CN105474016B - Augurin免疫试验 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测Augurin或其前体或片段的免疫试验方法，包括令疑有Augurin或其前体或片段的样品接触对Augurin或其前体或片段具有特异性的第一和第二抗体，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至107内所含表位具有特异性。

Description

AUGURIN免疫试验
技术领域
本发明属于免疫分析领域。具体地说，本发明涉及体液样品或组织样品中Augurin或其前体或片段含量的测定。
背景技术
Augurin，是一种新近鉴定到的分泌肽，由食道癌相关基因-4(ECRG4)编码，该肽在脊椎动物间保守(Mirabeau等2007.基因组研究(Genome Research)17:320-327)。人ECRG4编码一个148氨基酸的蛋白质，该蛋白含有位于残基1-30的前导肽。ECRG4编码蛋白的一种加工形式被命名为Augurin(残基 31-148)，但是，位于残基68-71的一个推定激素原剪切位点会产生两条推定激素肽：其一按ECRG4的EC部分命名为ecilin(残基31-70)，另一为片段71-148，按ECRG4的RG部分命名为argilin(Gonzalez等2011.CNS液体与屏障(Fluids and Barriers of the CNS).8:6)。供凝血酶剪切的第二个推定蛋白水解共有序列位点在与凝血酶共育时会产生C-末端Δ16序列(氨基酸残基134-148)。此外， Augurin二聚体也已有记载(Gonzalez等2011.CNS液体与屏障(Fluids and Barriers of the CNS).8:6)。
对小鼠垂体瘤和人结肠癌细胞内Augurin翻译后修饰的研究发现，它经弗林蛋白酶剪切，经组成型分泌途径分泌(Ozawa等2011.Molecular Endocrinology 25(5):776- 784)。此外，Augurin在转运和蛋白酶解切割过程中发生硫(酸)化(在R41E42和/或R70Q71)，这是Augurin抑制细胞繁殖所必需的一个翻译后修饰。
Dang等2012发现ECRG4位于人细胞上皮表面(Dang等2012.Cell Tissue Research 348(3):505-514)，并推测ECRG4释放具有细胞特异性，且组织特异性加工可调控不同组织中不同的ECRG4活性。
ECRG4表现出人心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰内的组织特异性表达，据测，心脏和肾内表达最强(Steck等2002.Biochemical and Biophysical Research Communications 299:109-115)。脑内各区中，ECGR4主要存在于下丘脑和脉络丛上皮细胞(Tadross等2010.British Journal of Pharmacology 159:1663-1671；Donahue等 2010.Cerebrospinal Fluid Research7(Suppl 1):S32；Gonzalez等2011.Fluids and Barriers of the CNS 8:6)。大鼠中枢神经系统(CNS)受损后，观察到脉络丛上皮内Augurin和ECRG4基因表达快速减少，伴有CNS损伤后Augurin立即动员，可能释放进了脑脊液(CSF)(Podvin等2011.PLoS One 6(9):e24609)。人CSF中，前Augurin被认为是一种内源肽 (Hoelttae等2012.PLoS One 7(8):e42555)。
据信，Augurin刺激经由下丘脑CRF释放的ACTH释放，可作为调节丘脑-垂体-肾上腺轴的新型治疗靶标(Tadross等2010.British Journal of Pharmacology 159:1663- 1671)。并且，ECRG4表达在软骨细胞和软骨中特别丰富，软骨分化期间显著升高，骨关节炎性软骨中则降低，这提示ECRG4是已分化关节软骨细胞和软骨毁损的标记(Huh等2009.基因 448:7-15)。
似乎，ECRG4还与成年小鼠脑内神经细胞衰老和老化有关(Kujuro等2010.PNAS 107(18):8259-8264)。
ECRG4基因在不同癌症(例如食管鳞状细胞癌[ESCC]，前列腺癌，结直肠癌，恶性胶质瘤和胃癌)中高甲基化而下调，这提示其表观遗传控制参与了正常细胞的癌变(Yue等 2003.World Journal of Gastroenterology 9(6):1174-1178；Vanaja等2009.Cancer Investigation 27(5):549–560；Goetze等2009.BMC Cancer 9:447；Wang等 2012.Hepatogastroenterology 59(118):1696-1698)。 ECRG4基因的高甲基化被关联到前列腺癌复发的预测(Vanaja等2009.Cancer Investigation 27(5):549–560)，并可用于监测早期胃癌和预测病理分期(Wang等2012.Hepatogastroenterology 59(118):1696- 1698)。并且，ECRG4mRNA表达水平可作为ESCC患者独立预后因子的一个候选，因为该水平与局部浸润程度、病理阶段和患者预后相关(Mori等Oncology Reports 18:981-985；Li等 2009.International Journal of Cancer:125,1505–1513)。Mori及其同事进一步假设，这对于为手术挑选能够从中获益的患者来说可能也很重要。浸润性乳腺癌样本中，ECRG4mRNA表达降低，且与癌症阶段和大小相关(Sabatier等2011PLoS ONE 6(11):e27656)。并且，它被提作预后因子，因为它与乳腺癌患者的无病存活和整体存活相关。
人外周血细胞中ECRG4 mRNA升高，但脂多糖(LPS)孵育显著降低多形核细胞和单核细胞的细胞表面ECRG4(Baird等2012.Journal of Leucocyte Biology 91(5):773- 781)。在经LPS-处理白细胞的条件培养基中检测到了14kDa 的ECRG4和8kDa的ECRG4(对应于ECRG471-148)。白细胞上ECRG4表达水平低下可关联TBSA烧伤、系统性炎症反应综合征[SIRS]和钝性外伤患者的损伤，这提示ECRG4在损伤生物学中具有临床相关性，并参与炎性反应。然而，血液中没有测到ECRG4表达(Baird等2012.Journal of Leucocyte Biology91 (5):773-781)。此外，大鼠中耳感染实验中，大鼠粘膜组织中，ECRG4表达在感染后3-48小时迅速下降(Kurabi等2013-PLoS One 8(4):e61394)。
已有检测人前原-(71-107)-Augurin(prepro-(71-107)-Augurin)的竞争性酶学免疫试验，由菲尼克斯制药公司(Phoenix Pharmaceuticals Inc，美国加州伯林盖姆)出品。然而，Augurin及其片段和前体检测仍然需要高灵敏度、高特异性、高再现且低实验间偏差的更好试验。本发明提供了这样的试验，它可用作(例如) 研究工具来高特异性地检测低浓度Augurin。
发明内容
本发明主题是一种免疫试验的方法，用于检测Augurin或其前体或片段。就某一方面而言，所述方法包括以下步骤：
(a)令疑有Augurin或其前体或片段的样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物和对Augurin或其前体或片段特异性的第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触的条件允许：在允许所述两抗体与Augurin或其前体或片段结合的条件下形成与Augurin 或其前体或片段的三元复合物，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1所示前Augurin(pre-Augurin)的氨基酸71至107 内所含表位具有特异性，并且
所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对不同且非交叠表位具有特异性，以及
(b)检测所述两抗体或其抗原结合性片段或衍生物与Augurin或其前体或片段的结合。
本发明还涉及包括以下步骤、用于检测Augurin或其前体或片段的免疫分析方法：
(a)令疑有Augurin或其前体或片段的样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触条件允许形成 Augurin或其前体或片段与所述第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物的复合物，
(b)令所述样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触条件允许形成Augurin或其前体或片段与所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物的三元复合物，其中，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1 所示前Augurin的氨基酸71至107内所含表位具有特异性，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对不同且非交叠表位具有特异性，以及
(c)检测所述三元复合物。
本发明还涉及用于检测Augurin或其前体或片段的试剂盒，所述试剂盒包含
(i)SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至107内、优选氨基酸71至 88内、更优选氨基酸71至83内所含表位的特异性抗体或其抗原结合性片段或衍生物，
(ii)SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至107内、优选氨基酸71 至88内、更优选氨基酸79至88内所含表位的特异性抗体或其抗原结合性片段或衍生物，
本发明另一主题是抗Augurin抗体或其抗原结合性片段或衍生物，所述抗体或其片段或衍生物对SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至107内、优选71至88内、更优选71至83内所含表位具有特异性，或对SEQ ID NO:1 所示前Augurin的氨基酸79至88内所含表位具有特异性。
本发明还涉及杂交瘤细胞系，选自：保藏号为DSM ACC3206的细胞系 439/F4，保藏号为DSM ACC3207的细胞系439/H10，保藏号为DSM ACC3208 的细胞系482/H2，保藏号为DSMACC3209的细胞系482/H10，保藏号为DSM ACC3210的细胞系482/H7和保藏号为DSM ACC3211的细胞系482/G9。
方法的优化改变形式如从属权利要求所述。
附图说明
图1:前Augurin的结构和可能的加工肽。
图2:以肽PQW14(SEQ ID NO:9)、AK 439/F4和AK 439/H10免疫所得单克隆抗体的表位图。
图3:以肽AUG-EL10(SEQ ID NO:10)、AK 482/H7、AK 482/H2、AK 482/G9和AK 482/H10免疫所得单克隆抗体的表位图。
图4:分析物稳定性。所示为单克隆免疫试验所测每一基质十份样本22℃储存指定时长后比之未储存样本(恢复率％)的平均值(SEM)。
图5:单克隆免疫试验测得的重组型前Augurin的量效曲线。
图6:单克隆免疫试验测得的健康群体(n＝100)中的Augurin免疫反应性频率分布。
图7:用菲尼克斯制药(Phoenix Pharmaceuticals Inc)的竞争性酶免疫试验前原Augurin(prepro-Augurin)(71-107)(A)，多克隆参比夹心免疫试验(B)和单克隆夹心免疫试验(C)对不同标准材料的测定。
发明详述
本发明涉及一种用于检测Augurin蛋白或其前体肽或肽片段的免疫试验。具体地说，所述免疫试验检测的表位包括SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸残基71至107、优选氨基酸残基71至88。因此，本公开中所述免疫试验能够检测出包含前Augurin序列中氨基酸残基71至107、优选71至88的 Augurin片段和前体。此类片段包括：argilin、Δ16-Augurin和Δ16-argilin，见下文(例如，图1)。本发明的免疫试验方法是基于下述意外发现：能够特异性结合前Augurin的氨基酸71至107内所含表位的两种抗Augurin抗体的组合增强Augurin(或其包含这些表位的片段或前体)的检测。本发明的免疫试验方法利用两种不同的抗Augurin抗体，它们能够特异性结合SEQ ID NO:1所示前Augurin 的氨基酸71至107、优选71至88内所含表位。据本发明的免疫试验方法，能够依据所述两种抗体与Augurin或其前体或片段的结合来定性和/或定量检测 Augurin或其前体或片段。若两抗体都结合Augurin或其片段或前体则鉴定存在有Augurin或其片段或前体。换言之，本发明涉及一种用于检测样品中 Augurin或其前体或片段的免疫试验，其包括以下步骤：令所述样品接触第一抗Augurin抗体(或其抗原结合性片段或衍生物)和第二抗Augurin抗体(或其抗原结合性片段或衍生物)，以及检测这些抗体与Augurin或其前体或片段的三元免疫复合物的存在。所述免疫复合物形成于允许这些抗体与所述样品之间发生免疫反应的条件下。
就某一方面而言，本发明还涉及包括以下步骤、用于检测Augurin或其前体或片段的免疫试验方法：
(a)令疑有Augurin或其前体或片段的样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物和对Augurin或其前体或片段特异性的第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触的条件允许：在允许所述两抗体与Augurin或其前体或片段结合的条件下形成与Augurin 或其前体或片段的三元复合物，其中，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1 所示前Augurin的氨基酸71至107内所含表位具有特异性，并且所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对不同且非交叠表位具有特异性，以及
(b)检测所述两抗体或其抗原结合性片段或衍生物与Augurin或其前体或片段的结合。所述两抗体或其抗原结合性片段或衍生物的特异性结合表明存在 Augurin或其前体或片段。
本发明还涉及包括以下步骤、用于检测Augurin或其前体或片段的免疫试验方法：
(a)令疑有Augurin或其前体或片段的样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触条件允许形成 Augurin或其前体或片段与所述第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物的复合物，
(b)令所述样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触条件允许形成Augurin或其前体或片段与所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物的三元复合物，其中，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1 所示前Augurin的氨基酸71至107内所含表位具有特异性，并且
所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对不同且非交叠表位具有特异性，以及
(c)检测所述三元复合物。样品中所述三元复合物的检测指示存在Augurin或其前体或片段。
本发明免疫试验方法中，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至107、优选71至100、更优选71至95、更更优选71至90、最优选71至88内所含表位具有特异性。两抗体所针对的表位可以是交叠表位，也可以是非交叠表位。例如，两抗体所针对的表位可优选相隔不超过6个氨基酸，即在Augurin序列内，这两个表位之间的氨基酸残基不超过6个。所述表位之间可以相隔例如不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸。所述表位也可以直接相邻，即彼此之间没有氨基酸残基。
某些情形中，第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对氨基酸71 至107内所含表位具有特异性，且该两抗体的所述表位相隔不超过6、5、4、3、 2、1或0个氨基酸。第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物也可对氨基酸71至100内所含表位具有特异性，且该两抗体的所述表位相隔不超过6、5、 4、3、2、1或0个氨基酸。第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物也可对氨基酸71至95内所含表位具有特异性，且该两抗体的所述表位相隔不超过 6、5、4、3、2、1或0个氨基酸。第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物也可对氨基酸71至90内所含表位具有特异性，且该两抗体的所述表位相隔不超过6、5、4、3、2、1或0个氨基酸。第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物也可对氨基酸71至88内所含表位具有特异性，且该两抗体的所述表位相隔不超过6、5、4、3、2、1或0个氨基酸。所有这些情绪中，优选单克隆抗体。
尤其好的是，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1中氨基酸71至88内所含表位具有特异性，且所述表位相隔不超过3 个氨基酸。例如，第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物对SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至83内所含表位具有特异性，第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物则对SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸79至88内所含表位具有特异性。
本公开所述免疫试验方法中的抗体或其抗原结合性片段或衍生物可以是多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程单克隆抗体，详见后文。优选两抗体都是单克隆抗体。例如，第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物是杂交瘤细胞系产生的，所述杂交瘤细胞系选自：保藏号为DSM ACC3208的细胞系482/H2、保藏号为DSM ACC3209的细胞系482/H10、保藏号为DSM ACC3210的细胞系 482/H7或保藏号为DSM ACC3211的细胞系482/G9。第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物可以例如由以下杂交瘤细胞系产生：保藏号为DSM ACC3206 的细胞系439/F4或保藏号为DSM ACC3207的细胞系439/H10。就本发明免疫试验方法和试剂盒而言，较好的是，第一抗体是杂交瘤细胞系482/H7产生的抗体，第二抗体是杂交瘤细胞系439/F4产生的抗体。
如上所述，本发明的免疫试验能够检出含有前Augurin序列之氨基酸残基71至107、优选71至88的Augurin片段和前Augurin。因此，本发明提供了检测argilin的免疫试验方法，检测Δ16-Augurin的免疫试验方法和检测免疫Δ16-argilin的测定方法。
抗体与Augurin(或其前体或片段)在合适的条件下(即允许免疫反应的条件，即允许免疫复合物形成时所述抗体与Augurin结合的条件)结合。这类条件是本领域技术人员所知道的，可以采用后文所述的免疫试验标准模式。这类条件优选处于生理温度、生理pH和生理离子强度，且可以形成于介质中，例如磷酸盐缓冲液(PBS)。
优选的检测方法包括各种模式的免疫试验，例如放射免疫试验(RIA)、化学发光免疫试验和荧光免疫试验、酶联免疫试验(ELISA)、基于Luminex的微珠阵列、蛋白质微阵实验和快速试验模式例如免疫层析试条试验。
这些试验可以是均质试验或非均质试验，竞争性试验和非竞争性试验。特别优选的实施方式之一中，试验为夹心试验的形式，这是一种非竞争性免疫试验，其中，待检和/或待定量的分析物结合第一抗体和第二抗体。第一抗体可以例如结合固定相(如微珠、孔格或其他容器表面、芯片或试条)，第二抗体带标记，例如以染料、放射性同位素、反应活性单元或催化活性单元标记。然后用适当方法检测结合分析物的带标记抗体的量。“夹心试验”的常用组分和程序已相当成熟，且为本领域所熟知(The Immonoassay Handbook,David Wild 编辑,Elsevier LTD,Oxford；第三版，(五月，2005),ISBN-13:978-0080445267；Hultschig C等,Curr Opin Chem Biol.2006 Feb；10(1):4-10.PMID:16376134，通过引用纳入本文)。夹心免疫试验可设计成一步法或两步法。
特别优选的实施方式之一中，试验包含分散于液体反应混合物中的两种抗体分子(即抗体或其抗原结合性片段或衍生物，优选抗体)，其中第一标记组分接在第一抗体分子上，该第一标记组分是基于荧光或化学发光猝灭或放大的标记系统的组成部分，而所述标记系统的第二标记组分接在第二抗体分子上，这样，当两抗体分子都结合分析物时就会产生可测信号，由此即可检测含样品溶液中形成的夹心复合物。
更好的是，标记系统包含与荧光染料或化学发光染料(尤以花青染料为例) 组合的稀土穴合物或稀土螯合物。本发明中，荧光试验用到染料，例如，所述染料可选自：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、呫吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX),TET,6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明 (ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料如BODIPY TMR、Oregon Green,香豆素如伞形酮、苯甲酰胺如Hoeschst 33258、菲啶如德州红、Yakima黄、Alexa Fluor、PET、溴乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。
本发明中,化学发光试验用到染料，依据的化学发光材料的物理原理可参见Kirk- Othmer,Encyclopedia of chemical technology，第4版，执行编辑：J.I.Kroschwitz；编 辑：M.Howe-Grant,John Wiley&Sons,1993,第15卷，第518-562页，援引纳入本文，包括其551-562页上的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯类。
本文中，“试验”可以是免疫分析领域各种类型的试验。这样的试验可以是基于待检分析物与一种或多种捕获探针(在此为抗体分子，即抗体或其抗原结合性片段或衍生物)一定亲和力的结合。就抗体分子与靶分子(即Augurin或其前体或片段)之间的相互作用而言，亲和常数范围为108至1011M-1、高于109M-1为佳。
试验的“灵敏度”指实际阳性被正确鉴定的比例，即鉴别阳性结果的能力 (真阳性结果/阳性数量)。因此，试验能够检出的分析物浓度越低，则试验灵敏度越高。试验的“特异性”指实际阴性被正确鉴定的比例，即鉴别阴性结果的能力(真阴性/阴性数量)。对抗体来说，“特异性”指某个抗原结合位点仅与一个抗原表位结合的能力。抗体的结合行为还可以用“亲和力(affinity)”和“亲合力 (avidity)”来描述。抗体的“亲和力”是一个抗原表位与一个抗原结合位点之间反应强度的指标。抗体的“亲合力”是多表位抗原与多价抗体之间整体结合强度的指标。
本发明中，“抗体分子”(亦称“捕获分子”)即能用来结合样品中的靶分子或目标分子亦即分析物(本发明中即Augurin)或其前体或片段的分子。捕获分子因此必须具备就特异性结合靶分子或目标分子而言适宜的形态，既包括空间形态也包括表面特征，例如表面电荷、疏水性、亲水性、有无路易斯(lewis)供体和/ 或受体。在此，举例来说，结合可以是捕获分子与靶分子或目标分子之间的离子相互作用、范德华力、π-π、σ-π、疏水相互作用或氢键相互作用，或以上两种或更多相互作用的组合所介导。本发明中，捕获分子是抗体分子。较好的是，抗体分子是抗体，包括对靶分子或目标分子具有足够亲和力的抗体片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段，还包括所述抗体或其片段的化学修饰和/或生物化学修饰的衍生物，所述片段源自长度至少12个氨基酸的变体链。
本文中，除非特别说明，术语“抗体”被宽泛使用，既指抗体分子也指各种由抗体衍生的分子。此类抗体衍生的分子包括至少一个可变区(重链或轻链可变区)，单独的抗体轻链，单独的抗体重链，抗体链与其它分子之间的嵌合融合分子等。本发明的功能性免疫球蛋白片段可以是Fv、scFv、二硫连接的Fv、 Fab和F(ab’)2。本发明抗体或其片段可用来构成检测Augurin及其片段的免疫试验。抗体可以是例如：IgM、IgD、IgE、IgA或IgG，优选IgG1、IgG2、IgG2b、 IgG3或IgG4，最好是IgG1抗体。“抗体”还包括多克隆抗体、单克隆抗体(“mAb”)，优选IgG1类抗体，嵌合单克隆抗体，人源化抗体，基因工程单克隆抗体。
采用噬菌体展示等技术选择特异性结合样品中目标分子的抗体。就此而言，“特异性结合”指针对目标分子或其片段产生的抗体。一个抗体，如果它对目标分子或其前述片段的亲和力比它对目标分子所在样品中其他分子的亲和力高至少50倍(优选)、更好为至少100倍、最好至少1000倍，则认为该抗体是特异性的。制备抗体和挑选特定特异性抗体的方法是本领域已知的。新的抗体/抗体分子通过重组构建和表达即可获得。可方便地生产足量的新抗体分子，所用技术包括已知的重组法等，参见例如：Bentley,杂交瘤17(1998),559-567； Racher,Appl.Microbiol.Biotechnol.40(1994),851-856；Samuelsson,Eur.J.Immunol.26(1996),3029-3034。
在此，较好的是，抗体分子是全抗体(免疫球蛋白，如IgG1、IgG2、IgG2b、 IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE)，F(ab)-、Fabc-、Fv-、Fab’-、F(ab’)2-片段，单链抗体，嵌合抗体，CDR移植抗体，二价抗体构建物，抗体融合蛋白或合成抗体。优选单克隆抗体。
本发明还涉及用于检测Augurin或其前体或片段的试剂盒，所述试剂盒包含
(i)SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至107、优选氨基酸71至88、更优选氨基酸71至83内所含表位的特异性抗体或其抗原结合性片段或衍生物，
(ii)SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至107、优选氨基酸71至88、更优选氨基酸79至88内所含表位的特异性抗体或其抗原结合性片段或衍生物。较好的是，试剂盒包含：
(i)SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至83内所含表位的特异性抗体或其抗原结合性片段或衍生物；和
(ii)SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸79至88内所含表位的特异性抗体或其抗原结合性片段或衍生物。所述抗体优选单克隆抗体。
本发明还是涉及本发明试剂盒以夹心免疫试验形式用于检测和/或定量体液来源生物样品中Augurin或其片段的用途。所述片段至少包含跨两个表位(即所述两抗体所针对的那两个表位)的序列，例如，所述试剂盒可用于Augurin、 argilin、Δ16-Augurin和Δ16-argilin的检测和/或定量。
本文中，“片段”指源自较大蛋白质或肽、因而包含所述较大蛋白质或肽的部分序列的较小蛋白质或肽。所述片段可以是较大蛋白质或肽内一个或多个肽键的皂化产物。
术语“样品”以生物样品为宜。本文中，“样品”指为诊断、预后或评价目标对象(如患者)而获取的体液样品或组织样品。就本发明而言，“患者”或“对象 (subject)”包括人和其他动物(尤其哺乳动物)以及其它生物。因此，本发明的方法既可用于人的诊断，也可用于兽医领域。优选实施方式之一中，患者是哺乳动物，最优实施方式中，患者或对象是人。
优选的试验样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液。此外，本领域技术人员可以看出，有些试验样品分离或纯化后会更易分析，例如全血分离成血清或血浆组分。
因此，本发明优选实施方式之一中，样品选自：血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿液样品，或上述样品的提取物。较好的是，样品是血液样品，最好是血清样品或血浆样品。
较好的是，血浆或血清样品的获取过程中，可能含有Augurin或其前体或片段的血细胞已经从血浆或血清中定量分离。这可以通过(例如)将血液样品以至少2000至3000g的速度离心至少15分钟来完成。
适当情形下，用于本发明前可能需要对样品进行均质化或溶剂萃取来获取液体样品。因此，液体样品可以是溶液或悬浮液。用于本发明前可对液体样品进行一种(次)或多种(次)预处理。这些预处理包括但不限于：稀释、过滤、离心、浓缩、沉降(sedimentation)、沉淀(precipitation)、透析。预处理还可以包括：向溶液中添加化学物质或生物化学物质，例如酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、反应性染料、去污剂、乳化剂、螯合剂。
本发明中，“血浆”为含有抗凝血剂的血液离心所得基本上或实质性 (virtually)无细胞的上清。抗凝血剂的例子包括钙离子结合化合物如EDTA或柠檬酸盐，以及凝血酶抑制剂如肝素盐或蛭素。无细胞血浆可通过抗凝血液(例如加了柠檬酸、EDTA或肝素的血液)于2000-3000g离心至少15分钟来获得。
如前所述，本发明还涉及针对前Augurin(SEQ ID NO:1)氨基酸残基71至 107、优选71至100、更优选71至95、更更优选71至90、更更优选71至88、最优选71至83和79至88内所含表位的抗体或其抗原结合性片段或衍生物。优选抗体见后文所述。本发明还涉及本发明抗体或其抗原结合性片段或衍生物以夹心免疫试验形式用于检测和/或定量体液来源生物样品中Augurin或其片段的用途。所述片段至少包含跨两个表位(即所述两抗体所针对的那两个表位)的序列，例如，所述试剂盒可用于Augurin、argilin、Δ16-Augurin和Δ16-argilin 的检测和/或定量。
就本发明抗体、试剂盒和免疫试验而言，针对前Augurin(SEQ ID NO:1) 氨基酸残基71至107、优选71至100、更优选71至95、更更优选71至90、更更优选71至88、最优选71至83和79至88内所含表位的抗体或其抗原结合性片段或衍生物是多克隆、单克隆或基因工程单克隆抗体。较好的是，抗体或其抗原结合性片段或衍生物是单克隆抗体。
针对前Augurin(SEQ ID NO:1)氨基酸残基71至107、优选71至100、更优选71至95、更更优选71至90、更更优选71至88、最优选71至83和79 至88内所含表位的抗体或其抗原结合性片段或衍生物以IgG或衍生自IgG为佳。
较好的是，本发明单克隆抗体可由以下DSMZ保藏号的杂交瘤细胞系产生：DSMACC3206、DSM ACC3207、DSM ACC3208、DSM ACC3209、DSM ACC3210或DSM ACC3211。这些细胞系产生本发明针对前Augurin氨基酸残基71至88内所含表位的特定单克隆抗体。产生单克隆抗体AK 482/H7的杂交瘤细胞系已保藏于的德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，保藏日为2013年7月3日，保藏号为DSM ACC3210。产生单克隆抗体AK 482/H2的杂交瘤细胞系已保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏日为2013年7月3日，保藏号为DSM ACC3208。产生单克隆抗体AK 482/G9的杂交瘤细胞系已保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏日为2013年7月3日，保藏号为DSM ACC3211 。产生单克隆抗体AK 482/H10的杂交瘤细胞系已保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏日为2013年7月3日，保藏号为DSM ACC3209。产生单克隆抗体AK 439/F4的杂交瘤细胞系已保藏于德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ)，保藏日为2013年7月3日，保藏号为DSM ACC3206。产生单克隆抗体AK 439/H10的杂交瘤细胞系已保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏日为2013年7月3日，保藏号为DSM ACC3207。杂交瘤细胞系全部按照前文所述原理制备，详见实施例1。
最后，本发明还涉及保藏于DSMZ的以下保藏号的杂交瘤细胞系：DSM ACC3206、DSMACC3207、DSM ACC3208、DSM ACC3209、DSM ACC3210 和DSM ACC3211。这些杂交瘤细胞系产生针对前Augurin氨基酸71至88、尤其氨基酸71至83和79至88的本发明优选的抗体。
上述杂交瘤细胞产生的抗体或其抗原结合性片段或衍生物都可用于本发明的免疫试验方法，或可包含在本发明试剂盒中。
本发明免疫试验或试剂盒的一个特定方面中，第一抗体是针对前Augurin 的氨基酸79-88的单克隆抗体，第二抗体是针对前Augurin氨基酸71-83的单克隆抗体。例如，优选抗AUG-EL10抗体AK 482/H7与抗PQW14抗体AK 439/F4的组合。例如，夹心ELISA中，抗PQW14抗体AK 439/F4可用作示踪抗体，抗AUG-EL10抗体AK 482/H7可用作固相抗体。
针对PQW14肽(SEQ ID NO:9)(前Augurin的氨基酸71-83)的单克隆抗体包括本文所述抗体AK 439/F4和AK 439/H10。针对AUG-EL10肽(SEQ ID NO: 10)(对应于前Augurin的氨基酸79-88)的单克隆抗体包括本文所述抗体AK 482/H7、AK 482/H2、AK 482/G9和AK482/H10。
具体实施方式之一中，本发明还涉及用于检测Augurin或其前体或片段的免疫试验方法，所述方法包括以下步骤：
(a)令疑有Augurin或其前体或片段的样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触条件允许形成Augurin 或其前体或片段与所述第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物的复合物，
(b)令所述样品接触对Augurin或其前体或片段特异性的第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物，接触条件允许形成Augurin或其前体或片段与所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物的三元复合物，其中，第一抗体或其抗原结合性片段或衍生物是针对前Augurin氨基酸 79-88的单克隆抗体或其抗原结合性片段或衍生物，第二抗体或其抗原结合性片段或衍生物是针对前Augurin氨基酸71-83的单克隆抗体或其抗原结合性片段或衍生物，以及
(c)检测所述三元复合物。较好的是，该实施方式中的免疫试验是夹心ELISA 试验，更好的是，将抗-PQW14抗体AK 439/F4用作示踪抗体(“第二抗体”)，将抗-AUG-EL10抗体AK 482/H7用作固相抗体(“第一抗体”)。然而，也可采用前述抗体的其他组合。例如，抗AUG-EL10抗体AK 482/H7可用作示踪抗体(“第二抗体”)，抗PQW14抗体AK 439/F4可用作固相抗体(“第一抗体”)。
序列
前Augurin肽(前Augurin)的氨基酸序列见SEQ ID NO:1所示。切下N- 末端信号肽(30个氨基酸)后，Augurin释出，此Augurin对应于前Augurin序列的氨基酸残基31至148。Augurin的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。Ecilin对应于前Augurin的氨基酸残基31-68。Ecilin的氨基酸序列见SEQ ID NO:3。Argilin 对应于前Augurin的氨基酸残基71-148。Argilin的氨基酸序列见SEQ ID NO:4 。Augurin可被切成名为Δ16(SEQ ID NO:5)的C-末端片段和Δ16-Augurin(SEQ ID NO:6)，前者对应于前Augurin的氨基酸序列134-148，后者对应于前Augurin 的氨基酸序列31-130。Δ16-Augurin可再切成Δ16-argilin，对应于前Augurin 的氨基酸序列71-130，见SEQ ID NO:7。
免疫所用肽PKE14(前Augurin的氨基酸48–60)的序列见SEQ ID NO:8。免疫所用肽PQW 14(前Augurin的氨基酸71-83)的序列见SEQ ID NO:9。免疫所用肽AUG-EL10(前Augurin的氨基酸79-88)的序列见SEQ ID NO:10。免疫所用肽PGY 14(前Augurin的氨基酸91-103)的序列见SEQ ID NO:11。免疫所用肽PDI 14(前Augurin的氨基酸117-129)的序列见SEQ ID NO:12。单克隆抗体 AK 439/F4和AK 439/H10结合表位的氨基酸序列见SEQ IDNO:13。单克隆抗体AK 482/H7和AK 482/H2结合表位的氨基酸序列见SEQ ID NO:14。单克隆抗体AK 482/G9和AK 482/H10结合表位的氨基酸序列见SEQ ID NO:15。合成肽PQP-61(含前Augurin氨基酸71-131)和AUG-WF15(含前Augurin氨基酸 73-87)的氨基酸序列分别见SEQID NO:16和17。
制做单克隆抗体(见表1)表位图所用肽的序列见SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:37。
SEQ ID NO:1(前Augurin的氨基酸序列):
SEQ ID NO:2(Augurin的氨基酸序列):
SEQ ID NO:3(ecilin的氨基酸序列):
1 GNKLKLMLQK REAPVPTKTK VAVDENKAKE FLGSLKRQ
SEQ ID NO:4(argilin的氨基酸序列):
SEQ ID NO:5(Δ16的氨基酸序列):
1 PYGFRHGASV NYDDY
SEQ ID NO:6(Δ16-Augurin的氨基酸序列):
SEQ ID NO:7(Δ16-argilin的氨基酸序列):
SEQ ID NO:8(PKE14的氨基酸序列)
1 KTKVAVDENK AKE
SEQ ID NO:9(PQW14的氨基酸序列)
1 QLWDRTRPEV QQW
SEQ ID NO:10(AUG-EL10的氨基酸序列)
1 EVQQWYQQFL
SEQ ID NO:11(PGY14的氨基酸序列)
1 GFDEAKFEDD ITY
SEQ ID NO:12(PDI14的氨基酸序列)
1 DYYQRHYDED SAI
SEQ ID NO:13(前Augurin的氨基酸序列73-78)
1 WDRTRP
SEQ ID NO:14(前Augurin的氨基酸序列82-87)
1 QWYQQF
SEQ ID NO:15(前Augurin的氨基酸序列83-87)
1 WYQQF
SEQ ID NO:16(PQD-61的氨基酸序列):
SEQ ID NO:17(AUG-WF15的氨基酸序列):
1 WDRTRPEVQQ WYQQF
SEQ ID NO:18(前Augurin的氨基酸序列71-86):
1 QLWDRTRPEV QQWYQQ
SEQ ID NO:19(前Augurin的氨基酸序列73-86):
1 WDRTRPEVQQ WYQQ
SEQ ID NO:20(前Augurin的氨基酸序列74-86):
1 DRTRPEVQQW YQQ
SEQ ID NO:21(前Augurin的氨基酸序列75-86):
1 RTRPEVQQWY QQ
SEQ ID NO:22(前Augurin的氨基酸序列76-86):
1 TRPEVQQWYQ Q
SEQ ID NO:23(前Augurin的氨基酸序列68-82):
1 QKRQLWDRTR PEVQQ
SEQ ID NO:24(前Augurin的氨基酸序列68-81):
1 QKRQLWDRTR PEVQ
SEQ ID NO:25(前Augurin的氨基酸序列68-80):
1 QKRQLWDRTR PEV
SEQ ID NO:26(前Augurin的氨基酸序列68-79):
1 QKRQLWDRTR PE
SEQ ID NO:27(前Augurin的氨基酸序列76-88):
1 TRPEVQQWYQ QFL
SEQ ID NO:28(前Augurin的氨基酸序列76-87):
1 TRPEVQQWYQ QF
SEQ ID NO:29(前Augurin的氨基酸序列76-85):
1 TRPEVQQWYQ
SEQ ID NO:30(前Augurin的氨基酸序列76-84):
1 TRPEVQQWY
SEQ ID NO:31(前Augurin的氨基酸序列76-83):
1 TRPEVQQW
SEQ ID NO:32(前Augurin的氨基酸序列79-91):
1 EVQQWYQQFL YMG
SEQ ID NO:33(前Augurin的氨基酸序列80-91):
1 VQQWYQQFLY MG
SEQ ID NO:34(前Augurin的氨基酸序列81-91):
1 QQWYQQFLYM G
SEQ ID NO:35(前Augurin的氨基酸序列82-91):
1 QWYQQFLYMG
SEQ ID NO:36(前Augurin的氨基酸序列83-91):
1 WYQQFLYMG
SEQ ID NO:37(前Augurin的氨基酸序列84-91):
1 YQQFLYMG
实施例
实施例1：抗体的产生
肽
选择人前Augurin已知氨基酸序列(见SEQ ID NO:1)中五个区域，用标准程序(JPT有限公司(JPT GmbH)，德国柏林)进行化学合成。这些肽是：PKE14(前 Augurin的氨基酸48–60，SEQ ID NO:8)，PQW 14(前Augurin的氨基酸71-83， SEQ ID NO:9)，AUG-EL10(前Augurin的氨基酸79-88，SEQ ID NO:10)，PGY 14(前Augurin的氨基酸91-103，SEQ ID NO:11)和PDI 14(前Augurin的氨基酸 117-129，SEQ ID NO:12)。
多克隆抗体的产生
采用标准程序(见EP 1488209 A1、EP 1738178 A1)产生针对以下肽的多克隆抗体：PKE14(前Augurin的氨基酸48-60，SEQ ID NO:8)，PQW 14(前Augurin 的氨基酸71-83，SEQ ID NO:9)，PGY 14(前Augurin的氨基酸91-103，SEQ ID NO:11)和PDI 14(前Augurin的氨基酸117-129，SEQ ID NO:12)。简而言之，将肽与载体蛋白KLH(钥孔戚血蓝素)(皮尔斯公司(PIERCE)，美国伊利诺伊州罗克福德)用MBS(间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)偶联。如下所述用该偶联物免疫绵羊：用100μg偶联物(所标质量为偶联物中肽单元的质量)初免，然后以四周为间隔加强免疫，每次50μg偶联物。初免后4个月，获取300ml 羊抗血清。如下所述从相应抗血清中分别纯化抗原特异性抗体：将5mg相应肽与5ml SulfoLink-凝胶(皮尔斯公司(PIERCE)，美国伊利诺伊州罗克福德) 偶联。分批，取50 ml抗血清与凝胶室温孵育4小时。将孵育物转移上柱(NAP25 空柱，法玛西亚公司(Pharmacia))。弃去通过物，用100ml洗胶缓冲液(100mM 磷酸钾，0.1％吐温20，pH 6.8)洗胶，用50mM柠檬酸、pH 2.7洗脱特异性结合的抗体。洗脱产物用50mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 8.0透析。
单克隆抗体的产生
用标准流程产生针对PQW 14(前Augurin的氨基酸71-83，SEQ ID NO:9) 和针对AUG-EL10(前Augurin的氨基酸79-88，SEQ ID NO:10)的单克隆抗体 (Harlow E,Lane D.Antibodies-A Laboratory Manual.冷泉港：冷泉港实验室，1988；Lane 1985.Journal of Immunology Methods 81:223-228)，简而言之，将肽与BSA用硫代MBS(Sulfo-MBS)偶联。用这些偶联物对Balb/c小鼠进行免疫和加强免疫，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞系。就分泌结合所述免疫原性肽的抗体的能力来筛选细胞系，免疫原性肽涂布在聚苯乙烯固相上。如此得到分泌单克隆抗体AK 439/F4和AK 439/H10(抗PQW14)和AK482/H7、 AK 482/H2、AK 482/G9、AK 482/H10(抗AUG-EL10)的细胞系。为了用于后续实验，用蛋白G亲和层析从培养上清中纯化单克隆抗体。
抗体的标记
根据标准程序标记抗体(EP 1488209 A1，EP 1738178 A1)：将各纯化抗体的浓度调至1g/L，将抗体与化学发光标记MACN-吖啶-NHS-酯(1g/L，InVent有限公司(InVentGmbH)，德国黑尼格斯多夫)按1:5的比例室温孵育20分钟，由此进行抗体标记。添加1/10体积的50mmol/L甘氨酸、室温下10分钟，由此停止反应。经NAP-5柱(GE医疗集团(GEHealthcare)，德国弗赖堡)和 SEC-400-5 HPLC柱子(伯乐公司(BIO-RAD))大小排阻层析将标记抗体与游离标记分离。
抗体涂布
根据标准程序涂布抗体(EP 1488209 A1，EP 1738178 A1)：聚苯乙烯 Startube管(葛莱娜(Greiner))用纯化抗体涂布(每管：2μg抗体含于300μL 10 mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、pH 7.8)，22℃过夜。然后各管用含有30g/L Karion FP(默克公司(Merck))、5g/L无蛋白酶牛血清白蛋白(西格玛公司(Sigma)) 的磷酸钠缓冲液(pH 6.5)封闭，然后冷冻保存。
实施例2：采用多克隆抗体的Augurin参比试验
用前文所述多克隆抗体设计了多个夹心免疫试验。采用供血者混合血浆，使用抗PKE14抗体的夹心试验都无信号，而使用抗PQW14、抗PGY14和抗PDI14 抗体的夹心试验有信号。最强信号见于以抗PQW14为示踪抗体(针对前Augurin 的氨基酸71-83、SEQ ID NO:9)并以抗PDI14为固相抗体(针对前Augurin氨基酸 117-129、SEQ ID NO:12)的试验。用该多克隆抗体组合进行后续实验。
将100μl标准品(重组人前Augurin，含氨基酸1-148[SEQ ID NO:1]， INVIVO生物技术服务有限公司(Invivo BioTech Services GmbH)，黑尼格斯多夫) 或样品与200μl含有MACN标记抗体的缓冲液加入已涂试管(300mM磷酸钾、 pH 7.0、50mM NaCl、10mM EDTA、0.09％叠氮钠、0.1％BSA、0.1％非特异性牛IgG、0.1％非特异性绵羊IgG、0.01％非特异性小鼠IgG，和已有每200μl 0.5x106相对光单位(RLU)的MACN标记抗体)。这些试管室温下搅拌孵育20小时。然后用1mL勃拉姆斯有限公司(B.R.A.H.M.S)的洗涤液(赛默飞世尔科学有限公司(Thermo Fisher Scientific)临床诊断部(Clinical Diagnostics)勃拉姆斯有限公司 (B.R.A.H.M.S)，德国亨尼希斯多夫)洗管4次，用LB952T照度计(伯赫公司(Berthold))测定结合化学光，每管1秒。用MultiCalc软件(Spline Fit)计算样品的浓度。
实施例3：单克隆抗体Augurin试验的研发
用前文所述单克隆抗体设计了多个夹心免疫试验。采用供血者混合血浆，使用抗PQW14和抗AUG-EL10抗体的夹心试验都有信号。最强信号见于用抗 PQW14抗体AK 439/F4作为示踪抗体并用AUG-EL10抗体AK 482/H7作为固相抗体的试验。用该单克隆抗体组合进行后续实验。
将50μl标准品(重组人前Augurin，含氨基酸1-148[SEQ ID NO:1]，INVIVO 生物技术服务有限公司(Invivo BioTech Services GmbH)，黑尼格斯多夫)或样品与200μl含有MACN标记抗体的缓冲液加入已涂试管(300mM磷酸钾、pH 7.0、 50mM NaCl、10mM EDTA、0.09％叠氮钠、0.1％BSA、0.1％非特异性牛IgG、 0.1％非特异性绵羊IgG、0.01％非特异性小鼠IgG，和已有每200μl 0.5x106相对光单位(RLU)的MACN标记抗体)。这些试管室温下搅拌孵育3小时。然后用1mL 勃拉姆斯有限公司(B.R.A.H.M.S)的洗涤液(赛默飞世尔科学有限公司(Thermo Fisher Scientific)临床诊断部(Clinical Diagnostics)勃拉姆斯有限公司 (B.R.A.H.M.S)，德国亨尼希斯多夫)洗管4次，用LB952T照度计(伯赫公司(Berthold))测定结合化学光，每管1秒。用MultiCalc软件(Spline Fit)计算样品的浓度。
实施例4：单克隆抗体的表位作图
用合成的前Augurin序列内不同肽对AK 439/F4、AK 439/H10、AK 482/H7、 AK482/H2、AK 482/G9和AK 482/H10这六种单克隆抗体在前Augurin内的表位作图，合成的肽添加了间隔序列和N末端或C末端的生物素。如前所述用生物素结合蛋白中性亲和素(塞默科技皮尔斯蛋白生物制品公司(Thermo Scientific Pierce Protein BiologyProducts))涂管，每管2μg。每管加300μl肽溶液(含50ng相应肽)，室温下搅拌孵育3小时。然后用1mL勃拉姆斯(B.R.A.H.M.S)洗涤液洗管4 次。200μl抗体溶液(含50ng相应抗体)室温下搅拌孵育16小时，再如前所述洗管 4次。为了检测单克隆抗体与不同肽可能的结合，将200μl含化学发光MACN- 吖啶-NHS-酯标记山羊抗小鼠抗体的示踪抗体溶液加入管内室温下搅拌孵育2 小时，然后洗管4次，用LB952T照度计(伯赫公司(Berthold))测定结合化学光，每管1秒。
表位作图结果见表1。如图2所示，单克隆抗体AK 439/F4和AK 439/H10 结合相同表位，该表位由前Augurin序列内73-78六氨基酸(WDRTRP,SEQ ID NO:13)构成。图3显示，单克隆抗体AK 482/H7和AK 482/H2结合相同表位，该表位由前Augurin序列内82-87六氨基酸(QWYQQF,SEQ ID NO:14)构成，单克隆抗体AK 482/G9和AK 482/H10结合相同表位，该表位由前Augurin序列内83-87五氨基酸(WYQQF,SEQ ID NO:15)构成。
表1：表位作图结果：将两抗体与所示各前Augurin亚序列代表肽的测得结合信号与每一抗体所得最大结合信号相比(B/Bmax)。
实施例5：分析物稳定性
四种不同基质(血清、EDTA-血浆、柠檬酸盐-血浆和肝素-血浆)各取10份样品于22℃做不同时长储存，然后分批用单克隆免疫试验进行测定。将0时刻未经22℃储存时的测得值作为参比值，设为100％。如图4所示，室温下，血清稳定6小时，储存23小时后下降10％，31.5小时后下降20％。分析物在22℃于 EDTA-血浆、柠檬酸盐-血浆和Heparin-血浆中稳定至少31.5小时。
还测定了分析物经数个冻融循环后的稳定性。对10份健康供血者的 EDTA-血浆样本进行七次融化-冷冻。经七次冻融循环后，EDTA-血浆中的分析物绝对稳定，Augurin免疫反应性无明显下降和上升。
实施例6：量效曲线
可以在如前所述单克隆免疫试验试验中用重组型前Augurin(SEQ ID NO:1)作为标准品来制作量效曲线。典型的量效曲线如图5所示。
实施例7：健康群体的Augurin免疫反应性
对100份健康EDTA-血浆进行单克隆免疫试验测定。这些样本中的 Augurin免疫反应性频率分布见图6所示。全部样本均测得Augurin免疫反应性，其中，中值为1119pmol/L(95％CI 1071-1195)，最低值为385pmol/L，最高值为1880pmol/L。第75百分位和第97.5百分位的值分别为1333和1744pmol/L。 Augurin免疫反应性在女性中(n＝64，中值1073pmol/L)显著低于(p<0.01)男性 (n＝36，中值1328pmol/L)。Augurin免疫反应性与年龄没有关联性(Spearman r＝0.076，p>0.05)。
实施例8：本发明单克隆夹心免疫试验与菲尼克斯肽公司(Phoenix Peptides)的 竞争性前原Augurin(71-107)免疫测定、以及实施例2的参比夹心免疫试验之间的比较
用实施例2和3所述夹心免疫试验和菲尼克斯制药公司(PhoenixPharmaceuticals Inc.，美国伯林格姆)的人前原Augurin(71-107)竞争性免疫试验 (EK-012-22)对不同的标准肽进行测定。所用四种标准肽是：重组型人前Augurin (氨基酸1-148；SEQ ID NO:1)，菲尼克斯制药公司(Phoenix Pharmaceuticals Inc.) 的前原Augurin(71-107)-肽、合成肽PQP-61(含前Augurin氨基酸71-131，SEQ ID NO:16)和AUG-WF15(含前Augurin氨基酸73-87，SEQ ID NO:17)。结果见图7A、 B和C。菲尼克斯制药公司的前原Augurin(71-107)竞争性酶免疫试验检测到标准肽前原Augurin(71-107)，未检出重组型前Augurin(1-148)，也未检出肽 PQP-61和肽AUG-WF15(图7A)。由于该试验是用来检测前原Augurin(71-107) 的，原以为至少能测出重组型前Augurin(1-148)和肽PQP-61，因为这两肽都含有氨基酸序列71-107。
多克隆参比夹心免疫试验检测到重组型前Augurin(1-148)和肽PQP-61，未检出菲尼克斯制药公司的前原Augurin(71-107)和肽AUG-WF15，所述多克隆夹心免疫试验是基于分别针对前Augurin氨基酸71-83和氨基酸117-129的抗体的组合(实施例2，图7B)。该免疫试验所用固相抗体是针对肽PDI14产生的，其指向前Augurin的氨基酸117-129，而菲尼克斯制药的前原Augurin(71-107)和 AUG-WF15不含该表位。所以，应当预期该多克隆免疫试验不能检测该两肽。相比之下，重组型前Augurin(1-148)和肽PQP-61包含PQW14与PDI14即产生多克隆抗体所用两肽的两表位，因而预计能被该试验检出。
四种标准肽在本申请所述采用两种单克隆抗体的夹心免疫试验中都被检出(图7C，实施例3)，这符合预计，因为全部四种标准肽包含这两单克隆抗体相应的表位。
用健康供血者的EDTA-血浆测试对分析物检测准确性的可能干扰。对16 份EDTA-血浆样品和相关样本两两1:1混合物进行了测定。用实施例2和实施例3 所述多克隆和单克隆免疫试验以及菲尼克斯制药的前原Augurin(71-107)试验对这16份EDTA-血浆样本和8份混合物样本进行了测定。样本、样本混合物的检测值，以及混合物的算得值和相应的偏差见表2所示。结果的偏差还如图8所示。菲尼克斯制药的前原Augurin(71-107)试验显示混合物的偏差为–85.5至 737.3％。8份混合物样本中仅两份的样本混合物算得值与测得值之间的偏差低于20％。实施例2所述参比免疫试验中，8份混合物样本的值都显著低于对应的样本算得值(-65.1至100.0％)。相比之下，实施例3所述本发明单克隆免疫试验显示混合物样本算得值与测得值之间仅有轻微偏差(-1.0至35.8％)，仅一份混合物样本的偏差超过20％。
全部样本(标准肽样本、患者样本、混合物样本)进行平行试验，所示结果为平均值。实施例3单克隆免疫试验所测样本无一显示偏差系数>10％，实施例2 多克隆免疫试验所测样本中仅20％偏差系数>10％，菲尼克斯制药前原Augurin (71-107)试验所测24份样本中80％显示偏差系数>10％。所以，菲尼克斯制药前原Augurin(71-107)试验无法对样本进行可靠的检测。
综合来看，以上结果清楚地表明，只有使用本发明所述采用针对前 Augurin残基71-107内表位的两种抗体的免疫试验才能给出Augurin免疫反应性的可靠测定。
表2：混合EDTA-血浆样本偏差结果
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Claims (11)

1.第一和第二抗体或其抗原结合片段用于制造免疫试验产品的用途，所述免疫试验产品用于检测样品中Augurin或其前体或含有SEQ ID NO:1内氨基酸残基71至107的其片段，所述第一抗体或其抗原结合性片段对SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸79至88内所含表位具有特异性，所述第二抗体或其抗原结合性片段对SEQ ID NO:1所示前Augurin的氨基酸71至83内所含表位具有特异性，所述第一和第二抗体或其抗原结合性片段对不同且非交叠表位具有特异性，
所述第一抗体与以下杂交瘤细胞系产生的抗体相同：保藏号为DSM ACC3208的细胞系482/H2，保藏号为DSM ACC3209的细胞系482/H10，保藏号为DSM ACC3210的细胞系482/H7或保藏号为DSM ACC3211的细胞系482/G9；并且
所述第二抗体与以下杂交瘤细胞系产生的抗体相同：保藏号为DSM ACC3206的细胞系439/F4或保藏号为DSM ACC3207的细胞系439/H10。
2.如权利要求1所述的用途，所述表位相隔不超过6个氨基酸。
3.如权利要求2所述的用途，所述表位相隔不超过3个氨基酸。
4.如前述权利要求中任一项所述的用途，所述抗体或其抗原结合性片段是多克隆、单克隆或其抗原结合性片段。
5.如权利要求4所述的用途，所述单克隆抗体是基因工程单克隆抗体。
6.如权利要求1或2所述的用途，所述抗体或其抗原结合性片段是单克隆抗体或其抗原结合性片段。
7.如权利要求6所述的用途，所述第一抗体或其抗原结合性片段是选自以下所述的杂交瘤细胞系产生的：保藏号为DSM ACC3208的细胞系482/H2，保藏号为DSM ACC3209的细胞系482/H10，保藏号为DSM ACC3210的细胞系482/H7或保藏号为DSM ACC3211的细胞系482/G9。
8.如权利要求6所述的用途，所述第二抗体或其抗原结合性片段是选自以下所述的杂交瘤细胞系产生的：保藏号为DSM ACC3206的细胞系439/F4或保藏号为DSM ACC3207的细胞系439/H10。
9.如权利要求1所述的用途，所述样品源自受试者的体液或组织。
10.一种用于检测Augurin或其前体或片段的试剂盒，包含：
(i)对SEQ ID NO:1所示Augurin的氨基酸79至88内所含表位具有特异性的第一抗体或其抗原结合性片段，所述第一抗体与以下杂交瘤细胞系产生的抗体相同：保藏号为DSMACC3208的细胞系482/H2，保藏号为DSM ACC3209的细胞系482/H10，保藏号为DSM ACC3210的细胞系482/H7或保藏号为DSM ACC3211的细胞系482/G9；
(ii)对SEQ ID NO:1所示Augurin的氨基酸71至83内所含表位具有特异性的第二抗体或其抗原结合性片段，所述第二抗体与以下杂交瘤细胞系产生的抗体相同：保藏号为DSMACC3206的细胞系439/F4或保藏号为DSM ACC3207的细胞系439/H10。
11.如权利要求10所述的试剂盒，
(i)所述第一抗体或其抗原结合性片段是以下杂交瘤细胞系产生的：保藏号为DSMACC3208的细胞系482/H2，保藏号为DSM ACC3209的细胞系482/H10，保藏号为DSM ACC3210的细胞系482/H7或保藏号为DSM ACC3211的细胞系482/G9；并且
(ii)所述第二抗体或其抗原结合性片段是以下杂交瘤细胞系产生的：保藏号为DSMACC3206的细胞系439/F4或保藏号为DSM ACC3207的细胞系439/H10。
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