KR20240022452A - SARS-CoV-2의 면역 측정 방법 및 면역 측정 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 의해, 생체 시료 중의 SARS-CoV-2의 면역 측정 방법이며, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 2종류 사용하고, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 다른 에피토프를 인식하는, 면역 측정 방법이 제공된다.
Description
본 발명은, SARS-CoV-2의 면역 측정 방법 및 면역 측정 키트에 관한 것이다.
본원은, 2021년 6월 16일에 일본에 출원된 일본 특허 출원 제2021-100123호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
SARS-CoV-2는 코로나 바이러스 질병(coronavirus disease) 2019(COVID-19)를 야기하는 바이러스이다. SARS-CoV-2는 게놈으로서 단일쇄 플러스쇄 RNA를 갖는, 코로나 바이러스과에 속해 있다. 현재, 코로나 바이러스 질병 2019가 전세계에 유행하여, 많은 감염자가 발생하였다.
SARS-CoV-2의 검출을 위해서, PCR 검사나 항원 검사가 사용되고 있다. 항원 검사는 검체 채취로부터 십수분 정도로 결과의 확인이 가능하므로, PCR 검사보다 간편하게 검사를 행할 수 있다. 그 반면, SARS-CoV-2의 신속 검출을 위해서는 고감도로 특이적인 검사가 요구된다. 그러나, 항원 검사는 일반적으로 PCR 검사보다도 저감도이다. 따라서, 보다 고감도의 항원 검사가 요구되고 있다.
바이오 인포매틱스를 사용하여, SARS-CoV-2의 아미노산 서열 중의, 면역 측정을 위한 에피토프가 될 수 있는 영역의 예측도 행해지고 있다(비특허문헌 1). 그러나, 기재되어 있는 영역을 에피토프로서 인식하는 항체의 제작은 실제로 행해지지 않았다.
또한, 일반적으로, 2종류의 항체를 사용하여 샌드위치계를 구축함으로써, 항원을 고감도로 측정하는 항원 검사가 가능해진다. 그러나, SARS-CoV-2를 항원으로 한 경우, 어떤 항체를 조합하여 샌드위치계를 구축하면 좋을지, 아직 불분명하였다.
PATHOGENS AND GLOBAL HEALTH 2020, VOL.114, N0.8, 463-470 Immunodominant regions prediction of nucleocapsid protein for SARS-CoV-2 early diagnosis: a bioinformatics and immunoinformatics study
「에스플라인(등록 상표) SARS-CoV-2」(후지레비오사) 체외 진단용 의약품의 첨부 문서
「퀵나비(등록 상표)-COVID19 Ag」(덴카사) 체외 진단용 의약품의 첨부 문서
본 발명의 과제는, 고감도로 신속한 면역 측정이 가능한 SARS-CoV-2 면역 측정 키트 및 SARS-CoV-2의 면역 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토하였다. 그리고, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질에 있어서, 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하여, 각각 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명자들은 실시예에 있어서, 본 발명의 면역 측정 방법의 일 실시 형태와 시판되고 있는 SARS-CoV-2 항원 검출용 시약인, 에스플라인(등록 상표) SARS-CoV-2(후지레비오사)(비특허문헌 2) 및 퀵나비(등록 상표)-COVID19 Ag(덴카사)(비특허문헌 3)의 감도를 비교하였다. 본 발명의 면역 측정 방법의 일 실시 형태는, 이들 2종의 시약에 대하여, 더 짧은 측정 시간에 동등 이상의 감도를 나타내고 있다.
구체적으로, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 생체 시료 중의 SARS-CoV-2의 면역 측정 방법으로서, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 2종류 사용하고, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 다른 에피토프를 인식하는, 면역 측정 방법.
[2] 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, 27 내지 30의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편인, [1]에 기재된 면역 측정 방법.
[3] 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질의 C 말단 영역에 위치하는, [1] 또는 [2]에 기재된 면역 측정 방법.
[4] 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편인, [1]에 기재된 면역 측정 방법.
[5] 상기 생체 시료가 호흡기 분비액인, [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 방법.
[6] 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 및 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 표지 물질과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있고, 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 고상과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 방법.
[7] 이하의 공정을 포함하는, [6]에 기재된 면역 측정 방법.
(1) 생체 시료와, 표지 물질에 결합되어 있는 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 접촉시켜, 제1 복합체를 형성하는 공정,
(2) 상기 제1 복합체와, 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 접촉시켜, 제2 복합체를 형성하는 공정, 및
(3) 표지 물질에서 유래하는 시그널을 측정하는 공정.
[8] 상기 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 상기 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편인, [7]에 기재된 면역 측정 방법.
[9] 면역 크로마토그래피 또는 ELISA인, [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 방법.
[10] 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 이하의 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택되는, [1] 내지 [9] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 방법.
(1) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(2) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(3) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 것의 항체 또는 그 항체 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 각각 80% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체 단편.
[11] 생체 시료 중의 SARS-CoV-2의 면역 측정 키트로서, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 2종류 포함하고, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 각각 다른 에피토프를 인식하는, 면역 측정 키트.
[12] 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, 27 내지 30의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편인, [11]에 기재된 면역 측정 키트.
[13] 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질의 C 말단 영역에 위치하는, [11] 또는 [12]에 기재된 면역 측정 키트.
[14] 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편인, [11]에 기재된 면역 측정 키트.
[15] 상기 생체 시료가 호흡기 분비액인, [11] 내지 [14] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 키트.
[16] 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 및 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 표지 물질과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있고, 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 고상과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있는, [11] 내지 [15] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 키트.
[17] 상기 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 상기 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편인, [16]에 기재된 면역 측정 키트.
[18] 면역 크로마토그래피 또는 ELISA용의 키트인, [11] 내지 [17] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 키트.
[19] 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 이하의 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택되는, [11] 내지 [18] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 키트.
(1) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(2) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(3) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR과, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 것의 항체 또는 그 항체 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 각각 80% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체 단편.
또한, 본 발명은 이하의 실시 형태도 포함한다.
(A) 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 LLPAA(서열 번호 26)로 표시되는 아미노산 서열을 에피토프로서 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 및 LDDFSKQLQ(서열 번호 27)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편인, [1] 내지 [10] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 방법.
(B) 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 LLPAA(서열 번호 26)로 표시되는 아미노산 서열을 에피토프로서 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 및 LDDFSKQLQ(서열 번호 27)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편인, [11] 내지 [19] 중 어느 것에 기재된 면역 측정 키트.
본 발명에 따르면, 고감도로 신속한 분석이 가능한 SARS-CoV-2 면역 측정 키트 및 SARS-CoV-2의 면역 측정 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 항체의 에피토프 해석에 사용한 합성 펩티드의 아미노산 서열과 뉴클레오캡시드 단백질 상의 아미노산 서열의 대응 관계를 나타내는 도면이다.
도 2는 항체의 에피토프 해석에 사용한 합성 펩티드의 아미노산 서열과 뉴클레오캡시드 단백질 상의 아미노산 서열의 대응 관계를 나타내는 도면이다.
1. SARS-CoV-2의 면역 측정 방법
(생체 시료)
본 명세서에 있어서의 「생체 시료」로서는, 주로 생체 유래의 고형 조직 및 체액을 들 수 있다.
생체 시료로서는, 혈액, 혈청, 혈장, 오줌, 눈물, 귀고름, 전립선액 또는 호흡기 분비액을 들 수 있다. 호흡기 분비액이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 「호흡기 분비액」이란, 호흡기의 조직 내 또는 표면에 있어서 분비되는 체액을 의미한다. 호흡기 분비액으로서는, 비공, 비강, 인두, 비인두, 구강, 기관, 기관지, 또는 및 폐 등에 있어서 분비되는 체액을 들 수 있지만, 비인두 닦음액, 비강 닦음액, 타액 또는 객담이 특히 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서 「호흡기」란, 호흡에 관련되는 기관의 총칭이며, 코 전정으로부터, 비강, 인두, 후두, 기관, 기관지, 세기관지를 지나 폐포(폐)까지의 기관을 말한다.
생체 시료를 채취하는 대상은, 인간 또는 동물(예를 들어, 원숭이, 개 또는 고양이)을 포함하고, 바람직하게는 인간이다. 생체 시료는 대상으로부터의 생체 시료 그 자체여도 되고, 채취한 생체 시료에 통상 행해지는 희석, 농축 등의 처리를 행한 것이어도 된다. 또한, 본 발명의 면역 측정 방법에 사용되는 생체 시료의 채취나 조제를 행하는 사람은, 본 발명의 면역 측정 방법을 행하는 사람과 동일 인물이어도 되고, 다른 인물이어도 된다. 또한, 본 발명에 사용되는 생체 시료는, 본 발명의 면역 측정 방법의 실시 시에 채취 또는 조제된 것이어도 되고, 미리 채취 또는 조제되어 보존된 것이어도 된다.
본 명세서에 있어서, 「에피토프」란, 항체에 의해 인식되는 항원(본 발명의 경우에는 SARS-CoV-2)의 일부를 말한다.
(SARS-CoV-2)
SARS-CoV-2는 코로나 바이러스 질병 2019(COVID-19)를 야기하는 바이러스이다. SARS-CoV-2의 바이러스 입자는, 스파이크 단백질, 뉴클레오캡시드 단백질, 막 단백질 및 엔벨로프 단백질로서 알려져 있는 4개의 단백질과, RNA에 의해 구성되어 있다.
SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질은, 419아미노산을 포함하는 단백질이다(서열 번호 22). 뉴클레오캡시드 단백질에는 변이가 발생할 가능성이 있고, 따라서 뉴클레오캡시드 단백질에는, 서열 번호 22로 표시되는 아미노산 서열과, 적어도 90%, 예를 들어 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드 단편이 포함된다.
뉴클레오캡시드 단백질에는, NTD 항원(N 말단의 RNA 결합 도메인을 포함함), CTD 항원(C 말단의 2량체화 도메인을 포함함), 및 중앙부에 위치하는 Ser/Arg(SR) 풍부한 링커 영역이 포함된다.
NTD 항원은 뉴클레오캡시드 단백질의 제1 내지 제174아미노산의 영역이다. 그 중 제1 내지 제49아미노산의 영역이 N 말단 영역이며, 제50 내지 제174아미노산의 영역이 RNA 결합 도메인이다.
NTD 항원의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAE(서열 번호 23)
링커 영역은 뉴클레오캡시드 단백질의 제175 내지 제247아미노산의 영역이다.
링커 영역의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
GSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVT(서열 번호 24)
CTD 항원은 뉴클레오캡시드 단백질의 제248 내지 제419아미노산의 영역이다. 그 중 제248 내지 제364아미노산의 영역이 2량체화 도메인이며, 제365 내지 제419아미노산의 영역이 C 말단 영역이다.
CTD 항원의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
KKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(서열 번호 25)
(모노클로날 항체)
본 명세서에 있어서, 「모노클로날 항체」란, 단일의 항체 산생 세포에서 유래하는 클론으로부터 얻어진 항체 또는 항체 분자를 의미한다. 본 발명의 면역 측정 방법에서는, 본 발명의 효과가 얻어지는 한, 해당 모노클로날 항체의 기능을 갖는 항체 단편도 사용할 수 있다. 모노클로날 항체의 기능을 갖는 항체 단편으로서는, 예를 들어 모노클로날 항체의 효소적 소화에 의해 얻어지는 해당 모노클로날 항체의 Fab 부분을 포함하는 기능성 단편, 유전자 재조합에 의해 제작되는 해당 모노클로날 항체의 Fab 부분을 포함하는 기능성 단편, 및 파지 디스플레이법으로 제작된 scFv를 포함하는 기능성 단편 등을 들 수 있다.
(연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편)
본 발명의 면역 측정 방법에서 사용되는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합한다. 이후, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편과 결합하는 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을, 본 발명의 모노클로날 항체 페어라 칭하는 경우가 있다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체 페어를 구성하는 하나의 모노클로날 항체를, 본 발명의 모노클로날 항체라 칭하는 경우가 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어는, 바람직하게는 모두 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 27 내지 30 이하의 아미노산을 포함하는 하나의 펩티드 단편과 결합하고, 보다 바람직하게는 모두 뉴클레오캡시드 단백질의 C 말단측의 영역에 존재하는 KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편에 결합하고, 더욱 바람직하게는, 한쪽의 모노클로날 항체가 KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식할 수 있고, 다른 한쪽의 모노클로날 항체가 AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식할 수 있고, 가장 바람직하게는, 한쪽의 모노클로날 항체가 LLPAA(서열 번호 26)로 표시되는 아미노산 서열을 에피토프로서 인식하고, 다른 한쪽의 모노클로날 항체가 LDDFSKQLQ(서열 번호 27)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식한다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어는 각각 다른 에피토프를 인식한다. 「다른 에피토프를 인식하는」이란, 에피토프로서 인식하는 아미노산 서열이 중복되지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어는, 각각 단리된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편일 수 있다.
또한, 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 「2종류 사용하는」이란, 본 발명의 모노클로날 항체를 「적어도 2종류」 사용하고 있으면 충분하고, 2종류보다도 많은 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하고 있는 실시 형태를, 본 발명의 범위로부터 제외하는 것은 아니다.
본 명세서에서는, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 제365 내지 제419아미노산을 C 말단 영역이라 칭한다. 본 발명의 모노클로날 항체 페어는, 각각, 이 C 말단 영역에 존재하는, 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편은, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질의 C 말단 영역에 위치하는 것이 바람직하다. C 말단 영역은, SARS-CoV-2의 아미노산 변이가 발생하기 어려운 것이 보고되어 있다. 따라서, C 말단 영역을 인식하는 항체는, 다른 영역을 인식하는 항체와 비교하여, 아미노산 변이가 발생한 SARS-CoV-2와도 결합할 수 있을 가능성이 높다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어는, 바람직하게는 각각 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편 중에 존재하는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 「에피토프를 특이적으로 인식하는」이란, 특정한 펩티드 단편 또는 에피토프 이외에는, 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어의 한쪽과, 어떤 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편이, 「실질적으로 결합하지 않는」지 여부를 확인하기 위해서, 예를 들어 SPR법에 기초하여, Biacore(등록 상표) T100이나 T200을 사용하고, 본 발명의 모노클로날 항체 페어의 한쪽을 고정화하여 측정을 행할 수 있다. 상기 SPR법 이외의 당업자에게 주지된 방법 또는 수단에 의해서도 「실질적으로 결합하지 않는」 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어는, 각각 이하의 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택되는 2종의 페어인 것이 바람직하다.
(1) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(2) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(3) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 것의 항체 또는 그 항체 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 각각 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체 단편.
상기한 아미노산 서열의 동일성은, 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 구성하는 아미노산 서열(HCCDR1+HCCDR2+HCCDR3+LCCDR1+LCCDR2+LCCDR3)에 대한 서열 동일성인 것이 바람직하다.
또한, 「서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1」이란, CDR1이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 기타 CDR(상보 결정 부위(Complementarity-determining region))에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명의 모노클로날 항체는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 이외에도, 정상 영역(C 영역)을 포함할 수 있다. 정상 영역으로서는, 경쇄에 있어서 CL 영역을 포함할 수 있고, 중쇄에 있어서 CH 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 포함할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어는, 각각 이하의 (1), (2) 및 (4)로 이루어지는 군에서 선택되는 2종의 페어인 것이 보다 바람직하다.
(1) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(2) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(4) 상기 (1) 내지 (2) 중 어느 것의 항체 또는 그 항체 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 각각 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체 단편.
본 발명의 모노클로날 항체 페어는, (1)의 항체 및 (2)의 항체의 페어인 것이 더욱 바람직하고, (1)의 항체를 표지 항체로서 사용하고, (2)의 항체를 고상 항체로서 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 항체 (1)로서는, KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 항체, 예를 들어 S32213 항체를 들 수 있다. 또한, 상기 항체 (1)로서는, LLPAA(서열 번호 26)로 표시되는 아미노산 서열을 에피토프로서 인식하는 항체, 예를 들어 S32213 항체를 들 수 있다.
상기 항체 (2)로서는, AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)의 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 항체, 예를 들어 S32217 항체를 들 수 있다. 또한, 상기 항체 (2)로서는, LDDFSKQLQ(서열 번호 27)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 항체, 예를 들어 S32217 항체를 들 수 있다.
상기 항체 (3)으로서는, CTD측 영역 항원 중의 에피토프를 인식하는 항체, 예를 들어 S32223 항체를 들 수 있다. S32223 항체는 S32217 항체와 마찬가지의 반응성을 갖는다고 생각된다.
본 명세서에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이 특정한 물질 또는 아미노산 서열과 「반응한다」, 「인식한다」, 및 「결합한다」는, 동일한 의미로 사용된다. 모노클로날 항체가 항원(화합물)과 「반응하는」지 여부의 확인은, 항원 고상화 ELISA, 경합 ELISA 또는 샌드위치 ELISA 등에 의해 행할 수 있다. 그 밖에도, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)의 원리를 이용한 방법(SPR법) 등에 의해 행할 수 있다. SPR법은 Biacore(등록 상표)의 명칭으로 시판되고 있는, 장치, 센서, 또는 시약류를 사용하여 행할 수 있다.
예를 들어, 후술하는 실시예 1의 에피토프 해석(항체의 에피토프 해석 1)과 마찬가지의 조작을 한 경우에, 가장 흡광도가 높아진 펩티드 단편에 포함되는 아미노산 서열을 에피토프로서 인식하였다고 평가할 수 있다.
(모노클로날 항체의 조제 방법)
본 발명의 모노클로날 항체는, 항원(면역원)으로서, 전체 길이의 뉴클레오캡시드 단백질을 인산 완충 생리 식염수 등의 용매에 용해시키고, 이 용액을 비인간 동물에 투여하여 면역함으로써 조제할 수 있다. 필요에 따라서 상기 용액에 적당한 아쥬반트를 첨가한 후, 에멀션을 사용하여 면역을 행해도 된다. 아쥬반트로서는, 유중수형 유제, 수중 유중수형 유제, 수중유형 유제, 리포솜, 수산화알루미늄겔 등의 범용되는 아쥬반트 이외에도, 생체 성분 유래의 단백질 또는 펩티드성 물질 등을 사용해도 된다. 예를 들어, 프로인트의 불완전 아쥬반트 또는 프로인트의 완전 아쥬반트 등을 적합하게 사용할 수 있다. 아쥬반트의 투여 경로, 투여량, 투여 시기는 특별히 한정되지 않지만, 항원을 면역하는 동물에 있어서 원하는 면역 응답을 증강시킬 수 있도록 적절히 선택하는 것이 바람직하다.
면역에 사용하는 동물의 종류도 특별히 한정되지 않지만, 포유 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 소, 토끼, 염소, 양, 알파카, 마우스 또는 래트가 바람직하고, 보다 바람직하게는 마우스 또는 래트를 사용할 수 있다. 동물의 면역은 일반적인 방법을 따라서 행하면 되고, 예를 들어 항원의 용액, 바람직하게는 아쥬반트와의 혼합물을 동물의 피하, 피내, 정맥 또는 복강내에 주사함으로써 행할 수 있다. 면역 응답은 일반적으로 면역되는 동물의 종류 및 계통에 따라서 다르므로, 면역 스케줄은 사용되는 동물에 따라서 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 항원 투여는 최초의 면역 후에 몇번이나 반복해서 행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 모노클로날 항체를 얻기 위해서, 계속 이하의 조작이 행해질 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 모노클로날 항체 그 자체의 제조 방법에 대해서는 당업계에 주지되어 있으며, 또한 범용되고 있으므로 당업자는 상기한 항원을 사용함으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 조제하는 것이 가능하다(예를 들어, Antibodies, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) 제6장 등을 참조).
최종 면역 후, 면역한 동물로부터 항체 산생 세포인 비장 세포 혹은 림프절 세포를 적출하고, 높은 증식능을 갖는 골수종 유래의 세포주와 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작할 수 있다. 세포 융합에는 항체 산생능(질·양)이 높은 세포를 사용하는 것이 바람직하고, 또한 골수종 유래의 세포주는 융합하는 항체 산생 세포가 유래하는 동물과 적합성이 있는 것이 보다 바람직하다. 세포 융합은 당해 분야에서 공지된 방법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜법, 센다이 바이러스를 사용한 방법, 또는 전류를 이용하는 방법 등을 채용할 수 있다. 얻어진 하이브리도마는 당업계에서 범용의 조건에 따라서 증식시킬 수 있다. 산생되는 항체의 성질을 확인하면서, 원하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 하이브리도마의 클로닝은, 예를 들어 한계 희석법이나 연한천법 등의 주지된 방법에 의해 행하는 것이 가능하다.
클로닝 공정 후, 산생되는 모노클로날 항체와 전체 길이의 뉴클레오캡시드 단백질의 결합능을 ELISA, RIA법 또는 형광 항체법 등의 방법을 사용하여 어세이할 수 있다. 이들 조작에 의해, 선택된 하이브리도마가 원하는 성질을 갖는 모노클로날 항체를 산생할지 여부를 확인할 수 있다.
상기와 같이 하여 선별된 하이브리도마를 대량 배양함으로써, 원하는 특성을 갖는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 대량 배양의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 하이브리도마를 적당한 배지 중에서 배양하여 모노클로날 항체를 배지 중에 산생시키는 방법, 및 포유 동물의 복강내에 하이브리도마를 주사하여 증식시켜, 복수 중에 모노클로날 항체를 산생시키는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로서는, 항체 분자 전체 이외에도 항원 항체 반응 활성을 갖는 모노클로날 항체의 항체 단편을 사용하는 것도 가능하다. 상기와 같이 동물에 대한 면역 공정을 거쳐 얻어진 것 이외에도, 유전자 재조합 기술을 사용하여 얻어지는 모노클로날 항체, 예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등을 사용하는 것도 가능하다. 모노클로날 항체의 단편으로서는 예를 들어, F(ab')2, Fab', scFv 등을 들 수 있다. 이들 프래그먼트는 상기와 같이 하여 얻어지는 모노클로날 항체를 단백질 분해 효소(예를 들어, 펩신이나 파파인 등)로 처리하는 것, 혹은 해당 항체의 DNA를 클로닝하여 대장균이나 효모를 사용한 배양계에서 발현시킴으로써 조제할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 페어를 사용함으로써, 본 발명의 면역 측정 방법에 있어서 샌드위치계를 구축할 수 있다. 샌드위치계란, 피검출 물질을, 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 항체 사이에 끼움으로써, 높은 특이성 및 감도를 얻는 방법이다.
연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 2종류 사용함으로써, 아미노산의 변이, 및 효소 등에 의한 펩티드의 절단에 영향받기 어려워져, 고감도가 되는 것이 생각된다.
샌드위치계를 구축하는 경우, 본 발명의 모노클로날 항체 페어 중 적어도 하나는 고상 항체이며, 적어도 하나는 표지 항체인 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 고상 항체란, 고상 상에 직접적 또는 간접적으로 고상화된 모노클로날 항체를 의미한다. 본 명세서에 있어서, 표지 항체란, 표지 물질 유래의 시그널 측정 시에, 후술하는 당업자에게 주지 관용의 표지 물질로 직접적 또는 간접적으로 표지되어 있는 모노클로날 항체를 의미한다.
예를 들어, 고상에 모노클로날 항체를 물리적으로 흡착시키거나 또는 화학적으로 결합(적당한 스페이서를 개재해도 됨)시킴으로써 고상 항체를 제조할 수 있다. 고상으로서는, 폴리스티렌 수지 등의 고분자 기재, 유리 등의 무기 기재 또는 셀룰로오스나 아가로오스 등의 다당류 기재 등을 포함하는 고상을 사용할 수 있다. 고상의 형상은 특별히 한정되지 않고, 판상(예를 들어, 마이크로플레이트나 멤브레인), 비즈 혹은 입자상(예를 들어, 라텍스 입자, 자성 입자), 또는 통 형상(예를 들어, 시험관) 등 임의의 형상을 선택할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체와 직접적으로 결합 가능한 표지 항체 (2차 항체)를 사용함으로써, SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편에 결합한 항체의 양을 측정할 수도 있다. 본 명세서에서는, 본 발명의 모노클로날 항체에 결합하고, 또한 표지 물질을 결합시킨 항체를 2차 항체라 칭한다. 이 2차 항체를 사용하여, 표지 물질을 본 발명의 모노클로날 항체에 간접적으로 결합시켜도 된다.
표지 물질이 발하는 시그널의 강도를 측정하여, 생체 시료 중의 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 양을 측정할 수 있다. 표지 항체를 조제하기 위한 표지 물질로서는, 예를 들어 금속 착체, 효소, 불용성 입자, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴, 아비딘, 방사성 동위체, 금 콜로이드 입자 또는 착색 라텍스를 들 수 있다. 표지 물질과 모노클로날 항체의 결합법으로서는, 당업자에게 이용 가능한 물리 흡착, 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법 또는 과요오드산법을 사용할 수 있다. 호스 래디쉬·퍼옥시다아제(HRP) 또는 알칼리 포스파타아제(ALP) 등의 효소를 표지 물질로서 사용하는 경우에는, 그 효소의 특이적 기질을 사용하여 효소 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소가 HRP인 경우에는, O-페닐렌디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용할 수 있고, ALP인 경우에는 p-니트로페닐·포스페이트를 사용하여 효소 활성을 측정할 수 있다. 비오틴을 표지 물질로서 사용하는 경우에는, 모노클로날 항체를 비오틴으로 표지하고, 효소, 색소 또는 형광 표지(바람직하게는 HRP)로 표지한 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 반응시킬 수도 있다. 본 발명의 면역 측정 방법에 있어서는, 표지 물질로서 금 콜로이드 입자를 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 항원이나 항체를 고상에 물리적 혹은 화학적으로 담지시키는 것 혹은 담지시킨 상태를 「고정화」 또는 「고상화」라고 표현하는 경우가 있다. 또한, 「분석」, 「검출」 또는 「측정」이라는 용어는, SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 존재의 증명 및 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 정량을 포함한다.
본 발명의 면역 측정 방법에서는, 다른 에피토프를 인식하는 2종류의 모노클로날 항체를 사용한다. 또한, 편의상, 한쪽의 모노클로날 항체를 제1 모노클로날 항체라 칭하고, 다른 쪽의 모노클로날 항체를 제2 모노클로날 항체라 칭하는 경우가 있다.
제1 모노클로날 항체가 표지 항체이며, 제2 모노클로날 항체가 고상 항체인 경우, 본 발명의 면역 측정 방법에서는, 이하의 공정 (1) 내지 (3)을 포함할 수 있다.
(1) 생체 시료와 표지 물질에 결합되어 있는 제1 모노클로날 항체를 접촉시켜, 제1 복합체(SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편, 표지 물질 및 제1 모노클로날 항체를 포함함)를 형성하는 공정.
(2) 상기 제1 복합체와 제2 모노클로날 항체를 접촉시켜, 제2 복합체(SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편, 표지 물질, 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체를 포함함)를 형성하는 공정.
(3) 표지 물질에서 유래하는 시그널을 측정하는 공정.
제2 복합체에는, 표지 물질이 포함되어 있다. 시그널의 측정은 표지 물질에 따라서, 당업자에게 주지된 측정 방법을 채용할 수 있다. 시그널의 측정은 측정 기기를 사용하여 행해도 되고, 눈으로 보아 행해도 된다.
본 발명의 면역 측정 방법에서는, 필요에 따라서 생체 시료를 전처리하는 공정, 및/또는 얻어진 시그널의 강도를 제1 역치와 비교하는 공정을 포함해도 된다. 전처리로서는, 생체 시료의 여과, 및 검체 희석액에 의한 생체 시료의 희석 등을 들 수 있다. 제1 역치는 감도 및 생체 시료 등의 종류를 고려하여, 적절히 설정할 수 있다.
제1 역치는 범위여도 된다. 「제1 역치가 범위이다」란, 나타내지는 범위의 사이에, 구체적인 역치가 존재하고, 측정값이 그 구체적인 역치보다 큰지 또는 작은지 판정함으로써 질환의 유무를 판단하는 것을 의미한다.
제1 역치는, 예를 들어 1.1×102TCID50/mL일 수 있다.
제1 역치가 범위인 경우, 제1 역치는 1.1×102TCID50/mL 내지 2.0×102TCID50/mL 사이, 1.1×102TCID50/mL 내지 1.8×102TCID50/mL 사이 또는 1.1×102TCID50/mL 내지 1.5×102TCID50/mL 사이에 존재할 수 있다.
본 발명의 면역 측정 방법에서는, 시그널의 강도가 제1 역치보다 낮은(높은) 경우에는, SARS-CoV-2에 감염되어 있다고 판정하는 공정을 포함할 수 있고, 또는 시그널의 강도가 제1 역치보다 높은(낮은) 경우에는, SARS-CoV-2에 감염되어 있지 않다고 판정하는 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 면역 측정 방법은 시그널의 측정값에 기초하여, SARS-CoV-2에 감염되어 있는 대상에 있어서의, 특정한 의약의 치료 효과를 판정할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 면역 측정 방법은 상기 공정에 더하여, 이하의 공정을 더 포함할 수 있다.
대상에, 특정한 의약을 투여하는 공정, 및/또는 시그널의 강도를 제2 역치와 비교하는 공정.
이 경우, 제2 역치는, 감도 및 생체 시료의 종류 등을 고려하여, 적절히 설정할 수 있지만, 대상에 특정한 의약을 투여하기 전의 상기 대상에 있어서의 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 측정값이어도 된다.
본 발명의 면역 측정 방법에서는, 시그널의 강도가 제2 역치보다 낮은(높은) 경우에는, 특정한 의약이 치료 효과가 있다고 판정하는 공정, 또는 시그널의 강도가 제2 역치보다 높은(낮은) 경우에는, 특정한 의약이 치료 효과가 없다고 판정하는 공정을 포함할 수 있다.
상기한 치료 효과의 판정에서는, 수일마다 측정을 행하여, 치료 효과를 모니터링해도 된다.
(면역 측정 방법)
「면역 측정 방법」이란 항원과 항체의 반응을 이용하여, 생체 시료 중에 포함되는 물질의 레벨을 측정하는 방법이다. 「레벨」이란, 물질의 양, 농도, 또는 존재 혹은 부존재의 확인 등을 포함한다.
본 발명의 면역 측정 방법으로서는, 전기 화학 발광 면역 측정법(ECL법), 효소 면역 측정법(ELISA), 라텍스 면역 비탁법(LTIA법), 화학 발광 면역 측정법, 면역 크로마토그래피 및 형광 항체법을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 면역 측정 방법은 바람직하게는 ELISA 또는 면역 크로마토그래피이며, 보다 바람직하게는 면역 크로마토그래피이다.
본 발명의 면역 측정 방법은 생체 내 또는 시험관 내의 면역 측정 방법일 수 있다. 또한, 감도를 증강시키기 위해서, 증감제를 사용할 수도 있다.
본 발명의 면역 측정 방법은 생체 시료에, 1.1×102TCID50/mL 이상에 상당하는 양으로 포함되는, SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편을 분석할 수 있다.
본 발명의 면역 측정 방법에 있어서, 본 발명의 모노클로날 항체와 생체 시료를 측정계에 첨가하는 순서는, 본 발명의 효과가 얻어지는 한, 한정되지 않는다. 즉, 본 발명의 모노클로날 항체를, 생체 시료의 첨가 전에, 생체 시료의 첨가와 동시에 또는 생체 시료의 첨가 후에, 측정계에 첨가할 수 있다.
이하, 채용하는 면역 측정 방법마다, 측정의 수순 및 원리를 설명한다. 하기는 본 발명의 일 실시 형태에 있어서의 측정의 수순 및 원리를 단순히 예시하는 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 전혀 아니다.
본 발명의 면역 측정 방법에서는, 표지 항체로서 KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하고, 고상 항체로서, AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하는 것이 바람직하고, 표지 항체로서 LLPAA(서열 번호 26)로 표시되는 아미노산 서열을 에피토프로서 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하고, 고상 항체로서, LDDFSKQLQ(서열 번호 27)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
하기 면역 측정 방법의 각각에 있어서, 모노클로날 항체의 고상에의 고정화의 방법, 모노클로날 항체와 표지 물질의 결합 방법, 표지 물질의 종류 등의 구체적인 방법은, 전술한 것을 포함하여, 당업자에게 주지된 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
(면역 크로마토그래피)
면역 크로마토그래피란, 피검출 물질에 결합한 표지 항체, 또는 표지 항체가 멤브레인 상을 흐르는 성질을 이용한 면역 측정 방법이다. 면역 크로마토그래피에 있어서의 피검출 물질을 측정하는 일반적인 원리는 이하와 같다.
피검출 물질인 항원에 대한 항체를, 크로마토그래프 매체인 불용성 멤브레인 담체 상에 고정화하여, 고정상인 검출부를 제작한다. 그리고, 콘쥬게이트(상기 피검출 물질과 결합 가능한 항체에 의해 감작된 표지 물질)를 이동상으로서 사용한다. 피검출 물질과 이동상인 콘쥬게이트를 특이적으로 반응시키고, 또한 고정상인 검출부에 있어서, 콘쥬게이트와 결합된 피검출 물질을, 검출부에 고정화된 항체에 특이적으로 반응시킨다.
본 발명의 면역 측정 방법으로서, 면역 크로마토그래피를 채용하는 경우의 측정 수순 및 원리는, 이하와 같다.
(1) 생체 시료를 공급하기 위한 샘플 공급부와 생체 시료를 접촉시킨다.
(2) 생체 시료 중의 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편과 콘쥬게이트가 접촉하여, 제1 복합체(SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편, 표지 물질 및 제1 모노클로날 항체를 포함함)가 형성된다. 콘쥬게이트는, 표지 물질에 제1 모노클로날 항체가 결합된 것이다.
(3) 상기 제1 복합체와, 검출부에 고정화된 제2 모노클로날 항체가 접촉하여, 제2 복합체(SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편, 표지 물질, 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체를 포함함)가 형성된다.
(4) 콘쥬게이트에 포함되는 표지 물질에서 유래하는 시그널의 강도를 측정함으로써, 상기 제2 복합체의 형성을 확인한다.
표지 물질로서는, 금 콜로이드 입자, 백금 콜로이드 입자, 컬러 라텍스 입자 및 자성 입자 등을 들 수 있다. 금 콜로이드 입자가 바람직하다. 이들 표지 물질의 종류 및 입경은, 당업자라면 원하는 감도에 따라서 적절히 조정할 수 있다.
(ELISA)
면역 측정 방법 중에서, 효소 표지를 사용하는 ELISA도, 간편하면서 신속하게 표적을 측정할 수 있어 바람직하다. 본 명세서에 있어서 ELISA란, 시료 중에 포함되는 피검출 물질인 항원 또는 항체를, 상기 피검출 물질에 대한 항체 또는 항원을 이용하여 포착한 후에, 효소 반응을 이용하여 검출하는 방법을 의미한다. 고상은 플레이트(면역 플레이트)가 바람직하다. 표지로서는, HRP 또는 ALP를 사용할 수 있다.
본 발명의 면역 측정 방법으로서, 샌드위치 ELISA를 사용하는 경우의 측정 수순 및 원리는, 이하와 같다.
(1) 고상 항체를 고정화한 고상에 생체 시료를 첨가하여 반응시키면, 생체 시료 중의 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편이 고상 항체와 결합하여, 고상 상에서 고상 항체와 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 복합체를 형성한다.
(2) 표지된 다른 에피토프를 인식하는 표지 항체를 고상에 첨가하여 반응시키면, 표지 항체는 상기 포착된 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편에 결합하여 전술한 고상 항체-SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 복합체와 샌드위치를 형성한다.
(3) 세정 후, 효소의 기질과 반응시켜 발색시켜, 흡광도를 측정한다.
측정한 표지 물질의 양에 따라서, 생체 시료 중의 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 양을 측정할 수 있다.
샌드위치 ELISA법에 있어서, 2차 항체를 사용할 수도 있다. 2차 항체를 사용함으로써, 반응이 증폭되어, 검출 감도를 높일 수 있다. 2차 항체는, 하기 예의 경우에는, 1차 항체(제2 모노클로날 항체)를 특이적으로 인식하는 항체이다.
2차 항체를 사용하는 경우, 이하의 수순 (1) 내지 (5)를 채용할 수 있다.
(1) 제1 모노클로날 항체를 고정화한 고상에 적절히 처리해 희석한 생체 시료를 첨가한 후 인큐베이팅하고, 생체 시료를 제거하여 세정한다.
(2) 1차 항체(제2 모노클로날 항체)를 첨가하여 인큐베이팅 및 세정을 행한다.
(3) 또한 효소 표지한 2차 항체를 첨가하여 인큐베이팅을 행한다.
(4) 기질을 첨가하여 발색시킨다.
(5) 플레이트 리더 등을 사용하여 발색을 측정함으로써 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편의 양을 측정한다.
(전기 화학 발광 면역 측정법)
전기 화학 발광 면역 측정법이란, 통전에 의해 표지 물질을 발광시켜, 그 발광량을 검출함으로써 피검출 물질의 양을 측정하는 방법을 의미한다. 전기 화학 발광 면역 측정법에서는, 표지 물질로서, 루테늄 착체를 사용할 수 있다. 고상(마이크로플레이트 등)에 전극을 설치하여 이 전극 상에서 라디칼을 발생시킴으로써 루테늄 착체를 여기 상태로 하여 발광시킨다. 그리고, 이 루테늄 착체의 발광량을 검출할 수 있다.
고상으로서 자성 입자, 그리고 표지 물질로서 루테늄 착체를 사용했을 때의 측정 수순 및 원리는, 이하와 같다.
(1) 고상 항체를 고정화한 자성 입자와 생체 시료를 접촉시키면, 생체 시료 중의 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편이 고상 항체와 결합한다.
(2) 자성 입자를 세정 후에 표지 항체를 접촉시키면, 자성 입자에 결합한 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편에 표지 항체가 결합한다.
(3) 자성 입자를 세정 후, 통전하면 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편에 결합한 표지 항체의 양에 따라서 발광한다. 이 발광량을 계측함으로써, 생체 시료 중의 피검출 물질의 양을 정확하게 측정할 수 있다.
(라텍스 면역 비탁법)
라텍스 면역 비탁법이란, 라텍스 표면에 결합시킨 항체와 피검출 물질(항원)의 응집을 이용한 면역 측정 방법이다. 라텍스 입자로서는, 체외 진단약에 일반적으로 사용되고 있는 라텍스 입자라면 특별히 제한되지 않는다. 응집 반응 측정 시의 라텍스 입자의 농도, 라텍스 입자의 평균 입경 등은, 감도 또는 성능에 따라서 적절히 설정할 수 있다.
본 발명의 면역 측정 방법으로서, 라텍스 면역 비탁법을 사용하는 경우의 측정 수순 및 원리는, 이하와 같다.
(1) 라텍스 입자에 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체를 결합시켜 생체 시료와 접촉시킨다.
(2) 생체 시료 중의 SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편이 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체와 결합하여, 항체 결합 라텍스 입자가 응집한다.
(3) 생체 시료에 근적외광을 조사하여, 흡광도의 측정 또는 산란광의 측정을 행한다. 측정값에 기초하여, 항원의 농도를 구할 수 있다.
본 발명의 면역 측정 방법으로서, 라텍스 면역 비탁법을 사용하는 경우, 라텍스는 고상이며, 또한 표지 물질로서 작용한다. 즉, 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체의 모두가, 고상 및 표지 물질의 각각 결합되어 있다.
2. 생체 시료 중의 SARS-CoV-2의 면역 측정 키트
본 발명의 생체 시료 중의 SARS-CoV-2의 면역 측정 키트(이하, 간단히 본 발명의 면역 측정 키트라 칭하는 경우가 있음)는, 본 발명의 모노클로날 항체 페어를 포함한다. 본 발명의 모노클로날 항체 페어는 각각 다른 에피토프를 인식한다. 본 발명의 모노클로날 항체 페어는 개개의 용기에 넣어져 있어도 된다.
본 발명의 면역 측정 키트로서는, 면역 크로마토그래피, ELISA, 전기 화학 발광 면역 측정법, 라텍스 면역 비탁법, 화학 발광 면역 측정법 및 형광 항체법을 실시하기 위한 면역 측정 키트를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 면역 측정 키트는, 바람직하게는 ELISA 또는 면역 크로마토그래피를 실시하기 위한 면역 측정 키트이며, 보다 바람직하게는 면역 크로마토그래피를 실시하기 위한 면역 측정 키트이다.
본 발명의 면역 측정 키트는, 생체 내 또는 시험관 내의 샘플을 분석하기 위한 면역 측정 키트일 수 있다.
본 발명의 면역 측정 키트에는, 그 밖에도, 표준 항원 물질, 정밀도 관리용 항원 시료 등, 다른 검사 시약, 검체 희석액 및/또는 사용설명서 등을 포함할 수도 있다. 항체를 포함하는 시약 등의 농도는, 당업자라면 적절히 조정 가능하다.
이하, 채용되는 면역 측정 방법마다, 키트에 포함되는 시약을 설명한다. 본 발명의 면역 측정 키트에서는, 표지 항체로서 KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하고, 고상 항체로서, AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하는 것이 바람직하고, 표지 항체로서 LLPAA(서열 번호 26)로 표시되는 아미노산 서열을 에피토프로서 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하고, 고상 항체로서, LDDFSKQLQ(서열 번호 27)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
면역 크로마토그래피를 사용하는 경우, 본 발명의 면역 측정 키트는, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 적당한 용기(하우징)에 저장·탑재한 형태일 수 있다.
면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 샘플 공급부를 갖는 샘플 패드, 크로마토그래프 매체인 불용성 멤브레인 담체, 및 상기 불용성 멤브레인 담체의 하류측 단부에 배치된 흡수 패드로 구성될 수 있다.
불용성 멤브레인 담체 상에, 제1 모노클로날 항체를 고정화한 검출부를 배치하고, 샘플 패드와 불용성 멤브레인 담체 사이에, 콘쥬게이트를 배치한 콘쥬게이트 패드를 배치할 수 있다.
콘쥬게이트는 샘플 패드 또는 불용성 멤브레인 담체 상에 함유시켜도 된다.
그 밖에도, 면역 크로마토그래피의 구성으로서는, 예를 들어 국제 공개 제2018/012517호 또는 국제 공개 제2016/031892호의 기재된 것을 적절히 채용할 수 있다.
표지 물질로서는, 금 콜로이드 입자, 백금 콜로이드 입자, 컬러 라텍스 입자 및 자성 입자 등을 들 수 있다. 금 콜로이드 입자가 바람직하다. 이들 표지 물질의 종류 및 입경은 당업자라면 적절히 조정할 수 있다.
샌드위치 ELISA를 사용하는 경우, 본 발명의 면역 측정 키트는 이하 (A) 및 (B)를 포함할 수 있다. (A) 제2 모노클로날 항체와 효소(HRP 또는 ALP 등)의 결합체를 포함하는 표지 시약 (B) 제1 모노클로날 항체를 고정화한 고상.
이러한 키트에서는, 먼저, 제1 모노클로날 항체를 고정화한 고상에 생체 시료를 첨가한 후 인큐베이팅하고, 생체 시료를 제거하여 세정한다. 이어서, 표지 시약을 첨가한 후 인큐베이팅하고, 기질을 첨가하여 발색시킨다. 플레이트 리더 등을 사용하여 발색을 측정함으로써, SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편을 분석할 수 있다.
전기 화학 발광 면역 측정법을 사용하는 경우, 본 발명의 면역 측정 키트는 이하 (A) 및 (B)를 포함할 수 있다.
(A) 제2 모노클로날 항체와 전기 화학 발광 물질(예를 들어, 루테늄 착체 등)의 콘쥬게이트를 포함하는 표지 시약.
(B) SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편에 결합하는 제1 모노클로날 항체를 고정화한 고상.
예를 들어, 고상으로서 자성 입자를 사용한 키트에서는, SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편에 결합하는 제1 모노클로날 항체를 고정화한 자성 입자에, 생체 시료를 첨가하여 반응시킨 후, 생체 시료를 제거하여 세정한다. 그리고, 콘쥬게이트를 첨가하여 반응시킨다. 자성 입자를 세정 후, 전기 에너지를 첨가하여 발광시킨다. 그리고, 표지 물질의 발광량을 측정함으로써, SARS-CoV-2 또는 그 펩티드 단편을 분석할 수 있다.
라텍스 면역 비탁법을 사용하는 경우, 본 발명의 면역 측정 키트는, 이하의 (1) 및 (2)를 포함할 수 있다.
(1) 제1 모노클로날 항체를 결합시킨 라텍스 입자.
(2) 제2 모노클로날 항체를 결합시킨 라텍스 입자.
본 발명의 면역 측정 키트로서, 라텍스 면역 비탁법용의 키트를 사용하는 경우, 라텍스는 고상이며, 또한 표지 물질이다. 따라서, 제1 모노클로날 항체 및 제2 모노클로날 항체의 모두가, 고상 및 표지 물질의 각각 결합되어 있다.
이상, 발명의 양태(aspect)로 나누어 설명을 하고 있지만, 각각의 양태에 기재된 사항, 어구의 정의 및 실시 형태는, 다른 양태에 있어서도 적용 가능하다.
다음에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 특별히 설명이 없는 한, %는 질량%를 의미한다.
실시예
[조제예 1 모노클로날 항체의 조제]
SARS-CoV-2(COVID-19) 뉴클레오캡시드 단백질, His-tag 1-419 aa(이하, Nu 항원, acrobiosystems사제, NUN-C5227)를 면역원으로 하였다. Nu 항원을, 첫회 면역은 프로인트 완전 아쥬반트(Freund's Complete Adjuvant)(Difco Laboratories), 2회째 면역 이후는 프로인트 불완전 아쥬반트(Freund's Incomplete Adjuvant)(Difco Laboratories)와 1:1로 혼합하여 사용하였다. Balb/c에 대하여, 첫회 면역은 20μg, 2회째 면역 이후 10μg(PBS로 희석)의 면역원량을 사용하여, 격주로 피하 면역을 계속하였다. 3회 면역 실시 후에 항원 고상화 ELISA에 의해 혈중 항체 역가를 평가하였다. 충분한 역가 상승이 확인된 개체에 대해서는, 해부의 1 내지 3일 전에 PBS로 희석한 면역원을 복강 면역시켰다. 그 후, 비장 세포, 장골 림프절 세포 및 쥐 경부 림프절 세포를 회수하여, 전기 융합법에 의해 미엘로마 세포 SP2/0과 융합하였다. 융합 세포는 96웰 플레이트에서 배양하고, 융합으로부터 7 또는 8일 후에 배양 상청을 회수하였다. 그 후, 후술하는 항원 고상화 ELISA에 의한 스크리닝을 실시하여, Nu 항원에 반응성을 나타내고, 또한 NHis-cBSA에 반응성을 나타내지 않는 주를 선택하였다. 또한, 스크리닝 전날에 배지 교환을 행하였다.
[조제예 2 항Nu 항원 항체의 스크리닝(항원 고상화 ELISA)]
ELISA용 96웰 플레이트(NUNC442404)에 Nu 항원 및 NHis-cBSA(His-tag 항원을 BSA에 콘쥬게이트(conjugate)한 것(자사 조제품), PBS 중의 100ng/mL)을 분주하여(50μL/well), 실온에서 2시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 블로킹액(1% BSA-PBST)을 분주하여(100μL/well), 실온에서 1시간 혹은 4℃에서 철야 정치하였다. 블로킹액을 제거 후, 세포 배양 상청(2배 희석), 항혈청(1000 및 10000배 희석)을 분주하여(50μL/well), 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 염소 항-마우스 IgG(H+L)PAb-HRP(SouthernBiotech사제, 1031-05, 9500배 희석)를 분주하여(50μL/well), 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, OPD 발색액을 분주하여(50μL/well), 실온에서 10분간 정치하였다. 정지액을 분주하여(50μL/well), 반응 정지 후, 플레이트 리더로 측정하였다(Abs.492nm). Nu 항원에 반응성을 나타내고, 또한 NHis-cBSA에 반응성을 나타내지 않는 항체를 선발하였다. 선발한 항체를, 반응성 등을 기초로, Group A(3종), Group B(15종), Group C1(8종), Group C2(3종), Group C3(3종), Group C4(1종) 및 Group D(1종)로 분류하였다.
[분석예 1 샌드위치 ELISA에 의한 항체 분류]
획득한 항체군에서 2종을 선택하여 샌드위치 ELISA를 실시한 경우에 Nu 항원을 검출할 수 있는지를, 하기 수순에 의해 확인하였다.
ELISA용 96웰 플레이트(NUNC442404)에 1종의 항체를 분주하여, 실온에서 2시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 블로킹액(1% BSA-PBST)을 분주하여(100μL/well), 4℃에서 철야 정치하였다. 블로킹액을 제거 후, Nu 항원을 분주하여 실온에서 30분간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 비오틴 표지한 더 1종의 항체를 첨가하여, 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 5000배 희석한 스트렙트아비딘-HRP를 50μL/well로 분주하여, 실온에서 30분간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, OPD 발색액을 분주하여, 실온에서 10분간 정치하였다. 반응 정지액을 분주하여, 플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다(파장 492nm).
샌드위치 ELISA에 의해 Nu 항원을 검출할 수 없었을 경우에, 그 2종의 항체의 항원 인식 부위가 가깝다고 판단하여, 그 2종을 동일한 군으로 분류하였다. 각 군의 항체 페어에 의한 샌드위치 가부는 하기 표 1과 같았다.
[분석예 2 면역 크로마토그래피에 의한 항체 분류]
면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 하기 수순으로 제작하였다.
1) 금 콜로이드 표지 항체액의 조제
1OD/mL의 금 콜로이드 용액 20mL에, 25μg/mL의 항SARS-CoV-2를 포함하는 인산 버퍼 1mL를 첨가하여, 실온에서 10분간 교반하였다. 계속하여 금 콜로이드 용액에 10% BSA 용액 2mL를 첨가하여, 실온에서 5분간 교반하였다. 얻어진 용액을, 10℃, 10,000rpm으로 45분간 원심하여 상청을 제거하였다. 잔사를 콘쥬게이트 희석 버퍼(Conjugate Dilution Buffer)(Scripps사)로 현탁시켜, 금 콜로이드 표지 항체액을 얻었다.
2) 콘쥬게이트 패드의 제작
1)에서 조제한 금 콜로이드 표지 항체액을, 1.33% 카제인, 4% 수크로오스 용액(pH 7.5)으로 4OD/mL로 희석하여 콘쥬게이트액을 조제하였다. 콘쥬게이트액을 유리 섬유 패드에 라인상으로 도포하고, 건조시켜 콘쥬게이트 패드를 얻었다.
3) 항체 고상화 멤브레인의 제작
0.75mg/mL의 항SARS-CoV-2 항체 및 2.5% 수크로오스를 포함하는 PBS를 조제하여, 테스트 라인 도포액으로 하였다. 1.0mg/mL 염소 항마우스 IgG 모노클로날 항체 및 2.5% 수크로오스를 포함하는 PBS를 조제하여, 컨트롤 라인 도포액으로 하였다. 면역 크로마토그래피법용 디스펜서 「XYZ3050」(BIO DOT사제)을 사용하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 테스트 라인 도포액 및 컨트롤 라인 도포액을 각각 1.0μL/cm로 도포하고, 건조시킴으로써, 항체 고상화 멤브레인을 얻었다.
4) 테스트 디바이스의 제작
플라스틱제 점착 시트에 항체 고상화 멤브레인, 콘쥬게이트 패드, 흡수 패드를 첩부하여, 5mm 폭으로 재단함으로써, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 얻었다.
시험 방법
1) 시료
SARS-CoV-2(단리(Isolate): USA-WA1/2020) 배양 유체(Culture Fluid)(열 비활성화(Heat Inactivated))(ZeptoMetrix사)를 Universal Transport Medium(BD사)으로 5.0×105TCID50/mL로 희석하였다. 래피드 테스터 FLU·NEXT용 검체 희석액(세끼스이 메디컬사)으로 추가로 11배 희석하여 시료로 하였다.
2) 시험 수순
시료 120μL를 테스트 스트립에 적하하고, 10분 후에, 항체 고상화 멤브레인상의 테스트 라인이 발색하였는지를 눈으로 보아 판정하였다.
각종 항체 조합으로 제작한 테스트 스트립을 사용한 SARS-CoV-2 불활성화 항원의 검출 시험 결과가 하기 표 2과 같았다. ELISA로 샌드위치 가능한 일부의 항체군 페어에 있어서, 면역 크로마토그래피로 SARS-CoV-2 불활성화 항원을 검출 가능한 것을 알았다.
[실시예 1 항체의 에피토프 해석 1]
각 항체군에서 1종의 항체를 각각 선택하고, 그들 항체가 Nu 항원의 N 말단측과 C 말단측 중 어느 것에 반응하는지를 확인하였다.
5μg/mL로 조정한 항His-tag 항체를 50μL/well로 96웰 ELISA용 마이크로플레이트에 분주하여, 4℃에서 밤새 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 1% BSA를 포함하는 PBST(블로킹액)를 100μL/well로 분주하여, 4℃에서 밤새 정치하였다. 블로킹액을 제거 후, 100ng/ml로 조제한 Nu 항원, SARS-CoV-2(COVID-19) NP NTD domain V2 재조합 단백질 His-tag, 44-180 aa(이하, NTD측 영역 항원, ProSci, 92-749), 또는 재조합 핵단백질 (C-term)항원(COVID-19용)(NP-CTD), His-tag 212-417 aa(이하, CTD측 영역 항원, rekom biotech, RAG0071)를 50μL/ml로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 1μg/ml로 조정한 비오틴 표지한 각 항체를 50μL/well로 분주하여, 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, 5000배 희석한 스트렙트아비딘-HRP를 50μL/well로 분주하여, 실온에서 30분간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후, OPD 발색액을 분주하여, 실온에서 10분간 정치하였다. 반응 정지액을 분주하여, 플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다(파장 492nm).
결과를 이하의 표 3에 나타낸다.
Group A 및 D에 속하는 항체는, NTD측 영역 항원에 반응하고, Nu 항원의 N 말단측을 인식하였다. Group B 및 C에 속하는 항체는, CTD측 영역 항원에 반응하고, Nu 항원의 C 말단측을 인식하였다. 표 1 및 2 중 어느 것에 있어서도 샌드위치가 가능한 조합은 Group B와 C의 조합, 및 Group C끼리의 조합이었기 때문에, Nu 항원의 C 말단측을 인식하는 항체 2종을 사용한 경우에, Nu 항원을 고감도로 검출 가능하다고 생각되었다.
[실시예 2 항체의 에피토프 해석 2]
Nu 항원의 C 말단측에 반응하는 항체에 대해서, 보다 상세하게 에피토프를 해석하기 위해서, 항원 고상 ELISA를 실시하였다.
Nu 항원의 특정한 아미노산 서열에 대응하는 합성 펩티드(10μg/mL)(도 2 참조)를 96웰 ELISA용 마이크로플레이트에 각각 분주하여(50μL/well), 실온에서 2시간 또는 4℃ 밤새 정치하였다. PBST로 3회 세정 후(400μL/well), 블로킹액(1% BSA-PBST)을 분주하여(100μL/well), 실온에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 정치하였다. 블로킹액을 제거 후, 비오틴 표지한 S32202, S32213, S32212, S32217, S32209 항체(1μg/mL)를 분주하여(50μL/well), 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후(400μL/well), 스트렙트아비딘-HRP(×5000)를 분주하여(50μL/well), 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정 후(400μL/well), OPD 발색액(2mg/mL)을 분주하여(50μL/well), 실온에서 10분간 정치하였다. 반응 정지액을 분주하여(50μL/well), 플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다(파장 492nm).
각 군을 대표하는 항체와 합성 펩티드의 반응성을 표 4에 나타낸다. 반응한 것을 「+」, 반응하지 않은 것을 「-」로 나타낸다. Group C1 및 C2에 속하는 항체는, 뉴클레오캡시드 단백질의 제388-제405번 아미노산의 서열(서열 번호 48)에 반응하였다. Group B, C3 및 C4에 속하는 항체는, 제397-제414아미노산의 서열(서열 번호 49)에 반응하였다.
[실시예 3 항체의 에피토프 해석 3]
S32213 및 S32217 항체의 상세한 에피토프 해석을, PEPperPRINT사의 PEPperMAP(등록 상표) 펩티드 마이크로어레이 수탁 해석 서비스를 이용하여 실시하였다. 리니어 에피토프 맵핑(15아미노산 잔기의 펩티드쇄 길이, 14아미노산 잔기 오버랩 펩티드에 의해 해석), 및 입체 배좌 에피토프 매핑(7, 10, 13아미노산 잔기의 펩티드쇄 길이, 각각 6, 9, 12아미노산 잔기 오버랩 펩티드에 의해 해석)에 의한 해석 결과의 일부 발췌를 표 5 및 6에 나타낸다. S32213 항체는 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질에 394-398번째의 아미노산 서열인 LLPAA(서열 번호 26)를, S32217 항체는 동 단백질에 400-408번째의 아미노산 서열인 LDDFSKQLQ(서열 번호 27) 중에 존재하는 에피토프를 인식하는 것이 나타내졌다.
[실시예 4 면역 크로마토그래피에 의한 SARS-CoV-2의 검출]
분석예 2와 마찬가지로, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 제작하였다. 표지 항체에는 S32213 항체, 고상 항체에는 S32217 항체를 사용하였다.
시험 방법
래피드 테스터 FLU·NEXT용 검체 희석액(세끼스이 메디컬)을 500μL씩 희석액 튜브에 분주하였다. SARS-CoV-2 PCR positive swab(Trina사)에 Universal Transport Medium(BD사)을 첨가하여 시료로 하였다. 시료에 검체 채취용 면봉을 삽입하여, 검체를 채취한 후, 희석액 튜브 내의 희석액으로 검체를 추출하였다. 희석액 튜브에 검체 여과 필터를 장착하여, 전량 여과하였다. 상기 시료를 테스트 디바이스에 120μL 적하하고, 10분 후에 눈으로 보아 테스트 라인의 유무를 판정하였다.
동 시료로부터, QIAmp Viral RNA mini Kit(QIAGEN사)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 국립 감염증 연구소의 『병원체 검출 매뉴얼 2019-nCoV Ver.2.9.1』에 기초하여, RT-PCR을 실시하였다. 결과를 표 7에 나타낸다. 또한, RT-PCR의 결과에서는, 29검체가 양성이며, 26검체가 음성이었다. 검체 채취 시에 양성이었던 검체를 구입하여, 시험에 사용했지만, 수송, 동결 융해 및 검체 희석의 영향에 의해, 일부 검체가 음성화한 것으로 생각된다.
면역 크로마토그래피에 있어서의 RT-PCR과의 양성 일치율은, 100%(29/29×100)였다. 면역 크로마토그래피에 있어서의 RT-PCR과의 음성 일치율은, 92.3%(24/26×100)였다. 사용한 검체에 대해서, 1테스트당 SARS-CoV-2의 카피수를 확인하였다. 양성 검체 29예 모두가, 1테스트당 1600 카피 이상의 SARS-CoV-2를 포함하고 있었다.
여기서, 시판되는 SARS-CoV-2 항원 검출용 시약의 첨부 문서에는, 1600 카피/테스트의 검체를 측정한 경우의 양성 일치율이 기재되어 있다.
에스플라인(등록 상표) SARS-CoV-2(후지레비오사)는, 측정 시간 30분에 양성 일치율이 92%(12/13×100)였다.
퀵나비(등록 상표)-COVID19 Ag(덴카사)는, 측정 시간 15분에 양성 일치율이 96.3%(26/27×100)였다.
따라서, 본 실시예의 면역 크로마토그래피는, 시판되고 있는 SARS-CoV-2 항원 검출용 시약과 비교하여, 더 짧은 측정 시간에 동등 이상의 감도를 나타냈다. 따라서, 본 실시예의 면역 크로마토그래피를 사용함으로써, SARS-CoV-2를 신속하면서 고감도로 검출할 수 있다고 말할 수 있다.
[실시예 5 면역 크로마토그래피의 특이성 평가]
실시예 4와 마찬가지의 테스트 디바이스를 사용하였다. 래피드 테스터 FLU·NEXT용 검체 희석액을 500μL씩 희석액 튜브에 분주하고, 희석액 튜브 1개에 대하여 동일한 건강인의 비인두 닦음 면봉 2개로부터 검체를 추출하였다. 희석액 튜브에 검체 여과 필터를 장착하여, 전량 여과하였다. 상기 시료를 실시예 5와 마찬가지의 테스트 디바이스에 120μL씩 적하하고, 10분 후 및 30분 후에 눈으로 보는 것과 장치로 판정하였다. 또한, 실시예 5와 마찬가지의 방법으로 RT-PCR도 실시하였다. 도너가 각각 다른 30예의 시료에 관한 판정 결과를 표 8에 나타낸다.
검체 1 내지 30은, 모두 RT-PCR에서 음성이었다. 실시예의 면역 크로마토그래피에 의한 10분 후의 판정에 있어서도, 모두 음성으로 판정되었다. 또한, 실시예의 면역 크로마토그래피의 미리 정해진 측정 시간을 초과하는 30분 후의 판정에 있어서도, 모든 검체가 음성으로 판정되었다. 따라서, 본 실시예의 면역 크로마토그래피는 양호한 특이성을 나타냈다.
[실시예 6 모노클로날 항체의 아미노산 서열의 해석]
공익 재단 법인 가즈사 DNA 연구소의 항체 가변 영역 해석을 이용하여, S32213 항체, S32217 항체 및 S32223 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 해석하였다. 그 결과, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, 각각 이하의 표 9와 같았다.
S32223 항체는, 분석예 1의 샌드위치 ELISA에 의한 항체 분류에 있어서, S32217 항체와 동일한 Group C3에 속하는 항체이다. S32223 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열은, 각각 S32217 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열과 높은 동일성을 갖고 있다. 따라서, S32223 항체는, SARS-CoV-2 항원에 대하여 S32217 항체와 마찬가지의 반응성을 갖는다고 생각된다.
[실시예 7 시판되는 SARS-CoV-2 항원 검출용 시약과의 비교]
SARS-CoV-2 양성 검체를 검체 수송 배지로 적절히 희석한 것을, 래피드 테스터 FLU·NEXT용 검체 희석액(세끼스이 메디컬), 에스플라인(등록 상표) SARS-CoV-2 검체 처리액(후지레비오사), 또는 퀵나비(등록 상표) 검체 부유액(COVID19 Ag용)(덴카사)에 첨가한 것을 시료로 하였다. 상기 시료를, 실시예 4에서 사용한 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립, 기존의 SARS-CoV-2 측정 시약인 에스플라인(등록 상표) SARS-CoV-2(후지레비오사) 및 퀵나비(등록 상표)-COVID19 Ag(덴카사)로 측정하였다.
측정 결과를 표 10에 나타낸다.
상기 결과로부터, 서열 번호 1에 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 2개의 모노클로날 항체를 사용함으로써, 고감도이면서 신속한 SARS-CoV-2 측정계를 확립할 수 있는 것이 실증되었다.
즉, 본 발명의 측정 시약은, 시판되고 있는 SARS-CoV-2 항원 검출용 시약과 비교하여, 더 짧은 측정 시간에 동등 이상의 감도를 나타내고, 또한 SARS-CoV-2를 신속하면서 고감도로 검출할 수 있는 것이 나타내졌다.
[서열 일람]
본 발명에 따르면, 고감도로 신속한 분석이 가능한 SARS-CoV-2 면역 측정 키트 및 SARS-CoV-2의 면역 측정 방법, 그리고 그들에 사용 가능한 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Sekisui Medical Co., Ltd.
<120> Immunoassay method and immunoassay kit for SARS-CoV-2
<130> 22P00298
<150> JP2021-100123
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Ala Ala
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 5
<400> 32
Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg
1 5 10 15
Gln Lys
<210> 33
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 6
<400> 33
Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr
1 5 10 15
Asn Val
<210> 34
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 7
<400> 34
Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 8
<400> 35
Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe
1 5 10 15
Gly Asp
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 9
<400> 36
Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly
1 5 10 15
Thr Asp
<210> 37
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 10
<400> 37
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
1 5 10 15
Ala Gln
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 11
<400> 38
Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala
1 5 10 15
Phe Phe
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 12
<400> 39
Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met
1 5 10 15
Glu Val
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 13
<400> 40
Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu
1 5 10 15
Thr Tyr
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 14
<400> 41
Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp
1 5 10 15
Asp Lys
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 15
<400> 42
Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln
1 5 10 15
Val Ile
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 16
<400> 43
Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp
1 5 10 15
Ala Tyr
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 17
<400> 44
Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Ile Thr Phe Pro Pro Thr
1 5 10 15
Glu Pro Lys
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 18
<400> 45
Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala
1 5 10 15
Asp Glu
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 19
<400> 46
Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg
1 5 10 15
Gln Lys
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 47
Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu
1 5 10 15
Leu Pro
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 21
<400> 48
Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 22
<400> 49
Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
1 5 10 15
Ser Ala
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<211> 14
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 23
<400> 50
Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 24
<400> 51
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 52
Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
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Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Unknown
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Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu
1 5
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 55
Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 56
Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
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Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 31
<400> 58
Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 59
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp
1 5
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<212> PRT
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<220>
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<400> 60
Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
1 5
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<213> Unknown
<220>
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<400> 61
Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp
1 5
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<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 62
Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 63
Ala Ala Asp Ile Asp Asp Phe
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 64
Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 65
Asp Leu Asp Asp Glu Ser Lys
1 5
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<213> Unknown
<220>
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<400> 66
Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln
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<212> PRT
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<220>
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<400> 67
Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
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<220>
<223> ptide 41
<400> 68
Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> eptide 42
<400> 69
Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 43
<400> 70
Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Glu Ser Lys Gln
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 44
<400> 71
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 45
<400> 72
Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Glu Ser Lys Gln Leu Gln
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 46
<400> 73
Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
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<220>
<223> peptide 47
<400> 74
Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 48
<400> 75
Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 49
<400> 76
Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 50
<400> 77
Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 51
<400> 78
Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala
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<212> PRT
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<220>
<223> peptide 52
<400> 79
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
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<220>
<223> peptide 53
<400> 80
Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
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<400> 81
Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> peptide 55
<400> 82
Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln
1 5 10 15
Claims (19)
- 생체 시료 중의 SARS-CoV-2의 면역 측정 방법으로서, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 2종류 사용하고, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 다른 에피토프를 인식하는, 면역 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, 27 내지 30의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편인, 면역 측정 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질의 C 말단 영역에 위치하는, 면역 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편인, 면역 측정 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체 시료가 호흡기 분비액인, 면역 측정 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편 및 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 표지 물질과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있고, 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 고상과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있는, 면역 측정 방법.
- 제6항에 있어서, 이하의 공정을 포함하는, 면역 측정 방법.
(1) 생체 시료와, 표지 물질에 결합되어 있는 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 접촉시켜, 제1 복합체를 형성하는 공정,
(2) 상기 제1 복합체와, 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 접촉시켜, 제2 복합체를 형성하는 공정, 및
(3) 표지 물질에서 유래하는 시그널을 측정하는 공정. - 제7항에 있어서, 상기 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 상기 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편인, 면역 측정 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 크로마토그래피 또는 ELISA인, 면역 측정 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 이하의 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택되는, 면역 측정 방법.
(1) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(2) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(3) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 것의 항체 또는 그 항체 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 각각 80% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체 단편. - 생체 시료 중의 SARS-CoV-2의 면역 측정 키트로서, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 중의 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 2종류 포함하고, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 각각 다른 에피토프를 인식하는, 면역 측정 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, 27 내지 30의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편인, 면역 측정 키트.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질의 C 말단 영역에 위치하는, 면역 측정 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 연속되는 30 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편인, 면역 측정 키트.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 생체 시료가 호흡기 분비액인, 면역 측정 키트.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편 및 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 표지 물질과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있고, 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은 고상과 간접적 또는 직접적으로 결합되어 있는, 면역 측정 키트.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, KQQTVTLLPAADLDDFSK(서열 번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 상기 제2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, AADLDDFSKQLQQSMSSA(서열 번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 중의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편인, 면역 측정 키트.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 면역 크로마토그래피 또는 ELISA용의 키트인, 면역 측정 키트.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 2종류의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이, 각각 이하의 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택되는, 면역 측정 키트.
(1) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(2) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(3) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR과, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체 단편.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 것의 항체 또는 그 항체 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 각각 80% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체 단편.
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