JPS60108756A - 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 あるいは各押戻のに由来する做惜成分などをｉｕ１＋定
する方法に関するもので多）る。

血清、尿などの体液゛に含まれる微−ｊｌ：成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非宮に有意
義であり、日常の臨床検査に活用されている。ところが
、これらの体液には多種多様の成分が含まれており、そ
のなかには、分子量の近ｒ以した物質、生理活性の似た
物質あるいは＃ＩＪｉ　３＜＋ｉの近（ＩＩＩした物質
なども含まれていることも多い。そこで、この分析法は
特異性が高く、かつ微少１ｉｉ寸で定Ｉ；１しうること
が要求される。さらに、日常（ω査として利用されるた
めに、簡便かつルーチン化しうろことが望ましい。

このような条件ｋ　（Ｉｆｉｉえた分析法として免疫学
的測定法がある。この方法は、抗原一抗体間の高い親和
性と、抗体が抗原決定基を’Ｉ’ｌｌ別する高い特異性
を利用しており、ラジオイムノア，セイ、酵素免疫測定
法、血球等の＃集反応を利用した方法雪に人シ用されろ
。

ラジオイムノア、セイは、感度はすぐれているが、人体
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、６殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題は々いが、ラジ
オイムノア、セイもそうであるが、ｉｆｆ離標識物と結
合標識物の分離が必要である。そして、この分離操作は
、非常に繁召ｔであり、操作及び測定誤差の両面で問題
になっている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く
、数ｎグ〜ｆＰのような極微量を測定することは困難で
ある。

本発明者らは上記のような欠点の々い測定方法を開発す
べく種々検討の結果、水に不溶性の高分子物質を基質と
する酵素に抗原決定基具有物質を結合させ、この抗原決
定基具有物質と測定対象たる抗原決定基具有物質とを抗
体に対して競争反応させ、その後この結合物の酵素活°
性を測定すると測定対象たる抗原決定基具有物質の量に
応じて酵素活性が顕著に低下することを見出し、この方
法を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前述
の分離操作を行なわない瓢で簡便に測定しうろことを見
出して、こ７″ｌ−に基いて本発明全完成するに至った
。

すなわち本発明は、検体に含１れる抗原決定基具有物質
（１）と、この抗原決定基具有物質（１）と少なくとも
−の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有物質（２）
と水に不溶性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物
を、溶液中で前記の共通の抗原決定基と反応する抗体と
接触せしめて反応させ、その後この結合物に前記の高分
子物質を接触せしめて酵素反応させ、酵素活性を測定す
ることを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法に関
するものである。

本発明方法における」１１定対象は検体に含捷れる抗原
決定基具有物質（りである。検体の種類は限定されない
が、例えば血清、尿などである。血清、尿などの場合に
は、通常は特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を
行なうことができる。

抗原決定ｊ＋’；　ｆ８．重物質（１）（以下リガンド
１という。）は抗原決定基を−又は二以上有しているも
のであり、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン類
、免疫グロブリン、アルブミン、フェリチン等の血漿蛋
白質、ＨＢ抗原等のウィルス、バクテリア類、α−フェ
トグロティン、癌胎児性抗原等の各種臓器あるいは血中
、尿中に存在する抗原などである。

結合物を構成して伝る抗原決定基具有物質（２）（以下
、リガンド２という。）はりガント１と少なくとも−の
抗原決定基が共通していなければならない。りがンド２
の抗原決定基は１以上がリガンド１と共通であればよく
、全てが共通であってもよい。従って、リガンド２はリ
ガンド】と同一であってもよい。

結合物を構成している酵素は水に不溶性の高分子化合物
に作用しうるものであるが、そのほか活性の測定方法が
容易なものがよい。このような酵素は、例えばアミラー
ゼ、セルラーゼ、コラーケ８ナーゼ、マンナーゼ、ゾロ
テアーゼ、エラスターゼ、リパーゼ、などである。

酵素とリガンド２との結合方法は双方の官能Ｊ、（を考
慮して決定すればよい。官能基は、アミン粘、カルホキ
フル基、水酸基、チオール基、イミググール基、フェニ
ル基斤どを利用することができ、例えばアミノ基相互間
を結合させる場合には、ジイノンアネ−１・法、グルタ
ルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン
法’：Ｑ数多く　知られている。また、アミノ−＋、！
；とカル７＋？ギノル基との間を結合させる方法として
は、カルボギンルノ、（をザクシンイミドエステル化す
る方法のほかカル＋ｌ’ジイミド法、つ、ドヮーク試薬
法等が知られており、アミノ基と糖鎖を架イρ１する〕
１・゛Δヨウ素醋酸酸化法Ｎａｋａｎｅ法）もある。チ
オールノ１（ヲ利用する場合には、例えばもう一方の側
のカルボギンルノ、（をザクシンイミドエステル化して
これに７ステインを反応させてチオール基を導入し、チ
オール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合するこ
とができる。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ
化法、アルギル化法などがある。結合方法はこれらの例
示に限られるものではｈく、この１１が例えばｒ　Ｍｅ
ｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ
　あるいは「酵素抗体測定法」等の酸相に記載されてい
る方法のなかから適宜選択して利用することができる。

結合比はＩ：１１Ｃ限らず、目的に応じて任童の比率を
とることができることはいうまでもない。反応後は、ケ
゛ル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィーなトラ適宜組み合わせて精製
を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥する。

抗体はりガント１と反応するものでなければならず、り
がンド２はこの抗体と反応するもので々ければならない
。すなわち、リガンド】とリガンド２とは少なくとも−
の抗原決定基が共通していなければならず、抗体はこの
共通の抗原決定基に対するものでなければならない。こ
の抗体にはＦ（ａｂ’）２　、　Ｆａｂ’　、　Ｆａｂ
などのフラグメントも含まれる。

抗体の製造方法としては、リガンド１もしくはリガンド
２又はこれらのいずれかと蛋白との結合物を兎、山羊、
馬、モルモット、ニワトリなどの混血動物に体重］　ｋ
ｇあ／こ９０３〜２ｍ！／をｌ−数回背中皮下、フッド
パ、］゛、犬１１・１１筋％　ＶＣアジ、バンドととも
に注射して当該動物の体内に形成させる。

この抗体は血ｉ’ｉ’？をそのま１用いてもよ＜　、１
ｒ＋＋　７１’□゛がら抗体すなわち免疫グロブリンを
採取する公知の方法によって精製してから用いてもよい
。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。そのｊソ１合には、マウスに前記のいずれ
かの抗原をアジ−パントとともに数［ｒ１１腹腔等に注
射し、ｌｌ１１］臓糾１胞を取９出して、Ｉ？　ＩＪエ
チレングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞と融
合させる。そして、この融合却１胞のなかから当該抗体
を産生ずるものをクローニングによってモノクローン細
胞として増幼させ、マウス腹腔中で増殖させることによ
って弔−抗体、すなわちモノクローナル抗体を大部に製
造することができる。

抗体を結合物のリガンド２と反応させても高分子物質に
対する酵素活性の低下が不充分な場合には抗体を予め高
分イ化しておいてもよい。高分子化の方法としては分子
量が１０万ダルトン以上でかつ水溶性の高分子化合物を
結合させればよい。

高分子化合物の例としては、可溶性デキストラン、カル
ボキンメチル化デキストラン、アミン化デキストラン、
アミロース等の多糖類及びその誘導体、ゼラチン、ヘモ
シアニン、フェリチン等の蛋白質、ポリエチレングリコ
ールなどを挙げることができる。結合方法は前述の酵素
とりがンド２との結合方法のなかから適宜選択すればよ
い。

検体に含まれるリガンド１と、リガンド２と前記の酵素
との結合物音溶液中で前記の抗体と接触させる。その際
、溶液の温度は２０〜４５℃程度、そして声は通常４〜
８．５程度が適当である。ＰＨを一定に保つために、必
要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用
いてもよい。その際、結合物の適当な量は、その種類、
リガンド１の種類、あるいは接触時の条件などによって
異なるので予め試験をして定めるのがよい。抗体とリガ
ンド１及び結合物との接触時間はいずれも、通常は充分
に反応しうる程度がよく、例えば３７℃の場合には２０
〜６０分間程度が適当である。抗体に対するリガンド１
及び結合物の接触順序は問うところではなく、いずれが
先であってもあるいは同時であってもよい。

抗体を結合物のリガンド２と反応させても高分子物質に
対する酵素活性の低下が不充分な場合に、前述のように
予め抗体を高分子化するがわりに、抗体を結合物のりガ
ン１°２と反応させてからさらに第２抗体と反応させて
抗体を高分子化してもよい。コノ場合、第２抗体はリガ
ンド１及び２の抗体全抗原として前述の抗体の取得方法
に準じて取得することができる。

抗体と反応させた結合物は高分子物質に接触させて反応
させる。

高分子物質と接触させる結合物は反応物から分離したも
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。

この高分子物質は結合物が酵素反応しうるものであり、
通常は基質であるが、水に不溶性であるところに特徴が
ある。すなわち、高分子物質が不溶性であるために結合
物の酵素部分との接触の太部分が固−液間になり、その
結果、酵素の高分子化による立体障害が大きく現われる
。本発明者らはこのことを確認するためにα−アミラー
ゼの系を用いて検討したところ、可溶性デキストランや
インタオースの場合には酵素の高分子化による酵素活性
の低下がほとんど認められず、一方、不溶化デンプンの
場合には酵素活性が著しく低下した。

高分子物質の例としては、α−アミラーゼの場合には不
溶性デンプン、セルラーゼの場合にはセルロース、コラ
−ゲナーゼの場合にはコラーゲン、マンナーゼの場合に
はマンナン、プロテアーゼの場合には不溶性蛋白質、エ
ラスターゼの場合にはエラスチン、そしてり・や−ゼの
場合には各種油脂類を挙げることができる。この高分子
物質はそれ自身が可溶性であっても、不溶性の担体に結
合させるとか、重合させるなどして不溶化して用いるこ
ともできる。

酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になるように定
めればよい。

酵素反応後は酵素活性をめる。酵素活性は、この酵素反
応による分解物の増加、原＋１である高分子物質の減少
、その他、酵素反応による糸の変化を追跡すればよい。

本発明の方法は、リガンド１を特異性高くかつ極めて高
感度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ
容易にリガンド１を定宿することが可能である。本発明
の方θ二はリガンドｌの神類を問わず測定できるが比較
的高分子の測定に威力を発揮する。

以下、実施例を示す。

実施例１ （１）　セルラーゼ基質の調製 沖紙を２０ｍＸ２０ｍの大きさに切断し、あらかじめ用
意しておいたりアクティブブルー溶液（５５’リアク、
テイブブルー、５　ＰＮａ、、Ｃｏ、蒸留水２００ｍｅ
）中に浸した。６０℃に加温し、時々攪拌しながら、３
日間加熱を続けた。このＰ紙を蒸留水で十分に洗浄し、
過剰の染料を除去した。続いて、恒温燥乾器で乾燥させ
、ｌＬ：ｒｎ×５Ｌ：ｒｎの大きさに切断して、目的の
基質を得た。

（２）　セルラーゼーヒ）　ＩｇＧ結合物の調製セルラ
ーゼｌ０ｍｇをｐＨ６，０の０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝
液２ｍｌに溶かし４−（マレイミドメチルシクロヘキサ
ン−１−ノノルどン酸）ザクシンイミドエステル（ＣＨ
ＭＳ）のジメチルスルホキシド溶液Ｃ２ｒｖ／ｍ１）２
００ｔｔＬｆ加え、室温で１時間、放置しん。この反応
液をセフアゾ、クスＧ−２５ｉ用いてケ゛ルｐ過し、未
反応のＣＨＭＳを除去した。このＣＨＭＳ化セルラーゼ
を１　ｍｌまで濃縮した。

一方、ヒトＩｇＧＩＯｍ９を５　ｍ　ＭＥＤＴＡ　”ｆ
：含むＰＨ７５の０．１Ｍリン酸緩衝液２ｍｌにとかし
９　ｒａｇ／ｍｌ　ノＳ−７セチルメルカゾトコノ・り
酸無水物（ＳＡＭＳ　）のジオキサン溶液２００μを加
えた。それから３７℃で一時間放虐後、ＩＭヒドロキシ
ルアミン水溶液（ｐＨ７，５）２００μを加えた。３０
分後反応液をセファデックスＧ−２５でグル濾過し未反
応のＳＡＭＳを除いた。このＨ８−ヒ）ＩｇＧ溶液を前
述のＣＨＭ化セルテーゼｌ　ｍｌに加え、３７℃で２時
間放置した。この反応液をセファクリルＳ−３００でグ
ル渥過し目的のセルラーゼーヒ）　ＩｇＧ結合物を得た
。

（３）　ヒトＩｇＧの測定 セルラーゼヒ）　ＩｇＧ結合物を含む溶液５０ｚ＋ｔに
ヒ）ＩｇＧを含む標準溶液５０　ＩＬＬを加えた。この
反応液に抗ヒ）ＩｇＧヤギ面’ｌ’ｆｆ　ｋ　５　／Ｉ
ｔ加え、３７℃で１時間放置した。これに、Ｈ５，Ｏの
０．１Ｍ酢酸緩衝液を１　ｍｌ加え、次１／（：（＋）
でΔｌｔ４製したブルーセルロースＰＭを１枚加えた。

１時間後反応液の吸光度を波長６５０　ｎｍで測定した
。表１は標準溶液中のヒトＩｇＧ１と吸光度を示したも
のである。

表　１ ヒ　ト　ＩｇＧ　（ＪＰ）　ΔＡ６５０ｎｍＯｎ、２８
０ １００　０、：３８０ ２００　０、／１９０ ４．００　０．６３０ ８００　０．９９０ ２０００　１．２２０ 実施例２ （１）　ＣＨＭ化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５　ｍ９をＩ）１１６
３の０．１Ｍリン酸緩衝液１　ｍｌに溶かし、ＣＨＭＳ
　２ｍ！７７ｍｅのＤＭＦ溶液＋００μｔを加えて室温
で１時間放置して反応させた。この反応液をセファデッ
クスＧ−２５のカラムに入れ、ｐ＋−１６，３のＯ，１
Ｍ　リン酸緩衝液を流してケ゛ル濾過を行ない、素通り
分画を分取した。

（２）　ＳＨ化α−フェトプロティンの調製α−フェト
プロティン５　ｍ９を５　ｒｎ　ＭＥＤＴＡを含むｐｔ
ｌ　７．５の０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液に溶かし、こ
れにＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物ｇ　ｍ９／
ｍｌのＤＭＦ溶液１００μｔを加えて３７℃で１時間反
応させた。この反応液に１Ｍヒドロキシルアミン水溶液
（ＰＩ＋７．５　）　１１０μｔを加え、３７℃で３０
分間加温した。続いて、セファデックスＧ−２５を用い
てケ°ル沢過し、素通シ分画を分取した。

（３）　アミラーゼ−α−フェトプロティン結合物の調
製 前記のＣＨＭ化アミラーゼ溶液とＳＨ化α−フェトプロ
ティン溶液を混合し、）ｍｅ捷で濃縮後・１℃で一夜放
首して反応させた。反応液を七フアクリルＳ−３００を
充填したカラ１、に入れ１．Ｉ＋　７．０の２０ｍＭＪ
ン酸緩衝生理食塩溶液を流してデル濾過を行ない、１：
１に結合した結合物の分画を分取した。

（４）　α−フェトプロティンの測定 濃度０〜２０００ｎグの（Ｙ−フェトプロティン溶溶５
０μｔに（３）で１ｙ、Ｈ製した結合物済液５　ｎ　ｔ
ｒｉを加え、８　ｔｔｆ／ｍｅの抗α−フェトプロティ
ンヤギＴｇＧ溶Ｗ５０μｔを加えて２０分間反応させた
。反応液にブルー−スターチ煮？’Ａ液１．　Ｏｍｌを
力ｎえて３７℃で２０分間さらに反応させ、０．５　Ｎ
ＮａＯＨＩ　ｍｅ　ｆ加えて反応を停止させた。これを
攪拌後、３５００ｒｐｍで２分間遠心し、イｉ）られだ
上循の６２０ｎｍＫおける吸光度を測定しだ。

得られた吸光度とα−フェトプロティンの濃度との関係
を示す横置、％！を第１図に示す。

実施例３ ７　ミ５−セ５　ｍ９をｐＨ８，０の０．１Ｍ炭酸緩衝
妙１ｍｅ　Ｉｃ　溶かし、３−カルボキシテオフィリン
サクンンイミトｘ　ｘチル２０　ｔｔｇ−／ｍｅ　（Ｄ
　ＤＭＦ溶液１００１１ｔを加えて室温で１時間反応さ
せた。反応液？：２０ｍＭ塩化カルシウム及び２０　ｍ
Ｍ　ＩＪン酸を含有するＰＨ６５の生理食塩水で予め平
衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでデル濾
過し、ボイド分画に溶出したテオフィリン結合α−アミ
ラーゼを分取して１ｍ／ｌで濃縮した。

８００　ｎ７／ｍ／のこのテオフィリン結合α−アミラ
ーゼ溶液５０μｔに血清５ｏμｔを加え、ヒト血清アミ
ラーゼの酵素作用を阻害させるため、５ｏ。

ｌｌ！７−／ｍｔの抗ヒトアミラーゼヤギＩｇＧ　５０
１ｔｌを加え、さらに１５　ｔ４／ｍｅ抗テオフィリン
マウスＩｇＧ　５０μｔを加えて３７℃で３０分間反応
させた。この反応液１００　ｔｚＬを、ポリスチレンフ
ィルム１上に陽イオン交換樹脂２、反射層３、ブルース
ターチ４の順に積層した第２図に示す多層フィルム上に
滴下し、室温２０分後のアミラーゼ活性をリフラクトメ
ータ−で測定した。

得られた反射強度とテオフィリン濃度との関係を示す検
量線を第３図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第３図は本発明の方法で１ｌｌｌｌ定して（
ｌ；られた検量線を表わしている。ｔｘ　２図は測定Ｖ
ＣｆＪｊ用した多層フィルムの構成を示すものである。 特許出願人富士レビオ株式会社 代理人　弁理」二　１）　中　政　浩

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｉ　検体に含まれる抗原決定基具有物質（１）と、この
   抗原決定基具有物質（１）と少なくとも−の抗原決定基
   を共通にする抗原決定基具有物質（２）と水に不溶性の
   高分子物質に作用しうる酵素との結合物を、溶液中で前
   記の共通の抗原決定基と反応する抗体と接触せしめて反
   応させ、その後この結合物に前記の高分子化合物を接触
   せしめて酵素反応させ、酵素活性を測定することを特命
   とする抗原決定基具有物質の測定方法 ２　抗体が予め高分子化されたものである特許請求の範
   囲第１項の測定方法 ３　抗体が抗原決定基と反応後高分子物質と接触前に高
   分子化される特許請求の範囲第１項記載の測定方法 ４　高分子化が第２抗体の結合によって行なわれる特許
   請求の範囲第３項記載の測定方法