TR201806292T4 - Prokalsi̇toni̇ni̇n saptanmasi i̇çi̇n i̇mmünoloji̇k test - Google Patents

Prokalsi̇toni̇ni̇n saptanmasi i̇çi̇n i̇mmünoloji̇k test Download PDF

Info

Publication number
TR201806292T4
TR201806292T4 TR2018/06292T TR201806292T TR201806292T4 TR 201806292 T4 TR201806292 T4 TR 201806292T4 TR 2018/06292 T TR2018/06292 T TR 2018/06292T TR 201806292 T TR201806292 T TR 201806292T TR 201806292 T4 TR201806292 T4 TR 201806292T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
procalcitonin
antibody
amino acid
pct
acid residues
Prior art date
Application number
TR2018/06292T
Other languages
English (en)
Inventor
Struck Joachim
Original Assignee
Brahms Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42184142&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201806292(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Brahms Gmbh filed Critical Brahms Gmbh
Publication of TR201806292T4 publication Critical patent/TR201806292T4/tr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/5753—Calcitonin gene related peptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/585—Calcitonins

Abstract

Bu buluş, bir denekten alınan bir vücut sıvısından elde edilen bir biyolojik numunede en az 20 amino asit kalıntısı uzunluğunda Prokalsitoninin veya bunun bir fragmanının saptanması için bir in vitro yöntemle ilgili olup, aşağıdaki adımları içermektedir: (i) söz konusu numunenin Prokalsitonin içerisindeki farklı epitoplara yönelik en az iki antikor veya bunların fonksiyonel fragmanları ile temas ettirilmesi ve (ii) söz konusu en az iki antikorun Prokalsitonine veya bunun söz konusu fragmanına bağlanmasının kalitatif olarak veya kantitatif olarak saptanması, burada bağlanma söz konusu numunede Prokalsitonin veya söz konusu fragmanın varlığını veya konsantrasyonunu belirtmektedir, burada en az bir antikor veya bunun fonksiyonel fragmanı Prokalsitoninin amino asit kalıntıları 2-52?yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yöneliktir. Buluş ayrıca, Prokalsitoninin N-terminal epitopuna yönelik antikorlar ve PCT?ye yönelik antikorları içeren kitler ile ilişkilidir.

Description

TARIFNAME PROKALSITONININ SAPTANMASI IÇIN IMMÜNOLOJ IK TEST Bulusun Alani Mevcut bulus, klinik tani alanindadir. Mevcut bulus özellikle bir denegin vücut sivisindan elde edilen bir numunede Prokalsitonin (PCT) seviyesinin belirlenmesi ile ilgilidir.
Bulusun Arka Plani Prokalsitonin (PCT), lokal ve sistemik bakteriyel enfeksiyonlarin, örnegin sepsisin varligi ve siddetini yansitan bir biyomarkör olarak bilinmektedir (Assicot ve arkadaslari, Lancet Antijen spesifik antikorlar immünolojik testlerin (immünoassaylerin) gelistirilmesi için kilit araçtir. PCT türevli peptitlere yönelik birkaç antikor açiklanmis olup, bunlar PCT”yi saptamak için immünolojik testlerde kullanilmistir, ancak sadece birkaçi natif PCTlyi saptamak için sandviç immünolojik testlerde kullanimlari açisindan test edilmistir (Tablo 1). PCT”nin kalsitonin ve katakalsin parçalarina yönelik antikorlarin kullanildigi sandviç immünolojik testler insan numunelerinde rutin olarak PCTSnin ölçülmesi için gelistirilmistir.
Yüksek PCT konsantrasyonlari ile iliskili durumlar için (medüller tiroid karsinomu hariç), özellikle bakteriyel enfeksiyonlar ve sepsis için, yalnizca tam boy PCTJnin degil (yaklasik 13 kDa), ayni zamanda PCT türevli fragmanlarin da hastalarin kan dolasiminda var olduguna inanilmaktadir. Özellikle, PCT,nin kalsitonin parçasinin hemen yukari yönünde proteolitik ayrilmanin meydana geldigi ele alinmis olup (Muller ve arkadaslari Crit Care Med fragmana (her ikisi de yaklasik yol açmaktadir. Ancak buna iliskin deneysel kanit çok azdir: PCTlnin kalsitonin parçasina yönelik bir antikor kullanilarak afinite kromatografisi ile sepsis hastalarindan dolasim halindeki PCT izole edilmistir ve PCT3-1165nin dolasim halindeki ana PCT türü oldugu sonucuna varilmistir (Weglohner ve arkadaslari, Peptides diger bir deyisle yalnizca bir kalsitonin içeren epitopu olan peptitler saflastirilmis ve sonraki ters fazli HPLC7den ilgili fraksiyonlarin tümü analiz edilmemistir. PCT için immünolojik testler ayrica PCT fragmantasyonu sorununu çözmek için uygun olmamistir, çünkü ya tek bir antikoru kapsayan kompetitif testler kullanilmistir (Whang ve arkadaslari, J Clin Endocrinol ve PCT”nin genis bir parçasini kaplamayan epitoplari olan iki antikoru kapsayan sandviç PCT,nin tam N ucuna yönelik antikorlar, bir sandviç testte septik hastalara ait numunelerde dokunulmamis N ucu olan PCT türlerini saptamak üzere PCTSnin katakalsin parçasina dokunulmamis PCT türlerinin, PCT”nin kalsitonin ve katakalsin parçalarina yönelik antikorlarin kullanildigi bir sandviç immünolojik testle saptanmis olan PCT immünoreaktivitesine göre farkli in vivo kinetikleri oldugu bulunmustur. Ek olarak, bu N ucunda dokunulmamis PCT türlerinin, PCT°nin kalsitonin ve katakalsin parçalarina yönelik antikorlann kullanildigi bir sandviç immünolojik testle saptanmis olan PCT immünoreaktivitesinin yalnizca yaklasik %10-20'sini olusturdugu bulunmustur. Ancak farkli analit konsantrasyonlarinin gözlenmesine yol açan proteolitik ayrilmanin PCTsnin tam N ucu ile kalsitonin parçasi arasindaki hangi bölgede/bölgelerde meydana geldigi net degildir.
PCT'l-116,nin DPP IV,ün etkisiyle N ucundan ayrilarak PCT3-116°ya yol açtigi molekülün ortasindaki bir diger bölgede ayrilip ayrilamayacagi net degildir.
Bu nedenle, PCT`nin tam N ucunu içermeyen (yani PCT1-116`nin 1. pozisyonu) kabaca PCT,nin kalsitonin parçasinin yukari yönünde (tam olarak: 53,üncü pozisyonun yukari yönünde) bir epitopa sahip bir antikorun, bir baska epitopa, örnegin 53. pozisyonun asagi yönünde bir epitopa sahip (örnegin PCT”nin kalsitonin veya katakalsin parçasi içerisinde bir epitop gibi) bir antikorla baglantili olarak, PCT,nin kalsitonin parçasi içerisinde bir epitopa sahip antikorlarin ve PCTinin katakalsin parçasi içerisinde bir epitopu olan bir antikor gibi, bunun asagi yönünde bir epitopu olan bir antikorun kullanildigi bir sandviç immünolojik test ile kiyaslandiginda bir hasta numunesinde natif PCTinin saptanmasi için bir sandviç immünolojik testte kullanilip kullanilamayacagi net degildir. Bu sandviç immünolojik test son zamanlarda analit olarak rekombinant PCT kullanilarak tanimlanmistir, ancak natif PCTinin hasta numunelerinden geri kazanimi degerlendirilmemistir ve potansiyel PCT fragmantasyon sorunu ise üzerinde düsündügümüz gibi daha önce ele alinmamistir (Kramer ve arkadaslari, HyTest, "HyTest News - Procalcitonin", Turku, Finland, (200802), sayfa 1 - 8, Product Data Sheet, URL: http://www.hytest.fi/data_sheets/newsletters/Procalcitonin%20News1etter.pdf, kaynaklari PCT`nin belirlenmesi için monoklonal antikorlari (mAb) açiklamaktadir.
Mevcut bulus kismen bulus sahiplerinin Prokalsitoninin 2-52. amino asit pozisyonlarinda bulunan epitoplara yönelik antikorlarin, PCT,nin molekülün ortasinda ayrilmamasindan ötürü sandviç immünolojik testler kullanilarak PCT'nin ölçülmesi için uygun oldugu sasirtici bulgusuna dayanmaktadir.
Bulusun Açiklamasi Mevcut bulus, PCTiye yönlendirilmis yeni bir antikor kombinasyonuna dayali olarak vücut sivisi numunelerinde PCT seviyelerinin belirlenmesi için gelistirilmis bir test saglamaktadir.
Bu tarifname, bir demekten alinan bir vücut sivisindan elde edilen bir biyolojik numunede en az 20 amino asit kalintisi uzunlugunda Prokalsitoninin veya bunun bir fragmaninin saptanmasi için bir in vitro yöntemle ilgili olup, asagidaki adimlari içermektedir: a. söz konusu numunenin Prokalsitonin içerisindeki farkli epitoplara yönelik en az iki antikorla veya bunlarin fonksiyonel fragmanlariyla temas ettirilmesi, b. söz konusu en az iki antikorun Prokalsitonine veya bunun söz konusu fragmanina baglanmasinin kalitatif olarak veya kantitatif olarak saptanmasi, burada baglanma söz konusu numunede Prokalsitoninin veya söz konusu fragmaninin varligini veya konsantrasyonunu belirtmektedir, burada en az bir antikor veya bunun fonksiyonel fragmani Prokalsitoninin amino asit kalintilari 2-52”yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yöneliktir.
Bu nedenle, mevcut bulus istem l,e göre bir yöntemle, istem 2iye göre bir antikorla ve istem 3'e göre bir kitle ilgilidir.
Tercihen diger antikor veya bunun fonksiyonel fragmani Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53-116”y1 kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yöneliktir.
Mevcut bulusun yöntemlerinde kullanilan en az iki antikor tercihen ilgili diger antikordaki veya antikorlardaki epitoplara önemli (yani >%10) çapraz reaktivite sergilememektedir.
Prokalsitoninin amino asit kalintilari 2-52”yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan bir antikor bu epitopa özgüdür ve dolayisiyla Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53- ve tam tersi de geçerlidir. Bu nedenle, mevcut bulusun antikorlari PCT içerisindeki epitoplarina özgüdür ve diger epitoplarla, özellikle bu peptit içerisindeki örtüsmeyen epitoplarla önemli çapraz reaktivite sergilememektedir.
Tercihen burada, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 2-52”yi kapsayan sekansta bulunan epitop, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-40& kapsayan sekansta bulunan bir epitoptur.
Daha tercihen, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-4071 kapsayan sekansta bulunan epitop, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 21-40& kapsayan sekansta bulunan bir epitop, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-35°i kapsayan sekansta bulunan bir epitop ve Prokalsitoninin amino asit kalintilari 25-37lyi kapsayan sekansta bulunan bir epitoptan olusan bir gruptan seçilmektedir.
Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53-116`y1 kapsayan sekansta bulunan epitop tercihen, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 96-116iyi kapsayan sekansta bulunan bir epitop ya da Prokalsitoninin amino asit kalintilari 60-91 ”i kapsayan sekansta bulunan bir epitoptur.
Mevcut bulusun yönteminin özel bir uygulamasinda numunedeki Prokalsitoninin veya bunun bir fragmaninin konsantrasyonu ölçülmektedir.
Tercihen mevcut bulusa göre denek, insan veya insan olmayan hayvandir, tercihen bir memelidir, en çok tercih edilen haliyle denek insandir.
Mevcut bulus baglaminda Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53-1165yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan antikor veya bunun fonksiyonel fragmani bir poliklonal veya monoklonal antikordur. Tercihen Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53-116, yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan antikor veya bunun fonksiyonel fragmani bir monoklonal antikordur.
Prokalsitoninin amino asit kalintilari 2-52”yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan antikor veya bunun fonksiyonel fragmani tercihen IgGSdir veya IgG,den elde edilmektedir. Benzer sekilde, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53-1 16” yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan antikor veya bunun fonksiyonel fragmani tercihen Mevcut bulusun yöntemi baglaminda vücut sivisi tercihen kan, serum, plazma, serebrospinal sivi, idrar, tükürük, balgam ve plevral efüzyonlardan olusan gruptan seçilmektedir.
Mevcut bulusun yönteminin tercih edilen bir uygulamasinda en az iki antikordan veya bunlarin fonksiyonel fragmanlarindan en az biri bir kati yüzey üzerinde sabitlenmistir. Daha tercihen, en az iki antikordan veya bunlarin fonksiyonel fragmanlarindan biri bir kati yüzey üzerinde sabitlenmistir. Diger antikor veya antikorlarin en az birinin tercihen bir kemilüminesans veya floresan boyanin kovalent baglanmasi ile etiketlenmesi tercih edilmektedir.
Yöntemin özel bir uygulamasinda Prokalsitoninin amino asit kalintilari 2-527yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan antikor veya bunun fonksiyonel fragmani bir kati yüzey üzerinde sabitlenmistir. Bir baska özel uygulamada Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53-] 163yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan antikor veya bunun fonksiyonel fragmani bir kati yüzey üzerinde sabitlenmistir.
Mevcut bulus ayrica, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-401 kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan bir antikor veya bunun fonksiyonel bir fragmani ile ilgilidir.
Tercihen, bir epitopa yönelik olan antikor veya bunun fonksiyonel fragmani, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 21-40& kapsayan sekansta bulunan bir epitop, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-351 kapsayan sekansta bulunan bir epitop ve Prokalsitoninin amino asit kalintilari 25-37' yi kapsayan sekansta bulunan bir epitoptan olusan bir gruptan seçilmektedir.
Antikorun monoklonal olmasi tercih edilmektedir.
Mevcut bulusun antikoru tercihen genetik immünizasyon ile üretilebilmektedir. Kisaca, PCT”ye yönelik monoklonal antikorlar genetik immünizasyonla, diger bir deyisle temelde üretilebilmektedir. PCT kodlayan sekans standart prosedürlerle bir vektör içerisine klonlanabilmektedir. Daha sonra hayvana, örnegin farelere söz konusu vektör enjekte edilebilmektedir. Enjeksiyonlar örnegin 3 ve 6 hafta sonra tekrar edilebilmektedir. Hayvanlar örnegin 18 hafta sonra sakrifiye edilmektedir. Bunun üzerine sakrifiye edilen hayvanlarin dalak hücreleri SP2/0 miyelom hücreleri ile füzyon edilerek hibridoma hücre hatlari olusturulmakta olup, bunlar daha sonra immobilize rekombinant insan PCT`sine baglanacak olan antikorlari salgilama yetenekleri açisindan taranmaktadir.
Mevcut bulusa göre Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-403 kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik monoklonal antikor tercihen DSMZ'de DSM ACC2993 veya DSM ACC2996 veya DSM ACC2997 erisim numarasi altinda saklanan bir hibridoma hücre hatti ile üretilebilmektedir. Bu hücre hatlari bulusa göre Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-40& kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik özel monoklonal antikorlar üretmektedir.
Monoklonal antikor FX7A7,yi üreten hibridoma hücre hatti 4 Haziran 2009 tarihinde DSM ACC2997 erisim numarasi altinda Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bünyesinde saklanmistir. Monoklonal antikor FW5H6” yi üreten hibridoma hücre hatti 4 Haziran 2009 tarihinde DSM ACC2996 erisim numarasi altinda Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bünyesinde saklanmistir. Monoklonal antikor FXlGS°i üreten hibridoma hücre hatti 29 Nisan 2009 tarihinde DSM ACC2993 erisim numarasi altinda Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bünyesinde saklanmistir. Tüm hibridoma hücre hatlari yukarida ve daha detayli olarak Örnek l*de açiklanan prensiplere göre üretilmistir.
Bir baska yönde mevcut bulus en azindan asagidakileri içeren bir kit ile ilgilidir: a. Prokalsitoninin amino asit kalintilari 2-52iyi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan bir birinci antikor veya bunun fonksiyonel bir fragmani, ve b. Prokalsitoninin amino asit kalintilari 53-1167yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olan bir ikinci antikor veya bunun fonksiyonel bir fragmani.
Tercihen, kitteki birinci antikor Prokalsitoninin amino asit kalintilari 16-403 kapsayan sekansta bulunan bir epitopa, tercihen Prokalsitoninin amino asit kalintilari 21-4071 kapsayan sekansta bulunan bir epitoptan, Prokalsitoninin amino asit kalintilari l6-35'i kapsayan sekansta bulunan bir epitoptan ve Prokalsitoninin amino asit kalintilari 25-373yi kapsayan sekansta bulunan bir epitoptan olusan bir gruptan seçilen bir epitopa yöneliktir.
Birinci antikorun bir monoklonal antikor olmasi tercih edilmektedir. Ayni zamanda ikinci antikorun bir monoklonal antikor olmasi tercih edilmektedir.
Kitin tercih edilen bir uygulamasinda ikinci antikor, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 60- 91,i kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yöneliktir ya da Prokalsitoninin amino asit kalintilari 96-1 16,yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yöneliktir.
Bulus ayrica, mevcut bulusa göre bir kitin bir vücut sivisindan alinan bir biyolojik numunede Prokalsitonin veya bunun bir fragmaninin saptanmasi ve/veya ölçülmesi için bir sandviç immünolojik test biçiminde kullanimi ile ilgilidir. Böyle bir fragman en azindan, iki antikorun yönelik oldugu iki epitopu kapsayan bir sekansi içermektedir.
Ayrica mevcut bulus, mevcut bulusa göre yöntemin, mevcut bulusa göre antikorun veya mevcut bulusa göre kitin bir vücut sivisindan alinan bir biyolojik numunede Prokalsitonin veya bunun bir fragmaninin varliginin veya yoklugunun belirlenmesi için veya Prokalsitonin veya bunun bir fragmaninin ölçülmesi için kullanimi ile ilgilidir.
Tercihen yöntem, antikor ve kit yüksek prokalsitonin seviyeleri ile iliskili bir hastaligin veya durumun tanisi, prognozu, risk siniflandirmasi, tedavi izlemesi, tedavi yönlendirmesi veya terapötik önlemlerin uygulanmasi amaci ile siniflandirilmasi için kullanilmaktadir.
Hastalik veya durum tercihen lokal bakteriyel enfeksiyonlar (özellikle solunum yollari ve akcigerlerde), sepsis, siddetli sepsis, septik soktan olusan gruptan seçilmektedir. Hastalik veya durum ayrica, bunlarla sinirli olmamak üzere kardiyovasküler hastaliklar (akut koroner sendrom, kalp yetmezligi, koroner arter hastaligi, ateroskleroz, inme), kanser, diyabet, kronik gastrointestinal hastaliklar, kronik böbrek hastaliklari, hipertansiyon, osteoporoz dahil ortopedik hastaliklar ve Alzheimer hastaligi dahil nörodejeneratif hastaliklari içeren bulasici olmayan hastaliklar grubundan seçilebilmektedir. Yukarida bahsi geçen hastaliklarin veya durumlarin tamami bir veya daha fazla komorbidite ile iliskili olabilir veya olmayabilir.
Mevcut bulusun antikorlarinin tercihen ilgili epitoplari için 108 ila 10” M'I araliginda, tercihen 109 M'1 üzerinde afinitesi vardir. fragmanlarini, özellikle FC fragmanlarinin yani sira “tek Zincirli antikorlar” olarak anilan CDR-graftli antikorlari ve dia veya tetrabodyderi (Holliger P. ve arkadaslari (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-8) içermektedir. Ayrica örnegin bir numunede bulunan ilgili moleküle spesifik olarak baglanmak için faj gösterimini içeren teknikler yoluyla seçilen proteinler gibi immünoglobulinler de dahildir. Bu baglamda “spesifik baglanma” terimi, ilgili moleküle veya bunun bir fragmanina karsi gelistirilmis antikorlari ifade etmektedir. Bir antikorun, ilgili moleküle veya bunun yukarida bahsedilen fragmanina yönelik afinitesinin ilgili molekülü içeren bir numunede bulunan diger moleküllere göre en az tercihen 50 kat yüksek, daha tercihen 100 kat yüksek, en çok tercih edilen haliyle 1000 kat yüksek olmasi halinde spesifik oldugu düsünülmektedir. Teknikte antikorlarin nasil yapilacagi ve belirli spesifitesi olan antikorlarin nasil seçilecegi iyi bilinmektedir. Yukarida bahsedildigi gibi, monoklonal antikorlar tercih edilmektedir.
Mevcut bulusa göre tercih edilen testler ve saptama yöntemleri örnegin radyoimmünoassay (RIA), kemilüminesansli ve Iloresanli immünolojik testler, Enzime bagli immünolojik testler (ELISA), Luminex bazli boncuk dizileri, protein mikrodizi testleri gibi çesitli biçimlerdeki immünolojik testleri ve immünokromatografik serit testleri gibi hizli test biçimlerini içermektedir.
Testler homojen veya heterojen testler, kompetitif ve non-kompetitif sandviç testler olabilmektedir. Mevcut bulusa göre iki antikorun kullanildigi özellikle tercih edilen bir uygulamada testler non-kompetitif bir immünolojik test olan bir sandviç test formundadir, burada saptanacak ve/veya ölçülecek PCT veya bunun bir fragmani birinci antikora ve ikinci antikora baglanmaktadir. Birinci antikor bir kati faza, örnegin bir boncuga, bir haznenin veya bir diger kabin yüzeyine, bir yonga veya seride baglanabilmektedir ve ikinci antikor, örnegin bir boyayla, bir radyoizotopla veya reaktif veya katalitik olarak aktif bir parça ile etiketlenmis bir antikordur. Analite baglanmis etiketli antikor miktari bu durumda uygun bir yöntemle ölçülmektedir. “Sandviç testlerde” kapsanan genel bilesim ve prosedürler oldukça yerlesiktir ve alanda uzman kisi tarafindan bilinmektedir. (The Immunoassay Handbook, Ed. David arkadaslari, Curr Opin Chem Biol. . Özellikle tercih edilen bir uygulamada test, her ikisi de bir sivi reaksiyon karisiminda dispersiyonlar seklinde mevcut olan mevcut bulusa göre iki antikor içermektedir, burada birinci etiketleme bileseni birici antikora baglanmaktadir, burada söz konusu birinci etiketleme bileseni floresan veya kemilüminesans söndürme veya amplifikasyon bazli bir etiketleme sisteminin parçasidir ve söz konusu isaretleme sisteminin ikinci etiketleme bileseni ikinci antikora baglanmaktadir, böylece her iki antikorun analite baglanmasi sonrasinda bir ölçülebilir sinyal olusturulmakta olup, bu numuneyi içeren çözeltideki olusmus sandviç komplekslerin saptanmasina olanak vermektedir.
Hatta daha tercihen, söz konusu etiketleme sistemi bir floresan boya veya kemilüminesans boya, özellikle Siyanin türünde bir boya ile kombinasyon halinde nadir toprak kriptatlarini veya nadir toprak selatlarini içermektedir.
Mevcut bulus baglaminda floresan bazli testler boyalarin kullanimini içermekte olup, bunlar örnegin FAM (5-veya 6-karboksiflu0resein), VIC, NED, Fluoresein, Fluoreseinizotiyosiyanat Karboksi-Z',4',7',, TET, 6-Karb0ksi-4`,5'-dikloro-2',7'- dimetodiIluoresein (JOE), N,N,N',N'-Tetrametil-6-karb0ksir0damin (TAMRA), 6-Karb0ksi- X-rodamin (ROX), 5-Karboksirodamin-6G (R6G5), 6-karboksirodamin-6G (RG6), Rodamin, Rodamin Yesil, Rodamin Kirmizi, Rodamin 110, BODIPY boyalari, mesela BODIPY TMR, Oregon Green, Kumarinler mesela Umbelliferon, Benzimidler, mesela Hoechst 33258; Fenantridinler, mesela Texas Kirmizisi, Yakima Sarisi, Alexa Fluor, PET, Etidiyumbromür, Akridinyum boyalari, Karbazol boyalari, Fenoksazin boyalari, Porfirin boyalari, Polimetin boyalari ve benzerini içeren gruptan seçilebilmektedir.
Mevcut bulus baglaminda kemilüminesans bazli testler 551-562. sayfalardaki alintilar da dahil olmak üzere Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical technology, 4th ed., executive kaynaginda kemilüminesans malzemeler için açiklanan fiziksel prensipleri baz alan boyalarin kullanimini içermektedir. Tercih edilen kemilüminesans boyalar akridinyum esterlerdir. erisim numarasi altinda saklanan hibridoma hücre hatlari ile ilgilidir. Bu hibridoma hücre hatlari, özellikle PCTinin 21-40 ve 25-37. pozisyonlarindaki N terminal epitoplara yönelik olan ve Örnek lide verildigi gibi olusturulmus olan mevcut bulusun tercih edilen antikorlarini üretmektedir.
Sekanslar SEKANS TANIM NO;l (PCTinin amino asit sekansi): FRPFRSALRSLÃI E"›'AI`J??I.T`IEI".II' HîtRIiI.Ii.-`›.I:I.U ÇD`i'"-."Ç.V.KÃ\.C`.F IFÇJEÇIEHMSS SLIISPE-ZSFRC GI'ILLJ'ICl-lL-'Jl' YL'CUEI'IKFHT I"l*Ç'I`F«.lG`u"GA PGHPÂRDXSSD .sil-.îUJ'iRL-ilili's ."lPQI'IAI-i Sekillerin Açiklamasi Sekil 1: Var olan testler (A ve B: sirasiyla B-R-AH~MiS PCT LIA ve B~R~A-H›M»S PCT sensitive LIA) ile kiyaslandiginda kullanilan testlerin (C, D ve E) sematik gösterimi. Kalsitonin ve katakalsin parçalari ile PCT resmedilmektedir ve epitoplari ile antikorlar gösterilmektedir. A ve B: Bir antikor kalsitonin parçasina yöneliktir ve diger antikor PCTinin katakalsin parçasina yöneliktir; C: Test, burada bir antikor PCTlnin amino asit kalintilari 21-40& kapsayan sekanstaki bir epitopa yöneliktir ve diger antikor PCT`nin katakalsin parçasina yöneliktir. D, E: Test, burada bir antikor PCT,nin amino asit kalintilari 21-403 kapsayan sekanstaki bir epitopa yöneliktir ve diger antikor PCT,nin kalsitonin parçasina yöneliktir.
Sekil 2: Boyutsal olarak fraksiyonlarina ayrilmis PCT içeren serumlarin PCT immünoreaktif profilleri. Fraksiyonlar A Testlerinde (Sekil 17deki gibi gösterim) ölçülmüstür ve ölçülen degerler, her fraksiyonasyon turunda her test için ölçülen maksimum deger ile iliskili olmustur. Ortalamalar + standart sapma (SEM) gösterilmektedir.
Sekil 3: Boyutsal olarak fraksiyonlarina ayrilmis PCT içeren serumlarin PCT immünoreaktif profilleri. Fraksiyonlar C ve D Testlerinde (sirasiyla Panel A ve B; Sekil 'l'deki gibi gösterim) ölçülmüstür ve ölçülen degerler, her fraksiyonasyon turunda her test için ölçülen maksimum deger ile iliskili olmustur. Ortalamalar + standart sapma (SEM) gösterilmektedir.
Sekil 4: Üç PCT sandviç immünolojik test için doz yanit egrileri. Testler 30 dakika (panel A) veya 2 saat (panel B) boyunca inkübe edilmistir. PCT LIA ve PCT LIA sens., sirasiyla B-R-A-H-M~S PCT LIA ve B-R~A~H-M~S PCT sensitive LIA,ya karsilik gelmektedir (Sekil lsde A ve B olarak gösterilmistir). FXlGS/anti-Calc., Test E testini temsil etmektedir.
Sekil 5: Prokalsitoninin (PCT) amino asit sekansi (SEKANS TANIM NO:1) Örnekler Malzeme ve Yöntemler A. Monoklonal antikorlarin gelistirilmesi PCT,ye yönelik monoklonal antikorlar prensip olarak tarif edilmis bir prosedür (Costagliola Kisaca, PCT kodlayan sekans standart prosedürlerle pcDNAIIl vektörüne (Invitrogen, Karlsruhe, Almanya) klonlanmistir. BALB/c farelerine 0. günde ön tibialis kasindan %25 sukroz içinde 100 mg pcDNAIII-PCT enjekte edilmistir. Bundan 3 ve 6 hafta sonra enjeksiyonlar tekrarlanmistir. Ilk immünizasyondan 8 ile 11 hafta sonra ve sakrifiye etme zamaninda, ki bu 18 hafta sonradir, dalaklar ve tiroidler de çikarildiginda retro-oküler kilcal damarlardan kan örnekleri alinmistir. Hibridoma hücre hatlarini olusturmak üzere dalak hücreleri SP2/0 miyelom hücreleri ile füzyon edilmistir. Hücre hatlari immobilize rekombinant insan PCT`sine (In Vivo GmbH, Hennigsdorf, Almanya) baglanacak olan antikorlari salgilama yetenekleri açisindan taranmistir. Bu yaklasimla monoklonal antikorlar saklanan hibridoma hücre hatti ile üretilmistir), FW5H6 (4 Haziran 2009 tarihinde DSMZ,de DSM ACC2996 erisim numarasi altinda saklanan hibridoma hücre hatti ile üretilmistir) ve hibridoma hücre hatti ile üretilmistir) salgilayan hücre hatlari olusturulmustur.
B. Epitop eslestirme Üç monoklonal antikorun (FX7A7, FW5H6 ve FX1G5) PCTlsi içerisindeki epitoplarin eslestirilmesi standart prosedürlerle (JPT GmbH, Berlin, Almanya) peptit mikrodizileri üzerinde gerçeklestirilmistir. Peptit mikrodizisi, örtüsen peptit taramalari olarak gösterilen sekansinin tamamini kaplayan 74 peptitten olusmustur. Mikrodiziler bloklama tamponu (Pierce, Superblock; oda sicakliginda 2 saat) ile ön islemden geçirilmis ve bunu pH 8,de TBS tamponu ve suyla (her biri 3 kez) yikama izlemistir. Ön islem görmüs her mikrodizi arkaplan kontrolü için Axon Genepix 4000B Tarayici kullanilarak taranmistir (hiçbir sinyal saptanamamistir). Tek tek mikrodiziler test tamponundaki antikorlarla inkübe edilmistir (Pierce Superblock tamponunda nihai konsantrasyon 60ug/mL; toplam test hacmi 350 uL, inkübasyon süresi 3 saat). Mikrodiziler TBS tamponu pH 8 ile yikanmis ve bunu floresan etiketli sekonder antikorla inkübasyon izlemistir (anti-fare-Dylight-647; Pierce 31015, lpg/mL, inkübasyon süresi 45 dk). Floresan etiketli sekonder antikorla kontrol inkübasyonu paralel olarak gerçeklestirilmistir. Mikrodiziler uygun dalga boyu ayarlarina sahip Axon Genepix 4000B Tarayici kullanilarak taranmistir. Veri analizi için SPOT tanima yazilim paketi ArrayPro kullanilmistir. Veri degerlendirmesi için her mikrodizi görüntüsündeki 3 özdes alt diziden gelen sinyal yogunluklarinin ortalamasi (lokal arkaplan için düzeltilmistir) kullanilmistir.
C. Immünolojik testler Kemilüminesans-/kaplanmis tüp biçimindeki sandviç immünolojik testler asagidaki sekilde hazirlanmistir: Test A: PCT için ticari olarak mevcut bir sandviç test kullanilmis olup (BRAHMS PCT LIA sensitive), bu test kati faz olarak PCT,nin katakalsin parçasina yönelik bir antikoru ve etiketli antikor olarak PCT”nin kalsitonin parçasina yönelik bir antikoru kullanmaktadir (BRAHMS AG, Hennigsdorf, Almanya). Çesitli konsantrasyonlardaki rekombinant PCT standart olarak kullanilmistir. Test E (asagiya bakiniz) ile karsilastirma için, inkübasyon kosullari Test E için açiklananlara adapte edilmistir; diger bir deyisle 50 pl numune ve 200 pl etiketli antikor çözeltisi kullanilmis ve 30 dakika veya 2 saat süreyle test tüplerinde tek adimli bir reaksiyonda inkübe edilmistir.
PCT için ticari olarak mevcut bir sandviç test kullanilmis olup (BRAHMS PCT LIA), bu test kati faz olarak PCT`nin katakalsin parçasina yönelik bir antikoru ve etiketli antikor olarak PCT'nin kalsitonin parçasina yönelik bir monoklonal antikoru kullanmaktadir (BRAHMS AG, Hennigsdorf, Almanya). Çesitli konsantrasyonlardaki rekombinant PCT standart olarak kullanilmistir. Test E (asagiya bakiniz) ile karsilastirma için, inkübasyon kosullari Test E için açiklananlara adapte edilmistir; diger bir deyisle 50 pl numune ve 200 pl etiketli antikor çözeltisi kullanilmis ve 30 dakika veya 2 saat süreyle test tüplerinde tek adimli bir reaksiyonda inkübe edilmistir.
Diger testler için test bilesenleri asagidaki gibi üretilmistir: Antikorlar'in etiketlenmesi yapilmistir: Saflastirilmis antikorun konsantrasyonu 1 g/L olarak ayarlanmistir ve antikor, 1:5 molar oraninda oda sicakliginda 20 dakika süreyle kemilüminesans etiket MACN- Akridinyum-NHS-Ester (l g/L; anent GmbH, Hennigsdorf, Almanya) ile inkübasyonla etiketlenmistir. Oda sicakliginda 10 dakika süreyle 1/ 10 hacimli 50 mmol/L glisin eklemesi ile reaksiyon durdurulmustur. Etiketli antikor, NAP-5 kolonu (GE Healthcare, Freiburg, Almanya) ve Bio-Sil® SEC- boyut dislama kromatografisiyle serbest etiketten ayrilmistir.
Antikorlar'in kaplanmasi PCTinin kalsitonin parçasina yönelik bir monoklonal antikorun (BRAHMS AG, Hennigsdorf, Polistiren tüpler (Greiner) 22°C”de gece boyunca saflastirilmis antikorla (tüp basina, 300 uL mmol/L Tris, 100 mmol/L NaCl, pH 7.8 içinde 2 ug antikor) kaplanmistir. Tüpler daha sonra 30 g/L Karion FP (Merck), 5 g/L proteazsiz bovin serum albumin (Sigma) içeren 10mmol/L sodyum fosfat (pH 6.5) ile bloke edilip liyofilize edilmistir.
Bu bilesenlerle asagidaki testler hazirlanmistir: Anti-katakalsin antikoru ve standartlarla (rekombinant PCT) kaplanmis tüpler B.R.A.H.M.S PCT LIA sensitive (B.R.A.H.M.S AG, Hennigsdorf, Almanya) testinden alinmistir. FX1G5 etiketli antikor olarak MACN etiketli antikor kullanilmistir. Test tamponu 300 mmol/L proteazsiz bovin serum albumin (Sigma), 1 g/L nonspesifik bovin IgG, l g/L nonspesifik koyun IgG, 1 g/L nonspesifik fare IgG olup, 200 pl basina MACN etiketli antikorun içermistir. 100 pl standart veya numune ve MACN etiketli antikoru içeren 200 iil test tamponu kaplanmis tüpler içerisinde pipetlenmistir. Tüpler çalkalama altinda 22°C°de 2 saat inkübe edilmistir. Daha sonra, tüpler 1 mL B.R.A.H.M.S yikama çözeltisiyle (B.R.A.H.M.S AG, Hennigsdorf, Almanya) 5 kez yikanmis ve baglanan kemilüminesans LB952T lüminometre (Berthold) ile her tüp için 1 saniye ölçülmüstür.
Numunelerin konsantrasyonlari Software MultiCalC (Spline Fit) kullanilarak hesaplanmistir.
Anti-kalsitonin antikoruyla kaplanmis tüpler kullanilmistir. Standartlar (rekombinant PCT), BRAHMS PCT LIA sensitive (BRAHMS AG, Hennigsdorf, Almanya) testinden alinmistir.
FXlG5 etiketli antikor olarak MACN etiketli antikor kullanilmistir. Test tamponu 300 mmol/L potasyum fosfat, pH 7.0, 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, 0.9 g/L sodyum azid, 5 g/L proteazsiz bovin serum albumin (Sigma), 1 g/L nonspesifik bovin IgG, 1 g/L nonspesifik koyun IgG, l g/L nonspesifik fare IgG olup, 200 nl basina MACN etiketli antikorun içermistir. 100 nl standart veya numune ve MACN etiketli antikoru içeren 200 ü] test tamponu kaplanmis tüpler içerisinde pipetlenmistir.
Tüpler çalkalama altinda 22°C”de 2 saat inkübe edilmistir. Daha sonra, tüpler l mL B.R.A.H.M.S yikama çözeltisiyle (B.R.A.H.M.S AG, Hennigsdorf, Almanya) 5 kez yikanmis ve baglanan kemilüminesans LB952T lüminometre (Berthold) ile her tüp için 1 saniye ölçülmüstür. Numunelerin konsantrasyonlari Software MultiCalc (Spline Fit) kullanilarak hesaplanmistir.
FXlG5 antikorla kaplanmis tüpler kullanilmistir. Standartlar (rekombinant PCT) ve etiketli poliklonal anti-Kalsitonin antikoru BRAHMS PCT LIA sensitive (BRAHMS AG, Hennigsdorf, Almanya) testinden alinmistir. 50 iil standart veya numune ve MACN etiketli antikoru içeren 200 iil test tamponu kaplanmis tüpler içerisinde pipetlenmistir. Tüpler çalkalama altinda 22°C,de ya 30 dakika ya da 2 saat süreyle inkübe edilmistir. Daha sonra, tüpler 1 mL B.R.A.H.M.S yikama çözeltisiyle (B.R.A.H.M.S AG, Hennigsdorf, Almanya) 5 kez yikanmis ve baglanan kemilüminesans LB952T lüminometre (Berthold) ile her tüp için 1 saniye ölçülmüstür.
D. Boyut dislama kromatograjîsi Yüksek PCT konsantrasyonlari olan dokuz hastadan (sepsisli hastalar da dahil) alinan plazma numuneleri Bio-Sil® SEÇ- HPLC kolonu kullanilarak fraksiyonlarina ayrilmistir. Numune hacmi 100 ul olmustur. Yürütme tamponu PBS pH 7.4 olmustur. Akis hizi 0.8 mL/dk olmustur. 0.4 mL,lik fraksiyonlar test A, C, D”de toplanip ölçülmüstür. Asagidaki peptitler kalibratörler olarak kullanilmistir: rekombinant PCT (MW: yakl. 13 kDa; In Vivo GmbH, Hennigsdorf, Almanya), preproADM 45-92 (Sekans ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV; MW=5.1 kDa; JPT GmbH, Berlin, Almanya), Vitamin Bl2 (MW . Rekombinant PCT ve preproADM 45-92, BRAHMS PCT LIA sensitive ve BRAHMS MR-proADM LIA (BRAHMS AG, Hennigsdorf, Almanya) testlerinden elde edilen standart matris içinde çözündürülmüs ve boyut fraksiyonasyon HPLC`deki elüsyon profilleri bu testler kullanilarak belirlenmistir.
Vitamin B12 yürütme tamponu içinde seyreltilmis ve kromatografiye tabi tutulmustur; 280 nm,de absorpsiyon kaydedilmistir.
E. Numunelerin ölçümü Lokal bakteriyel enfeksiyon, sepsis, septik sok bulunan hastalardan otuz serum numunesi test A, C, D9de ölçülmüstür.
Sonuçlar Monoklonal antikorlar Üç fare monoklonal antikoru PCT kodlayan sekansin tamaminin kullanildigi genetik immünizasyonla üretilmistir. Epitop eslestirme üç antikorun tamami için benzer olmakla birlikte ayni olmayan sonuçlar vermistir (Tablo 2). Antikorlar FW5H6 ve FX7A7, EARLLLAALVQDYVQMKASE peptidine (PCT içerisinde 21-40. pozs.) maksimum baglanma göstermistir ve antikor FX1G5 için, öncekinden, yani LLAALVQDYVQMKdan (25-37. pozs.) elde edilen bir peptitte maksimum baglanma gözlemlenmistir. Bu bölgelerin disinda, bu üç antikor için PCT sekansi içerisindeki herhangi bir baska önemli baglanma bölgesi tespit edilmemistir. Burada kullanilan immünizasyon yöntemi sadece bir örnektir.
Diger yöntemler iyi bilinmekte olup, bunlar açiklanan bölgelerdeki ve daha genel olarak 53. pozisyonun yukari yönündeki bir epitopa yönelik antikorlar üretmek için alternatif olarak uygulanabilir; örnegin bir tasiyici proteine konjuge kimyasal olarak sentezlenmis peptitler Boyut dislama kromatografisi Natif PCT,nin görünür molekül agirligi ve çesitli sandviç immünolojik testlerle saptanabilirligi, boyut dislama HPLC°si kullanilarak yüksek natif PCT konsantrasyonlari olan hastalardan (sepsis hastalari da dahil) alinan serum numunelerinin fraksiyonasyonu ile degerlendirilmistir. Esas olarak, fraksiyonlar ister test A, C isterse D ile ölçülsün (Sekil 1) ayni immonoreaktivite profili gözlemlenmistir. Natif PCTSnin elüsyon süresi rekombinant PCTninkinden (13 kDa) ayirt edilemez olmustur (Sekil 2 ve 3). Üç testin herhangi biriyle 13 kDa°dan daha az olan bir molekül agirligina karsilik gelen hemen hemen hiç PCT immünoreaktivitesi saptanmamistir. En belirgin olarak, Test A ile yaklasik 6 kDa olan bir molekül agirligina karsilik gelen PCT immünoreaktivitesi saptanmamistir; bu, teknigin bilinen durumundaki PCT”nin, PCT7nin kalsitonin parçasinin hemen yukari yönünde bölünebilecegi varsayimlari dogru olsaydi beklenirdi. Bu sonuçlar, teknigin bilinen durumundaki spekülasyonlarin aksine, yüksek PCT konsantrasyonlari olan hastalarda (medüller tiroid karsinomu hariç) PCT'nin molekülün ortasinda algilanabilir biçimde ayrilmadigini ve A, C veya D tipi sandviç immünolojik testlerin ayni antijeni saptadigini göstermektedir.
Numunelerin ölçümü Lokal bakteriyel enfeksiyon, sepsis, septik sok bulunan hastalardan otuz serum numunesi test A, C, D`de ölçülmüstür. Spearman korelasyon katsayilari asagidaki sekilde olmustur: Test A hastalardan alinan önemli sayida numunedeki ölçümden elde edilen bu ideal korelasyon katsayilari boyut dislama kromatografisi ile elde edilen sonuçlari dogrulamaktadir, böylece genel olarak PCT,nin, normal üzerine yükseldiginde (medüller tiroid karsinomu hariç) molekülün ortasinda ayrilmadigi sonucuna varilmasi gerekmektedir.
Test karakteristikleri PCTinin 25-37. pozisyonlarina karsilik gelen bir epitopa sahip olan ve mevcut bulusta açiklanan antikorlarin birinin, FXlGS, ikinci antikor olarak bir anti-Kalsitonin antikoru kullanilan bir sandviç testte (Test E) kullanimi, ayni saptama teknolojisinden (kaplanmis tüp/kemilüminesans etiket), yani BRAHMS PCT LIA sensitive (Test A) ve BRAHMS PCT LIA”dan (Test B) faydalanan teknigin bilinen durumundaki PCT testlerine kiyasla analiz edilmistir. Sasirtici bir biçimde, Test E inkübasyon süresinden bagimsiz olarak her iki yerlesik testten ciddi biçimde daha dinamik doz yanit egrileri sergilemistir (Sekil 4).
Tablo 1: Açiklanan anti-PCT antikorlari ve bunlarin immünolojik testlerde kullanimi Adi Kaynak anti- Koyun Kalsiton anti- fare katakalsi Immünojen 1 16idaki amino asit pozisyonlari ni belirtir) Kalsitonin Katakalsin FRSALESSP Epitop sandviç natif (rakamlar, immünoloji PCT ile PCT 1- k testte test test amino asit pozisyonlarini belirtir) GTYTQDFNK evet evet ERDHRPHVS evet evet M; 102-111 n.d. evet hayir Referans (Morgenthaler, ve arkadaslari Clin Chem 2002;48:788- (Morgenthaler, ve arkadaslari Clin Chem 2002;48:788- (Kramer, ve arkadas] ari Ana] Bioanal Adi Kaynak PROC4 siçan 6C6 vb.
R2B7 tavsan antiseru 295/3H1 fare 98-47/44 fare Immünojen Epitop 1163daki 116,daki sandviç immünoloji 1- k testte test test asit amino asit pozisyonlari pozisyonlarini m belirtir) SDLERDHR n.d.
Amino- n.d.
APFRLSAL n.d. belirtir) N-terminal evet disinda Alanin gereklidir DSPRSKRC n.d. edilmistir edilmistir Referans (Kramer, ve arkadaslari Anal Bioanal (Whan g, ve arkadaslari J Endocrinol DE 10 2007 009751 US 6451311 98-31/04 fare Immünojen 1163daki pozisyonlari ni belirtir) fare Kalsitonin fare Katakalsin 1 163daki amino asit pozisyonlarini belirtir) TYTQDFN; 70- DMSSDLERD sandviç immünoloji edilmistir edilmistir Referans US 6451311 (Assicot, ve arkadaslari Lancet 8; Ghillani ve arkadaslari, Cancer Res (Assicot, ve arkadaslari Lancet 1993;341 Ghillani, ve arkadaslari Cancer Res Adi Kaynak Immünojen Epitop sandviç natif Referans (rakamlar, (rakamlar, immünoloji PCT ile 1163daki 116idaki edilmistir edilmistir amino asit amino asit pozisyonlari pozisyonlarini ni belirtir) belirtir) Tablo 2: Epitop eslestirme sonuçlari: PCT sekansinin tamaminin sekanslarini temsil eden gösterilen peptitlere üç antikor için gözlemlenen baglanma sinyalleri her antikor için elde edilen maksimum baglanma ile ilgilidir (B/Bmax). peptit# sekans FXlGS F W5H6 FX7A7 l APFRSALESSPAD %00 %00 %00 2 FRSALESSPADPA %00 %00 %00 3 SALESSPADPATL %00 %00 %00 4 LES SPADPATLSE %00 %00 %00 SSPADPATLSEDE %00 %00 %00 6 PADPATLSEDEAR %00 %00 %00 7 DPATLS EDEARLL %00 %00 %00 8 ATLSEDEARLLLA %00 %01 %00 peptit# sekans FXlGS FW5H6 FX7A7 9 LSEDEARLLLAAL %30 %00 %00 EDEARLLLAALVQ %03 %00 %00 1 1 EARLLLAALVQDY %17 %00 %00 LVQDYVQMKASEL %00 %00 %00 16 QDYVQMKASELEQ %00 %00 %00 17 YVQMKASELEQEQ %00 %00 %00 18 QMKASELEQEQER %00 %00 %00 19 KASELEQEQEREG %00 %00 %00 SELEQEQEREGSS %00 %00 %00 21 LEQEQEREGSSLD %00 %01 %00 22 QEQEREGSSLDSP %00 %00 %00 23 QEREGSSLDSPRS %00 %00 %00 peptit# sekans FXlGS FW5H6 FX7A7 GSSLDSPRSKRCG %00 %03 %01 26 SLDSPRSKRCGNL %00 %0.2 %03 27 DSPRSKRCGNLST %00 %00 %02 28 PRSKRCGNLSTCM %00 %00 %02 29 SKRCGNLSTCMLG %00 %00 %00 RCGNLSTCMLGTY %00 %00 %0.2 31 GNLSTCMLGTYTQ %0.] %00 %00 32 LSTCMLGTYTQDF %00 %00 %00 33 TCM LGTYTQDFNK %00 %00 %00 GTYTQDFNKFHTF %00 % l .9 %00 36 YTQDFNKFHTFPQ %00 %0.1 %00 37 QDFNKFHTFPQTA %04 %00 %00 38 FNKFHTFPQTAIG %00 %0.1 %00 39 KFHTFPQTAIGVG %02 %00 %00 40 HTFPQTAIGVGAP %00 %00 %00 peptit# sekans FX1G5 FW5H6 FX7A7 41 FPQTAIGVGAPGK %01 %00 %00 42 QTAIGVGAPGKKR %1.0 %01 %01 43 AIGVGAPGKKRDM %00 %00 %00 44 GVGAPGKKRDMSS %00 %00 %00 45 GAPGKKRDMSSDL %00 %06 %00 46 PGKKRDMSSDLER %00 %03 %0.] 47 KKRDMSSDLERDH %00 %00 %00 48 RDMSSDLERDHRP %00 %15 %00 50 SDLERDHRPHVSM %04 %15 %09 51 LERDHRPHVSMPQ %13 %15 %28 52 RDHRPHVSMPQNA %00 %01 %02 53 DHRPHVSMPQNAN %00 %00 %00 peptit# sekans TLSEDEARLLLAALVQDYVQ EARLLLAALVQDYVQMKASE LAALVQDYVQMKASELEQEQ QDYVQMKASELEQEQEREGS MKASELEQEQEREGSSLDSP LEQEQEREGSSLDSPRSKRC EREGSSLDSPRS KRCGNLST SLDSPRSKRCGNLSTCMLGT RSKRCGNLSTCMLGTYTQDF GNLSTCMLGTYTQDFNKFHT CMLGTYTQDFNKFHTFPQTA YTQDFNKFHTFPQTAIGVGA NKFHTFPQTAIGVGAPGKKR FPQTAIGVGAPGKKRDMSSD PGKKRDMSSDLERDHRPHVS FX1G5 FW5H6 FX7A7 peptit# sekans FX1G5 73 DMSSDLERDHRPHVSMPQNA %02 74 MSSDLERDHRPHVSMPQNAN %03 SEKANS LISTESI <110> B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft <`120> Immunoassay for the Detection of Procalcitonin <130> B60441PCT <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <2'11> 116 <2`12> PRT <213> Homo sapiens

Claims (1)

  1. ISTEMLER . Bir denekten alinan bir vücut sivisindan elde edilen bir biyolojik numunede SEKANS TANIM NO: l,de tanimlandigi gibi Prokalsitoninin veya bunun SEKANS TANIM NO: l,deki amino asit kalintilari 3-116°yi içeren bir fragmaninin saptanmasi için in vitro yöntem olup, asagidaki adimlari içermektedir: a. söz konusu numunenin Prokalsitonin içerisindeki farkli epitoplara yönelik en az iki antikorla veya bunlarin fonksiyonel fragmanlariyla temas ettirilmesi, ve b. söz konusu en az iki antikorun Prokalsitonine veya bunun söz konusu fragmanina baglanmasinin kalitatif olarak veya kantitatif olarak saptanmasi, burada baglanma söz konusu numunede Prokalsitoninin veya söz konusu fragmaninin varligini veya konsantrasyonunu belirtmektedir, burada en az bir antikor veya bunun fonksiyonel fragmani, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 25-37”yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik olup, burada antikor DSMZide DSM ACC2993 erisim numarasi altinda saklanan bir hibridoma hücre hatti ile üretilmistir ve burada bir diger antikor veya bunun fonksiyonel fragmani, Prokalsitoninin amino asit kalintilari 96-116” yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa veya Prokalsitoninin amino asit kalintilari 60-91,i kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yöneliktir ve burada söz konusu diger antikor veya bunun fonksiyonel fragmani bir monoklonal antikordur. . Prokalsitoninin amino asit kalintilari 25-37”yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik antikor veya bunun fonksiyonel bir fragmani olup, burada antikor DSMZ,de DSM ACC2993 erisim numarasi altinda saklanan bir hibridoma hücre hatti ile üretilmistir. . En azindan asagidakileri içeren kit: a. Prokalsitoninin amino asit kalintilari 25-37”yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik bir birinci antikor veya bunun fonksiyonel bir fragmani olup, burada antikor DSMZde DSM ACC2993 erisim numarasi altinda saklanan bir hibridoma hücre hatti ile üretilmistir, ve b. Prokalsitoninin amino asit kalintilari 96-116”yi kapsayan sekansta bulunan bir epitopa veya Prokalsitoninin amino asit kalintilari 60-9lli kapsayan sekansta bulunan bir epitopa yönelik bir ikinci antikor veya bunun fonksiyonel bir fragmani. . Istem 3`e göre bir kitin, bir vücut sivisindan elde edilen bir biyolojik numunede SEKANS TANIM NO: 1,de tanimlandigi gibi Prokalsitoninin veya bunun SEKANS TANIM NO: 1,deki amino asit kalintilari 3-1 16” yi içeren bir fragmaninin in vitro saptanmasi ve/veya ölçülmesi için bir sandviç immünolojik testte kullanimi. . Istem 1”e göre yöntemin, istem 2°ye göre antikorun veya istem 3*e göre kitin, bir vücut sivisindan alinan bir biyolojik numunede Prokalsitoninin veya bunun bir fragmaninin varliginin veya yoklugunun in vitro belirlenmesi için veya Prokalsitoninin veya bunun bir fragmaninin ölçülmesi için kullanimi. Yüksek Prokalsitonin seviyeleri ile iliskili bir hastaligin veya durumun in vitro tanisi, prognozu, risk siniflandirmasi, tedavi izlemesi, tedavi yönlendirmesi veya terapötik önlemlerin uygulanmasi amaci ile siniflandirilmasi için istem 5,e göre kullanim. . Istem 67ya göre kullanim olup, burada hastalik veya durum lokal bakteriyel enfeksiyonlar, sepsis, siddetli sepsis, septik sok, kardiyovasküler hastaliklar (akut koroner sendrom, kalp yetmezligi, koroner arter hastaligi, ateroskleroz, inme) dahil bulasici olmayan hastalik, kanser, diyabet, kronik gastrointestinal hastaliklar, kronik böbrek hastaliklari, hipertansiyon, osteoporoz dahi] ortopedik hastaliklar ve Alzheimer hastaligi dahil nörodejeneratif hastaliklardan olusan gruptan seçilmektedir. . DSMZlde DSM ACC2993 erisim numarasi altinda saklanan hibridoma hücre hatti.
TR2018/06292T 2009-04-28 2010-04-27 Prokalsi̇toni̇ni̇n saptanmasi i̇çi̇n i̇mmünoloji̇k test TR201806292T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09158983 2009-04-28
EP09165227 2009-07-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201806292T4 true TR201806292T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=42184142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/06292T TR201806292T4 (tr) 2009-04-28 2010-04-27 Prokalsi̇toni̇ni̇n saptanmasi i̇çi̇n i̇mmünoloji̇k test

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20120122114A1 (tr)
EP (1) EP2425259B1 (tr)
JP (2) JP6009938B2 (tr)
CN (1) CN102395887B (tr)
DK (1) DK2425259T3 (tr)
ES (1) ES2666332T3 (tr)
HK (1) HK1167180A1 (tr)
TR (1) TR201806292T4 (tr)
WO (1) WO2010125076A1 (tr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130046085A1 (en) * 2011-06-22 2013-02-21 Universidad De Sevilla Antibodies against n-procalcitonin
CN102759631B (zh) * 2012-08-02 2016-05-11 南京诺尔曼生物技术有限公司 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒
CN102928606B (zh) * 2012-11-16 2015-10-07 武汉明德生物科技股份有限公司 多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒
WO2014083232A1 (es) * 2012-11-30 2014-06-05 Servicio Andaluz De Salud Uso de péptidos o anticuerpos anti n-procalcitonina para el tratamiento de lesiones pulmonares
WO2015104443A1 (es) * 2014-01-08 2015-07-16 Servicio Andaluz De Salud Agentes moduladores de n-procalcitonina para la prevención y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas
CN104792997B (zh) * 2014-01-22 2017-07-11 天津汇滨生物科技有限公司 一种人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
DE102014106854A1 (de) 2014-05-15 2016-01-28 Odos Imaging Ltd. Bildgebendes System und Verfahren zum Überwachen eines Sichtfeldes
CN104090109A (zh) * 2014-07-25 2014-10-08 胡晓武 快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸及其检测方法
CN104745534B (zh) * 2015-03-02 2018-06-22 南方医科大学 一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2h4及单克隆抗体
CN111793133A (zh) * 2015-07-09 2020-10-20 南京诺尔曼生物技术有限公司 人源降钙素原的单克隆抗体其制备方法和用途
CN106841606B (zh) * 2017-03-28 2019-03-05 广州瑞博奥生物科技有限公司 检测pct的胶体金免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
JP7051096B2 (ja) * 2018-05-30 2022-04-11 国立大学法人山口大学 ウシプロカルシトニンを特異的に認識する抗体、その抗原結合断片、および、その使用
CN109055318A (zh) * 2018-07-31 2018-12-21 广东立诊得生物科技有限公司 杂交瘤细胞株a4-6a2及其产生的降钙素原单克隆抗体和应用
CN108998421A (zh) * 2018-07-31 2018-12-14 广东立诊得生物科技有限公司 杂交瘤细胞株a4-1b1及其产生的降钙素原单克隆抗体和应用
CN109652382A (zh) * 2018-12-12 2019-04-19 杭州华葵金配生物科技有限公司 一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用
JP7205691B2 (ja) * 2019-01-23 2023-01-17 ウシオ電機株式会社 抗イヌプロカルシトニン抗体及びこれを用いた検査用キット
CN112986585A (zh) * 2019-12-17 2021-06-18 上海奥普生物医药股份有限公司 一种降钙素原检测试剂盒、制备方法及用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
DE4227454C1 (de) * 1992-08-19 1994-02-03 Henning Berlin Gmbh Verfahren zur Früherkennung, zur Erkennung des Schweregrads sowie zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung einer Sepsis sowie Mittel zur Durchführung des Verfahrens
US20070037158A1 (en) * 2003-09-18 2007-02-15 Garvan Institute Of Medical Research Methods of modulating bone growth, bone remodeling and adiposity
DE102005034174A1 (de) * 2005-07-21 2007-02-08 B.R.A.H.M.S Ag Liquordiagnostisches in vitro Verfahren zur Diagnose von Demenz-Erkrankungen und neuroinflammatorischen Erkrankungen
CN1800384A (zh) * 2005-11-08 2006-07-12 浙江大学 降钙素原的制备方法
CN101029897A (zh) * 2007-02-09 2007-09-05 深圳市新产业生物医学工程有限公司 一种降钙素原测试试剂盒及其测试方法
DE102007009751A1 (de) * 2007-02-28 2008-09-04 B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft Verfahren zur selektiven Bestimmung von Procalcitonin 1-116 für diagnostische Zwecke sowie Antikörper und Kits zur Durchführung eines solchen Verfahrens
RU2342666C1 (ru) * 2007-07-02 2008-12-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Способ определения степени тяжести гестоза
EP2020603A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-04 BRAHMS Aktiengesellschaft Method for risk stratification in stable coronary artery disease

Also Published As

Publication number Publication date
CN102395887A (zh) 2012-03-28
CN102395887B (zh) 2015-04-08
DK2425259T3 (en) 2018-04-30
HK1167180A1 (en) 2012-11-23
JP6009938B2 (ja) 2016-10-19
EP2425259B1 (en) 2018-02-28
JP6100822B2 (ja) 2017-03-22
US10048280B2 (en) 2018-08-14
US20170131297A1 (en) 2017-05-11
ES2666332T3 (es) 2018-05-04
US20120122114A1 (en) 2012-05-17
WO2010125076A1 (en) 2010-11-04
EP2425259A1 (en) 2012-03-07
JP2012525568A (ja) 2012-10-22
US20190041408A1 (en) 2019-02-07
JP2015163877A (ja) 2015-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201806292T4 (tr) Prokalsi̇toni̇ni̇n saptanmasi i̇çi̇n i̇mmünoloji̇k test
JP7022969B2 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を診断するための方法および試薬
EP2828282B1 (en) Biomarkers
US11719697B2 (en) Immunoassay and antibodies for the detection of chromogranin A
EP2518084B1 (en) Method for measuring human insulin and measurement reagent
US9222946B2 (en) Composition of diagnostic biomarker for stomach cancer and method of diagnosing stomach cancer using the composition
WO2015064348A1 (ja) 糖鎖不全ヒトＩｇＡ１ヒンジ部を認識するモノクローナル抗体及びその用途
EP3019875B1 (en) Augurin immunoassay
KR20210011273A (ko) 지카 바이러스 외피 단백질 도메인 ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도
US20180156822A1 (en) Biomarker for cardiac disorders
CA2771954A1 (en) Pneumonia biomarkers
EP4070112B1 (en) A neo-epitope specific assay measuring protease mediated degradation of type iv collagen
WO2023190560A1 (ja) ヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するための方法、組成物、及びキット
JP2013541560A (ja) 組成物、抗体、喘息診断方法、及び抗体の調製方法