CN113150143A - 一种用于检测血清中g17含量的配对抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测血清中G17含量的配对抗体及其应用，包括与G17的N端表位如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_N和与G17的C端表位如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_C，并采用化学发光检测方法特异性识别AntiG17_N、AntiG17_C，检测G17的含量。本发明创造性的将G17抗原进行分成N端和C端两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C，用于检测血清中胃泌素17的含量，进而判断患者胃黏膜的损伤情况，对临床上指导用药的安全性具有重要意义。

Description

一种用于检测血清中G17含量的配对抗体及其应用
技术领域
本发明涉及胃部疾病诊断领域，具体涉及一种用于检测血清中G17含量的配对抗体及其应用。
背景技术
胃泌素是一种主要由胃窦和十二指肠的G细胞分泌的胃肠激素，对调节消化道功能和维持其结构完整有重要作用。人体中,95％以上有生物活性的胃泌素是α-酰胺化胃泌素，主要含两种异构体G-17和G-34，其中80％—90％是G-17。G-17仅由胃窦部G细胞分泌，因此G-17是反映胃黏膜损伤情况的重要指标。
据文献《胃蛋白酶原、胃泌素-17及Hp-IgG抗体对胃癌、萎缩性胃炎患者胃粘膜状况的血清学评价》中得知研究应用血清PGⅠ、G-17和PGⅠ/PGⅡ比值及Hp感染状况,对早期胃癌、萎缩性胃炎患者胃粘膜状况的评价,探讨胃癌高危人群的非侵袭性血清学筛查方法。
筛查方法：内镜和组织病理学确诊胃癌患者65例,内镜确诊萎缩性胃炎患者70例、正常对照组50例。使用ELISA法检测各组血清PGⅠ、PGⅡ、G-17及Hp-IgG。结果如下：胃体萎缩时,胃癌组血清PGⅠ水平及PGⅠ/PGⅡ比值降低,与对照组比较均具显著差异(P＜0.01),与胃炎组比较亦均有显著差异(P＜0.05)。多灶性萎缩性时,胃癌组血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ比值显著降低,与正常对照组比较具非常显著差异(P＜0.01和P＜0.001),与胃炎组比较亦具有显著差异(P＜0.05和P＜0.01),血清G-17水平显著降低,与正常对照组和胃炎组比较具有统计意义(P＜0.001和P＜0.05),且多灶性萎缩病变在胃癌中的比例明显多于胃炎组。而Hp感染不影响胃癌患者血清PGⅠ和G17的水平。结论为：低水平血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ比值和G-17提示患者可能有胃癌高风险的多灶性萎缩病变,血清PGs和G-17的检测可作为胃粘膜萎缩的非侵袭性检查方法。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种用于检测血清中G17含量的配对抗体及其应用。
根据本申请实施例提供的技术方案，一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，包括与G17的N端表位如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_N和与G17的C端表位如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_C，
所述AntiG17_N包括如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ IDNO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiG17_C包括如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。
本发明中，所述AntiG17_N包含轻链LCDR1即SEQ ID NO:4所示、LCDR2即SEQ IDNO:5所示、LCDR3即SEQ ID NO:6所示的三个氨基酸序列，重链HCDR1即SEQ ID NO:8所示、HCDR2即SEQ ID NO:9所示、HCDR3即SEQ ID NO:10所示的三个氨基酸序列，所述AntiG17_C包含轻链LCDR1即SEQ ID NO:14所示、LCDR2即SEQ ID NO:15所示、LCDR3即SEQ ID NO:16所示的三个氨基酸序列，重链HCDR1即SEQ ID NO:18所示、HCDR2即SEQ ID NO:19所示、HCDR3即SEQ ID NO:20所示的三个氨基酸序列。
本发明中，所述配对抗体可以变换成G17结合片段Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di-scFv。
本发明中，所述AntiG17_N、所述AntiG17_C为IgG型单克隆抗体，所述AntiG17_N作为捕获抗体，所述AntiG17_C作为检测抗体，所述AntiG17_C的检测标记是酶、荧光基团、放射性同位素。
本发明中，所述配对抗体可与检测标记蛋白重组表达，所述检测标记蛋白为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
本发明中，所述配对抗体的含量通过免疫学检测方法检测，所述免疫学检测方法包括酶联免疫(ELISA)、化学发光检测、蛋白质印迹检测和免疫组化(IHC)、免疫层析检测。
一种化学发光检测试剂盒，包含与G17的N端表位结合的AntiG17_N和与G17的C端表位结合的AntiG17_C，以化学发光检测方法特异性识别AntiG17_C，用于检测G17的含量。
综上所述，本申请的有益效果：本发明创造性的将G17抗原进行分成N端如SEQ IDNO:2所示和C端如SEQ ID NO:3所示两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C，用于检测血清中胃泌素17的含量，进而判断患者胃黏膜的损伤情况，对临床上指导用药的安全性具有重要意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1本发明配对抗体反应原理示意图；
图2为本发明pcDNA3.1-NL-LFc载体构建；
图3为本发明pcDNA3.1-NH-HFc载体构建；
图4为本发明重组AntiG17_N蛋白纯化图谱；
图5为本发明pcDNA3.1-CL-LFc载体构建；
图6为本发明pcDNA3.1-CH-HFc载体构建；
图7为本发明重组AntiG17_C蛋白纯化图谱；
图8为本发明试剂盒性能验证操作示意图；
图9是本发明性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第一次测定曲线；
图10是本发明性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第二次测定曲线；
图11是本发明性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第三次测定曲线；
图12为本发明试剂盒与市场试剂盒检测浓度结果相关性示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，包括与G17的N端表位如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_N和与G17的C端表位如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_C，所述AntiG17_N包括如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiG17_C包括如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。所述AntiG17_N包含轻链LCDR1即SEQ ID NO:4所示、LCDR2即SEQ ID NO:5所示、LCDR3即SEQ ID NO:6所示的三个氨基酸序列，重链HCDR1即SEQ ID NO:8所示、HCDR2即SEQ IDNO:9所示、HCDR3即SEQ ID NO:10所示的三个氨基酸序列，所述AntiG17_C包含轻链LCDR1即SEQ ID NO:14所示、LCDR2即SEQ ID NO:15所示、LCDR3即SEQ ID NO:16所示的三个氨基酸序列，重链HCDR1即SEQ ID NO:18所示、HCDR2即SEQ ID NO:19所示、HCDR3即SEQ ID NO:20所示的三个氨基酸序列。所述配对抗体可以变换成G17结合片段Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di-scFv。所述AntiG17_N、所述AntiG17_C为IgG型单克隆抗体，所述AntiG17_N作为捕获抗体，所述AntiG17_C作为检测抗体，所述AntiG17_C的检测标记是酶、荧光基团、放射性同位素。所述配对抗体可与检测标记蛋白重组表达，所述检测标记蛋白为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。所述配对抗体的含量通过免疫学检测方法检测，所述免疫学检测方法包括酶联免疫(ELISA)、化学发光检测、蛋白质印迹检测和免疫组化(IHC)、免疫层析检测。
一种化学发光检测试剂盒，包含与G17的N端表位结合的AntiG17_N和与G17的C端表位结合的AntiG17_C，以化学发光检测方法特异性识别AntiG17_C，用于检测G17的含量。
实施例1
单克隆抗体AntiG17_N和单克隆抗体AntiG17_C的制备
a)分别合成G17的N端表位(SEQ ID NO:2)和G17的C端表位(SEQ ID NO:3)，分别偶联KLH蛋白后免疫小鼠，小鼠为8周龄的雌性Balb/c小鼠。
b)免疫方法为：100ug的抗原免疫小鼠4次，每次间隔4周。
c)细胞融合：将免疫后的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞按1:1的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1000rpm/min离心10分钟，弃去上清，用吸管吸净残留液体(为了避免影响PEG的浓度)，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
d)用吸管在60s内加预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，边加边轻轻搅拌。
e)用10ml吸管在90s内加20-30ml预热的不完全培养基(终止PEG作用)；20-27℃静置10分钟。
f)1000r/min离心5分钟，弃上清。
g)加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
h)分装96孔细胞培养板(孔板内有饲养细胞层)，每孔0.1-0.15ml(或分装24孔板，每孔1.0-1.5ml)，然后将培养板置37℃，6％CO2培养箱内培养。
i)5天后用HAT培养基换出1/2培养基
j)7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；
k)经常观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清通过ELISA检测其活性。
l)通过多轮筛选和有限稀释法，最终获得纯的有效价的克隆。
实施例2
单克隆抗体AntiG17_N和单克隆抗体AntiG17_C的筛选
对实施例1获得克隆抗体分别进行N端抗原(SEQ ID NO:2)和C端抗原(SEQ ID NO:3)筛选。最终分别获得活性和配对最佳的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C，其中AntiG17_N能特异性的结合G17的N端抗原(SEQ ID NO:2)，而不结合G17的C端抗原(SEQ ID NO:3)。AntiG17_C能特异性的结合G17的C端抗原(SEQ ID NO:3)，而不结合G17的N端抗原(SEQ IDNO:2)。
G17全抗原(SEQ ID NO:1)包被，化学发光法验证。
G17的N端抗原(SEQ ID NO:2)包被，化学发光法检测。
G17的C端抗原(SEQ ID NO:3)包被，化学发光法检测。
将G17全抗原(SEQ ID NO:1)、G17的N端抗原(SEQ ID NO:2)、G17的C端抗原(SEQID NO:3)分别进行包被，加入不同体积的AntiG17_N和AntiG17_C，再加入二抗进行反应，最后加入底物液，检测其发光值，结果如下：
表1
全抗原(SEQ ID NO:1) N端抗原(SEQ ID NO:2) C端抗原(SEQ ID NO:3)
空白组 7284 7416 7441
AntiG17_N 2ul 127823 127347 7284
AntiG17_N 10ul 571879 519624 7684
AntiG17_N 50ul 2704866 2602532 7508
AntiG17_C 10ul 127896 7367 120010
AntiG17_C 20ul 586989 7430 525512
AntiG17_C 50ul 2739263 7369 2580593
由表1可以确认本发明抗体对中的AntiG17_N能够识别N端抗原不能识别C端抗原。本发明抗体对中的AntiG17_C能够识别C端抗原不能识别N端抗原。
实施例3
重组表达G17的N端抗体AntiG17_N和G17的C端抗体AntiG17_C
a、重组表达G17的N端抗体AntiG17_N
对实施例2获得抗体对中的AntiG17_N的杂交瘤进行测序后，获得抗体AntiG17_N的轻链可变区序列(SEQ ID NO:7)重链可变区(SEQ ID NO:11)。对其序列进行优化后，将轻链可变区克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，获得pcDNA3.1-NL-LFc(如图2所示)。将重链可变区克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，获得pcDNA3.1-NH-HFc(如图3所示)。pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区。其中NL(轻链可变区)的核酸序列为SEQ ID NO:12，NH(重链可变区)的核酸序列为SEQ ID NO:13。将pcDNA3.1-NL-LFc和pcDNA3.1-NH-HFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗G17的N端抗体AntiG17_N(如图4所示)。
注：
图2中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1-NL-LFc Plasmid；
Lane 2:NL
图3中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1-NH-HFc Plasmid；
Lane 2:NH
图4中Lane M：Marker；
Lane 1：AntiG17_N
b、重组表达G17的C端抗体AntiG17_C
对实施例2获得抗体对中的AntiG17_C的杂交瘤进行测序后，获得抗体AntiG17_C的轻链可变区序列(SEQ ID NO:17)重链可变区(SEQ ID NO:21)。对其序列进行优化后，将轻链可变区克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，获得pcDNA3.1-CL-LFc(如图5所示)。将重链可变区克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，获得pcDNA3.1-CH-HFc(如图6所示)。pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区。其中CL(轻链可变区)的核酸序列为SEQ ID NO:22，NH(重链可变区)的核酸序列为SEQ ID NO:23。将pcDNA3.1-CL-LFc和pcDNA3.1-CH-HFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗G17的C端抗体AntiG17_C(如图7所示)。
注：
图5中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1-CL-LFc Plasmid；
Lane 2:CL
图6中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1-CH-HFc Plasmid；
Lane 2:CH
图7中Lane M：Marker；
Lane 1：AntiG17_C
实施例4
配对抗体参与化学发光试剂盒制备和验证
按照现有化学发光法诊断试剂生产工艺，将本发明中AntiG17_C作为捕获抗体进行包被配置成G-17包被板，将本发明中AntiG17_N作为结合抗体进行标记配置成G-17酶结合物，将G-17抗原配置成系列校准品(0pmol/L、1pmol/L、4pmol/L、16pmol/L、64pmol/L、256pmol/L)形成一套完整试剂盒并对其进行一系列验证。
参照YY/T1175-2010肿瘤标志物定量测定试剂(盒)化学发光法行业标准以及参考市场上现有G-17试剂盒厂家的技术要求，制定对本发明抗体制成试剂盒的性能验证指标。
1.性能指标
1.1最低检测限
应不高于0.6pmol/L。
1.2剂量-反应曲线的线性
在线性区间1pmol/L～256pmol/L内，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900。
1.3准确度
以试剂盒检测回收率，应在0.85-1.15范围内。
1.4精密度
精密度(CV)应不大于10％。
1.5特异性
5.0pmol/L的人胆囊收缩素(CCK)，检测表观值应不大于0.5pmol/L。
2.检验方法
2.1最低检测限
平行测定20孔零校准品(0pg/ml)的相对发光强度，计算发光值平均值和标准偏差SD，用剂量-反应曲线计算发光值为均值+2×SD时对应的浓度值即为最低检出限，结果应符合1.1要求。
2.2剂量-反应曲线的线性
复孔测定试剂盒的参考品(S0～S5，浓度依次为0pmol/L、1pmol/L、4pmol/L、16pmol/L、64pmol/L、256pmol/L)，采用双对数法拟合试剂盒的剂量-反应曲线，线性相关系数r应符合1.2要求。
2.3准确度
将G-17抗原配制成标准溶液(180pmol/L)按体积比为1：9加入到已知浓度的低值样本(3.82-5.39pmol/L)中，在试剂盒上进行检测，根据公式(1)计算回收率R，结果应符合1.3的规定。
Figure BDA0003058800120000101
式中：R——回收率；
V——加入标准溶液的体积；
V0——低值样本的体积；
C——低值样本加入标准溶液后的检测浓度；
C0——低值样本的检测浓度；
Cs——标准溶液的浓度。
2.4精密度
平行测定质控品Q1和质控品Q2各10孔，分别按照公式计算CV，结果应符合1.4的规定。
Figure BDA0003058800120000102
式中：
Figure BDA0003058800120000103
—质控品测定浓度值的平均值
SD—质控品测定浓度值的标准差
2.5特异性
在正常人血清中加入人胆囊收缩素(CCK)，配制成含5.0pmol/L的CCK样本，进行检测，表观值应符合1.5的要求。
3.实验配置
3.1校准品配置
将G-17抗原用抗原稀释液(0.5molPBS+1％BSA)稀释六个梯度(0pmol/L、1pmol/L、4pmol/L、16pmol/L、64pmol/L、256pmol/L)。
3.2回收率标准溶液配置
将G-17抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释到180pmol/L，作为标准溶液，选取3.82-5.39pmol/L正常人血清作为低值样本。
3.3质控品配置
将G-17抗原用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释成Q1(3.33±1.05pmol/L)和Q2(184.8±44.65pmol/L)。
3.4特异性样本配置
将人胆囊收缩素(CCK)用稀释液(0.5mol PBS+1％BSA配制成含5.0pmol/L的CCK样本。
4、加样操作
(1)分别取上述配置的3.1-3.4G-17校准品、回收率标本，质控品及特异性样本各100μl加入相应包被板板孔内，振荡器振荡30秒钟，使其充分混合均匀
(2)盖上封板膜，置37℃温育30分钟
(3)取出，用应用洗涤液(0.5mol PBS+0.025％T-20)洗板3次
(4)取100μL G-17酶结合物加入各孔，振荡器振荡30秒钟
(5)盖上封板膜，置37℃温育30分钟
(6)取出，用应用洗涤液(0.5mol PBS+0.025％T-20)洗板3次
(7)每孔加入底物液100ul(购买自北京利德曼生化股份有限公司)
(8)用中生百克BHP9504化学发光仪检测化学发光强度(RLU)
5、性能指标验证结果
5.1最低检测限
表2
Figure BDA0003058800120000121
由表2可知，最低检测限为0.272pmol/l,不高于0.6pmol/l，符合指标。
5.2剂量-反应曲线的线性
表3
第一次测 第二次测 第三次测
线性相关系数R 0.9999 0.9994 0.9996
由表3、图9、图10和图11可知，连续三次测定0-256pmol/L浓度范围G-17抗原曲线，线性相关系数r均大于0.9900，符合指标。
5.3准确度
表4
CS(pmol/L) C0(pmol/L) 样本C发光值 C(pmol/L) 回收率(％)
130 3.5 616883 16.444 102.26
由表4可知，以试剂盒检测回收率，在0.85-1.15范围内，符合指标。
5.4精密度
表5
Figure BDA0003058800120000131
由表5可知，连续三次平行测定QC1 QC2，结果均不大于10％要求，符合指标。
5.5特异性
表6
项目 发光值 浓度值(pg/mL)
人胆囊收缩素(5.0pmol/L) 8245 0.293
由表6可知，人胆囊收缩素(5.0pmol/L)检测值为0.293pmol/l，不大于0.5pmol/l，符合要求。
由上可知，本发明制成G-17试剂盒的剂量-反应曲线，准确性，均一性等性能指标均符合技术要求。
实施例5
本发明抗体试剂盒与市场现有试剂盒的对比试验
随机选取40份人血清标本，用本发明抗体制成试剂盒及市场现有G-17试剂盒(山东一达)对以上血清进行检测，对比相关性
40份人血清标本对比结果如下：
表7
Figure BDA0003058800120000132
Figure BDA0003058800120000141
如表7、图9可知，本发明检测浓度结果与市场已有试剂盒检测浓度结果相关性R2为0.9962。
即临床样本检测结果基于本发明制成试剂与市场现有化学发光法检测试剂(山东一达)检测结果相符。
实施例6
G17的序列见SEQ ID NO:1。因为G17的抗原较小，因此开发抗体对存在较大的难度。同时，对开发出来的抗体对具有临床应用价值，则更有难度。本发明创造性的将G17抗原进行分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列。并用这两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C。
本发明提供了G17抗体对的核心序列(抗体对重轻链的可变区)。其中AntiG17_N的轻链序列中的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和重链序列中的SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10是G17抗原N端表位(SEQ ID NO:2)结合的关键位置。AntiG17_C的轻链序列中的SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和重链序列中的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20是G17抗原C端表位(SEQ ID NO:3)结合的关键位置。
本发明的抗体对中的抗体可以是Fab片段；可以是F(ab’)2片段；可以是Fab’片段；可以是scFv片段；可以是di-scFv片段。
本发明的抗体对中的抗体是单克隆抗体。
本发明的抗体对中的抗体是IgG型抗体。
本发明的抗体对中的抗体AntiG17_N轻链包含所有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。重链包含所有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。
本发明的抗体对中的抗体AntiG17_C轻链包含所有SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16。重链包含所有SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20。
本发明的抗体对中的抗体AntiG17_N包含根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区和包含根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区。
本发明的抗体对中的抗体AntiG17_C包含根据SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区和包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区。
本发明的抗体对是鼠抗体或鼠源的抗体。
本发明抗体对中的抗体AntiG17_N是捕获抗体，AntiG17_C是标记抗体，可进一步与可检测标记偶联。
本发明的抗体对中的抗体AntiG17_C的可检测标志半酶或酶或荧光基团或者放射性同位素。
本发明的抗体用于检测样品中G17(SEQ ID NO:1)的存在，样品是生物学样品，优选为血清。
本发明的抗体对，通过夹心法免疫学方法检测G17(SEQ ID NO:1)是否存在。本实施类中选择化学发光方法学检测。因此，可以精确的检测生物样本中G17的含量。
本发明的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C，通过化学放光方法检测G17的存在和表达。
本发明的体外方法中使用的样品源自患有以下或具有以下风险的对象：胃炎，胃溃疡和胃癌。
本发明涉及如上公开的本发明的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C在检测样品中G17表达的用途。
本发明提供了抗体对AntiG17_N和AntiG17_C可变区的氨基酸序列。
本发明提供了表达AntiG17的表达载体pCDNA3.1-AntiG17_NL和pCDNA3.1-AntiG17_NH，其包含编码本发明的抗体AntiG17_N的重链和轻链多核苷酸。
本发明提供了表达AntiG17的表达载体pCDNA3.1-AntiG17_CL和pCDNA3.1-AntiG17_CH，其包含编码本发明的抗体AntiG17_C的重链和轻链多核苷酸。
本发明提供的表达载体，其用于产生本发明的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C。
本发明提供至少一种宿主细胞，其包含至少2种根据本发明的表达载体。
本发明提供至少一种根据本发明的宿主细胞，其用于制备本发明的抗体对。
本发明提供诊断胃部疾病的方法，其包括以下步骤：使用如上公开的本发明的抗体对AntiG17_N和AntiG17_C，采用化学发光检测方法来检测患者样品中G17的表达情况。如果G17含量不在正常值范围内则提示有胃炎、胃癌风险。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理等方案的说明。同时，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
序列表
<110> 廊坊天光生物技术有限公司
<120> 一种用于检测血清中G17含量的配对抗体及其应用
<150> 202010389676X
<151> 2020-05-11
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp
1 5 10 15
Phe
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Gly Pro Trp Leu Glu Glu
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
Tyr Gly Trp Met Asp Phe
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Asp Thr Ser
1
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Arg His Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Glu Met Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg His Pro Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
Ile Arg Leu Lys Ala Asn Asn His Ala Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
Glu Ile Thr Thr Leu Tyr
1 5
<210> 11
<211> 123
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ala Asn Asn His Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Glu Ile Thr Thr Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
gagatggttc ttactcagtc tcctgccatc ctgtctgcat ccccaggaga gaaggtgacc 60
atgacttgcc gcgcaagctc atcagtcagc tatatgcact ggtatcagca aagacccggc 120
agtagcccaa agccttggat ttacgatact tcaaacctgg ctagcggagt gcctgtaagg 180
ttctccggga gcggttctgg gacaagttat agcctgacca tttcaagggt tgaagtggag 240
gacgccgcca cttactactg tcagcaatgg agccgccacc ctccaattac cttcggctca 300
ggcaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 13
<211> 369
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 13
gaggttaagt tggaagaaag tggtggggac ttggtccagc caggtcagtc catgaaactc 60
agctgtgttg ctagcggatt cacatttagt aatgcctgga tgaattgggt acgtcaaagc 120
cctgagaaag ggttggagtg ggtggccgag ataagactga aggccaataa tcacgccact 180
cattacgcag agagtgtgaa gggccgattc acaatttccc gagacgacag caaatcttca 240
gtctatctgc agatgaacaa cctgcgagcc gaggacacag gtatctatta ctgcacacgc 300
gagatcacta cactgtacta ctacgctatg gattactggg gccaaggaac atccgtaacc 360
gtaagcagc 369
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 15
Arg Met Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 16
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Ile Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 18
Gly Phe Thr Leu Ser Arg Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 19
Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 20
Ser Arg Tyr Gly Tyr Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 21
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Tyr Gly Tyr Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 22
<211> 336
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 22
gatattgtca tgacacaggc tgcccctagt gtcccagtga ctccaggaga gagcgtctcc 60
ataagttgca gatctaacaa gagtctcctc cactccaatg gtaataccta catttactgg 120
tttctgcaga gaccaggcca atctcctcaa ctcctcctgt accggatgag caacctggcc 180
tccggagtgc ctgatcgatt cagtggaagc gggtccggca cagcctttac cctgcgaatc 240
tccagggtgg aggcagagga tgtgggcgtc tactattgta tgcagcacct cgaatatcct 300
ctcacatttg gtgcaggcac caagctcgag ctcaag 336
<210> 23
<211> 360
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 23
gaggtgatgc tcgtagagtc aggaggagga cttgtcaaac ctggtggtag tctgaagctt 60
agctgcgcag catccggctt tactctcagt aggtatacta tgagttgggt ccgtcagacc 120
cctgagaagc ggctcgagtg ggtcgctatc ataacatccg ggggcggagg aaacactttt 180
taccccgaca gcgtgaaggg tcggtttacc atcagtcgtg ataatgccaa aaacaatctt 240
tatttgcaga tgagctctct tcgtagcgag gataccgccc tttattattg ttcacgatat 300
gggtatgatg gcgcctggtt tgcttattgg gggcagggga cactggtcac tgtgagtgct 360

Claims (7)

1.一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，其特征是：包括与G17的N端表位如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_N和与G17的C端表位如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiG17_C，
所述AntiG17_N包括如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiG17_C包括如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，其特征是：
所述AntiG17_N包含轻链LCDR1即SEQ ID NO:4所示、LCDR2即SEQ ID NO:5所示、LCDR3即SEQ ID NO:6所示的三个氨基酸序列，重链HCDR1即SEQ ID NO:8所示、HCDR2即SEQ IDNO:9所示、HCDR3即SEQ ID NO:10所示的三个氨基酸序列，
所述AntiG17_C包含轻链LCDR1即SEQ ID NO:14所示、LCDR2即SEQ ID NO:15所示、LCDR3即SEQ ID NO:16所示的三个氨基酸序列，重链HCDR1即SEQ ID NO:18所示、HCDR2即SEQ ID NO:19所示、HCDR3即SEQ ID NO:20所示的三个氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，其特征是：所述配对抗体可以变换成G17结合片段Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di-scFv。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，其特征是：所述AntiG17_N、所述AntiG17_C为IgG型单克隆抗体，所述AntiG17_N作为捕获抗体，所述AntiG17_C作为检测抗体，所述AntiG17_C的检测标记是酶、荧光基团、放射性同位素。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，其特征是：所述配对抗体可与检测标记蛋白重组表达，所述检测标记蛋白为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测血清中G17含量的配对抗体，其特征是：所述配对抗体的含量通过免疫学检测方法检测，所述免疫学检测方法包括酶联免疫(ELISA)、化学发光检测、蛋白质印迹检测和免疫组化(IHC)、免疫层析检测。
7.一种化学发光检测试剂盒，其特征是：包含与G17的N端表位结合的AntiG17_N和与G17的C端表位结合的AntiG17_C，以化学发光检测方法特异性识别AntiG17_C，用于检测G17的含量。
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