CN112074738A - 心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法以及抗体的组合 - Google Patents

心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法以及抗体的组合 Download PDF

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Abstract

[所要解决的问题]简单且高精度地对心力衰竭进行检测等。[解决问题的技术方案]提供一种使用了从活体采集的样本的心力衰竭检测方法，其通过使用表位为NT‑proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT‑proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对上述样本中含有的NT‑proANP或其片段实施夹心免疫检测，来检测心力衰竭。捕获用抗体和标记用抗体这两种抗体的表位都在NT‑proANP的氨基酸序列31～67位中，因此，即使在NT‑proANP在血液循环中被进一步切断三部分的情况下，也能够检测出与切断分解前的NT‑proANP相同物质量的片段。因此，能够简单且高精度地测定活体样本中的NT‑proANP并检测出心力衰竭。

Description

心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法以 及抗体的组合
技术领域
本发明涉及使用了表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体的心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法、两抗体的组合等。
背景技术
心力衰竭(heart failure)是心脏的血液输出不足、无法保证全身所需的循环量的病症。多数影响心脏的疾病、例如先天性心脏病、心脏瓣膜病(例如二尖瓣关闭不全、三尖瓣关闭不全、主动脉瓣关闭不全、肺动脉瓣关闭不全等)、心肌疾病(例如扩张性心肌病、肥厚性心肌病、心肌炎等)、盘尾丝虫病、血管疾病(例如血栓、塞栓、动脉硬化等)、高血压症等都是引发心力衰竭的原因。
心力衰竭多数情况下在初期病状中几乎不会表现出明显的症状，之后，经过数日、有时为数年，呼吸急促、疲劳等症状会逐渐明显。心力衰竭症状有时会稳定较长时间，但在不知不觉间慢慢发展的情况也很多。总体而言，心力衰竭是一种如不进行充分治疗病情就会逐渐加重的进行性疾病，预后也多数不佳，因此早期发现至关重要。
ANP(Atrial natriuretic peptide；心房利钠肽)是一种由28个氨基酸组成的具有生理活性的肽。ANP在心房体液量增加、内压上升等的刺激下由心房肌细胞等分泌至血液中。作为激素发挥作用，以肾脏、血管等为靶器官，具有强效的排钠利尿作用、以及舒张血管和降血压作用。但是，其在血液中的半衰期约为100秒，难以测定其血中浓度。
ANP在心房肌细胞等中被生物合成为其前体proANP(Proatrial natriureticpeptide：前心房利钠肽)。ANP的前体proANP由126个氨基酸组成，由氨基酸序列1～98位的NT-proANP(N-terminal proANP)和氨基酸序列99～126位的ANP组成。在由心房肌细胞等分泌到血液中时，被切断为NT-proANP和ANP。
已知在人、犬等患有充血性心力衰竭等时，血液中的ANP会增加；因此，ANP作为心力衰竭等的标志物是有用的。但是，如上所述，ANP在血液中的稳定性较低，其半衰期较短，因此，难以简易且高精度地测定。故而，人们尝试使用血液中的NT-proANP来替代ANP作为心力衰竭等的标志物，并提出了各种建议。
例如，专利文献1中记载了使用对N肽的氨基酸序列43～66位进行识别的第一抗体或第二抗体的夹心免疫检测法等；专利文献2中记载了使用对NT-proANP的氨基酸序列53～72位进行识别的第一抗体和对该序列73～90位进行识别的第二抗体的夹心免疫分析等；专利文献3中记载了使用对犬NT-proANP的氨基酸序列31～40位进行识别的抗体和对该序列74～82位进行识别的抗体的免疫学测定方法以及犬的心脏疾病检测方法等。
此外，非专利文献1中还记载了人的NT-proANP在血液循环中会进一步被切断分解为氨基酸序列1～30位、该序列31～67位、该序列79～98位这三部分；以及人的NT-proANP的氨基酸序列31～67位的片段作为充血性心力衰竭的标志物，敏感度最高。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本公开专利公报特开平8-226919号公报
专利文献2:日本公开专利公报特表2006-523298号公报
专利文献3:日本公开专利公报特开2014-210761号公报
非专利文献1:Sreedevi Daggubati,James R.Parks,Rose M.Overton,GuillermoCintron,Douglas D.Schocken,David L.Vesely,"Adrenomedullin,endothelin,neuropeptide Y,atrial,brain,and C-natriuretic prohormone peptides compared asearly heart failure indicators".Cardiovascular Research(36)246-255,1997
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于更加简单且高精度地对心力衰竭进行检测等。
用于解决问题的技术方案
本发明者们独立发现，在血液循环中，实际上，NT-proANP几乎不会保持全长，很可能在早期就变为片段，同时，基于这一见解，尝试制作了表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位且表位互不重叠的两种抗体并获得了成功，而且还证实，通过使用这些抗体实施夹心免疫检测，能够简单且高精度地测定活体样本中的NT-proANP并检测出心力衰竭。
因此，在本发明中，提供一种使用了从活体采集的样本的心力衰竭检测方法，其通过使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对上述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测，来检测心力衰竭。
在本发明中，捕获用抗体和标记用抗体这两种抗体的表位都在NT-proANP的氨基酸序列31～67位中，因此，即使在NT-proANP在血液循环中被进一步切断分解为氨基酸序列1～30位、该序列31～67位、该序列68～98位这三部分的情况下，也能够检测出与切断分解前的NT-proANP相同物质量的片段。因此，通过使用这些抗体的组合对NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测，能够简单且高精度地测定活体样本中的NT-proANP并检测出心力衰竭。
作为夹心免疫检测法，可以采用免疫层析法。使用免疫层析法，更具体而言，例如按照(1)向液体因毛细现象而扩展的流路的上游侧供给上述样本的步骤、以及(2)一边使上述液体从上述流路的上游侧向下游侧扩展一边使上述样本依次通过用标记物质标记了的上述第二抗体被保持的第一区域和上述第一抗体被固定在上述流路上的第二区域的步骤测定上述样本中含有的NT-proANP或其片段，由此，实质上通过仅是向流路的上游侧供给样本这样的简单作业就能测定NT-proANP并检测出心力衰竭。另外，该方法能够作为结构比较简单的器具实现，该器具的量产也较容易，因此能够对众多个体较为简单且价格低廉地实施心力衰竭的检查和检测，通用性较高。
本发明既能用于对包括人在内的哺乳动物的心力衰竭的检测，也能有效地检测非人类哺乳动物、例如犬或猫的心力衰竭。例如，犬或猫中存在二尖瓣关闭不全、心肌病、盘尾丝虫病等严重且发生频率较高的心脏疾病，为了早期发现这些疾病，极需早期发现心力衰竭。另一方面，非人类哺乳动物的情况下，因其个体自身无法自行阐述不适，因此只能通过饲养者的观察、定期诊断等发现心力衰竭的细微征兆，与人相比，多数情况下早期发现尤为困难。对此，本发明按照仅是利用从这些个体采集的样本实施夹心免疫检测这样简单的步骤就能高精度地检测出心力衰竭，对非人类哺乳动物的心力衰竭检测有用性尤其高。
发明效果
采用本发明，能够简单且高精度地检测出心力衰竭。
具体实施方式
＜本发明的抗体组合＞
本发明包括用于夹心免疫检测的捕获用抗体和标记用抗体这两种抗体组合中上述两抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位且各表位互不重叠的所有的抗体组合。
序列号1是犬proANP的氨基酸序列的例子，其1～98位为NT-proANP，99～126位为ANP。一般认为，proANP在由心房肌细胞等分泌到血液中时，被丝氨酸蛋白酶等切断为NT-proANP和ANP。
在NT-proANP(序列号1的序列中的1～98位)上，还在30-31位间、67-68位间存在分别被天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶切断的部位，人的情况下，NT-proANP在血液循环中还进一步被切断分解为氨基酸序列1～30位、该序列31～67位、该序列68～98位这三部分。
在本发明的夹心免疫检测中，捕获用第一抗体和标记用第二抗体使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位且各表位互不重叠的抗体。两种抗体的表位互不重叠，由此两抗体能够分别与NT-proANP的氨基酸序列31～67位或含有该部位的片段中的其它区域结合，即能够没有竞争的情况下同时结合，因此，通过将一者作为捕获用抗体、将另一者作为标记用抗体，就能用于夹心免疫检测。另外，两抗体都与NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位结合，因此，不仅是NT-proANP在测定时得以保持全长的情况下，即使在测定前NT-proANP已在30-31位间和/或67-68位间被切断的情况下，也能够检测出与切断分解前原本存在的NT-proANP相同的物质量。因此，通过使用这些抗体组合实施NT-proANP的夹心免疫检测，能够高精度地测定活体样本中的NT-proANP并检测出心力衰竭。
这两种抗体只要是能够识别想要检测心力衰竭的动物种类的NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位且识别区域互不重叠的抗体组合即可。本发明不会因是哪种动物种类的NT-proANP的氨基酸序列、识别区域是NT-proANP的氨基酸序列31～67位中具体哪个区域等而被严格限定。另外，虽然优选单克隆抗体，但不会严格地限定为单克隆抗体。
例如，可以根据想要检测心力衰竭的动物种类采用能够识别该动物种类的NT-proANP的氨基酸序列31～67位中的任一区域的抗体、即以该动物种类的NT-proANP的任一氨基酸序列31～67位中任一部位为表位的抗体。例如，在检测人、犬、猫的心力衰竭时，分别基于人NT-proANP、犬NT-proANP、猫NT-proANP的氨基酸序列制作抗体。此外，当一对抗体的两个表位是动物种类间共通的序列时，该抗体也能够识别与原本的动物种类不同的动物种类的NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一区域，因此能够通过相同的抗体组合检测出两种以上动物种类的心力衰竭。例如，NT-proANP的45～64位的氨基酸序列在人与犬中是完全相同的，因此若采用能够对人或犬的NT-proANP的氨基酸序列45～64位中任一区域进行识别的一对抗体、即以该系列45～64位中任一部位为表位的一对抗体，就能通过相同的抗体组合测定人和犬这两者的NT-proANP并检测出心力衰竭。
例如，可以采用(1)一种抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列45～54位中任一部位、另一种抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列55～64位中任一部位的抗体组合；(2)一种抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列31～42位中任一部位、另一种抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列55～64位中任一部位的抗体组合；或者(3)一种抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列31～42位中任一部位、另一种抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列49～60位中任一部位的抗体组合等。此外，还可以采用一对抗体组合中的一种抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列39～51位或39～54位中任一部位的抗体组合。
这些组合所涉及的各抗体都能够使用已知的方法制作。
例如，为制作这些抗体而使用的抗原可以使用与想检测心力衰竭的动物种类的NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位具有相同的氨基酸序列的合成肽。例如，可以通过使用具有NT-proANP的氨基酸序列45～54位中任一部位的氨基酸序列的合成肽和具有该序列55～64位中任一部位的氨基酸序列的合成肽分别使动物免疫来制作各抗体。另外，还可以使用具有NT-proANP的氨基酸序列31～42位中任一部位、该序列39～51位或39～54位中任一部位、该序列49～60位中任一部位的氨基酸序列的合成肽使动物免疫来制作一对抗体中的一种抗体。这些合成肽能够使用已知方法进行化学合成。
可以使这些合成肽与牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、牛甲状腺球蛋白(BTG)等已知的载体蛋白、或者聚氨基酸类、聚苯乙烯类、聚丙烯酸类等合成高分子载体结合后使动物免疫。合成肽与载体蛋白或合成高分子载体的结合可以采用已知方法、例如使用重氮化合物、二醛化合物、二马来酰亚胺化合物、马来酰亚胺活性酯化合物、碳二亚胺化合物等的方法来实施。
将这样制备出的抗原投用给动物，使之免疫。用于免疫的动物并不特别限定。免疫的动物可以使用猴、兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等，可以优选使用小鼠。对这些动物的抗原投用量和抗原投用方法也是采用已知方法即可，并不特别限定。例如，可以通过腹腔内投用、静脈投用、皮下投用等每4日～6周共投用2～10次，使之免疫。另外，还可以将抗原与适当的佐剂(例如弗氏完全佐剂等、弗氏不完全佐剂等)适量混合并使之乳浊后投用给动物，使之免疫。
为了制作单克隆抗体，还可以构建分泌该抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的构建能够利用已知方法实施。例如，可以挑选出已免疫动物中抗体滴度升高的个体，在最终免疫的1～8日后，采集其脾脏或淋巴结，与来自与免疫动物相同的动物的骨髓瘤细胞融合，制作出分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。例如，来自小鼠的骨髓瘤细胞株可以使用P3(P3-X63Ag8、P3U1(P3-X63Ag8U1))、X63.653(X63Ag8.653)、SP2(Sp2/0-Ag14)、FO、NS-1(NSI/1-Ag4-1)、NSO/1、FOX-NY等；来自大鼠的骨髓瘤细胞株可以使用Y3-Ag1.2.3、YB2/0、IR983F等。例如，已使小鼠免疫时，优选来自小鼠的骨髓瘤细胞。脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合可以使用PEG(聚乙二醇)等。例如，可以将从已免疫动物采集的抗体分泌细胞(脾脏、淋巴结等的细胞)与骨髓瘤细胞在培养液中以1:1～10:1左右的比例充分混合，将PEG溶液(例如平均分子量1000～6000左右的溶液)加热至37℃，以30～60％(w/v)的浓度将PEG添加至两种细胞中并进行混合，使两种细胞融合。细胞融合后，去除PEG，以规定浓度接种融合细胞，使用HAT选择性培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的培养基)等培养数日～数周，使杂交瘤细胞以外的细胞死灭，选择性地培养杂交瘤细胞。从选择性培养液中存活的杂交瘤细胞中筛选出分泌目标抗体的杂交瘤细胞。筛选方法并不特别限定，例如，通过利用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay：酶联免疫吸附测定)法、流式细胞术、蛋白质印迹法、斑点杂交法、放射免疫测定法等的体系调查抗原与杂交瘤细胞培养上清液中的抗体之间有无结合性，可以挑选目标杂交瘤细胞株。而且，挑选分泌目标抗体的杂交瘤细胞，根据需要进行单克隆，构建分泌抗体的杂交瘤细胞。
例如，将建好的杂交瘤细胞株在已知的培养基和条件下培养，获得其培养上清液，由此能够获得单克隆抗体。另外，通过将该杂交瘤细胞株投用到小鼠等的腹腔内，使之增殖，回收其腹水，能够获得高浓度的单克隆抗体。
还可以使用已知方法提纯培养上清液和腹水中等含有的抗体。例如采用乙醇沉淀法、等电点沉积法、电泳法、利用离子交换柱(例如DEAE)的吸附法与解吸法、超离心法、凝胶过滤法、使用活性吸附剂(蛋白A、蛋白G等)的方法、亲和层析法等，能够高纯度地提纯抗体。
作为建好的杂交瘤细胞株，例如可以将保藏号NITE BP-02602(保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，所在地：日本国2920818千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8，原保藏日：2017年12月27日)、保藏号NITE BP-02603(保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，所在地：日本国2920818千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8，原保藏日：2017年12月27日)、保藏号NITE BP-02604(保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，所在地：日本国2920818千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8，原保藏日：2017年12月27日)、保藏号NITE BP-02605(保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，所在地：日本国2920818千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8，原保藏日：2017年12月27日)、保藏号NITE BP-02606(保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，所在地：日本国2920818千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8，原保藏日：2017年12月27日)中的任一种作为一对组合来使用。保藏号NITE BP-02602的杂交瘤细胞株是分泌表位为犬NT-proANP的氨基酸序列31～42位中任一部位的抗体的细胞株；保藏号NITE BP-02603的杂交瘤细胞株是分泌表位为犬NT-proANP的氨基酸序列49～60位中任一部位的抗体的细胞株；保藏号NITE BP-02604的杂交瘤细胞株是分泌表位为犬NT-proANP的氨基酸序列45～54位中任一部位的抗体的细胞株；保藏号NITE BP-02605的杂交瘤细胞株是分泌表位为犬NT-proANP的氨基酸序列55～64位中任一部位的抗体的细胞株；保藏号NITE BP-02606的杂交瘤细胞株是分泌表位为犬NT-proANP的氨基酸序列55～64位中任一部位的抗体的细胞株。因此，能够(1)将保藏号NITEBP-02602的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和保藏号NITE BP-02603的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为本发明的抗体组合；(2)将保藏号NITE BP-02602的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和保藏号NITE BP-02604的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为本发明的抗体组合；(3)将保藏号NITE BP-02602的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和保藏号NITE BP-02605或保藏号NITE BP-02606的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为本发明的抗体组合；(4)将保藏号NITE BP-02604的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和保藏号NITE BP-02605或保藏号NITE BP-02606的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体作为本发明的抗体组合等。
＜本发明的夹心免疫检测法＞
本发明包括所有使用了上述抗体组合的夹心免疫检测法，即所有使用了表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体的夹心免疫检测法。
如上所述，在本发明中，使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位且各表位互不重叠的捕获用第一抗体和标记用第二抗体。因此，通过使用两抗体，除了能够捕获和检测出血液中等存在的全长的proANP(1～126位)、全长的NT-proANP(1～98位)外，还能毫无遗漏地捕获和检测出具有31～98位或31～126位的氨基酸序列的片段(在30-31位间被切断的产物)、具有1～67位的氨基酸序列的片段(在67-68位间被切断的产物)以及具有31～67位的氨基酸序列的片段(在30-31位间和67-68位间被切断的产物)等。也就是说，无论是否被切断或者在哪个部位被切断，理论上都能检测出与proANP或其切断产物即NT-proANP同等的物质量。
通过将上述一对抗体分别作为捕获用抗体和标记用抗体来使用，能够利用夹心免疫检测法，简单且高精度地捕获和检测出NT-proANP或其片段。夹心免疫检测法能够广泛采用已知方法，并不特别限定。例如可以采用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay：酶联免疫吸附测定)等夹心酶免疫测定法(EIA法)、基于夹心法的免疫层析法、夹心放射免疫测定法(RIA法)、夹心萤光免疫分析法(FIA法)、夹心化学发光免疫分析法(CLIA法)、夹心化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)等。
在基于ELISA法的夹心免疫检测中，可以采用已知方法测定，例如包含以下步骤的方法：使捕获用一抗固相化；添加样本；添加被实施了酶标记的第二抗体；添加底物溶液；以及测定吸光度。具体而言，例如首先使捕获用第一抗体在96孔板、聚苯乙烯珠粒等珠粒、试管、硝酸纤维素等的膜等支承体上固相化，进行清洗，添加封闭剂，进行清洗。接下来，添加样本并培养后，进行清洗。接下来，添加被实施了酶标记的标记用第二抗体并培养后，进行清洗。接下来，添加针对酶的发色底物溶液，以一定时间通过酶反应使底物变为色素后，添加反应终止液，终止酶反应。酶反应终止后，测定吸光度，基于该色素的显色程度，计算测试样本中的抗原量。按照这些步骤，能够定量地测定NT-proANP或其片段。能够用作标记的酶可以使用β-半乳糖苷酶(βGAL)、碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)等，发色底物可以使用TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)等，反应终止液可以使用硫酸等酸。
在基于免疫层析法的夹心免疫检测中，可以采用已知方法测定，例如包含如下步骤的方法：向液体因毛细现象而扩展的流路的上游侧供给上述样本；一边使上述液体从上述流路的上游侧向下游侧扩展一边使上述样本依次通过用标记物质标记了的上述第二抗体被保持的第一区域和上述第一抗体被固定在上述流路上的第二区域。使捕获用第一抗体在流路上的特定区域固定化后，向该流路上的上游供给样本，由此样本从流路的上游向下游浸透移动，在中途，样本中的抗原与被标记了的第二抗体结合，该抗原抗体复合体进一步向下游浸透移动。然后，该抗原抗体复合体被捕获用第一抗体捕获，存留于其区域，因此，能够基于标记物质对该区域的着色程度半定量或定性地简单且高精度地测定NT-proANP或其片段。此外，使用标记物质标记第二抗体能够采用已知方法实施。标记物质可以使用聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物等有机高分子的乳胶着色颗粒、金胶体、银胶体等金属胶体、金属硫化物等金属颗粒等。
在基于夹心放射免疫测定法(RIA法)的夹心免疫检测中，可以采用已知方法测定，例如包含以下步骤的方法：使捕获用一抗固相化；添加样本；添加用放射性同位素标记了的第二抗体；以及测定放射活性。具体而言，例如首先在样本中添加使捕获用第一抗体固相化了的珠粒并混和，在25～37℃下培养1～4小时后，进行清洗。接下来，添加含有用放射性同位素标记了的第二抗体的溶液，在25～37℃下培养1～4小时后，进行清洗。接下来，回收珠粒，使用伽玛射线计数器等检测与珠粒结合了的抗原抗体复合体的放射能量。用来标记的放射性元素可以使用14C、3H、32P、125I、131I等。使用放射性同位素标记抗体能够采用已知方法、例如氯胺T法、过氧化物酶法、Iodogen法(碘化法)、Bolton-Hunter试剂法等实施。
在基于夹心萤光免疫分析法(FIA法)的夹心免疫检测中，可以采用已知方法测定，例如包含如下步骤的方法：使捕获用一抗固相化；添加样本；添加用萤光物质标记了的第二抗体；以及测定萤光强度。萤光物质可以使用荧光素、氟胺、异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明等。
在基于夹心化学发光免疫分析法(CLIA法)的夹心免疫检测中，可以采用已知方法测定，例如包含以下步骤的方法：使捕获用一抗固相化；添加样本；添加用发光物质标记了的第二抗体；以及测定发光强度。发光物质可以使用虫荧光素、鲁米诺、鲁米诺衍生物、吖啶酯等。
在基于夹心化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)的夹心免疫检测中，可以采用已知方法测定，例如包含如下步骤的方法：使捕获用一抗在抗体结合性磁性颗粒上固相化；添加样本；添加用萤光物质标记了的第二抗体；利用磁力对其复合体进行聚磁；以及测定发光强度。发光物质可以使用虫荧光素、鲁米诺、鲁米诺衍生物、吖啶酯等。
＜本发明的心力衰竭检测方法＞
本发明是通过实施上述夹心免疫检测来检测出心力衰竭的心力衰竭检测方法，亦即使用了从活体采集的样本的心力衰竭检测方法，包括所有使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体来对上述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测从而检测出心力衰竭的心力衰竭检测方法。
如上所述，通过使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位且是与上述第一抗体不重叠的部位的标记用第二抗体来对上述样本中含有的NT-proANP实施夹心免疫检测，由此能够简单且高精度地捕获和检测出NT-proANP或其片段。ANP的前体即proANP在心房的内压上升和体液量增加等的刺激下由心房肌细胞等分泌到血液中，此时，proANP被切断为NT-proANP和ANP。因此，在因充血性心力衰竭等致使血液中的ANP增加了时，能够推断血液中的NT-proANP或其片段也以相同的物质量增加。因为能够推断NT-proANP或包含其氨基酸序列31～67位的片段比ANP稳定性高、半衰期长，所以通过使用本发明的方法高精度地检测NT-proANP或其片段，能够简单且高精度地检测出心力衰竭。
本发明能够用于对心力衰竭即心脏的血液输出不足、无法保证全身所需的循环量的病症的检测。特别是对早期发现充血性心力衰竭等表现出心房的内压上升、体液量增加等症状的病症有效。例如，可以用于对ISACHC(International Small Animal CardiacHealth Council：国际小动物心脏健康理事会)I～II级或ACVIM(American College ofVeterinary Internal Medicine：美国兽医内科学院，以下皆同)指南的A～B2阶段、即无症状～中等程度的心房性慢性心力衰竭的检测等。另外，利用本发明能够早期且高精度地检测出心力衰竭，因此对成为心力衰竭病因的疾病(先天性心脏病除外)、例如心脏瓣膜病(例如二尖瓣关闭不全、三尖瓣关闭不全、主动脉瓣关闭不全、肺动脉瓣关闭不全等)、心肌疾病(例如扩张性心肌病、肥厚性心肌病、心肌炎等)、盘尾丝虫病、血管疾病(例如血栓、塞栓、动脉硬化等)、高血压症等的检测和早期发现也是有效的。
上述夹心免疫检测的测定值显示出与心力衰竭的发展程度有显著的相关性。因此，可以基于按照上述的使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体来对上述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测的步骤、以及根据该测定值判定心力衰竭发展程度的步骤所得到的定量的测定值判定心力衰竭的发展阶段。
另外，还可以预先设定与心力衰竭的发展阶段相对应的阈值，按照使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体来对上述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测的步骤、以及当该测定值大于上述阈值时判定与该阈值相对应的发展阶段的步骤来判定心力衰竭的发展阶段。通过这些，不仅能够检测出心力衰竭，连其发展程度也能简单且高精度地检测出。
本发明的心力衰竭检测方法既能用于包括人在内的哺乳动物的心力衰竭检测，也能有效地检测非人类哺乳动物、例如犬或猫的心力衰竭。在该情况下，如上所述，使用能够对想要检测心力衰竭的动物种类的NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一区域进行识别的一对抗体、即以该动物种类的NT-proANP中任一氨基酸序列31～67位中任一部位为表位的一对抗体分别实施夹心免疫检测，检测出该动物种类的心力衰竭。例如，可以基于人NT-proANP、犬NT-proANP、猫NT-proANP的氨基酸序列制作一对抗体，使用它们分别检测出人、犬、猫的心力衰竭。
此外，当一对抗体的两种表位为动物种类间共通的序列时，该抗体也能够识别与原来的动物种类不同的动物种类的NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一区域，因此，能够利用相同的抗体组合检测两种以上动物种类的心力衰竭。例如，犬NT-proANP的氨基酸序列45～54位和55～64位与人NT-proANP的该部位的序列完全相同，因此，通过使用表位为犬NT-proANP的氨基酸序列45～54位中任一部位的抗体和表位为犬NT-proANP的氨基酸序列55～64位中任一部位的抗体的组合来实施夹心免疫检测，能够以相同的抗体组合检测出犬和人的心力衰竭。
实施心力衰竭检测时所采用的夹心免疫检测法能够广泛采用上述方法。例如，在使用ELISA法测定上述样本中含有的NT-proANP或其片段时，能够定量地测定心力衰竭的发病、其严重程度或其风险程度；在使用免疫层析法测定上述样本中含有的NT-proANP时，能够定性或半定量地测定心力衰竭的发病、其严重程度或其风险程度。
用于该心力衰竭检测方法(或者夹心免疫检测法)的样本可以例举出血液、血清、血浆、尿等从活体采集的对象动物的体液和排泄物等。
＜本发明的心脏肥大检测方法＞
本发明是对作为心力衰竭发展程度指标的心脏肥大(的病状)的检测方法，广泛包括包含使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对上述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测的步骤、以及在该测定值大于预先设定的临界值时判定为心脏肥大的步骤的心脏肥大检测方法等。
心力衰竭的发展中被认为心脏肥大的阶段相当于ACVIM指南中的B2阶段。当到达C阶段时，心力衰竭发病，难以治疗，因此，B2阶段是虽然尚无临床症候但需要开始治疗的阶段，从早期发现的观点来看，也是非常重要的阶段。针对于此，在本发明的夹心免疫检测中，通过判定其测定值是否大于预先设定的特定的临界值，能够简单且高精度地检测出是否为被认为心脏肥大的阶段。
临界值能够根据用于夹心免疫检测的抗体的结合性和敏感度等适当地设定。例如，可以使用从被预先诊断出发展阶段的多个检体采集的各样本分别实施夹心免疫检测，根据其测定值，设定适合的阈值作为临界值。
＜本发明的心力衰竭检测用器具＞
本发明包括使用上述抗体组合并利用免疫层析法检测心力衰竭的所有器具。作为具体的构成，例如可以是向液体因毛细现象而扩展的流路供给从活体采集的样本并使用免疫层析法来检测心力衰竭的心力衰竭检测用器具，且上述流路从上游侧开始依次为(1)供给上述样本样本供给部、(2)保持用标记物质标记了的第二抗体的标记抗体保持部、以及(3)其为由细长部件形成的主体部分且捕获用第一抗体以与长边方向大致垂直的方向呈大致线状地被固定在上述细长部件的规定位置上的测定部，上述两抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位。
图1是示出本发明的心力衰竭检测用器具例子的内部构造的立体示意图。此外，本发明并不狭窄地仅局限于图1所示的形态。
在图1的心力衰竭检测用器具A中，配置有供给样本的样本供给部1、保持用标记物质标记了的第二抗体的标记抗体保持部2、作为由细长部件形成的主体部分的测定部3、以及对扩展开来的样本进行吸收的吸收部4，通过样本供给部1与标记抗体保持部2、标记抗体保持部2与测定部3(以及测定部3与吸收部4)分别接触，由此形成液体因毛细现象而从上游侧C1向下游侧C2扩展的一连串的流路C。
样本供给部1是供给样本的部位。例如，通过使测定对象样本滴下至样本供给部1的上表面大致中央区域11，向心力衰竭检测用器具A供给样本。在图1中，至少使形成于大致矩形的板片上的样本供给部1的下表面的一部分与标记抗体保持部2的上表面有表面接触，所供给的样本向标记抗体保持部2扩展。
样本供给部1的材质只要是能够使所供给的样本向标记抗体保持部2扩展的材料即可，能够广泛采用已知的材质，并不特别限定。例如，可以使用由纤维素纤维、玻璃纤维、聚氨酯、聚乙酸盐、醋酸纤维素、尼龙等形成的材料。
标记抗体保持部2是保持用标记物质标记了的第二抗体的部位。例如，通过事先将一定量的已标记抗体溶液滴下到该部位或者浸泡该部位并进行干燥，能够事先使该部位保持用标记物质标记了的第二抗体。在图1中，至少使在大致矩形的板片上形成的标记抗体保持部2的上表面的一部分与样本供给部1的下表面进行表面接触，被供给至样本供给部1的样本向标记抗体保持部2扩展。另外，还至少使在大致矩形的板片上形成的标记抗体保持部2的下表面的一部分与测定部3的上表面有表面接触，扩展至标记抗体保持部2的样本向标记部3扩展。此时，当样本中含有NT-proANP或其片段时，以该NT-proANP等与标记第二抗体的复合体的形式向标记部3扩展。
标记抗体保持部2的材质只要是能够使从样本供给部1扩展开来的样本向测定部3扩展的材料即可，能够广泛地采用已知的材质，并不特别限定。例如，可以使用由纤维素纤维、玻璃纤维、无纺布等形成的材料。此外，如上所述，用标记物质标记第二抗体能够采用已知方法实施。标记物质可以使用聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物等有机高分子的乳胶着色颗粒、金胶体、银胶体等金属胶体、金属硫化物等金属颗粒等。
测定部3是由片状的细长部件形成的主体部分，是层析载体部分。在图1中，测定部3的上游侧的上表面的一部分与标记抗体保持部2的下表面有表面接触，样本(样本中含有NT-proANP或其片段时，包含NT-proANP等与标记第二抗体的复合体)从标记抗体保持部2向测定部3扩展，进一步在测定部3从上游侧C1向下游侧C2扩展。
测定部3的材质只要是使液体因毛细现象而扩展的材料、即作为层析载体发挥功能的材料即可，能够广泛采用已知材料，并不特别限定。多孔性载体可以使用由硝酸纤维素膜、纤维素膜、乙酰纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维、无纺布等形成的载体。
在图1中，在测定部3的中间区域32的大致下游侧C2形成有大致线状的第一抗体固定化区域31。在该第一抗体固定化区域31，捕获用第一抗体以与长边方向大致垂直的方向以俯视下呈大致线状地被固定在作为测定部3的主体部分的上述细长部件的规定位置上。当在测定部3从上游侧C1向下游侧C2扩展的样本中含有NT-proANP或其片段与标记第二抗体的复合体时，该复合体会在第一抗体固定化区域31被捕获，由此标记物质聚集到该区域31，因此，当样本中含有NT-proANP或其片段时，第一抗体固定化区域31被着色，使有无抗原可视化。通过检测该着色的有无或程度，能够测定样本中是否含有NT-proANP或其片段，能够检测出心力衰竭。
吸收部4是通过吸收来回收经由样本供给部1、标记抗体保持部2扩展至测定部3的下游侧C2的样本的部位。吸收部4的材质可以使用滤纸等吸收性能强的材料等。
这样，在本器具A中，在样本从样本供给部1至吸收部4、从流路C的上游侧C1向下游侧C2扩展的过程中，在标记抗体保持部2形成NT-proANP或其片段与标记第二抗体的复合体，该复合体在测定部3的第一抗体固定化区域31被捕获，由此该区域31被标记物质着色。通过检测该着色的有无或程度，能够定性或半定量地测定样本中是否含有NT-proANP或其片段，基于其结果，能够检测心力衰竭的发病、其严重程度或其风险程度。
实施例1
在实施例1中，尝试制作了与犬NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位结合的单克隆抗体。
准备了两种合成肽，即在犬NT-proANP的氨基酸序列32～67位序列的C末端侧添加半胱氨酸的合成肽和同样在犬NT-proANP的氨基酸序列31～66位的N末端侧添加半胱氨酸的合成肽。而且，使前一种合成肽的C末端侧和后一种合成肽的N末端侧分别与KLH结合。KLH与各合成肽的结合是使用马来酰亚胺类试剂实施的。
将制成的两种KLH结合肽作为抗原分别投用给小鼠，使之免疫。每隔2周对小鼠(Balb/c、雌性、7周龄，日本查尔斯河实验室(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN,INC.))进行各KLH结合肽的腹腔内投用，共5次，初次各投用100μg，第二次及之后各投用50μg，并且在最后一次投用的9周后，作为增强免疫，向腹腔内投用了126μg并向尾静脈投用了60μg。在初次免疫中，与弗氏完全佐剂混合后投用，在第2～5次免疫中与弗氏不完全佐剂混合后投用，在增强免疫中，与D’s PBS(-)混合后投用。
在最后一次免疫的3日后，从已免疫的各小鼠取出脾脏，使用50％的聚乙二醇(Merck公司制)使其脾脏细胞(6.27×108个)与骨髓瘤细胞(P3U1株；6.27×107个)融合，使用HAT选择性培养基进行培养后进行了挑选。
在细胞融合的10日后，使用ELISA法实施了对分泌与犬NT-proANP结合的抗体的杂交瘤细胞株的筛选。准备将山羊抗小鼠IgG抗体固定在孔底的干板，使用含有0.05％的Tween 20的PBS(phosphate buffer saline：磷酸缓冲盐溶液，以下称“PBST”)清洗3次后，在各孔中添加25％BLOCK ACE(DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD制)溶液200μL，在室温下静置1小时，实施了阻断。接下来，使用PBST清洗3次后，在各孔中分别加入50μL各杂交瘤细胞株的培养上清液，然后使用含有0.1％BSA的D’s PBS(-)制备出犬NT-proANP的31-67位的合成肽的C端侧结合有赖氨酸生物素的物质后，在各孔中分别加入50μL，使其在室温下反应了3小时。接下来，使用含有0.05％Tween 20的生理盐水清洗4次后，在各孔中分别添加100μLHRP标记链霉亲和素偶联物溶液，使其在室温下反应2小时，然后清洗4次后，分别添加100μL的OPD(SIGMA公司制)，使其在室温下进行30分钟的酶反应，添加100μL的1M硫酸溶液，停止了反应。使用读板机测定了各孔在主波长490nm下的吸光度。
使用有限稀释法对筛选中呈阳性的杂交瘤细胞株进行克隆，共构建了11株分泌与犬NT-proANP结合的抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞株。使用这些细胞株的培养上清液，用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Roche公司制)对分泌抗体的亚型进行检测，结果为IgG1(κ)或IgG2b(κ)。
准备了多个具有犬NT-proANP的31～67位氨基酸序列中任一部分序列的长度为10～15个氨基酸的合成肽，使用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)分别制备了这些合成肽，在96孔板的各孔中分别加入了100μL，在室温下静置了5小时，使其在底面固相化。使用PBS液清洗2次后，使用2％BSA溶液在4℃静置一晩，实施了阻断。使用PBS液清洗2次后，分别添加100μL的培养上清液，在室温下静置了2小时。使用PBST清洗3次，使用PBS清洗2次，共清洗5次后，分别添加100μL用0.5％BSA液制备的AP标记山羊抗小鼠IgG抗体，在室温下静置了1小时。然后，使用PBST清洗3次，使用PBS清洗2次，共清洗5次后，添加100μL的pNPP试液，在室温下连续测定15～60分钟间、405nm下的吸光度，实施了各杂交瘤细胞分泌的抗体的表位鉴定。其结果是，所得到的杂交瘤细胞株是分泌表位分别为犬NT-proANP的氨基酸序列45～54位中任一部位、该序列49～60位中任一部位、该序列55～64位中任一部位、该序列31～42位中任一部位、该序列45～54位中任一部位、该序列39～51位或39～54位中任一部位的抗体的细胞株。
将这些杂交瘤细胞株中分泌表位为犬NT-proANP的氨基酸序列31～42位中任一部位的IgG2b(κ)抗体的细胞株命名为“KS1 Clone 3B3-31”，进行了国际保藏(保藏号NITEBP-02602)；将分泌表位为该序列49～60位中任一部位的IgG2b(κ)抗体的细胞株命名为“KS1 Clone 19B7-31”，进行了国际保藏(保藏号NITE BP-02603)；将分泌表位为该序列45～54位中任一部位的IgG1(κ)抗体的细胞株命名为“KS1 Clone 20C-13”，进行了国际保藏(保藏号NITE BP-02604)；将分泌表位为该序列55～64位中任一部位的IgG1(κ)抗体的细胞株命名为“KS2 Clone 1C12-5”，进行了国际保藏(保藏号NITE BP-02605)；将分泌表位为该序列55～64位中另一个任一部位的IgG1(κ)抗体的细胞株命名为“KS2 Clone No.31-4”，进行了国际保藏(保藏号NITE BP-02606)。
实施例2
在实施例2中，实施了使用在实施例1中构建的杂交瘤细胞株所分泌抗体的NT-proANP夹心免疫检测，验证了其反应性和特异性。
在96孔板(Nunc公司制)的各孔分别加入了100μL实施例1中构建的KS1Clone 20C-13株(保藏号NITE BP-02604)所分泌抗体(表位为犬NT-proANP的氨基酸序列45～54位中任一部位的抗体)作为一抗，在室温下静置了一晩，使其在底面固相化。使用300μL的PBST清洗3次后，添加300μL的PBS-BSA溶液(1～3％BSA)，在室温下静置2小时，实施了阻断。
接下来，准备N末端侧带有His标签的全长NT-proANP(重组体)、犬NT-proANP的氨基酸序列1～30位序列的合成肽、该序列31～67位序列的合成肽、该序列68～98位序列的合成肽这四种肽作为评价用抗原，将分别适当地制备为0pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL等的肽溶液中任一种在各孔中各添加100μL，在37℃下静置2小时，使用300μL的PBST清洗了3次。
接下来，使实施例1中构建的KS2 Clone No.31-4株(保藏号NITE BP-02606)所分泌抗体(表位为犬NT-proANP的氨基酸序列55～64位中任一部位的抗体)生物素化，作为二抗在各孔中分别添加100μL，在37℃下静置1小时，使用300μL的PBST清洗了3～5次。
接下来，将HRP标记链霉亲和素(R&D公司制)稀释为1/200，在各孔中分别添加100μL，在37℃下静置1小时，使用300μL的PBST清洗3～5次后，分别添加100μL的TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；KEM EN TEC公司制)，在37℃下进行20分钟酶反应，添加50μL的1N硫酸溶液停止了反应。然后，使用读板机测定了各孔在主波长450nm下的吸光度。
结果示于图2。图2是表示使用了实施例1中构建的杂交瘤细胞所分泌抗体的夹心ELISA结果的图表。在该图表中，横轴表示评价用抗原的添加浓度，纵轴表示OD值。另外，在该图表中，“NT-proANP”的折线示出以各浓度添加了全长NT-proANP作为评价用抗原时的结果；“片段1”的折线示出以各浓度添加了犬NT-proANP的氨基酸序列1～30位序列的合成肽作为评价用抗原时结果；“片段2”的折线示出以各浓度添加了该氨基酸序列31～67位序列的合成肽时的结果；“片段3”的折线示出以各浓度添加了该氨基酸序列68～98位序列的合成肽时的结果。
如图2所示，使用实施例1中构建的杂交瘤细胞所分泌的一对抗体实施了夹心ELISA，结果没有检测出犬NT-proANP的氨基酸序列1～30位序列的合成肽(片段1)和该序列68～98位序列的合成肽(片段3)，而以肽浓度依赖性方式检测出了犬全长NT-proANP和犬NT-proANP的氨基酸序列31～67位序列的合成肽。另外，考虑到犬全长NT-proANP的分子量(10466.5)和犬NT-proANP的氨基酸序列31～67位序列的肽的分子量(3815.2)，推测利用该夹心ELISA检测出的全长NT-proANP和NT-proANP的31～67位的片段的物质量大致相同。
由本结果证实了，通过使用实施例1中构建的杂交瘤细胞所分泌的一对抗体的夹心ELISA，能够高精度且特异性地检测出犬全长NT-proANP或其31～67位的片段。
实施例3
在实施例3中，尝试了通过使用了实施例1中构建的杂交瘤细胞株所分泌抗体的夹心免疫检测来检测心力衰竭。
从50只听诊结果没有心力衰竭症候的野外健康犬采集血液，使用含有1％BSA的PBS溶液适当稀释所得到的血液的血浆，将其作为评价用抗原的样本，利用与实施例2相同的夹心ELISA尝试了对NT-proANP或其片段的定量。以各浓度添加实施例2中N末端侧带有His标签的全长NT-proANP(重组体)作为评价用抗原，同时进行测定，由此制作了校准曲线。
其结果是，50只野外健康犬的血液中的NT-proANP或其片段的浓度平均为4ng/mL。
另一方面，以与健康犬相同的方法对4只疑似为ISACHC II级心力衰竭的犬采集血液，使用含有1％BSA的PBS溶液(pH5.5)适当稀释所得到的血液的血浆，将其作为评价用抗原的样本，利用与实施例2相同的夹心ELISA尝试了对NT-proANP或其片段的定量。此外，参加该试验的各犬的症状等如下。(1)绝育雌性，体重4.35kg，ISACHC II级，心杂音：左Levine(莱文法)IV级收缩期返流性杂音、右Levine(莱文法)II级收缩期返流性杂音，有二尖瓣黏液样变性、晕厥的症状；(2)雌性，体重23.3kg，ISACHC II级，心杂音：左Levine(莱文法)IV级收缩期返流性杂音、右Levine(莱文法)III级收缩期返流性杂音，有三尖瓣畸形、肺动脉高血压、肺动脉瓣狭窄的症状；(3)雌性，体重6.45kg，ISACHC II级，心杂音：Levine(莱文法)VI级，二尖瓣黏液样变性、三尖瓣返流的症状；(4)去势雄性，体重3.15kg，ISACHC II级，心杂音：左Levine(莱文法)VI级收缩期返流性杂音、右Levine(莱文法)V级收缩期返流性杂音，有二尖瓣黏液样变性的症状。
其结果是，4只疑似心力衰竭的犬的血液中的NT-proANP或其片段的浓度分别为平均27.9ng/mL、12.0ng/mL、13.8ng/mL、17.1ng/mL，与野外健康犬的浓度(平均4ng/mL)相比，显著升高。
实施例4
在实施例4中，以猫为检体，尝试了基于夹心免疫检测的心力衰竭检测。
从15只听诊结果没有心力衰竭症候的健康猫采集血液，用含有1％BSA的PBS溶液(pH5.5)适当稀释所得到的血液的血浆，将其作为评价用抗原的样本，按照与实施例3相同的步骤，测定了基于夹心ELISA的NT-proANP或其片段的浓度。此外，一抗(固相抗体)使用了实施例1中构建的KS1 Clone 19B7-31株(保藏号BP-02603)分泌的抗体，二抗(标记抗体)使用了在实施例1中构建的KS1 Clone 3B3-31株(保藏号BP-02602)所产生的抗体。
其结果是，15只健康猫的血液中的NT-proANP或其片段的浓度为980pg/mL、694pg/mL、1883pg/mL、2730pg/mL、915pg/mL、1970pg/mL、1624pg/mL、1650pg/mL、3125pg/mL、915pg/mL、946pg/mL、447pg/mL、367pg/mL、6278pg/mL、4656pg/mL，平均为1945pg/mL。由该结果可知，猫也能使用该检测系统测定。
接下来，以与健康猫相同的方法对2只患有心脏疾病的猫采集血液，使用含有1％BSA的PBS溶液(pH5.5)适当地稀释所得到的血液的血浆，将其作为评价用抗原的样本，尝试了对NT-proANP或其片段的定量。此外，各猫的症状等如下。(1)杂种，推断14岁，去势雄性，体重3.7kg，有肺动脉瓣狭窄症、三尖瓣畸形的症状。需要治疗。(2)杂种，12岁7个月，绝育雌性，3.95kg，有过量节制索型心肌病的症状。需要治疗。
其结果是，2只患有心脏疾病的猫的血液中的NT-proANP或其片段的浓度分别为平均23097pg/mL和平均15355pg/mL，与健康猫相比，显著升高。该结果表明，本实验中使用的两抗体与猫的NT-proANP具有交叉反应性，且猫也能够用该测定系统检测出心力衰竭。
实施例5
在实施例5中，研究了在以人为检体时是否也能应用本发明的夹心免疫检测。
从人(日本人、56岁、女性、健康、无药物治疗)采集血液，使用含有1％BSA的PBS溶液(pH5.5)适当稀释所得到的血液的血浆，按照与实施例3相同的步骤，测定了基于夹心ELISA的NT-proANP或其片段的浓度。以各浓度添加NT-proANP片段(氨基酸序列31-76位)的合成肽作为评价用抗原，同时进行测定，由此制作了校准曲线。
其结果是，血液中的NT-proANP或其片段的浓度为6.11ng/mL。该结果表明了人也能够应用该测定系统的可能性。
实施例6
在实施例6中，调查了本发明的夹心免疫检测的测定值与心力衰竭发展程度之间的相关性，并研究了用于判定心力衰竭发展程度的临界值。
基于ACVIM指南，从被诊断为A1阶段(40只)、B1阶段(22只)、B2阶段(37只)、C阶段(15只)、D阶段(8只)的共122只犬分别采集血液，使用含有1％BSA的PBS溶液(pH5.5)适当稀释所得到的血液的血浆，按照与实施例5相同的步骤，测定了基于夹心ELISA的NT-proANP或其片段的浓度。
结果示于图3。图3是示出心力衰竭发展程度与夹心免疫检测测定值之间的相关性的图表。图中的横轴表示基于ACVIM的心力衰竭阶段，纵轴表示从被诊断为各阶段的检体采集的血液中的NT-proANP浓度。在该图中，以五数概括法表示各阶段的NT-proANP浓度值，下端和上端的whisker(须)表示最小值和最大值；box(箱)表示第1四分位数和第3四分位数；box内的横杠表示中位数。另外，图中的圆圈表示通过剔除检验被剔除了的值。
如图3所示，随着心力衰竭阶段的发展，NT-proANP的测定值升高了。该结果证明了本发明的夹心免疫检测的测定值与心力衰竭发展程度之间存在相关性，并且表明能够利用该测定系统进行定量的、半定量的测定。
接下来，研究了用于将ACVIM指南的B1阶段以上的病状判定为阳性(心力衰竭检测)的临界值。将NT-proANP浓度的任意值作为阈值并调节该阈值的设定，在设定为各阈值时，根据全部122例NT-proANP测定值是否分别为大于阈值的值来判断阳性/阴性，并且与基于ACVIM指南的实际诊断对照，取得了该判断是否为正确判定的数据。接下来，关于全部122例，将正确判定为阳性的比例作为“敏感度(sensitivity)”，将正确判定为阴性的比例作为特异度(specificity)，将特异度作为横轴，将敏感度作为纵轴，描绘出ROC曲线。然后，使用Youden Index(约登指数)法计算出成为最大值的阈值作为最佳临界值，结果计算出，将ACVIM指南的B1阶段以上的病状判定为阳性(心力衰竭检测)时的最佳临界值为6281pg/mL(敏感度80.5％、特异度82.5％、阳性命中率90.3％、阴性命中率67.6％)。
该结果表明，在应用了该测定系统的情况下，例如在犬血中的NT-proANP的测定值大于等于6000pg/mL时，能够简单且高精度地在没有出现临床症状的极早期检测出ACVIM指南的B1阶段以上的心力衰竭病状。基于该见解，可以将大于等于6000pg/mL的值设定为用于使用本测定系统判定是否为ACVIM指南B1阶段以上的临界值。例如，优选将该临界值设为6000～6500pg/mL的值，更优选设为6100～6400pg/mL的值，最优选设为6200～6300pg/mL的值。
接下来，研究了用于将ACVIM指南的B2阶段以上的病状(具体指胸部X射线检查时VHS(Vetebral Heart Size：椎体心脏比分)大于10.2的情况、或者心脏超声检查时LA/Ao比大于等于1.6的情况)判定为阳性(心力衰竭检测)的临界值。与上述相同，将NT-proANP浓度的任意值作为阈值并调节该阈值的设定，在设定为各阈值时，根据全部122例NT-proANP测定值是否分别为大于阈值的值来判断阳性/阴性，并且与基于ACVIM指南的实际诊断对照，取得了该判断是否为正确判定的数据。接下来，关于全部122例，将正确判定为阳性的比例作为“敏感度(sensitivity)”，将正确判定为阴性的比例作为特异度(specificity)，将特异度作为横轴，将敏感度作为纵轴，描绘出ROC曲线。然后，使用Youden Index法计算出成为最大值的阈值作为最佳临界值，结果计算出，将ACVIM指南的B2阶段以上的病状判定为阳性(心力衰竭检测)时的最佳临界值为8498pg/mL(敏感度83.7％、特异度78.4％、阳性命中率67.6％、阴性命中率89.9％)。
该结果表明，在应用了该测定系统的情况下，例如在犬血中的NT-proANP的测定值大于等于8000pg/mL时，能够简单且高精度地在没有出现临床症状的早期检测出ACVIM指南的B2阶段以上的心力衰竭病状。基于该见解，可以将大于等于8000pg/mL的值设定为用于使用本测定系统判定是否为ACVIM指南的B2阶段以上的临界值。例如，优选将该临界值设为8000～9000pg/mL的值，更优选设为8200～8800pg/mL的值，最优选设为8400～8600pg/mL的值。
需要说明的是，在对心力衰竭的诊断、治疗开始进行判断时，多数情况下根据是否已发展到该阶段进行判断。因此，本发明的该测定手段在能够针对犬简单且高精度地判定是否为ACVIM指南的B2阶段以上的病状这一点上有用性较高。
附图说明
图1是示出本发明的心力衰竭检测用器具的例子的内部构造的立体示意图。
图2是示出实施例2中使用了实施例1中构建的杂交瘤细胞所分泌抗体的夹心ELISA结果的图表。
图3是示出实施例6中心力衰竭发展程度与夹心免疫检测的测定值之间的相关性的图表。
附图符号说明
1 样本供给部
2 标记抗体保持部
3 测定部
4 吸收部
A 心力衰竭检测用器具
B 流路
C1 上游侧
C2 下游侧
序列表
<110> 共立制药股份有限公司
<120> 心力衰竭检测方法
<130> KR014
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 灰狼(Canis lupus)
<400> 1
Asn Pro Val Tyr Gly Ser Val Ser Asn Ala Asp Leu Leu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Asn Leu Leu Asp Arg Leu Glu Asp Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Glu Ser Pro Gln Ala Leu Ser Glu Gln Asn Ala Glu Ala Gly Ala Ala
35 40 45
Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro
50 55 60
Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Ser Pro Trp Asp Ser Ser
65 70 75 80
Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Ala Ala
85 90 95
Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg
100 105 110
Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
115 120 125

Claims (9)

1.一种心力衰竭检测方法，使用了从活体采集的样本，其中，
使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对所述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测，来检测心力衰竭。
2.根据权利要求1所述的心力衰竭检测方法，其中，
上述第二抗体的表位不是与上述第一抗体重叠的部位。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的心力衰竭检测方法，其中，
使用免疫层析法，测定上述样本中含有的NT-proANP或其片段。
4.根据权利要求3所述的心力衰竭检测方法，其中，
包括向液体因毛细现象而扩展的流路的上游侧供给上述样本的步骤、
以及一边使上述液体从上述流路的上游侧向下游侧扩展一边使上述样本依次通过用标记物质标记了的上述第二抗体被保持的第一区域和上述第一抗体被固定在上述流路上的第二区域的步骤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的心力衰竭检测方法，其中，
检测犬、猫或人的心力衰竭。
6.一种心脏肥大的检测方法，所述心脏肥大是心力衰竭发展程度的指标，其中，
包括使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对上述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测的步骤、
以及当该测定值超过预先设定的临界值时判定为心脏肥大的步骤。
7.一种心力衰竭检测用器具，用来向液体因毛细现象而扩展的流路供给从活体采集的样本，使用免疫层析法检测心力衰竭，其中，
上述流路从上游侧开始依次为(1)其用于供给上述样本的样本供给部、(2)保持用标记物质标记了的第二抗体的标记抗体保持部、以及(3)其是由细长部件形成的主体部分且捕获用第一抗体以与长边方向大致垂直的方向大致呈线状地被固定在所述细长部件的规定位置上的测定部，
上述两抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位。
8.一种夹心免疫检测法，其中，
使用了表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体。
9.一种抗体的组合，用于夹心免疫检测的捕获用抗体和标记用抗体这两种抗体的组合，其中，
上述两抗体的表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位，并且各表位互不重叠。
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