DK149909B - Immunoenzymatisk fremgangsmaade til paavisning og bestemmelse af triiodthyronin eller triiodthyronin-antistof samt koblingsprodukter til udoevelseaf fremgangsmaaden - Google Patents

Description

149909

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til påvisning og bestemmelse af triiodthyronin eller dettes antistof, hvilken fremgangsmåde er af den i krav l's indledning angivne art og ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte. Endvidere angår opfindelsen koblingsprodukter til' udøvelse af fremgangsmåden.

Det er kendt, at der findes en række metoder til analyse af triiodthyronin, kort betegnet T3, og af dets antistof, navnlig til deres kvantitative bestemmelse i blodserum.

Blandt disse metoder kan nævnes følgende: . 3 1) Måling af koncentrationen af totalt T : a) Bestemmelse ved hjælp af mætnings-analyse, hvilket med- 149909 2 3 4 fører fraskillelse af T fra thyroxin (T ), hvilken adskillelse i virkeligheden er besværlig og udgør en alvorlig hindring for en rutinemæssig anvendelse.

b) Radioimmunologisk bestemmelse: For nærværende er det den bedst egnede metode til bestemmelse af triiodthyronin. Den gør brug af et specifikt antistof og af T^, hvilket sidstnævnte er mær-125 3 ket med I . T fra det serum, der undersøges, konkurrerer med det

*5 *1 O C O

mærkede T om antistoffet, og mængden af komplekset I -T -antistof er omvendt proportional med koncentrationen af T^ i den prøve, der undersøges. Det skal i forbindelse med denne metode understreges, at de nødvendige forbindelser, såsom I , har en forholdsvis kort levetid, og at prøven kræver kostbart udstyr. Endvidere er anvendelsen af radio-isotoper underkastet streng lovgivning af de offentlige sundhedsmyndigheder.

2) Måling af gensidig indvirkning mellem hormon og TBP (Thyroxin-bindende protein): a) Bestemmelse af fraktionen af frit hormon ved ligevægtsdialyse, ultrafiltrering, b) bestemmelse af den relative mætning af de thyroxin-bindende 3 3 steder: fiksering på en harpiks af det mærkede T (RT U, dvs. Harpiks- 3 T -optagning), c) kvantitativ bestemmelse af thyroxin-bindende proteiner: koncentration af TBG (thyroxin-bindende globulin) og af TBPA (thyroxin-bindende prealbumin).

Alle disse er besværlige metoder, der er baseret på evnen hos TBP til at binde til hormonet, og giver et indirekte mål for det cir- 3 3

kulerende T . Den metode, der måler fikseringen af det mærkede T

til harpiksen, er alt i alt den letteste af de tre metoder, selv om den har de allerede ovenfor under 1 b) anførte ulemper.

3

Ved at måle koncentrationen af det totale T eller af den gensidige indvirkning mellem hormonet og TBP er det muligt at beregne koncentrationen af det frie T .

Fra US patentskrift 3.654.090 og dansk fremlæggelsesskrift 140.268 er det kendt til påvisning og bestemmelse af haptener eller deres antistoffer at benytte en teknik baseret på kontakt mellem den prøve, der skal undersøges for den ene komponent af hapten/an-tistof, med dels en given mængde af den anden komponent i uopløse-liggjort form og dels en given mængde af et koblingsprodukt bestå- 3 U99Q9 ende af et enzym covalent bundet til første komponent, og efterfølgende bestemmelse af resterende enzymaktivitet.

Denne teknik er ikke tidligere foreslået anvendt til bestemmelse af triiodthyronin per se eller dettes antistof. Forklaringen herpå er formodentligt, at triiodthyronin er kendt som en inhibitor for mange enzymer. For eksempel hæmmes dehydrogenase-enzymer af 3 3 T , og lysozym udfælder med T i form af et uopløseligt kompleks.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den overraskende erkendelse, at ovennævnte kendte teknik til påvisning og bestem- 3 melse af haptener eller deres antistoffer er velegnet også til T per se, hvis der som enzymet i det til metodens gennemførelse anvendte koblingsprodukt benyttes enzymet carboanhydrase.

Den foreliggende fremgangsmåde til påvisning og bestemmelse af triiodthyronin eller dettes antistof gennemføres således under anvendelse af den kendte metode, der er baseret på kontakt mellem en prøve, der skal undersøges for den ene komponent af hapten/an-tistof, en given mængde af den anden komponent i uopløseliggjort form og en given mængde af et koblingsprodukt bestående af et enzym covalent bundet til første komponent, og efterfølgende bestemmelse af resterende enzymaktivitet, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at der som enzym i nævnte koblingsprodukt anvendes carboanhydrase.

Denne fremgangsmåde gør det muligt at bestemme triiodthyronin eller dets antistof i selv meget små mængder, af størrelsesordenen nano-gram og mindre, uden forekomst af nogen af de ovennævnte ulemper.

Det til det anvendte koblingsprodukt valgte enzym carboanhydrase opfylder følgende kriterier: a) det viser høj specifik aktivitet ved et sådant pH, at der ikke sker nogen svækkelse af antigen-antistof-bindingen, b) det kan let måles, c) det kan let fås i en meget ren, opløselig og stabil form, d) det udviser reaktive grupper, til hvilke andre molekyler kan bindes uden noget tab i biologisk aktivitet, og e) det hæmmes ikke af stoffer, der er til stede i blodserum. Bestemmelsen ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende op- 3 findelse gennemføres i praksis ved, at T fra den prøve, der undersøges, ekstraheres ved affinitets-chromatografi gennemført på et 3 uopløseliggjort T -antistof, idet chromatografien gennemføres enten 4 149909 i en søjle eller i et forsøgsrør. Ved et sådant trin opnås en koncentrering af det stof, der undersøges, og komponenter, der eventuelt kunne gribe ind i analysen, fjernes. Derefter behandles søjlen med en opløsning af enzym-T -koblingsprodukt (E-T ), og den resterende enzym-aktivitet bestemmes i det bortflydende materiale. Hvis prøven ikke indeholder stoffer, der skal bestemmes (T ), 3 binder antistoffet E-T . Hvis derimod stoffet er til stede, vil det konkurrere med enzymet over for antistoffet, hvilket forårsager, at 3 en del af E-T findes i det bortflydende materiale.

Af det foregående fremgår, at den immunoenzymatiske metode ifølge den foreliggende opfindelse til bestemmelse af triiodthyro-nin er værdifuld, da den giver et direkte mål for hormonet, selv hvis dette er til stede i meget lav koncentration. Endvidere påvirkes en sådan fremgangsmåde ikke af stoffer, der er til stede i blod-serum'et, og den er let at gennemføre.

Det fremgår, at den foreliggende fremgangsmåde også kan an- 3 vendes til bestemmelse af T -antistof, da det er tilstrækkeligt 3 3 at uopløseliggøre nævnte T , hvorefter det uopløseliggjorte T bringes i kontakt først med prøven og derefter med carboanhydrase, der 3 er covalent bundet til T -antistof. Til slut måles den resterende enzym-aktivitet.

Det til fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte koblingsprodukt bestående af enzymet carboanhydrase covalent bundet enten til triiodthyronin eller til triiodthyronin-antistof er ligeledes omfattet af opfindelsen.

Materialer til prøverne.

Carboanhydrase og okseserumalbumin var produkter fra Boehrin-ger-Mannheim Co. l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid var et produkt fra Sigma. 3,5,3'-Triiodthyronin og glutaraldehyd var fra Fluka. Reagenserne til elektroforese var fra Canalco. Bio-Gel var fra Bio-RAD. Alle de andre produkter var fra Carlo Erba eller fra Merck.

Forsøgsresultater.

3 A) Fremstilling af T -antistoffer: 50 mg BSA (okseserumalbumin) blev opløst i 25 ml vand, og 150 5 149909 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid blev tilsat. Der-

O

efter blev der dråbevis tilsat 100 mg T , der var opløst i 5 ml N,N-dimethylformamid. Efter ca. 5 minutter blev der tilsat 50 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.

Reaktionen fik lov at forløbe i 18 timer ved stuetemperatur, i mørke og med omrøring. Efter endt reaktion blev prøven centrifugeret og dialyseret over for hyppigt fornyet destilleret vand i 72 timer.

3

Antallet af rester af T , der var inkorporeret i hvert molekyle albumin, blev bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse af en koefficient på 6.100 M 1 cm 1 ved 320 nm (nanometer). Resultaterne viste, at ca.

3 5 T -rester var konjugeret med hvert molekyle BSA. UV-spektrene af 3 BSA og af T -BSA-konjugatet er vist ved kurver 1 og 2 i fig. 1 på tegningen. Antistoffet var vundet ved række-immuniseringer af kaniner 3 med T -BSA-konjugatet. Til titrering af antistofferne anvendtes den passive agglutineringsmetode, der er en klassisk serologi-metode og består i, at røde blodceller, der forud er behandlet med garvesyre, belægges med det antigen, der prøves, hvorefter der gennemføres en agglutineringsprøve.

Det vundne antistof havde en titer på 1:8.000. Rensningen af antistoffet foregik ved centrifugering af serum'et og fortynding af den overliggende væske med ét volumen vand og ét volumen af en mættet ammoniumsulfatopløsning, således at der blev opnået en endelig koncentration på 33%. Efter 15 minutter blev blandingen centrifugeret ved 4.000 rpm i 20 minutter, og bundfaldet blev genopslemmet i en saltopløsning og atter fældet med ammoniumsulfat, indtil fuldstændig affarvning af opløsningen var opnået. Bundfaldet, der blev optaget i en saltopløsning, blev dialyseret mod saltopløsning, fornyet to til tre gange, ved 4°C, indtil ammoniumsulfat var helt fjernet.

B) Fremstilling af de immuno-absorberende antistoffer på poly-acrylamid.

Bio-Gel P-300 blev henstillet til hydratisering i 24 timer i vand og blev vasket mange gange i det samme medium. Til 100 ml af den hydratiserede gel blev der sat 500 ml af en 6% opløsning af glutaraldehyd i en 0,1M phosphatpuffer ved pH 7,0. Opløsningen blev inkuberet natten over ved 37°C. Gelen blev derefter vasket 10 til 20 gange med vand under anvendelse til hver vaskeoperation af et volumen på 500 ml.

U9909 6 10 ml Aktiveret gel blev blandet med 12 ml blodserum. Opløsningen blev omrørt langsomt ved stuetemperatur i 14 timer, centrifugeret ved 3.000 rpm i 10 minutter ved 4°C, og den overliggende væske blev fjernet for at bestemme mængden af antistof, der ikke var absorberet. Gelpartiklerne blev derefter vasket med en isotonisk puffer, indtil den optiske tæthed af den overliggende væske var mindre end 0,02 ved 280 nm. Den mængde antistof, der var blevet konjugeret, var på 23 mg pr. ml gel.

3 3 C) Fremstilling af T -carboanhydrase-konjugat.(T -BCA).

50 mg Carboanhydrase blev opløst i 25 ml vand og blandet med 3 30 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, og 20 mg T , der var opløst i 5 ml Ν,Ν-dimethylformamid, blev tilsat dråbevis, idet pH holdtes mellem 5,5 og 6,0. Opløsningen holdtes med konstant omrøring ved stuetemperatur, i mørke, i ca. 18 timer. Efter afslutning af dette trin blev prøven centrifugeret og dialyseret mod hyppigt fornyet vand ved 4°C i ca. 48 timer. Den spektrofotometriske

O

analyse viste, at en rest af T var blev konjugeret med ét molekyle carboanhydrase. Den resterende enzym-aktivitet af konjugatet svare- 3 de til ca. 50% af aktiviteten af det naturlige enzym. T -BCA-konju-gatet var homogent og forskelligt fra det naturlige enzym, som påvist ved elektroforese.

3 D) Bestemmelse af T .

En kalibreringskurve blev først optegnet ved følgende fremgangsmåde: 1 ml antistof, der var uopløseliggjort på Bio-Gel P-300, blev anbragt på en søjle (0,5 x 5 cm), der holdtes termostatisk ved 25°C. Af en opløsning indeholdende -BCA-konjugatet i en koncentra tion på 0,5M blev 1 ml bragt til at løbe gennem søjlen. Søjlen blev henstillet 1 time, hvorefter den blev vasket med 1 ml isotonisk opløsning, og på det udstrømmende materiale bestemtes den resterende biologiske aktivitet af konjugatet. Den biologiske aktivitet af T^-BCA-konjugatet blev bestemt spektrofotometrisk ved 25°C ved at måle absorptionsstigningen ved 348 nm, der skyldtes den af p-nitrophenyl-acetat inducerede hydrolyse. Af det udstrømmende materiale blev 1 ml blandet med 1 ml 3 millimolær (mM) p-nitrophenylacetatopløsning, 0,3 ml 20mM phosphatpuffer (pH 7,4) og 0,7 ml vand. I standardcellen anbragtes en blindprøve, der indeholdt alle reagenserne undtagen enzymet. Til bestemmelse af triiodthyronin blev gradvis stigende mængder af frit hormon (fra 3 til 70 nanogram pr. milliliter) anbragt i forskellige søjler, der hver indeholdt 1 ml uopløseliggjort anti 7 149909 stof, idet prøvebeholderne blev henstillet i 1 time. Harpiksen blev vasket med 5 ml isotonisk opløsning (puffer), elueret igen med 1 ml 3 0,5 mikromolær T -BCA og henstillet 1 time. Harpiksen blev igen vasket med 1 ml isotonisk puffer, og på det udstrømmende materiale be-stemtes den specifikke aktivitet af T -BCA-konjugatet. Figur 2 på 3 tegningen viser forløbet af den specifikke aktivitet af T -BCA-kon-jugatet som funktion af koncentrationen af frit T (abscisse). Den mindste mængde, der kan måles, er 1 til 2 nanogram.

3 E) Bestemmelse af T i standard-menneskeblodserum.

Med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde blev der analyseret tre standard-sera fra hypo-, eu- og hyperthyroidale patienter, idet der blev opnået følgende respektive værdier: 110 nanogram pr. 100 ml -236 nanogram pr. 100 ml - 500 nanogram pr. 100 ml. Disse værdier er i god overensstemmelse med værdierne målt ved anvendelse af radioimmunologiske prøver. Specificiteten for antistoffet opnået ved den foreliggende opfindelse er blevet vurderet ved at måle evnen hos T4 3 til at konkurrere med T om antiserum. For at opnå en variation af 3 den specifikke aktivitet af T -BCA-konjugatet, der var ækvivalent med den af 2 nanogram inducerede, kræves 500 mikrogram T4. Når man ta- 4 ger i betragtning, at den normale koncentration af T i mennekseblod-serum er ca. 80 nanogram pr. milliliter, er dets indgriben i målesystemet ubetydelig.

Forklaring af tegningen.

3

Fig. 1 er et UV-spektrum af serumalbuminet (okse) og T -okse-serumalbumin-konjugatet i vandig opløsning. Kurve 1 er kurven for 3 okseserumalbumxn alene. Kurve 2 er kurven for T -okseserumalbumin-konjugatet. Kurve 3 er differentialspektret for konjugatet uden ok-seserumalbuminet.

Fig. 2 viser den procentvise variation af aktiviteten af kon- 3 jugatet T -carboanhydrase som en funktion af koncentrationen af frit . Kurven a) gælder området fra O til 7 nanogram pr. milliliter, og kurve b) gælder området fra 0 til 70 nanogram pr. milliliter. Aktiviteten blev bestemt som ovenfor beskrevet.