JP2003121444A5 - - Google Patents
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前記のニックβ2グリコプロテインIの免疫学的測定は、例えば、特開2000−28607号公報に記載の「インタクトβ2グリコプロテインIと反応しないが、ニックβ2グリコプロテインIとは反応するモノクローナル抗体」(以下、抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体と称することがある)又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体としては、好ましくは、(1)インタクトβ2グリコプロテインIとは反応せず、ニックβ2グリコプロテインIと反応し、しかも、ニックβ2グリコプロテインIの第Vドメインに反応する[特に、ヒトβ2グリコプロテインIにおける(アミノ末端側から数えて)第242番目のアミノ酸残基〜第326番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する]モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマNGPI−59(FERM P−16892)から分泌されるモノクローナル抗体NGPI−59、あるいは、(2)インタクトβ2グリコプロテインIとは反応せず、ニックβ2グリコプロテインIと反応し、しかも、ニックβ2グリコプロテインIの第Iドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する[特に、ヒトβ2グリコプロテインIにおける(アミノ末端側から数えて)第1番目のアミノ酸残基〜第241番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する]モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマNGPI−60(FERM P−16893)から分泌されるモノクローナル抗体NGPI−60を挙げることができる。
前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体としては、好ましくは、(1)インタクトβ2グリコプロテインIとは反応せず、ニックβ2グリコプロテインIと反応し、しかも、ニックβ2グリコプロテインIの第Vドメインに反応する[特に、ヒトβ2グリコプロテインIにおける(アミノ末端側から数えて)第242番目のアミノ酸残基〜第326番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する]モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマNGPI−59(FERM P−16892)から分泌されるモノクローナル抗体NGPI−59、あるいは、(2)インタクトβ2グリコプロテインIとは反応せず、ニックβ2グリコプロテインIと反応し、しかも、ニックβ2グリコプロテインIの第Iドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する[特に、ヒトβ2グリコプロテインIにおける(アミノ末端側から数えて)第1番目のアミノ酸残基〜第241番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する]モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマNGPI−60(FERM P−16893)から分泌されるモノクローナル抗体NGPI−60を挙げることができる。
前記のトータルβ2グリコプロテインIの免疫学的測定は、例えば、特開2000−28607号公報に記載の「インタクトβ2グリコプロテインIと反応し、しかもニックβ2グリコプロテインIとも反応するモノクローナル抗体」(以下、抗トータルβ2GPIモノクローナル抗体と称することがある)又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗トータルβ2GPIモノクローナル抗体としては、インタクトβ2グリコプロテインI(特には、ヒトインタクトβ2グリコプロテインI)、及びニックβ2グリコプロテインI[特には、第Vドメインに開裂を受けたヒトニックβ2グリコプロテインI]と反応し、好ましくはインタクトβ2グリコプロテインI及びニックβ2グリコプロテインIの第Iドメイン〜第IVドメインからなる領域[例えば、ヒトβ2グリコプロテインIにおける(アミノ末端側から数えて)第1番目のアミノ酸残基〜第241番目のアミノ酸残基からなる領域]にエピトープを有するモノクローナル抗体が好ましく、ハイブリドーマNGPI−23(FERM P−16891)から分泌されるモノクローナル抗体NGPI−23がより好ましい。
前記の抗トータルβ2GPIモノクローナル抗体としては、インタクトβ2グリコプロテインI(特には、ヒトインタクトβ2グリコプロテインI)、及びニックβ2グリコプロテインI[特には、第Vドメインに開裂を受けたヒトニックβ2グリコプロテインI]と反応し、好ましくはインタクトβ2グリコプロテインI及びニックβ2グリコプロテインIの第Iドメイン〜第IVドメインからなる領域[例えば、ヒトβ2グリコプロテインIにおける(アミノ末端側から数えて)第1番目のアミノ酸残基〜第241番目のアミノ酸残基からなる領域]にエピトープを有するモノクローナル抗体が好ましく、ハイブリドーマNGPI−23(FERM P−16891)から分泌されるモノクローナル抗体NGPI−23がより好ましい。
抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体又は抗トータルβ2GPIモノクローナル抗体の抗体フラグメントとしては、前記の各モノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとの各モノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントを用いることができる。抗体フラグメントには、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、又はFv等が含まれる。
ニックβ2グリコプロテインIの免疫学的測定法は、例えば、前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第1抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第1抗体と体液試料とを接触させ、続いて、第1抗体とは別種の前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第2抗体、又は前記の抗トータルβ2GPIモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第2抗体と接触させると、前記の固定化第1抗体−ニックβ2グリコプロテインI複合体と結合した前記第2抗体又は前記の固定化第1抗体−ニックβ2グリコプロテインI複合体と結合しなかった前記第2抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、体液試料中のニックβ2グリコプロテインIの量を測定することができる(サンドイッチ法)。
また、前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも1種類と、別種の前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は前記の抗トータルβ2GPIモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント1種類とを不溶性担体に固定化し、これらの固定化したモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと体液試料とを接触させると、体液試料中のインタクトβ2グリコプロテインIとは凝集反応を起こさず、ニックβ2グリコプロテインIとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるので、体液試料中のニックβ2グリコプロテインIの量を測定することができる(凝集法)。
サンドイッチ法を利用するニックβ2グリコプロテインIの免疫学的分析方法では、具体的には、前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体(例えば、前記のモノクローナル抗体NGPI−59又はモノクローナル抗体NGPI−60)又はその抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する(第1抗体)。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤[例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)やゼラチン等]で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、未希釈の体液試料を加えて一定時間(例えば、5分〜3時間)及び一定温度(例えば、4℃〜40℃、好ましくは室温付近)で接触させ反応させる(1次反応)。続いて、前記第1次抗体として用いたモノクローナル抗体とは別種の前記の抗ニックβ2GPIモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第2抗体、又は前記の抗トータルβ2GPIモノクローナル抗体(例えば、モノクローナル抗体NGPI−23)若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第2抗体を加えて一定時間(例えば、5分〜3時間)及び一定温度(例えば、4℃〜40℃、好ましくは室温付近)で接触させ反応させる(2次反応)。これを適当な洗浄液(例えば、界面活性剤を含む生理食塩水)で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、体液試料中のニックβ2グリコプロテインIの量を算出することができる。また、1次反応と2次反応とを同時に行うことも可能である。
前記の脳梗塞患者より採取された血漿検体及び健常人より採取された血漿検体を試料とし、以下の方法にてニックβ2グリコプロテインIの測定を行った。
モノクローナル抗体NGPI−60の断片F(ab’)2を10μg/mLの濃度で含有するトリス緩衝液A〔50mmol/L Tris−HCl,0.15mol/L NaCl(pH7.5)〕100μLを96ウェルELISA用マイクロタイタープレート(Immulon−II;日本ダイナテック株式会社)の各ウェルに入れて、4℃で18時間放置した。そのプレートを洗浄液W(0.05%Tween−20:0.5mol/L NaCl)で3回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、ニックβ2グリコプロテインIを200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL及び6.25ng/mLの濃度になるようにトリス緩衝液B〔20mmol/L Tris−HCl,0.5mol/L NaCl,0.05%Tween−20(pH7.6)〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料100μL、あるいは、検体血漿を同様のトリス緩衝液Bにて5倍に希釈した検体試料100μLを加え、25℃で2時間反応させた。
モノクローナル抗体NGPI−60の断片F(ab’)2を10μg/mLの濃度で含有するトリス緩衝液A〔50mmol/L Tris−HCl,0.15mol/L NaCl(pH7.5)〕100μLを96ウェルELISA用マイクロタイタープレート(Immulon−II;日本ダイナテック株式会社)の各ウェルに入れて、4℃で18時間放置した。そのプレートを洗浄液W(0.05%Tween−20:0.5mol/L NaCl)で3回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、ニックβ2グリコプロテインIを200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL及び6.25ng/mLの濃度になるようにトリス緩衝液B〔20mmol/L Tris−HCl,0.5mol/L NaCl,0.05%Tween−20(pH7.6)〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料100μL、あるいは、検体血漿を同様のトリス緩衝液Bにて5倍に希釈した検体試料100μLを加え、25℃で2時間反応させた。
Claims (1)
- 体液試料中のニックβ2グリコプロテインIの濃度を測定することを特徴とする、脳梗塞を検出する方法。
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