JP4070443B2 - 脳梗塞を検出する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳梗塞を検出する方法に関する。本発明は、特に、脳梗塞患者の診断及び治療後の病態観察に利用することができる。
【０００２】
本明細書において、「ニックβ２グリコプロテインＩ」とは、プロテアーゼによりアミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。
また、本明細書において、プロテアーゼによる開裂を受けていないβ２グリコプロテインＩを、前記の「ニックβ２グリコプロテインＩ」と区別する必要がある場合には、「インタクトβ２グリコプロテインＩ」と称することがある。従って、本明細書において、単に「β２グリコプロテインＩ」と称する場合には、特に断わらない限り、「インタクトβ２グリコプロテインＩ」を指すものとする。
更に、本明細書において、「トータルβ２グリコプロテインＩ」とは、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」と前記「インタクトβ２グリコプロテインＩ」との両方を含む。
【０００３】
【従来の技術】
β２グリコプロテインＩは、健常人の血液中に約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在する糖タンパク質であり、陰性荷電リン脂質と結合する性質を有し、内因系凝固の接触相、ＡＤＰによる血小板凝集、活性化第５因子やリン脂質依存性プロトロンビナーゼ活性、プロテインＳとその結合タンパクとの相互反応などを抑制して抗凝固活性を示すことが知られている。
また、β２グリコプロテインＩの一部がプロテアーゼにより開裂を受けたニックβ２グリコプロテインＩでは、陰性荷電リン脂質との親和性が、インタクトβ２グリコプロテインＩの親和性から約１／１００以下に低下することが報告されている［Ｊ．Ｅ．Ｈｕｎｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９０巻，第２１４１頁〜第２１４５頁（１９９３年）］。様々な病態において、血管内凝固系が活性化されると、これに引き続いて線溶系酵素であるプラスミンが活性化されるので、このプラスミンによってβ２グリコプロテインＩが開裂を受け［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１巻，第４１７３頁〜第４１７９頁（１９９８年）］、陰性荷電リン脂質との親和性が低下し、ニックβ２グリコプロテインＩが血液中に遊離してくるものと考えられる。
【０００４】
脳梗塞は血栓による脳動脈の閉塞により生じる疾患であり、日本における死因の第３位になっている脳卒中の主病型で死亡率の高い疾患である。
従来から、脳梗塞の診断にはＣＴ検査などによる画像診断がなされているが、これに加えて、血中の脳梗塞特異的な分子マーカーを測定することが可能となれば、脳梗塞の予知や治療後の病態のスクリーニングに有効に活用されるものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、脳梗塞検出可能な方法を開発する目的で鋭意研究したところ、ニックβ２グリコプロテインＩは健常人に比べ脳梗塞患者で有意に高値となること、更に、トータルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率も、脳梗塞の診断に有効であることを見出した。
また、従来の凝固線溶系マーカー、例えば、ＴＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値では、健常人における正常基準値と脳梗塞患者（あるいは脳梗塞経験患者）の測定値との間に統計学的な有意差が認められない。これに対し、ニックβ２グリコプロテインＩ（例えば、プラスミンにより開裂を受けたニックβ２グリコプロテインＩ）は、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に高値となり、更に、トータルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率も、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に高値となるので、ニックβ２グリコプロテインＩ、又はトータルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率は、脳梗塞の診断に有効な高感度のマーカーとなる。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することを特徴とする、脳梗塞を検出する方法に関する。
また、本発明は、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指標とする、脳梗塞を検出する方法に関する。
更に、本発明の好ましい態様においては、前記の濃度測定を免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行う。
【０００７】
本明細書において、「ニックβ２グリコプロテインＩ」とは、前記のとおり、プロテアーゼによりアミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。具体的には、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」には、例えば、（１）プラスミンにより第Ｖドメインに開裂（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目のリジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩ、及び（２）顆粒球エラスターゼにより第Ｖドメインに開裂（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１４番目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩが含まれる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明方法によれば、脳梗塞を高感度に検出することができる。脳梗塞は、血栓による脳動脈の閉塞により生じる疾患である。頭蓋内外の脳動脈に、狭窄ないし閉塞により、脳循環障害が起こり、その結果、脳組織に非可逆的に損傷が起こることにより脳梗塞となる。脳組織の損傷により、種々の神経症状を呈する。脳梗塞は、生じる血管の閉塞機序により、塞栓性の心原性脳梗塞、血栓性のラクナ梗塞、あるいは前記２者に血行力学性因子が加わるアテローム血栓性脳梗塞に分類される。その診断は、従来から、例えば、画像診断（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）所見及び臨床所見（神経徴候、等）により行われている［東ら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２９巻２号，第１３８項〜１４６項（２００１年）］。また、脳梗塞（ラクナ梗塞）の診断への補助的アプローチとして、凝血学的検査としてＴＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、ＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値の測定が行われている［山口ら，今日の診断指針，第３版，医学書院，第４９９項〜５００項（１９９２年）］。
本明細書において「脳梗塞」とは、例えば、上記の診断方法により診断された疾患病態をいう。また、前記の脳梗塞を経験し、その後の治療経過を観察中の病態も含まれる。
【０００９】
本発明方法においては、任意の哺乳動物（特にはヒト）の任意の体液試料を用いることができる。体液試料としては、例えば、血液試料、特には血漿、血清を挙げることができ、特に血漿を用いるのが好ましい。
【００１０】
本発明者は、後述する実施例に示すとおり、脳梗塞患者においては、健常人と比較して、体液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃度が統計学的に有意に高くなることを見出した。
従って、本発明方法においては、検査対象者から採取した体液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することによって、脳梗塞を検出することができる。
ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行うことができる。
【００１１】
また、本発明者は、後述する実施例に示すとおり、脳梗塞患者では、健常人と比較して、体液試料中においてトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）が統計学的に有意に高くなることを見出した。
従って、本発明方法においては、検査対象者から採取した体液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）を算出し、そしてそのＲ値を指標とすることによって、脳梗塞を検出することができる。
ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、前記の免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行うことができ、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度も、同様に、免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行うことができる。
【００１２】
前記のニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応しないが、ニックβ２グリコプロテインＩとは反応するモノクローナル抗体」（以下、抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体としては、好ましくは、（１）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する［特に、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９２）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、あるいは、（２）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する［特に、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ−６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９３）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を挙げることができる。
【００１３】
前記のトータルβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応し、しかもニックβ２グリコプロテインＩとも反応するモノクローナル抗体」（以下、抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体としては、インタクトβ２グリコプロテインＩ（特には、ヒトインタクトβ２グリコプロテインＩ）、及びニックβ２グリコプロテインＩ［特には、第Ｖドメインに開裂を受けたヒトニックβ２グリコプロテインＩ］と反応し、好ましくはインタクトβ２グリコプロテインＩ及びニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域［例えば、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域］にエピトープを有するモノクローナル抗体が好ましく、ハイブリドーマＮＧＰＩ−２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９１）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３がより好ましい。
【００１４】
抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又は抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体の抗体フラグメントとしては、前記の各モノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとの各モノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントを用いることができる。抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。
【００１５】
ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定法は、例えば、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と体液試料とを接触させ、続いて、第１抗体とは別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体と接触させると、前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合した前記第２抗体又は前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を測定することができる（サンドイッチ法）。
【００１６】
また、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類とを不溶性担体に固定化し、これらの固定化したモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと体液試料とを接触させると、体液試料中のインタクトβ２グリコプロテインＩとは凝集反応を起こさず、ニックβ２グリコプロテインＩとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を測定することができる（凝集法）。
【００１７】
従って、前記のニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法においては、体液試料を前処理せずに（例えば、クロマトグラフィーの手法で、予めインタクトβ２グリコプロテインＩとニックβ２グリコプロテインＩとを分離操作することなく）、そのまま使用しても、体液試料中に存在するインタクトβ２グリコプロテインＩの妨害を避けることができる。
【００１８】
サンドイッチ法を利用するニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法では、具体的には、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、前記のモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９又はモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０）又はその抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、未希釈の体液試料を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、前記第１次抗体として用いたモノクローナル抗体とは別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３）若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を算出することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行うことも可能である。
【００１９】
トータルβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定法は、例えば、前記のニックβ２グリコプロテインＩの測定法において、抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントの代わりに抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを用いて同様の方法により測定することが可能である（サンドイッチ法）。
【００２０】
前記のサンドイッチ法による免疫学的分析方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００２１】
凝集反応を利用する免疫学的分析方法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。
【００２２】
前記のニックβ２グリコプロテインＩ及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、生化学的に測定することもできる。例えば、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩの生化学的測定法は、過塩素酸処理したヒト血漿を、ＨｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより分画することで実施することができる［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１巻，第４１７３頁〜第４１７９頁，（１９９８年）］。この際、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩは、それらの溶出位置の違いにより（すなわち、ヘパリンに対するアフィニティーの違いにより）、分離が可能となる。溶出フラクションのタンパク定量を行うことにより、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩのそれぞれの量を測定することができる。前記のニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩのそれぞれの量からトータルβ２グリコプロテインＩの濃度を算出し、これらの値からトータルβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ＝Ｒ）を求めることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ニックβ２グリコプロテインＩの測定》
本実施例では、脳梗塞患者群、及び健常人群におけるニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定した。ここで、脳梗塞患者群は、脳梗塞経験者で定期的に経過観察をしている患者である。
【００２４】
前記の脳梗塞患者より採取された血漿検体及び健常人より採取された血漿検体を試料とし、以下の方法にてニックβ２グリコプロテインＩの測定を行った。
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０の断片Ｆ（ａｂ’）2を１０μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕１００μＬを９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、４℃で１８時間放置した。そのプレートを洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０：０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、ニックβ２グリコプロテインＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料１００μＬ、あるいは、検体血漿を同様のトリス緩衝液Ｂにて５倍に希釈した検体試料１００μＬを加え、２５℃で２時間反応させた。
【００２５】
次に、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後に、ビオチン標識モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３の断片Ｆ（ａｂ’）2を２μｇ／ｍＬの量で含有するトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。続いて、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ダコ社）１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液Ｗで３回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍｏｌ／Ｌフェノール／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン／０．００５％過酸化水素を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）］を各ウェルに２００μＬずつ加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。各濃度のスタンダード試料の吸光度をもとに検量線を作製し、この検量線より検体血漿中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度を求めた。
【００２６】
結果を表１及び図１に示す。各群のニックβ２グリコプロテインＩ濃度の平均値±ＳＤは、健常人群（４４例）が５８．６０±３８．９８ｎｇ／ｍＬ、脳梗塞患者群（６３例）が１９６．６９±１４５．７５ｎｇ／ｍＬであった。健常人に対して脳梗塞患者群はｐ＜０．００１であり、統計学的に有意な差が認められた。
【００２７】
【００２８】
【実施例２】
《トータルβ２グリコプロテインＩ及びＲ値の測定》
本実施例では、脳梗塞患者群、並びに健常人群におけるトータルβ２グリコプロテインＩを測定し、Ｒ値を算出した。
実施例１と同じ血漿検体を試料として使用し、以下の方法にてトータルβ２グリコプロテインＩの測定を行った。
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３を５μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕５０μＬを９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、４℃で１８時間放置した。そのプレートを前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、インタクトβ２グリコプロテインＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料５０μＬ及び、検体血漿を同様のトリス緩衝液Ｂにて８０００倍に希釈した検体試料５０μＬを加え、２５℃で２時間反応させた。
【００２９】
次に、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後に、ビオチン標識抗ヒトβ２グリコプロテインＩウサギポリクローナル抗体（セダレーン社）を２．５μｇ／ｍＬの量で含有するトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕５０μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。続いて、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ダコ社）１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液Ｗで３回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍｏｌ／Ｌフェノール／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン／０．００５％過酸化水素を含むトリス緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕］を各ウェルに２００μＬずつ加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。各濃度のスタンダード試料の吸光度をもとに検量線を作製し、この検量線より検体血漿中のトータルβ２グリコプロテインＩ濃度を求めた。
【００３０】
前記実施例１で測定したニックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）を用いて、本実施例で測定したトータルβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ＝Ｒ）を個々の検体について算出した。その結果を表２及び図２に示す。健常人に対して脳梗塞患者群ではｐ＜０．００１となり、統計学的に有意な差が認められた。
【００３１】
【００３２】
【実施例３】
《ＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤＤ測定値とニックβ２グリコプロテインＩ値の相関性の検定》
本実施例においては、脳梗塞患者群に関して、従来法によってＴＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値を測定し、ニックβ２グリコプロテインＩ値との相関性の検討を行った。
本実施例でも、実施例１及び２で用いた同じ血漿検体を使用した。前記凝固線溶系マーカーの測定は、ＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤＤのいずれに関しても凝集法（ヤトロン）を使用した。
【００３３】
その結果、ニックβ２グリコプロテインＩとの相関は、それぞれ以下の通りであった。
ＴＡＴ値：ｒ＝０．０１７、
ＰＩＣ値：ｒ＝−０．０２８、
ＤＤ値：ｒ＝−０．０１８。
すなわち、いずれの測定値ともニックβ２グリコプロテインＩとの相関性は認められなかった。
【００３４】
【実施例４】
《脳梗塞患者群のＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤＤ測定値における正常基準値との比較》
実施例３で測定したＴＡＴ、ＰＩＣ及びＤＤ測定値を用いて、これらの値と正常基準値（各試薬の添付文書に記載された参考基準値による）との比較を行った。結果を表３に示す。
【００３５】
【００３６】
その結果、脳梗塞患者群におけるＴＡＴ、ＰＩＣ及びＤＤの値はいずれも正常基準値とほとんど統計学的有意差が認められなかった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、脳梗塞を高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法によるサンドイッチ酵素免疫測定法により測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテインＩ（ニックβ２ＧＰＩ）濃度の値を、健常人及び脳梗塞患者群別に示した棒グラフである。
【図２】本発明方法によるサンドイッチ酵素免疫測定法にて測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテインＩ濃度及びトータルβ２グリコプロテインＩ濃度から算出した比率Ｒを、健常人及び脳梗塞患者群別に示した棒グラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳梗塞を検出する方法に関する。本発明は、特に、脳梗塞患者の診断及び治療後の病態観察に利用することができる。
【０００２】
本明細書において、「ニックβ２グリコプロテインＩ」とは、プロテアーゼによりアミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。
また、本明細書において、プロテアーゼによる開裂を受けていないβ２グリコプロテインＩを、前記の「ニックβ２グリコプロテインＩ」と区別する必要がある場合には、「インタクトβ２グリコプロテインＩ」と称することがある。従って、本明細書において、単に「β２グリコプロテインＩ」と称する場合には、特に断わらない限り、「インタクトβ２グリコプロテインＩ」を指すものとする。
更に、本明細書において、「トータルβ２グリコプロテインＩ」とは、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」と前記「インタクトβ２グリコプロテインＩ」との両方を含む。
【０００３】
【従来の技術】
β２グリコプロテインＩは、健常人の血液中に約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在する糖タンパク質であり、陰性荷電リン脂質と結合する性質を有し、内因系凝固の接触相、ＡＤＰによる血小板凝集、活性化第５因子やリン脂質依存性プロトロンビナーゼ活性、プロテインＳとその結合タンパクとの相互反応などを抑制して抗凝固活性を示すことが知られている。
また、β２グリコプロテインＩの一部がプロテアーゼにより開裂を受けたニックβ２グリコプロテインＩでは、陰性荷電リン脂質との親和性が、インタクトβ２グリコプロテインＩの親和性から約１／１００以下に低下することが報告されている［Ｊ．Ｅ．Ｈｕｎｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９０巻，第２１４１頁〜第２１４５頁（１９９３年）］。様々な病態において、血管内凝固系が活性化されると、これに引き続いて線溶系酵素であるプラスミンが活性化されるので、このプラスミンによってβ２グリコプロテインＩが開裂を受け［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１巻，第４１７３頁〜第４１７９頁（１９９８年）］、陰性荷電リン脂質との親和性が低下し、ニックβ２グリコプロテインＩが血液中に遊離してくるものと考えられる。
【０００４】
脳梗塞は血栓による脳動脈の閉塞により生じる疾患であり、日本における死因の第３位になっている脳卒中の主病型で死亡率の高い疾患である。
従来から、脳梗塞の診断にはＣＴ検査などによる画像診断がなされているが、これに加えて、血中の脳梗塞特異的な分子マーカーを測定することが可能となれば、脳梗塞の予知や治療後の病態のスクリーニングに有効に活用されるものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、脳梗塞検出可能な方法を開発する目的で鋭意研究したところ、ニックβ２グリコプロテインＩは健常人に比べ脳梗塞患者で有意に高値となること、更に、トータルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率も、脳梗塞の診断に有効であることを見出した。
また、従来の凝固線溶系マーカー、例えば、ＴＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値では、健常人における正常基準値と脳梗塞患者（あるいは脳梗塞経験患者）の測定値との間に統計学的な有意差が認められない。これに対し、ニックβ２グリコプロテインＩ（例えば、プラスミンにより開裂を受けたニックβ２グリコプロテインＩ）は、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に高値となり、更に、トータルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率も、健常人に比べ脳梗塞患者で統計学的に有意に高値となるので、ニックβ２グリコプロテインＩ、又はトータルβ２グリコプロテインＩ濃度に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度の比率は、脳梗塞の診断に有効な高感度のマーカーとなる。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することを特徴とする、脳梗塞を検出する方法に関する。
また、本発明は、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指標とする、脳梗塞を検出する方法に関する。
更に、本発明の好ましい態様においては、前記の濃度測定を免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行う。
【０００７】
本明細書において、「ニックβ２グリコプロテインＩ」とは、前記のとおり、プロテアーゼによりアミノ酸配列の一部に開裂を受けて２本のポリペプチド鎖からなるものの、それらがジスルフィド結合により結合しているβ２グリコプロテインＩを意味する。具体的には、前記「ニックβ２グリコプロテインＩ」には、例えば、（１）プラスミンにより第Ｖドメインに開裂（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１７番目のリジン残基と第３１８番目のトレオニン残基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩ、及び（２）顆粒球エラスターゼにより第Ｖドメインに開裂（ヒトβ２グリコプロテインＩにおいては、第３１４番目のアラニン残基と第３１５番目のフェニルアラニン残基との間で開裂）を受けたニックβ２グリコプロテインＩが含まれる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明方法によれば、脳梗塞を高感度に検出することができる。脳梗塞は、血栓による脳動脈の閉塞により生じる疾患である。頭蓋内外の脳動脈に、狭窄ないし閉塞により、脳循環障害が起こり、その結果、脳組織に非可逆的に損傷が起こることにより脳梗塞となる。脳組織の損傷により、種々の神経症状を呈する。脳梗塞は、生じる血管の閉塞機序により、塞栓性の心原性脳梗塞、血栓性のラクナ梗塞、あるいは前記２者に血行力学性因子が加わるアテローム血栓性脳梗塞に分類される。その診断は、従来から、例えば、画像診断（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）所見及び臨床所見（神経徴候、等）により行われている［東ら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２９巻２号，第１３８項〜１４６項（２００１年）］。また、脳梗塞（ラクナ梗塞）の診断への補助的アプローチとして、凝血学的検査としてＴＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、ＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値の測定が行われている［山口ら，今日の診断指針，第３版，医学書院，第４９９項〜５００項（１９９２年）］。
本明細書において「脳梗塞」とは、例えば、上記の診断方法により診断された疾患病態をいう。また、前記の脳梗塞を経験し、その後の治療経過を観察中の病態も含まれる。
【０００９】
本発明方法においては、任意の哺乳動物（特にはヒト）の任意の体液試料を用いることができる。体液試料としては、例えば、血液試料、特には血漿、血清を挙げることができ、特に血漿を用いるのが好ましい。
【００１０】
本発明者は、後述する実施例に示すとおり、脳梗塞患者においては、健常人と比較して、体液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃度が統計学的に有意に高くなることを見出した。
従って、本発明方法においては、検査対象者から採取した体液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することによって、脳梗塞を検出することができる。
ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行うことができる。
【００１１】
また、本発明者は、後述する実施例に示すとおり、脳梗塞患者では、健常人と比較して、体液試料中においてトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）が統計学的に有意に高くなることを見出した。
従って、本発明方法においては、検査対象者から採取した体液試料中に含まれているニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）（すなわち、Ｒ値）を算出し、そしてそのＲ値を指標とすることによって、脳梗塞を検出することができる。
ニックβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、前記の免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行うことができ、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度も、同様に、免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行うことができる。
【００１２】
前記のニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応しないが、ニックβ２グリコプロテインＩとは反応するモノクローナル抗体」（以下、抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体としては、好ましくは、（１）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｖドメインに反応する［特に、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第２４２番目のアミノ酸残基〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ−５９（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９２）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９、あるいは、（２）インタクトβ２グリコプロテインＩとは反応せず、ニックβ２グリコプロテインＩと反応し、しかも、ニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域に反応する［特に、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域にエピトープを有する］モノクローナル抗体、より好ましくは、ハイブリドーマＮＧＰＩ−６０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９３）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０を挙げることができる。
【００１３】
前記のトータルβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定は、例えば、特開２０００−２８６０７号公報に記載の「インタクトβ２グリコプロテインＩと反応し、しかもニックβ２グリコプロテインＩとも反応するモノクローナル抗体」（以下、抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体と称することがある）又はその抗体フラグメントを用いて実施することができる。
前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体としては、インタクトβ２グリコプロテインＩ（特には、ヒトインタクトβ２グリコプロテインＩ）、及びニックβ２グリコプロテインＩ［特には、第Ｖドメインに開裂を受けたヒトニックβ２グリコプロテインＩ］と反応し、好ましくはインタクトβ２グリコプロテインＩ及びニックβ２グリコプロテインＩの第Ｉドメイン〜第IVドメインからなる領域［例えば、ヒトβ２グリコプロテインＩにおける（アミノ末端側から数えて）第１番目のアミノ酸残基〜第２４１番目のアミノ酸残基からなる領域］にエピトープを有するモノクローナル抗体が好ましく、ハイブリドーマＮＧＰＩ−２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８９１）から分泌されるモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３がより好ましい。
【００１４】
抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又は抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体の抗体フラグメントとしては、前記の各モノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとの各モノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントを用いることができる。抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。
【００１５】
ニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定法は、例えば、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と体液試料とを接触させ、続いて、第１抗体とは別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体と接触させると、前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合した前記第２抗体又は前記の固定化第１抗体−ニックβ２グリコプロテインＩ複合体と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を測定することができる（サンドイッチ法）。
【００１６】
また、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少なくとも１種類と、別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメント１種類とを不溶性担体に固定化し、これらの固定化したモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと体液試料とを接触させると、体液試料中のインタクトβ２グリコプロテインＩとは凝集反応を起こさず、ニックβ２グリコプロテインＩとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるので、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を測定することができる（凝集法）。
【００１７】
従って、前記のニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法においては、体液試料を前処理せずに（例えば、クロマトグラフィーの手法で、予めインタクトβ２グリコプロテインＩとニックβ２グリコプロテインＩとを分離操作することなく）、そのまま使用しても、体液試料中に存在するインタクトβ２グリコプロテインＩの妨害を避けることができる。
【００１８】
サンドイッチ法を利用するニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法では、具体的には、前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、前記のモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−５９又はモノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０）又はその抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、未希釈の体液試料を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、前記第１次抗体として用いたモノクローナル抗体とは別種の前記の抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体、又は前記の抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３）若しくはその抗体フラグメントに標識を付した第２抗体を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの量を算出することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行うことも可能である。
【００１９】
トータルβ２グリコプロテインＩの免疫学的測定法は、例えば、前記のニックβ２グリコプロテインＩの測定法において、抗ニックβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントの代わりに抗トータルβ２ＧＰＩモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを用いて同様の方法により測定することが可能である（サンドイッチ法）。
【００２０】
前記のサンドイッチ法による免疫学的分析方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００２１】
凝集反応を利用する免疫学的分析方法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。
【００２２】
前記のニックβ２グリコプロテインＩ及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度は、例えば、生化学的に測定することもできる。例えば、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩの生化学的測定法は、過塩素酸処理したヒト血漿を、ＨｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより分画することで実施することができる［大蔵ら，Ｂｌｏｏｄ，第９１巻，第４１７３頁〜第４１７９頁，（１９９８年）］。この際、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩは、それらの溶出位置の違いにより（すなわち、ヘパリンに対するアフィニティーの違いにより）、分離が可能となる。溶出フラクションのタンパク定量を行うことにより、ニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩのそれぞれの量を測定することができる。前記のニックβ２グリコプロテインＩ及びインタクトβ２グリコプロテインＩのそれぞれの量からトータルβ２グリコプロテインＩの濃度を算出し、これらの値からトータルβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ＝Ｒ）を求めることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ニックβ２グリコプロテインＩの測定》
本実施例では、脳梗塞患者群、及び健常人群におけるニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定した。ここで、脳梗塞患者群は、脳梗塞経験者で定期的に経過観察をしている患者である。
【００２４】
前記の脳梗塞患者より採取された血漿検体及び健常人より採取された血漿検体を試料とし、以下の方法にてニックβ２グリコプロテインＩの測定を行った。
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−６０の断片Ｆ（ａｂ’）2を１０μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕１００μＬを９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、４℃で１８時間放置した。そのプレートを洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０：０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、ニックβ２グリコプロテインＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料１００μＬ、あるいは、検体血漿を同様のトリス緩衝液Ｂにて５倍に希釈した検体試料１００μＬを加え、２５℃で２時間反応させた。
【００２５】
次に、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後に、ビオチン標識モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３の断片Ｆ（ａｂ’）2を２μｇ／ｍＬの量で含有するトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。続いて、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ダコ社）１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液Ｗで３回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍｏｌ／Ｌフェノール／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン／０．００５％過酸化水素を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）］を各ウェルに２００μＬずつ加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。各濃度のスタンダード試料の吸光度をもとに検量線を作製し、この検量線より検体血漿中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度を求めた。
【００２６】
結果を表１及び図１に示す。各群のニックβ２グリコプロテインＩ濃度の平均値±ＳＤは、健常人群（４４例）が５８．６０±３８．９８ｎｇ／ｍＬ、脳梗塞患者群（６３例）が１９６．６９±１４５．７５ｎｇ／ｍＬであった。健常人に対して脳梗塞患者群はｐ＜０．００１であり、統計学的に有意な差が認められた。
【００２７】
【実施例２】
《トータルβ２グリコプロテインＩ及びＲ値の測定》
本実施例では、脳梗塞患者群、並びに健常人群におけるトータルβ２グリコプロテインＩを測定し、Ｒ値を算出した。
実施例１と同じ血漿検体を試料として使用し、以下の方法にてトータルβ２グリコプロテインＩの測定を行った。
モノクローナル抗体ＮＧＰＩ−２３を５μｇ／ｍＬの濃度で含有するトリス緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕５０μＬを９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに入れて、４℃で１８時間放置した。そのプレートを前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、インタクトβ２グリコプロテインＩを２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ及び６．２５ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料５０μＬ及び、検体血漿を同様のトリス緩衝液Ｂにて８０００倍に希釈した検体試料５０μＬを加え、２５℃で２時間反応させた。
【００２９】
次に、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後に、ビオチン標識抗ヒトβ２グリコプロテインＩウサギポリクローナル抗体（セダレーン社）を２．５μｇ／ｍＬの量で含有するトリス緩衝液Ｂ〔２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）〕５０μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。続いて、前記洗浄液Ｗ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０−０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、トリス緩衝液Ｂにて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン（ダコ社）１００μＬを加え、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液Ｗで３回洗浄した後、酵素基質液［１０ｍｍｏｌ／Ｌフェノール／０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン／０．００５％過酸化水素を含むトリス緩衝液Ａ〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）〕］を各ウェルに２００μＬずつ加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。各濃度のスタンダード試料の吸光度をもとに検量線を作製し、この検量線より検体血漿中のトータルβ２グリコプロテインＩ濃度を求めた。
【００３０】
前記実施例１で測定したニックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）を用いて、本実施例で測定したトータルβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩ濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ＝Ｒ）を個々の検体について算出した。その結果を表２及び図２に示す。健常人に対して脳梗塞患者群ではｐ＜０．００１となり、統計学的に有意な差が認められた。
【００３１】
【実施例３】
《ＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤＤ測定値とニックβ２グリコプロテインＩ値の相関性の検定》
本実施例においては、脳梗塞患者群に関して、従来法によってＴＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）値、ＰＩＣ（プラスミン・α２プラスミンインヒビター複合体）値、及びＤＤ（Ｄ−Ｄダイマー）値を測定し、ニックβ２グリコプロテインＩ値との相関性の検討を行った。
本実施例でも、実施例１及び２で用いた同じ血漿検体を使用した。前記凝固線溶系マーカーの測定は、ＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤＤのいずれに関しても凝集法（ヤトロン）を使用した。
【００３３】
その結果、ニックβ２グリコプロテインＩとの相関は、それぞれ以下の通りであった。
ＴＡＴ値：ｒ＝０．０１７、
ＰＩＣ値：ｒ＝−０．０２８、
ＤＤ値：ｒ＝−０．０１８。
すなわち、いずれの測定値ともニックβ２グリコプロテインＩとの相関性は認められなかった。
【００３４】
【実施例４】
《脳梗塞患者群のＴＡＴ、ＰＩＣ、及びＤＤ測定値における正常基準値との比較》
実施例３で測定したＴＡＴ、ＰＩＣ及びＤＤ測定値を用いて、これらの値と正常基準値（各試薬の添付文書に記載された参考基準値による）との比較を行った。結果を表３に示す。
【００３５】
その結果、脳梗塞患者群におけるＴＡＴ、ＰＩＣ及びＤＤの値はいずれも正常基準値とほとんど統計学的有意差が認められなかった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、脳梗塞を高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法によるサンドイッチ酵素免疫測定法により測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテインＩ（ニックβ２ＧＰＩ）濃度の値を、健常人及び脳梗塞患者群別に示した棒グラフである。
【図２】本発明方法によるサンドイッチ酵素免疫測定法にて測定した血漿検体中のニックβ２グリコプロテインＩ濃度及びトータルβ２グリコプロテインＩ濃度から算出した比率Ｒを、健常人及び脳梗塞患者群別に示した棒グラフである。
Claims (3)
- 体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度を測定することを特徴とする、脳梗塞を検出する方法。
- 体液試料中のニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）及びトータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）を測定し、トータルβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｔ）に対するニックβ２グリコプロテインＩの濃度（Ｎ）の比率（Ｎ／Ｔ）を算出し、その比率を指標とする、請求項１に記載の方法。
- 濃度測定を免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行う、請求項１又は２に記載の方法。
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