CN116836940A - 一种氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。所述杂交瘤细胞株包括保藏编号为GDMCC No:63553的杂交瘤细胞株JD03#5‑21和保藏编号为GDMCCNo:63554的杂交瘤细胞株JD02#2‑2；本申请通过获得分泌抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得针对氧化低密度脂蛋白不同抗原表位的单克隆抗体两种，该单克隆抗体特异性、亲和力、效价均较高，可以通过配对检测样本中的氧化低密度脂蛋白含量，应用于检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。
背景技术
氧化低密度脂蛋白脂蛋白是低密度脂蛋白(LDL)在体内发生氧化修饰而形成的。低密度脂蛋白上的多不饱和脂肪酸氧化后形成丙二醛，丙二醛氧化修饰载脂蛋白B上的赖氨酸残基，当赖氨酸修饰量超过15％后将形成新的抗原表位，即形成氧化低密度脂蛋白。
氧化低密度脂蛋白不能被低密度脂蛋白受体识别，此时吞噬细胞将大量、快速、无限制地吞噬氧化低密度脂蛋白。氧化低密度脂蛋白能抵抗细胞内溶酶体酶和组织蛋白酶对它的降解，导致胆固醇在细胞内大量积聚，最终形成泡沫细胞。泡沫细胞是导致动脉粥样硬化的关键因素，而氧化低密度脂蛋白是导致动脉粥样硬化的关键性蛋白。
国内外对氧化低密度脂蛋白的临床意义已有比较深入的研究，对其在动脉粥样硬化上的致病性上一致认可。但在临床的检测上面临着重大的检测难题，主要原因是氧化低密度脂蛋白的交叉反应物质多，难以获得特异性好的单克隆抗体，且交叉反应物质的浓度高于氧化低密度脂蛋白的浓度，因此，亟需一种特异性识别血样本中的氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及分泌抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。本申请通过获得分泌抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞株JD03#5-21和杂交瘤细胞株JD02#2-2)，进而获得针对氧化低密度脂蛋白不同抗原表位的单克隆抗体两种，该单克隆抗体特异性、亲和力、效价均较高，可以通过配对检测样本中的氧化低密度脂蛋白含量，应用于检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一方面，本申请提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株包括保藏编号为GDMCC No:63553的杂交瘤细胞株JD03#5-21和保藏编号为GDMCC No:63554的杂交瘤细胞株JD02#2-2；所述杂交瘤细胞株JD03#5-21和杂交瘤细胞株JD02#2-2均于2023年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
第二方面，本申请提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株产生，所述单克隆抗体特异性识别氧化低密度脂蛋白。
本申请筛选出的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以特异性识别血样本中的氧化低密度脂蛋白，该单克隆抗体特异性、亲和力均较高，可以通过配对检测血样本中的氧化低密度脂蛋白含量，具有检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。
经过单克隆抗体效价检测的试验，杂交瘤细胞株JD03#5-21和杂交瘤细胞株JD02#2-2单克隆抗体效价分别为1：256000和1:128000，效价高。
作为本申请所述单克隆抗体的优选实施方式，所述氧化低密度脂蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
经过单克隆抗体配对实验验证，杂交瘤细胞株JD03#5-21分泌的单克隆抗体作为捕获抗体与杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体反应性好，与交叉反应物质基本没有反应。
作为本申请所述单克隆抗体的优选实施方式，所述杂交瘤细胞株JD03#5-21分泌的单克隆抗体识别氨基酸序列如SEQ ID NO:1的氧化低密度脂蛋白；所述杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体识别氨基酸序列如SEQ ID NO:2的氧化低密度脂蛋白。
第三方面，本申请还提供了一种上述单克隆抗体的制备方法，将上述杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，采集腹水后，经纯化获得单克隆抗体。
更优选地，上述杂交瘤细胞株的筛选方法，包括以下步骤：
1)氧化低密度脂蛋白片段准备：通过蛋白表达获得2段低密度脂蛋白片段，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，再用丙二醛在37℃条件下处理2小时得到氧化低密度脂蛋白片段。
2)用氧化低密度脂蛋白片段免疫小鼠，检测小鼠血清效价；
3)检测小鼠血清效价达到1:10000后用氧化低密度脂蛋白片段腹腔加强免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，克隆筛选出单克隆抗体的杂交瘤细胞行扩大再培养和保存。
更优选地，所述小鼠骨髓瘤细胞为SP2/0小鼠骨髓瘤细胞。
更优选地，上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)向BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，腹腔接种上述杂交瘤细胞株，采集腹水上清备用；
2)将采集的腹水用微孔滤膜过滤溶液，加入硫酸铵，搅拌均匀后，静置，收集沉淀，并用PBS溶液重溶沉淀；将得到的粗纯抗体上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用甘氨酸-盐酸溶液洗脱抗体，得到单克隆抗体。
第四方面，本申请提供了上述杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在检测氧化低密度脂蛋白中的应用。
第五方面，本申请提供了上述单克隆抗体在制备氧化低密度脂蛋白体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
第六方面，本申请提供了一种免疫检测试剂，所述免疫检测试剂包括保藏编号为GDMCC No:63553的杂交瘤细胞株JD03#5-21和保藏编号为GDMCC No:63554的杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体。
第七方面，本申请提供了一种氧化低密度脂蛋白检测试剂盒，所述检测试剂盒包括保藏编号为GDMCC No:63553的杂交瘤细胞株JD03#5-21和保藏编号为GDMCC No:63554的杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体。
作为本申请所述氧化低密度脂蛋白检测试剂盒的优选实施方式，所述检测试剂盒还包括标准品、检测抗体和化学发光底物。
第八方面，本申请提供了上述杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在制备检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本申请提供了一种氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用，本申请通过获得分泌抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞株JD03#5-21和杂交瘤细胞株JD02#2-2)，获得针对氧化低密度脂蛋白不同抗原表位的单克隆抗体两种，该单克隆抗体特异性、亲和力、效价均较高，经过单克隆抗体配对实验验证，杂交瘤细胞株JD03#5-21分泌的单克隆抗体作为捕获抗体与杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体反应性好，与交叉反应物质基本没有反应。并且，本申请制备的单克隆抗体可以通过配对检测样本中的氧化低密度脂蛋白含量，应用于检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。
附图说明
图1为杂交瘤细胞株JD03#5-21、D01#5-5、JD02#2-2和JD02#2-10分泌的抗体进行7.5％和13.0％SDS-PAGE的电泳图。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、分泌氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1)小鼠免疫：用氧化低密度脂蛋白片段免疫BALB/c小鼠，每只小鼠每次免疫50μg蛋白。首次免疫氧化低密度脂蛋白片段与弗氏完全佐剂按照质量比为1：1混合，随后氧化低密度脂蛋白片段与弗式不完全佐剂按照质量比为1：1混合，每隔两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。
2)杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用氧化低密度脂蛋白片段腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合在50mL离心管，然后加入1mL预热PEG作用45s后，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基至35mL，42℃水浴15min，1000rpm/min离心10min弃上清，加50mL预热HAT培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。采用氧化低密度脂蛋白片段鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞4株，分别命名为杂交瘤细胞株JD03#5-21、GLU-N2-17、JD02#2-2和JD02#2-10。
在本实施例中，杂交瘤细胞株JD03#5-21的保藏编号为GDMCC No:63553，杂交瘤细胞株JD02#2-2的保藏编号为GDMCC No:63554；杂交瘤细胞株JD03#5-21和杂交瘤细胞株JD02#2-2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间均为2023年6月9日。
实施例2、氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的制备、纯化及效价检测
1)单抗腹水制备：10-12周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹腔接种上述杂交瘤细胞株(JD03#5-21、JD01#5-5、JD02#2-2和JD02#2-10)，1x106/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，收集腹水上清备用。
2)抗体纯化：将收集的腹水用0.45μm的微孔滤膜过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀，得粗纯抗体。将粗纯抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH 2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行7.5％和13.0％SDS-PAGE电泳，结果显示，由杂交瘤细胞株JD03#5-21、JD01#5-5、JD02#2-2和JD02#2-10分别分泌的抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于95％，见图1所示。
3)单克隆抗体效价检测：
以100μL、1μg/mL的氧化低密度脂蛋白的碳酸盐缓冲液(pH9.5)4℃过夜包被微孔板。将步骤2)纯化后的抗体浓度调整为1mg/mL，梯度稀释各个抗体(1:4000、1:8000，1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(1:200000)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，杂交瘤细胞株JD03#5-21、JD01#5-5、JD02#2-2和JD02#2-10分泌的单克隆抗体效价分别均为1：256000、1:128000、1:128000、1:128000。
实施例3、单克隆抗体表位鉴定
重组截断氧化低密度脂蛋白构建表达：根据低密度脂蛋白氨基酸序列，设计了以下氨基酸序列，连接至表达载体pET28a，并装入表达菌株BL21(DE3)中。在LB培养基中，IPTG1mmol/L室温条件下过夜诱导低密度脂蛋白截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经聚组氨酸标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，纯度均在90％以上。纯化后的蛋白加入5mM的丙二醛在37℃条件下氧化修饰处理2小时。
SEQ ID NO:1：KLKETIQKLS NVLQQVKIKD YFEKLVGFID DAVKKLNELS FKTFIEDVNKFLDmLIKKLK SF
SEQ ID NO:2：KEFLKTTKQS FDLSVKAQYK KNKHRHSITN PLAVLCEFIS QSIKSFDRHFEKNRNNALDF VTKSYNETKI KFDKYKAEK
ELISA法确认单克隆抗体识别表位：分别以碳酸盐缓冲液100μL体积包被1ug/mL氧化低密度脂蛋白片段4℃过夜，将上述4株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体分别倍比稀释(800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、255ng/mL、12.5ng/mL和0ng/mL)后加入到微孔反应板，然后加入羊抗鼠IgG-HRP(1:20000)，结果如表1所示。结果确定杂交瘤细胞株JD03#5-21和杂交瘤细胞株JD01#5-5分泌的单克隆抗体能识别SEQ ID NO:1，杂交瘤细胞株JD02#2-2和杂交瘤细胞株JD02#2-10分泌的单克隆抗体特异识别SEQ ID NO:2。
表1单克隆抗体识别抗原表位分析
实施例4、交叉反应考察
将1μg/mL的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)分别包被微孔板，将上述4株杂交瘤细胞株分泌的抗体分别倍比稀释(800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL和0ng/mL)后加入100μL到微孔反应板，37℃孵育30min洗涤后加入100μL羊抗鼠IgG-HRP(1:20000)，37℃孵育30min，洗涤后加入底物200μL，室温避光反应15min，加入终止液后采用酶标仪测定其吸光度OD450nm。结果如表2所示。
4株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与ox-LDL的反应性均较强，其中细胞株JD03#5-21和JD02#2-2分泌的单克隆抗体与类似物低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白基本没有反应，杂交瘤细胞株JD01#5-5和JD02#2-10分泌的单克隆抗体与低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白反应性与氧化低密度脂蛋白的反应性基本一致。因此细胞株JD03#5-21和JD02#2-2分泌的单克隆抗体能够特异性识别氧化低密度脂蛋白。
表2单克隆抗体识别抗原表位分析
实施例5、抗体配对验证及交叉反应考察
化学发光法配对及交叉反应验证：将吖啶衍生物(Acridan)和辣根过氧化物酶(HRP)分别标记杂交瘤细胞株JD03#5-21和JD02#2-2分泌的单克隆抗体进行标记。
干扰样本准备：准备低密度脂蛋白(2mg/mL)、极低密度脂蛋白(2mg/mL)和高密度脂蛋白(0.6mg/mL)。检测干扰样本时使用样本稀释液稀释400倍。取10μL不同浓度氧化低密度脂蛋白校准品及稀释好的交叉反应物质、40μL3μg/mL Acridan标记抗体、40μL 500ng/mLHRP标记抗体，37℃孵育30min，加入含过氧化氢的发光底物同时检测1-3秒内的发光信号下峰面积(AUC)。检测结果如表3所示，Acridan标记JD03#5-21抗体与HRP标记JD02#2-2抗体配对反应性好，与低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的交叉反应率低，不会影响检测结果。
表3单克隆抗体配对及交叉反应
| 氧化低密度脂蛋白和干扰样本 | 峰面积(AUC) |
| 0(mU/L) | 589 |
| 25(mU/L) | 2266 |
| 50(mU/L) | 4691 |
| 100(mU/L) | 9431 |
| 200(mU/L) | 19952 |
| 350(mU/L) | 36387 |
| 低密度脂蛋白(2mg/mL) | 623 |
| 极低密度脂蛋白(2mg/mL) | 599 |
| 高密度脂蛋白(0.6mg/mL) | 563 |
实施例6、一种氧化低密度脂蛋白检测试剂盒
本实施例提供一种氧化低密度脂蛋白检测试剂盒，试剂盒包含三个试剂组分，分别为Acridan标记杂交瘤细胞株JD03#5-21分泌的单克隆抗体(Acridan标记抗体)，HRP标记杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体(HRP标记抗体)，样本稀释液(由磷酸缓冲液和去氧胆酸钠组成，市面可购买)，校准品为冻干粉，浓度为0-350mU/L，Acridan标记抗体、待测氧化低密度脂蛋白以及HRP标记抗体形成双抗体夹心免疫复合物，加入底物后，免疫复合物中HRP催化底物中的过氧化物产生羟自由基，自由基传递到夹心复合物上的Acirdan，Acridan经加成反应和氧化反应后产生光信号，通过光信号与待测物浓度呈正相关。该试剂盒可以检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。
实施例7、氧化低密度脂蛋白检测试剂盒在疾病上的应用
从医院分别选取血脂正常、无动脉粥样硬化的样本(第1组)、血脂异常、无动脉粥样硬化的样本(第2组)和有动脉粥样硬化疾病的样本(第3组)，各选取20例。用实施例6中的试剂盒进行检测，检测结果如表4所示。分别将第2组和第3组检测结果与第1组进行显著性分析，结果发现p值均小于0.001，具有显著差异。故在血脂异常或动脉粥样硬化的患者中，氧化低密度脂蛋白的浓度与健康人群有显著性差异。故检测氧化低密度脂蛋白与血脂异常或动脉粥样硬化疾病有一定相关性。
表4 3组样本中氧化低密度脂蛋白检测结果比较单位：U/L
| 样本序号 | 第1组 | 第2组 | 第3组 |
| 1 | 41.54 | 62.97 | 46.07 |
| 2 | 34.46 | 55.31 | 72.49 |
| 3 | 27.33 | 41.59 | 59.96 |
| 4 | 34.28 | 60.98 | 72.18 |
| 5 | 33.97 | 47.96 | 46.79 |
| 6 | 25.79 | 59.98 | 52.91 |
| 7 | 27.26 | 57.97 | 71.34 |
| 8 | 26.71 | 49.25 | 60.77 |
| 9 | 23.66 | 59.33 | 61.66 |
| 10 | 30.74 | 65.58 | 57.26 |
| 11 | 34.58 | 47.78 | 73.65 |
| 12 | 24.77 | 59.18 | 70.37 |
| 13 | 44.77 | 57.08 | 68.94 |
| 14 | 35.73 | 48.38 | 69.07 |
| 15 | 37.37 | 45.12 | 71.27 |
| 16 | 26.02 | 48.94 | 65.32 |
| 17 | 28.08 | 54.18 | 58.82 |
| 18 | 35.00 | 58.96 | 66.45 |
| 19 | 24.38 | 44.65 | 63.47 |
| 20 | 38.12 | 48.66 | 47.16 |
| AV | 31.73 | 53.69 | 62.80 |
| SD | 6.10 | 6.91 | 9.00 |
| p | / | ＜0.001 | ＜0.001 |
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株包括保藏编号为GDMCC No:63553的杂交瘤细胞株JD03#5-21和保藏编号为GDMCCNo:63554的杂交瘤细胞株JD02#2-2；所述杂交瘤细胞株JD03#5-21和杂交瘤细胞株JD02#2-2均于2023年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生，所述单克隆抗体特异性识别氧化低密度脂蛋白。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述氧化低密度脂蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株JD03#5-21分泌的单克隆抗体识别氨基酸序列如SEQ ID NO:1的氧化低密度脂蛋白；所述杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体识别氨基酸序列如SEQ ID NO:2的氧化低密度脂蛋白。
5.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株或如权利要求2～4任一项所述的单克隆抗体在检测氧化低密度脂蛋白中的应用。
6.如权利要求2～4任一项所述的单克隆抗体在制备氧化低密度脂蛋白体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
7.一种免疫检测试剂，其特征在于，所述免疫检测试剂包括保藏编号为GDMCC No:63553的杂交瘤细胞株JD03#5-21和保藏编号为GDMCC No:63554的杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体。
8.一种氧化低密度脂蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括保藏编号为GDMCC No:63553的杂交瘤细胞株JD03#5-21和保藏编号为GDMCC No:63554的杂交瘤细胞株JD02#2-2分泌的单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的氧化低密度脂蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括标准品、检测抗体和化学发光底物。
10.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株或如权利要求2～4任一项所述的单克隆抗体在制备检测氧化低密度脂蛋白含量变化或诊断以氧化低密度脂蛋白为表征的疾病的产品中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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