JPH08304398A - 免疫測定方法 - Google Patents

免疫測定方法

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JPH08304398A
JPH08304398A JP13274195A JP13274195A JPH08304398A JP H08304398 A JPH08304398 A JP H08304398A JP 13274195 A JP13274195 A JP 13274195A JP 13274195 A JP13274195 A JP 13274195A JP H08304398 A JPH08304398 A JP H08304398A
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JP
Japan
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antigen
antibody
blood
carrier
filter paper
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JP13274195A
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English (en)
Inventor
Shuichi Hiyamuta
修一 冷牟田
Keiko Shimizu
敬子 清水
Kyoko Ohashi
恭子 大橋
Akihiko Kadota
明彦 門田
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Idemitsu Kosan Co Ltd
Original Assignee
Idemitsu Kosan Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 希釈操作を行うことなく、正確に血液中の抗
原量を測定することができる免疫分析方法を提供するこ
と。 【構成】 測定すべき抗原を含むかもしれない被検血液
を濾紙に吸着させた血液吸着濾紙を、ブロッキング剤と
してのタンパク質を含む溶液で抽出し、担体上に不動化
された、前記抗原と反応する抗体と該抽出液とを反応さ
せ、担体に結合された抗原量を測定することにより、前
記被検血液中の測定すべき抗原を測定することから成る
免疫測定方法を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、血液中の抗原を測定す
るための免疫測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来より、血液を濾紙ディスクに吸着さ
せ、これを緩衝液等で抽出し、抽出された目的の抗原を
酵素免疫分析等の免疫分析方法により測定することが行
われている。免疫分析方法は、高感度の方法であるの
で、血液中に目的の抗原が高濃度に含まれる場合には、
抽出液の原液を免疫分析に供したのでは抗原濃度が高す
ぎて抗原の定量ができない。このため、測定すべき抗原
濃度が高い場合には、抽出液を希釈した後、免疫分析を
行っている。しかしながら、希釈操作は煩雑であり、特
に、多数の検体を処理しなければならない場合には分析
の効率が希釈操作により大幅に落ちる。また、希釈時の
ミスや希釈倍率の誤差により測定結果が不正確になる虞
もある。
【0003】また、体内に一定量存在する抗原溶液の測
定には、従来、ラテックス凝集法や、標識抗原を用いた
阻害試験による測定も用いられている。しかしながら、
ラテックス凝集法は目視による凝集の判定を行うため、
定量性が乏しい。また、一定濃度より濃いか薄いかを判
定するためのものであり、定量には向かない。一方、阻
害試験は、標識した抗原を競合させて測定を行う方法だ
が、抗原となる物質が不安定な場合、定量的に測定を行
うことは困難であった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、希釈操作を行うことなく、正確に血液中の抗原量を
測定することができる免疫分析方法を提供することであ
る。
【0005】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、被検血液を吸着させた濾紙を抽出する溶液中
にブロッキング剤等を共存させることにより、希釈操作
を行うことなく正確に免疫分析ができることを見出し、
本発明を完成した。
【0006】すなわち、本発明は、測定すべき抗原を含
むかもしれない被検血液を濾紙に吸着させた血液吸着濾
紙を、ブロッキング剤としてのタンパク質を含む溶液で
抽出し、担体上に固定された、前記抗原と反応する抗体
と該抽出液とを反応させ、担体に結合された抗原量を測
定することにより、前記被検血液中の測定すべき抗原を
測定することから成る免疫測定方法を提供する。
【0007】以下、本発明を詳細に説明する。
【0008】本発明の方法では、濾紙に吸着された血液
試料を用いる。なお、本発明で言う「血液」という語
は、血清や血漿のような血液成分も包含する意味で用い
ている。また、本発明の方法により測定される抗原は、
血液中に含まれ、かつ、対応抗体と抗原抗体反応を行う
ことができるものであれば何でもよく、例えばセルロプ
ラスミン、CEA及びAFP等が挙げられる。なお、濾
紙の形状は特に限定されないが、マイクロタイタープレ
ートのウェル内に挿入可能な大きさのディスク状である
と便利である。
【0009】本発明の方法では、先ず、血液吸着濾紙
を、ブロッキング剤としてのタンパク質を含む溶液で抽
出する。ブロッキング剤は、担体に不動化された抗体を
用いる場合に、抗原と担体との非特異的吸着を防止する
ために用いられるタンパク質である。ブロッキング剤と
しては、ウシ血清アルブミン(BSA)、スキムミル
ク、カゼイン溶液等が常用されており、本発明の方法に
おいてもこれらを好ましく用いることができる。また、
これらのタンパク質から成るブロッキング剤は市販され
ており(例えば、カゼインを含む雪印乳業社製「ブロッ
クエース」等)、本発明の方法においてこれらの市販の
ブロッキング剤を好ましく用いることができる。
【0010】抽出に用いられる溶液としては、上記ブロ
ッキング剤をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)等の緩衝
液中に含むものが好ましく用いられる。溶液中のブロッ
キング剤の濃度は、特に限定されないが、通常0.1〜
20重量%程度であり、好ましくは1〜10重量%程度
である。
【0011】抽出に用いられる溶液には、上記ブロッキ
ング剤に加え、(1) 測定すべき抗原と競合する既知濃度
の抗原(以下、「阻害抗原」と言うことがある)及び
(2) 測定すべき抗原と反応する抗体と競合する既知濃度
の抗体(以下、「阻害抗体」と言うことがある)のいず
れか一方又は両方を含んでいてもよい。阻害抗原及び/
又は阻害抗体を加えることにより、さらに高濃度の抗原
を希釈することなく測定することができる。特に、阻害
抗原と阻害抗体の両方を加えることにより、より安定的
に高濃度抗原を測定することが可能になる。
【0012】抽出に用いる溶液中の阻害抗原の量は、被
検血液中に含まれる測定すべき抗原の量に依存し、特に
限定されないが、該測定すべき抗原の予想されるおよそ
の重量を100とすると、100〜200程度である。
また、抽出に用いる溶液中の阻害抗体の量も、被検血液
中に含まれる測定すべき抗原の量に依存し、特に限定さ
れないが、該測定すべき抗原の予想されるおよその重量
を100とすると、200〜400程度である。
【0013】抽出に用いられる溶液のpHは、抗原及び
抗体の反応性に影響を与えない範囲であればいずれでも
よく、通常4〜10、好ましくは5〜8、さらに好まし
くは5〜6程度である。下記実施例で具体的に示される
ように、抽出に用いられる溶液のpHが5〜6の範囲に
あれば検量線の直線性が特に高く、かつ、測定のバラツ
キが特に低い測定が可能になる。
【0014】血液吸着濾紙の抽出は、特に限定されない
が、4〜25℃の温度で10〜20時間行うことが好ま
しく、さらに好ましくは4〜10℃の温度で14〜18
時間行う。
【0015】血液吸着濾紙を抽出した後、抽出液と不動
化抗体とを反応させてもよいが、抽出操作と抗原抗体反
応とを同時に行ってもよい。後者の方が分析の効率が高
いのでより好ましい。これは例えば、測定すべき抗原と
反応する抗体が不動化されたマイクロタイタープレート
のウェルに濾紙血ディスク及び抽出に用いる前記溶液を
加え、前記の条件でインキュベートすることにより行う
ことができる。いずれの場合でも、抽出液を希釈する必
要はない。
【0016】担体に固定化される抗体は、測定すべき抗
原と抗原抗体反応する抗体であれば、モノクローナル抗
体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【0017】抽出及び抗原抗体反応を行った後、担体を
洗浄し、担体上に結合された抗原の量を測定する。これ
は、例えば、測定すべき抗原と反応するが、担体に不動
化した抗体とは認識エピトープが異なる二次抗体を反応
させ、洗浄後、担体に結合された該二次抗体の量を測定
することにより行うことができる。担体に結合された二
次抗体の定量は、例えば、酵素標識、蛍光標識、ビオチ
ン標識及び放射標識のような標識を付した二次抗体を用
い、該標識を測定することにより行うことができる。あ
るいは、上記阻害抗原として標識したものを用い、担体
に結合された該標識の量を測定することにより間接的に
被検血液中の抗原量を測定することができる。これは、
免疫分析の常法に従って行うことができる。なお、二次
抗体もモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも
よい。
【0018】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【0019】実施例1 血中プラスミンの測定 抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体ID−1
(Hybridoma (1994) vol. 13, No. 2, pp.139-141 )を
不動化したマイクロタイタープレートの各ウェルに、濾
紙血1ディスク(血液は各種既知濃度のセルロプラスミ
ンを含む)及び抽出用溶液(PBSで10倍希釈したブ
ロックエース(雪印乳業社製)(カゼイン含有PBS)
中に不活化ヒトセルロプラスミン(セルロプラスミンを
37℃で2カ月以上放置して失活させたもの)19μg
/ml及び0.4M NaClを含む(pH7.4)、
抽出用溶液中のブロックエース(雪印乳業社製)終濃度
10容量%)100μlを加え、4℃で一夜インキュベ
ートした。0.05%Tween20(商品名、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート)含有PBSで
ウェルを3〜5回洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼで
標識した抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体I
D−2(Hybridoma (1994) vol. 13, No. 2, pp.139-14
1 )を0.1μg/mlの濃度で含む二次抗体溶液10
0μlを各ウェルに加え、30℃で1.5時間インキュ
ベートした。次いで、上記と同様に洗浄し、ABTS
(2,2−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン
−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩)溶液を100μ
l加えて発色させ、5〜10分後3N硫酸100μlを
加えて反応を停止し、波長415nmにおける吸光度を
測定した。
【0020】結果を表1に示す。また、表1に示すデー
タをプロットして得られた検量線を図1に示す。表1及
び図1から明らかなように、吸光度は血液中のセルロプ
ラスミンの量に応じて変化しており、本発明の方法によ
り血液中の抗原を定量できることが明らかになった。な
お、上記から明らかなように、この分析操作では希釈は
一切行っていない。
【0021】
【表1】
【0022】実施例2 抽出用溶液が、19μg/mlの不活化ヒトセルロプラ
スミンに代えて2μg/mlの抗ヒトセルロプラスミン
モノクローナル抗体ID−1を含むことを除き実施例1
と同じ操作を行った。結果を表2及び図2に示す。
【0023】
【表2】
【0024】実施例3 抽出用溶液が、19μg/mlの不活化ヒトセルロプラ
スミンに代えて3μg/mlの抗ヒトセルロプラスミン
モノクローナル抗体ID−1及び1.95μg/mlの
不活化ヒトセルロプラスミンを含むことを除き実施例1
と同じ操作を行った。結果を表3及び図3に示す。
【0025】
【表3】
【0026】実施例4 抽出用溶液のpHが5.8であることを除き実施例3と
同じ操作を行った。結果を表4及び図4に示す。
【0027】
【表4】
【0028】表4及び図4から明らかなように、抽出用
溶液のpHを5.8とすることにより検量線の直線性が
特に高く、かつ、測定のバラツキが特に低くなった。
【0029】
【発明の効果】本発明の方法によれば、血液中に高濃度
に含まれる例えばセルロプラスミンのような抗原を、希
釈操作をすることなく正確に免疫分析することができ
る。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の実施例1の方法により得られた検量
線を示す図である。
【図2】 本発明の実施例2の方法により得られた検量
線を示す図である。
【図3】 本発明の実施例3の方法により得られた検量
線を示す図である。
【図4】 本発明の実施例4の方法により得られた検量
線を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 門田 明彦 千葉県袖ケ浦市上泉1280番地 出光興産株 式会社中央研究所内

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 測定すべき抗原を含むかもしれない被検
    血液を濾紙に吸着させた血液吸着濾紙を、ブロッキング
    剤としてのタンパク質を含む溶液で抽出し、担体上に不
    動化された、前記抗原と反応する抗体と該抽出液とを反
    応させ、担体に結合された抗原量を測定することによ
    り、前記被検血液中の測定すべき抗原を測定することか
    ら成る免疫測定方法。
  2. 【請求項2】 前記担体に不動化された前記抗体の存在
    下において、前記抽出を行うことにより、前記抽出と前
    記抗原と抗体との反応を同時に行う請求項1記載の方
    法。
  3. 【請求項3】 担体に結合された抗原量は、該抗原と反
    応する二次抗体を該抗原と反応させ、担体に結合された
    該二次抗体の量を測定するサンドイッチ法により行う請
    求項1又は2記載の方法。
  4. 【請求項4】 前記血液吸着濾紙の抽出に用いられる液
    は、測定すべき抗原と競合する抗原をさらに含む請求項
    1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 【請求項5】 前記血液吸着濾紙の抽出に用いられる液
    は、測定すべき抗原と反応する前記抗体と競合する抗体
    をさらに含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の
    方法。
  6. 【請求項6】 前記血液吸着濾紙の抽出に用いられる液
    は、(1) 測定すべき抗原と競合する抗原と、(2) 測定す
    べき抗原と反応する前記抗体と競合する抗体をさらに含
    む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
  7. 【請求項7】 前記血液吸着濾紙の抽出に用いられる液
    のpHは5〜6である請求項1ないし6のいずれか1項
    に記載の方法。
  8. 【請求項8】 前記抽出液は、希釈することなく前記抗
    体と反応させる請求項1記載の方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002323499A (ja) * 2001-02-22 2002-11-08 Sanyo Chem Ind Ltd 血液中の腫瘍マーカー定量方法
JP2003240774A (ja) * 2002-02-18 2003-08-27 Sanyo Chem Ind Ltd 血液中の腫瘍マーカー定量方法
JP2003270250A (ja) * 2002-03-14 2003-09-25 Sanyo Chem Ind Ltd 血液中の心不全マーカー定量方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002323499A (ja) * 2001-02-22 2002-11-08 Sanyo Chem Ind Ltd 血液中の腫瘍マーカー定量方法
JP2003240774A (ja) * 2002-02-18 2003-08-27 Sanyo Chem Ind Ltd 血液中の腫瘍マーカー定量方法
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