JPS63159759A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、例えば血も門、尿などに含まれる薬物あるい
は各種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関
するものである。

血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析は病気の
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であシ
、日常の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれておシ、そのなかに
は、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質あるい
は構造の近似した物質なども含まれていることも多い。

そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで定
量しうろことが要求される。さらに、日常検査として利
用されるために、簡便かつルーチン化しうることが望ま
しい。

（従来技術） これまで酵素免疫測定法はその標識法の改良あるいは酵
素の選択、基質の改良により飛躍的に感度が上昇し、そ
の感度はラジオイムノアッセイを超えるまでに発展した
。一般的には検体の測定対象物を抗体もしくは抗原を結
合せしめた固相と接触させ、次に酵素標識された測定対
象物と反応する抗体を反応せしめて固定化し洗浄を数回
くシ返し未反応の該酵素標識抗体を完全に除去して、固
相に結合した標識酵素の活性を測定するものである。

（発明が解決しようとする問題点） この洗浄の操作は非常に繁雑で、ルーチン化することか
難かしい。さらにこの洗浄によシ検体に含まれる感染性
の細菌もしくはウィルス等の飛散を起こし、測定実施者
の感染を引き起こすことが心配される。さらにこの洗浄
によシ時間もよシ長くかかる等の問題があった。

（問題を解決するための手段） 本発明はこれらの問題点を解決した新規な酵素免疫測定
法である。

この洗浄という操作を除くために本発明は固相に結合し
なかった未反応の酵素標識抗体もしくは酵素標識抗原の
酵素をこの酵素の阻害剤を結合せしめた不溶化物に接触
せしめることによシその活性を消失させるものである。

これによシ洗浄と同じ効果を得ることができる。すなわ
ち、異なる固相に分別され九阻害剤は未反応の標識酵素
とのみ結合しその活性を消失させ、一方の標識物が結合
した固相の活性は保持せしめることができる。可溶化さ
れた阻害剤を用いた場合この阻害剤は未反応及び反応し
た標識物中の酵素の両方と反応して両方とも活性を失っ
てしまうため、使用できない。

本発明で使用する阻害剤は標識酵素の活性を消失せしめ
るものであシ、特に非拮抗阻害型のインヒビターが良い
。その例として、アミラーゼに対する小麦由来インヒビ
ター細菌由来のアミラーゼインヒビターがあげられる。

これらは、阻害定数Ｋｉが１０−８オーダーでその使用
量は極めて少なくてよい。また酵素に対する抗体の多く
は本発明における酵素阻害剤として使用することができ
る。

その例を以下に示す。

抗醪素抗体　　　　　　　標識酵素 抗カルゲキシラーゼ抗体　　　　　カル２キシラーゼ抗
Ｇ６ＰＤＨ抗体　　　　　　　　　Ｇ６ＰＤＨ抗αグリ
セロホスファターゼ抗体　α−グリセロホスファターゼ
抗へキソキナーゼ抗体　　　　　　へキンキナーゼ抗ア
ミラーゼ抗体　　　　　　　　アミラーゼ抗βガラクト
シダーゼ抗体　　　　β−ガラクトシダーゼ酵素阻害剤
と標識酵素の組み合わせの例を以下に示す。

標識酵素　　　　　　酵素阻害剤 トリ／シン　　　　　　　　ダイズ由来トリグシンイン
ヒビターノ９−オキシダーゼ　　　　　０−ジアニシジ
ンデキストランプロピオニルＬｏＡ　　　　　　アビジ
ンカルゲキシラーゼ　　　　　ストレグトアピゾンビル
ペート力ル〆キシ　　　アビジン ラーゼ　　　　　　　　　　ストレグトアビゾントロン
ピン　　　　　　　　α−アンチトリプシンここに述べ
た酵素以外のものでも細菌培養によシタン・ダク性のイ
ンヒビターを得ることができる。

阻害剤を固定化する同相としては単位体積当シの阻害剤
の結合量の高いものを使用するのが好ましく、例えばデ
キストラングルが好適である。最近は多くのタイプのグ
ルが市販されておりその結合量は１ｒＩＬｌ当シ５〜１
０ダにも及ぶ。これらはすでに活性化されているものが
多い。ＣＮＢｒセファロースがその一つであシ、グルの
ためボア内の保持容量が極めて大きい。外面に対しボア
内部の結合量は９０１程度に達している。本発明では不
溶化物の外面よシも内面に阻害剤を結合できるものが好
ましい。外面では一部が標識物を結合した固相と反応し
て、本来測定される標識酵素活性も阻害してしまうこと
があるため、得られた測定値がバラツキや不正確さを生
じることもある。

メンブランフィルタ−も固定化の固相としてすぐれてお
シ、活性化された膜を入手することができる。この場合
メンブランフィルタ−の耐久性の高いものが好ましい。

以下にその例を示す。

ニトロセルロースフィルター セルロースアセテートフィルター 濾紙 グラスファイバーフィルター さらに、酵素阻害剤分子中のアミノ基あるいは、カルボ
キシル基の荷電を利用して、イオン交換樹脂やイオン交
換膜に結合させて固定化しても良い。

これらグルや樹脂等の固相と酵素阻害剤の結合法は両者
の官能基を利用して行えばよい。例えばアミノ基、カル
♂キシル基、水酸基等をジアルデヒド、／ｆラキノン、
ジフルオロベンゼン、ジイソシアネートなどを用いて結
合せしめる。固定化物が特別の官能基を有していない場
合にはアミノ基やカルメキシル基を導入することによシ
容易に結合させることができる。

通常、酵素免疫測定法はコンペテイテイプアツセイとサ
ンドイッチアッセイの２つに分類される。

コンペティティプアツセイは検体の抗原と標識抗原もし
くは固相に固定化された抗原と検体中の抗原のその抗原
に対する抗体との競争反応を利用して通常は、以上のよ
うに反応を進める。固定化された抗体固相に検体及び標
識抗原を加えて抗原。

抗体反応させた後、未反応標識抗原を洗浄により除去す
る。そして固相と反応した標識物の活性を測定するもの
であシ、また抗原を固定化した測定法では、検体及び固
定化抗原に酵素標識抗体を加え、一定時間反応後未反応
の標識抗体を洗浄によシ除去し、固相に結合した標識酵
素の活性を測定するものである。

サンドイッチアッセイにはワンステップ法とツーステッ
プ法があシ、ワンステツブアッセイでは。

抗体を固定化した固相と検体及び酵素標識抗体とを同時
に反応させ、一定時間後反応しなかった標識抗体を洗浄
によシ除去し、固相の酵素活性を測定するものである。

またツーステップアッセイでは上記の反応においてまず
抗体固定化物と検体を反応させ、一定時間後に未反応の
検体中の抗原を洗浄によシ除去し、次に酵素標識抗体を
反応させ、一定時間後に洗浄によシ未反応の標識抗体を
除去し、固相の酵素活性を測定する。

以上説明したごとく、゛通常の酵素免疫測定法は、液相
に残存する未反応酵素標識抗原もしくは未反応酵素標識
抗体を固液分離および洗浄によって測定系外に除去する
ことによシ固相結合した標識酵素の活性のみを測定する
ことによシ行なわれる。

つまり固液分離と洗浄が不可欠である。

本発明は、との固液分離および洗浄操作を全く必要とし
ない。即ち、本発明によれば、上記通常の酵素免疫測定
の固液分離、洗浄操作に替え、酵素阻害剤の固定化物を
接触させることによシ、未反応標識抗原もしくは未反応
標識酵素の活性を消失せしめることができるので、固液
分離および洗浄を行うことなく固相に結合した標識＃虞
の活性のみを測定することができる。酵素阻害剤の固定
化物の添加は、抗原抗体反応が完了した後に行う。

酵素活性測定用の基質添加と同時でもよいが、その前に
添加しておくのがよい。

酵素活性測定時の反応温度は４〜４０℃で行えばよく、
特に、室温ないしは３７℃が好ましい。

以下、実施例によシ本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ １−１　ブタ膵臓アミラーゼとテオフィリン繍合物の作
製 ８−プロビルカルゲキシテオフイリン１０η及びＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミド５Ｉｎ９をジメチルホルムアミ
ド５００μｌに溶かし、これに水溶性カメジイミド（Ｅ
ＤＣ）１０Ｉｎｇを加え室温にて３時間攪拌した。この
反応液２００μｌを予め０．１Ｍグリセロリン酸及び１
チデンデンを溶かした０、５俤ブタ膵臓アミラーゼ溶液
（ｐＨ７，５）２ｍに加え、室温にて２時間放置した。

次にこの反応液を２０　ｍＭグリセロリン酸ｐＨ７，０
に平衡化したセファデックスＧ−２５のカラム（１０Ｘ
３５ｃｒ１１）に展開し、未反応のテオフィリンを除去
し、目的のテオフィリン−アミラーゼ結合物を７η得た
。これにＢＳＡを加え終濃度で１％とし安定化させた。

１−２　アミラーゼインヒビター固定化物の作製工４キ
シ化セファロース４Ｂを水に膨潤させ、一度洗浄した後
、この５ゴに１０　ｍ９／ｙｔｌの濃度になるように溶
かしたアミラーゼインヒビター溶液（０，１Ｍ炭酸、ｐ
ｉ（９，５）５ｍ加え室温で１日攪拌した。次にとのグ
ルを０゜０２Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ　）で
十分に洗浄し、０．１　Ｍ　）リス塩酸ｐｉ（８，５に
けん濁させ、３７℃で２時間放置した。

同様にＰＢＳで４回洗浄し、１チＢＳＡを含むＰＢＳｌ
ｏｒＩＬｌにけん濁させ目的の固定化物を作製した。

１−３　　抗テオフィリン抗体結合セファロースの作製 抗テオフィリンマウスモノクローナル抗体１５〜を０，
１Ｍ炭酸０．５　Ｍ　ＮｈＣＬを含む緩衝液ｓｙに溶か
した。ファルマシア製ＣＮＢｒ　活性化セファロース２
１　ｔ　１　ｍＭ　Ｈｃｔ水溶液にぼう潤させ、洗浄し
これに上記の抗テオフィリン溶液を加えエンドオーバー
エンドミキサーで室温で１８時間攪拌し、ＰＢＳで５回
洗浄した。次に０．１　Ｍ　）　９スー塩酸−８，５に
けん濁させ室温で２時間放置し、ＰＢＳで洗浄した。こ
のグルを１１　ＢＳムーＰＢＳ溶液中（１５１１１）に
けん濁させ保存した。

１−４　テオフィリンの測定 テオフィリン溶液ｓ’　Ｏμｉ　（０〜１００　ｐｉｎ
Ｒｌ）Ｋ■で調製したテオフイリンアミラーぜ結合物５
０μｌ　（２０４／ｍｌ　）に■で作製したグルを５０
μ１ｆｌｎえ３７℃で１０分間放置し、次に■で作製し
たアミラーゼインビター固定化物を１００　ＡＩ及び１
％ｐニトロフェニルヘキサオース、３ｕ／ｌｅｌのαグ
ルコシダーゼを含む５０ｍＭグリセロリン酸溶液（ＰＨ
７，０）８００μＪを加え３７℃で３０分間酵素反応さ
せた。図１はそのときの活性とテオフィリン濃度の関係
を示す。

実施例２ ２−１　抗ヒトアルファ７工トプロテイン抗体結合フィ
ルターの作製 バイオダイン社の活性化メンブランフィルタ−を（イム
ノアフイニティメンプラン３μｍボア）１０ｍＸ１０ｍ
に切断し、抗ヒトアルファフェトプロティンマウスモノ
クローナル抗体溶液２０４（２００μ！ｉ／Ｉｌｌマク
スｘｇａ　、　ＰＢＳ溶液）にひたした。

４℃で一夜放置し、ＰＢＳで洗浄した。次に５チＢＳＡ
を含む０．１　Ｍ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ８，５’）溶
液２０ｄにひたし、活性基を完全にブロックした。

このフィルターを５１１１１のディスクにノ４ンチアウ
トした。

２−２　抗ヒトアルファ７エトプロテインマウスＩｇＧ
−Ｆａｂ　：ブタαアミラーゼ結合物の作製 抗ヒトアルファフェトプロティンマウスＩｇＧ１０ηを
０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）２ｍ／にペプシン
３００μｇを加え、３７℃で１８時間攪拌した。

Ｑ、　Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨを加エテ声を７．　ＯＫ調節し
、この反応液を予め０．１Ｍリン酸緩衝１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ溶液（ｐＨ６，３）で平衡化したセファクリルＳ−
３００グルカラムに入れ、上記の緩衝液で溶出した。分
子量１０万ダルトン付近に溶出されたピーク部分を集め
て１ゴに濃縮し、抗ヒトアルファフェトプロティンマウ
スＩｇＧ　Ｆ（轟ｂす２を得た。

次にこのＦ（ａｂす、３Ｉｎ９を含むこの溶液１ｄにｘ
ｏｍｇ７ｒｔｔｔの２−メルカプトエチルアミン水溶液
（ｐＨ７，０）１００μ！を加え、３７℃で９０分間攪
拌した。この反応液を予め０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で緩衝化したセファデックスＧ−２５カラムで
ダルＦ遇し未反応の２−メルカプトエチルアミンを除去
し、ＨＳ−Ｆａｂ’を得た。ブタαアミラーゼ３■を−
７，０の０．１　Ｍリン酸緩衝液１ｄに溶かし、３％デ
ングン水溶液２００μ！加えＣＨＭＳ　ＩＷ／ＩＬＩの
ＤＭＦ’溶液２００μｌを加え室温で１時間放置して反
応させた。この反応液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５でダルｐ退
し未反応のＣＨＭＳ　ｔ−除去しＣＩ（Ｍ化アミラーゼ
２，５り得た。このＣＨＭ化アミラーゼ２ダに上記のＨ
Ｓ−Ｆａｂ　Ｚ　ｍ９を加え４℃で１８時間放置し、２
−メルカプトエチルアミン水溶液１００μ１（１０ダ／
コ）を添加し、３７℃で一時間攪拌した。

この反応液を２０　ｍＭグリセロリン酸緩衝化生理食塩
水（ＣＢＳ　）　ｐＨ７，０で平衡化したセファクリル
−８−３００ｒルカラム（１ｏｙ＋Ｘ　１００ｙｎ）に
入れ１０万付近の分子量のタンノｆり成分を分画したつ
これＫよυ目的のＦａｂ’−８−ＣＨＭ−アミラーゼ溶
液（３００μｌ！／ＩＬＩ）１０ｒｔｔｌｌを得た〇２
−３　ヒトアルファフェトプロティンの測定抗ヒトアル
ファフェトプロティン抗体固定化フィルター（実施例２
−１で調製）５圏ディスク１枚をパイロットチェープに
とりヒトアルファフェトプロティン溶液（０〜８００μ
ｐ７ｍｉ）　ｓ　ｏ　μｉ　ヲ加えさらに実施例２（２
−２）で作製した抗ヒトアルファ７エトプロテインマウ
スＩｇＧＦａｂ−アミラーゼ結合物５０μｌ（３μｇ／
ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。次に実施
例１（１−２）で作製シたアミラーゼインヒビターダル
１°００μｌ及びｐ−ニトロフェニルヘキサオース１１
３ｕ／ゴα−グリコシダーゼを含む基質液（ＰＨ７，０
）８００μ！を加え、３７℃で３０分間反応させ、０１
５Ｍ炭酸０．１　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ９，０）ｅ５
００＃加え反応を停止させ、上清の発色を４０３ｎｍの
吸光度として測定した。図２はそのときのスタンダード
カーブである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 酵素免疫測定法において、抗原抗体反応させたのち、未
   反応の酵素標識抗体もしくは酵素標識抗原に酵素標識物
   を阻害する酵素阻害剤を固定化した不溶化物を接触せし
   めて、未反応の酵素標識抗体もしくは酵素標識抗原の酵
   素活性を消失せしめ、同時にもしくはその後に酵素基質
   を反応せしめることを特徴とするリガンドの測定法。