CN117567611B - 抗成熟型胃泌素17的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了抗成熟型G‑17氨基端单克隆抗体，其轻链CDR1序列为SEQ ID NO.2、CDR2序列为LVS、CDR3序列为SEQ ID NO.3，重链CDR1‑3序列分别为SEQ ID NO.5‑7；还公开了抗成熟型G‑17羧基端单克隆抗体，其轻链CDR1序列为SEQ ID NO.9、CDR2序列为LVS、CDR3序列为SEQ ID NO.10，重链CDR1‑3序列分别为SEQ ID NO.12‑14。上述抗单克隆抗体对成熟型G‑17均具有很好的亲和力和特异性，可以单独或或组合应用于制备检测成熟型G‑17的产品或者单独用于制备治疗G‑17高表达肿瘤的药物。

Description

抗成熟型胃泌素17的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗成熟型胃泌素17(G-17)的单克隆抗体及其在检测成熟型胃泌素17或者治疗成熟型胃泌素17高表达的肿瘤中的应用。
背景技术
胃癌的发生与胃肠道激素的表达异常有关，胃泌素(Gastrin)是其中重要的一种，胃泌素17(G-17)检测可以提示慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃癌等多种胃肠道疾病，因此，在2023年中国中西医结合学会检验医学专业委员会发布的《中国早期胃癌筛查检验技术专家共识》中提出PG、G-17、Hp检测可作为胃癌筛查目标人群的初筛项目。
胃泌素是一种胃肠肽激素，主要由胃窦和十二指肠的G细胞分泌，具有促进胃酸分泌等生理功能。胃泌素在体内以多种形式存在，包括大大胃泌素(BBG)、成份I(Comp-I)、大胃泌素(G-34)、小胃泌素(G-17)、微小胃泌素(G-14)、四肽胃泌素(G-4)等。正常生理状态下以分泌G-17、G-34为主，占人体生物活性胃泌素的95％以上，其中80％～90％是G-17，5％～10％是G-34。G-34和G-17都分别包括成熟形式和甘氨酸延伸型形式，成熟形式的G17是促进胃酸分泌的主要效应物，其功效至少比G-34强6倍。成熟型G-17的氨基端和羧基端残基都进行修饰，N-端谷氨酸环化形成焦谷氨酸(pGlu)，C端苯丙氨酸的游离羧基被肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)酰胺化，形成C端酰胺化苯丙氨酸(Phe-NH2)。因此，无论从数量上，还是从功效上来看，成熟型G-17都是胃窦中及进餐后血液中胃泌素的主要形式，是筛查萎缩性胃炎和胃癌的重要标志物。
成熟型G-17可通过自分泌、旁分泌或内分泌作用方式发挥“生长因子”样作用促进肿瘤发生发展。胃泌素在促肿瘤作用中涉及的信号通路纷繁复杂，且各条通路之间又存在着广泛的交叉与联系，阻断单个信号转导途径难以起到很好疗效，因此抗胃泌素治疗已成为相关肿瘤的主要治疗策略，具体方法包括分泌抑制、受体拮抗和抗胃泌素抗体法。被动型抗胃泌素抗体法就是通过注射抗胃泌素抗体，中和过量表达的胃泌素，从而起到抑制肿瘤的作用。
在多种形式的胃泌素中，G-34、G-17和G-14分子具有相同的羧基端氨基酸序列，此外，胆囊收缩素(CCK)的羧基端也有5个氨基酸与胃泌素相同，抗G-17羧基端的抗体同时也可以识别G-34、G-14和CCK的羧基端表位序列，因此使用单克隆抗体检测成熟型G-17时常常会与G-34、G-14和CCK出现交叉免疫反应。为了弥补以上不足，本发明针对成熟型G-17制备了具有高亲和力的抗氨基端单克隆抗体，通过使用本发明的抗氨基端单克隆抗体以及抗羧基端的其他单克隆抗体对能够通过双抗体夹心方式特异性检测成熟型G-17。
发明内容
为此，本发明的目的在于提供利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体，以及抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体，并且经过实验获得的两个单克隆抗体均能够识别成熟型G-17，并具有很好亲和力，同时使用抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体并配合使用其他抗成熟型G-17羧基端的单克隆抗体作为抗体对用于通过双抗体夹心方式特异性检测成熟型G-17。
本发明涉及抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，轻链CDR2的氨基酸序列为LVS或与序列LVS相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQID NO.3所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQID NO.7所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列。
进一步地，本发明还涉及一种抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示序列。
进一步地，本发明还涉及一种抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体，这些抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区，因此能够识别和结合成熟型G-17氨基端表位。
本发明还涉及包含编码上述抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，以及包含上述核酸分子的表达载体，所述表达载体能够表达上述的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体，其可以产生上述抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及分泌上述抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其为小鼠杂交瘤细胞株1A8623，保藏号为CGMCC No.45708。
本发明还涉及上述抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段在检测成熟型G-17中的应用以及在制备检测成熟型G-17的产品中的应用。进一步地，所述检测为酶联免疫吸附测定、化学发光、荧光免疫层析、胶体金免疫层析、免疫组化检测。
本发明还涉及上述抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗G-17高表达的肿瘤的药物中的应用。
本发明还涉及一种检测成熟型G-17的试剂盒，所述试剂盒包含上述抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于捕获成熟型G-17。进一步地，上述试剂盒还包含抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于检测成熟型G-17。试剂盒可以是基于但不限于上述酶联免疫吸附测定、化学发光、荧光免疫层析、胶体金免疫层析、免疫组化检测的试剂盒。对于上述特定类型的试剂盒而言，试剂盒中除了抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段、或者抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段和抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段之外，试剂盒的其他成分是本领域众所周知的。
再另一方面，本发明涉及抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示序列或与SEQ ID NO.9所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，轻链CDR2的氨基酸序列为LVS或与序列LVS相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示序列或与SEQ ID NO.10所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示序列或与SEQ ID NO.12所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示序列或与SEQ ID NO.13所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ IDNO.14所示序列或与SEQ ID NO.14所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列。
本发明的还涉及一种抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示序列，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示序列。
本发明还涉及一种抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体。这些抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区，因此能够识别和结合成熟型G-17羧基端表位。
本发明还涉及包含编码上述抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，以及包含上述核酸分子的表达载体，所述表达载体能够表达上述的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体，其可以产生上述抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及分泌上述抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其为小鼠杂交瘤细胞株5G11412，保藏号为CGMCC No.45709。
本发明还涉及上述一种抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段在检测成熟型G-17中的应用以及在制备检测成熟型G-17的产品中的应用。进一步地，所述检测为酶联免疫吸附测定、化学发光、荧光免疫层析、胶体金免疫层析、免疫组化检测。
本发明还涉及上述抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗G-17高表达的肿瘤的药物中的应用。
生物材料保藏说明
本发明的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体杂交瘤细胞株命名为小鼠杂交瘤细胞株1A8623，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.45708，保藏日期为2023年8月31日。本发明的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体杂交瘤细胞株命名为小鼠杂交瘤细胞株5G11412，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.45709，保藏日期为2023年8月31日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
附图说明
图1是显示小鼠杂交瘤细胞株1A8623分泌的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体亚类鉴定结果图，经鉴定其为小鼠IgG1亚型，抗体轻链为Igκ亚型。
图2是显示小鼠杂交瘤细胞株5G11412分泌的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体亚类鉴定结果图，经鉴定其为小鼠IgG1亚型，抗体轻链为Igκ亚型。
具体实施方式
本发明的一个目的在于提供利用融合的杂交瘤细胞株制备的一对抗成熟型G-17的单克隆抗体，包括抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体和抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体。其中制备的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体可以识别成熟型G-17，制备过程为，以成熟型G-17全长序列(pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2)的合成肽偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)后作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体，以成熟型G-17氨基末端7个氨基酸(pEGPWLEE)的合成肽偶联牛血清白蛋白(BSA)后作为抗原筛选抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体杂交瘤细胞株，筛选后获得一株表达高亲和力高特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，命名为1A8623。2023年8月31日将该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45708，保藏日期为2023年8月31日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。还制备了抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体，该株抗体同样可以识别成熟型G-17，制备过程为，以成熟型G-17全长序列(pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2)的合成肽偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)后作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体，以成熟型G-17羧基末端9个氨基酸(EEAYGWMDF-NH2)的合成肽偶联牛血清白蛋白(BSA)后作为抗原筛选抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体杂交瘤细胞株。筛选后获得一株表达高亲和力高特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，命名为5G11412。2023年8月31日将该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.45709，保藏日期为2023年8月31日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
本发明人对小鼠杂交瘤细胞株1A8623分泌的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体进行了测序，单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为109个氨基酸，其序列如下：DIVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSISTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKS(SEQ ID NO.1)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为KSISTSGYSY(SEQ ID NO.2)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列为119个氨基酸，其序列如下：EVKLVESGGGSVKPGGSLKLSCTASGFTFNNYAMSWVRQIPDKRLQWIASINNGGDTFYPDNVKGRFTISRDYARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGNKHDGYSLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.4)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GFTFNNYA(SEQ ID NO.5)；CDR2位于51-57aa，氨基酸序列为INNGGDT(SEQ IDNO.6)；CDR3位于96-108aa，氨基酸序列为ARGNKHDGYSLDY(SEQ ID NO.7)。经测定，上述单克隆抗体对成熟型G-17具有高特异性和高亲和力，能够用于检测成熟型G-17，或者制备检测成熟型G-17的产品，或者用于制备治疗成熟型G-17高表达的肿瘤的药物。
本发明人还对小鼠杂交瘤细胞株5G11412分泌的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体进行了测序，单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为108个氨基酸，其序列如下：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASRSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK(SEQ ID NO.8)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为RSVSTSGYSY(SEQ ID NO.9)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.10)；经过测序发现该单克隆抗体轻链CDR2和CDR3序列与上述抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体轻链CDR2和CDR3的序列完全相同，推测为记忆B细胞产生功能抗体后存在广泛的轻链一致性所致。重链可变区氨基酸序列为120个氨基酸，其序列如下：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYT FTENTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTDFNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVRYDYRFY FGMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.11)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GYTFTENT(SEQ ID NO.12)；CDR2位于51-58aa，氨基酸序列为INPNNGGT(SEQ ID NO.13)；CDR3位于97-109aa，氨基酸序列为VRYDYRFYFGMDY(SEQID NO.14)。经测定，上述单克隆抗体对成熟型G-17具有高亲和力，能够用于检测成熟型G-17，或者制备检测成熟型G-17的产品，或者用于制备治疗成熟型G-17高表达的肿瘤的药物。
众所周知，抗体重链CDR区和轻链CDR区是识别和结合相应抗原的重要序列，并且氨基酸序列中1个保守氨基酸替换一般不会改变蛋白质的性质。因此，对轻链CDR1和/或轻链CDR2和/或轻链CDR3和/或重链CDR1和/或重链CDR2和/或重链CDR3进行1个保守氨基酸替换后所得到的单克隆抗体或其抗原结合片段仍能够识别和结合成熟型G-17。保守氨基酸替换是指蛋白质中某一氨基酸被另一结构上相似的氨基酸所替换，例如芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr之间替换，脂肪族性氨基酸Ala、Gly、Leu、Ile、Val之间替换，极性氨基酸Gln、Asn之间替换，碱性氨基酸Lys、Arg、His之间替换，酸性氨基酸Asp、Glu之间替换，以及羟基氨基酸Ser、Thr之间替换等。
还可以通过本领域现有技术，基于本发明的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体制备各种能够与成熟型G-17氨基端结合的各种抗体片段，即抗原结合片段，例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2；或者基于本发明的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体制备各种能够与成熟型G-17羧基端结合的各种抗体片段，即抗原结合片段，例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2。Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域，由一条完整的轻链与重链的可变区VH和恒定区CH1结构域(Fd段)组成，轻链与重链均存在一个恒定区与一个可变区，轻重链间存在二硫键链接。抗原结合片段可以如下制备，例如使用木瓜蛋白酶酶解作用后，抗体IgG被降解为两个Fab片段及一个Fc片段。在胃蛋白酶的作用下，抗体IgG被降解为一个F(ab')2片段和一个pFc'片段，F(ab')2片段进一步被还原形成两个Fab'片段。上述抗原结合片段能够用于检测检测成熟型G-17，或者用于制备检测成熟型G-17的产品，或者制备用于治疗成熟型G-17高表达的肿瘤的药物。
还可以通过本领域现有技术，基于本发明的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体制备能够与成熟型G-17氨基端结合的单链抗体(scFv)，或者基于本发明的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体制备能够与成熟型G-17氨基端结合的单链抗体。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过数个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体，其只有一条链，是一种人工合成的抗体。短肽linker的长度以及氨基酸组成是本领域众所周知的，并且通过简单的重复实验可以确定针对本发明的单克隆抗体的可以使用的短肽linker。单链抗体可以通过基因工程技术在例如大肠杆菌中表达。单链抗体分子量小、穿透力强并且抗原性弱等优点，上述单链抗体可以用于检测成熟型G-17，或者用于制备检测成熟型G-17的产品，或者用于制备用于治疗成熟型G-17高表达的肿瘤的药物。
可以通过本领域的现有技术，将本发明的单克隆抗体的轻链恒定区和重链恒定区替换成人抗体氨基酸序列，从而使本发明的鼠单克隆抗体进行人源化改造得到人源化抗体，以便用于对成熟型G-17高表达肿瘤患者进行抗体治疗，以减少鼠源抗体对人机体的免疫副反应。因此本发明的人源化单克隆抗体可以应用于检测成熟型G-17，或者用于制备检测成熟型G-17的产品，或者用于制备用于治疗成熟型G-17高表达的肿瘤的药物。
本领域技术人员能够基于上述的抗成熟型G-17的单克隆抗体可变区的氨基酸序列设计、合成编码其的核酸分子，也能够将合成的核酸分子插入到核酸载体中，构建得到表达载体，该载体能够表达出抗成熟型G-17的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员还能够将所合成的核酸分子或者构建的表达载体导入生物体如细胞、细菌、酵母等中得到重组体，并经由上述重组体表达生产本发明的抗体或其抗原结合片段，如此表达的抗体或其抗原结合片段能够结合和识别成熟型G-17，因此上述的核酸分子、表达载体以及重组体处于本发明的权利要求书保护范围内。并且上述的技术均属于本领域众所周知的技术，本领域技术人员无需创造性劳动即可开展。
如上所述，本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别和结合成熟型G-17，因此可以用于制备用于检测成熟型G-17的试剂盒，所述试剂盒可以是任何利用了本发明抗体或其抗原结合片段与成熟型G-17结合反应的试剂盒，例如但不限于酶联免疫吸附测定、化学发光、荧光免疫层析、胶体金免疫层析、免疫组化类型的试剂盒。优选地，使用本发明的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体，使用其他抗成熟型G-17的抗体作为检测抗体进行检测；更优选地，使用本发明的抗成熟型G-17氨基酸单克隆抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体，使用本发明的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体或其抗原结合片段作为检测抗体进行检测。
由于本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合成熟型G-17，因此所述抗体或其抗原结合片段或者人源化抗体可以用于制备治疗成熟型G-17高表达肿瘤患者的产品，例如药物。治疗可以是例如但不限于抗体被动免疫治疗和抗体主动免疫治疗。在抗体被动免疫中，外源注射入本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或人源化抗体，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或人源化抗体与肿瘤患者体内成熟型G-17相结合，从而消除或者降低成熟型G-17对细胞增殖的促进作用，获得治疗效果。在抗体主动免疫中，导入编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或人源化抗体的核酸序列，在体内持续分泌表达本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或人源化抗体，与肿瘤患者体内成熟型G-17相结合，从而消除或者降低成熟型G-17对细胞增殖的促进作用，获得治疗效果。
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例进行说明。
实施例1：免疫用和筛选用成熟型G-17多肽的制备
为了获得分别特异性识别成熟型G-17氨基端表位序列和特异性识别成熟型G-17羧基端表位序列的单克隆抗体，本发明采用以全长成熟型G-17多肽作为免疫原进行免疫制备抗体，分别采用成熟型G-17氨基端多肽作为筛选用抗原，筛选特异性识别成熟型G-17氨基端表位序列单克隆抗体，采用成熟型G-17羧基端多肽作为筛选用抗原筛选特异性识别成熟型G-17羧基端表位序列单克隆抗体。成熟型G-17全长多肽序列为pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO.15)，免疫用的成熟型G-17全长多肽使用KLH偶联以提高免疫活性，另外使用非偶联的成熟型G-17全长多肽用于双抗体夹心检测方法建立和配对抗体的筛选；成熟型G-17氨基端多肽序列为pEGPWLEE(SEQ ID NO.16)，成熟型G-17羧基端多肽序列为EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO.17)，将此两种多肽分别偶联BSA以提高包被效率。此外使用成熟型G-34多肽(pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2，SEQ ID NO.18)和G-14多肽(WLEEEEEAYGWMDF-NH2，SEQ ID NO.19)用于本发明所建立双抗体夹心检测方法的特异性的评价。上述多肽合成及KLH或BSA偶联委托上海德翅生物科技有限公司完成。
实施例2：抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体和抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体的制备与筛选
使用KLH偶联成熟型G-17全长多肽作为免疫原，采用8周龄BALB/c雌性小鼠，100μg/只抗原加等量弗氏完全佐剂，搅拌器彻底乳化后，背部皮下及腹腔注射免疫小鼠。间隔四周和八周后分别进行第二次和第三次免疫，60μg/只抗原加不完全弗氏佐剂，搅拌器彻底乳化后，背部皮下及腹腔注射免疫小鼠。第三次免疫7天后，小鼠尾静脉采血检测免疫血清效价，选择效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫(50μg/只)，3天后取脾细胞进行融合。复苏SP20骨髓瘤细胞，培养至其处于对数生长期。取免疫的BALB/c小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液。
取上述脾细胞与骨髓瘤细胞按照5：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，充分吸取上清，轻轻震荡离心管底部，振散细胞，在1分钟内加入1mL预热过的50％ PEG融合细胞，边加边轻轻摇匀，加完后静置90秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合(第一分钟加1mL，第二分钟加2mL，第三分钟加8mL)，37℃静置10min，1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃、5％ CO2的细胞培养箱中培养。培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底约50％时，采用间接ELISA法筛选阳性克隆。具体方法为：碳酸盐分别包被缓冲液稀释KLH偶联的成熟型G-17全长多肽、BSA偶联的成熟型G-17氨基端多肽pEGPWLEE或BSA偶联的成熟型G-17羧基端多肽EEAYGWMDF-NH2，浓度为2.0μg/ml，每孔包被100μL，4℃过夜。用洗液洗板2次。加入110μL/孔封闭液室温封闭6小时。用洗液洗板5次。每孔加入100μL样品稀释液后，分别加入10μL细胞培养上清，室温孵育30min，弃液。用1×洗液洗板，重复洗涤5次。将洗好的酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以去除多余的洗液。加入100μL/孔HRP标记的抗鼠IgG抗体，室温孵育20min。用洗液洗板5次。每孔加入TMB显色液A液和B液各50μL，室温避光孵育10分钟。加入2M H2SO4终止液50μL，终止反应。设定酶标仪检测波长450nm，测定每孔OD值，终止后10分钟内读值。共获得11株可以识别成熟型G-17全长多肽的阳性克隆，其中5株为特异性识别成熟型G-17氨基端表位序列的阳性克隆，分别为1G1362、1A8623、2E733、5C844和2D8171；6株为特异性识别成熟型G-17羧基端表位序列的阳性克隆，分别为5B613、5G11412、1D213、3F9112、4D2114和3B9765，OD450nm均大于等于3.0。检测结果如表1所示。
表1.阳性克隆株的筛选结果
实施例3：成熟型G-17检测配对抗体的筛选
(一)单克隆抗体制备与纯化
取实施例2中5株特异性识别成熟型G-17氨基端表位序列的阳性克隆细胞株和6株特异性识别成熟型G-17羧基端表位序列的阳性克隆细胞株，用含10％胎牛血清的1640培养基培养。BALB/c雄性小鼠每只腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集所培养细胞，用10mL生理盐水重悬细胞，每只小鼠腹腔注射0.5mL(细胞密度大约为1×107个/mL)。2周后收集腹水，以Thermo公司Melon Gel Monoclonal IgG Purification Kit试剂盒进行抗体纯化，纯化的抗体采用分光光度法测定浓度，分装后于-20℃保存。
(二)单克隆抗体标记辣根过氧化物酶
将上述6株特异性识别成熟型G-17羧基端表位序列的单克隆抗体，采用改良过碘酸钠法分别标记辣根过氧化物酶(HRP)，具体步骤如下：取5mg HRP溶于0.5mL去离子水，加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻轻搅拌30分钟，液体呈黄绿色；加入1mL 0.16mol/L乙二醇，室温下轻搅1小时，终止氧化反应；装入透析袋，用0.01mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)1000mL，4℃透析过夜，换液3次；在3mL醛化HRP溶液中加入含有5mg单克隆抗体的碳酸盐缓冲液1mL，室温避光轻搅下结合2～3小时；加入5mg NaHB4，4℃过夜；装入透析袋，用0.01mol/L PBS(pH7.2)，4℃透析24小时，换液3次；3000r/min离心30分钟除去沉淀物，上清中加入等量甘油，分装低温保存备用。
(三)配对抗体检测特异性的评价
由于G-34、G-17和G-14分子具有相同的羧基端氨基酸序列，而且胆囊收缩素(CCK)的羧基端也有5个氨基酸与胃泌素相同，抗成熟型G-17羧基端的抗体可能会与G-34、G-14和CCK的羧基端发生不同程度的交叉免疫反应。为了避免这种交叉反应，我们采用特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体作为捕获成熟型G-17的抗体，采用特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体作为检测抗体，建立双抗体夹心法进行特异性检测。
用碳酸盐包被缓冲液将特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次，每孔200μL；每孔加入100μL封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，每孔200μL；用稀释液将成熟型G-17全长多肽、成熟型G-34多肽pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2、G-14多肽WLEEEEEAYGWMDF-NH2或胆囊收缩素(CCK)抗原均稀释为100pg/mL，分别以每孔100μL加样；37℃孵育60min；用洗液洗板5次，每孔200μL；加入100μLHRP标记特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体，37℃孵育30min；用洗液洗板5次，每孔200μL；每孔加入TMB显色液A液和B液各50μL，室温避光孵育10分钟；每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，采用酶标仪波长450nm测定各孔的吸光值，终止后10分钟内读值。检测结果如表2所示。
表2.成熟型G-17检测配对抗体的筛选结果
结果显示，采用特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体作为捕获抗体，特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体作为检测抗体建立的双抗体夹心法可以特异性检测成熟型G-17，而对具有相同羧基端的成熟型G-34、G-17和CCK均没有交叉反应，其中以特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体1A8623作为捕获抗体，以5B613、5G11412或4D2114特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体作为检测抗体的抗体配对，以及以特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体2D8171作为捕获抗体，以特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体1D213作为检测抗体的抗体配对，检测浓度为100pg/mL成熟型G-17时OD值均大于3.0，选择以上四组抗体配对进行灵敏度评价筛选最优抗体配对。
(四)配对抗体检测灵敏度的评价
用碳酸盐包被缓冲液将特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体(作为捕获抗体)稀释成浓度为2.5μg/mL，每孔包被100μL，4℃过夜；用洗液洗板2次，每孔200μL；每孔加入100μL封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，每孔200μL；用稀释液将成熟型G-17全长多肽进行系列稀释，以每孔100μL加样；37℃孵育60min；用洗液洗板5次，每孔200μL；加入100μL HRP标记特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体，37℃孵育30min；用洗液洗板5次，每孔200μL；每孔加入TMB显色液A液和B液各50μL，室温避光孵育10分钟；每孔加入50μL 2MH2SO4终止反应，采用酶标仪波长450nm测定各孔的吸光值，终止后10分钟内读值。检测结果如表3所示。
表3.配对抗体灵敏度检测结果
结果显示，以特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体1A8623作为捕获抗体，以特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体5G11412作为检测抗体的抗体配对具有最高灵敏度，检测下限为1.0pg/mL，高于其余3组。
(五)双抗体夹心酶联免疫法定量测定人血清中成熟型G-17的含量
用碳酸盐包被缓冲液将1A8623单克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL，每孔包被100μL，4℃过夜；用洗液洗板2次，每孔200μL；每孔加入100μL封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，每孔200μL；G-17参考品S0-S4(0、5、10、20、40pmol/L)每孔分别加入100μL，待测样本先每孔加入50μL样品稀释液，再分别加入50μL样本；37℃孵育60min；用洗液洗板5次，每孔200μL；加入100μL HRP标记5G11412单克隆抗体，37℃孵育30min；用洗液洗板5次，每孔200μL；每孔加入TMB显色液A液和B液各50μL，室温避光孵育10分钟；每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，采用酶标仪波长450nm测定各孔的吸光值，终止后10分钟内读值。以参考品浓度的对数为X轴，以OD值的对数为Y轴做标准曲线，根据标准曲线计算样品中成熟型G-17的含量。OD值与浓度呈正相关。
共检测20例无胃病相关病史的正常体检者血清样本和20例有胃炎、胃溃疡等胃病患者血清样本，检测结果如表4所示。
表4.人血清中成熟型G-17含量的测定
临床上G-17的正常参考区间为1～7pmol/L，当G-17含量≤1pmol/L时，如幽门螺旋杆菌IgG抗体阳性则提示重度的胃窦黏膜萎缩风险，如幽门螺旋杆菌IgG抗体阴性则提示胃酸分泌增多；当G-17含量为7～15pmol/L时，提示非萎缩性胃炎；当G-17含量≥15pmol/L时，提示胃体黏膜萎缩或胃窦增生的风险。本发明双抗体夹心酶联免疫法定量测定人血清中G-17含量的结果显示，20例无胃病相关病史的正常体检者血清样本的G-17含量均在正常范围内，20例有胃炎、胃溃疡等胃病患者血清样本的G-17含量仅2例在正常范围内，2例G-17含量≤1pmol/L，10例G-17含量在7～15pmol/L之间，另外8例G-17含量≥15pmol/L，提示本发明单克隆抗体及双抗体夹心酶联免疫法可以用于临床样本中G-17含量的测定，辅助相关胃病的诊断。
实施例4：抗成熟型G-17单克隆抗体的制备及其亚型分析
取特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体杂交瘤细胞株1A8623和特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体杂交瘤细胞株5G11412，分别用含10％胎牛血清的1640培养基培养。每只BALB/c雄性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集所培养的细胞，用10mL生理盐水重悬细胞，每只小鼠腹腔注射0.5mL(细胞密度大约为1×107个/mL)。2周后，收集腹水。以Thermo公司Melon Gel Monoclonal IgG Purification Kit试剂盒进行抗体纯化，纯化的抗体分装后于-20℃保存。
采用安泰吉(北京)生物技术有限公司的小鼠抗体亚型快速检测卡鉴定小鼠抗体的重链和轻链亚型。首先用PBS将抗体稀释为1μg/mL，然后每孔加入100μl稀释好的抗体，静置5-10min后观察记录结果。结果如图1和2所示，特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体1A8623和特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体5G11412均为单克隆抗体，且均为小鼠IgG1亚型，抗体轻链为Igκ亚型。
实施例5：抗成熟型G-17单克隆抗体可变区序列测定
分别取特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体杂交瘤细胞株1A8623和特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体杂交瘤细胞株5G11412，Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，Thermo Fisher公司High Capacity cDNA Rever Transcription Kit试剂盒逆转录cDNA后，根据《重组抗体》(科学出版社，沈倍奋主编，2005年出版)中鼠单抗引物序列，设计并由北京擎科生物科技有限公司合成该抗体的重轻链引物，PCR扩增(扩增程序为：95℃预热1min，进行30个循环(95℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)，最后72℃延伸5min)，连接pMD18-T载体，大肠杆菌JM109表达，挑选阳性克隆进行测序。将测定序列在BLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对分析小鼠来源单克隆抗体CDR区序列。
经序列分析后发现，小鼠杂交瘤细胞株1A8623分泌的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为109个氨基酸，其序列如下：DIVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSISTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKS(SEQ ID NO.1)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为KSISTSGYSY(SEQ ID NO.2)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.3)。小鼠杂交瘤细胞株1A8623分泌的抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为119个氨基酸，其序列如下：EVKLVESGGGSVKPGGSLKLSCTASGFTFNNYAMSWVRQIPDKRLQWIASINNGGDTFYPDNVKGRFTISRDYARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGNKHDGYSLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.4)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GFTFNNYA(SEQ ID NO.5)；CDR2位于51-57aa，氨基酸序列为INNGGDT(SEQ ID NO.6)；CDR3位于96-108aa，氨基酸序列为ARGNKHDGYSLDY(SEQ ID NO.7)。
小鼠杂交瘤细胞株5G11412分泌的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为108个氨基酸，其序列如下：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASRSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK(SEQ IDNO.8)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为RSVSTSGYSY(SEQ ID NO.9)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.10)。小鼠杂交瘤细胞株5G11412分泌的抗成熟型G-17羧基端单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为120个氨基酸，其序列如下：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTENTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTDFNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVRYDYRFYFGMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.11)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GYTFTENT(SEQ ID NO.12)；CDR2位于51-58aa，氨基酸序列为INPNNGGT(SEQ ID NO.13)；CDR3位于97-109aa，氨基酸序列为VRYDYRFYFGMDY(SEQ ID NO.14)。
实施例6：抗成熟型G-17单克隆抗体对人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖的抑制作用
通过MTT法检测抗成熟型G-17单克隆抗体对人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖的抑制作用。选择对数生长期的SGC-7901细胞，0.25％胰蛋白酶消化，10％小牛血清的RPMll640培养基制备单细胞悬液，以每孔1×104个细胞/mL接种于96孔细胞培养板，每孔200μL，置37℃、5％CO2条件下培养24小时。用无血清RPMI1640培养基继续培养24h后，分组进行以下处理：①对照组：无血清培养基；②G-17实验组：含50pmol/L成熟型G-17的无血清培养基；③1A8623单抗实验组：含50pmol/L成熟型G-17+0.5mg/mL 1A8623单抗的无血清培养基；④5G11412单抗实验组：含50pmol/L成熟型G-17+0.5mg/mL 5G11412单抗的无血清培养基。以上每个实验组设置6个复孔，每孔加入200μL相应培养基。继续培养72小时，每孔加入5mg/mL的MTT 10μL，4小时后加入DMSO每孔100μL，混匀后于570nm波长测定各孔吸光值。结果如表5显示，成熟型G-17可以显著促进人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖，而本发明的特异性识别成熟型G-17氨基端单克隆抗体1A8623和特异性识别成熟型G-17羧基端单克隆抗体5G11412均可以显著抑制成熟型G-17对胃癌细胞的促增殖效应。
表5.抗成熟型G-17单克隆抗体细胞增殖抑制作用
分组 OD570nm
对照组 0.438士0.047
G-17实验组 0.623士0.065
1A8623单抗实验组 0.469士0.058*#
5G11412单抗实验组 0.427士0.097*#
*表示与对照组比较无显著性差异，p>0.05；#与G-17实验组比较有显著性差异，p<0.05。

Claims (9)

1.一种抗成熟型G-17氨基端单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；
所述轻链CDR2的氨基酸序列为LVS；
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列；
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列；
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列；
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列。
2. 根据权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体。
4.核酸分子，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1或2所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。
5.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述的核酸分子。
6.重组体，其特征在于，所述重组体包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体。
7. 一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株1A8623，保藏号为CGMCC No. 45708。
8.权利要求1或2所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测成熟型G-17的产品的应用。
9.一种检测成熟型G-17的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
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