JPS607362A - 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法 - Google Patents
酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法Info
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- JPS607362A JPS607362A JP11435783A JP11435783A JPS607362A JP S607362 A JPS607362 A JP S607362A JP 11435783 A JP11435783 A JP 11435783A JP 11435783 A JP11435783 A JP 11435783A JP S607362 A JPS607362 A JP S607362A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関する
ものである。
ものである。
患者に投与されている薬物、例えばノボキシン、テオフ
ィリンなどの血中濃度を測定することは適正な治療を進
めるうえで重要であり、また、癌など各種の疾患に由来
する成分を検診者の血液力・ら検出することは当該疾患
の早期発見を１１なう，祖で極めて有効である。
ィリンなどの血中濃度を測定することは適正な治療を進
めるうえで重要であり、また、癌など各種の疾患に由来
する成分を検診者の血液力・ら検出することは当該疾患
の早期発見を１１なう，祖で極めて有効である。
そこで、血液のこれらの微量成分を＠ １３するり５法
が種々開発されているが、感度、１キ異（’ＩＥ、大量
検体の短時間処理などの点にすぐれる酵素免疫ｍｌｌ定
法が賞月されている。しかしなめくら、従来のＣＩ￥素
免疫測定法の場合には、未だ感度７５：充分とはいえず
、また洗浄操作が繁雑であったり、チュー７゛の移しか
えが必要であったりしてｉＥ確々ｖ１度を一Ａ（めるこ
とか容易でなかった。
が種々開発されているが、感度、１キ異（’ＩＥ、大量
検体の短時間処理などの点にすぐれる酵素免疫ｍｌｌ定
法が賞月されている。しかしなめくら、従来のＣＩ￥素
免疫測定法の場合には、未だ感度７５：充分とはいえず
、また洗浄操作が繁雑であったり、チュー７゛の移しか
えが必要であったりしてｉＥ確々ｖ１度を一Ａ（めるこ
とか容易でなかった。
そこで本発明者らは、さらに感度を高め力１つ繁雑な操
作の少ない分析方法を６貫発するべく検年１を進め、ビ
オチン−アビノン系の反ＬＥ＝を第１」用した西Ｙ素免
疫測定方法を案出するに至った。そして、この方法を用
いれば血中の微量成分を本ｈめて高Ｉ盛度で測定できし
かも操作もより簡便になることを見出して、本発明を完
成した。
作の少ない分析方法を６貫発するべく検年１を進め、ビ
オチン−アビノン系の反ＬＥ＝を第１」用した西Ｙ素免
疫測定方法を案出するに至った。そして、この方法を用
いれば血中の微量成分を本ｈめて高Ｉ盛度で測定できし
かも操作もより簡便になることを見出して、本発明を完
成した。
すなわち本発明は、検体に含捷れる抗原決定店（具有物
質（１）と、この抗原決定基具有１勿質（１）と少なく
とも−の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有物質（
２）とアビノン、ストレプトアビノン又はこれらの誘導
体との結合物とを、溶液中で前記の共通の抗原決定基と
反応する抗体と接触せしめて反応させ、この結合物をビ
オチン酵素と接触せしめ、その後ビオチン酵素の活性を
測定することを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方
法に関するものである。
質（１）と、この抗原決定基具有１勿質（１）と少なく
とも−の抗原決定基を共通にする抗原決定基具有物質（
２）とアビノン、ストレプトアビノン又はこれらの誘導
体との結合物とを、溶液中で前記の共通の抗原決定基と
反応する抗体と接触せしめて反応させ、この結合物をビ
オチン酵素と接触せしめ、その後ビオチン酵素の活性を
測定することを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方
法に関するものである。
本発明方法における測定対象は検体に含捷れる抗原決定
基具有物質（１）である。検体の種類は限定されないが
、例えば血清、尿などである。
基具有物質（１）である。検体の種類は限定されないが
、例えば血清、尿などである。
抗原決定基具有物質（１）（以下リガント責１）という
。）は抗原決定基を−又は二以上有しているものであシ
、例えば、ノボキシン、テオフィリン、フェニトインな
どの合成医薬品、被ニジリン、アミカシン、ゲンタマイ
シンなどの抗生物質、インシュリン、ＴＳＨ１Ｔ４、プ
ロスタグランノン、ＩｇＧ、２−フェトプロティン、グ
リコリピッドＱ’Ｊ４、ＨＢｓ抗原、ガン抗原などを含
む。
。）は抗原決定基を−又は二以上有しているものであシ
、例えば、ノボキシン、テオフィリン、フェニトインな
どの合成医薬品、被ニジリン、アミカシン、ゲンタマイ
シンなどの抗生物質、インシュリン、ＴＳＨ１Ｔ４、プ
ロスタグランノン、ＩｇＧ、２−フェトプロティン、グ
リコリピッドＱ’Ｊ４、ＨＢｓ抗原、ガン抗原などを含
む。
結合物を構成している抗原決定基具有物質（２）（以下
、リガント責２）という。）も抗原決定基を−又は二以
上有しているものであるが、少なくともその−の抗原決
定基に：リガンド（１）のいずれかの抗原決定基と共通
していなければならない。リガンド（２）の抗原決定基
は一以上かりガント（１）と共通であればよく、全てが
共通であってもよい。従って、リガント責２）はりガン
ト責１）と同一であってもよい。
、リガント責２）という。）も抗原決定基を−又は二以
上有しているものであるが、少なくともその−の抗原決
定基に：リガンド（１）のいずれかの抗原決定基と共通
していなければならない。リガンド（２）の抗原決定基
は一以上かりガント（１）と共通であればよく、全てが
共通であってもよい。従って、リガント責２）はりガン
ト責１）と同一であってもよい。
結合物を構成しているアビノン及びストレプトアビノン
はビオチン酵素と結合しうるものであることはいうまで
もないが、これらの誘導体もビオチン酵素と結合しつる
ものであれば用いることができる。誘導体の例としては
アビノンあるいはストレプトアビノンを無水酢酸などで
アセチル化したものなど、一般の化学修飾剤で処理した
ものを挙げることができる。誘導体はビオチンとの結合
定数の小さいもののほうが本発明に好適である。
はビオチン酵素と結合しうるものであることはいうまで
もないが、これらの誘導体もビオチン酵素と結合しつる
ものであれば用いることができる。誘導体の例としては
アビノンあるいはストレプトアビノンを無水酢酸などで
アセチル化したものなど、一般の化学修飾剤で処理した
ものを挙げることができる。誘導体はビオチンとの結合
定数の小さいもののほうが本発明に好適である。
リガンド（２）とアビノン、ストレフ０トアビノン又は
これらの誘導体との結合方法は、リガン１責２）とアビ
ノン等の双方の官能基を考慮して決定すればよい。官能
基はアミン基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、
フェニル基などを利用すればよく、例工ば、リガンド（
２）が低分子でカルボキシル基を有する場合には、この
カル＋（？キソル基をザクシンイミドエステル化する方
法がある。これは活性エステルであり、アビノン等のア
ミン基と反応して安定なペプチド結合を形成する。
これらの誘導体との結合方法は、リガン１責２）とアビ
ノン等の双方の官能基を考慮して決定すればよい。官能
基はアミン基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、
フェニル基などを利用すればよく、例工ば、リガンド（
２）が低分子でカルボキシル基を有する場合には、この
カル＋（？キソル基をザクシンイミドエステル化する方
法がある。これは活性エステルであり、アビノン等のア
ミン基と反応して安定なペプチド結合を形成する。
リガンド（２）がチオール基を有している場合にはアビ
ノン等にＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を反応
させてチオール基を導入した後、チオール基反応性二価
架橋試薬を用いて結合物を仕ることができる。
ノン等にＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を反応
させてチオール基を導入した後、チオール基反応性二価
架橋試薬を用いて結合物を仕ることができる。
また、このほか、アビノン等のアミン基とリガンド（２
）のアミン基とを架橋させる方法は、ノインシ了ネート
法、一段階グルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン
法、ベンゾキノンｒ 等数多く 知られている。また、
このアビノン等のアミン基とリガンド（２）のカルボキ
シル基を結合する架橋法もカルボソイミド法、つ、ドワ
ード試薬法等が知られている。さらに、アミノ基と糖鎖
を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある
。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、アル
キル化法などがある。本発明の方法に用いる結合物はこ
れらの方法によって合成することができる。
）のアミン基とを架橋させる方法は、ノインシ了ネート
法、一段階グルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン
法、ベンゾキノンｒ 等数多く 知られている。また、
このアビノン等のアミン基とリガンド（２）のカルボキ
シル基を結合する架橋法もカルボソイミド法、つ、ドワ
ード試薬法等が知られている。さらに、アミノ基と糖鎖
を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある
。フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法、アル
キル化法などがある。本発明の方法に用いる結合物はこ
れらの方法によって合成することができる。
反応後はケ゛ルｐ過、カチオン交換樹脂、アニオン交換
樹脂などを用いたイオン交換クロマトグラフィー、シリ
カケゝル、ポーラスポリマーなどを用いた吸着剤処理、
薄層クロマトグラフィーなどを適宜胡み合わせて精製を
行ない、必要により凍結乾燥等で乾燥する。
樹脂などを用いたイオン交換クロマトグラフィー、シリ
カケゝル、ポーラスポリマーなどを用いた吸着剤処理、
薄層クロマトグラフィーなどを適宜胡み合わせて精製を
行ない、必要により凍結乾燥等で乾燥する。
このような結合物は通常は単一で使用するが、併用して
もよい。添加量はリガント責１）に対するリガンド（２
）のモル比で通常０２〜２倍程度が適当である。
もよい。添加量はリガント責１）に対するリガンド（２
）のモル比で通常０２〜２倍程度が適当である。
抗体はりガント（１）とリガンド（２）の共通の抗原決
定基に対するものでなければならない。この抗体にはＦ
（ａｂ’）、、 、 Ｆａｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラ
グメントも含まれる。
定基に対するものでなければならない。この抗体にはＦ
（ａｂ’）、、 、 Ｆａｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラ
グメントも含まれる。
抗体の製造方法としては、リガンド（１）、リガンド（
２）もしくは前記の結合物又はこれらのいずれかと蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の温血動物に体重１ ｋｇあたり０３〜２ ｍｇを１〜
数回背中皮下、フット・ぐラド、大腿筋等にアノ−バン
ドとともに注射して当該動物の体内に形成させる。この
抗体は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗体すな
わち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって精製
してから用いてもよい。
２）もしくは前記の結合物又はこれらのいずれかと蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の温血動物に体重１ ｋｇあたり０３〜２ ｍｇを１〜
数回背中皮下、フット・ぐラド、大腿筋等にアノ−バン
ドとともに注射して当該動物の体内に形成させる。この
抗体は血清をそのまま用いてもよく、血清から抗体すな
わち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって精製
してから用いてもよい。
一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアノ−バンドとともに数回腹腔等に注射し、牌臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアノ−バンドとともに数回腹腔等に注射し、牌臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。
検体に含まれるリガンド（１）と、前記の結合物とを溶
液中でこの抗体に接触させる。接触時の結合物の量は検
体中に予想されるリガンド（１）の最大量と同量程度が
よく、抗体は結合物との結合定数等によって異なるが例
えば結合物に対し１〜５倍モル程度がよい。リガンド（
１）の量は、例えば０．０１＋Ｊ〜１ ｍｇ程度が適当
であり、その場合、結合物はｌｎｇ 〜１ｍ９程度、そ
シテ抗体は］ １１ｇ 〜Ｉ Ｏ”Ｑ Ｆｉ！度が通常
適当である。溶液のＰＨは４〜８．５ ｆ！ｉｉ度にす
るのがよく、そのために必要により５、リン酸緩衝液、
酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。温度はりガン
ト責１）、結合物及び抗体のいずれもが失活しなければ
よいわけであるが、２０〜４５゛Ｃ程度にすればよい。
液中でこの抗体に接触させる。接触時の結合物の量は検
体中に予想されるリガンド（１）の最大量と同量程度が
よく、抗体は結合物との結合定数等によって異なるが例
えば結合物に対し１〜５倍モル程度がよい。リガンド（
１）の量は、例えば０．０１＋Ｊ〜１ ｍｇ程度が適当
であり、その場合、結合物はｌｎｇ 〜１ｍ９程度、そ
シテ抗体は］ １１ｇ 〜Ｉ Ｏ”Ｑ Ｆｉ！度が通常
適当である。溶液のＰＨは４〜８．５ ｆ！ｉｉ度にす
るのがよく、そのために必要により５、リン酸緩衝液、
酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。温度はりガン
ト責１）、結合物及び抗体のいずれもが失活しなければ
よいわけであるが、２０〜４５゛Ｃ程度にすればよい。
リガント責１）と抗体及び結合物と抗体との接触時間は
いずれも、通常は抗体が検体由来のりガント（１）ある
いは結合物中のりガント（２）部分と充分反応しうる程
度がよく、例えば３７Ｃの場合には２０〜６０分間程度
が適当である。抗体に対するリガンド（１）及び結合物
の接触順序は問うところではなく、いずれが先であって
もあるいは同時であってもよい。
いずれも、通常は抗体が検体由来のりガント（１）ある
いは結合物中のりガント（２）部分と充分反応しうる程
度がよく、例えば３７Ｃの場合には２０〜６０分間程度
が適当である。抗体に対するリガンド（１）及び結合物
の接触順序は問うところではなく、いずれが先であって
もあるいは同時であってもよい。
抗体と検体中のリガンド（１）及び結合物中のりがンド
（２）部分とは溶液中で接触させれば反応する。
（２）部分とは溶液中で接触させれば反応する。
次に、この結合物をビオチン酵素と接触せしめる。ビオ
チン酵素は活性中心にビオチン基をもっているものであ
って、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、アセチル
ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ
、メチルマロニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロ
ニルＣｏＡ ）ランスカルボキシラーゼ、メチルクロト
ニルＣｏＡカルボキシラーゼ等種々のものが知られてい
るが、そのいずれであっても用いることができる。ビオ
チン酵素は純品であってもよく、本発明の方法を阻害し
ない範囲で不純物を含んでいてもよい。ビオチン酵素の
量は結合物中のアビジン又はストレプトアビノンに対す
る結合定数等によって異なるが結合物に対するモル比で
例えば０．２〜２６５程度が適当である。ビオチン酵素
は要は反応後の結合物と接触させることができればよく
、その添加時期は問わない。すなわち、リガンド（１）
及び結合物を抗体に反応させる以前から溶液に添加して
おいてもよく、また、反応後に添加してもよい。
チン酵素は活性中心にビオチン基をもっているものであ
って、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、アセチル
ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ
、メチルマロニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロ
ニルＣｏＡ ）ランスカルボキシラーゼ、メチルクロト
ニルＣｏＡカルボキシラーゼ等種々のものが知られてい
るが、そのいずれであっても用いることができる。ビオ
チン酵素は純品であってもよく、本発明の方法を阻害し
ない範囲で不純物を含んでいてもよい。ビオチン酵素の
量は結合物中のアビジン又はストレプトアビノンに対す
る結合定数等によって異なるが結合物に対するモル比で
例えば０．２〜２６５程度が適当である。ビオチン酵素
は要は反応後の結合物と接触させることができればよく
、その添加時期は問わない。すなわち、リガンド（１）
及び結合物を抗体に反応させる以前から溶液に添加して
おいてもよく、また、反応後に添加してもよい。
反応後の結合物をビオチン酵素と接触させる際のＰＩ３
及び温度は結合物のアビノン等とビオチン酵素とが反応
しやすい範囲がよく、ＰＨは４〜８５秤度、そして、温
度は２０〜４５°Ｃ程度が適当である。また、接触時間
はビオチン酵素と結合物中のアビノン等との反応が充分
に行なわれる程度がよく、例えば３７℃の場合には１０
〜６０分間程度が適当である。
及び温度は結合物のアビノン等とビオチン酵素とが反応
しやすい範囲がよく、ＰＨは４〜８５秤度、そして、温
度は２０〜４５°Ｃ程度が適当である。また、接触時間
はビオチン酵素と結合物中のアビノン等との反応が充分
に行なわれる程度がよく、例えば３７℃の場合には１０
〜６０分間程度が適当である。
これらの接触を行なわせたのちには、ビオチン酵素の活
性を測定して結合物のアビノン等と反応しなかったビオ
チン酵素の量をめる。酵素活性の測定方法は公知の方法
に従って行なえばＪ−り、例エハグロビオニルＣｏＡカ
ルボキ７ラーゼの場合には反応系で生じるＡＤｐをピル
ビン酸キナーゼと乳酸デヒドロケ゛ナーゼにより共役さ
せ、その際のＮＡＤＨの減少として活性を測定できる。
性を測定して結合物のアビノン等と反応しなかったビオ
チン酵素の量をめる。酵素活性の測定方法は公知の方法
に従って行なえばＪ−り、例エハグロビオニルＣｏＡカ
ルボキ７ラーゼの場合には反応系で生じるＡＤｐをピル
ビン酸キナーゼと乳酸デヒドロケ゛ナーゼにより共役さ
せ、その際のＮＡＤＨの減少として活性を測定できる。
メチルマロニルＣｏＡ ｌ・ランスカルボキシラーゼの
場合には生成したオキザロ酢酸をリンコ″′酸デヒドロ
ケ８ナーゼの共役によってリンコゝ酸に変え、その際の
ＮＡＤＨの減少量を測定することによって活性値をめる
ことができる。
場合には生成したオキザロ酢酸をリンコ″′酸デヒドロ
ケ８ナーゼの共役によってリンコゝ酸に変え、その際の
ＮＡＤＨの減少量を測定することによって活性値をめる
ことができる。
また、フ０ロビオニルＣｏＡカル？キシラーゼを用いた
場合には、逆反応によってＡＴＰを生成させて、これを
ルシフェラーゼ及びルシフェリンの共存下で反応させる
と生物発光する。そこで、これをフォトカウンターで測
定することによって１０−１４Ｍ以下のＡＴＰを定量で
きる。この方法を用いればさらに極微量のリガント責１
）を定量することが可能である。
場合には、逆反応によってＡＴＰを生成させて、これを
ルシフェラーゼ及びルシフェリンの共存下で反応させる
と生物発光する。そこで、これをフォトカウンターで測
定することによって１０−１４Ｍ以下のＡＴＰを定量で
きる。この方法を用いればさらに極微量のリガント責１
）を定量することが可能である。
本発明の方法はアビノン、ストレプトアビジン及びこれ
らの誘導体をリガンド（２）と結合させてもビオチン酵
素に対する反応性が低下しないという新知見に基づいて
おり、このアビジン等とリガンド（２）との結合物を用
いることによって従来の方法より感度を飛躍的に向上さ
せることができた。本発明の方法は、そのほか操作が簡
便であり安価かつ容易にリガンド（１）を定量すること
が可能である。
らの誘導体をリガンド（２）と結合させてもビオチン酵
素に対する反応性が低下しないという新知見に基づいて
おり、このアビジン等とリガンド（２）との結合物を用
いることによって従来の方法より感度を飛躍的に向上さ
せることができた。本発明の方法は、そのほか操作が簡
便であり安価かつ容易にリガンド（１）を定量すること
が可能である。
以下、実施例を示す。
実施例１
１）アビジ結合物オフィリン結合物の調製３−プロピオ
ニルカルボキシテオフィリン５０■をジメチルスルホキ
シド５ ｍｉに懸濁し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
２５ｍ９を加えて４℃ニ冷却した。この混合物にジシク
ロヘキフル力ルｌ？ノイミド５０ｍＱを攪拌しつつ加え
、２時間攪拌後４°Ｃで一夜放置した。沈澱物を戸別し
、Ｐ液から溶媒を減圧下で留去した。残渣に食間゛のエ
ーテルを加え、結晶化物をグラスフィルターで集めてエ
ーテルで洗浄した。これによりテオフィリンザクシンイ
ミドエステル３０ｍ夕を得た。
ニルカルボキシテオフィリン５０■をジメチルスルホキ
シド５ ｍｉに懸濁し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
２５ｍ９を加えて４℃ニ冷却した。この混合物にジシク
ロヘキフル力ルｌ？ノイミド５０ｍＱを攪拌しつつ加え
、２時間攪拌後４°Ｃで一夜放置した。沈澱物を戸別し
、Ｐ液から溶媒を減圧下で留去した。残渣に食間゛のエ
ーテルを加え、結晶化物をグラスフィルターで集めてエ
ーテルで洗浄した。これによりテオフィリンザクシンイ
ミドエステル３０ｍ夕を得た。
一方、アビノン２０ ｍ’；）をＯ，Ｉ Ｍ炭酸緩衝液
（ｐｌ＋８、Ｑ）４ｍ６に溶かし、上記のテオフィリン
ザクノンイミドエステルのジメチルスルホキシド溶液２
、０ ｍ９／ｍｅを２００μ！加えて室温で２時間１η
拝して反応させた。反応液を予めｐｌ＋ ７．０の２０
ｍＭ’Ｊンｒ）ｙ緩衝生理食塩溶液で平衡化しておいた
セファデックスＧ−２５のカラムに流し、流出液の波長
２８０ｎｍにおける吸光度を測定して流出してくる最初
のピーク区分を集めて凍結乾燥し、テオフィリン−アビ
ノン結合物を得た。
（ｐｌ＋８、Ｑ）４ｍ６に溶かし、上記のテオフィリン
ザクノンイミドエステルのジメチルスルホキシド溶液２
、０ ｍ９／ｍｅを２００μ！加えて室温で２時間１η
拝して反応させた。反応液を予めｐｌ＋ ７．０の２０
ｍＭ’Ｊンｒ）ｙ緩衝生理食塩溶液で平衡化しておいた
セファデックスＧ−２５のカラムに流し、流出液の波長
２８０ｎｍにおける吸光度を測定して流出してくる最初
のピーク区分を集めて凍結乾燥し、テオフィリン−アビ
ノン結合物を得た。
１１）テオフィリンの定量
チオ７（リンの濃度がＯｔｔＦ／／ｍｌ 、 ５ μｇ
／ｍｉ 、 １０μｇ７ｍｌ 、 ２０ μｇ／ｍｌ
、 ４０ ｔｔｇ／ｍｌ 、 ８０ ｔｔｇ／ｍｌ （
Ｄ各５１１Ｂの溶液にテオフィリン−アビノン結合物２
０μｋ及び抗テオフィリンウキギＩｇＧ溶液２５μ！を
加えた。
／ｍｉ 、 １０μｇ７ｍｌ 、 ２０ μｇ／ｍｌ
、 ４０ ｔｔｇ／ｍｌ 、 ８０ ｔｔｇ／ｍｌ （
Ｄ各５１１Ｂの溶液にテオフィリン−アビノン結合物２
０μｋ及び抗テオフィリンウキギＩｇＧ溶液２５μ！を
加えた。
この混合物を室温で３０分間放置後、プロピオニルＣｏ
Ａカルボキシラーゼ溶液を１００μｆづつ加えて３７°
Ｃで１５分間放置した。
Ａカルボキシラーゼ溶液を１００μｆづつ加えて３７°
Ｃで１５分間放置した。
次に、４ｍＭＭｇＣｔ２．２ｍＭグルタチオン（還元型
）、２ ｍＭ ＡＴＰ 、 ０． Ｉ ＭＫＣｔ、 ５
Ｑ ｍＭ炭酸水素カリウム、１ｍＭホスホエノールピ
ルビン酸、２５００Ｕμピルビン酸キナーゼ、３５００
Ｕμ乳酸デヒド、：ｌゲナーゼ、０．１５ ｍＭ ＮＡ
ＤＨ、及び２ ｍＭプロピオニルＣｏＡを含むＰＨ８，
０の基質溶液Ａを１、２ ｍＩｉづつ加え、３７℃で波
長３４０ ｎｍにおける吸光度を測定し、テオフィリン
の濃度とプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼの活性と
の関係をめた。
）、２ ｍＭ ＡＴＰ 、 ０． Ｉ ＭＫＣｔ、 ５
Ｑ ｍＭ炭酸水素カリウム、１ｍＭホスホエノールピ
ルビン酸、２５００Ｕμピルビン酸キナーゼ、３５００
Ｕμ乳酸デヒド、：ｌゲナーゼ、０．１５ ｍＭ ＮＡ
ＤＨ、及び２ ｍＭプロピオニルＣｏＡを含むＰＨ８，
０の基質溶液Ａを１、２ ｍＩｉづつ加え、３７℃で波
長３４０ ｎｍにおける吸光度を測定し、テオフィリン
の濃度とプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼの活性と
の関係をめた。
得られた結果を第１図に示す。
次に、各種のヒト血清をアビノン結合がラスビーズに懸
濁し、２０分後にその上清５μｆづつを用いて上記と同
様に測定を行ない、第１図を検晴紳としてテオフィリン
の濃度を測定した。一方、これに並行して従来法である
ＲＴＡ法を用いて同じヒト血清のテオフィリン濃度を測
定した。
濁し、２０分後にその上清５μｆづつを用いて上記と同
様に測定を行ない、第１図を検晴紳としてテオフィリン
の濃度を測定した。一方、これに並行して従来法である
ＲＴＡ法を用いて同じヒト血清のテオフィリン濃度を測
定した。
得られた結果を下表に示す。
テオフィリン濃度
Ａ ５．１ ｍｇ／ｍ１ ４．９ ｍｔＪ／ｍｉＢ １
１．６ １０．８ Ｃ１７，６１８，２ Ｄ ３．１ ４．０ Ｅ ７． ｓ ７．９ 尚、アビノン結合ガ°ラスビーズは次のようにして調製
した。すなわち、アミノ化ガラスピーズを２係グルタル
アルデヒド溶液に浸漬して４℃で２時間放置し、０１Ｍ
Ｎａ２ＣＯ３溶液ｐｌ−１ｇ、 ０で洗浄した。
１．６ １０．８ Ｃ１７，６１８，２ Ｄ ３．１ ４．０ Ｅ ７． ｓ ７．９ 尚、アビノン結合ガ°ラスビーズは次のようにして調製
した。すなわち、アミノ化ガラスピーズを２係グルタル
アルデヒド溶液に浸漬して４℃で２時間放置し、０１Ｍ
Ｎａ２ＣＯ３溶液ｐｌ−１ｇ、 ０で洗浄した。
続いて、０１係アビノンを含む０． ］、 Ｍ Ｎａ２
Ｃｏ３溶液Ｐｌ−１ｇ、 ０に浸して４℃で一夜放置し
、１． ％ ＢＳＡを含む０．０２ Ｍ リン酸緩衝生
理食塩溶液で洗浄してさらにこの溶液に浸してアビソン
結合ガラスビーズを得た。
Ｃｏ３溶液Ｐｌ−１ｇ、 ０に浸して４℃で一夜放置し
、１． ％ ＢＳＡを含む０．０２ Ｍ リン酸緩衝生
理食塩溶液で洗浄してさらにこの溶液に浸してアビソン
結合ガラスビーズを得た。
実施例２
１）ＳＨ化ストし７’トアビノンの調製ストレプトアビ
ノン５ｍｇをｌ ｍ１３の０．１ Ｍリン酸緩衝５ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ溶液ＰＨ７，５に溶かし、これに９．６ｍ
、Ｑ／ｍｌ、のＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
のノオキサン溶液１００μｋを加えて、３７°Ｃで１時
間反応させた。続いて、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（
ｐＨ７，５）を１１０μＬ加え、さらに３７°Ｃで３０
分間反応させた。この反応液を０．１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ６，３で予め平衡化した
セファデックスＧ−２５カラムに流してケゝルｐ過し、
素通り分画を分取して目的のＳＨ化ストレプトアビノン
を得た。
ノン５ｍｇをｌ ｍ１３の０．１ Ｍリン酸緩衝５ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ溶液ＰＨ７，５に溶かし、これに９．６ｍ
、Ｑ／ｍｌ、のＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
のノオキサン溶液１００μｋを加えて、３７°Ｃで１時
間反応させた。続いて、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（
ｐＨ７，５）を１１０μＬ加え、さらに３７°Ｃで３０
分間反応させた。この反応液を０．１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝１ ｍＭ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ６，３で予め平衡化した
セファデックスＧ−２５カラムに流してケゝルｐ過し、
素通り分画を分取して目的のＳＨ化ストレプトアビノン
を得た。
１１）インシュリン−ストレプトアビノン結合物のＮ８
製 インシーリン５ ｍＱをＰＨ６，３の０．１Ｍリン酸緩
衝液１ ｍｌに溶解し、これ［４−（マレイミドメチル
シクロヘキサン−１−カルボン酸）サクゾフイミドエス
テ＃ （ＣＩ（ＭＳ ） ０．２ ｍＱをジオキサン’
１００ μｉに溶かした溶液を加えた。３７°Ｃにて１
時間１７ノ、押抜セフ、・デックスＧ−２５を用いてケ
゛ルｐ過し、未反応のＣＨＭＳを除去した。ＣＨＭ化イ
フィンシュリンラムを素通りしてくるのでこれを集め、
先ＶＣ調製したＳ Ｉ−Ｉ化ストレフ０トアビソンを加
えた。混合物を１ ｍｌまで濃縮し、３０°Ｃで１時間
加温後セファデックスＧ−２００でケ゛ル濾過して目的
の結合物を得た。
製 インシーリン５ ｍＱをＰＨ６，３の０．１Ｍリン酸緩
衝液１ ｍｌに溶解し、これ［４−（マレイミドメチル
シクロヘキサン−１−カルボン酸）サクゾフイミドエス
テ＃ （ＣＩ（ＭＳ ） ０．２ ｍＱをジオキサン’
１００ μｉに溶かした溶液を加えた。３７°Ｃにて１
時間１７ノ、押抜セフ、・デックスＧ−２５を用いてケ
゛ルｐ過し、未反応のＣＨＭＳを除去した。ＣＨＭ化イ
フィンシュリンラムを素通りしてくるのでこれを集め、
先ＶＣ調製したＳ Ｉ−Ｉ化ストレフ０トアビソンを加
えた。混合物を１ ｍｌまで濃縮し、３０°Ｃで１時間
加温後セファデックスＧ−２００でケ゛ル濾過して目的
の結合物を得た。
１１１）インシーリンの定量
’ｒ７’／−＋）ンの濃度が０１’Ｕ／ｍｌ、 Ｉ Ｏ
ｔｄｌ、＊６．２゜１’Ｕ／Ｍｌ、４０ ｐＩＪ／ｍｌ
、８０ ｔｔＵ／ｍｉ、１６０ ｔｔＵ／ｍｅ及び３２
０μＵ／ｍ６の溶液を各２０μｊ宛試験管にとり、これ
に各々２０μｇのインシーリン−ストレグ！・アビノン
結合物を含む５０μにの溶液を加えた。次いで、抗イン
シュリンモルモッ）ＩｇＧ溶ｒ＆ ５０ ｌｔＺを加え
、３７℃で３０分間加温後、各々に４０ ／Ｚｇのメチ
ルマロニルＣｏＡ ）ランスカルボキシラーゼヲ含ｔｒ
５０μ！の溶液を加えて３７℃で１０分間加温した。
ｔｄｌ、＊６．２゜１’Ｕ／Ｍｌ、４０ ｐＩＪ／ｍｌ
、８０ ｔｔＵ／ｍｉ、１６０ ｔｔＵ／ｍｅ及び３２
０μＵ／ｍ６の溶液を各２０μｊ宛試験管にとり、これ
に各々２０μｇのインシーリン−ストレグ！・アビノン
結合物を含む５０μにの溶液を加えた。次いで、抗イン
シュリンモルモッ）ＩｇＧ溶ｒ＆ ５０ ｌｔＺを加え
、３７℃で３０分間加温後、各々に４０ ／Ｚｇのメチ
ルマロニルＣｏＡ ）ランスカルボキシラーゼヲ含ｔｒ
５０μ！の溶液を加えて３７℃で１０分間加温した。
各々にピルビン酸５ｍＭ、リンコ″酸デヒドロヶ゛ナー
ゼ２０００ Ｕ／Ａ、ＮＡＤＨ０，２５ｍＭ及びメチル
マロニルＣｏＡ ３ ｍＭを含むｐＨ７，２の５ Ｑ
ｍＭ ）リス−塩酸緩衝溶液１． □ ｍｌ宛加えて波
長３４０ ｎｍにおける吸光度を測定して、インシュリ
ンの濃度とメチルマｏ ＝ ／ｌ／ ＣｏＡ ｌ・ラン
スカル？キシラーゼ活性（！：（７） ｑ係をめた。
ゼ２０００ Ｕ／Ａ、ＮＡＤＨ０，２５ｍＭ及びメチル
マロニルＣｏＡ ３ ｍＭを含むｐＨ７，２の５ Ｑ
ｍＭ ）リス−塩酸緩衝溶液１． □ ｍｌ宛加えて波
長３４０ ｎｍにおける吸光度を測定して、インシュリ
ンの濃度とメチルマｏ ＝ ／ｌ／ ＣｏＡ ｌ・ラン
スカル？キシラーゼ活性（！：（７） ｑ係をめた。
得られた結果を第２図に示す。
各種ヒト血清に予めアビジン結合ガラスピーズに加えて
３７℃で５分間処理後遠心して得た上清について上記と
同様に測定を行ない、第２図を検量線としてインシュリ
ンの濃度を測定した結果を下表に示す。従来法であるＲ
ＩＡ法で測定した結果も併せて同表に示す。
３７℃で５分間処理後遠心して得た上清について上記と
同様に測定を行ない、第２図を検量線としてインシュリ
ンの濃度を測定した結果を下表に示す。従来法であるＲ
ＩＡ法で測定した結果も併せて同表に示す。
インシュリン濃度
血清 本発明法 ＲＩＡ法
１ ９、５１１Ｕ／ｍｌ ９．０ μＵ／ｍｔ２ ２７
２６ ３ １１０ １０７ ４ ２６ ２２ ５ ２４１ ２３０ 実施例３ １）アビノン−ジゴキシン結合物の調製ノコゝキシン５
ｍＱをエタノール０．３ ｍｅに懸濁し、これに０．
３ ｍｌの０．１ Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムを加え
て室温で２５分間攪拌した。１Ｍエチレングリコール６
μｋを加え、５分後にアビノン５ ｍＬ！ヲ３００μに
の０．１ Ｍ炭酸緩衝液ｐＨｇ、 ５に溶かして加えた
。ＰＨを９０に維持し、４５分後に３１ｎｑのＮａ Ｂ
）Ｉ、、を加えて３時間攪拌した。１Ｍ蟻酸を加えてＰ
Ｈ６，５とし、１時間攪拌してからＩ Ｍ Ｎ１−Ｉ、
、ＯＨを加えてＰＨ８，５とした。この溶液を２０ ｍ
Ｍリン酸緩衝生理食塩溶液に対して透析して目的のアビ
ノン−ジゴキシン結合物５ ｍｇを得た。
２６ ３ １１０ １０７ ４ ２６ ２２ ５ ２４１ ２３０ 実施例３ １）アビノン−ジゴキシン結合物の調製ノコゝキシン５
ｍＱをエタノール０．３ ｍｅに懸濁し、これに０．
３ ｍｌの０．１ Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムを加え
て室温で２５分間攪拌した。１Ｍエチレングリコール６
μｋを加え、５分後にアビノン５ ｍＬ！ヲ３００μに
の０．１ Ｍ炭酸緩衝液ｐＨｇ、 ５に溶かして加えた
。ＰＨを９０に維持し、４５分後に３１ｎｑのＮａ Ｂ
）Ｉ、、を加えて３時間攪拌した。１Ｍ蟻酸を加えてＰ
Ｈ６，５とし、１時間攪拌してからＩ Ｍ Ｎ１−Ｉ、
、ＯＨを加えてＰＨ８，５とした。この溶液を２０ ｍ
Ｍリン酸緩衝生理食塩溶液に対して透析して目的のアビ
ノン−ジゴキシン結合物５ ｍｇを得た。
１１）ジゴキシンの定量
ジゴキシンの濃度が０ 、０．１ 、０．５ 、 Ｊ−
、５及び１０ｎ９／ｍ、１．の溶液各ＪＯμＬに前記の
アビノン−ジゴキシン結合物５ ｔｔｇを含む溶液２０
μ！及び抗ノゴキゾンウサギＩｇＧ １０μｇを含む溶
液２０ ／ｌＡを加え、さらにトランスカルボキシラー
ゼ３μ、９ヲ、ＩＪＩＩえて３７℃で１時間加温した。
、５及び１０ｎ９／ｍ、１．の溶液各ＪＯμＬに前記の
アビノン−ジゴキシン結合物５ ｔｔｇを含む溶液２０
μ！及び抗ノゴキゾンウサギＩｇＧ １０μｇを含む溶
液２０ ／ｌＡを加え、さらにトランスカルボキシラー
ゼ３μ、９ヲ、ＩＪＩＩえて３７℃で１時間加温した。
プロピオニルＣｏＡ２ ｍ ｍｏ ｌ／Ｂ 、オキザロ
酢酸３０ ｍｍｏ／！、／Ａ 、 ＮＡＤＨＯ，２ｍｍ
ｏｌμ、ラクテートデハイドロケ８ナーゼ２０００ＵＡ
ｎｉ及び０１Ｍトリス−ＨＣｔを含有するＰｌ−Ｉ ７
．５の基質溶液１． Ｑ ｍｌを加え、３７℃で波長３
４０ ｎｍにおける吸光度の減少をレートアッセイして
酵素活性を測定した。得られた結果を第３図に示す。
酢酸３０ ｍｍｏ／！、／Ａ 、 ＮＡＤＨＯ，２ｍｍ
ｏｌμ、ラクテートデハイドロケ８ナーゼ２０００ＵＡ
ｎｉ及び０１Ｍトリス−ＨＣｔを含有するＰｌ−Ｉ ７
．５の基質溶液１． Ｑ ｍｌを加え、３７℃で波長３
４０ ｎｍにおける吸光度の減少をレートアッセイして
酵素活性を測定した。得られた結果を第３図に示す。
予めアビジンを結合したセファロース４Ｂを充填したカ
ラムに通したヒト血清について上記と同様に測定を行な
い、第３図を検母線としてノコゞキ／ン濃度を測定した
結果を下表に示す。従来法であるＲＩＡ法で測定した結
果も併せて同表に示す。
ラムに通したヒト血清について上記と同様に測定を行な
い、第３図を検母線としてノコゞキ／ン濃度を測定した
結果を下表に示す。従来法であるＲＩＡ法で測定した結
果も併せて同表に示す。
ノボキシン濃度
血清 本発明法 ＲＩＡ法
Ａ ０．３５ ｎｇ、Ａｎｉ ０．３２ ｎｇＡ６Ｂ
Ｏ，８１０，９０ Ｃ１，２０１，１１ Ｄ、 ２，２４ ２．３６ Ｅ Ｏ，１５０，１３ 尚、アビノン結合セファロース４Ｂは次のようにして調
製した。すなわち、ＣＮＢ ｒ活性化セファロース（フ
ァルマシアケミカル社製）５．！９を１ｍＭ塩酸５００
ｍｅで洗浄し、０．２ Ｍ ＮａＨＣＯ３−０，５Ｍ
ＮａＣｔ溶液ＰＨ８，０でさらに１回洗浄した。これを
１幅了ビジンを含有する。、 Ｉ Ｍ ＮａＴ（Ｃｏ
３ｏ、 ５ Ｍ ＮａＣ１溶ｇｐ。
Ｏ，８１０，９０ Ｃ１，２０１，１１ Ｄ、 ２，２４ ２．３６ Ｅ Ｏ，１５０，１３ 尚、アビノン結合セファロース４Ｂは次のようにして調
製した。すなわち、ＣＮＢ ｒ活性化セファロース（フ
ァルマシアケミカル社製）５．！９を１ｍＭ塩酸５００
ｍｅで洗浄し、０．２ Ｍ ＮａＨＣＯ３−０，５Ｍ
ＮａＣｔ溶液ＰＨ８，０でさらに１回洗浄した。これを
１幅了ビジンを含有する。、 Ｉ Ｍ ＮａＴ（Ｃｏ
３ｏ、 ５ Ｍ ＮａＣ１溶ｇｐ。
８．０に懸濁し、室温で２時間攪拌した。こうして得ら
れた目的のデルをＱ、 ２ Ｍ ＋−’Ｊスー塩酸緩Ｓ
液ｐＨＢ、５で洗−浄して、１係ＢＳＡを含有する０、
１ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液ＰＨ８，０中に保存した
。
れた目的のデルをＱ、 ２ Ｍ ＋−’Ｊスー塩酸緩Ｓ
液ｐＨＢ、５で洗−浄して、１係ＢＳＡを含有する０、
１ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液ＰＨ８，０中に保存した
。
実施例４
ｉ） ＣＨＭ化α−フェトプロティンの調製α−フェト
プロティン５ ｍｇを１． ｍｌの０．１ Ｍす／酸緩
衝液ｐ！（６，３Ｋ溶か゛し、これに２ ｎｒｑ／ｍｌ
のＣＨｆＶＩＳのツメチルホルムアミド溶液１．００μ
ｋを加えて３０℃で１時間反応させた。反応液をｌ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．１ Ｍ ！ｊン酸緩衝液Ｐｔ（
６，３で平衡化したセファデックスＧ−２５のカラムに
流して、ＣＨＭ化α−フェトプロテインを含む素通り分
画を得た。
プロティン５ ｍｇを１． ｍｌの０．１ Ｍす／酸緩
衝液ｐ！（６，３Ｋ溶か゛し、これに２ ｎｒｑ／ｍｌ
のＣＨｆＶＩＳのツメチルホルムアミド溶液１．００μ
ｋを加えて３０℃で１時間反応させた。反応液をｌ ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．１ Ｍ ！ｊン酸緩衝液Ｐｔ（
６，３で平衡化したセファデックスＧ−２５のカラムに
流して、ＣＨＭ化α−フェトプロテインを含む素通り分
画を得た。
ｉｉ） ＳＨ化ストレプトアビソンの調製ストレプトア
ビノン５ ｍＬ２を５ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０、１
Ｍ ＋、１ン酸緩衝液ｐＨ７，５に溶かし、これに９ｍ
９／ｍｌのＳ−アセチルメルカプトコノ１り酸無水物の
ツメチルホルムアミド溶液］ ００ ｔｔＡを加えて３
７℃で１時間加温した。続いて、ｐＨ７，５のＩＭＮＩ
−１２０Ｈを１１０μ！加え、さらに３７°Ｃで３０分
間加温した。この液をセファデックスＧ−２５カラムで
ケ゛ル濾過し、素通り分画を集めてＳＨ化ストレプトア
ビソンを得た。
ビノン５ ｍＬ２を５ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０、１
Ｍ ＋、１ン酸緩衝液ｐＨ７，５に溶かし、これに９ｍ
９／ｍｌのＳ−アセチルメルカプトコノ１り酸無水物の
ツメチルホルムアミド溶液］ ００ ｔｔＡを加えて３
７℃で１時間加温した。続いて、ｐＨ７，５のＩＭＮＩ
−１２０Ｈを１１０μ！加え、さらに３７°Ｃで３０分
間加温した。この液をセファデックスＧ−２５カラムで
ケ゛ル濾過し、素通り分画を集めてＳＨ化ストレプトア
ビソンを得た。
ｉｉｉ ） α−フェトフ０ロテインーストレグトアビ
ノン結合物の調製 り ｆ 得ｆｃ ＣＨＭ化α−フェトプロティンを含む
素通り分画と１１）で得たＳＨ化ストレプトアビノンを
含む素通り分画を混合して１ｍ１ｉで濃縮し、３７℃で
１時間加温した。セファデックスＧ−１５０を用いてケ
゛ル濾過し、素通あ分画を集めて目的の結合物を得た。
ノン結合物の調製 り ｆ 得ｆｃ ＣＨＭ化α−フェトプロティンを含む
素通り分画と１１）で得たＳＨ化ストレプトアビノンを
含む素通り分画を混合して１ｍ１ｉで濃縮し、３７℃で
１時間加温した。セファデックスＧ−１５０を用いてケ
゛ル濾過し、素通あ分画を集めて目的の結合物を得た。
１い α−フェトプロティンの測定
α−フェトプロティンの濃度がＱ、０．５，２゜８ 、
５０ 、２００及び１０００ ｎｇ／ｍｌの溶液釜２０
ｐｉを試験管にとり、これに１１１）で調製したα−
フェトプロティン〜ストレフ０トアピノン結合’Ｊ’ｌ
Ｊ １０００ｎｌ／ｍｌ及び抗α−フェトプロティンヤ
ギ抗体２４．Ｉｎｅを含む液２０μｆを加えた。これに
、さらに１０μｊｊ／ｍｌのピルビン酸カルボギシラー
ゼ溶液５０ ｔｔβを加え、３７℃で１時間加温した。
５０ 、２００及び１０００ ｎｇ／ｍｌの溶液釜２０
ｐｉを試験管にとり、これに１１１）で調製したα−
フェトプロティン〜ストレフ０トアピノン結合’Ｊ’ｌ
Ｊ １０００ｎｌ／ｍｌ及び抗α−フェトプロティンヤ
ギ抗体２４．Ｉｎｅを含む液２０μｆを加えた。これに
、さらに１０μｊｊ／ｍｌのピルビン酸カルボギシラー
ゼ溶液５０ ｔｔβを加え、３７℃で１時間加温した。
次に、４ ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭ ＡＤＰ、］ＯｍＭ
オキザロ酢酸、１０ｍＭピロリン酸及び０．１ Ｍ Ｋ
Ｃｔを含む０１Ｍトリス−塩酸緩衝液ＰＨ７，８を基質
溶液として加えて３７℃で２０分間反応させ、１０μｉ
／ｍｌのアビジン溶液１００μ！を加えて反応を停止さ
せた。との液４００１ｔ７にルシフェリンルシフェラー
ゼ溶液１００μｋを加えて５６５ ｎｍにおける発光量
を測定した。
オキザロ酢酸、１０ｍＭピロリン酸及び０．１ Ｍ Ｋ
Ｃｔを含む０１Ｍトリス−塩酸緩衝液ＰＨ７，８を基質
溶液として加えて３７℃で２０分間反応させ、１０μｉ
／ｍｌのアビジン溶液１００μ！を加えて反応を停止さ
せた。との液４００１ｔ７にルシフェリンルシフェラー
ゼ溶液１００μｋを加えて５６５ ｎｍにおける発光量
を測定した。
得られた結果を第４図に示す。
第１図はテオフィリンについて、第２図はインシュリン
について、第３図はノコゝキ／ンについて、そして第４
図はα−フェトプロティンについて、いずれもその濃度
と酵素活性との関係を示している。 第１図 インシュ′ｌン／ＰＷｍ１ 第３図 第４図
について、第３図はノコゝキ／ンについて、そして第４
図はα−フェトプロティンについて、いずれもその濃度
と酵素活性との関係を示している。 第１図 インシュ′ｌン／ＰＷｍ１ 第３図 第４図
Claims (1)
- 検体に含まれる抗原決定基具有物質（１）と、この抗原
決定基具有物質（１）と少なくとも−の抗原決定基を共
通にする抗原決定基具有物質（２）とアビジン、ストレ
プトアビジン又はこれらの誘導体との結合物とを、溶液
中で前記の共通の抗原決定基と反応する抗体と接触せし
めて反応させ、この結合物をビオチン酵素と接触せしめ
、その後ビオチン酵素の活性を測定することを特徴とす
る抗原決定基具有物質の測定法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11435783A JPS607362A (ja) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法 |
| EP84304093A EP0132292A3 (en) | 1983-06-27 | 1984-06-18 | Method of measuring biological ligands |
| ES533715A ES8601309A1 (es) | 1983-06-27 | 1984-06-26 | Un metodo de medir un ligando biologico |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11435783A JPS607362A (ja) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS607362A true JPS607362A (ja) | 1985-01-16 |
Family
ID=14635698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11435783A Pending JPS607362A (ja) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0132292A3 (ja) |
| JP (1) | JPS607362A (ja) |
| ES (1) | ES8601309A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0170652A1 (en) * | 1984-01-27 | 1986-02-12 | Molecular Biosystems, Inc. | Assay for immobilized reporter groups |
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