不溶性であるために結合物
の酵素部分との接触の大部分が固−液間になシ、その結
果、酵素の高分子化による立体障害が大きく現われる。

本発明者らはこのことを確認するだめにα−アミラーゼ
の系を用いて検討したところ、Ｋンタオースの場合には
酵素の高分子化による酵素活性の低下がほとんど認めら
れず、一方、不溶化デンプンの場合には酵素活性が著し
く低下した。

このような系に高分子化りがンド２を新たに導入したと
ころに本発明の特徴がある。すなわち、この高分子化リ
ガンド２を抗体に対してリガンド１と競争反応させるこ
とによって、リガンド１と反応しなかった抗体には高分
子化リガンド２が反応し、このものはその後の酵素反応
に大きな立体障害をもたらす。そこで、リガンド−１と
高分子化リガンド２との立体障害の差が大きくあられれ
、リガンド１が低分子であってもこれを高感度で測定で
きるようになるのである。

（実施例） ■　ＣＨＭ化アミラーゼの作製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５ダをｐＨ６，３の０
．１Ｍリン酸緩衝液１　ｒｌＬｔに溶かし、ＣＨＭＳ　
２１℃ｇ／ｒｎｌのＤＭＦ溶液１００μｌを加えて室温
で１時間放置して反応させた。この反応液をセファデッ
クスＧ−２５のカラムに入れ、Ｐ）（６，３の０．１　
Ｍ　Ｉｊン酸緩衝液を流してグル濾過を行ない、素通り
分画を分取し九■　抗ノゴキシンウサギＩ　ｇＧＦ　（
ａ　ｂ′）２の作製抗ソゴキシンウサギＩｇＧ１０＃を
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）２ｄに４プシン３０
０μｇを加え、３７℃で１８時間撹拌した。０．Ｉ　Ｎ
ＮａＯＨを加えて−を６．０に調節しこの反応液を予め
０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝１　ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
６，３）で緩衝化したセファクリルＳ−３００グルカラ
ムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した。分子量約１
０万付近に池田されたピーク部分を集めて１　ｒｎｌに
濃縮し、目的の抗ノゴキシンウサギＩ　ｇＧＦ　（ａ　
ｂ　’）２を得た。

■　α−アミラーゼ−抗ジゴキシンウサギＩｇＧＦａ　
ｂ’結合物の作製 ■で調製した抗ノゴキシンウサギＩ　ｇＧ　Ｆ　（ａ　
ｂ’）　２６ηを含む０．１Ｍリン酸緩衝１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０）１ｍＡ！に１０ｍ９／ｒｕｌ
（７）　２−　メルカプｌ−！　ｆ　ル７ミン塩酸塩水
溶液１００μｌを加え、３７℃で９０分間撹拌した。こ
の反応液を予め０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，
３）で緩衝化したセファデックスＧ−２５カラムでグル
濾過して未反応の２−メルカプトメチルアミンを除去し
、Ｈ８−Ｆａ　ｂ’を得た。これに■で調製したＣＨＭ
化α−゛アミラーゼ２　ｍｌを加え、３７℃で９０分間
反応させた。次にこの反応液を０．１Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ
塩化カルシウム溶液（ＰＨ６，０）で緩衝化したセファ
クリルＳ−３００カラムでケ０ル濾過して分子量２０万
以上の分画を集め、これを濃縮して目的の結合物を得た
。

■　高分子化ジゴキシンの作製 ジゴキシン１０ηをエタノール５００μｌに懸濁し、こ
れに０．２Ｍメタ過ヨウ素酸すトリウム水溶液５００μ
ｌを加えた。この混合物を室温にて１時間撹拌し、ＩＭ
エチレングリコール水溶′ｏ、１μｇを添加した。５分
後にヘモシアニン１０ダを加え、室温で３時間撹拌した
。これに０．５１’ＩＰのＮａＢＨ４を加え、４℃でさ
らに１８時間撹拌した。この反応液を３回透析後、予め
０．０２　Ｍ　ＩＪン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７，０で
平衡化したセファデックスＧ−５０に流し、未反応のジ
ゴキシンを除去した。ボイド分画をプールして目的の高
分子化ジゴキシンを得た。

■　ジゴキシンの測定 血清にジゴキシンをＯ〜１２．５　ｎ、９含有せしめた
溶液５０μｌに■で作製した結合物溶液５０μｌ、■で
作製した高分子化ジゴキシン５０μｇ　＜１００ｎ＆／
ｒｎｌ）及びヒトアミラーゼインヒビター５０μＩｔ（
１，ｏｍ９／ｍｌ　）を加えて２０分間反応させた。反
応液にブルースターチ懸濁液１．０　ｍｌを加えて３７
℃で２０分間さらに反応させ、０．５　ＮＮａＯＨ１ｒ
ｎｌを加えて反応を停止させた。これを撹拌後、３５０
０　ｒｐｍで２分間遠心し、得られた上清の６２０　ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。

得られた吸光度とジゴキシンの濃度との関係を示す検量
線を第１図に示す。

（発明の効果） 本発明の方法は、リガンドを特異性高くかつ極めて高感
度で測定できる。また、操作が簡単であシ、安価かつ容
易にリガンドを定量することが可能である。本発明の方
法はりがンドの種類を問わず測定できるｈ′−特に低分
子の測定に威力を発揮する。本発明の方法に用いる試薬
にはリガンドを直接使用せず、りがンドは抗体の製造に
用いられるだけであるから微量で足りるという利点も有
する。

従って、本発明の方法は測定対象と同じリガンドが入手
しにくい場合とか、高価な場合に特に有効である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で測定して得られたジゴキシン量
と吸光度との関係を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 測定対象の抗原決定基具有物質（１）と、この抗原決定
   基具有物質（１）と少なくとも一の抗原決定基を共通に
   する抗原決定基具有物質（２）と高分子化合物との結合
   物を、この共通の抗原決定基と反応する抗体と水に不溶
   性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物に水溶液中
   で接触せしめて反応させ、その後この抗体と酵素との結
   合物に前記の高分子物質を接触せしめて酵素反応させ、
   酵素活性を測定することを特徴とする抗原決定基具有物
   質の測定方法