JPWO2007072896A1

JPWO2007072896A1 - 急性冠症候群の予後予測方法

Info

Publication number: JPWO2007072896A1
Application number: JP2007551138A
Authority: JP
Inventors: 典昭久米; 悟郎小南
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2009-06-04
Also published as: CN101341406A; AU2006328412B2; WO2007072896A1; TW200739077A; EP1975614A4; US20110045504A1; CA2639624A1; AU2006328412A1; KR20080078675A; EP1975614A1

Abstract

本発明は、急性冠症候群の予後予測のための診断用マーカーを提供することを目的とする。本発明に従って、血中における可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定することにより、急性冠症候群の再発リスクの予測が可能となる。

Description

本発明は、将来の急性冠症候群の再発リスクを予測する方法及びこの方法を実施するためのキットに関する。

不安定狭心症から急性心筋梗塞、さらにはこれらに合併する心臓性突然死までの一連の病態は包括的に急性冠症候群（ＡＣＳ）と呼ばれる。いずれも心臓に栄養を供給する冠動脈の動脈硬化により生じた粥腫（プラーク）が崩壊し、これに血栓が付着した結果、冠動脈の狭窄や閉塞が生じて発症するとされる。現代社会において、急性冠症候群は増加の一途をたどっているが、その大部分は何の前兆もなく突然に発症するため、救命できず突然死の経過をたどることも多い。また、たとえ速やかに病院に収容された場合でも、救命のために緊急心臓手術、緊急経皮経管冠動脈血管形成術（ＰＣＩ）等が必要になることも多く、その医療経済上の負担は計り知れない。

抗血小板剤や、コレステロール低下剤(スタチン)などの治療により、急性冠症候群の再発はある程度は防止できるようになったが、それでも大規模臨床試験の示すところでは、スタチンによる再発症の減少は３０％程度であり、残りの７０％の患者ではこのような薬物での治療でも予防できていないことになる。したがって急性冠症候群の再発症を完全に阻止する新しい治療法が期待されるが、現在のところこのような治療法はない。このような状況下においては、発症リスクの高い症例を正確に同定し、集中的に管理することで発症を未然に防ぐか、それができなかったとしても病院外での突然の発症を防ぐことが救命と予後の改善のためには有用であろうと考えられる。

現在のところ臨床の現場においては、冠動脈造影・左室造影を含む心臓カテーテル検査や心エコーなどの機器検査を行う、もしくはバイオマーカーを利用することによって再発の予知を行っている。しかし、前者は時間・コスト面から診断として簡便に行えるものではなく患者の負担も決して軽くない。また再発予知という観点からは完全な情報を提供しない。例えば、冠動脈造影での冠動脈の狭窄度では、発症の危険を予知できないことがすでにこれまでの研究で示されている（後記非特許文献４）。後者においては、トロポニンＴ、Ｈ−ＦＡＢＰ、高感度ＣＲＰなど急性期のマーカーや、総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、レムナント様リポタンパク質（ＲＬＰ）コレステロールなどの危険因子としてのマーカーが利用されているが、その感度・特異度から、再発予知のためのマーカーとしての効果については満足できるものではなかった（後記非特許文献５）

急性冠症候群の発症は、粥状動脈硬化プラークの破綻あるいは糜爛に続発して生じる閉塞性の血栓形成に起因することが近年明らかになってきた。プラークの破綻、糜爛には血管壁内での催炎症反応、酸化ストレスが重要な役割を担うことが示されてきたが、中でも酸化変性を受けたＬＤＬ（低比重リポタンパク質）により惹起された、プロテアーゼ活性の増加及びアポトーシス（細胞死）を中心とする血管壁の機能障害がその主要な原因として知られている。ＬＯＸ−１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅｏｘｉｄｉｚｅｄｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ−１：レクチン様酸化低比重リポタンパク質受容体−１）は、この酸化ＬＤＬの受容体タンパク質として同定されたものである（後記非特許文献１）。このＬＯＸ−１は、生体内において通常膜タンパク質として細胞表面に発現しているが、プロテアーゼの作用により膜貫通部近傍の細胞外ドメインにて切断されて可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＬＯＸ−１として血中に遊離することが知られている（後記非特許文献２）。また急性冠症候群の急性期（ａｃｕｔｅｐｈａｓｅ）においては、この可溶性ＬＯＸ−１の血中濃度が著明に上昇することから、急性冠症候群の一次的診断マーカーとしての可能性が報告されている（後記非特許文献３）。しかし、急性冠症候群の再発を予測するためのマーカーとしての可能性については未知であった。
Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、Ｖｏｌ．３８６、ｐ７３−７７Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、２０００、２０（３）、ｐ７１５−７２０Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００５、１１２（６）、ｐ８１２−８１８ＬｅｖｉｎｅＧＮ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９５年、第３３２巻、５１２〜５２１ページ：Ｌｉｂｂｙ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９５年、第９１巻、２８４４〜２８５０頁Ｍ．Ｐａｎｔｅｇｈｉｎｉ、Ｒｏｌｅａｎｄｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ：ＥｕｒｏｐｅａｎＨｅａｒｔＪ．（２００４）２５、１１８７−１１９６

急性冠症候群の再発を未然に防ぐため、感度が高い予後予測方法を提供することが本発明の目的である。

本発明者らは、急性冠症候群に罹患した患者について約７年間における予後の追跡調査を行ない、可溶性ＬＯＸ−１の血中濃度と急性冠症候群の再発率との関係を調べた。そして、可溶性ＬＯＸ−１の濃度と急性冠症候群の再発率との間には高い相関があることを見出した結果、本発明を完成させた。

本発明に従って被験者由来の被検試料に含まれる可溶性ＬＯＸ−１濃度を測定することにより、急性冠症候群の再発を予知することが可能となる。

ヒト可溶性ＬＯＸ−１の標準曲線である。急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡に至った患者群について、ヒト可溶性ＬＯＸ−１を測定した結果の中間値、１０、２５、７５、９０パーセンタイルを示したグラフである。急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡に至った患者群について、高感度ＣＲＰを測定した結果の中間値、１０、２５、７５、９０パーセンタイルを示したグラフである。急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡に至った患者群について、心臓超音波法による左室駆出分画（ＬＶＥＦ）を測定した結果の中間値、１０、２５、７５、９０パーセンタイルを示したグラフである。

急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡に至った患者群について、トロポニンＴを測定した結果の中間値、１０、２５、７５、９０パーセンタイルを示したグラフである。ヒト可溶性ＬＯＸ−１の血中濃度のカットオフを５ｎｇ／ｍｌに設定した場合に急性冠症候群の再発症（死亡も含む）の有無の追跡結果をカプラン−マイヤー曲線で示したものである。ヒト可溶性ＬＯＸ−１の血中濃度のカットオフを３ｎｇ／ｍｌに設定した場合に急性冠症候群の再発症（死亡も含む）の有無の追跡結果をカプラン−マイヤー曲線で示したものである。

本発明は、被検者由来の被検試料における可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する工程を含む、その測定値を急性冠症候群が再発する可能性の指標とする、急性冠症候群を再発する可能性の高い被検者の選別方法に関するものである。また、本発明は、被検者由来の被検試料における可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する工程を含み、ここで、被検試料における濃度が、基準値よりも大きくなる場合、前記被検者に急性冠症候群が再発する可能性が高いことを指標とする、急性冠症候群を再発する可能性が高い被検者の選別方法に関するものである。この方法を用いれば、急性冠症候群を再発する可能性が高い被検者を容易に選別、もしくはその発症リスクを予測することができる。

具体的には、本発明には、被検者に由来する試料中の可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する工程が含まれる。「被検者」は特に限定されないが、健常人のほかに急性冠症候群に罹患している者（測定の結果、罹患していたことが判明した者も含む）や、急性冠症候群に罹患していると疑われる者が好ましい。

上記被検者から試料（以下、「被検試料」という）を採取する。被検試料には、尿、全血、血漿、血清、または血液に由来するものが含まれるが、血清や血漿が好ましい。

次いで、上記被検試料における可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する。本発明の可溶性ＬＯＸ−１は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列で示されるヒトＬＯＸ−１の細胞外ドメインの一部が、プロテアーゼにより切断されることにより生じる。そして切断箇所の違いによって種々の可溶性ＬＯＸ−１が血中に存在する。このようなアミノ酸配列の具体例としては、例えば配列番号２や３に記載したものが挙げられるが、これらに１〜５個のアミノ酸が欠失、付加、あるいは置換されたものでもよい。このとき、可溶性ＬＯＸ−１の濃度は当業者に周知の種々の方法（例えば、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ）により測定することが可能であるが、一般にはヒト可溶性ＬＯＸ−１と特異的に結合する抗体または抗体断片を用いるＥＬＩＳＡ法が望ましい。抗体は、可溶性ＬＯＸ−１ポリペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体は常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、３８９ページ、１９９２年）得ることができる。また、公知の方法（単クローン抗体、講談社サイエンティフィック、１９８３年）に従えば、モノクローナル抗体を得ることもできる。そして、かかる抗体は、被検試料中の可溶性ＬＯＸ−１濃度を測定するための診断キットの構成品として、また診断用マーカーとして使用することも可能である。

ＥＬＩＳＡ法につき詳述すれば、その原理は酵素免疫測定法に基づいている。即ち、この方法によれば、例えば、まず固体支持体（例えばプレート）に抗ヒト可溶性ＬＯＸ−１抗体、好ましくはモノクローナル抗体(第１抗体)を固相化し、更に非特異吸着を防ぐために非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）でブロッキングを行う。次に、上記固相化プレートにヒト可溶性ＬＯＸ−１標準液又は被検試料を加えて反応させる。反応後、プレートを洗浄し、酵素マーカーで標識した抗ヒト可溶性ＬＯＸ−１抗体(第２抗体)を加えて反応させる。プレートを洗浄後、基質を加えて酵素反応を行い、プレートに残った酵素活性を吸光度として読みとる。

上記において、第１抗体としてポリクローナル抗体を、第２抗体としてモノクローナル抗体を用いることもできる。上記方法に従えば、用いる標準液又は被検試料中の可溶性ＬＯＸ−１濃度が高いほど、強い酵素活性(吸光度)が認められる。上記標準液の吸光度をプロットして標準曲線(検量線)を作成し、被検試料の吸光度を該標準曲線と対比させれば、被検試料中に含まれる可溶性ＬＯＸ−１の濃度を簡便に読みとることができる。この値を、予め設定した基準値（カットオフ）と比較することにより被検試料の提供者である被検者の急性冠症候群に罹患する可能性を判断することができる。

具体的には、得られた測定値を、基準値と比較し基準値より高い場合、被検者は急性冠症候群を再発する可能性が高い群、即ち高リスク群として選別されることになる。基準値は被検者の年齢、性別、罹患している他の疾患等にも依存するが、当業者であれば個々の患者について許容できる擬陽性または擬陰性結果に応じて別の基準値を設定することができる。例えば、後述の実施例３の結果などから判断して被検者から血清を採取し、被検試料とした場合にその基準値として、３ｎｇ／ｍｌと設定することができる。そして、この基準値を越える被検者においては急性冠症候群が再発するリスクは非常に高いといえる。また、過去に急性冠症候群に罹患したことがないランダムなヒト対照群における測定値や、同一患者において以前に測定した値を基準値として、リスクの予測に利用することができる。

かくして、本発明は急性冠症候群の再発を予測する上で極めて有用な判断材料を提供するものである。
本発明の一つの側面は、可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する工程を含む、急性冠症候群を再発する可能性が高い被検者の選別方法を提供することである。
本発明の別の側面は、可溶性ＬＯＸ−１の急性冠症候群の再発診断用マーカーとしての使用である。
本発明の別の側面は、上記方法において使用される、ヒト可溶性ＬＯＸ−１と特異的に結合する抗体または抗体断片を含むキットの提供である。以下、本発明キット及びこれを利用して被検試料中の可溶性ＬＯＸ−１濃度を測定する方法につき詳述し、本発明をさらに明らかにする。

本発明キットを利用した測定法において、被検試料としては血清や血漿が好ましく、これらは被検者より採血後に、常法に従い調製できる。
本発明に係わるキットは、ヒト可溶性ＬＯＸ−１に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体(抗ヒト可溶性ＬＯＸ−１抗体)を必須成分として、これと可溶性ＬＯＸ−１に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のそれぞれとの組み合わせ、あるいは２種類のモノクローナル抗体の組み合わせを含有していることが好ましい。
プレート上に固定化する抗体はモノクローナル抗体が好ましく、予め固定化されたプレート形態として用いられるのがよい。また、アフィニィティゲル形態としてそのまま用いることができ、また該ゲルを振とう及び遠心分離が可能であってアフィニィティゲル非結合フラクションを除去可能な適当な容器もしくはテストチューブに調製して用いることもできる。

また予め適当な緩衝液で上記固相化プレート又はゲルを平衡化しておくことも好ましい。更に上記固相化プレート又はゲルには、プロクリン１５０等の通常の保存剤を含ませることができる。更なる本発明キット成分としてＥＬＩＳＡのための第２抗体として、酵素標識した抗ヒト可溶性ＬＯＸ−１抗体を供給するのがより好ましい。尚、本発明キットには、必要に応じてウシ血清アルブミン等の安定化剤及び／又は保存剤を添加配合することができる。この保存剤はキットの使用に際し、実験値に影響を与えないものから選択される。

また本発明キットには、吸着防止のための３−[(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸等の界面活性剤や、水溶性もしくは水と混和し得るグリセリン、アルコール類、グリコール類等を含有させること、及び脱脂質のためのエタノールとジエチルエーテル、クロロホルムとメタノールのような混合有機溶媒等を含有させることもできる。

実施例１
(1)可溶性ＬＯＸ−１を認識するポリクローナル抗体の作製
ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメイン（ｈｉｓタグ付き）発現大腸菌を培養し、この大腸菌からＮｉ−ＮＴＡゲルカラムにより、ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質を精製した。本タンパク質約０．８ｍｇ／ｍｌを含む生理食塩液を、等量のフロインドコンプリートアジュバントと良く混和してエマルジョンとした。このエマルジョン０．５ｍｌをウサギ(日本白色種、雌性)の背部に３週間隔で６回免疫した。最終免疫終了後、１０日目に全採血を行って、抗血清を得た。

(2)酵素標識抗体の作製
酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）４．６１ｍｇを０．１ｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）０．４ｍｌに溶かし、そこにスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート０．４ｍｇを加えて３０℃で６０分間反応させた．反応液をゲルろ過カラムにより精製しマレイミド化酵素３．１０ｍｇを得た。

一方、抗血清のＩｇＧ画分をペプシン消化した後、ゲルろ過カラムにて精製しＦ（ａｂ’）_２画分を得た。さらにＦ（ａｂ’）_２画分をメルカプトエチルアミンにて還元し、ゲルろ過ＨＰＬＣで精製してＦａｂ’画分を得た。
得られたマレイミド化酵素３．１０ｍｇとＦａｂ’画分３．１１ｍｇを０．１ｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）０．５２ｍｌ中４℃で１８時間反応させた後、ゲルろ過ＨＰＬＣで精製して酵素標識抗体３．４７ｍｇを得た。得られた酵素標識抗体のＦａｂ’画分１分子あたりに導入された酵素分子は、平均１．０個であった。防腐剤としてプロクリン１５０を０．１ｖｏｌ％となるよう酵素標識抗体溶液に添加した後、分注し−８０℃で凍結保管した。

(3)抗体固相化プレートの作製
抗血清のＩｇＧ画分０．１ｍｇを０．１ｖｏｌ％プロクリン１５０を含む０．１ｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに加え混合後、９６穴マイクロプレートの各ウェルに０．１ｍｌ添加し、室温で一夜静置した。測定緩衝液（０．５ｇ／ｄｌウシ血清アルブミン、０．１ｇ／ｄｌ３−[(３−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸及び０．１ｖｏｌ％プロクリン１５０を含む０．１ｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）約０．２ｍｌで２回洗浄し、さらに測定緩衝液０．２ｍｌを加えて室温で２時間以上ブロッキングした。

(4)ＥＬＩＳＡ
抗体固相化プレートのウェルに測定緩衝液０．１ｍｌ及び標準試料溶液又はヒト血清試料０．０１ｍｌを加えて室温で２時間インキュベーションした後、測定緩衝液約０．２ｍｌで２回洗浄した。次いで、酵素標識抗体溶液希釈液（約９００ｎｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを加え、室温で１６時間インキュベーションし、測定緩衝液約０．２ｍｌで２回洗浄した後、基質液（たとえばＴＭＢ＋、ＤＡＫＯ製）０．１ｍｌを加え遮光下室温で正確に３０分間静置した。さらに０．５ｍｏｌ／ｌ硫酸０．１ｍｌで反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。
(5)ＥＬＩＳＡの標準曲線
ヒト血清中の可溶性ＬＯＸ−１を定量限界１ｎｇ／ｍｌ、定量範囲１〜１００ｎｇ／ｍｌで測定可能なＥＬＩＳＡ法を確立した。標準曲線の例を図１に示す。

実施例２
急性冠症候群発症後の再発の予見における可溶性ＬＯＸ−１の有用性
急性冠症候群患者（１０７例）から、急性冠症候群初発時の急性期に採取した末梢静脈血に含まれる可溶性ＬＯＸ−１の濃度を、上記ＥＬＩＳＡ法により測定した。全ての患者については、その後の臨床経過を最長で約７年間追跡しており、この結果に基づいて、急性冠症候群が再発（それによって死亡した患者も含む）した患者群（１５例）と非発症である患者群（８８例）に分けた。そして各群と可溶性ＬＯＸ−１濃度の相関関係について、クラスカル−ウォリスによる検定（新版医学への統計学、朝倉書店、１９９３年）を行った。
また、現在臨床において急性冠症候群の一次マーカーとして使用されている血中高感度ＣＲＰ値（７１例）、血中トロポニンＴ濃度（８９例）、左室駆出分画(ＬＶＥＦ)（８８例）と比較した。なお、トロポニンＴについては、電気化学発光イムノアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ社）により、高感度ＣＲＰについてはイムノネフェロメトリーアッセイキット（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ社）により、そしてＬＶＥＦについては心臓超音波法により測定を行った。具体的な測定方法については製造業者の指定に従った。

検定の結果、可溶性ＬＯＸ−１の血中濃度については、再発症群と非再発症群において、P＜０．００３と統計学的に有意性を示した（図２）。一方その他のマーカーや検査法については、血中高感度ＣＲＰ値（０．３４８）、血中トロポニンＴ濃度（０．７８２）、左室駆出分画(ＬＶＥＦ)（０．７８２）といずれも有意性を示さなかった（図３〜５）。このように、可溶性ＬＯＸ−１については、その他のマーカーや検査法と異なり、急性冠症候群の再発（再発に基づく死亡も含む）と高い相関を示すことがわかる。

実施例３
可溶性ＬＯＸ−１について、再発もしくは死亡までの時間も考慮に入れた統計処理に基づき、カプラン−マイヤー曲線（新版医学への統計学、朝倉書店、１９９３年）を求めた。カットオフを３ｎｇ／ｍｌおよびは５ｎｇ／ｍｌに設定した。その結果、いずれの場合も、陽性（カットオフ値よりも高い値）の患者群は、陰性（カットオフ値よりも低い値）の患者群よりも、高い頻度で早期の急性冠症候群の再発もしくは再発による死亡例がみられた（図６、図７）。
これらの結果は、可溶性ＬＯＸ−１は、一次的診断マーカーとしてのみならず急性冠症候群の再発予測（予後予測）のマーカー（二次的診断マーカー）としても有用であることを示すものである。

本発明は、今後患者数の増加が予想される急性冠症候群の再発リスクの高い患者を正確に同定し集中的に管理することが可能となる。

Claims

被検者由来の被検試料における可溶性ＬＯＸ−１の濃度を測定する工程を含む、その測定値を急性冠症候群が再発する可能性の指標とする、急性冠症候群を再発する可能性の高い被検者の選別方法。
前記測定値が、基準値よりも大きくなる場合、前記被検者に急性冠症候群が再発する可能性が高いことの指標とする、請求項１記載の選別方法。
前記測定がヒト可溶性ＬＯＸ−１と特異的に結合する抗体または抗体断片を用いて行うものである請求項１または２のいずれかに記載の方法。
前記測定がＥＬＩＳＡによるものである請求項３記載の方法。
請求項１から４のいずれかの方法に使用するためのキット。
可溶性ＬＯＸ−１の急性冠症候群の再発診断用マーカーとしての使用。