DE102007009751A1 - Verfahren zur selektiven Bestimmung von Procalcitonin 1-116 für diagnostische Zwecke sowie Antikörper und Kits zur Durchführung eines solchen Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur selektiven Bestimmung von Procalcitonin 1-116 für diagnostische Zwecke sowie Antikörper und Kits zur Durchführung eines solchen Verfahrens Download PDF

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Abstract

Immundiagnostisches Verfahren zur Bestimmung von Procalcitonin und Procalcitoninabkömmlingen in einer biologischen Probe eines Patienten für diagnostische Zwecke, insbesondere im Rahmen der Kontrolle und Steuerung der Therapie und der Überwachung des Verlaufs einer lokalen oder systemischen bakteriellen Infektion, Entzündung, Sepsis oder neurodegenerativen Erkrankung, bei dem man selektiv solche molekularen Formen des Procalcitonins oder davon abgeleiteter Procalcitoninteilpeptide bestimmt, die die Aminosäuren Alanin und Prolin (Ala Pro, AP) in den Stellungen 1 und 2 des Aminoterminus des vollständigen Procalcitonins 1-116 (SEQ ID NO:1) aufweisen, sowie Antikörper und Kits für die Durchführung eines solchen Verfahrens.

Description

  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der medizinischen Diagnostik, insbesondere die Bestimmung von Biomarkern in biologischen Flüssigkeiten mittels immundiagnostischer Methoden. Genauer betrifft die Erfindung die Bestimmung des Peptids Procalcitonin zu diagnostischen Zwecken, wobei ein bisher noch nicht erhältlicher selektiver Messwert für das vollständige Procalcitonin 1–116 ermittelt und insbesondere für eine empfindlichere Früherkennung, Therapiekontrolle und Verlaufskontrolle von systemischen und lokalen Infektionen, insbesondere von bakteriellen Infektionen und von Sepsis, genutzt wird.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden dabei Begriffe wie "Diagnostik" oder "für diagnostische Zwecke" als Oberbegriff für medizinische Bestimmungen gebraucht, denen je nach dem klinischen Zustand des Patienten, bei dem die Bestimmung durchgeführt wird, unterschiedliche Fragestellungen zugrunde liegen können und die insbesondere der Erkennung und Früherkennung, der Bestimmung des Schweregrads und der Verlaufsbeurteilung, auch der therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung, und der Prognose des zukünftigen Verlaufs einer Erkrankung und der Risikostratifizierung von Patienten die nen. Auch wenn in der nachfolgenden Beschreibung ein besonderes Augenmerk einer verbesserten Verlaufs- und Therapiekontrolle gilt, ist damit keine Einschränkung des Begriffs "für diagnostische Zwecke" auf derartige spezielle diagnostische Ziele verbunden.
  • Das reife Prohormon Procalcitonin (PCT) ist ein aus 116 Aminosäuren bestehendes Peptid, das zuerst als Vorläufer des wichtigen Hormons Calcitonin (Thyreocalcitonin) diskutiert wurde und dessen vollständige Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1) seit langem genauso bekannt ist wie die Details seines normalen proteolytischen Abbaus, der zur Freisetzung des reifen Hormons Calcitonin und anderer kürzerer Peptide, darunter insbesondere des sogenannten Katacalcins (Procalcitonin 96–116) und eines N-terminalen Peptids (N-Procalcitonin 1–57), führt, die hierin, neben anderen, als "PCT-Teilpeptide" bezeichnet werden. Wie z. B. in den Patenten EP 0 656 121 31 bzw. US 5,639,617 der Anmelderin und in Veröffentlichungen wie ASSICOT M., GENDREL D., CARSIN H., RAYMOND J., GUILBAUD J., BOHUON C. (1993): High serum Procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection. Lancet 341: 515–518, genauer erläutert wird, wird bei schweren bakteriellen Infektionen und gewissen Parasiten- und Pilzinfektionen mit systemischer inflammatorischer Reaktion die Freisetzung von PCT in den Kreislauf induziert, wo es in sehr hohen, gut messbaren Mengen gefunden wird (vgl. z. B. auch die Übersichtsdarstellungen in O'CONNOR E., VENKATESH B., LIPMAN J., MASHONGONYIKA C., HALL J. (2001): Procalcitonin in critical Illness. Critical Care and Resuscitation 3: 236–243; WHICHER I., BIENVENU J., MONNERET G. (2001): Procalcitonin as an acute Phase marker. Annals of Clinical Biochemistry 38: 483–893; BECKER K. L., NYLEN E. S., WHITE J. C., MUELLER B., SNIDER R. H. (2004): Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection, and sepsis: a journey from calcitonin back to its precursors. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 89: 1512–1525). Virale, Autoimmun- und allergische Erkran kungen führen dagegen nicht zu einer nennenswerten Erhöhung der messbaren PCT-Konzentration im Blut. PCT reflektiert den Schweregrad einer bakteriellen Infektion und wird als Marker für die Diagnose und das therapeutische Monitoring von Sepsis, schwerer Sepsis und septischem Schock bakteriellen Ursprungs verwendet (DANDONA P., NIX D., WILSON M. F., ALJADA A., LOVE J., ASSICOT M., BOHUON C. (1994): Procalcitonin increase after endotoxin injection in normal subjects. Journal of Clinical Endocrinolgy and Metabolism 79: 1605–1608; GENDREL D., ASSICOT M., RAYMOND J., MOULIN F., FRANCOUAL C., BADOUAL J., BOHOUN C. (1996): Procalcitonin as a marker for the early diagnosis of neonatal infection. Journal of Pediatrics 128: 570–573; SNIDER R. H. JR., NYLEN E. S., BECKER K. L. (1997): Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation: immunochemical characterization. Journal of Investigative Medicine 45: 552–560; WHANG K. T., STEINWALD P. M., WHITE J. C., NYLEN E. S., SNIDER R. H., SIMON G. L., GOLDBERG R. L., BECKER K. L. (1998): Serum calcitonin precursors in sepsis and systemic inflammation. Journal of Clinical Endocrinolgy and Metabolism 83: 3296–3301; MUELLER B., BECKER K. L., SCHACHINGER H., RICKENBACHER P. R., HUBER P. R., ZIMMERLI W., RITZ R. (2000): Calcitonin precursors are reliable markers of sepsis in a medical intensive care unit. Critical Care Medicine 28: 977–983). Auf das in den genannten Patenten und Literaturstellen niedergelegte allgemeine Fachwissen wird zur Ergänzung der vorliegenden Beschreibung ausdrücklich verwiesen.
  • Die Bestimmung von PCT läßt sich auch zu differentialdiagnostischen Zwecken nutzen, da sich anhand der messbaren PCT-Konzentrationen in Serum und Plasma entzündliche Erkrankungen aufgrund bakterieller Infektionen von solchen nicht-infektiöser Ätiologie unterscheiden lassen (vgl. auch EP 0 880 702 B1 ). Diese Unterscheidungsmöglichkeit hat sich als sehr wertvoll zur Steuerung des Einsatzes von Antibiotika in der Therapie erwiesen, indem vermieden werden kann, Antibiotika auch in Fällen zu verabreichen, in denen sie mangels einer bakteriellen Infektion des Patienten nicht wirksam sind.
  • Es wurde auch schon versucht, Procalcitonin bei Infektionen in Liquor cerebrospinalis (CSF) zu bestimmen. Dabei wurde in allen in der Literatur beschriebenen Fällen mit einem für die Sepsisdiagnostik entwickelten kommerziellen Assay gearbeitet, der eine funktionale Assay-Sensitivität (FAS) von nur 300 ng/l aufwies. Die erhaltenen Messergebnisse waren widersprüchlich. Wie in der soeben veröffentlichten Patentanmeldung DE 10 2005 034 174.8 bzw. in WO 2007/009789 beschrieben wird, können jedoch signifikantere Messergebnisse erhalten werden, wenn man mit einem sensitiveren Assay arbeitet, wie er seit einiger Zeit ebenfalls zur Verfügung steht. Mit einem solchen Assay wird auch bei neurodegenerativen Erkrankungen eine signifikante Korrelation der messbaren PCT-Immunreaktivität mit der Schwere der Erkrankung erhalten. Auch wenn im Folgenden auf die Bestimmung von PCT in CSF nicht spezieller eingegangen wird, liegt es ausdrücklich im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das hierin beschriebene erfindungsgemäße Verfahren auch auf diesem Teilgebiet der Diagnostik einzusetzen.
  • Auch eine Bestimmung in Urin wird von der vorliegenden Erfindung grundsätzlich mitumfasst.
  • Die Bestimmung von PCT erfolgt, wie in den oben genannten Patenten und Literaturstellen beschrieben, geeigneter Weise mit Immunoassays vom Sandwichtyp unter Verwendung von zwei Antikörpern, die so an die Aminosäuresequenz des vollständigen PCT-Peptids binden, dass das vollständig unter Freisetzung von Calcitonin prozessierte PCT nicht erfasst wird, dagegen das gesamte unprozessierte PCT sowie gegebenenfalls auch solche längeren PCT-Teilpeptide, die noch beide Bindungsstellen für die beiden in einem Sandwichassay verwendeten Antikörper innerhalb eines einzigen Moleküls aufweisen, wobei zwischen ggf. terminal modifizierten PCT-Formen nicht unterschieden werden kann. In den herkömmlichen Verfahren wird mit zwei Antikörpern gearbeitet, die, allgemein gesprochen, an solche Abschnitte des vollständigen PCT-Peptids binden, die bei der proteolytischen Prozessierung von PCT unter Bildung von Calcitonin auf verschiedenen der gebildeten PCT-Teilpeptide zu liegen kommen oder die auf PCT-Teilpeptiden liegen, die die Calcitonin-Sequenz nicht umfassen.
  • Dass bei Sepsis in Serum oder Plasma nicht oder wenigstens nicht in erster Linie das vollständige PCT 1–116 (SEQ ID NO:1) gefunden wird wird, sondern ein um zwei Aminosäuren verkürztes PCT 3–116 (SEQ ID NO:2), wird erläutert in EP 1 121 600 A1 bzw. EP 1 408 334 A1 oder US 6,756,483 , auf die zur Ergänzung der vorliegenden Beschreibung verwiesen wird. Ferner wird in diesem Zusammenhang verwiesen auf die Publikation: WEGLÖHNER W, STRUCK J, FISCHER-SCHULZ C, MORGENTHALER NG, OTTO A, BOHUON C, BERGMANN A: Isolation and characterization of serum procalcitonin from patients with sepsis. Peptides 2001; 22: 2099–103. Wie in den genannten Veröffentlichungen erläutert wird, war das einzige in den untersuchten Proben von Sepsispatienten charakterisierbare Biomolekül mit Procalcitonin-Immunreaktivität das erwähnte Procalcitonin 3–116 (SEQ ID NO:2). In der weiteren Arbeit: WRENGER S, KAHNS T, BOHUON C, WEGLÖHNER W, ANSORGE S, REINHOLD D: Amino-terminal truncation of procalcitonin, a marker for systemic bacterial infections, by dipeptidyl peptidase IV (DP IV); FERS Lett 2000; 466: 155–9; wird gezeigt, dass dieses Procalcitonin 3–116 aus einem synthetische hergestellten Procalcitonin 1–116 durch Einwirkung der Dipeptidyl-aminopeptidase IV (DAP IV; DP IV; CD 26; E. C 3.4.14.5) erhalten werden kann.
  • Keiner der genannten Veröffentlichungen ist zu entnehmen, ob das im Falle von Sepsis und Infektionen charakterisierte Procalcitonin 3–116 direkt sekretiert wird, oder ob es nachträglich proteolytisch aus einem "vollständigen" Vorläufer in Form des intermediär in die Zirkulation abgegebe nen Procalcitonin 1–116 (PCT 1–116) gebildet wird. Genausowenig ist den genannten Veröffentlichungen zu entnehmen, ob ein "vollständiges Procalcitonin" 1–116 in den untersuchten biologischen Proben (Vollblut bzw. Serum oder Plasma) in messbaren Stationärkonzentrationen vorkommt und ob es einen nennenswerten Beitrag zu dem bei der herkömmlichen Procalcitonin-Bestimmung erhaltenen Messsignal liefert.
  • Zur Bestimmung der Procalcitonin-Immunreaktivitäten in Serum/Plasma existieren verschiedene kommerzielle Assays der Anmelderin, z. B. der Chemilumineszenz-Assay B. R. A. H. M. S PCT LIA (B. R. A. H. M. S AG), der eine FAS von etwa 300 ng/l aufweist und auf die PCT-Bestimmung bei Sepsis zugeschnitten ist, wo sehr hohe PCT-Konzentrationen auftreten können. Für die PCT-Bestimmung mit einer höheren Sensitivität wurde in jüngerer Zeit ein abgewandelter Sandwichimmunoassay entwikkelt, der mit einem affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper arbeitet und der in näheren Einzelheiten in MORGENTHALER N. G., STRUCK J., FISCHER-SCHULZ C., BERGMANN A. (2002): Sensitive immunoluminometric assay for the detection of procalcitonin. Clinical Chemistry 48: 788–789 beschrieben wird und als B. R. A. H. M. S PCTsensitiv LIA (B. R. A. H. M. S AG) erhältlich ist. Dieser Assay weist eine deutlich bessere funktionalen Assay-Sensitivität (FAS) von 7 ng/l auf. Mit Hilfe dieses Assays war es möglich, bei gesunden Personen eine mittlere PCT-Serumkonzentration von 13.5 ng/l (13.5 pg/ml) zu ermitteln, wobei Werte zwischen < 7 bis 63 ng/l gefunden wurden und das 97.5% Perzentil bei 42.5 ng/l lag.
  • Um dem Klinikarzt eine rasche Überprüfung des Status eines potentiellen Sepsispatienten direkt in der Klinik ("Point-of-Care") zu ermöglichen, wird ferner ein Ein-Schritt-Schnelltest in Form eines immunchromatographischen Assays zur raschen semiquantitativen Bestimmung von Procalcitonin im Humanserum oder Humanplasma eines Patienten angeboten (PCT-Q; B. R. A. H. M. S Aktiengesellschaft).
  • Wie sich beispielsweise aus den oben zitierten Veröffentlichungen und Übersichtsartikeln ergibt, hat die Bestimmung des Biomarkers Procalcitonin inzwischen einen festen Platz in der klinischen Routine gefunden, und zwar in erster Linie zur Sepsis-Früherkennung. Grund für den Erfolg ist eine zuverlässige Korrelation von Sepsis bzw. bakteriellen Infektionen mit einem Anstieg der messbaren PCT-Immunreaktivität im Blut bzw. Serum/Plasma der Patienten, sowie eine relativ einfache Messbarkeit dieser PCT-Immunreaktivität aufgrund der hohen Konzentrationen, die im Blut von Sepsispatienten erreicht werden, bedingt durch die hohe Stabilität des bei der Messung wenigstens vorrangig erfassten PCT 3–116.
  • Trotz dieser unbestreitbaren Vorteile der Bestimmung der PCT-Immunreaktivität mit den bisher dafür zur Verfügung stehenden Assays gelangten die Erfinder nunmehr jedoch zu der Erkenntnis, dass die hohe Stabilität und die hohen Konzentrationen der gemessenen PCT-Immunreaktivität für bestimmte klinisch relevante diagnostische Fragestellungen auch mit gewissen Nachteilen verknüpft sind:
    Eine hohe Stabilität oder "Langlebigkeit" eines Analyten, z. B. eines Peptids wie PCT 3–116, bedeutet, dass die Messung eines solchen Analyten eine Art summarische Information über die bereits abgelaufenen sekretorischen Aktivitäten für einen längeren Zeitraum liefert. Nimmt man z. B. eine mehr oder weniger kontinuierliche Produktion eines Analyten während eines akuten Krankheitsgeschehens an, sammelt sich der stabile Analyt in der biologischen Probe an, und in seinen messbaren Konzentrationen spiegelt sich seine zurückliegende physiologische Produktion kumulativ wieder, allerdings vermindert um seine im gleichen Zeitraum erfolgte Konzentrationsverminderung nach Maßgabe seiner physiologischen Clearance-Geschwindigkeit (seines Verschwindens aus der Probe aufgrund seiner Umwandlung in analytisch nicht erfassbare Abbauprodukte, seine Ausscheidung über die Nieren oder aufgrund anderer an sich bekannter physiologischer Mechanismen). Je langlebiger ein Analyt ist, bzw. je geringer seine Clearance-Geschwindigkeit ist, desto geringer ist der Einfluss des genauen Messzeitpunkts auf die Bestimmung der o. g. "Bildung" oder "Sekretion" des Analyten. Z. B. kann in diesem Bild eine über längere Zeiträume konstante Konzentration bedeuten, dass sich Bildung und Clearance die Waage halten. Sinkt die Konzentration, so kann das darauf hindeuten, dass sich die Sekretion des Analyten, die im Sinne einer "Konzentrationsauffrischung" wirkt, vermindert hat. Trotzdem kann die Konzentration des Analyten im Blut immer noch hohe Werte aufweisen. Sind jedoch die messbaren Konzentrationswerte hoch, und ist die Clearance-Geschwindigkeit gering, äußern sich Veränderungen bei der Sekretion eines Analyten nur als relativ geringe, schwer interpretierbare Veränderungen von relativ großen Zahlen.
  • Ist der Kliniker jedoch gerade an der raschen Feststellung von Veränderungen der Sekretion des Analyten interessiert, z. B. weil er anhand dieser Veränderungen Rückschlüsse auf einen Therapieerfolg oder einen Rückfall oder eine Neuinfektion ziehen möchte, ist es häufig schwierig, eine solche Veränderung anhand der gemessenen Konzentrationswerte "langlebiger" Analyten rasch und eindeutig zu erkennen.
  • Die Erfinder stellten sich daher die Aufgabe, die Bestimmung von Procalcitonin in dem Sinne zu verbessern, dass Veränderungen der Procalcitonin-Sekretion rasch und zuverlässig erkannt werden können, so dass sich die Zeiträume für eine Erkennung eines Therapieerfolgs bzw. die Einleitung nötigenfalls erforderlicher therapeutischer Interventionen verkürzen, und dass zusätzliche, bisher nicht verfügbare Informationen gewonnen werden können, die sofort Rückschlüsse darüber ermöglichen, wie weit eine Infektion/Sepsis bereits fortgeschritten ist, wenn der Arzt den Patienten zum ersten Mal zu beurteilen hat.
  • Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 12 sowie durch die Schaffung der für ein solches Verfahren benötigten neuen Antikörper gemäß den Ansprüchen 13 bis 15 sowie die entsprechenden Kits gemäß den Ansprüchen 16 bis 22 gelöst.
  • Weitere wichtige Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung und den Erläuterungen zu den Beispielen, insbesondere aus den Diskussionen der angeführten Messergebnissen, wobei auf diese Erläuterungen und Beispiele ausdrücklich ergänzend Bezug genommen wird.
  • Am Anfang der Überlegungen der Erfinder stand die Annahme, dass das Peptid Procalcitonin, das nach den herkömmlichen Bestimmungsverfahren als PCT-Immunreaktivität bestimmt wird, vermutlich aus seinem zugehörigen Pre-Peptid (Pre-Procalcitonin; Pre-PCT) mit 141 Aminosäuren gebildet wird, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist (SEQ ID NO:3). Wie generell für viele Prohormone bekannt ist, wird PCT wird aus diesem längeren Vorläufermolekül durch Abspaltung der Signalsequenz gebildet. Die Spaltstelle ist zwar experimentell nicht bestimmt worden, jedoch haben Signalsequenzen im allgemeinen ähnliche Muster, so dass Spaltstellen mit hoher Wahrscheinlichkeit vorhergesagt werden können. Im Falle von Pre-PCT sollte die Signalsequenz die Aminosäuren 1 bis 24 des Pre-PCT (SEQ ID NO:3) umfassen. Daraus folgt, dass die aminoterminale Aminosäure in Position 1 des Prohormons PCT der Aminosäure 25 des Pre-PCT (SEQ ID NO:3) entspricht. Aufgrund solcher Überlegungen wurde ursprünglich davon ausgegangen, dass das bei Sepsis in der Zirkulation gefundene PCT nach Abspaltung der Signalsequenz 116 Aminosäuren umfasst und die Aminosäuresequenz PCT 1–116 (SEQ ID NO:1) aufweist. Da in Proben von Sepsispatienten jedoch nur PCT 3–116 (SEQ ID NO:3) charakterisiert werden konnte, blieb die Frage einer intermediären Sekretion von PCT 1–116 und der evtl. erreichten Konzentrationen eines solchen PCT 1–116 in der Zirkulation offen. Dabei ist noch einmal darauf hinzuweisen, dass die bisher zur Bestimmung einer Procalcitonin-Immunreaktivität eingesetzten Assays vom Sandwichtyp mit Kombinationen von zwei Antikörpern arbeiten, die keine Unterscheidung zwischen PCT 1–116 und 3–116 gestatten. Die bekannten Assays können daher naturgemäß die genannten verschiedenen Formen des PCT nicht selektiv erfassen, und sie erfassen daher auch nicht eventuelle charakteristische Veränderungen der relativen molaren Mengen der genannten Analyten, sollte es im Verlauf eines Krankheitsgeschehens, z. B. im Verlauf einer Sepsis, zu solchen Veränderungen kommen. Die mit einem herkömmlichen Assay bestimmte PCT-Immunreaktivität wird daher in der vorliegenden Anmeldung auch als "PCT-Gesamt" bezeichnet.
  • Die Erfinder entschieden sich in dieser Situation, eine neue Art von Verfahren zur immundiagnostischen Bestimmung von Procalcitonin zu schaffen, mit dem selektiv nur solche Procalcitonin-Fraktionen erfasst werden, die auch die beiden ersten Aminosäuren des Procalcitonin 1–116 aufweisen, und unter Einsatz dieses neuen Verfahren zu prüfen, ob damit klinisch relevante Messergebnisse erhalten werden können, die sich qualitativ von den Ergebnissen der bisherigen Bestimmung der Procalcitonn-Immunreaktivität abheben Wie im nachfolgenden experimentellen Teil näher beschrieben wird, entwickelten die Erfinder zuerst neue Antikörper mit den für eine klinische Bestimmung erforderlichen Bindungseigenschaften, so dass sie nur solche Procalcitoninmoleküle erkennen, die die am Aminoterminus vollständige Procalcitoninsequenz mit den beiden ersten Aminosäuren (Ala-Pro) des Procalcitonin 1–116, oder die wenigstens die Aminosäure 2 (Pro) enthalten. Diese neuen Antikörper setzten sie dann in einem Assay vom Sandwichtyp ein, der eine selektive Bestimmung von PCT 1–116 in einer biologischen Probe eines humanen Patienten ermöglicht, z. B. in Serum oder insbesondere in Plasma, ohne dass der Messwert durch die Anwesenheit des PCT 3–116 (SEQ ID NO:2) in der Probe beeinflusst wird.
  • Die unter Verwendung eines solchen Assays erhaltenen Messergebnisse erfüllten, wie nachfolgend im experimentellen Teil der Anmeldung gezeigt wird, die Hoffnungen der Erfinder auf die angestrebte Verbesserung der diagnostischen Bestimmung von Procalcitonin für die o. g. besonderen diagnostischen Zwecke.
  • Es wurde nämlich festgestellt, dass in frischen Proben von humanem Serum und insbesondere von frischem humanem Plasma von Patienten signifikante, gut messbare Konzentrationen von PCT 1–116 vorhanden sind. Die von den Erfindern in solchen Proben gefundenen molaren Konzentrationen für PCT 1–116 liegen im Bereich von etwa 1/5 bis 1/8 der nach traditionellen Verfahren parallel messbaren molaren Konzentrationen für die PCT-Immunreaktivität ("PCT-Gesamt").
  • Nimmt man an, dass das gesamte in die Zirkulation ausgeschüttete PCT primär als PCT 1–116 ausgeschüttet wird, folgt, dass zu einem hypothetischen Zeitpunkt des Beginns der PCT-Ausschüttung die Konzentrationen für PCT 1–116 und für PCT-Gesamt gleich sein müssen, so dass ein maximaler hypothetischer Anfangs-Grenzwert von 1,0 für das Verhältnis PCT 1–116 zu PCT-Gesamt angenommen werden kann. Verhältnisse im Bereich von etwa 1/5 bis 1/8, wie sie von den Erfindern in den untersuchten Proben gefunden wurden, enthalten daher bereits per se eine Information über die Vorgeschichte der Probe, z. B. im Sinne der bereits durchlaufenen Dauer und/oder Schwere der Infektion/Sepsis. Aufgrund der geringeren Stabilität von PCT 1–116 (wegen der Umwandlung in PCT 3–116) spiegeln das genannte Verhältnis und die feststellbaren Konzentrationsveränderungen für PCT 1–116 den Akutstatus eines Patienten sehr viel direkter wider als die Werte für das stabilere PCT 3–116. Die selektive Bestimmung von PCT 1-116 führt daher zu erheblichen diagnostischen Fortschritten. Diese zeigen sich insbesondere auch dann, wenn die erfindungsgemäße selektive Bestimmung des PCT 1–116 mit Hilfe des neuen Verfahrens mit der herkömmlichen Bestimmung der gesam ten PCT-Immunreaktivität (PCT-Gesamt) kombiniert wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren weist besondere Vorteile in Fällen auf, in denen eine rasche Erfassung des aktuellen Krankheitsstatus eines Patienten wünschenswert ist. Grundsätzlich kann es jedoch in allen Fällen zur Anwendung kommen, in denen bisher die bekannten Verfahren zur Bestimmung der PCT-Immunreaktivität zu Anwendung kamen. Solange eine Bestimmung selektiv für PCT 1–116 mit beiden aminoterminalen Aminosäuren (Ala-Pro), oder wenigstens für ein Procalcitonin mit der Aminosäure in Stellung 2 (Pro), ist, ist das Verfahren als eines gemäß der vorliegenden Erfindung zu betrachten. Das spezielle gewählte Assayformat spielt dabei eine eher untergeordnete Rolle, und ein spezielles Assayformat wird in erster Linie unter praktischen, messtechnischen Gesichtspunkten ausgewählt.
  • Obwohl daher im experimentellen Teil dieser Anmeldung ein konkretes Verfahren vom Sandwichtyp unter Verwendung konkreter Antikörper (monoklonaler Antikörper) beschrieben und zur Messung eingesetzt wird, ist die vorliegende Erfindung nicht auf dieses konkrete Verfahren oder ein Verfahren eines ähnlichen Typs beschränkt. Sie erfasst vielmehr beliebige immundiagnostische Verfahren, die im Sinne der vorliegenden Erfindung eine selektive Bestimmung von PCT 1–116 ermöglichen, ohne dass der Messwert durch gleichzeitig vorhandene andere PCT-Abkömmlinge, insbesondere PCT 3–116, beeinflusst wird.
  • Es versteht sich für den Fachmann, dass z. B. anstelle des beschriebenen Assays vom Sandwichtyp auch Assays vom kompetitiven Typ (z. B. mit einem immobilisierten selektiven Antikörper und einem markierten/selektiv markierbaren Analogen des Analyten, das mit PCT 1–116 kompetiert; oder mit einem immobilisierten Analogen und einem markierten selektiven Antikörper) oder andere Assayformate, z. B. sogenannte turbidometrische Assays, zu Anwendung kommen können.
  • Prinzipiell kann dabei jeder bekannte und für diagnostische Assays geeignete Marker zum Einsatz kommen (d. h. anstelle der in den Beispielen eingesetzten Lumineszenzmarkierung können z. B. auch Radioisotope, Enzyme, Fluoreszenz-, andere Chemolumineszenz- oder Biolumineszenz-Label und direkt optisch detektierbaren Farbmarkierungen, wie beispielsweise Goldatomen und Farbstoffteilchen, wie sie bei Schnelltests eingesetzt werden, genutzt werden).
  • Es liegt ferner ausdrücklich auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das erfindungsgemäße Verfahren als Schnelltest, z. B. in Form eines immunchromatographischen Bestimmungsverfahrens, auszugestalten.
  • Wird das Verfahren als heterogenes Verfahren ausgestaltet, bei dem ein spezifischer Binder in immobilisierter Form an eine Festphase gebunden vorliegt und/oder die Reaktionsprodukte wenigstens teilweise an eine Festphase immobilisiert werden, kann die Festphase jede beliebige geeignete Festphase sein, z. B. die Wand eine Teströhrchens, eine partikelförmige Festphase, z. B. in Form von in der Reaktionslösung suspendierten Magnetpartikeln, oder auch eine Festphase in Form eines Trägers einer immunchromatographischen Vorrichtung (für einen Schnelltest).
  • Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren als heterogener Sandwich-Immunoassay durchgeführt, bei dem einer der Antikörper an die Wände beschichteter Teströhrchen (z. B. aus Polystyrol; "Coated Tubes"; CT) oder an Mikrotiterplatten, zum Beispiel aus Polystyrol, oder an Partikel, beispielsweise Magnetpartikel, immobilisiert ist, während der andere Antikörper einen Rest trägt, der ein direkt nachweisbares Label darstellt oder eine selektive Verknüpfung mit einem Label ermöglicht und der Detektion der gebildeten Sandwich-Strukturen dient. Auch eine zeitlich verzögerte bzw. nachträgliche Immobilisierung unter Verwendung geeigneter Festphasen ist möglich.
  • Das Verfahren muss jedoch nicht als heterogenes Verfahren ausgestaltet sein, bei dem mindestens ein spezifischer Binder in immobilisierter Form vorliegt. Alle Reaktanten und Reaktionsprodukte können auch in homogener flüssiger Phase suspendiert vorliegen und dort für die Messung verbleiben. In einem solchen Fall ist es bevorzugt, beide für die Bestimmung verwendeten Antikörper mit Teilen eines Nachweissystems zu markieren, das dann, wenn beide Antikörper in einen einzigen Sandwich integriert werden, eine Signalerzeugung oder Signalauslösung ermöglicht. Derartige Techniken sind insbesondere als Fluoreszenzverstärkungs- oder Fluoreszenzlöschungs-Nachweisverfahren ausgestaltbar. Ein besonderes bevorzugtes derartiges Verfahren betrifft die Verwendung von paarweise einzusetzenden Nachweisreagenzien, wie sie beispielsweise beschrieben sind in US-A-4 822 733 , EP-B1-180 492 oder EP-B1-539 477 und dem darin zitierten Stand der Technik. Sie ermöglichen eine Messung, die selektiv nur Reaktionsprodukte erfaßt, die beide Markierungskomponenten in einem einzigen Immunkomplex enthalten, direkt in der Reaktionsmischung. Als Beispiel ist auf die unter den Marken TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) bzw. KRYPTOR® angebotene Technologie zu verweisen, die die Lehren der o. g. Anmeldungen umsetzt.
  • Es wird ferner davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren mit Vorteil auch im Rahmen einer sogenannten Multiparameterdiagnostik zur Anwendung kommen kann. Weitere dabei bestimmte Parameter sind beispielsweise Sepsis- und Infektionsparameter, die z. B. aus einer Gruppe ausgewählt sein können, die besteht aus Anti-Gangliosid-Antikörpern, den Proteinen Gesamt-Procalcitonin (PCT-Gesamt), Procalcitonin 3–116, CA 125, CA 19-9, S100B, S100A-Proteinen, LASP-1, löslichen Cytokeratin-Fragmenten, insbesondere CYFRA 21, TPS und/oder löslichen Cytokeratin-1-Fragmenten (sCY1F), den Peptiden Inflammin und CHP, anderen Peptid-Prohormonen wie insbesondere pro-ANP, pro-BNP, pro-Adrenomedullin, pro-Endothelin, pro-Vasopressin und deren diagnostisch nutzbaren Peptidfragmenten, der Glycin-N-Acyltransferas (GNAT), der Carbamoylphosphat Synthetase 1 (CPS 1) und dem C-reaktiven Protein (CRP), Cytokinen, z. B. vom Interferon-Typ, oder geeigneten Fragmenten davon. Bei den genannten Multiparameter-Bestimmungen kann vorgesehen sein, die Messergebnisse für mehrere Parameter gleichzeitig oder parallel zu bestimmen und z. B. mit Hilfe eines Computerprogramms, das auch diagnostisch signifikante Parameterkorrelationen nutzt, auszuwerten.
  • Eine besonders wichtige Kombinationsmessung ist eine parallele selektive Messung von PCT 1–116 und der üblichen PCT-Immunreaktivität (PCT-Gesamt), die sich im Lichte der Ergebnisse der vorliegenden Anmeldung als eine summarische Messung der in eine Probe enthaltenen Konzentrationen von PCT 1–116 plus PCT 3–116 darstellt. Zu den Vorteilen einer derartigen Messung wird ausdrücklich auf die nachfolgenden Beispiele verwiesen.
  • Es ist ferner möglich, selektive Messungen von PCT 1–116 und PCT 3–116 zu kombinieren. Die Erfinder haben derartige Kombinationsmessungen unter Verwendung eines für PCT 3–116 selektiven monoklonalen Antikörpers ebenfalls durchgeüfhrt (Ergebnisse nicht gezeigt). Da in die Konzentrationen von PCT 3–116 direkt die beim proteolytischen Abbau von PCT 1–116 ständig neu gebildeten Konzentrationen von PCT 3–116 eingehen, ist die Auswertung der Vergleichmessunge jedoch komplexer. Außerdem hat es den Anschein, dass es am Aminoterminus von PCT 3–116 zu einem weiteren proteolytischen Abbau kommen kann, wodurch die Messergebnisse verfälscht werden. Eine Kombinationsmessung von PCT 1–116 mit einer selektiven Messung von PCT 3–116 ist daher derzeit weniger bevorzugt.
  • In den nachfolgenden Beispielen wird auf Figuren Bezug genommen, in denen:
  • 1 eine Standardkurve eines Sandwich-Assays zur selektiven Bestimmung von PCT 1–116 zeigt, wie er im experimentellen Teil näher beschrieben wird;
  • 2 eine Standardkurve eines herkömmlichen B. R. A. H. M. S PCT LIA nach Anpassung der Eichkurve an die Einheit pmol/L zeigt;
  • 3 Vergleichende Messungen der Veränderung der Konzentration von PCT 1–116 mit dem erfindungsgemäßen Assay (Dreiecke) und der Konzentration von PCT-Gesamt mit einem kommerziellen Assay (B. R. A. H. M. S PCT LIA; Quadrate) zeigt, jeweils bezogen auf die zugeordneten Ausgangskonzentrationen an Tag 0 und gemessen in EDTA-Plasmen von acht erfolgreich behandelten Sepsispatienten einer Intensivstation;.
  • 4 Ergebnisse der Ermittlung des molaren Verhältnisses von PCT 1–116 zu PCT-Gesamt in Proben gemäß 3 und dessen zeitliche Veränderung innerhalb von 3 Tagen zeigt;
  • EXPERIMENTELLER TEIL
  • I. ASSAYENTWICKLUNG – Peptidsynthesen und Antikörperentwicklung
  • I.1. Peptidsynthesen
  • Als Antigenbestandteile zur Antikörpererzeugung, als selektive Bindungspartner zur Affinitätsreinigung und zum Epitopmapping sowie als potentielle Standards und Kompetitoren wurden die folgenden Peptide synthetisch erzeugt:
    Abgeleitet von der bekannten Aminosäuresequenz von Pre-Procalcitonin (Pre-PCT; SEQ ID NO:3) wurden mehrere Teilpep tid-Bereiche ausgewählt und nach Standardverfahren als lösliche Peptide chemisch synthetisiert. Diese wurden gereinigt, mittels Massenspektrometrie und Reversed Phase HPLC qualitätskontrolliert und in Aliquots lyophilisiert (Firma JPT, Berlin, Deutschland). Die Aminosäuresequenzen der synthetischen Peptide lauten (die angegebenen Aminosäurepositionen sind bezogen auf Pre-PCT; Aminosäure 25 entspricht der Aminosäure 1 des PCT 1–116 gemäß SEQ ID NO:1):
    Figure 00170001
  • I.2. Entwicklung, Markierung und Charakterisierung von Antikörpern mit Spezifität für den N-Terminus von PCT 1–116
  • I.2.1. Entwicklung und Selektion von monoklonalen Antikörpern
  • Monoklonale Antikörper wurden nach Standardverfahren entwickelt, wie z. B. von Harlow und Lane beschrieben wird (Harlow E., Lane D. „Antibodies – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, ISBN 0-87969-314-2). Die Entwicklung wird im Folgenden zusammenfassend genauer dargestellt:
    Mittels MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid Ester) wurde das Peptid PAS10 (SEQ ID NO:4; Aminosäuren 1 bis 10 des PCT 1–116) an das Trägerprotein KLH (Keyhole limpet hemocyanin) konjugiert (s. Arbeitsanleitung „NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers" Firma PIERCE, Rockford, IL, USA). Mit diesem Konjugat wurden Balb/c Mäuse immunisiert. Nach Boosterung wurden später Milzzellen der Mäuse mit SP2/0 Myelomzellen fusioniert.
  • Für Bindungstests der Antikörper aus den Kulturüberständen der Myelomzellen wurden die Peptide PAD20 (SEQ ID NO:6) bzw. PPD19 (SEQ ID NO:7; Aminosäuren 2–20 des PCT 1–116) auf Mikrotiterplatten immobilisiert. Zu diesem Zweck wurden die Peptide in 20 mM Na-Phosphat, pH 7.4, 50 mN NaCl in einer Konzentration von 7 μg/ml gelöst, und davon wurden 150 μl pro Kavität pipettiert. Es wurde 20 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Lösung wurde abgesaugt. Dann wurde jede Kavität mit 150 μl 10 mM Natriumphosphat, 2% Karion FP, 0.3% Bovinem Serum Albumin, pH 6.5 befüllt. Nach 20 Stunden wurde die Lösung abgesaugt.
  • Von den zu testenden Kulturüberständen wurden je 150 μl in mit PAD20 (SEQ ID NO:6) bzw. PPD19 (SEQ ID NO:7) beschichtete Kavitäten der Mikrotiterplatten pipettiert. Es wurde zwei Stunden bei 22°C inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt. Es wurde zweimal mit 20 mM Na-Phosphat, pH 7.4, 50 mM NaCl gewaschen, und gebundene Antikörper wurden mit einem sekundären anti-Maus Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugat nach Standardverfahren nachgewiesen (SIGNA, Deisenhofen, Deutschland).
  • Für die Vereinzelung wurden solche Zellkulturen selektiert, welche Antikörper sekretierten, die an das Peptid PAD20 (SEQ ID NO:6), aber weit geringer an das Peptid PPD19 (SEQ ID NO:7) gebunden hatten. Kulturüberstände aus den Vereinzelungen wurden nach dem gleichen Verfahren wie die initialen Zellkulturen gescreent. In diesem Sinne positiv gescreente Zellklone wurden dann in größerem Maßstab kultiviert, und mittels Affinitätschromatographie an einer Protein G-Säule wurden die Antikörper gereinigt, von denen drei als potentielle Kandidaten für die selektive Bindung von PCT 1–116 in einem Immunoassay weiter untersucht wurden (interne Bezeichnungen der Antikörper mAb 295/3H12; mAb 295/4G9; mAb 295/4G11).
  • I.2.2. Markierung der Antikörper
  • Zur Charakterisierung der Epitop-Spezifität der drei ausgewählten Antikörper und späteren Assayentwicklung wurden die gewonnenen monoklonalen Antikörper mit einem Chemilumineszenz-Label wie folgt markiert:
    Jeder Antikörper wurde in 100 mM Kalium-Phosphatpuffer (pH 8,0) auf eine Konzentration von 1,5 mg/ml eingestellt. 67 μl der Antikörperlösung wurden mit 10 μl MA70-Akridinium-NHS-Ester (1 mg/ml; Firma HOECHST Behring) versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 423 μl 1 M Glycin zugesetzt, und es wurde weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurde der Markierungsansatz über eine NAP-5 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) in 1 ml Laufmittel A (50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7.4) nach Arbeitsanleitung umgepuffert und dabei von niedermolekularen Bestandteilen befreit. Zur Abtrennung letzter Reste nicht an Antikörper gebundenen Labels wurde eine Gelfiltrations-HPLC durchgeführt (Säule: Waters Protein Pak SW300). Die Probe wurde aufgetragen und bei einer Flußrate von 1 ml/min mit Laufmittel A chromatographiert. Mit einem Durchflußphotometer wurden die Wellenlängen 280 nm und 368 nm gemessen. Das Absorptionsverhältnis 368 nm/280 nm als Maß für den Markierungsgrad des Antikörpers betrug am Peak 0.10 +/– 0.01. Die monomeren Antikörper enthaltenden Fraktionen (Retentionszeit 8–10 min) wurden gesammelt und in 3 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Bovines Serum Albumin, 0.1% Natrium Azid, pH 7.4, gesammelt.
  • I.2.3. Epitop-Mapping von drei ausgewählten monoklonalen Antikörpern
  • Für das Epitop-Mapping der drei entwickelten und ausgewählten monoklonalen Antikörper wurden diverse Peptide, die den N-terminalen Bereich von Procalcitonin repräsentieren (vgl. I.1.; Tab. 1), auf Röhrchen immobilisiert. Dies erfolgte wie oben für die Beschichtung von Mikrotiterplatten beschrieben, mit dem Unterschied, dass statt 150 μl 300 μl Peptidlösung pipettiert wurden.
  • Der jeweilige chemilumineszenzmarkierte monoklonale Antikörper wurde in Assaypuffer (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 0.5% Bovines Serum Albumin, 0.1% unspez. Maus IgG, 0.1% Natrium Azid, pH 7.4), verdünnt, so dass eine Endkonzentration von 0.9 Millionen RLU (relative light units)/200 μl erhalten wurde. Je 200 μl dieser Lösungen wurden in die Peptid-Röhrchen pipettiert, und es wurde 2 Stunden bei 22°C unter Schütteln inkubiert. Dann wurde 4 × mit je 1 ml Waschlösung (0.1% Tween 20) pro Röhrchen gewaschen, abtropfen gelassen, und die am Röhrchen gebundene Chemilumineszenz wurde in einem Luminometer (Firma BERTHOLD, LB952T; Basisreagenzien BRAHMS AG) vermessen.
  • Wie aus der nachfolgenden Tabelle 1 ersichtlich ist, reagierten alle drei ausgewählten Antikörper (interne Bezeichnungen mAb 295/3H12; mAb 295/4G9; mAb 295/4G11) am besten mit einem von Pre-Procalcitonin (bzw. Procalcitonin) abgeleiteten Peptid, wenn dieses N-terminal mit der Position 25 endete (Peptid PAD20; SEQ ID NO:6). Fehlte Position 25 (Peptid PPD19; SEQ ID NO:7), wurde nur noch eine marginale Bindung erreicht, die für die einzelnen monoklonalen Antikörper nur etwa das doppelte der unspezifischen Bindung ausmachte und um den Faktor 199 (mAb 295/3H12), Faktor 85 (mAb 295/4G9) bzw. Faktor 102 (mAb 295/4G11) niedriger lag als bei Peptid PAD20, bei dem Position 25 vorhanden war.
  • Die Antikörper sind somit hochspezifisch und geeignet für die Unterscheidung von Procalcitonin-Peptiden, die N-terminal die Positionen 1 und 2 des PCT 1–116 (Position 25 und 26 des Pre-PCT) enthalten, von solchen Procalcitonin-Peptiden, die diesen gegenüber N-terminal auch nur um einen Aminosäurerest verkürzt sind.
  • Tabelle 1: Epitop-Mapping. Angegeben sind gemessene Bindungswerte als relative Lumineszenz-Einheiten [RLU].
    Peptid Sequenz Aminosäureposition (Pre-PCT) mAb 295/3H12 mAb 295/4G9 mAb 295/4G11
    PAD20 SEQ ID NO:6 25–44 36186 26496 30222
    PPD19 SEQ ID NO:7 26–44 182 310 297
    PFD18 SEQ ID NO:8 27–44 96 190 171
    PRD17 SEQ ID NO:9 28–44 65 158 164
    PSD16 SEQ ID NO:10 29–44 64 176 146
    Konrolle 61 149 162
  • I.4. Entwicklung eines Sandwichimmunoassays zur spezifischen Messung von PCT 1–116
  • I.4.1. Kopplung
  • Hochbindende 5 ml Polystyrolröhrchen (Firma Greiner) wurden mit einem monoklonalen Antikörper (interne Bezeichnung: QN05), der gegen ein Epitop im C-terminalen Bereich von Procalcitonin gerichtet ist und auch im kommerziellen Assay B. R. A. H. M. S PCT LIA verwendet wird, wie folgt beschichtet: Der Antikörper wurde in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.8 zu einer Konzentration von 6.6 μg/ml verdünnt. In jedes Röhrchen wurden 300 μl dieser Lösung pipettiert. Die Röhrchen wurden 20 Stunden bei 22°C inkubiert. Die Lösung wurde abgesaugt. Dann wurde jedes Röhrchen mit 4.2 ml 10 mM Natriumphosphat, 2% Karion FP, 0.3% Bovines Serum Albumin, pH 6.5 befüllt. Nach 20 Stunden wurde die Lösung abgesaugt. Schließlich wurden die Röhrchen in einem Vakuumtrockner getrocknet.
  • I.4.2. Markierung
  • Der oben bezüglich seines Bindungsverhaltens näher charakterisierte monoklonale Antikörper mAb 295/3H12, der spezifisch den N-Terminus von PCT 1–116 erkennt, wurde wie oben unter I.2.2. beschrieben chemilumineszenzmarkiert.
  • I.4.3. Durchführung und Auswertung des Immunoassays
  • Als Standardmaterial diente das Peptid PAN40 (SEQ ID NO:11), das seriell in Pferdenormalserum verdünnt wurde. Den so hergestellten Standards wurden Konzentrationen gemäß der Peptideinwaage zugeschrieben.
  • Der Sandwichimmunoassay wurde wie folgt angesetzt: In die mit Antikörper beschichteten Teströhrchen wurden 50 μl Standards bzw. Proben sowie 150 μl Assaypuffer (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 0.5% Bovines Serum Albumin, 0.1% unspez. Maus IgG, 0.1% Natrium Azid, pH 7.4), enthaltend 0.5 Millionen RLU (relative light units) des MA70-markierten Antikörpers, pipettiert. Es wurde 3 Stunden bei 22°C unter Schütteln inkubiert. Dann wurde 4 × mit je 1 ml Waschlösung (0.1% Tween 20) pro Röhrchen gewaschen, abtropfen gelassen, und die am Röhrchen gebundene Chemilumineszenz wurde in einem Luminometer (Firma BERTHOLD, LB952T; Basisreagenzien BRAHMS AG) vermessen. Unter Verwendung der Software MultiCalc (Spline Fit) wurden die PCT 1–116 Konzentrationen der Proben an der Standardkurve abgelesen. Eine typische Standardkurve ist in 1 gezeigt. Der Test hatte eine Funktionale Assaysensitivität (FAS), definiert als die Konzentration, bei der der Variationskoeffizient des Mittels von zehn unabhängigen Testläufen bei 20% lag, von 6 pmol/L.
  • Anknüpfend an die oben beschriebenen Experimente zur Epitopspezifität des Antikörpers 295/3H12 wurde untersucht, welche Kreuzreaktivität der Assay für ein von Procalcitonin abgeleitetetes Peptid aufwies, dem die erste N-terminale Aminosäure fehlte: Eine Probe PCT 2–116 (InVivo GmbH, Hennigsdorf, Deutschland; vgl. auch EP 1 408 334 ) einer Konzentration von 37433 pmol/L wurde gemessen mit 206 pmol/L. Die Kreuzreaktivität betrug somit nur 0.5%.
  • II. MESSUNGEN ZUR ANALYTSTABILITÄT UND VON HUMANPLASMEN VON SEPSISPATIENTEN
  • II.1. Analytstabilität in Proben
  • Es wurde zuerst untersucht, wie stabil, bezogen auf seine Messbarkeit im PCT 1–116 Assay gemäß I., natives PCT 1–116 in Proben von Sepsispatienten ist. Dazu wurden von zehn Sepsispatienten EDTA-Plasma und Serumproben gewonnen und dann frisch sowie nach Lagerung über sechs Stunden bei 22°C mit dem o. g. Assay gemessen.
  • Im Mittel lag die Abnahme an Immunreaktivität nach 6 h bei den Plasmen bei nur 3.6% und die individuell größte Abnahme bei 7.6%. Bei den Seren nahm die Immunreaktivität hingegen im Mittel um 13.5% ab, und es wurden beträchtliche individuelle Unterschiede bei der Abnahme beobachtet.
  • Die beobachteten individuellen Stabilitätsunterschiede von PCT 1–116 insbesondere in Serum, die eine möglicherweise individuell unterschiedliche Enzymaktivität widerspiegeln, haben zur Folge, dass es u. U. nicht ohne weiteres möglich ist, messbare Konzentrationsveränderungen von PCT 1–116 in einer individuellen Patientenprobe zu einem universell gültigen Bezugswert für die Eliminierung von PCT 1–116 aus der Zirkulation in Beziehung zu setzen, beispielsweise um Fälle einer reinen Abnahme einer fixen Ausgangskonzentration des PCT 1–116 von Fällen, bei denen eine solche Konzentra tionsabnahme von einer anhaltenden oder wieder einsetzenden Ausschüttung von PCT 1–116 überlagert wird, zu unterscheiden.
  • Procalcitonin, gemessen als PCT-Immunreaktivität oder "PCT-Gesamt" mit dem herkömmlichen B. R. A. H. M. S PCT LIA, ist in Serumproben nach Lagerung über sechs Stunden bei 22°C stabil (Arbeitsanleitung B. R. A. H. M. S PCT LIA).
  • Bei dem B. R. A. H. M. S PCT LIA handelt es sich um einen Sandwichimmunoassay, der monoklonale Antikörper gegen Epitope im C-terminalen Bereich (Katacalcin-Anteil) bzw. mittregionalen Bereich (Calcitonin-Anteil) verwendet. Um eine vergleichende Betrachtung zu ermöglichen, wurden die vom Hersteller in ng/mL angegebenen Konzentrationen der Standards umgerechnet in pmol/L. Eine typische Standardkurve ist in 2 gezeigt. Der Test hatte eine Funktionale Assaysensitivität (FAS), definiert als die Konzentration, bei der der Variationskoeffizient des Mittels von zehn unabhängigen Testläufen bei 20% lag, von 20 pmol/L.
  • Die ermittelte Stabilität des Analyten PCT 1–116 in humanem EDTA-Plasma kann als normalerweise für die klinische Praxis ausreichend angesehen werden. Sollte jedoch ein Risiko bestehen, dass das jeweilige, aus der Probe gewonnene EDTA-Plasma nicht ausreichend zeitnah vermessen werden kann, liegt es im Bereich der vorliegenden Erfindung, den Abbau des PCT 1–116 durch Dipeptidyl-Aminopeptidase IV (DAP IV) zu PCT 3–116 durch Zusatz von synthetischen Inhibitoren für DAP IV zu der Probe zu verhindern (z. B. von Lys[Z(NO2)]-thiazolidid oder von Pro-Pro(P)[OPh-4Cl]2; vgl. WRENGER S. KAHNS T, BOHUON C, WEGLÖHNER W, ANSORGE S, REINHOLD D: Amino-terminal truncation of procalcitonin, a marker for systemic bacterial infections, by dipeptidyl peptidase IV (DP IV). FERS Lett 2000; 466: 155–9). Sollten, gegebenenfalls zusätzlich, andere Enzyme zum Abbau der Konzentration von PCT 1–116 in einer Probe beitragen, können selbstverständlich auch andere Inhibitoren der störenden Enzymwirkung eingesetzt werden.
  • II.2. Messungen zur klinischen Wertigkeit
  • II.2.1. Kinetik bei erfolgreicher Behandlung von Infektionen
  • Es ist wünschenswert, den Therapieerfolg bei Sepsispatienten frühzeitig und sicher zu erkennen, weil dadurch die Sicherheit im Behandlungsregime eines Patienten erhöht wird und kostspielige Verweilzeiten auf der Intensivstation reduziert werden können.
  • Zur Überprüfung der Frage, ob die erfindungsgemäße Messung von PCT 1–116 unter Verwendung des oben beschriebenen Sandwich-Assays Ergebnisse liefern kann, die sich von denen einer herkömmlichen Messung der PCT-Immunreaktivität ("PCT-Gesamt") unterscheiden, wurden wie folgt verfahren:
    Von acht Patienten mit Sepsis, die auf der Intensivstation erfolgreich behandelt wurden, wurden täglich Plasmaproben gewonnen. PCT-Gesamt (gemessen mit dem herkömmlichen B. R. A. H. M. S PCT LIA; s. o.) sowie PCT 1–116 wurden zu Beginn der Behandlung sowie an den beiden Folgetagen gemessen. Die Konzentrationen zu Beginn der Messungen (am Tag 0) betrugen
    im Median für PCT 1–116: 100,6 pmol/L und für PCT-Gesamt: 591,8 pmol/L, (molares Verhältnis der Anfangskonzentrationen von etwa 0,17).
  • Die Konzentrationen von PCT 1–116 nahmen signifikant schneller ab als die von PCT-Gesamt: Die Abnahme, bezogen auf Tag 0, betrug für PCT 1–116 am ersten Tag 32%, am zweiten Tag 52%. Hingegen betrug die Abnahme von PCT-Gesamt am ersten Tag nur 11%, am zweiten Tag nur 30% (3).
  • Angesichts des diagnostischen Ziels, einen Therapierefolg möglichst rasch anhand eines Abfalls der Procalcitonin-Sekretion zu erkennen, kann man sich nunmehr die Frage stellen, nach welcher Zeit beide oben verglichenen Bestimmungsverfahren überhaupt einen Abfall erkennen lassen. Berücksichtigt man Interassayvarianzen, gilt näherungsweise, dass ein Abfall um etwa 20% als sicher erkennbar eingestuft werden kann. Ein solcher Abfall ist bei einer Messung von PCT 1–116 bereits nach 0,6 Tagen erkennbar, hingegen bei der herkömmlichen Messung der PCT-Immunreaktivität (von PCT-Gesamt) erst nach 1,2 Tagen (3).
  • Der Erfolg einer Behandlung ist also bei einer Messung von PCT 1–116 deutlich schneller und sicherer erkennbar als bei einer herkömmlichen Messung der PCT-Immunreaktivität ("PCT-Gesamt").
  • Für eine weitere Auswertung der Messdaten wurde für jeden Patienten und jeden Messzeitpunkt das jeweilige molare Verhältnis (Ratio) von PCT 1–116 zu PCT-Gesamt berechnet. Über die drei Beobachtungstage nahm dieses Verhältnis im Median von 0.17 über 0.15 auf 0.12 ab (4). Auch diese Auswertung spiegelt die unterschiedlichen Abbaukinetiken von PCT 1–116 und PCT-Gesamt wider. Dabei gilt vereinfacht gesprochen, dass die Abnahme von PCT 1–116 direkt dessen Abbau bzw. geringere Stabilität widerspiegelt, während die Abnahme von "PCT-Gesamt" den Abbau von PCT 3–116 bzw. dessen Stabilität widerspiegelt. Da sich die Umwandlung von PCT 1–116 in PCT 3–116 messtechnisch bei der Bestimmung von PCT-Gesamt nicht wesentlich auswirken sollte, weil das herkömmliche Verfahren nicht zwischen PCT 1–116 und PCT 3–116 unterscheidet, beeinflusst die Geschwindigkeit der Umwandlung von PCT 1–116 in PCT 3–116 die Konzentrationsabnahme von PCT-Gesamt nicht signifikant, so dass diese im wesentlichen der Abnahme des stabileren, in der Probe angesammelten PCT 3–116 entspricht.
  • Es ergibt sich aus den obigen Überlegungen, dass darüberhinein kleiner Wert für das Verhältnis von PCT 1–116 zu PCT- Gesamt (d. h eine geringe Konzentration von PCT 1–116 bei einer gleichzeitig vergleichweise hohen Konzentration von PCT-Gesamt) auf ein Ausklingen der Infektion hindeutet, während ein großer Wert eine zeitliche Nähe zum Beginn der PCT-Ausschüttung und damit eine hochakute Infektion anzeigt. Diese Beobachtung hat nicht nur Implikationen für die Verlaufsbeobachtung, sondern auch für die initiale Einschätzung des Infektionsstatus eines Patienten, beispielsweise auf der Notaufnahme oder bei der ambulanten ärztlichen Betreuung.
  • II.2.2. Kinetik bei Folgeinfektionen
  • Bei Sepsispatienten kommt es während des Aufenthalts auf der Intensivstation häufig zu einer weiteren Infektion, die aufgrund des geschwächten Immunsystems besonders lebensbedrohlich ist und sich fatal auswirken kann. Je frühzeitiger eine solche Folgeinfektion erkannt wird, desto eher und wirksamer lassen sich therapeutische Gegenmaßnahmen einleiten. Aufgrund des bekannten Phänomens der Endotoxin-Toleranz resultieren Folgeinfektionen allerdings in einem nur vermindert ausgeprägten Anstieg der PCT-Gesamtkonzentration.
  • Besonders erschwert wird das frühzeitige Erkennen einer bakteriellen Neuinfektion, die mit einem weniger stark ausgeprägten Wiederanstieg der zwischenzeitlich bereits verminderten oder sogar beendeten PCT-Ausschüttung verbunden ist, dadurch, dass die Patienten infolge der primären Infektion bereits erhebliche PCT-Gesamtkonzentrationen aufweisen, die aufgrund der hohen Stabilität von PCT 3–116 selbst bei erfolgreicher Behandlung nur relativ langsam abgebaut werden. Wie oben gezeigt wurde, weist PCT 1–116 in vivo eine deutlich schnellere Abbaukinetik auf als PCT-Gesamt (mit einem überwiegenden Anteil an PCT 3–116). Geht man davon aus, dass PCT 1–116 im ersten Schritt seines Abbaus in PCT 3–116 umgewandelt wird, entspricht der Abnahme der (in Absolutwerten kleineren) Konzentration des PCT 1–116 keine Zunahme der Werte für PCT-Gesamt. Diese steigen nur nach Maßgabe der Neuproduktion von PCT 1–116 an.
  • Bei einer weitgehend überstandenen, nicht mehr akuten Infektion – d. h. vor einer Folgeinfektion – sollten die messbaren Konzentrationen von PCT 1–116 relativ niedrig liegen, obwohl Absolutwerte für die Konzentrationen von PCT-Gesamt wegen der Stabilität von PCT 3–116, das zu diesem Zeitpunkt den Hauptbeitrag zu der gemessenen Konzentration von PCT-Gesamt liefern dürfte, noch hoch sind. Ein durch eine Folgeinfektion induzierter Wiederanstieg der PCT-Ausschüttung sollte daher anhand der Messwerte für PCT 1–116 früh erkennbar sein, während er anhand der absolut sehr viel höheren Messwerte für PCT-Gesamt noch nicht oder nicht eindeutig erkennbar ist.
  • Die Überlagerung der bei der Bestimmung von PCT-Gesamt gemeinsam erfassten Konzentrationen von PCT 1–116 und PCT 3–116 führt dazu, dass unter dem Einfluss des eher langsamen Abfalls einer hohen Konzentration von PCT 3–116 aus der primären Infektion und des Neuanstiegs von PCT aus der Folgeinfektion der Beginn des Wiederausschüttung von PCT möglicherweise nicht sofort als messbarer Anstieg des Gesamt-PCT erkennbar wird, sondern zunächst nur als eine schwer erkennbare Verminderung des Abfalls der PCT-Gesamt-Konzentrationen, die anfangen, langsamer abzusinken als der Clearing-Geschwindigkeit von PCT 3–116 entspricht.
  • Es wurde daher untersucht, ob eine Konzentrationsentwicklung von PCT 1–116 im Sinne einer Erhöhung oder Verlangsamung unter die übliche stabilitätsbedingte Konzentrationsverminderung von PCT 1–116, die sich deutlich von der Konzentrationsentwicklung von PCT-Gesamt unterscheidet, einen Wiederanstieg auch von PCT-Gesamt am Folgetag – als Zeichen einer Folgeinfektion – vorhersagt.
  • Von 44 Sepsispatienten mit einer mittleren Verweilzeit von 10,8 Tagen auf der Intensivstation wurde täglich Plasma gewonnen, in dem parallel PCT-Gesamt und PCT 1–116 bestimmt wurden, und es wurde für jeden individuellen Patienten deren Konzentrationsverlauf während des Zeitraum der Messungen verfolgt.
  • Sechsmal wurde dabei beobachtet, dass einem Anstieg von PCT-Gesamt am Folgetag ein Anstieg von PCT 1–116 vorausging, während PCT-Gesamt noch abfiel.
  • In 7 anderen Fällen wurde – jeweils bei anhaltendem Abfall von PCT-Gesamt – eine reduzierte Verminderung des Abfalls der Konzentration von PCT 1–116, d. h. ein langsamerer Abfall als in anderen Proben, beobachtet, der mit einer einsetzenden Folgeinfektion in Verbindung gebracht wurde. Die Konzentrationen von PCT-Gesamt veränderten sich dabei noch nicht in signifikanten Ausmaß. Erst am Folgetag wurden Zeichen für einen Wiederanstieg von PCT-Gesamt erlennbar. Es liegt im Bereich der vorliegenden Erfindung, auch solche "versteckten" Erhöhungen der Konzentration von PCT 1–116, die bei der Überwachung von PCT-Gesamt noch nicht manifest werden, unter Anwendung geeigneter Überwachungs- und Auswertungstechniken und dafür geeigneter mathematischer Modelle im Rahmen der Überwachung von therapierten Sepsispatienten zur Erkennung von Folgeinfektionen zu nutzen.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein gegenüber PCT-Gesamt verminderter Abfall von PCT 1–116 oder gar ein Anstieg von PCT 1–116 am Folgetag einen Anstieg von PCT-Gesamt als Ausdruck einer Folgeinfektion hochspezifisch und auch sensitiv vorhersagt.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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Claims (22)

  1. Immundiagnostisches Verfahren zur Bestimmung von Procalcitonin und Procalcitoninabkömmlingen für diagnostische Zwecke, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer biologischen Probe eines Patienten selektiv solche molekularen Formen des Procalcitonins oder davon abgeleiteter Procalcitoninteilpeptide bestimmt, die die Aminosäuren Alanin und Prolin (Ala Pro, AP) in den Stellungen 1 und 2 des Aminoterminus des vollständigen Procalcitonins 1–116 (SEQ ID NO:1) aufweisen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung unter Verwendung wenigstens eines Antikörpers durchführt, der für seine spezifische Bindung eine Procalcitoninsequenz mit wenigstens einer der Aminosäuren der Stellungen 1 und 2 der vollständigen Sequenz des Procalcitonins 1–116 (SEQ ID NO:1) benötigt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper für seine spezifische Bindung die Anwesenheit beider Aminosäuren der Stellungen 1 und 2 der vollständigen Sequenz des Procalcitonins 1–116 (SEQ ID NO:1) benötigt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Antikörper ein monoklonaler Antikörer oder ein polyklonaler Antikörper, beispielsweise ein durch Affinitätschromatographie aufgereinigter polyklonaler Antikörper, ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine biologische Flüssigkeit ist, die ausgewählt ist aus Blut und einer Blutfraktion, insbesondere Serum oder Plasma, und Liquor cerebrospinalis (cerebrospinal fluid; CSF).
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man es im Rahmen der Diagnose von Erkrankungen durchführt, die ausgewählt sind aus lokalen oder systemischen Infektionen, Entzündungen, Sepsis sowie neurodegenerativen Erkrankungen.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man im Rahmen der Kontrolle und Steuerung der Therapie und der Überwachung des Verlaufs einer der genannten Erkrankungen durchführt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es als immunchromatographisches Verfahren für die Point-of-Care Diagnostik oder als ein anderer Schnelltest ausgestaltet ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man es im Rahmen einer Multiparameter-Bestimmung durchführt.
  10. Verfahren nach Ansspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man es im Rahmen einer Multiparameter-Bestimmung unter Einsatz der Chip-Technologie und/oder im Rahmen eines automatisierten Verfahrens mit computergestützer Auswertung der Messergebnisse durchführt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Multiparameter-Bestimmung mindestens ein weiterer für die Sepsisdiagnostik relevanter Parameter bestimmt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die weitere(n) für die Sepsisdiagnostik relevante(n) Parameter aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Gesamt-Procalcitonin, Procalcitonin 3– 116, CA 125, CA 19-9, S100B, S100A-Proteinen, LASP-1, löslichen Cytokeratin-Fragmenten, insbesondere CYFRA 21, TPS und/oder löslichen Cytokeratin-1-Fragmenten (sCY1F), den Peptiden Inflammin und CHP, den Prohormonen pro-ANP, pro-BNP, pro-Adrenomedullin, pro-Endothelin, pro-Vasopressin und ihren für diagnostische Zwecke nutzbaren Fragmenten, der Glycin-N-Acyltransferase (GNAT), der Carbamoylphosphat Synthetase 1 (CPS 1), dem C-reaktiven Protein (CRP) und Fragmenten davon sowie aus Cytokinen.
  13. Antikörper, der selektiv nur an das intakte Procalcitonin 1 bis 116 (SEQ ID NO:1) oder Procalcitoninabkömmlinge bindet, die eine Procalcitonin-Aminosäuresequenz oder Procalcitonin-Aminosäureteilsequenz mit wenigstens einer der Aminosäuren 1 und 2, vorzugsweise mit beiden Aminosäuren 1 und 2, vom Aminoterminus der Sequenz des vollständigen Procalcitonins 1 bis 166 (SEQ ID NO:1) aufweisen.
  14. Antikörper nach Anspruch 13, der durch Immunisierung eines Tiers mit einem Antigen erhältlich ist in Form eines Konjugats mit einem Peptid, das das Peptid gemäß SEQ ID NO:4 ist oder umfasst.
  15. Antikörper nach Anspruch 13 oder 14, der ein monoklonaler Antikörper ist.
  16. Kit zur Durchführung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der neben üblichen Puffer- und Waschflüssigkeiten wenigstens enthält – wenigstens einen Antikörper nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15 in festphasengebundener Form oder in markierter oder selektiv markierbarer Form sowie – einen Kompetitor oder eine Standardverbindung in Form eines Peptids, das wenigstens die Aminosäuren 1 bis 6 der Aminosäuresequenz des vollständigen Procalcitonins 1 bis 116 (SEQ ID NO:1) umfasst und das von dem wenigstens einen Antikörper selektiv gebunden wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Kompetitor festphasengebunden oder markiert oder selektiv markierbar ist.
  18. Kit zur Durchführung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der neben üblichen Puffer- und Waschflüssigkeiten sowie gegebenenfalls Substanzen zur Signalerkennung oder Signalerzeugung wenigstens enthält – einen ersten Antikörper nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, und – einen zweiten Antikörper, der selektiv an eine beliebige Aminosäure-Teilsequenz des vollständigen Procalcitonins 1 bis 116 (SEQ ID NO:1) bindet, die nicht die Aminosäuren 1 und 2 vom Aminoterminus des Procalcitonins umfasst.
  19. Kit nach Anspruch 18, wobei einer der beiden Antikörper in festphasengebundener Form vorliegt und der anderen der Antikörper in markierter oder selektiv markierbarer Form vorliegt.
  20. Kit nach Anspruch 18, wobei beide Antikörper in einer für einen Einsatz als Dispersion in flüssiger Phase geeigneten Form vorliegen, wobei an den ersten Antikörper eine erste Markierungskomponente gebunden ist, die Teil eines auf Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Löschung oder -Verstärkung beruhenden Markierungssystems ist, und an den zweiten Antikörper die zweite Markierungskomponente dieses Markierungssystems gebunden ist, so dass nach Bindung beider Antikörper an das nachzu weisende Peptidfragment ein messbares Signal erzeugt wird, das eine Detektion der gebildeten Sandwichkomplexe in der Messlösung ermöglicht.
  21. Kit nach Anspruch 20, wobei das Markierungssystem Seltenerdkrypate oder -chelate in Kombination mit einem Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Farbstoff, insbesondere von Cyanintyp, umfaßt.
  22. Kit nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei der Kit außerdem als zusätzliche Komponente eine Verbindung zur Stabilisierung der biologischen Probe durch Hemmung der Enzymwirkung der Dipeptidyl-Aminopeptidase IV (DAP IV; DP IV; CD 26) umfasst.
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