JPH0245152B2 - Kosoomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho - Google Patents
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- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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-
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、例えば血清、尿などに含まれる薬物
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。
血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多重多様の成分
が含まれており、そのなかに、分子量の近似した
物質、生理活性の似た物質あるいは構造の均似し
た物質なども含まれていることも多い。そこで、
この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで定量
しうることが要求される。さらに、日常検査とし
て利用されるために、簡便かつルーチン化しうる
ことが望ましい。
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多重多様の成分
が含まれており、そのなかに、分子量の近似した
物質、生理活性の似た物質あるいは構造の均似し
た物質なども含まれていることも多い。そこで、
この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで定量
しうることが要求される。さらに、日常検査とし
て利用されるために、簡便かつルーチン化しうる
ことが望ましい。
このような条件を備えた分析法として免疫学的
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
親和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
親和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。
ラジオイムノアツセイは、感度はすぐれている
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ｎｇ〜ｆｇのような極微量を測定する
ことは困難である。
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ｎｇ〜ｆｇのような極微量を測定する
ことは困難である。
本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分
子物質を基質とする酵素に抗原決定基具有物質を
結合させ、この抗原決定基具有物質と測定対象た
る抗原決定基具有物質とを抗体に対して競争反応
させ、その後この結合物の酵素活性を測定すると
測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵
素活性が顕著に低下することを見出し、この方法
を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ
前述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうる
ことを見出して、これに基いて本発明を完成する
に至つた。
を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分
子物質を基質とする酵素に抗原決定基具有物質を
結合させ、この抗原決定基具有物質と測定対象た
る抗原決定基具有物質とを抗体に対して競争反応
させ、その後この結合物の酵素活性を測定すると
測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵
素活性が顕著に低下することを見出し、この方法
を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ
前述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうる
ことを見出して、これに基いて本発明を完成する
に至つた。
すなわち本発明は、検体に含まれる抗原決定基
具有物質１と、この抗原決定基具有物質１と少な
くとも一の抗原決定基を共通にする抗原決定基具
有物質２と水に不溶性の高分子物質に作用しうる
酵素との結合物を、溶液中で前記の共通の抗原決
定基と反応する抗体と接触せしめて反応させ、そ
の後この結合物に前記の高分子物質を接触せしめ
て酵素反応させ、酵素活性を測定することを特徴
とする抗原決定基具有物質の測定方法に関するも
のである。
具有物質１と、この抗原決定基具有物質１と少な
くとも一の抗原決定基を共通にする抗原決定基具
有物質２と水に不溶性の高分子物質に作用しうる
酵素との結合物を、溶液中で前記の共通の抗原決
定基と反応する抗体と接触せしめて反応させ、そ
の後この結合物に前記の高分子物質を接触せしめ
て酵素反応させ、酵素活性を測定することを特徴
とする抗原決定基具有物質の測定方法に関するも
のである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる
抗原決定基具有物質１である。検体の種類は限定
されないが、例えば血清、尿などである。血清、
尿などの場合には、通常は特別な前処理を必要と
せず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質１である。検体の種類は限定
されないが、例えば血清、尿などである。血清、
尿などの場合には、通常は特別な前処理を必要と
せず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質１（以下リガンド１とい
う。）は抗原決定基を一又は二以上有しているも
のであり、例えば、各種内分泌腺に由来するホル
モン類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチ
ン等の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バク
テリア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原
等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原
などである。
う。）は抗原決定基を一又は二以上有しているも
のであり、例えば、各種内分泌腺に由来するホル
モン類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチ
ン等の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バク
テリア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原
等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原
などである。
結合物を構成している抗原決定基具有物質２
（以下、リガンド２という。）はリガンド１と少な
くとも一の抗原決定基が共通していなければなら
ない。リガンド２の抗原決定基は１以上がリガン
ド１と共通であればよく、全てが共通であつても
よい。従つて、リガンド２はリガンド１と同一で
あつてもよい。
（以下、リガンド２という。）はリガンド１と少な
くとも一の抗原決定基が共通していなければなら
ない。リガンド２の抗原決定基は１以上がリガン
ド１と共通であればよく、全てが共通であつても
よい。従つて、リガンド２はリガンド１と同一で
あつてもよい。
結合物を構成している酵素は水に不溶性の高分
子化合物に作用しうるものであるが、そのほか活
性の測定方法が容易なものがよい。このような酵
素は、例えばアミラーゼ、セルラーゼ、コラーゲ
ナーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスター
ゼ、リパーゼ、などである。
子化合物に作用しうるものであるが、そのほか活
性の測定方法が容易なものがよい。このような酵
素は、例えばアミラーゼ、セルラーゼ、コラーゲ
ナーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスター
ゼ、リパーゼ、などである。
酵素とリガンド２との結合方法は双方の官能基
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワーク試験法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakane法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を立用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれら例示に限られるものではなく、この
ほか例えば「Method in Immunochemistry」あ
るいは「酵素抗体測定法」等の成書に記載されて
いる方法のなかから適宜選択して利用することが
できる。結合比は１：１に限らず、目的に応じて
任意の比率をとることができることはいうまでも
ない。反応後は、ゲル過法、イオン交換クロマ
トグラフイー、アフイニテイークロマトグラフイ
ーなどを適宜組み合わせて精製を行ない、必要に
より凍結乾燥法等で乾燥する。
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワーク試験法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakane法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を立用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれら例示に限られるものではなく、この
ほか例えば「Method in Immunochemistry」あ
るいは「酵素抗体測定法」等の成書に記載されて
いる方法のなかから適宜選択して利用することが
できる。結合比は１：１に限らず、目的に応じて
任意の比率をとることができることはいうまでも
ない。反応後は、ゲル過法、イオン交換クロマ
トグラフイー、アフイニテイークロマトグラフイ
ーなどを適宜組み合わせて精製を行ない、必要に
より凍結乾燥法等で乾燥する。
抗体はリガンド１と反応するものでなければな
らず、リガンド２はこの抗体と反応するものでな
ければならない。すなわち、リガンド１とリガン
ド２とは少なくとも一の抗原決定基が共通してい
なければならず、抗体はこの共通の抗原決定基に
対するものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）2、Fab′、Fabなどフラグメントも含まれ
る。
らず、リガンド２はこの抗体と反応するものでな
ければならない。すなわち、リガンド１とリガン
ド２とは少なくとも一の抗原決定基が共通してい
なければならず、抗体はこの共通の抗原決定基に
対するものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）2、Fab′、Fabなどフラグメントも含まれ
る。
抗体の製造方法としては、リガンド１もしくは
リガンド２又はこれらのいずれかと蛋白との結合
物を兎、山羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの
温血動物に体重１Kgあたり0.3〜２mgを１〜数回
背中皮下、フツトパツド、大腿筋等にアジユバン
トとともに注射して当該動物の体内に形成させ
る。この抗体は血清をそのまま用いてもよく、血
清から抗体すなわち免疫グロブリンを採取する公
知の方法によつて精製してから用いてもよい。
リガンド２又はこれらのいずれかと蛋白との結合
物を兎、山羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの
温血動物に体重１Kgあたり0.3〜２mgを１〜数回
背中皮下、フツトパツド、大腿筋等にアジユバン
トとともに注射して当該動物の体内に形成させ
る。この抗体は血清をそのまま用いてもよく、血
清から抗体すなわち免疫グロブリンを採取する公
知の方法によつて精製してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバンドとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバンドとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。
抗体を結合物のリガンド２と反応させても高分
子物質に対する酵素活性の低下が不充分な場合に
は抗体を予め高分子化しておいてもよい。高分子
化の方法としては分子量が10万ダルトン以上でか
つ水溶性の高分子化合物を結合させればよい。高
分子化合物の例としては、可溶性デキストラン、
カルボキシメチル化デキストラン、アミノ化デキ
ストラン、アミロース等の多糖類及びその誘導
体、ゼラチン、ヘモシアニン、フエリチン等の蛋
白質、ポリエチレングリコールなどを挙げること
ができる結合方法は前述の酵素とリガンド２との
結合方法のなかから適宜選択すればよい。
子物質に対する酵素活性の低下が不充分な場合に
は抗体を予め高分子化しておいてもよい。高分子
化の方法としては分子量が10万ダルトン以上でか
つ水溶性の高分子化合物を結合させればよい。高
分子化合物の例としては、可溶性デキストラン、
カルボキシメチル化デキストラン、アミノ化デキ
ストラン、アミロース等の多糖類及びその誘導
体、ゼラチン、ヘモシアニン、フエリチン等の蛋
白質、ポリエチレングリコールなどを挙げること
ができる結合方法は前述の酵素とリガンド２との
結合方法のなかから適宜選択すればよい。
検体に含まれるリガンド１と、リガンド２と前
記の酵素との結合物を溶液中で前記の抗体と接触
させる。その際、溶液の温度は20〜45℃程度、そ
してPHは通常４〜8.5程度が適当である。PHを一
定に保つために、必要により、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。その際、
結合物の適当な量は、その種類、リガンド１の種
類、あるいは接触時の条件などによつて異なるの
で予め試験をして定めるのがよい。抗体とリガン
ド１及び結合物との接触時間はいずれも、通常は
充分に反応しうる程度がよく、例えば37℃の場合
には20〜60分間程度が適当である。抗体に対する
リガンド１及び結合物の接触順序は問うところで
はなく、いずれが先であつてもあるいは同時であ
つてもよい。
記の酵素との結合物を溶液中で前記の抗体と接触
させる。その際、溶液の温度は20〜45℃程度、そ
してPHは通常４〜8.5程度が適当である。PHを一
定に保つために、必要により、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。その際、
結合物の適当な量は、その種類、リガンド１の種
類、あるいは接触時の条件などによつて異なるの
で予め試験をして定めるのがよい。抗体とリガン
ド１及び結合物との接触時間はいずれも、通常は
充分に反応しうる程度がよく、例えば37℃の場合
には20〜60分間程度が適当である。抗体に対する
リガンド１及び結合物の接触順序は問うところで
はなく、いずれが先であつてもあるいは同時であ
つてもよい。
抗体を結合物のリガンド２と反応させても高分
子物質に対する酵素活性の低下が不充分な場合
に、前述のように予め抗体を高分子化するかわり
に、抗体を結合物のリガンド２と反応させてから
さらに第２抗体と反応させて抗体を高分子化して
もよい。この場合、第２抗体はリガンド１及び２
の抗体を抗原として前述の抗体へ取得方法に準じ
て取得することができる。
子物質に対する酵素活性の低下が不充分な場合
に、前述のように予め抗体を高分子化するかわり
に、抗体を結合物のリガンド２と反応させてから
さらに第２抗体と反応させて抗体を高分子化して
もよい。この場合、第２抗体はリガンド１及び２
の抗体を抗原として前述の抗体へ取得方法に準じ
て取得することができる。
抗体と反応させた結合物は高分子物質に接触さ
せて反応させる。
せて反応させる。
高分子物質と接触させる結合物は反応物から分
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。
この高分子物質は結合物が酵素反応しうるもの
であり、通常は基質であるが、水に不溶性である
ところに特徴がある。すなわち、高分子物質が不
溶性であるために結合物の酵素部分との接触の大
部分が固−液間になり、その結果、酵素の高分子
化による立体障害が大きく現われる。本発明者ら
はこのことを確認するためにα−アミラーゼの系
を用いて検討したところ、可溶性デキストランや
ペンタオースの場合には酵素の高分子化による酵
素活性の低下がほとんど認められず、一方、不溶
化デンプンの場合には酵素活性が著しく低下し
た。高分子物質の例としては、α−アミラーゼの
場合には不溶性デンプン、セルラーゼの場合には
セルロース、コラーゲナーゼの場合にはコラーゲ
ン、マンナーゼの場合にはマンナン、プロテアー
ゼの場合には不溶性蛋白質、エラスターゼの場合
にはエラスチン、そしてリパーゼの場合には各種
油脂類を挙げることができる。この高分子物質は
それ自身が可溶性であつても、不溶性の担体に結
合させるとか、重合させるなどして不溶化して用
いることもできる。
であり、通常は基質であるが、水に不溶性である
ところに特徴がある。すなわち、高分子物質が不
溶性であるために結合物の酵素部分との接触の大
部分が固−液間になり、その結果、酵素の高分子
化による立体障害が大きく現われる。本発明者ら
はこのことを確認するためにα−アミラーゼの系
を用いて検討したところ、可溶性デキストランや
ペンタオースの場合には酵素の高分子化による酵
素活性の低下がほとんど認められず、一方、不溶
化デンプンの場合には酵素活性が著しく低下し
た。高分子物質の例としては、α−アミラーゼの
場合には不溶性デンプン、セルラーゼの場合には
セルロース、コラーゲナーゼの場合にはコラーゲ
ン、マンナーゼの場合にはマンナン、プロテアー
ゼの場合には不溶性蛋白質、エラスターゼの場合
にはエラスチン、そしてリパーゼの場合には各種
油脂類を挙げることができる。この高分子物質は
それ自身が可溶性であつても、不溶性の担体に結
合させるとか、重合させるなどして不溶化して用
いることもできる。
酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になる
ように定めればよい。
ように定めればよい。
酵素反応後は酵素活性を求める。酵素活性は、
この酵素反応による分解物の増加、原料である高
分子物質の減少、その他、酵素反応による系の変
化を追跡すればよい。
この酵素反応による分解物の増加、原料である高
分子物質の減少、その他、酵素反応による系の変
化を追跡すればよい。
本発明の方法は、リガンド１を特異性高くかつ
極めて高感度で測定できる。また、操作が簡単で
あり、安価かつ容易にリガンド１を定量すること
が可能である。本発明の方法はリガンド１の種類
を問わず測定できるが比較的高分子の測定に威力
を発揮する。
極めて高感度で測定できる。また、操作が簡単で
あり、安価かつ容易にリガンド１を定量すること
が可能である。本発明の方法はリガンド１の種類
を問わず測定できるが比較的高分子の測定に威力
を発揮する。
以下、実施例を示す。
実施例 １
(1) セルラーゼ基質の調製
紙を20cm×20cmの大きさに切断し、あらか
じめ用意しておいたリアクテイブブルー溶液
（５ｇリアクテイブブルー、５ｇNa2CO3蒸留
水200ml）中に浸した。60℃に加温し、時々撹
拌しながら、３日間加熱を続けた。この紙を
蒸留水で十分に洗浄し、過剰の染料を除去し
た。続いて、恒温乾燥器で乾燥させ、１cm×５
cmの大きさに切断して、目的の基質を得た。
じめ用意しておいたリアクテイブブルー溶液
（５ｇリアクテイブブルー、５ｇNa2CO3蒸留
水200ml）中に浸した。60℃に加温し、時々撹
拌しながら、３日間加熱を続けた。この紙を
蒸留水で十分に洗浄し、過剰の染料を除去し
た。続いて、恒温乾燥器で乾燥させ、１cm×５
cmの大きさに切断して、目的の基質を得た。
(2) セルラーゼ−ヒトIgG結合物の調製
セルラーゼ10mgをPH6.0の0.1Mリン酸緩衝液
２mlに溶かし４−（マレイミドメチルシクロヘ
キサン−１−カルボン酸）サクシンイミドエス
テル（CHMS）のジメチルスルホキシド溶液
２mg／ml）200μを加え、室温で１時間、放
置した。この反応液をセフアデツクスＧ−25を
用いてゲル過し、未反応のCHMSを除去し
た。このCHMS化セルラーゼを１mlまで濃縮
した。
２mlに溶かし４−（マレイミドメチルシクロヘ
キサン−１−カルボン酸）サクシンイミドエス
テル（CHMS）のジメチルスルホキシド溶液
２mg／ml）200μを加え、室温で１時間、放
置した。この反応液をセフアデツクスＧ−25を
用いてゲル過し、未反応のCHMSを除去し
た。このCHMS化セルラーゼを１mlまで濃縮
した。
一方、ヒトIgG10mgを５ｍMEDTAを含むPH
7.5の0.1Mリン酸緩衝液２mlにとかし９mg／ml
のＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
（SAMS）のジオキサン溶液200μ加えた。そ
れから37℃で一時間放置後、1Mヒドロキシル
アミン水溶液（PH7.5）200μ加えた。30分後
反応液をセフアデツクスＧ−25でゲル過し未
反応のSAMSを除いた。このHS−ヒトIgG溶
液を前述のCHM化セルテーゼ１mlに加え、37
℃で２時間放置した。この反応液をセフアクリ
ルＳ−300でゲル過し目的のセルラーゼ−ヒ
トIgG結合物を得た。
7.5の0.1Mリン酸緩衝液２mlにとかし９mg／ml
のＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
（SAMS）のジオキサン溶液200μ加えた。そ
れから37℃で一時間放置後、1Mヒドロキシル
アミン水溶液（PH7.5）200μ加えた。30分後
反応液をセフアデツクスＧ−25でゲル過し未
反応のSAMSを除いた。このHS−ヒトIgG溶
液を前述のCHM化セルテーゼ１mlに加え、37
℃で２時間放置した。この反応液をセフアクリ
ルＳ−300でゲル過し目的のセルラーゼ−ヒ
トIgG結合物を得た。
(3) ヒトIgGの測定
セルラーゼヒトIgG結合物を含む溶液50μ
にヒトIgGを含む標準溶液50μを加えた。こ
の反応液に抗ヒトIgGヤギ血清を5μ加え、37
℃で１時間放置した。これにPH5.0の0.1M酢酸
緩衝液を１ml加え、次に(1)で調製したブルーセ
ルロース紙を１枚加えた。１時間後反応液の
吸光度を波長650nｍで測定した。表１は標準
溶液中のヒトIgG量と吸光度を示したものであ
る。
にヒトIgGを含む標準溶液50μを加えた。こ
の反応液に抗ヒトIgGヤギ血清を5μ加え、37
℃で１時間放置した。これにPH5.0の0.1M酢酸
緩衝液を１ml加え、次に(1)で調製したブルーセ
ルロース紙を１枚加えた。１時間後反応液の
吸光度を波長650nｍで測定した。表１は標準
溶液中のヒトIgG量と吸光度を示したものであ
る。
表 １
ヒトIgG(μｇ) Δ650nｍ
０ 0.280
100 0.380
200 0.490
400 0.630
800 0.990
2000 1.220
実施例 ２
(1) CHM化アミラーゼの調製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ５mgをPH
6.3の0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶かし、
CHMS2mg／mlのDMF溶液100μを加えて室
温で１時間放置して反応させた。この反応液を
セフアデツクスＧ−25のカラムに入れ、PH6.3
の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル過を行な
い、素通り分画を分取した。
6.3の0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶かし、
CHMS2mg／mlのDMF溶液100μを加えて室
温で１時間放置して反応させた。この反応液を
セフアデツクスＧ−25のカラムに入れ、PH6.3
の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル過を行な
い、素通り分画を分取した。
(2) SH化α−フエトプロテインの調製
α−フエトプロテイン５mgを５ｍMEDTA
を含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶かし、こ
れにＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物９
mg／mlのDMF溶液100μを加えて37℃で１時
間反応させた。この反応液に1Mヒドロキシル
アミン水溶液（PH7.5）110を加え、37℃で30
分間加温した。続いて、セフアデツクスＧ−25
を用いてゲル過し、素通り分画を分取した。
を含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶かし、こ
れにＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物９
mg／mlのDMF溶液100μを加えて37℃で１時
間反応させた。この反応液に1Mヒドロキシル
アミン水溶液（PH7.5）110を加え、37℃で30
分間加温した。続いて、セフアデツクスＧ−25
を用いてゲル過し、素通り分画を分取した。
(3) アミラーゼ−α−フエトプロテイン結合物の
調製 前記のCHM化アミラーゼ溶液とSH化α−
フエトプロテイン溶液を混合し、１mlまで濃縮
後４℃で一夜放置して反応させた。反応液をセ
フアクリルＳ−300を充填したカラムに入れ、
PH7.0の20ｍＭリン酸緩衝生理食塩溶液を流し
てゲル過を行ない、１：１に結合した結合物
の分画を分取した。
調製 前記のCHM化アミラーゼ溶液とSH化α−
フエトプロテイン溶液を混合し、１mlまで濃縮
後４℃で一夜放置して反応させた。反応液をセ
フアクリルＳ−300を充填したカラムに入れ、
PH7.0の20ｍＭリン酸緩衝生理食塩溶液を流し
てゲル過を行ない、１：１に結合した結合物
の分画を分取した。
(4) α−フエトプロテインの測定
濃度０〜2000nｇのα−フエトプロテイン溶
溶50μに(3)で調製した結合物溶液50μを加
え、8μｇ／mlの抗α−フエトプロテインヤギ
IgG溶液50μを加えて20分間反応させた。反
応後にブルースターチ懸濁液1.0mlを加えて37
℃で20分間さらに反応させ、0.5NNaOH1mlを
加えて反応を停止させた。これを撹拌後、
3500rpmで２分間遠心し、得られた上清の620n
ｍにおける吸光度を測定した。
溶50μに(3)で調製した結合物溶液50μを加
え、8μｇ／mlの抗α−フエトプロテインヤギ
IgG溶液50μを加えて20分間反応させた。反
応後にブルースターチ懸濁液1.0mlを加えて37
℃で20分間さらに反応させ、0.5NNaOH1mlを
加えて反応を停止させた。これを撹拌後、
3500rpmで２分間遠心し、得られた上清の620n
ｍにおける吸光度を測定した。
得られた吸光度とα−フエトプロテインの濃度
との関係を示す検量線を第１図に示す。
との関係を示す検量線を第１図に示す。
実施例 ３
アミラーゼ５mgをPH8.0の0.1M炭酸緩衝液１ml
に溶かし、３−カルボキシテオフイリンサクシン
イミドエステル20μｇ／mlのDMF溶液100μを
加えて室温で１時間反応させた。反応液を20ｍＭ
塩化カルシウム及び20ｍＭリン酸を含有するPH
6.5の生理食塩水で予め平衡化しておいたセフア
デツクスＧ−25カラムでゲル過し、ボイド分画
に溶出したテオフイリン結合α−アミラーゼを分
取して１mlまで濃縮した。
に溶かし、３−カルボキシテオフイリンサクシン
イミドエステル20μｇ／mlのDMF溶液100μを
加えて室温で１時間反応させた。反応液を20ｍＭ
塩化カルシウム及び20ｍＭリン酸を含有するPH
6.5の生理食塩水で予め平衡化しておいたセフア
デツクスＧ−25カラムでゲル過し、ボイド分画
に溶出したテオフイリン結合α−アミラーゼを分
取して１mlまで濃縮した。
800nｇ／mlのこのテオフイリン結合α−アミ
ラーゼ溶液50μに血清50μを加え、ヒト血清
アミラーゼの酵素作用を阻害させるため、500μ
ｇ／mlの抗ヒトアミラーゼヤギIgG50μを加え、
さらに15μｇ／ml抗テオフイリンマウスIgG50μ
を加えて37℃で30分間反応させた。この反応液
100μを、ポリスチレンフイルム１上に陽イオ
ン交換樹脂２、反射層３、ブルースターチ４順に
積層した第２図に示す多層フイルム上に滴下し、
室温20分後のアミラーゼ活性をリフラクトメータ
ーで測定した。
ラーゼ溶液50μに血清50μを加え、ヒト血清
アミラーゼの酵素作用を阻害させるため、500μ
ｇ／mlの抗ヒトアミラーゼヤギIgG50μを加え、
さらに15μｇ／ml抗テオフイリンマウスIgG50μ
を加えて37℃で30分間反応させた。この反応液
100μを、ポリスチレンフイルム１上に陽イオ
ン交換樹脂２、反射層３、ブルースターチ４順に
積層した第２図に示す多層フイルム上に滴下し、
室温20分後のアミラーゼ活性をリフラクトメータ
ーで測定した。
得られた反射強度とテオフイリン濃度との関係
を示す検量線を第３図に示す。
を示す検量線を第３図に示す。
第１図及び第３図は本発明の方法で測定して得
られた検量線を表わしている。第２図は測定に使
用した多層フイルムの構成を示すものである。
られた検量線を表わしている。第２図は測定に使
用した多層フイルムの構成を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 検体に含まれる抗原決定基具有物質１と、こ
の抗原決定基具有物質１と少なくとも一の抗原決
定基を共通にする抗原決定基具有物質２と水に不
溶性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物
を、溶液中で前記の共通の抗原決定基と反応する
抗体と接触せしめて反応させ、その後この結合物
に前記の高分子化合物を接触せしめて酵素反応さ
せ、酵素活性を測定することを特徴とする抗原決
定基具有物質の測定方法。 ２ 抗体が予め高分子化されたものである特許請
求の範囲第１項の測定方法。 ３ 抗体が抗原決定基と反応後高分子物質と接触
前に高分子化される特許請求の範囲第１項記載の
測定方法。 ４ 高分子化が第２抗体の結合によつて行なわれ
る特許請求の範囲第３項記載の測定方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21714583A JPH0245152B2 (ja) | 1983-11-18 | 1983-11-18 | Kosoomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho |
| US06/670,764 US4692404A (en) | 1983-11-18 | 1984-11-13 | Method of measuring biological ligand by the use of enzymes |
| EP84307834A EP0144176B1 (en) | 1983-11-18 | 1984-11-13 | Method of measuring a biological ligand |
| DE8484307834T DE3485339D1 (de) | 1983-11-18 | 1984-11-13 | Verfahren zur messung eines biologischen ligands. |
| ES537707A ES8602141A1 (es) | 1983-11-18 | 1984-11-16 | Un metodo de medir un ligando biologico |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21714583A JPH0245152B2 (ja) | 1983-11-18 | 1983-11-18 | Kosoomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60108756A JPS60108756A (ja) | 1985-06-14 |
| JPH0245152B2 true JPH0245152B2 (ja) | 1990-10-08 |
Family
ID=16699557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21714583A Expired - Lifetime JPH0245152B2 (ja) | 1983-11-18 | 1983-11-18 | Kosoomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0245152B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5265257B2 (ja) | 2008-06-30 | 2013-08-14 | 富士フイルム株式会社 | 犬ｃｒｐ及び人ｃｒｐを認識する抗体 |
| JP5292270B2 (ja) | 2009-12-21 | 2013-09-18 | 富士フイルム株式会社 | 犬ｃｒｐ測定用乾式分析要素 |
| JP5492158B2 (ja) | 2011-08-24 | 2014-05-14 | 富士フイルム株式会社 | ヒトｔｓｈ及び犬ｔｓｈに対する抗体 |
-
1983
- 1983-11-18 JP JP21714583A patent/JPH0245152B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60108756A (ja) | 1985-06-14 |
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