CN102675461A

CN102675461A - 针对可溶型lox-1的单克隆抗体

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Publication number: CN102675461A
Application number: CN2011103631990A
Authority: CN
Inventors: 小南悟郎; 中村昌弘; 久米典昭; 太田英树
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2007-07-27
Publication date: 2012-09-19
Also published as: AU2007277684B2; KR20110075052A; JP5147696B2; TW200819465A; CA2660947A1; KR20090039802A; AU2007277684A1; KR101219148B1; EP2048161B1; CN101522715B; EP2048161A4; EP2048161A1; WO2008013257A1; US20090203039A1; CN101522715A; KR101193043B1; JPWO2008013257A1; US8187873B2

Abstract

本发明提供一种特异性识别人可溶型LOX-1的单克隆抗体，特别是提供一种与人可溶型LOX-1的解离常数(Kd)为1×10^-9(M)以下的单克隆抗体。该抗体能够由采用包括下述工序的方法调制的杂交瘤产生：(1)将来自原核细胞的人LOX-1细胞外结构域免疫非人动物的工序，(2)从该动物回收抗体产生细胞的工序，(3)融合该抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的工序，(4)从上述工序中得到的融合细胞中选择产生与上述人LOX-1细胞外结构域反应的单克隆抗体的杂交瘤的工序，和(5)从该选择出的杂交瘤中选择产生与来自真核细胞的人LOX-1细胞外结构域反应的单克隆抗体的杂交瘤的工序。

Description

针对可溶型LOX-1的单克隆抗体

(本申请是2009年3月27日递交的发明名称为“针对可溶型LOX-1的单克隆抗体”的申请200780036077.2的分案申请)

技术区域

本发明涉及与作为氧化低密度脂蛋白(以下称为“氧化LDL”)受体的凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1)(以下称为“LOX-1”)的一部分断裂产生的可溶型分子(以下称为“可溶型LOX-1”)具有特异性亲和性而结合的单克隆抗体，以及产生该抗体的杂交瘤。本发明还涉及该单克隆抗体的用途。

背景技术

从不稳定心绞痛到急性心肌梗塞，再到在合并有不稳定心绞痛和急性心肌梗塞的心脏性猝死的一系列病态，概括地称为急性冠脉综合征(ACS)。其均为由向心脏供给营养的冠状动脉的动脉硬化所生成的粥样斑(斑块)崩解、在其上附着血栓，结果产生冠状动脉狭隘和闭塞而发病的。在现代社会，急性冠脉综合征逐渐增加，但由于大部分患者没有任何先兆而突然发病，所以，大多数无法急救而突然死亡。另外，即使在迅速被送到医院的情况下，为了抢救，大多必须进行紧急的经皮经管冠状血管形成手术(PCI)，其医疗经济上的负担不可估计。

近年来逐渐明确，急性冠脉综合征的发病起因于粥样动脉硬化斑块的破损或糜烂而持续产生的闭塞性血栓形成(非专利文献1)。虽然已经显示在斑块的破损、糜烂时，在血管壁内的炎症反应、氧化应激反应起着重要作用，但在其中，已知由受到氧化变性的LDL(低密度脂蛋白)所引起的、以蛋白酶活性增加和凋亡(细胞死亡)为中心的血管壁功能障碍是其主要原因。LOX-1是作为该氧化LDL的受体蛋白质被鉴定的物质(非专利文献2)。已知该LOX-1在机体内通常作为膜蛋白质而在细胞表面表达，但由蛋白酶的作用，在跨膜部分附近的细胞外结构域被切断而作为可溶型(soluble)LOX-1在血中游离(非专利文献3)。另外，由于在急性冠脉综合征的急性期，该可溶型LOX-1的血中浓度显著上升，所以有报告其作为急性冠脉综合征的初步诊断标记物的可能性(非专利文献4)。

因此，可以说如果能够在早期阶段正确地定量在血中存在的可溶型LOX-1量，就能够预先防止急性冠脉综合征(ACS)。另一方面，虽然有关于针对LOX-1的抗体的报告，但都停留在一般的记载，目前的现状是，能够在实现上述目的的ELISA等免疫化学测定系统中使用的具有高亲和性的单克隆抗体尚没有报告(专利文献1～3)。

非专利文献1：Medical Tribune，1999，Vol.32，No.31，p.6

非专利文献2：Nature，1997，Vol.386，p.73-77

非专利文献3：Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，2000，20(3)，p.715-720

非专利文献4：Circulation，2005，112(6)，p.812-818

专利文献1：日本特开平9-98787号公报

专利文献2：日本特开2000-109435号公报

专利文献3：日本特表2002-510710号公报

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性识别并结合作为人氧化LDL受体的LOX-1的可溶型分子的人可溶型LOX-1的单克隆抗体，特别是与人可溶型LOX-1的解离常数为1×10^-9(M)以下的、对人可溶型LOX-1具有高亲和性的单克隆抗体。另外，本发明的目的还在于提供该单克隆抗体的用途，例如，提供利用了该抗体具有的对人可溶型LOX-1的特异亲和性和结合性的免疫学试剂(例如，人可溶型LOX-1的特异性结合试剂或特异性检测试剂)、和利用了该试剂的人可溶型LOX-1的特异性且高灵敏度的检测方法。

本发明的目的还在于，通过检测或定量在血中存在的人可溶型LOX-1，提供诊断以心肌梗塞为代表的急性冠脉综合征的方法、以及评价急性冠脉综合征的治疗药物及其辅助药物的药效的方法。

通过使用上述单克隆抗体检测或定量在血中存在的人可溶型LOX-1，急性冠脉综合征的诊断和针对急性冠脉综合征的被试验药物的药效评价能够比以往方法容易而且早期地进行。因此，本发明的目的还在于提供单克隆抗体在这样的急性冠脉综合征的诊断和药效评价中的用途。

为了解决上述课题，本发明的发明人等进行了深入研究，发现以与人LOX-1细胞外结构域的结合为指标而调制杂交瘤，由该由杂交瘤产生的单克隆抗体与人可溶型LOX-1的解离常数为1×10^-9(M)以下，具有极高的亲和性，还确认如果根据使用了这些单克隆抗体的夹心ELISA法，能够高灵敏度地检测和测定反映急性冠脉综合征病态的血中可溶型LOX-1的存在。根据这些见解，确信如果采用使用了本发明涉及的单克隆抗体的检查试剂盒，就能够进行急性冠脉综合征的高精度诊断，还能够以高精度评价针对急性冠脉综合征的被检验药物的药效。

本发明是基于这样的见解而完成的发明，包含下述形态：

(I)单克隆抗体

(I-1)一种单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，具有与人可溶型LOX-1特异性结合的性质。

(I-2)如(I-1)所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，其特征在于，与人可溶型LOX-1的解离常数(Kd)为1×10 ^-9(M)以下。

(I-3)如(I-1)或(I-2)所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，其特征在于，由采用包括下述工序的方法调制的杂交瘤产生：

(1)将来自原核细胞的人LOX-1细胞外结构域免疫非人动物的工序、

(2)从该动物回收抗体产生细胞的工序、

(3)融合该抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的工序、

(4)从上述工序中得到的融合细胞中选择产生与上述人LOX-1细胞外结构域反应的单克隆抗体的杂交瘤的工序、和

(5)从该选择出的杂交瘤中选择产生与来自真核细胞的人LOX-1 细胞外结构域反应的单克隆抗体的杂交瘤的工序。

(I-4)由杂交瘤“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 1A7”(保藏号：FERM BP-10645)或“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 6B11”(保藏号：FERM BP-10646)产生的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物。

(I-5)如(I-1)～(I-4)中任一项中所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，其中，单克隆抗体的一部分是与人可溶型LOX-1特异性结合的单克隆抗体的Fab’片段。

(II)单克降抗体或其一部分或者它们的标记物的用途

上述单克隆抗体或其一部分能够有效利用在血液等体液中存在的人可溶型LOX-1的高灵敏度检测中，能够应用于急性冠脉综合征的诊断。另外，这些单克隆抗体或其一部分能够有效利用在急性冠脉综合征的治疗药物或辅助治疗药物的药效评价中。因此，在本发明中包含下述形态。

(II-1)如(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，其用于急性冠脉综合征的诊断。

(II-2)一种急性冠脉综合征的诊断方法，具有使用(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，测定人体液中的可溶型LOX-1的工序。

(II-3)如(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，用于急性冠脉综合征的治疗药物或辅助治疗药物的药效评价。

(II-4)一种急性冠脉综合征的治疗药物或辅助治疗药物的药效评价方法，具有以投入有急性冠脉综合征的治疗药物或辅助治疗药物的人体液为对象，使用(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，测定该人体液中的可溶型LOX-1的工序。

(III)杂交瘤及其调制方法

(III-1)产生(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体的杂交瘤。

(III-2)如(III-1)所述的杂交瘤，以人LOX-1细胞外结构域的可溶性成分和来自CHO细胞的可溶型LOX-1的竞争性结合作为筛选指标而调制。

(III-3)如(II-1)或(II-2)所述的杂交瘤，其为“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 1A7”(保藏号：FERM BP-10645)或“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 6B11”(保藏号：FERM BP-10646)。

(III-4)如(III-1)所述的杂交瘤的调制方法，包括下述工序：

(2)从该动物回收抗体产生细胞的工序、

(3)融合该抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的工序、

(5)从该选择出的杂交瘤中选择产生与来自真核细胞的人LOX-1细胞外结构域反应的单克隆抗体的杂交瘤的工序。

(III-5)利用(III-4)所述的方法调制的杂交瘤。

(III-6)如(III-1)～(III-3)中任一项所述的杂交瘤，其利用(III-4)所述的方法调制。

(IV)人可溶型LOX-1检测用试剂盒及其用途

(IV-1)一种人可溶型LOX-1检测用试剂盒，包含(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物，作为针对人可溶型LOX-1的特异性结合试剂或人可溶型LOX-1的特异性检测试剂。

(IV-2)如(IV-1)中所述的试剂盒，其为急性冠脉综合征诊断试剂盒。

另外，该试剂盒可以改称为“包含(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物的急性冠脉综合征诊断试剂盒”。

(V)人可溶型LOX-1的特异性检测方法

(V-1)一种人可溶型LOX-1的特异性检测方法，具有将(I-1)～(I-5)中任一项所述的单克隆抗体或其一部分或者它们的标记物作为针对人可溶型LOX-1的特异性结合试剂或特异性检测试剂使用的工序。

由于血液中的可溶型LOX-1量与急性冠脉综合征的病态相关联而增加，所以，通过利用上述检测方法，就能够对被检验者诊断急性冠脉综合征病态的有无及其程度。

发明的效果

由于本发明的单克隆抗体特异性识别人可溶型LOX-1，并以高亲和性结合，所以，在该人可溶型LOX-1的特异性检测和特异性结合中有用。如果根据这样的本发明的单克隆抗体、其一部分或者它们的标记物(或包含它们的任意一种的人可溶型LOX-1检测试剂)以及利用其的人可溶型LOX-1的特异性检测法，就能够以免疫化学的方法调查在机体组织或活体试样中的可溶型LOX-1的表达分布和存在，从而能够更详细地解释可溶型LOX-1的生理学作用及意义。另外，如果根据本发明的单克隆抗体、其一部分或者它们的标记物(或包含它们的任意一种的人可溶型LOX-1检测试剂)以及利用其的人可溶型LOX-1的特异性检测法，就能够以免疫化学方法或免疫组织学方法诊断与LOX-1的表达(表达亢进、表达不全/减少)而产生的各种疾病和病态。作为这些疾病或病态，可以例示伴随LOX-1的表达亢进(或起因于表达亢进)的疾病或病态，例如动脉硬化和作为比其进一步进展的病态的例如心血管疾病(缺血性心脏病、心律不齐)，即急性冠脉综合征。

特别是如实施例中所示，如果根据组合使用了本发明的2种单克隆抗体的双抗体夹心ELISA，即使为每1mL人血清约0.1ng/mL的定量限度，也能够测定人可溶型LOX-1的血中浓度。这样的测定定灵敏度相当于以往测定方法的大约10倍。

具体实施方式

I.单克隆抗体及其制造方法

以下，通过阐明本发明中所使用的各种用语的意义，详细说明本发明的单克隆抗体及其制造方法。

在本发明中，所谓“LOX-1”，是来自哺乳动物的氧化LDL(Oxdized low density lipoprotein)的受体。在这里，作为哺乳动物，可以列举人、牛、山羊、兔、小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等，但优选为已经在报告中记载的人、牛、兔、大鼠或小鼠的氧化LDL受体(Oxdized low density lipoprotein receptor)(Nature，Vol.386，p.73-77，1997；脂质生化学研究，Vol.39，p.83-84，1997；日本特开平9-98787号公报；GenBank Accession No.BAA81912；Biochem.J.，Vol.330(Pt.3)，p.1417-1422，1998)。具体而言，可以列举具有在序列号1中记载的氨基酸序列的人LOX-1。

这样的LOX-1为带有糖链的约50kDa的II型膜蛋白质，从N末端开始，由细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域构成，该细胞外结构域进一步由颈结构域(neck domain)和凝集素样结构域(lectin-like domain)的2个结构域构成(合计4个结构域)。其中，凝集素样结构域作为氧化LDL的识别部位发挥作用(泽村达也，临床检查，Vol.45，No.3，p297)。在人LOX-1(序列号1)的情况下，具体而言，该氨基酸1-36区域相当于细胞内结构域，氨基酸37-57区域相当于跨膜结构域，氨基酸58-273区域相当于细胞外结构域。

在本发明中，所谓“LOX-1细胞外结构域”，意指上述LOX-1的全部结构中“细胞外结构域”的全部或其一部分。具体而言，意指在作为跨膜蛋白LOX-1中，在细胞膜的外侧存在的部分结构(部分区域)的全部或一部分。换言之，所谓“LOX-1细胞外结构域”，意指除去了进入膜内的跨膜结构域和与该结构域连续的存在于细胞质内的细胞内结构域的区域的全部或一部分。在人LOX-1(序列号1)的情况下，如上所述，其氨基酸序列的58-273区域相当于“LOX-1细胞外结构域”的全部。

所谓“人LOX-1细胞外结构域的一部分”，意指“LOX-1细胞外结构域”的一部分，除了人LOX-1的氨基酸序列(序列号1)的85-273区域(序列号2)以外，可以列举“可溶型LOX-1”等显示可溶性的部分区域。

在本发明中，所谓“可溶型LOX-1”，意指切断(解离)膜中存在的LOX-1的一部分(通常是“细胞外结构域”的一部分)而释放(分泌)入血的LOX-1的一部分。

更具体而言，所谓人可溶型LOX-1，是由人LOX-1的细胞外结构域的一部分构成的可溶型感受器。作为相当于人LOX-1细胞外结构域的一部分的可溶型感受器分子的例子，可以例示由人LOX-1的氨基酸序列(序列号1)的88-273区域(序列号3)构成的分子，或由该氨基酸序列(序列号1)的92-273区域(序列号4)构成的分子。另外，在相当于人LOX-1细胞外结构域的一部分的分子中，包含位于人LOX-1细胞外结构域的N端侧的肽。作为该肽，具体而言，可以例示相当于可溶型分子的氨基酸序列(序列号3)的1-10区域的肽(序列号5)和相当于可溶型分子的氨基酸序列(序列号4)的1-10区域的肽(序列号6)。另外，这些肽分别相当于人LOX-1的氨基酸序列(序列号1)的88-97区域和92-101区域。

作为本发明对象的所谓“单克隆抗体”，是与上述人可溶型LOX-1特异性结合的单克隆抗体。在人血液中存在着具有LOX-1的一部分开裂生成的以序列号3或4表示的氨基酸序列的可溶型LOX-1，由于其量随着急性冠脉综合征的进展而增加，所以，认为该可溶型LOX-1能够成为反映该急性冠脉综合征的诊断指标，具体而言，能够成为反映动脉硬化和起因于动脉硬化而发病的缺血性心脏病的病态的诊断指标(林田等，Circulation，2005，112(6)，p.812-818)。

因此，作为本发明的对象的“单克隆抗体”，适合地是对具有以序列号3或4表示的氨基酸序列的人可溶型LOX-1具有高亲和性的抗体。

对这样的人可溶型LOX-1具有特异性结合性的本发明的“单克隆抗体”，能够将人LOX-1细胞外结构域的一部分(包括天然体、重组体、合成物、细胞培养上清)作为免疫原使用而调制。具体而言，首先以人LOX-1细胞外结构域的一部分作为免疫原，另外，根据需要，与弗氏佐剂同时使用，在非人哺乳动物，优选在小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、犬、猪、山羊、绵羊、驴、马或牛(包括人抗体产生转基因小鼠那样的为了产生来自其它动物的抗体而制出的转基因动物)，更优选在小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔的皮下内、肌肉内、静脉内、足垫内或腹腔内1次乃至数次地注射，由此施加免疫致敏。通常，从初次免疫起，每约1～21日进行1～4次免疫，自末次免疫约1～10日后，能够从被免疫致敏的该非人哺乳动物取得抗体产生细胞。施加免疫的次数和时间间隔能够根据使用的免疫原的性质而适当变更。

另外，作为在标准物质、免疫原(半抗原)和筛选中所使用的“人 LOX-1细胞外结构域的一部分”，例如，可以例示下述的物质。另外，下述任何一种也可以是以高浓度包含人LOX-1细胞外结构域的一部分的部分(fraction)。

(甲)在细胞表面表达人LOX-1的细胞或者为了在细胞表面表达而人工建立的细胞株、或者培养为了在细胞表面表达人LOX-1而使用基因重组技术制成的基因重组细胞所得到的培养上清、或者从该培养上清纯化得到的人可溶型LOX-1；

(乙)培养为了将人LOX-1细胞外结构域的部分区域作为蛋白质表达而使用基因重组技术制成的基因重组细胞所得到的培养上清、或者从该培养上清纯化得到的人LOX-1细胞外结构域的部分区域；或

(丙)化学合成的人LOX-1细胞外结构域的N末端区域。

具体而言，作为(甲)的人可溶型LOX-1，例如，可以列举在细胞培养液中分泌的人可溶型LOX-1。这是因为在细胞培养液中分泌的可溶型LOX-1最接近天然的人可溶型LOX-1的缘故。该人可溶型LOX-1，如在实施例1(2)中记载的方法那样，能够采用基因工程的方法调制(参照日本特开2002-17353号公报等)。

另外，作为(乙)的人LOX-1细胞外结构域的部分区域，可以列举人LOX-1细胞外结构域(序列号1的氨基酸序列58-273区域)的一部分(例如序列号2)。该部分区域如在实施例1(1)中记载的方法那样，能够采用基因工程的方法调制。

进而，作为(丙)的人LOX-1细胞外结构域的N末端区域，可以列举具有在序列号5或6中记载的氨基酸序列的肽。当该肽作为半抗原使用时，必须使之与牛血清白蛋白(BSA)等高分子结合。

作为在本发明中所使用的免疫原，优选为(乙)的来自大肠杆菌等原核细胞的人LOX-1细胞外结构域的部分区域。

分泌单克隆抗体的杂交瘤的调制，可以按照科勒和米尔斯坦等的方法(Nature，1975，Vol.256，p.495-497)以及基于此方法的方法进行。即，使从如上述那样免疫致敏的非人哺乳动物取得的脾脏、淋巴结、骨髓或扁桃体等，优选在脾脏中包含的抗体产生细胞与优选来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物，更优选来自小鼠、大鼠或人的自身没有产生抗体能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合，由此能够调制杂交瘤。

作为在细胞融合中所使用的骨髓瘤细胞，例如，能够使用来自小鼠的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/O、Sp2)、PAI、F0或BW5147；来自大鼠的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3；来自人的骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15。

产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选通过下述方法进行：首先，在例如微量滴定板中培养杂交瘤，利用RIA和ELISA等免疫测定法测定可见到增殖的孔的培养上清对上述非人动物的免疫致敏中使用的免疫原(上述(甲)～(丙)的任意一个，优选以(乙)的方法调制得到的来自原核细胞的人LOX-1细胞外结构域的一部分)的反应性，选择产生对该免疫原产生显示特异性亲和性单克隆抗体的克隆。在该方法中，通常采用将免疫原固相化、使用以酶标记的第二抗体检测与其结合的培养上清中的抗体的非竞争法ELISA。但是，由于该非竞争法也检测非特异性结合，所以，难以仅检测特异性结合的抗体。而且，一般而言，以大肠杆菌等原核生物的细胞表达蛋白质时，其立体结构与天然的不同。对于以大肠杆菌表达的人LOX-1细胞外结构域的一部分，大多变成沉淀物。因此，虽然可以使用该沉淀和上清的悬浊液作为免疫原，但在该情况下，预想产生的抗体也大多包含与不同于天然的人可溶型LOX-1的沉淀等变性蛋白质结合的物质。

因此，本发明的发明人阶段性地进行下述的(1)和(2)的筛选，其结果，选择得到了与天然型的人可溶型LOX-1具有极高亲和性而结合的单克隆抗体的杂交瘤。

(1)使杂交瘤培养上清中的抗体与固相化的第二抗体结合，在其中首先添加来自原核细胞的人LOX-1细胞外结构域的一部分，使之与以生物素标记的人可溶性LOX-1竞争反应，选择产生与来自原核细胞的人LOX-1细胞外结构域的一部分反应的抗体的杂交瘤。

(2)使用上述所选择的杂交瘤的培养上清，使其中所含的抗体与固相化的第二抗体结合，并使来自真核细胞的人LOX-1细胞外结构域的一部分和以生物素标记的人可溶性LOX-1与之竞争反应，选择产生与来自真核细胞的人LOX-1细胞外结构域的一部分反应的抗体的杂交瘤。

由杂交瘤制造单克隆抗体能够通过下述方法进行：体外培养杂交瘤或在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等非人哺乳动物、优选在小鼠或大鼠、更优选在小鼠的腹水中等中培养，从得到的培养上清或哺乳动物的腹水中分离。在体外培养的情况下，结合所培养的细胞种的特性、试验研究的目的和培养方法等各种条件，使杂交瘤增殖、维持和保存，能够使用用于使单克隆抗体在培养上清中产生而使用的那样的已知营养培养基或从已知的基本培养基衍生调制的所有的营养培养基而实施。

作为基本培养基，例如，可以列举Ham’F12培养基、MCDB153培养基或低钙MEM培养基等低钙培养基以及MCDB104培养基、MEM培养基、D-MEM培养基、RPMI1640培养基、ASF104培养基或RD培养基等高钙培养基等，该基本培养基，根据目的，可以含有例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。单克隆抗体的分离、纯化能够通过将上述的培养上清或腹水供给饱和硫酸铵、离子交换色谱(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白或蛋白A柱等亲和色谱等而进行。

本发明的单克隆抗体，可以是具有IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE的任意亚型的单克隆抗体。优选是IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，更优选是IgG1或IgG2，特别优选是IgG1。

在本发明中，所谓“单克隆抗体的一部分”，是上述本发明的单克隆抗体的一部分，意指与该单克隆抗体同样具有与人可溶型LOX-1特异性结合性的区域(以下，也将其简称为“抗体片段”)。

作为这样的片段，具体而言，可以列举对上述人可溶型LOX-1具有特异性结合性的Fab(fragment of antigen binding)、F(ab’)₂、Fab’、单链抗体single chain Fv(以下表示为“scFv”)、2倍体化V区片段(以下表示为Diabody)、二硫化物稳定化抗体(disulfide stabilized Fv；以下表示为“dsFv”)、dAd(single domain antibody)、包含CDR的肽等(Expert Opinion on Therapeutic Patents，第6卷，第5号，第441～456 页，1996年)。

Fab是由H链的N末端侧约一半和L链全部构成的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。该Fab能够通过以木瓜蛋白酶在IgG的铰链区分解交联2根H链的2个二硫键(S-S键)上部的肽部分而调制，在本发明中所使用的Fab也能够以木瓜蛋白酶处理上述本发明的单克隆抗体而得到。或者也能够通过将编码上述本发明的单克隆抗体的Fab的DNA插入动物细胞用表达载体中，将该载体导入动物细胞中使之表达而制造Fab。

F(ab’)₂是2个Fab’区域以铰链部分结合而构成的分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段。该F(ab’)₂可以通过以胃蛋白酶分解IgG的铰链区的2个S-S键的下部而调制，在本发明中所使用的F(ab’)₂也能够以胃蛋白酶处理上述本发明的单克隆抗体而得到。或者也能够通过将编码该单克隆抗体的F(ab’)₂的DNA插入动物细胞用表达载体中，将该载体导入动物细胞中使之表达而制造F(ab’)₂。

Fab’是切断上述F(ab’)₂的铰链之间的S-S键而得到的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。在本发明中所使用的Fab’能够通过以还原剂二硫苏糖醇处理上述本发明的单克隆抗体的F(ab’)₂而得到。或者也能够通过将编码该单克隆抗体的Fab’的DNA插入动物细胞用表达载体中，将该载体导入动物细胞中使之表达而制造Fab’。

scFv是使用适当的肽接头(以下表示为P)连接一根VH和一根VL得到的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并为具有抗原结合活性的抗体片段。在本发明中所使用的scFv中包含的VH和VL可以是上述本发明的单克隆抗体的VH和VL。本发明中所使用的scFv能够通过从生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤取得编码VH和VL的cDNA，构建scFv表达载体，导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达而制造。

dsFv指的是使分别将VH和VL中的1个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基而得到的多肽通过S-S键结合得到的片段。取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基能够按照由Reiter等公开的方法(Protein Engineering，7，697(1994))，基于抗体的立体结构预测来选择。在本发明中所使用的dsFv中包含的VH和VL可以是本发明的单克隆抗体的VH和VL。本发明中所使用的dsFv能够通过从生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤取得编码VH和VL的cDNA，插入适当的表达载体而构建dsFv表达载体，将该表达载体导入大肠杆菌、酵母或动物细胞中使之表达而制造。

Diabody是抗原结合特异性相同或不同的scFv形成2倍体的抗体片段，是具有对相同抗原的2价抗原结合活性或对不同抗原的特异抗原结合活性的抗体片段。例如，在本发明的单克隆抗体中特异性反应的2价Diabody，能够通过取得编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码具有3～10个残基的肽接头的scFv的DNA，将该DNA插入动物细胞用表达载体中，再将该表达载体导入动物细胞中而使Diabody表达而制造。

包含CDR的肽，由包含VH或VL的CDR的至少1个区域以上而构成。多个CDR能够通过直接或适当的肽接头而结合。包含本发明所使用的CDR的肽，能够通过取得编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA后，构建编码CDR的DNA，将该DNA插入动物细胞用表达载体中，再将该表达载体导入动物细胞中使该载体表达而制造。另外，包含CDR的肽也能够通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造。

作为“单克隆抗体的一部分”，可以优选列举以胃蛋白酶处理本发明的单克隆抗体(IgG)而得到的F(ab’)₂。

作为表示单克隆抗体或其一部分对抗原的亲和性的指标所使用的解离常数(Kd)，能够按照各种方法解析。例如，使用以各种标记剂标记的抗原的Scatchard法、使用市售的测定试剂盒Biacore系统(Amersham-Pharmacia公司生产)或类似的试剂盒，按照在该试剂盒中附加的使用说明书和实验操作方法而能够容易地解析。使用这些方法而求出的Kd值以M(摩尔)表示。被试验的单克隆抗体的解离常数(Kd值)越小，表示具有越强的亲和性。

在本发明作为对象的单克隆抗体或其一部分中，包含与人可溶型LOX-1的解离常数(Kd)为1×10^-9(M)以下、优选为5×10^-10(M)以下、更优选为2×10^-10(M)以下的与人可溶型LOX-1特异性结合的人单克隆抗体或其一部分。

本发明作为对象的单克隆抗体或其一部分的解离常数如果在1× 10^-9(M)以下，则对人可溶型LOX-1的亲和性非常高，因此能够达到以往不能达到的人可溶型LOX-1的高灵敏度的检测和定量。特别是如果根据本发明的单克隆抗体，则能够克服健康正常人血清中的可溶型LOX-1浓度很低而采用以往的测定方法不能正确测定的问题。

另一方面，虽然报告了使用类似免疫原得到的单克隆抗体(WO01/64862)，但是其为以治疗为目的的人型抗体，公开的任一种单克隆抗体的解离常数也显示大于1×10^-8(M)的值。认为这种程度的解离常数，在测定健康正常人或慢性期之类的血清中的可溶型LOX-1浓度低的被检验者时，从灵敏度方面考虑，不能达到作为诊断标记物的目的(参照实施例5(9))。

本发明作为对象的单克隆抗体中，作为更适合的抗体，如在实施例中所示的那样，可以列举由杂交瘤6B11或1A7产生的单克隆抗体。

由这些杂交瘤6B11和1A7产生的各单克隆抗体的“解离常数(Kd)”表示如下。

[表1]

单克隆抗体	Kd(×10^-10M)
		1A7	5.1
6B11	3.4

关于该杂交瘤6B11和1A7，分别作为“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-11A7”和“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-16B11”，在2006年7月26日被国际保藏在住所为日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6的国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心。各杂交瘤的受领号和保藏号如下。

[表2]

II.可溶型LOX-1检测用试剂盒和使用其的可溶型LOX-1的特异性检测方法

上述的本发明的单克隆抗体及其一部分(抗体片段)与人可溶型LOX-1具有高亲和性而特异性结合。

因此，如果采用本发明的单克隆抗体或其抗体片段，利用免疫测定法，就能够选择性且特异性检测人可溶型LOX-1。因此，本发明的单克隆抗体或其抗体片段，能够作为调查人可溶型LOX-1的组织定位及其表达程度、或检测可能在被检验试样中存在的人可溶型LOX-1的用于定量的免疫学试剂(例如，免疫电泳用试剂和免疫测定用试剂等)有效地利用。即，上述本发明的单克隆抗体或其抗体片段，在利用免疫电泳法或免疫测定法检测和测定人可溶型LOX-1时，能够作为对人可溶型LOX-1的特异性结合试剂或特异性检测试剂(免疫学试剂)有效地使用。在这里，作为免疫测定法的例子，可以列举直接或间接的竞争试验或非竞争试验(例如夹心法等)。另外，在免疫电泳法或免疫测定法中，包含蛋白质印迹法、荧光抗体法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA法)、免疫组织染色法和免疫细胞染色法等免疫组织化学染色法(ABC法、CSA法等)、免疫沉降法等(単クロ一ン抗体実験マニユアル，讲坛社Scientific(1987)；続生化学実験講座5，免疫生化学研究会(东京化学同人(1986)等)。

本发明提供用于利用免疫电泳法或免疫测定法特异性检测或测定人可溶型LOX-1的试剂盒。该本发明是用于利用抗原-抗体反应检测和测定被检试样中的人可溶型LOX-1的存在或其量的试剂盒，其特征在于，包含上述本发明的单克隆抗体或其抗体片段作为对人可溶型LOX-1的特异性结合试剂成分或特异检测试剂成分。另外，也可以使用对人可溶型LOX-1具有特异性结合的其一部分(抗体片段)代替本发明的单克隆抗体或其抗体片段。

本发明的单克隆抗体或其一部分(抗体片段)，作为免疫测定用的试剂，既可以原样使用，也可以以结合在固体支持体上的形态使用。在这里，作为使这些单克隆抗体或抗体片段结合的固体支持体，能够任意使用本领域公知的固体支持体，例如，可以列举玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然/改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂和磁石等。另外，在这些固体支持体中，包括反应皿的孔、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝酸纤维素带、膜、乳胶颗粒等。单克隆抗体或抗体片段与这些固体支持体的结合方法也是公知的，本发明也能够适用该公知的方法。

另外，本发明的单克隆抗体及其抗体片段，作为免疫电泳用和免疫测定用等免疫学试剂，既可以原样使用，也可以采用以任意标记剂标记的标记物的形态使用。作为在本发明中能够使用的标记剂，可以广泛地列举作为向单克隆抗体结合的标记剂在本领域公知的酶(例如碱性磷酸酯酶(ALP)、过氧化物酶(HRP)等)、放射性同位素(例如 ¹²⁵I、³H、¹⁴C等)、荧光性化合物(例如荧光素异硫氰酸盐(FITC)、四甲基若丹明异硫氰酸盐(RITC)等)、化学发光性化合物和生物发光性化合物等。另外，以这些作为标记剂使用的免疫测定法，称为酶免疫分析(EIA)、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫分析、发光免疫分析等。

优选以酶作为标记剂使用的免疫测定法(EIA、ELISA)，具体而言，可以列举使用碱性磷酸酯酶(ALP)作为酶、使用化学发光底物APS-5(phosphoric acid mono-[(4-chloro-phenylsulfanyl)-(10-methyl-10H-acridin-9-ylidene)-methyl]ester disodium salt(Lumigen APS-5，Oriental Yeast Co.，Ltd.)作为检测用的显色底物的ELISA法，和使用过氧化物(HRP)作为酶、使用比色底物四甲基联苯胺作为检测用的显色底物的ELISA法。

本发明提供的适合的人可溶型LOX-1检测用试剂盒，是使用与人可溶型LOX-1特异性结合的2个单克隆抗体的夹心ELISA用的试剂盒。在该试剂盒中，至少包含在固体支持体上被固定化的本发明的单克隆抗体或其片段、以上述标记剂标记的本发明的单克隆抗体或其片段、以及与该标记剂反应而显色、发荧光或发光的底物。此时，作为标记剂，优选上述的酶，特别可以列举碱性磷酸酯酶(ALP)，另外，作为底物，可以优选列举APS-5。根据这样的夹心ELISA，能够以更高的灵敏度检测可溶型LOX-1。

另外，采用这些标记剂的标记方法和间接由标记化进行的修饰方法、以及它们的检测方法等，能够按照自身公知的方法进行(《単クロ一ン抗体》岩崎辰夫他著，讲坛社Scientific，1984年；《酵素免疫測定法》第2版，石川荣治他著，医学书院，1982年等)。

在本发明的试剂盒中，除上述本发明的单克隆抗体、其抗体片段或者它们的标记物外，根据免疫电泳法或免疫测定法等的用途，还可以包含适当的反应液、稀释液、洗净液、人可溶型LOX-1的标准液、转印溶液、电泳溶液、反应停止液、抗体检测试剂、标记活性测定试剂、染色液、反应板、硝酸纤维素过滤器、聚丙烯酰胺凝胶等。另外，在这里，作为抗体检测试剂，可以列举与本发明的单克隆抗体结合的二次抗体，例如，以放射性物质或酶等标记的抗IgG抗体和蛋白质A等。

通过利用包含与本发明的单克隆抗体、抗体片段或它们标记物结合或检测的试剂的上述试剂盒，按照一般的免疫电泳法和免疫测定法，能够简便、特异且高灵敏度地检测和测定人可溶型LOX-1。

因此，本发明还提供一种人可溶型LOX-1的特异性测定方法，其特征在于，使用本发明的单克隆抗体、抗体片段或者它们的标记物作为对人可溶型LOX-1的特异性结合试剂或特异性检测试剂。

本发明的测定方法必须是将上述本发明的单克隆抗体、抗体片段或者它们的标记物作为对人可溶型LOX-1的特异性结合试剂或特异性检测试剂使用的方法，在该限定内，其它的基本操作等没有特别限制，能够广泛采用在通常的免疫电泳法或免疫测定法中惯用的方法。因此，利用本发明的单克隆抗体、抗体片段或者它们的标记物的抗原-抗体反应，以及产生的抗原-抗体结合物和抗体检测试剂的反应条件也没有特别限制，可以采用通常的免疫反应中的条件。通常，可以列举在45℃以下、优选约在4～40℃、更优选在25～40℃左右的温度条件下，pH在约5～9左右下、约0.5～40小时、优选1～20小时左右放置或孵育的方法。

本发明提供的适合的人可溶型LOX-1的测定法，是使用与人可溶型LOX-1特异性结合的2个单克隆抗体的夹心ELISA法(双抗体夹心ELISA法)。该方法是使被检验试样和人可溶型LOX-1的标准液(抗原)与固定有与人可溶型LOX-1特异性结合的本发明的单克隆抗体或其抗体片段的固体支持体(固相化抗体)结合，接着使其与用标记剂标记的本发明的单克隆抗体或其抗体片段(标记抗体)反应，使固相化抗体-抗原(人可溶型LOX-1)-标记抗体的夹心型复合体形成，基于由其标记剂与底物的反应所产生的发光而检测或定量这样形成的复合体的方法。

由于本发明的单克隆抗体、其抗体片段和它们的标记物特异性识别人可溶型LOX-1且以高亲和性结合，所以，利用含有该抗体的上述试剂盒的人可溶型LOX-1测定法，除了用于被检试样(例如血液、尿等)和各种组织中的人可溶型LOX-1的特异性检测和定量、人可溶型LOX-1表达组织的分布测定、以及利用了亲和性的人可溶型LOX-1的纯化以外，在伴随人可溶型LOX-1表达的增加(或起因于人LOX-1表达的增加)的各种疾病的免疫化学和免疫组织学的诊断中有用。

如在现有技术栏中所述的那样，LOX-1作为氧化LDL受体发挥功能，在动脉硬化病变中的粥样斑块的形成中，在通过聚集在血管内膜的巨噬细胞中的氧化LDL受体(LOX-1)摄入而产生胆固醇酯在细胞内的蓄积中占有主要作用。另外，在实际中，显示在覆盖动脉硬化初期病变的血管内皮细胞和进行的动脉硬化斑块的内膜平滑肌细胞和巨噬细胞中，LOX-1的表达被增强。这样，通过氧化LDL受体(LOX-1)摄入氧化LDL，不仅关系到在血管内皮细胞中的功能障碍，而且也关系血管平滑肌细胞的功能障碍和巨噬细胞的泡沫细胞化，与动脉粥样硬化的进展有密切关系。而且，显示LOX-1的一部分在细胞外结构域的膜近处部位被切断，在血液中作为可溶型分子(可溶型LOX-1)存在。这样，由于可溶型LOX-1的血中浓度反映体内细胞中的LOX-1的表达的程度，所以作为反映急性冠脉综合征的病态的诊断标记物而受到关注，认为通过对其进行测定，能够早期诊断急性冠脉综合征(Medical Tribune，1999，Vol.32，No.31，p6；Circulation，2005，112(6)，p.812-818)。

因此，如果根据利用了包含上述本发明的单克隆抗体、其抗体片段或者它们的标记物的试剂盒的人可溶型LOX-1测定法，就能够通过测定被检者的血液中的人可溶型LOX-1而对该被检者诊断急性冠脉综合征的危险程度。特别是在急性冠脉综合征的复发危险程度的诊断中也有效(WO 2007/072896)。

另外，如上所述，由于人可溶型LOX-1的血中浓度成为反映急性冠脉综合征病态的生物标记物，所以，通过将该浓度作为指标，能够评价针对急性冠脉综合征的被检药物的药效。具体而言，如果根据利用了包含本发明的单克隆抗体、其抗体片段或者它们的标记物的试剂盒的人可溶型LOX-1测定法，例如，在急性冠脉综合征的临床试验中，通过测定被检者血液中的人可溶型LOX-1，就能够容易地判断治疗药物对该被检者的药效。另外，如果根据上述人可溶型LOX-1测定法，就能够通过测定该被检者的血液中的人可溶型LOX-1，容易地判断被检药物对急性冠脉综合征患者的治疗效果。

实施例

以下，列举实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。

实施例1[标准物质的调制]

作为标准物质，如下述所示那样调制(1)人LOX-1细胞外结构域、和(2)来自CHO细胞的可溶型LOX-1。

(1)LOX-1细胞外结构域蛋白

将编码人LOX-1细胞外结构域的一部分的序列(序列号2)重组入pQE载体(Qiagen)中，制作质粒(pQE-hLOX-1)，将其导入大肠杆菌(高速转化大肠杆菌DH5α，Nippon Gene株式会社生产)。在含有氨苄青霉素100μg/mL和硫酸卡那霉素25μg/mL的LB(Luria-Bertani)培养基50mL中培养一晚，制作起始物质，将其移入1L培养基后，添加0.5mol/L IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，培养4小时。

离心分离培养基(8000min^-1，10分钟)，在10mL含有0.5mL的Protease inhibitor cocktail(Sigma生产)和20mg溶菌酶的缓冲液A(含有1mM EDTA的0.05M Tris盐酸缓冲液，pH8.0)中悬浮所收集的大肠杆菌，冰冷下放置1小时。接着，以超声波处理(1分钟10次)破碎，离心(9000min^-1，15分钟)，收集沉淀。以8mL缓冲液B(含有8M尿素、0.1M NaH₂PO₄·2H₂O的0.01M Tris盐酸缓冲液，pH8.0)将该不溶性成分溶化，在其中加入8mL Ni-NTA agarose凝胶(Qiagen生产)，室温混合1小时。接着，将凝胶移入空柱(1.1id×13cm)，以含有20mmol/L咪唑的缓冲液B充分洗净后，以含有250mmol/L咪唑的缓冲液B洗脱LOX-1细胞外结构域蛋白质(sLOX-1-D)。将该蛋白质洗脱成分对0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH9.0)透析。将透析时加入的尿素浓度以4、2、1和0mol/L阶段性降低，进行蛋白质的重新折叠。

通过透析，使全部成分的90％以上沉淀，最终得到的人LOX-1细胞外结构域蛋白质可溶成分(称为“sLOX-1-D”)为2.4mg/15mL。以SDS-PAGE检查得到的sLOX-1-D，几乎为一条带，确认是几乎单一的sLOX-1-D。

(2)来自CHO细胞的可溶型LOX-1

在人LOX-1表达CHO细胞的培养液中被分泌的sLOX-1，认为最接近天然的人可溶型LOX-1。因此，编码人LOX-1的cDNA重组入pVP22/myc-his载体(Invitrogen生产)中，制作pVP22/myc-his-LOX-1，并将其转染CHO细胞，制成稳定细胞(stable cell)(人LOX-1(带有C-myc-his标签)表达CHO细胞)。在加入了20mL培养液(含有10vol％FCS(Fetal Calf Serum)和0.04g/dL G-418的Ham’sF-12培养基)的培养瓶(80cm²)中培养(37℃，5％CO₂)该人LOX-1(带有C-myc-his标签)表达CHO细胞，按照下述方法由该培养细胞进行传代。

首先，每3～4日将培养的烧瓶更换培养基，直到细胞成为密集状态时，进行胰蛋白酶-EDTA处理，将集聚的细胞移到几个培养瓶中，进行传代培养。另外，细胞冷冻保存一部分，其它部分用于扩大培养。在扩大培养中，在加入了约5×10⁶个细胞的3层培养瓶(500cm²，培养液150mL)中37℃培养4～6日，再更换为无血清的培养液，培养2日后，将该培养上清进行超滤(0.22μm过滤器)，加入0.33mL浓缩10倍的Protease inhibitor cocktail，冷冻保存。

收集该LOX-1(附有C-myc-his标签)表达CHO细胞培养上清，硫酸铵盐析、透析、浓缩后，使用Ni-NTA agarose(Qiagen生产)柱进行亲和性纯化。从Ni-NTA agarose柱洗脱时，精细改变咪唑浓度为5、10、20、50和100mmol/L，进行洗净，并使用250mmol/L的咪唑洗脱采取目的蛋白质(来自CHO细胞的sLOX-1)。

实施例2[TR-FIA法和使用该方法的抗体价及亲和性的测定]

作为抗体的筛选法，构建了TR-FIA(time-resolved fluoroimmunoassay)法。该方法的原理如下：在第二抗体固相化板上加入被检抗体试样，使生物素标记的抗原(生物素标记的sLOX-1-D)与其结合，生成复合体，以铕(Eu)标记的抗生物素蛋白(或Eu标记抗生物素蛋白链菌素)标记生成的复合物(第二抗体-抗sLOX-1抗体-生物素标记sLOX-1-D)，通过时间分辨荧光法检测(参照图1)。

在该反应体系中，添加在实施例1(1)或(2)中调制的标准物质(sLOX-1-D或来自CHO细胞的sLOX-1)，使之与生物素标记的sLOX-1-D竞争，抑制被检抗体试样与生物素标记的sLOX-1-D的结合，由此能够测定被检抗体试样对上述各标准物质(sLOX-1-D或来自CHO细胞的sLOX-1)的亲和性。

(1)sLOX-1-D的生物素化(生物素标记sLOX-1-D的调制)

使用生物素化试剂(sulfo-NHS-LC-biotin，Pierce生产)将实施例1(1)中调制的人LOX-1细胞外结构域蛋白质(sLOX-1-D)生物素化。即，按照手册进行下述的方法。

(i)在0.25mL反应缓冲液(0.1摩尔/L磷酸盐缓冲液，pH7.4)中溶解0.06mg sLOX-1-D(3×10^-9摩尔)，在其中加入溶解了0.025mgsulfo-NHS-LC-biotin(4.5×10^-8摩尔)(Pierce生产)的0.025mL反应缓冲液。

(ii)室温搅拌2小时进行反应。

(iii)反应后，通过凝胶过滤(PD-10，Amersham生产)分离取得目的物(生物素标记sLOX-1-D)，然后浓缩。

(2)第二抗体固相化板的调制

作为第二抗体，使用以MAPS-II试剂盒(BioRad生产)由山羊抗鼠IgG血清(柴山羊)纯化而得到的IgG成分(15.8mg/mL)。使用该IgG成分时，在固相化缓冲液(含有0.05g/dL氮化钠的0.05摩尔/L的Tris缓冲液，pH7.8)中调制为10μg/mL，在微量滴定板(maxi soap fluoro，Nunc生产)的各孔中分别注入100μL。室温静置一晚以上后，以封闭缓冲液(在100mL精制水和加入100mL固相化缓冲液溶解20g/dL蔗糖和blockase(1包4g，雪印乳业))洗净2次，再加入200μL封闭缓冲液，静置5小时以上。吸引封闭缓冲液，将该板减压下室温干燥，作为第二抗体固相化干板(4℃保管)。

(3)抗体量(抗体价)的测定方法

以洗净液(含有0.01g/dL Tween 20和0.05g/dL氮化钠的生理食盐水)2次洗净在(2)中调制的第二抗体固相化板后，在各孔中加入50μL被检抗体试样和100μL标记抗原混合液(生物素标记sLOX-1-D和Eu标记抗生物素蛋白的等量混合物)，在4℃孵育16小时，洗净3次。接着，加入150μL增强试剂(以精制水使1.39g邻苯二甲酸氢钾、6.0g醋酸、19.3mg TOPO(tri-n-octylphosphine oxide)、4.59mg NFA(2-naphthoyltrifluoroacetone)和1.0g Triton X-100成为1L)，由多标记计数器(1420 Arbo SX，Wallach生产)测定被固定在固相的铕(Eu)的时间分辨荧光强度。这样，根据荧光强度带来100000个读数的被检抗体的稀释倍数，能够求出被检抗体试样的抗体价。

另外，在本测定中，作为在试剂调制等中使用的试验缓冲液，可以列举含有0.5g/dL BSA、0.05g/dL氮化钠、0.98mg/dL DTPA、0.1g Tween 80和0.9g/dL氯化钠的0.05摩尔/L的Tris缓冲液(pH7.4)。

(4)抗体对人可溶型LOX-1的亲和性的评价方法(抑制曲线)

在(2)调制的第二抗体固相化板的孔中加入50μL被检抗体试样的稀释液、50μL人可溶型LOX-1的标准物质(sLOX-1-D或来自CHO细胞的sLOX-1)、50μL标记抗原混合液(生物素标记sLOX-1-D和Eu标记抗生物素蛋白的等量混合物)后，4℃孵育一晚，3次洗净。接着，加入150μL增强试剂，由多标记计数器(1420 Arbo SX，Wallach生产)测定被固定在固相的铕(Eu)的时间分辨荧光强度。阶段性改变配合的标准物质浓度，测定被检抗体试样和生物素标记sLOX-1-D的结合，根据标准物质(sLOX-1-D或来自CHO细胞的sLOX-1)的浓度制成抑制曲线。根据抑制曲线数据的Scatchard分析，能够求出被检抗体对人可溶型LOX-1的亲和性(解离常数，Kd)。

实施例3[单克降抗体的制作]

(1)免疫原

作为免疫原，将在实施例1(1)中调制的sLOX-1-D(包含沉淀的悬浊液)、和位于人LOX-1细胞外结构域的N端侧的由序列号5和6表示的氨基酸序列构成的肽(肽1、肽2)作为半抗原。这是由于相比于大肠杆菌等，实施例1(2)的来自CHO细胞的sLOX-1在培养液中的含量非常少，而且培养液中的夹杂物多，所以在将该sLOX-1作为抗原使用时，难以确保必须量的缘故。将上述半抗原和牛血清白蛋白(BSA，Sigma生产)的结合物作为免疫原使用。

为了与交联试剂结合，在各肽的C端导入Cys。使用交联试剂N-(ε-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(sulfo-EMCS，Pierce生产)在BSA上导入马来酰亚胺基，使其与上述含有SH基的肽段反应，得到半抗原-BSA结合物。即，在1mL反应缓冲液(0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0)中溶解27mg BSA(4×10^-7摩尔)，在其中加入0.2mL溶解了8.21mg sulfo-EMCS(2×10^-5摩尔)的反应缓冲液。室温搅拌反应90分钟。反应后，使用凝胶过滤柱(PD-10，Amersham生产)对反应液总量进行凝胶过滤，分离取得马来酰亚胺化BSA。

在2mL导入马来酰亚胺基的BSA溶液(总量的1/2)中，加入在0.5mL反应缓冲液中溶解的序列号5所示的肽1(其中，在C端导入Cys，8.68mg，6.8×10^-6摩尔)，室温搅拌1.5小时后，在4℃反应一夜。对精制水透析后，冷冻干燥(肽1-BSA)。

另外，对序列号6所示的肽2(带有Cys)8.33mg(6.6×10^-6摩尔)，使用导入马来酰亚胺基的BSA溶液2mL进行同样的反应(肽2-BSA)。

(2)免疫

作为免疫动物，使用A/J小鼠(6～8周龄，雌性，10～20g(体重)，由日本SRC获得)。使用20只A/J小鼠，分为5组，每组4只[1-1组(No.1101～1104)、2-1组(No.2101～2104)、3-1组(No.3101～3104)、4-1组(No.4101～4104)、5-1组(No.5101～5104)]。在生理食盐水中溶解免疫原(sLOX-1-D、肽1-BSA和肽2-BSA)，加入等量的弗式完全佐剂(Difco社)使之乳化。如表3所示，将约100μg/100μL该乳液向各小鼠腹腔内以3周间隔投与4次。

[表3]

组	免疫原	系统(小鼠No.)	接种量	免疫次数(间隔)
					1-1	sLOX-1-D	A/J(1101-1104)	约100μg	4次(3周间隔)
2-1	肽1-BSA	A/J(2101-2104)	约100μg	4次(3周间隔)
					3-1	肽2-BSA	A/J(3101-3104)	约100μg	4次(3周间隔)
4-1	肽1-BSA	A/J(4101-4104)	约100μg	4次(3周间隔)
					5-1	sLOX-1-D	A/J(5101-5104)	约100μg	4次(3周间隔)

以致敏3～4次后采取的抗血清作为被检抗体试样，通过进行在实施例2中说明的TR-FIA法，调查各抗血清的抗体价。在表4中表示由1-1组(No.1101～1104)、2-1组(No.2101～2104)、3-1组(No.3101～3104)的小鼠得到的抗血清的抗体价。

[表4]

滴度(1/V)：在100000cps时的稀释

从这些结果可知，以sLOX-1-D免疫而得到的抗血清的抗体价(荧光强度在100000cps时的稀释倍数)分别是10万以上，以2～3次免疫几乎达到平台。另外，根据抗体价判断，任意一组小鼠的脾脏细胞都能够在细胞融合中使用。

进而，通过以下方法从中进行小鼠的选择。具体而言，由实施例2(4)的TR-FIA法，以抗血清(在3次致敏后除去的抗血清)为被检抗体试样，首先调查对作为免疫原使用的sLOX-1-D的亲和性。接着，以对sLOX-1-D的亲和性高的抗血清为被检抗体试样，调查对来自CHO细胞的sLOX-1的亲和性。在图2中表示对1-1组小鼠调查的结合抑制曲线。所有的小鼠都与免疫原sLOX-1-D的50％抑制浓度均为近似的低值(每孔2～3ng)，但对来自CHO细胞的sLOX-1，虽然因小鼠而异，但均显示结合抑制。另外，在将以肽2为半抗原的BSA结合物免疫的鼠血清中，与肽2的反应性高，但与来自CHO细胞的sLOX-1不显示结合抑制。由此，对以肽2为半抗原免疫的鼠不进行细胞融合。

(3)细胞融合

如上述那样操作，从抗血清对作为免疫原使用的sLOX-1-D和来自CHO细胞的sLOX-1的亲和性都高的小鼠(No.1103、No.2101、No.4103、No.5101)采取脾脏细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合。骨髓瘤细胞选择P3U1细胞(P3-X63.Ag8.U1细胞的社内传代系)。使用前，将在液氮中保存的骨髓瘤细胞解冻后，使用骨髓瘤传代用培养基(RPMI-HEPES：RPMI 1640 450mL中，1mol/L HEPES(pH6.8)5mL、OPK溶液(草醋酸盐7.5mg/mL、丙酮酸钠7.5mg/mL、卡那霉素5mg/mL)10mL和FBS(Fetal Bovine Serum)50mL，传代培养7～10日，供细胞融合。

在细胞融合3日前，在乙醚麻醉下，摘出追加免疫的该小鼠的脾脏，以RPMI-HEPES(RPMI1640225mL和1摩尔/L HEPES(pH6.8)2.5mL)洗净后，在网上进行处理，调制脾脏细胞的悬浮液。混合该脾脏细胞约1×10⁸细胞和P3U1骨髓瘤细胞约2×10⁷细胞，离心除去上清后，保持在37℃，边振荡混合，边以1分钟添加800μL的50g/dL聚乙二醇4000(PEG4000)(气相色谱用，Merck)，再搅拌1.5分钟。接着，反复2次边搅拌边在1分钟内滴加1mL的RPMI-HEPES，再反复2次边搅拌边在30秒内滴加1mL的RPMI-HEPES。接着，边搅拌边用2分钟追加6mL的RPMI-HEPES，最后加入12mL的RPMI-HEPES。

离心在RPMI-HEPES中悬浮的细胞，完全除去上清后，使其悬浮在170mL HAT培养基(含有RPMI1640350mL、NCTC109(GIBCO)50mL、OPK溶液10mL、NEAA(non-essential amino acids，GIBCO) 5mL、1摩尔/L HEPES(pH6.8)5mL、HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)5mL、FCS100mL和10vol％BM-Condimed H1(Roche Applied Sciences)的培养基))中，分别注入约9块培养用96孔微板(878孔)中(1.1×10⁵细胞/0.19mL/孔)，在5％二氧化碳气体培养器内37℃下培养。在表5中表示各细胞融合的详细条件。

[表5]

细胞融合的条件

使用PEG4000的细胞融合结果，融合效率几乎100％，确认每孔数个～10数个细胞集落。

(4)由HAT培养基进行的融合细胞的筛选

在培养融合细胞的第5日，在各孔中追加加温为37℃的HAT培养基0.1mL。使用相差显微镜每日观察杂交瘤的生长，如果杂交瘤增殖为孔全部的1～5％，就各取样0.1mL各孔的培养上清。以此作为被检抗体试样，进行在实施例2中说明的TR-FIA法，从抗体价高的中再选择亲和性和细胞增殖强的，供给下述的克隆。

(5)克隆(有限稀释法)

将进行克隆的孔的杂交瘤以巴斯德吸管剥下，移动并扩大至24孔培养板中。将一部分计数，以HT培养基(含有RPMI1640 350mL、NCTC109 50mL、OPK溶液10mL、NEAA 5mL、1摩尔/L HEPES(pH6.8)5mL、HT(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)5mL、FBS 100mL和10vol％BM-Condimed H1的培养基)成倍稀释(8阶段)，使其为约50细胞/mL。将该0.2mL(以细胞数计为0.1～10细胞/孔)分别注入培养板。在3～6日后，以相差显微镜观察，检查各孔的细胞数。如果杂交瘤在某种程度上增殖，就对每孔约2个以下细胞的孔，以培养上清作为被检抗体试样，使用TR-FIA法进行筛选，在抗体价、亲和性和增殖性好的中选择单克隆的孔(一次克隆)。选择出的孔迅速进行再次克隆(二次克隆)，和一次克隆同样使用TR-FIA法进行筛选，选择目的抗体。对没有成为单克隆的，再次进行克隆(三次克隆)。确立的克隆边反复传代，边慢慢向大的培养瓶转移，调制为约5～10×10⁶细胞/mL的浓度，在血清管中分别注入0.5mL(约5根)，在液氮中保存。分离取得此时的培养上清，检查抗体价。另外，确立的杂交瘤在冷冻后，为了确认，再次进行培养，检查细胞的增殖性和抗体价。

从以sLOX-1-D免疫过的小鼠(No.1103)得到的杂交瘤，在细胞融合的第10日进行筛选，检测合计11个阳性孔(＞100000cps)。其中，对增殖好的5孔，以有限稀释法进行一次克隆，得到认为几乎是单克隆的10孔。再进行二次克隆，在其第10日进行筛选，得到认为是单克隆的3孔。这些都是从6B11的克隆得到的。

另外，在从小鼠(No.5101)同样制作的杂交瘤中检测合计48个阳性孔。其中，对sLOX-1-D亲和性强的9孔进行一次克隆。在克隆后的第10日进行筛选，选择抗体价和亲和性良好且接近单克隆的孔进行二次克隆。其结果，得到合计8个克隆(1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1B8、1A7)。

再对从以肽1作为半抗原的BSA结合物3次免疫后的A/J小鼠(No.2101)得到的杂交瘤也通过2次克隆，确立克隆(5C11)。同样操作，从小鼠(No.4103)通过2次筛选和克隆，确立克隆(4D1)。

在表6中表示以上的克隆结果。

[表6]

(6)单克隆抗体的采取(培养上清和腹水)

在(5)中调制的杂交瘤中，大量培养以LOX-1的细胞外结构域蛋白质(sLOX-1-D)以及作为LOX-1细胞外结构域的N端肽的肽1的BSA结合物为免疫原调制得到的11种杂交瘤(1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1B8、1A7、6B11、5C11、4D1)，置换为无血清培养基，收集该培养上清液，由此采取单克隆抗体。

另外，将上述杂交瘤中以LOX-1的细胞外结构域蛋白质(sLOX-1-D)为免疫原调制得到的杂交瘤(1G2、2G11、6B11和1A7)以及以肽1为半抗原调制得到的杂交瘤(5C11、4D1)，在预先以1mL降植烷处理过的小鼠(Balb/c和Balb/c nu(裸鼠))腹腔内各接种约2～3×10⁶细胞。另外，将杂交瘤从在液氮中的冷冻状态解冻，在7～10日扩大培养后，向小鼠腹腔内投与。观察该小鼠，对腹部膨胀的小鼠(投与后8～17日)在乙醚麻醉下致死后，采取腹腔内的腹水。从接种了各杂交瘤的小鼠中，每1只取得1.2～4.9mL腹水，测定抗体价(表7)。

[表7]

单克隆抗体的采取

(7)单克隆抗体的纯化

将在(6)中调制的杂交瘤的培养上清和小鼠腹水中包含的单克隆抗体供给蛋白A亲和柱(亲和凝胶蛋白AMAPS-II试剂盒，BioRad)，纯化为IgG。具体而言，首先在空柱中填充约1mL的蛋白A固定化珠的凝胶(制成悬浮液约1.5～2mL)，以结合缓冲液(在试剂盒中带有) 10mL洗净，制成蛋白A亲和柱。混合杂交瘤的培养上清或小鼠腹水0.5mL和结合缓冲液0.5～1mL，将离心分离而调制的上清供给上述制成的蛋白A亲和柱，首先流动20mL结合缓冲液，洗净不被保持的物质，接着，使用洗脱缓冲液(在试剂盒中带有)30mL，使IgG脱离、洗脱。取代为洗脱缓冲液后，将最初出现的蛋白质峰作为IgG溶液采取。因为洗脱缓冲液为酸性(pH3.0)，所以，立即以1摩尔/L Tris缓冲液(pH9.0)中和洗脱出来的IgG。将得到的IgG溶液在磷酸缓冲食盐水(PBS)中透析后，冷冻保存。其结果，从杂交瘤的培养上清的一部分(30～40mL)得到100～700μg的IgG。

由MAb-BASED MOUSE Ig ISOTYPING KIT(PHARMINGEN)鉴定得到的单克隆抗体(IgG)的亚型。其结果，11种(6B11、1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1A7、1B8、5C11、4D1)中的9种是IgG1，其余的是IgG2a和IgG2b(表8)。另外，这些单克隆抗体的解离常数(Kd)的一部分表示如下(表9)。另外，上述Kd的各值是相对人LOX-1细胞外结构域的一部分(序列号2)的值，但由于人可溶型LOX-1(序列号3和4)和氨基酸序列的差异非常小，所以，认为对人可溶型LOX-1的Kd也几乎相同。

[表8]

[表9]由Scatchard图得到的解离常数

实施例4 单克隆抗体的组合

按照在实施例2(1)中说明的方法，将在实施例3中得到的11种单克隆抗体(培养上清的IgG部分)中除去1B8抗体的10种进行生物素标记。按照实施例2(2)的方法将这10种生物素标记抗体和上述11种单克隆抗体使用固相化板构建双抗体夹心ELISA，对110那样的抗体组合，调查以sLOX-1-D和来自CHO细胞的sLOX-1为标准物质时的ELISA标准曲线。

以肽1(在序列号5所示的多肽末端附加有结合用的半胱氨酸的肽)与BSA结合得到的肽1-BSA为免疫原，使按照实施例3调制得到的抗体(4D1抗体和5C11抗体)成为固相时，尽管空白高，但是，在与无论哪个生物素标记单克隆抗体(6B11、1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1A7、1B8)组合的ELISA中，均显示良好的反应(表10)。

[表10]

在sLOX-1ELISA中的单克隆抗体的组合

由此可知，将sLOX-1-D免疫得到的9种单克隆抗体(6B11、1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1A7、1B8)，显示与针对sLOX-1 N端肽的抗体同时结合，并确认识别与sLOX-1的N端(新抗原决定簇)不同的部位。

在将sLOX-1-D免疫得到的抗体之间(6B11、1G2、2E4、2E5、2G11、3E12、7G1、1A7、1B8)，只在1A7抗体和6B11抗体的组合中显示强反应，提示此外的抗体都有接近的识别部位的可能性(表10)。

另外，在产生在上述中得到的单克隆抗体的杂交瘤中，对杂交瘤1A7和6B11，作为杂交瘤的表示“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-11A7”和“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 6B11”，在2006年7月26日被国际保藏在住所为日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6的国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心。各杂交瘤的受领号和保藏号如下：

[表11]

杂交瘤的表示	受领号	保藏号
			“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 1A7”	FERM ABP-10645	FERM BP-10645
“Mouse-Mouse hybridoma sLOX-1 6B11”	FERM ABP-10646	FERM BP-10646

实施例5[化学发光ELISA]

(1)单克隆抗体的片段化方法

在单克隆抗体(IgG)的0.02摩尔/L醋酸缓冲液(pH4.0)0.25mL中加入胃蛋白酶(Sigma)稀释液(50μg/mL)50μL，搅拌后，在37℃反应3小时。反应结束后，由凝胶过滤HPLC系统(岛津LC-6A，柱：TSK-gelG3000SWXL，6.8×300mm，洗脱液：含有0.2摩尔/L氯化钠的0.1摩尔/L磷酸盐缓冲液，pH7.0，流速：0.5mL/min，检测：280nm)分离取得保持时间约18分钟的F(ab’)₂成分(分子量约9.2万)。

以离心超滤(YM-30，Centricon生产)浓缩分离取得的F(ab’)₂成分后，在加入有0.1摩尔/L 2-巯基乙胺的缓冲液A(含有5mmol/LEDTA的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.0)0.25mL中加入0.32mg，在37℃还原90分钟。反应结束后，由凝胶过滤HPLC系统采取保持时间约20分钟的Fab’成分(分子量约4.6万)。分离取得的Fab’成分以离心超滤(YM-30)浓缩。

(2)由碱性磷酸酯酶进行的抗体标记方法

在0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)0.2mL中溶解碱性磷酸酯酶(ALP，来自牛小肠，Kikkoman)1mg，加入在精制水0.05mL中溶解的N-(8-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺、钠盐(sulfo-HMCS，同仁化学)0.1mg，室温反应2小时。反应结束后，以PD-10柱(洗脱液：缓冲液A)纯化后，以离心超滤(YM-10，Centricon)浓缩该高分子成分，得到马来酰亚胺化ALP。

在含有0.13mg的在(1)中调制的单克隆抗体Fab’的缓冲液A0.25mL中，加入上述马来酰亚胺化ALP溶液0.026mL(0.128mg)并搅拌后，使之在室温反应16小时。反应结束后，将0.15ml反应液由凝胶过滤HPLC系统(洗脱液：含有0.2mol/L氯化钠的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0)分离纯化(保持时间约15分钟)，得到ALP标记抗体(ALP标记Fab’)。

(3)ALP标记单克隆抗体(1G2、2G11、6B11)的最适量的研究

按照上述(1)和(2)的方法，将从培养上清或腹水中得到的3种单克隆抗体(1G2、2G11、6B11)的IgG成分(1G2：2.0mg、2G11：1.9mg、6B11：1.3mg)在胃蛋白酶处理后还原，成为Fab’，使之与马来酰亚胺化ALP反应，由凝胶过滤HPLC分别取得3种Fab’-ALP结合物(酶标记抗体)。得到的酶标记抗体分别为0.41mg、0.42mg和0.29mg。

使用3种固相抗体(5C11、4D1、1A7)调查得到的3种酶标记抗体(1G2、2G11和6B11)的评价。其结果，无论哪个酶标记抗体(1G2、2G11、6B11)对3种固相抗体(5C11、4D1、1A7)都显示良好的反应，确认所制作的酶标记抗体都能够在ELISA中使用。另外，酶标记抗体的每孔使用量，1G2为70ng/mL，2G11为50ng/mL，6B11为90ng/mL，使用100μL。

(4)利用化学发光ELISA的人血清试样测定方法

使用单克隆抗体IgG(1A7的IgG)的固相化缓冲液稀释液100μL(1μg/100μL)，按照在实施例2(2)项中叙述的第二抗体固相化板制作方法操作，制作抗体固相化干板。

以洗净液(含有0.01g/dL Tween 20和0.05g/dL氮化钠的生理食盐水)2次洗净该抗体固相化板后，在各孔中加入sLOX-1-D标准溶液或来自CHO细胞的sLOX-1纯化液100μL(人血清试样测定时，在试验缓冲液100μL中加入试样10μL)，静置5小时。洗净3次后，加入ALP标记抗体溶液(6B11的Fab’-ALP结合物)100μL。室温孵育一晚，洗净4次后，在固相上加入化学发光底物溶液(100μL)，立即由多标记计数器测定各孔的发光强度。发光底物使用LumigenAPS-5(Oriental Yeast)。另外，作为固相化抗体和ALP标记抗体的组合，使用1A7-6B11(固相化抗体-ALP标记抗体)。

另外，在试剂的调制等中使用的试验缓冲液使用含有0.5g/dLBSA、0.05g/dL氮化钠、0.01g/dL Tweem 80、1mmol/L氯化镁、0.1mmol/L氯化锌和0.9g/dL氯化钠的0.05mol/L的Tris缓冲液(pH7.4)。

(5)ELISA体系的选择

按照实施例5(4)项，使用将3种酶标记抗体(1G2、2G11和6B11)和单克隆抗体1A7、5C11和4D1的IgG固相化(1μg/0.1mL)的板，制成以LOX-1细胞外结构域蛋白质为标准物质的化学发光双抗体夹心ELISA的标准曲线(0.24～250pg/孔)。任意组合都显示高反应，特别是固相化抗体和标记抗体(Fab’-ALP结合物)的组合，分别在1A7-6B11、5C11-1G2、4D1-2G11时得到高灵敏度的标准曲线。其中，尽管空白稍高，但反应最高的是1A7-6B11组合(推定检测限度是0.24pg/孔(约6amol/孔))。

在以来自CHO细胞的sLOX-1为标准物质的化学发光双抗体夹心ELISA的标准曲线中，也确认相比于在固相中使用针对肽1的抗体的5C11-1G2、4D1-2G11，1A7-6B11的组合良好，达到100倍程度的灵敏度(图3)。

(6)血清成分对ELISA产生的影响

将人血清(组合5名志愿者的血清)、兔血浆和胎牛血清稀释到1/1～1/64，使用上述3种试验体系测定其50μL(血清量是0.78～50μL/well)。在1A7-6B11(固相化抗体-ALP标记抗体)的ELISA体系中，动物血清几乎不反应，但人血清根据血清量而表现出反应，在0.78～12.5μL的范围中可见稀释直线性。这些结果表示，该测定体系能够特异地测定人血清中的人sLOX-1(图4)。

另外，在人血清的取样量10μL以下时，推定血清成分的影响极小，所以，血清的取样量为10μL，标准溶液以不含人血清的试验缓冲液调制。

(7)小鼠γ球蛋白对ELISA产生的影响

已知在血中具有抗小鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)的人以不能忽视的比例存在的情况，在使用小鼠抗体的ELISA中，这些人的血液试样显示异常的高值。这种妨碍能够通过在试验缓冲液中预先添加小鼠γ球蛋白(IgG)来抑制，在本ELISA中，也在试验缓冲液中添加小鼠γ球蛋白以消除其影响。调查小鼠γ球蛋白浓度对ELISA标准曲线的影响，直到20μg/mL几乎不产生影响，在化验缓冲液中成为添加10μg/mL的小鼠γ球蛋白。另外，在这里使用的5名志愿者血清中不存在HAMA。在图5中表示以含有小鼠γ球蛋白的试验缓冲液制作的ELISA标准曲线。

(8)预验证和定量限度的推定

对于sLOX-1浓度低的志愿者血清(No.3)，使用将sLOX-1-D添加至0.100～12.8ng/mL(1～128pg/孔)浓度的试样进行预验证。如在表12中所示的那样，在0.100～6.40ng/mL的范围内的精度和保真度良好(1.7～15.7％和-10.5～+14.4％)。在同样浓度范围中的实验之间的精度和保真度也良好(5.3～12.3％和-8.3～+7.5％)。另一方面，在高浓度(12.8ng/mL)下，保真度稍差，但认为修正标准曲线的点和回归计算方法能够改善。从这些结果推定，定量限度是约0.1ng/mL，能够达到比使用多克隆抗体的ELISA(定量限度是约1ng/mL)提高10倍的灵敏度。

本ELISA的第一和第二反应的时间(分别是5小时和一晚)符合多克隆抗体说明书的反应时间，但因为使用单克隆抗体，所以有能够缩短反应时间的可能性，调查使第一反应为4小时、第二反应为1小时的实验内的精度和保真度后，得到如在表13中所示的没有问题的结果(分别是2.3～14.7％和-14.1～16.0％)。

[表12]

[表13]

sLOX-1ELISA在短时间测定条件下的精度和保真度

(第一反应时间：4小时，第二反应时间：1小时)

(9)血清中sLOX-1的测定

使用本试验体系，测定从健康正常5名志愿者得到的血清中的sLOX-1浓度(以sLOX-1-D为标准物质时的免疫反应性)。如在表14中所示的那样，健康正常人血清的sLOX-1值是0.15～0.57ng/mL，利用本ELISA，用以往方法(多克隆抗体说明书的ELISA)不能测定的健康正常人血清中的sLOX-1的测定是可能的。另外，从该测定结果不能确认与性别或年龄的关联。

[表14]

由sLOX-1ELISA测定健康正常志愿者血清的结果

因为健康正常人的sLOX-1血中平均浓度是0.35ng/mL，所以如果考虑其分子量，血清中的摩尔浓度就成为2×10^-11M左右，根据将其稀释为10倍供测定，计算测定时的摩尔浓度为2×10^-12M左右。另一方面，本发明的单克隆抗体那样的高亲和性(Kd＝1×10^-10M以下)抗体的0.1％与sLOX-1结合时的sLOX-1总浓度估计为2×10^-12M左右。通过使用这样的高亲和性的单克隆抗体，能够测定健康正常人血清中的sLOX-1浓度，从而能够正确地诊断。

附图说明

图1是表示在本发明的单克隆抗体筛选中使用的双抗体夹心ELISA的概略图。

图2是使用将sLOX-1-D免疫而制成的A/J小鼠[No.1101(圆标记)、No.1102(三角标记)、No.1103(四方标记)、No.1104(菱形标记)]的抗血清，以标准物质sLOX-1-D(黑标记)和来自CHO细胞的sLOX-1(白标记)为抑制物质，进行TR-FIA，将其结果作为抑制曲线描绘的图(实施例3)。纵轴表示各浓度(B)的荧光强度对零浓度(B₀)的荧光强度的百分率，横轴表示LOX-1细胞外结构域蛋白质(sLOX-1-D)浓度或从LOX-1表达CHO细胞得到的可溶型LOX-1(sLOX-1)的推定浓度(ng/孔)。

图3表示使用1A7-6B11(●)、5C11-1G2(▲)、4D1-2G11(■)作为固相化抗体-标记抗体的双抗体夹心ELISA的标准曲线。图A表示使用sLOX-1-D作为标准物质进行的ELISA的标准曲线，图B表示使用来自CHO细胞的sLOX-1作为标准物质进行的ELISA的标准曲线(实施例5(4))。纵轴表示荧光强度(cps)，横轴表示各标准物质的添加浓度(pg/孔)。

图4表示使用1A7-6B11作为固相化抗体-标记抗体的双抗体夹心ELISA对各血清(人血清◆、正常家兔血清▲)的反应(实施例5(6))。纵轴表示荧光强度(cps)，横轴表示血清的添加量(μl)。

图5是表示使用固相化1A7抗体-标记6B11抗体的双抗体夹心ELISA的标准曲线。图A表示log-log图，图B表示semi-log图。纵轴表示荧光强度(cps)，横轴表示标准物质(sLOX-1-D)的添加浓度(pg/孔)。添加的γ球蛋白浓度是0μg/mL(○)、5μg/mL(●)、10μg/mL(◆)、20μg/mL(■)。

序列表自由文本

序列号5表示相当于可溶型分子(序列号3)的氨基酸序列的1～10区域的肽的氨基酸序列。相当于人LOX-1(序列号1)的氨基酸序列的88～97区域。

序列号6表示相当于可溶型分子(序列号4)的氨基酸序列的1～10区域的肽的氨基酸序列。相当于人LOX-1(序列号1)的氨基酸序列的92～101区域。

Claims

1.一种单克隆抗体、所述单克隆抗体的片段、或者所述单克隆抗体或其片段的标记物，其特征在于：

所述单克隆抗体由保藏号为FERM BP-10646的“Mouse-Mousehybridoma sLOX-1 6B11”杂交瘤产生，具备与具有序列号2所示的氨基酸序列的人可溶型LOX-1特异性结合的特性，与人可溶型LOX-1的解离常数(Kd)为1×10^-9(M)以下，

所述单克隆抗体的片段选自对所述人可溶型LOX-1具有特异性结合的特性的Fab(fragment of antigen binding)、F(ab’)₂、Fab’、scFv(singlechain Fv)、2倍体化V区片段(Diabody)、dsFv(disulfide stabilized Fv)、dAd(single domain antibody)以及包含CDR的肽中的至少一种，

所述单克隆抗体或其片段的标记物以选自酶、放射性同位素、荧光性化合物、化学发光性化合物和生物发光性化合物中的至少一种标记。

2.一种杂交瘤，其特征在于：

其为产生与人可溶型LOX-1的解离常数(Kd)为1×10^-9(M)以下的单克隆抗体的、保藏号为FERM BP-10646的“Mouse-Mousehybridoma sLOX-1 6B11”。

3.一种人可溶型LOX-1检测用试剂盒，其特征在于：

包含权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求1所述的单克隆抗体的片段或者权利要求1所述的标记的单克隆抗体或其片段。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：

其为急性冠脉综合征诊断试剂盒。