JPS5925184B2 - 免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法 - Google Patents
免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法Info
- Publication number
- JPS5925184B2 JPS5925184B2 JP53157546A JP15754678A JPS5925184B2 JP S5925184 B2 JPS5925184 B2 JP S5925184B2 JP 53157546 A JP53157546 A JP 53157546A JP 15754678 A JP15754678 A JP 15754678A JP S5925184 B2 JPS5925184 B2 JP S5925184B2
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- Japan
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- insulin
- measurement
- immunoassays
- serum
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法
に関するものである。
に関するものである。
更に詳しくはラジオイムノアツセイ、酵素免疫測定法、
レーザーネフエロメトリー等の測定法による生体中の微
量物質量の決定の際、疎水性蛋白と塩類を共存させて、
生体試料中に含まれる干渉物質の影響を抑え、生体中に
ある目的とする物質量の含有を正確に測定することを可
能ならしめるところの免疫測定法における非特異的阻害
作用の除去法に関するものである。一般に、血清、尿等
の生体試料中に含有される微量物質、例えばペプタイド
ホルモン類、ステロトドホルモン類、蛋白質類などの含
有量を決定する場合、その濃度が非常に低いため、これ
まで免疫反応を利用したラジオイムノアツセイ法が用い
られてきた。
レーザーネフエロメトリー等の測定法による生体中の微
量物質量の決定の際、疎水性蛋白と塩類を共存させて、
生体試料中に含まれる干渉物質の影響を抑え、生体中に
ある目的とする物質量の含有を正確に測定することを可
能ならしめるところの免疫測定法における非特異的阻害
作用の除去法に関するものである。一般に、血清、尿等
の生体試料中に含有される微量物質、例えばペプタイド
ホルモン類、ステロトドホルモン類、蛋白質類などの含
有量を決定する場合、その濃度が非常に低いため、これ
まで免疫反応を利用したラジオイムノアツセイ法が用い
られてきた。
また、最近になつて、簡便さ、安全性の面から、同じく
免疫反応を利用した酵素免疫測定法、レーザーネフエロ
メトリー法が開発され、かくして血清、尿を用いての微
量物質を測定する免疫測定法が拡められてきたのである
。しかしながら、これら免疫測定法の感度には一定の限
界があるので、さらに感度を高めるためには測定試料を
多く用いることが必要であつたが、単に測定試料を多く
するだけでは生体試料中に共存するある種の因子によつ
て、免疫反応が非特異的に阻害されるため、目的とする
微量物質の定量が大きく妨げられることがあきらかにな
つたのである。
免疫反応を利用した酵素免疫測定法、レーザーネフエロ
メトリー法が開発され、かくして血清、尿を用いての微
量物質を測定する免疫測定法が拡められてきたのである
。しかしながら、これら免疫測定法の感度には一定の限
界があるので、さらに感度を高めるためには測定試料を
多く用いることが必要であつたが、単に測定試料を多く
するだけでは生体試料中に共存するある種の因子によつ
て、免疫反応が非特異的に阻害されるため、目的とする
微量物質の定量が大きく妨げられることがあきらかにな
つたのである。
例えば、固相法によるＬＨホルモンのラジオィムノアツ
セイ〔ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａＶｏｌ
７２、２３５−２４２（１９７３）〕の場合、α−フエ
トプロテトンの酵素免疫測定法〔ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉ
ｍｉｃａＡｃｔａＶｏｌ８７、３６７−３７２（１９７
８）〕の場合、及び二抗体法及びチヤーコールデキスト
ラン法によるセクレチンのラジオイムノアツセイ〔Ａｎ
ａｌｙ一ｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ８
７、３７６−３８５（１９７８）〕の場合等でそれぞれ
明らかにされている。
セイ〔ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａＶｏｌ
７２、２３５−２４２（１９７３）〕の場合、α−フエ
トプロテトンの酵素免疫測定法〔ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉ
ｍｉｃａＡｃｔａＶｏｌ８７、３６７−３７２（１９７
８）〕の場合、及び二抗体法及びチヤーコールデキスト
ラン法によるセクレチンのラジオイムノアツセイ〔Ａｎ
ａｌｙ一ｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ８
７、３７６−３８５（１９７８）〕の場合等でそれぞれ
明らかにされている。
従つて、これら免疫測定法（特に固相法の免疫測定法）
をよりー般的に使い易くするためには測定試料中の免疫
反応阻害物質の影響を除去することが必須の条件とされ
て来たわけであるが、現状においては、阻害作用が発現
しない程度の少量の検体を使用するとか、目的とする微
量物質を抽出等により阻害物質と分離したうえで、使用
するとか、標準検体中に測定物質を除去した同種又は異
種の検体試料を添加して使用するとかして、生体試料中
の免疫反応阻害作用の影響をできる限り抑うて測定され
ている。
をよりー般的に使い易くするためには測定試料中の免疫
反応阻害物質の影響を除去することが必須の条件とされ
て来たわけであるが、現状においては、阻害作用が発現
しない程度の少量の検体を使用するとか、目的とする微
量物質を抽出等により阻害物質と分離したうえで、使用
するとか、標準検体中に測定物質を除去した同種又は異
種の検体試料を添加して使用するとかして、生体試料中
の免疫反応阻害作用の影響をできる限り抑うて測定され
ている。
しかしながら、これら従来の操咋は測定感度を低下させ
たり、操作が煩雑になつたりしていずれも好ましいもの
ではない。
たり、操作が煩雑になつたりしていずれも好ましいもの
ではない。
そこで本発明者らは、生体試料中の免疫反応阻害物質に
よる免疫微量測定法への免疫反応阻害作用を抑制するこ
とができさえすれば、この問題を解決することができる
ものと考え、鋭意研究を続けた結果、反応測定時に疎水
性の高い蛋白質、例えばコラーゲン分解物、ゼラチン等
を添加し、かつイオン強度を高く保つことにより 上記
した測定系への阻害作用を抑制して消失させることがで
きて、測定試料を多く投入することができ、したがつて
正確な免疫測定が出来ることを見い出し、本発明を完成
したものである。
よる免疫微量測定法への免疫反応阻害作用を抑制するこ
とができさえすれば、この問題を解決することができる
ものと考え、鋭意研究を続けた結果、反応測定時に疎水
性の高い蛋白質、例えばコラーゲン分解物、ゼラチン等
を添加し、かつイオン強度を高く保つことにより 上記
した測定系への阻害作用を抑制して消失させることがで
きて、測定試料を多く投入することができ、したがつて
正確な免疫測定が出来ることを見い出し、本発明を完成
したものである。
従来、免疫測定系（一例として酵素免疫測定法）に加え
られる蛋白質としては牛血清アルブミン、家兎血清等が
あるが、測定系へ血清試料として反応液の１０〜３０％
添加されるが、この血清試料中の免疫反応阻害物質の作
用を受け、その阻害物質の量によつては目的とする微量
物質の測定回収率は３〜１００％と、大きくばらついて
しまつていたのである。
られる蛋白質としては牛血清アルブミン、家兎血清等が
あるが、測定系へ血清試料として反応液の１０〜３０％
添加されるが、この血清試料中の免疫反応阻害物質の作
用を受け、その阻害物質の量によつては目的とする微量
物質の測定回収率は３〜１００％と、大きくばらついて
しまつていたのである。
本発明の特色とするところは、疎水性蛋白と塩類を共存
させて、生体試料中に含まれる干渉物質の影響を抑制す
るところにある。
させて、生体試料中に含まれる干渉物質の影響を抑制す
るところにある。
例えば、反応系に牛血清アルブミンの代わ・りに塩濃度
０．３Ｍの食塩ととも０，５％のゼラチンを加えると、
測定回収率は９０〜１００（Ｆ６となり、阻害物質の影
響はほとんどみとめられなくなる。本発明において、免
疫反応阻害作用を除去する物質としては、疎水性の強い
蛋白質類（例えばコラーゲン水解物、ゼラチン、リポプ
ロテインリパーゼ等）が効果的であり、反応系中の濃度
としては、０．１（ｆ）以上であれば使用できるが、実
用的には０．５（ｆ）程度が特に好ましい。
０．３Ｍの食塩ととも０，５％のゼラチンを加えると、
測定回収率は９０〜１００（Ｆ６となり、阻害物質の影
響はほとんどみとめられなくなる。本発明において、免
疫反応阻害作用を除去する物質としては、疎水性の強い
蛋白質類（例えばコラーゲン水解物、ゼラチン、リポプ
ロテインリパーゼ等）が効果的であり、反応系中の濃度
としては、０．１（ｆ）以上であれば使用できるが、実
用的には０．５（ｆ）程度が特に好ましい。
又、イオン強度を保つ塩類としては、測定系を阻害しな
ければ特に限定されないが、臨床検査試←般としては食
塩、燐酸塩が特に利用され、塩濃度としては、例えば食
塩について述べれば０．２Ｍ〜１．０Ｍで使用できるが
、測定感度を高く保つためには０．３Ｍ程度が好ましい
。
ければ特に限定されないが、臨床検査試←般としては食
塩、燐酸塩が特に利用され、塩濃度としては、例えば食
塩について述べれば０．２Ｍ〜１．０Ｍで使用できるが
、測定感度を高く保つためには０．３Ｍ程度が好ましい
。
本発明において免疫反応阻害作用を除去するためには、
疎水性の強い蛋白質を加える必要があるが、単独では完
全ではなく、高イオン強度を保つ塩類を共存せしめるこ
とが必要である。
疎水性の強い蛋白質を加える必要があるが、単独では完
全ではなく、高イオン強度を保つ塩類を共存せしめるこ
とが必要である。
以上の如く、本発明の免疫測定法における疎水性蛋白質
と塩類の共存による生体試料中に存在する免疫反応阻害
作用の除去方法は、ラジオイムノアツセイ、酵素免疫反
応、レーザーネフエロメトリ一法等の免疫反応を用いる
各種の微量物質の測定法の全般にわたり、測定値の信頼
性を高めることができ、かつ生体試料を多く使用できる
ので、更に微量な物質を測定することができるとともに
、測定法の安定性を増加せしめることができるものであ
る。
と塩類の共存による生体試料中に存在する免疫反応阻害
作用の除去方法は、ラジオイムノアツセイ、酵素免疫反
応、レーザーネフエロメトリ一法等の免疫反応を用いる
各種の微量物質の測定法の全般にわたり、測定値の信頼
性を高めることができ、かつ生体試料を多く使用できる
ので、更に微量な物質を測定することができるとともに
、測定法の安定性を増加せしめることができるものであ
る。
次に本発明の試験例及び実施例を示す。
なお、ここに示したインスリンの回収率とは次のように
求めたものである。
求めたものである。
すなわち、インスリン濃度既知の試料に一定量のインス
リンを添加し、これを検体としてインスリン量を測定す
る。試料中に最初から存在していたインスリン量をＡ、
添加したインスリン量をＢ、測定インスリン量をＸとす
ると回収率Ｒは、Ｒ−（Ｘ−Ａ）÷Ｂ×１００％で表さ
れる。用いた測定法が正確である程回収率は１００％近
くなる。試験例 固相法によるインスリンの酵素免疫測定系で本発明によ
つて血清阻害作用が除去されるかどうかを見た。
リンを添加し、これを検体としてインスリン量を測定す
る。試料中に最初から存在していたインスリン量をＡ、
添加したインスリン量をＢ、測定インスリン量をＸとす
ると回収率Ｒは、Ｒ−（Ｘ−Ａ）÷Ｂ×１００％で表さ
れる。用いた測定法が正確である程回収率は１００％近
くなる。試験例 固相法によるインスリンの酵素免疫測定系で本発明によ
つて血清阻害作用が除去されるかどうかを見た。
測定方法は実施例１に示すように行い、各血清に一定量
（１μＵｎｉｔ）のインスリンを添加しその回収率をし
らべた。その結果は第１図に示されるが、緩衝液Ａによ
ればインスリンの回収率は２０〜３０％まで低下し、緩
衝液Ｇによれば９０〜１０００１）の測定回収率で測定
できることが分る。
（１μＵｎｉｔ）のインスリンを添加しその回収率をし
らべた。その結果は第１図に示されるが、緩衝液Ａによ
ればインスリンの回収率は２０〜３０％まで低下し、緩
衝液Ｇによれば９０〜１０００１）の測定回収率で測定
できることが分る。
即ちこれによつて血清阻害作用が抑制されていることが
わかる。実施例１ サンドイツチ法によるインスリンの酵素免疫測定法：イ
ンスリン測定系−Ａ：緩衝液ＡＣＯ．ｌＭＮａＣｌ，ｌ
ｍＭＭｇＣｌ２，Ｏ．ｌ（ｆ）牛血清アルブミン、０，
１％ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（
ＰＨ７．Ｏ）〕０．４５ｍ１に適当に希釈したインスリ
ン含有液５０μｌを加え、更にシリコンゴム一抗インス
リン抗体結合物（φ３×４ｍ０を１ケ加えて、３０℃で
２時間振盪する。
わかる。実施例１ サンドイツチ法によるインスリンの酵素免疫測定法：イ
ンスリン測定系−Ａ：緩衝液ＡＣＯ．ｌＭＮａＣｌ，ｌ
ｍＭＭｇＣｌ２，Ｏ．ｌ（ｆ）牛血清アルブミン、０，
１％ＮａＮ３を含む０．０１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（
ＰＨ７．Ｏ）〕０．４５ｍ１に適当に希釈したインスリ
ン含有液５０μｌを加え、更にシリコンゴム一抗インス
リン抗体結合物（φ３×４ｍ０を１ケ加えて、３０℃で
２時間振盪する。
振盪終了後、緩衝液Ａにてシリコンゴムをよく洗浄し、
緩衝液Ａで希釈した抗インスリン抗体−β−ガラクトシ
ダーゼ複合体０．２ｍ１を加えて、４℃にて一夜反応さ
せる。反応終了物を再び緩衝液Ａにてよく洗浄し、シリ
コンゴムに結合しているβ−ガラクトシダーゼ活性を測
定する。インスリン測定系−Ｇ：緩衝液Ｇ〔緩衝液Ａに
ゼラチン０．５係とＮａＣｌＯ．２Ｍを加えたもの〕０
．４５ｍ１に適当に希釈したインスリン含有液５０μｌ
を加え、以下測定系−Ａと同様の操作をする。
緩衝液Ａで希釈した抗インスリン抗体−β−ガラクトシ
ダーゼ複合体０．２ｍ１を加えて、４℃にて一夜反応さ
せる。反応終了物を再び緩衝液Ａにてよく洗浄し、シリ
コンゴムに結合しているβ−ガラクトシダーゼ活性を測
定する。インスリン測定系−Ｇ：緩衝液Ｇ〔緩衝液Ａに
ゼラチン０．５係とＮａＣｌＯ．２Ｍを加えたもの〕０
．４５ｍ１に適当に希釈したインスリン含有液５０μｌ
を加え、以下測定系−Ａと同様の操作をする。
但し３０℃、２時間振盪後のシリコンゴム固相の洗浄は
、はじめ緩衝液Ｇで行ない、ついで緩衝液Ａでする。こ
のようにして求められた上記両測定系での標準曲線を第
２図に示す。ついで種々な人血清５０μｌを用い両測定
系で得られたインスリン測定値とラジオイムノアツセイ
インスリンリアキツト（ダイナボツトＲ研究所製）法で
得られたインスリン値との相関を求めた。
、はじめ緩衝液Ｇで行ない、ついで緩衝液Ａでする。こ
のようにして求められた上記両測定系での標準曲線を第
２図に示す。ついで種々な人血清５０μｌを用い両測定
系で得られたインスリン測定値とラジオイムノアツセイ
インスリンリアキツト（ダイナボツトＲ研究所製）法で
得られたインスリン値との相関を求めた。
結果は第３図、第４図に示されるが、これらから測定系
−Ａとラジオイムノアツセイ法との相関はみられないが
、測定系−Ｇとラジオイムノアツセイ法とではよく相関
することが分る。実施例２ 人イムノグロプリン一Ｅ（以下ＧＥと略す）の酵素免疫
測定法：固相をポリスチレンボール一抗体１ｇＧ結合物
、複合体を抗１ｇＥ抗体−βガラクトシダーゼに代える
以外は実施例１に示す方法で行ない標準曲線を求め、次
に５種類の乳幼児血清について実施例１に示すごとき測
定系−Ａ、測定系一ＧにてＩｇＥ量を測定し、同時に各
々の血清にＩｇＥ（１２５単位／ＭＯを添加して両測定
系におけるＩｇＥ量を測定し、回収率を表１に示す。
−Ａとラジオイムノアツセイ法との相関はみられないが
、測定系−Ｇとラジオイムノアツセイ法とではよく相関
することが分る。実施例２ 人イムノグロプリン一Ｅ（以下ＧＥと略す）の酵素免疫
測定法：固相をポリスチレンボール一抗体１ｇＧ結合物
、複合体を抗１ｇＥ抗体−βガラクトシダーゼに代える
以外は実施例１に示す方法で行ない標準曲線を求め、次
に５種類の乳幼児血清について実施例１に示すごとき測
定系−Ａ、測定系一ＧにてＩｇＥ量を測定し、同時に各
々の血清にＩｇＥ（１２５単位／ＭＯを添加して両測定
系におけるＩｇＥ量を測定し、回収率を表１に示す。
第１図は試験例における人血清中に加えたインスリンの
回収率を示す図で、Ａ，ｂは緩衝液Ｇにおける各人血清
に加えたインスリンの回収率を示し、ａ′，ｂ′は緩衝
液Ａにおける各人血清に加えたインスリンの回収率を示
している。
回収率を示す図で、Ａ，ｂは緩衝液Ｇにおける各人血清
に加えたインスリンの回収率を示し、ａ′，ｂ′は緩衝
液Ａにおける各人血清に加えたインスリンの回収率を示
している。
Claims (1)
- １ 免疫測定法による生体中微量物質量の決定の際、疎
水性蛋白０．１％以上と塩類０．２Ｍ〜１．０Ｍとを共
存させて、生体試料中に含まれる干渉物質の影響を抑制
することを特徴とする免疫測定法における非特異的阻害
作用の除去法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53157546A JPS5925184B2 (ja) | 1978-12-22 | 1978-12-22 | 免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53157546A JPS5925184B2 (ja) | 1978-12-22 | 1978-12-22 | 免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5598359A JPS5598359A (en) | 1980-07-26 |
| JPS5925184B2 true JPS5925184B2 (ja) | 1984-06-15 |
Family
ID=15652035
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53157546A Expired JPS5925184B2 (ja) | 1978-12-22 | 1978-12-22 | 免疫測定法における非特異的阻害作用の除去法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5925184B2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5794780U (ja) * | 1980-12-03 | 1982-06-10 | ||
| JPS5930373Y2 (ja) * | 1980-12-03 | 1984-08-30 | 株式会社日立製作所 | 冷蔵庫 |
| JPS5798269U (ja) * | 1980-12-08 | 1982-06-16 | ||
| JPS57131062A (en) * | 1981-02-05 | 1982-08-13 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Quantitative determination of antigen using enzyme- labelled antigen and second antibody insolubilizing carrier |
| JPS58171672A (ja) * | 1982-03-31 | 1983-10-08 | Amano Pharmaceut Co Ltd | カルモデユリンの定量法 |
| JPS59102161A (ja) * | 1982-12-03 | 1984-06-13 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 逆受身凝集反応による抗原検出用試薬 |
| GB8317855D0 (en) * | 1983-06-30 | 1983-08-03 | Iq Bio Ltd | Biochemical detection method |
| JPS61241665A (ja) * | 1985-04-18 | 1986-10-27 | Toyobo Co Ltd | 安定化された固相試薬 |
| JP2691575B2 (ja) * | 1988-08-26 | 1997-12-17 | 第一化学薬品株式会社 | 免疫反応の測定方法 |
| JPH1138006A (ja) * | 1995-06-27 | 1999-02-12 | Dainabotsuto Kk | 検査方法及び検査用キット |
| JP2010127827A (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52151726A (en) * | 1976-06-11 | 1977-12-16 | Takeda Chem Ind Ltd | Serodiagnostic reagent and method of preparing same |
-
1978
- 1978-12-22 JP JP53157546A patent/JPS5925184B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52151726A (en) * | 1976-06-11 | 1977-12-16 | Takeda Chem Ind Ltd | Serodiagnostic reagent and method of preparing same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5598359A (en) | 1980-07-26 |
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