TW202200603A - 對抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之結構蛋白質之抗體之抗原決定區、和該抗原決定區反應之抗體、使用該抗體檢測ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之方法、含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２檢測套組、檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２用疫苗以及含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２傳染病治療藥 - Google Patents

對抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之結構蛋白質之抗體之抗原決定區、和該抗原決定區反應之抗體、使用該抗體檢測ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之方法、含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２檢測套組、檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２用疫苗以及含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２傳染病治療藥 Download PDF

Info

Publication number
TW202200603A
TW202200603A TW110108040A TW110108040A TW202200603A TW 202200603 A TW202200603 A TW 202200603A TW 110108040 A TW110108040 A TW 110108040A TW 110108040 A TW110108040 A TW 110108040A TW 202200603 A TW202200603 A TW 202200603A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cov
sars
protein
seq
antibody
Prior art date
Application number
TW110108040A
Other languages
English (en)
Inventor
小笠原真也
Original Assignee
日商電化股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商電化股份有限公司 filed Critical 日商電化股份有限公司
Publication of TW202200603A publication Critical patent/TW202200603A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明係對於SARS-CoV-2之結構蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段，前述SARS-CoV-2之結構蛋白質係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種；及對於和SARS-CoV-2之蛋白質反應之抗體專一性地反應之半抗原，前述SARS-CoV-2之蛋白質係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種。

Description

對抗SARS-CoV-2之結構蛋白質之抗體之抗原決定區、和該抗原決定區反應之抗體、使用該抗體檢測SARS-CoV-2之方法、含有該抗體之SARS-CoV-2檢測套組、檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗SARS-CoV-2抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗SARS-CoV-2抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之SARS-CoV-2用疫苗以及含有該抗體之SARS-CoV-2傳染病治療藥
本發明係關於對抗SARS-CoV-2之結構蛋白質之抗體之抗原決定區、和該抗原決定區反應之抗體、使用該抗體檢測SARS-CoV-2之方法、含有該抗體之SARS-CoV-2檢測套組、檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗SARS-CoV-2抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗SARS-CoV-2抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之SARS-CoV-2用疫苗以及含有該抗體之SARS-CoV-2傳染病治療藥。
冠狀病毒係帶有正的單鏈RNA基因體與螺旋對稱性之核鞘的有套膜病毒。感染人的冠狀病毒有乙型冠狀病毒，其中，已知MERS冠狀病毒(MERS-CoV)及SARS冠狀病毒(SARS-CoV)會引發嚴重的呼吸器官症狀。
2019年時中國發生新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)，於2020年2月，以東亞為中心，於東南亞、中東、歐洲等處感染持續擴大中。故除了對付SARS-CoV-2之治療法、疫苗，為了能夠早期發現SARS-CoV-2並防止感染擴大，開發迅速且簡便的檢測法乃當務之急。
SARS-CoV-2發生以後，已有針對SARS-CoV-2之抗原性及候選抗原決定區之報告(例如：非專利文獻1)，該候選抗原決定區係指向對付SARS-CoV-2之疫苗之開發，而針對適於檢測SARS-CoV-2之抗原決定區及認識該抗原決定區之抗體尚未有人報告。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
非專利文獻1：Suresh Kumar, Preprints, doi:https://www.preprints.org/manuscript/202002.0071/v1
[發明欲解決之課題]
本發明的目的在於提供檢測SARS-CoV-2之抗體、使用該抗體來檢測SARS-CoV-2之方法及含有該抗體之檢測套組。又，本發明之目的在於提供能同時檢測SARS-CoV-2以及MERS-CoV、SARS-CoV等引發嚴重呼吸器官症狀之人感染性冠狀病毒之抗體、使用該抗體來同時檢測SARS-CoV-2及人感染性冠狀病毒之方法、及含有該抗體之檢測套組。 [解決課題之方式]
以往，已有多個預測抗原性之演算法的報告(例如：Chou PY, Fasman GD. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47：45-148)，惟該等演算法含有互為相反的指標，故各個演算法有抗原性預測之精度不足的問題。本案發明人等為了統合該等演算法而提高抗原性之精度進行改良，從針對使用該經改良之演算法獲得之構成SARS-CoV-2之結構蛋白質分子全體之抗原性之強弱分數(圖1~4)，發現構成SARS-CoV-2之結構蛋白質中有特定胺基酸序列之區域的病毒抗原性強，該特定胺基酸序列作為檢測SARS-CoV-2之抗體認識之抗原決定區(多胜肽)為有用，乃完成本發明。
亦即，本發明提供和SARS-CoV-2之結構蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段、及含有該抗體之SARS-CoV-2之檢測套組。在此，前述SARS-CoV-2之結構蛋白質，係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種蛋白質。
又，本發明提供一種檢測檢體中之SARS-CoV-2之方法，包括下列步驟：使會和SARS-CoV-2之結構蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段和檢體接觸，以免疫學的測定法來檢測SARS-CoV-2。檢測檢體中之SARS-CoV-2之方法，宜為針對各結構蛋白質使用至少2種單株抗體或其抗原結合性片段之三明治法為較佳。
又，本發明提供一種SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒(較佳為MERS-CoV及/或SARS-CoV)之檢測套組，包括：會和SARS-CoV-2之結構蛋白質、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒(較佳為MERS-CoV及/或SARS-CoV)之結構蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段及該抗體。在此，前述SARS-CoV-2之結構蛋白質，係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種蛋白質，前述SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之結構蛋白質係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種蛋白質。
又，本發明提供檢測SARS-CoV-2之抗體認識之抗原決定區(多胜肽)。進而，本發明提供檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗SARS-CoV-2抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗SARS-CoV-2抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之SARS-CoV-2用疫苗、及含有該抗體之SARS-CoV-2感染症治療藥。 [發明之效果]
依照本發明，可提供檢測SARS-CoV-2之抗體、使用該抗體來檢測SARS-CoV-2之方法、及含有該抗體之檢測套組。又，依照本發明，能提供同時檢測SARS-CoV-2、及MERS-CoV、SARS-CoV等引起嚴重呼吸器官症狀之冠狀病毒之抗體、及含有該抗體之檢測套組。再者，依照本發明，可提供檢測SARS-CoV-2之抗體認識之抗原決定區(多胜肽)。
[對抗SARS-CoV-2之抗體、使用該抗體來檢測SARS-CoV-2之方法及含有該抗體之檢測套組] SARS-CoV-2係主要由S-蛋白質(表面蛋白質)、N-蛋白質(核殼蛋白)、M-蛋白質(膜蛋白質)及E-蛋白質(封套蛋白)構成之乙型冠狀病毒屬之病毒。本實施形態之單株抗體，會和構成SARS-CoV-2之主要結構蛋白質，亦即選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種蛋白質專一性地反應。
本實施形態中，「專一性地」係指在蛋白質與本實施形態之單株抗體混合之液系中，該抗體不會和SARS-CoV-2之蛋白質以外之蛋白質成分以能檢測的水平引起抗原抗體反應，或即使發生結合反應、締合反應，也僅會發生比起該抗體和SARS-CoV-2之蛋白質間的抗原抗體反應明顯較弱之反應。
SARS-CoV-2之S-蛋白質(表面蛋白質；以下在本說明書也簡稱「S-蛋白質」)，代表上，以序列編號1表示之1273個胺基酸序列構成。S-蛋白質可為由序列編號1之胺基酸序列構成之蛋白質，也可為和序列編號1有90%以上(較佳為95%以上)之序列相同性之蛋白質。
本實施形態之和SARS-CoV-2之S-蛋白質專一性地反應之單株抗體，係結合於S-蛋白質之66~85號(序列編號5)、87~107號(序列編號6)、105~131號(序列編號7)、140~157號(序列編號8)、155~170號(序列編號9)、522~541號(序列編號10)、538~562號(序列編號11)、595~611號(序列編號12)、670~693號(序列編號13)、761~797號(序列編號14)、802~818號(序列編號15)或1235~1273號(序列編號16)之胺基酸區。該等胺基酸區在針對S-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖1中，係抗原性分數(antigenicity score)相較於閾值分數(threshold score)為高而由至少16個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和SARS-CoV-2之S-蛋白質專一性地反應之單株抗體較佳為結合於S-蛋白質之71~83號、89~103號、107~127號、143~154號、158~167號、524~538號、546~560號、598~608號、672~691號、772~796號、806~816號或1238~1269號之胺基酸區。該等胺基酸區在針對S-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖1中，係抗原性分數相較於閾值分數為較高而由至少10個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和S-蛋白質專一性地反應之單株抗體，更佳為和S-蛋白質之73~79號、93~99號、109~115號、145~152號、160~165號、526~531號、553~558號、599~607號、674~684號、773~795號、808~814號或1257~1261號之胺基酸區結合。該等胺基酸區在針對S-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖1中，係抗原性分數相較於閾值分數為最高而由至少5個胺基酸序列構成之多胜肽。
SARS-CoV-2之N-蛋白質(核殼蛋白；以下，於本說明書也簡稱「N-蛋白質」)，由序列編號2表示之419個胺基酸序列構成。
本實施形態之和N-蛋白質專一性地反應之單株抗體，結合於N-蛋白質之1~18號(序列編號17)、19~49號(序列編號18)、174~207號(序列編號19)、230~252號(序列編號20)、247~267號(序列編號21)、336~350號(序列編號22)、362~379號(序列編號23)、377~395號(序列編號24)或401~419號(序列編號25)之胺基酸區。該等胺基酸區在針對N-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖2中，係抗原性分數(antigenicity score)相較於閾值分數(threshold score)為高而由至少15個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和N-蛋白質專一性地反應之單株抗體較佳為結合於N-蛋白質之1~12號、20~48號、175~206號、234~250號、254~263號、338~348號、366~377號、381~391號或403~417號之胺基酸區。該等胺基酸區在針對N-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖2中，係抗原性分數相較於閾值分數為較高而由至少10個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和N-蛋白質專一性地反應之單株抗體，更佳為結合於N-蛋白質之4~11號、27~41號、185~196號、237~247號、256~261號、340~347號、367~375號、384~390號或406~415號之胺基酸區。該等胺基酸區在針對N-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖2中，係抗原性分數相較於閾值分數為最高而由至少6個胺基酸序列構成之多胜肽。
SARS-CoV-2之M-蛋白質(膜蛋白質；以下，在本說明書也簡稱「M-蛋白質」)，由序列編號3表示之222個胺基酸序列構成。
本實施形態之和M-蛋白質專一性地反應之單株抗體，結合於M-蛋白質之1~24號(序列編號26)、33~50號(序列編號27)、101~120號(序列編號28)、121~139號(序列編號29)、146~171號(序列編號30)、169~195號(序列編號31)或193~222號(序列編號32)之胺基酸區。該等胺基酸區在針對M-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖3中，係抗原性分數(antigenicity score)相較於閾值分數(threshold score)為高而由至少18個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和M-蛋白質專一性地反應之單株抗體較佳為結合於M-蛋白質之1~19號、38~45號、103~118號、122~138號、155~168號、172~195號或196~216號之胺基酸區。該等胺基酸區在針對M-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖3中，係抗原性分數相較於閾值分數為更高而由至少8個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和M-蛋白質專一性地反應之單株抗體，更佳為結合於M-蛋白質之1~16號、40~44號、105~117號、123~136號、160~167號、173~179號或205~215號之胺基酸區。該等胺基酸區在針對M-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖3中，係抗原性分數相較於閾值分數為最高而由至少5個胺基酸序列構成之多胜肽。
SARS-CoV-2之E-蛋白質(封套蛋白；以下，在本說明書也簡稱「E-蛋白質」)，係由序列編號4表示之75個胺基酸序列構成。
本實施形態之和E-蛋白質專一性地反應之單株抗體，結合於E-蛋白質之1~19號(序列編號33)或50~75號(序列編號34)之胺基酸區。該等胺基酸區在針對E-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖4中，係抗原性分數(antigenicity score)相較於閾值分數(threshold score)為高而由至少19個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和E-蛋白質專一性地反應之單株抗體較佳為結合於E-蛋白質之4~13號或51~72號之胺基酸區。該等胺基酸區在針對E-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖4中，係抗原性分數相較於閾值分數為較高而由至少10個胺基酸序列構成之多胜肽。
本實施形態之和E-蛋白質專一性地反應之單株抗體，更佳為和E-蛋白質之5~10號或60~71號之胺基酸區結合。該等胺基酸區在針對E-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖4中，係抗原性分數相較於閾值分數為最高而由至少6個胺基酸序列構成之多胜肽。
也能依據本實施形態之單株抗體，僅使抗原結合部位分離並使用。亦即，依公知之方法製作之Fab、Fab’、F(ab’)2 、單鏈抗體(scFv)、VHH等有專一性的抗原結合性的片段(抗原結合性片段)係包括在本發明之範圍中。又，本實施形態之單株抗體的類別不限於IgG，也可為IgY、IgM、Camel Ig或Ig NAR。又，本說明書中，除了文章脈絡看來顯然不是如此的情形，「抗體」係指「抗體或其抗原結合性片段」。
本實施形態之單株抗體，可藉由公知之免疫學的方法，將SARS-CoV-2之蛋白質或其部分胜肽(例如：由上述S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質或E-蛋白質中之特定胺基酸區構成之多胜肽)對於被免疫動物進行免疫，並使用被免疫動物之細胞來製作融合瘤，或藉由基因重組技術製成重組抗體以獲得。免疫使用之胜肽之長度不特別限定，較佳為使用5個胺基酸以上，更佳為10個胺基酸以上，又更佳為13個胺基酸以上之胜肽當作免疫原。
成為免疫原之SARS-CoV-2之蛋白質亦可以從培養病毒液獲得，也可藉由將編碼為SARS-CoV-2之蛋白質之DNA嵌入到質體載體，並將其導入到寄主細胞而使其表現以獲得。
作為免疫原之SARS-CoV-2之蛋白質或它們的部分胜肽，能以和以下所例示之蛋白質以融合蛋白質的形式表現，精製之後，或維持未精製，作為免疫原使用。融合蛋白質之製作，可利用該技術領域中具通常知識者一般使用當作「蛋白質表現・精製標籤」之谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin)(TRX)、Nus標籤、S標籤、HSV標籤、FLAG標籤、多組胺酸標籤、Strep標籤、Strep-II標籤、Myc標籤、HA標籤、V5標籤、E標籤、T7標籤、VSV-G標籤、Glu-Glu標籤、Avi標籤等。和它們的融合蛋白質宜使用消化酵素將SARS-CoV-2之蛋白質或其部分胜肽部分及其之外之標籤部分予以切斷並分離精製後作為免疫原使用較佳。
從經免疫之動物製備單株抗體時，可使用周知之Kohler等人的方法(Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497(1975))輕易地實施。亦即，從經免疫之動物，回收脾細胞、淋巴球等抗體產生細胞，將其依常法和小鼠骨髓瘤細胞融合並製作融合瘤，將獲得之融合瘤利用極限稀釋法等選殖，並從已選殖之各融合瘤產生之單株抗體當中，選出會和SARS-CoV-2之蛋白質進行抗原抗體反應之單株抗體。
從腹水、培養上清精製單株抗體時，可使用公知之免疫球蛋白精製法。例如：利用使用硫酸銨、硫酸鈉之鹽析所為之分級法、PEG分級法、乙醇分級法、DEAE離子交換層析法、凝膠過濾法等。又，可因應免疫動物種類及單株抗體之類別，利用已結合Protein A、Protein G、Protein L中任意者之擔體的親和層析法來精製。
本實施形態之檢測SARS-CoV-2之方法，包括使檢體接觸會和選自由SARS-CoV-2之蛋白質、亦即，S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種之蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段，並利用免疫學的測定法檢測SARS-CoV-2之步驟。
本實施形態之檢測方法使用之檢體，例如：人或動物之血液、血清、血漿、尿、精液、髓液、唾液、汗、涙、腹水或羊水等體液；黏液；糞便；血管或肝臟等臟器；組織；細胞、或它們的萃取液等可能含有SARS-CoV-2之蛋白質之生物體試樣，較佳為容易取樣之來自口腔、扁桃腺、鼻腔、咽頭、喉頭、氣管、支氣管或肺等之細胞及分泌液、鼻腔拭液、咽頭拭液、漱口液、痰液、氣管抽吸液、支氣管肺胞洗淨液等。收集該等檢體之方法不特別限定，可採用公知之方法。具體而言，可列舉使用綿棒之方法。
本實施形態之SARS-CoV-2之蛋白質之測定，只要是對於該技術領域中具通常知識者而言為周知之免疫學的測定法皆可採用。免疫學的測定法，例如競爭法、凝聚法、西方墨點法、免疫染色法、三明治法等。
本實施形態之SARS-CoV-2之蛋白質之測定法宜為使用至少2種單株抗體之三明治法較佳。三明治法本身於免疫測定之領域為周知，可利用例如免疫層析法、ELISA法等。本實施形態之測定法，除了使用上述會和SARS-CoV-2之蛋白質專一性地反應之單株抗體以外，可利用周知之三明治法實施。
三明治法中，測定之SARS-CoV-2之蛋白質為S-蛋白質時，宜使用能和選自由66~85號(序列編號5)、87~107號(序列編號6)、105~131號(序列編號7)、140~157號(序列編號8)、155~170號(序列編號9)、522~541號(序列編號10)、538~562號(序列編號11)、595~611號(序列編號12)、670~693號(序列編號13)、761~797號(序列編號14)、802~818號(序列編號15)及1235~1273號(序列編號16)構成之群組中之胺基酸區同時結合之至少2種單株抗體較佳。
三明治法中，測定之SARS-CoV-2之蛋白質為N-蛋白質時，宜使用能和選自由1~18號(序列編號17)、19~49號(序列編號18)、174~207號(序列編號19)、230~252號(序列編號20)、247~267號(序列編號21)、336~350號(序列編號22)、362~379號(序列編號23)、377~395號(序列編號24)及401~419號(序列編號25)構成之群組中之胺基酸區同時結合之至少2種單株抗體較佳。
三明治法中，測定之SARS-CoV-2之蛋白質為M-蛋白質時，宜使用能和選自由1~24號(序列編號26)、33~50號(序列編號27)、101~120號(序列編號28)、121~139號(序列編號29)、146~171號(序列編號30)、169~195號(序列編號31)及193~222號(序列編號32)構成之群組中之胺基酸區同時結合之至少2種單株抗體較佳。
三明治法中，測定之SARS-CoV-2之蛋白質為E-蛋白質時，宜使用能和1~19號(序列編號33)及50~75號(序列編號34)之胺基酸區同時結合之2種單株抗體較佳。
本實施形態之SARS-CoV-2之檢測套組，包括會和SARS-CoV-2之蛋白質，亦即，選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段。
本實施形態之SARS-CoV-2之檢測套組，只要是上述免疫學的測定法中使用的形態皆可採用，但較佳為能正確、迅速且簡便地測定SARS-CoV-2之免疫層析條片之形態。
本實施形態之SARS-CoV-2之檢測套組之一理想態樣，包括能和選自由S-蛋白質之66~85號(序列編號5)、87~107號(序列編號6)、105~131號(序列編號7)、140~157號(序列編號8)、155~170號(序列編號9)、522~541號(序列編號10)、538~562號(序列編號11)、595~611號(序列編號12)、670~693號(序列編號13)、761~797號(序列編號14)、802~818號(序列編號15)及1235~1273號(序列編號16)構成之群組中之胺基酸區同時結合之至少2種單株抗體或其抗原結合性片段。
本實施形態之SARS-CoV-2之檢測套組之一理想態樣，包括能和選自由N-蛋白質之1~18號(序列編號17)、19~49號(序列編號18)、174~207號(序列編號19)、230~252號(序列編號20)、247~267號(序列編號21)、336~350號(序列編號22)、362~379號(序列編號23)、377~395號(序列編號24)及401~419號(序列編號25)構成之群組中之胺基酸區同時結合之至少2種單株抗體或其抗原結合性片段。
本實施形態之SARS-CoV-2之檢測套組之一理想態樣，包括能和選自由M-蛋白質之1~24號(序列編號26)、33~50號(序列編號27)、101~120號(序列編號28)、121~139號(序列編號29)、146~171號(序列編號30)、169~195號(序列編號31)及193~222號(序列編號32)構成之群組中之胺基酸區同時結合之至少2種如請求項8記載之單株抗體或其抗原結合性片段。
本實施形態之SARS-CoV-2之檢測套組一理想態樣，包括能和E-蛋白質之1~19號(序列編號33)及50~75號(序列編號34)之胺基酸區同時結合之2種單株抗體或其抗原結合性片段。
[對抗SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之抗體；使用該抗體檢測SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之方法；及含有該抗體之檢測套組] 本實施形態之單株抗體，會和SARS-CoV-2之結構蛋白質亦即選自由SARS-CoV-2之S-蛋白質(表面蛋白質)、N-蛋白質(核殼蛋白)、M-蛋白質(膜蛋白質)及E-蛋白質(封套蛋白)構成之群組中之至少1種之蛋白質、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之結構蛋白質亦即選自由SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之S-蛋白質(表面蛋白質)、N-蛋白質(核殼蛋白)、M-蛋白質(膜蛋白質)及E-蛋白質(封套蛋白)構成之群組中之至少1種之蛋白質專一性地反應。
本實施形態中，「專一性地」，係指在蛋白質與本實施形態之單株抗體混合之液系中，該抗體不會和SARS-CoV-2之蛋白質、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之蛋白質以外之蛋白質成分以能檢測的水平引起抗原抗體反應，或即使發生結合反應、締合反應，也僅會發生比起該抗體和SARS-CoV-2之蛋白質、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之蛋白質以外之蛋白質間的抗原抗體反應明顯較弱之反應。
SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒，只要是會於人引起嚴重的呼吸器官症狀的冠狀病毒則無特殊限制，較佳為MERS-CoV及/或SARS-CoV，更佳為SARS-CoV。
本實施形態之單株抗體，能使用和上述[對抗SARS-CoV-2之抗體、使用該抗體來檢測SARS-CoV-2之方法及含有該抗體之檢測套組]記載的方法依同樣的方法製備。
本實施形態之檢測SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之方法，包括下列步驟：使檢體接觸會和SARS-CoV-2之結構蛋白質亦即選自由SARS-CoV-2之S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種之蛋白質、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之結構蛋白質亦即選自由SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種之蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段，依免疫學的測定法檢測SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒。
本實施形態之方法使用之檢體、及SARS-CoV-2之蛋白質、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之蛋白質之測定，和上述[對抗SARS-CoV-2之抗體、使用該抗體來檢測SARS-CoV-2之方法及含有該抗體之檢測套組]中之記載之檢體及測定方法相同。
本實施形態之SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之檢測套組，包括會和SARS-CoV-2之結構蛋白質亦即選自由SARS-CoV-2之S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種之蛋白質及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之結構蛋白質亦即選自由SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種之蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段。
[檢測SARS-CoV-2之抗體認識之抗原決定區(多胜肽)] 本實施形態之由序列編號5~34中任一胺基酸序列構成之多胜肽，可利用於作為檢測檢體中存在之SARS-CoV-2之抗體認識之抗原決定區。又，本實施形態之多胜肽，除了可作為檢測檢體中存在之SARS-CoV-2之抗體認識之抗原決定區，尚可作為檢測檢體中存在之SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之抗體認識之抗原決定區。
本實施形態之多胜肽，可利用於檢測檢體中(較佳為血液中)存在之對抗SARS-CoV-2之抗體(亦即，利用生物體內針對SARS-CoV-2以防禦機制產生之抗SARS-CoV-2抗體價)之半抗原。因此就本發明之一實施形態，提供一種檢測檢體中之抗SARS-CoV-2抗體之方法，包括使檢體(較佳為血液)接觸具序列編號5~34之胺基酸序列之1種或2種以上之多胜肽，依免疫學的測定法檢測抗SARS-CoV-2抗體之步驟。又，本發明之一實施形態提供一種抗SARS-CoV-2抗體之檢測套組，包括具序列編號5~34之胺基酸序列之1種或2種以上之多胜肽。
本實施形態之多胜肽，可利用於檢測檢體中(較佳為血液中)存在之對抗SARS-CoV-2之抗體、及對抗SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之抗體(亦即，利用生物體內針對SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒以防禦機制產生之抗人感染性冠狀病毒抗體價)之半抗原。因此就本發明之一實施形態，提供一種檢測檢體中之抗SARS-CoV-2抗體、及抗SARS-CoV-2抗體以外之抗人感染性冠狀病毒抗體之方法，包括使檢體(較佳為血液)接觸具序列編號5~34之胺基酸序列之1種或2種以上之多胜肽，依免疫學的測定法檢測抗SARS-CoV-2抗體及抗SARS-CoV-2抗體以外之抗人感染性冠狀病毒抗體之步驟。又，本發明之一實施形態提供一種抗SARS-CoV-2抗體、及抗SARS-CoV-2抗體以外之抗人感染性冠狀病毒抗體之檢測套組，包括具序列編號5~34之胺基酸序列之1種或2種以上之多胜肽。
本實施形態之多胜肽，具有作為以SARS-CoV-2之感染預防為目的之疫苗(例如：胜肽疫苗、雞尾酒胜肽疫苗、融合胜肽、或含該胜肽之片段微域)之基本骨架利用的可能性。又，本實施形態之多胜肽，除了作為以SARS-CoV-2之感染預防為目的之疫苗之基本骨架利用的可能性，尚具有作為以SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之感染預防為目的之疫苗之基本骨架利用的可能性。
本實施形態之多胜肽，具有作為以SARS-CoV-2感染症之嚴重化之預防為目的之疫苗(例如：胜肽疫苗、雞尾酒胜肽疫苗、融合胜肽或含該胜肽之片段微域)之基本骨架利用的可能性。又，本實施形態之多胜肽，除了作為以SARS-CoV-2感染症之嚴重化之預防為目的之疫苗之基本骨架利用的可能性，尚具有以SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒感染症之嚴重化之預防為目的之疫苗之基本骨架利用的可能性。
會和本實施形態之多胜肽專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段，具有作為以SARS-CoV-2感染症之治療為目的之抗體醫藥(中和抗體)利用之可能性。又，會和本實施形態之多胜肽專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段，除了作為以SARS-CoV-2感染症之治療為目的之抗體醫藥(中和抗體)利用之可能性外，尚具有作為用以治療SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒感染症之抗體醫藥(中和抗體)利用的可能性。
上述各實施形態中之SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒只要是會於人引起嚴重的呼吸器官症狀的冠狀病毒即無特殊限制，較佳為MERS-CoV及/或SARS-CoV，更佳為SARS-CoV。 實施例
[實施例1：抗體價之測定] 將有序列編號5、6、7、8、9、10、11、13、15、16、18、19、20、21、23、24、25、26、27、30、31、32、33或34之序列之共計24種各多胜肽，依MBS法(Syed Salman Lateef, et al. J Biomol Tech. 2007 Jul；18(3)：173-176.)，製備成和藍色載體蛋白(Blue Carrier Protein)(mollusk-derived hemocyanin)及BSA(bovine serum albumin)各自分別共價鍵結之胜肽接合體。以使用了藍色載體蛋白之胜肽接合體作為免疫抗原，各以100μg/200μL/隻之投予量分別對3隻BALB/c小鼠進行腹腔投予。使用sigma佐劑系作為佐劑。免疫期間中之經時採血係從尾靜脈進行。抗體價，係利用使用BSA之胜肽接合固相化ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)法，依下列之程序確認。 1)將PBS稀釋成2μg/mL之共計24種BSA胜肽接合溶液以100μL/孔逐一添加到96孔免疫培養板，於4℃進行一晩固相化。 2)廢棄BSA胜肽接合溶液，以清洗緩衝液(0.05%Tween20/PBS)洗淨2次後，將以MilliQ water稀釋5倍之Blocking One(Nacalai Tesque公司製)以250μL/孔之量逐一添加，於25℃溫育約1小時，以進行阻斷。 3)廢棄阻斷溶液，以清洗緩衝液洗淨2次後，添加以清洗緩衝液稀釋100~100,000倍之小鼠血漿各100μL/孔，於25℃溫育2小時。 4)將血漿溶液廢棄，以清洗緩衝液洗淨3次後，添加以清洗緩衝液稀釋5,000倍之接合有過氧化酶之山羊抗小鼠免疫球蛋白(Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulins)(DAKO公司製)各100μL/孔，於室溫溫育1小時。 5)將抗體溶液廢棄，以清洗緩衝液洗淨3次後，添加TMB溶液(TMB One-Step Substrate System：DAKO公司製)各100μL/孔。 6)於25℃溫育20分鐘後，添加2N H2 SO4 各100μL/孔，停止反應。 7)以讀盤儀測定450nm/630nm之吸光度。 其結果示於圖5a~5x。又，圖中之誤差槓(SD)為免疫小鼠之個體間差異(n＝3)。
如圖5a~5x所示，確認對抗S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質之抗原決定區胜肽之抗體價上昇。
[實施例2：抗體對SARS-CoV-2不活化抗原之反應性] 使用已將SARS-CoV-2(EPI_ISL_406034)之不活化抗原固相化之微量滴定盤，利用ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)法依以下之程序確認實施例1獲得之共計24種抗體對SARS-CoV-2不活化抗原之反應性。 1)於已將SARS-CoV-2不活化抗原固相化之96孔免疫培養板添加實施例1獲得之共計24種抗體各100μL/孔，於37℃溫育1小時。 2)將血漿溶液廢棄，以清洗緩衝液(0.05% Tween20/PBS)洗淨2次後，添加以稀釋緩衝液(0.05% Tween20,0.5% BSA/PBS)稀釋了25,000倍之Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(subclasses 1+2a+2b+3)及Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch公司製)各100μL/孔，於37℃溫育1小時。 3)將抗體溶液廢棄，以清洗緩衝液洗淨2次後，添加TMB溶液(TMB One-Step Substrate System：DAKO公司製)各100μL/孔。 4)於25℃溫育20分鐘後，添加2N H2 SO4 各100μL/孔，停止反應。 5)以讀盤儀測定450nm/630nm之吸光度。 其結果示於圖6。 又，圖中之誤差槓(1.96×SD)為測定間差異(n＝3)。
如圖6所示，確認實施例1獲得之共計24種抗體皆會和SARS-CoV-2不活化抗原反應。
[實施例3：以SARS-CoV-2不活化抗原作為免疫原時，存在於抗血清中之抗體之抗原決定區之解析] 以實施例2使用之SARS-CoV-2不活化抗原作為免疫原，依和實施例1同樣之程序對於BALB/c小鼠進行免疫。依下列程序解析獲得之抗血清中存在之抗體之抗原決定區。 1)使用使SARS-CoV-2之N-蛋白質之序列(序列編號2)從N末端向C末端側各滑動1個胺基酸，且為連續之15個胺基酸構成之多胜肽，且對於各多胜肽鏈之N末端進行生物素標識，且各多胜肽鏈之C末端附加了1個甘胺酸殘基之SARS-CoV-2 N-蛋白質胜肽套組(BioTidesTM Biotinylated Peptides：JPT Peptide Technologies GmbH公司製)。 2)將上述1)記載之BioTidesTM Biotinylated Peptides溶於DMF(N,N-二甲基甲醯胺)，介由LumAvidin 微球(Liminex公司製)生物素-抗生物素蛋白反應，製備成BioTidesTM Biotinylated Peptides-immobilized LumAvidin微球。本製備之詳情係依Luminex公司之xMAP(註冊商標)Cookbook(Chapter 4.2.1)。 3)將SARS-CoV-2不活化抗原對於BALB/c小鼠免疫所得之抗血清以PBS-TBN(0.02% Tween20,0.1% BSA/PBS)稀釋100倍而成之溶液50μL，及上述2)製備之BioTidesTM Biotinylated Peptides-immobilized LumAvidin 微球，以對於各種SARS-CoV-2之N-蛋白質胜肽取500個LumAvidin微球珠混合成的混合珠50μL進行混合後，於37℃溫育1小時。 4)以3000rpm離心5分鐘後，將反應溶液之上清廢棄，以清洗緩衝液(0.02% Tween20/PBS)洗淨2次。 5)將R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(subclasses 1+2a+2b+3)及Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch公司製)以PBS-TBN稀釋200倍成的溶液100μL，添加到上述4)反應後之混合珠，於37℃溫育1小時。 6)於3000rpm離心5分鐘後，將反應溶液之上清廢棄，並以清洗緩衝液洗淨2次。 7)將PBS-BN(1% BSA/PBS)50μL添加到上述6)反應後之混合珠，製備成珠懸浮液。 8)針對上述7)製備之珠懸浮液，使用Bio-Plex 200(Bio-Rad公司製)量測MFI(meadian fluorescence intensity，螢光強度中位值)。又，作為空白值(參考對照)，將上述3)中之抗血清換成僅有稀釋劑即PBS-TBN，按測定試樣使用之條件也進行量測，將抗血清之量值扣減空白值之量測值而得之值，表示為ΔMFI(-Blank)。其結果示於圖7。
如圖7所示，實施例3獲得之抗血清，確認對於序列編號21及22以外之N-蛋白質抗原決定區序列有優良的抗體價。
[實施例4：以重組N-蛋白質作為免疫原時存在於抗血清中之抗體之抗原決定區之解析] 以重組N-蛋白質(full-length；序列編號2)作為免疫原，依和實施例1同樣的程序對於BALB/c小鼠進行免疫。依和實施例3相同程序解析獲得之抗血清中存在之抗體之抗原決定區。其結果示於圖8。
如圖8所示，實施例4獲得之抗血清確認對於序列編號17~25之N-蛋白質之全抗原決定區序列有優良的抗體價。
[實施例5：抗血清中之抗體對於N-蛋白質之抗原決定區序列之反應性] 使用實施例3及實施例4獲得之抗血清，依下列程序確認上述抗血清中之抗體對於序列編號17~25之N-蛋白質之抗原決定區序列之反應性。 1)對於序列編號17~25之各多胜肽之N末端施加生物素標識，將該多胜肽溶於DMF(N,N-二甲基甲醯胺)，對於LumAvidin微球(Liminex公司製)介由生物素-抗生物素蛋白反應製備成固定有生物素化之抗原決定區之胜肽之LumAvidin微球。本製備之詳情依Luminex公司之xMAP(註冊商標)Cookbook(Chapter 4.2.1)。 2)將實施例3及實施例4獲得之抗血清以PBS-TBN(0.02% Tween20, 0.1% BSA/PBS)稀釋100倍之溶液50μL，與上述製備之固定有生物素化之抗原決定區之胜肽之LumAvidin微球，以對於序列編號17~25之各多胜肽取500個LumAvidin 微球珠混合成之混合珠50μL混合後，於37℃溫育1小時。 3)於3000rpm離心5分鐘後，將反應溶液之上清廢棄，以清洗緩衝液(0.02% Tween20/PBS)洗淨2次。 4)將R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(subclasses 1+2a+2b+3)及Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch公司製)以PBS-TBN稀釋200倍之溶液100μL，添加到上述3)反應後之混合珠，於37℃溫育1小時。 5)以3000rpm離心5分鐘後，將反應溶液之上清廢棄，以清洗緩衝液洗淨2次。 6)將PBS-BN(1% BSA/PBS)50μL添加到上述5)反應後之混合珠，製備成珠懸浮液。 7)針對上述6)製備之珠懸浮液，使用Bio-Plex 200(Bio-Rad公司製)量測MFI(meadian fluorescence intensity，螢光強度中位值)。又，作為空白值(參考對照)，將上述2)中之抗血清換成僅有稀釋劑即PBS-TBN，按測定試樣使用之條件也進行量測。其結果示於圖9。又，圖中之誤差槓(SD)係測定間差異(n＝3)。
如圖9所示，實施例3及實施例4獲得之抗血清確認對於序列編號17~25之N-蛋白質之全抗原決定區序列有優良的抗體價。
圖1係針對SARS-CoV-2之S-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖。 圖2係針對SARS-CoV-2之N-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖。 圖3係針對SARS-CoV-2之M-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖。 圖4係針對SARS-CoV-2之E-蛋白質分子全體將抗原性之強弱予以評分之圖。 圖5a係將有序列編號5之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5b係將有序列編號6之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5c係將有序列編號7之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5d係將有序列編號8之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5e係將有序列編號9之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5f係將有序列編號10之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5g係將有序列編號11之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5h係將有序列編號13之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5i係將有序列編號15之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5j係將有序列編號16之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5k係將有序列編號18之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5l係將有序列編號19之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5m係將有序列編號20之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5n係將有序列編號21之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5o係將有序列編號23之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5p係將有序列編號24之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5q係將有序列編號25之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5r係將有序列編號26之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5s係將有序列編號27之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5t係將有序列編號30之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5u係將有序列編號31之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5v係將有序列編號32之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5w係將有序列編號33之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖5x係將有序列編號34之序列之多胜肽進行免疫時，對該多胜肽之專一性的反應性的圖。 圖6係實施例1獲得之共計24種抗體對於SARS-CoV-2不活化抗原之反應性之圖。 圖7係解析將SARS-CoV-2不活化抗原進行免疫獲得之抗血清中存在之抗體之抗原決定區之結果。 圖8係解析將序列編號2記載之重組N-蛋白質(full-length)進行免疫而獲得之抗血清中存在之抗體之抗原決定區的結果。 圖9顯示實施例3及4獲得之抗血清中之抗體對於序列編號17~25之N-蛋白質抗原決定區序列之反應性。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022

Claims (36)

  1. 一種單株抗體或其抗原結合性片段，係和SARS-CoV-2之結構蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段，該SARS-CoV-2之結構蛋白質係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種。
  2. 如請求項1之單株抗體或其抗原結合性片段，其中， 該SARS-CoV-2之結構蛋白質為S-蛋白質， 該單株抗體或其抗原結合性片段結合於該S-蛋白質之66~85號(序列編號5)、87~107號(序列編號6)、105~131號(序列編號7)、140~157號(序列編號8)、155~170號(序列編號9)、522~541號(序列編號10)、538~562號(序列編號11)、595~611號(序列編號12)、670~693號(序列編號13)、761~797號(序列編號14)、802~818號(序列編號15)或1235~1273號(序列編號16)之胺基酸區。
  3. 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該S-蛋白質之71~83號、89~103號、107~127號、143~154號、158~167號、524~538號、546~560號、598~608號、672~691號、772~796號、806~816號或1238~1269號之胺基酸區。
  4. 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該S-蛋白質之73~79號、93~99號、109~115號、145~152號、160~165號、526~531號、553~558號、599~607號、674~684號、773~795號、808~814號或1257~1261號之胺基酸區。
  5. 如請求項1之單株抗體或其抗原結合性片段，其中， 該SARS-CoV-2之結構蛋白質為N-蛋白質， 該單株抗體或其抗原結合性片段結合於該N-蛋白質之1~18號(序列編號17)、19~49號(序列編號18)、174~207號(序列編號19)、230~252號(序列編號20)、247~267號(序列編號21)、336~350號(序列編號22)、362~379號(序列編號23)、377~395號(序列編號24)或401~419號(序列編號25)之胺基酸區。
  6. 如請求項1或5之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該N-蛋白質之1~12號、20~48號、175~206號、234~250號、254~263號、338~348號、366~377號、381~391號或403~417號之胺基酸區。
  7. 如請求項1或5之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該N-蛋白質之4~11號、27~41號、185~196號、237~247號、256~261號、340~347號、367~375號、384~390號或406~415號之胺基酸區。
  8. 如請求項1之單株抗體或其抗原結合性片段，其中， 該SARS-CoV-2之結構蛋白質為M-蛋白質， 該單株抗體或其抗原結合性片段結合於該M-蛋白質之1~24號(序列編號26)、33~50號(序列編號27)、101~120號(序列編號28)、121~139號(序列編號29)、146~171號(序列編號30)、169~195號(序列編號31)或193~222號(序列編號32)之胺基酸區。
  9. 如請求項1或8之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該M-蛋白質之1~19號、38~45號、103~118號、122~138號、155~168號、172~195號或196~216號之胺基酸區。
  10. 如請求項1或8之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該M-蛋白質之1~16號、40~44號、105~117號、123~136號、160~167號、173~179號或205~215號之胺基酸區。
  11. 如請求項1之單株抗體或其抗原結合性片段，其中， 該SARS-CoV-2之結構蛋白質為E-蛋白質， 該單株抗體或其抗原結合性片段結合於該E-蛋白質之1~19號(序列編號33)或50~75號(序列編號34)之胺基酸區。
  12. 如請求項1或11之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該E-蛋白質之4~13號或51~72號之胺基酸區。
  13. 如請求項1或11之單株抗體或其抗原結合性片段，結合於該E-蛋白質之5~10號或60~71號之胺基酸區。
  14. 一種檢測檢體中之SARS-CoV-2之方法，包括下列步驟： 使如請求項1至13中任一項之單株抗體或其抗原結合性片段和檢體接觸，利用免疫學的測定法來檢測SARS-CoV-2。
  15. 如請求項14之檢測檢體中之SARS-CoV-2之方法，其中， 使用能同時結合於選自由S-蛋白質之66~85號(序列編號5)、87~107號(序列編號6)、105~131號(序列編號7)、140~157號(序列編號8)、155~170號(序列編號9)、522~541號(序列編號10)、538~562號(序列編號11)、595~611號(序列編號12)、670~693號(序列編號13)、761~797號(序列編號14)、802~818號(序列編號15)及1235~1273號(序列編號16)構成之群組中之胺基酸區之至少2種單株抗體或其抗原結合性片段。
  16. 如請求項14之檢測檢體中之SARS-CoV-2之方法，其中， 使用能同時結合於選自由N-蛋白質之1~18號(序列編號17)、19~49號(序列編號18)、174~207號(序列編號19)、230~252號(序列編號20)、247~267號(序列編號21)、336~350號(序列編號22)、362~379號(序列編號23)、377~395號(序列編號24)及401~419號(序列編號25)構成之群組中之胺基酸區之至少2種單株抗體或其抗原結合性片段。
  17. 如請求項14之檢測檢體中之SARS-CoV-2之方法，其中， 使用能同時結合於選自由M-蛋白質之1~24號(序列編號26)、33~50號(序列編號27)、101~120號(序列編號28)、121~139號(序列編號29)、146~171號(序列編號30)、169~195號(序列編號31)及193~222號(序列編號32)構成之群組中之胺基酸區之至少2種單株抗體或其抗原結合性片段。
  18. 如請求項14之檢測檢體中之SARS-CoV-2之方法，其中， 使用能同時結合於E-蛋白質之1~19號(序列編號33)及50~75號(序列編號34)之胺基酸區之2種單株抗體或其抗原結合性片段。
  19. 一種SARS-CoV-2之檢測套組，包含如請求項1至13中任一項之單株抗體或其抗原結合性片段。
  20. 如請求項19之SARS-CoV-2之檢測套組，含有能同時結合於選自由S-蛋白質之66~85號(序列編號5)、87~107號(序列編號6)、105~131號(序列編號7)、140~157號(序列編號8)、155~170號(序列編號9)、522~541號(序列編號10)、538~562號(序列編號11)、595~611號(序列編號12)、670~693號(序列編號13)、761~797號(序列編號14)、802~818號(序列編號15)及1235~1273號(序列編號16)構成之群組之胺基酸區之至少2種單株抗體或其抗原結合性片段。
  21. 如請求項19之SARS-CoV-2之檢測套組，含有能同時結合於選自由N-蛋白質之1~18號(序列編號17)、19~49號(序列編號18)、174~207號(序列編號19)、230~252號(序列編號20)、247~267號(序列編號21)、336~350號(序列編號22)、362~379號(序列編號23)、377~395號(序列編號24)及401~419號(序列編號25)構成之群組之胺基酸區之至少2種如請求項5之單株抗體或其抗原結合性片段。
  22. 如請求項19之SARS-CoV-2之檢測套組，含有能同時結合於選自由M-蛋白質之1~24號(序列編號26)、33~50號(序列編號27)、101~120號(序列編號28)、121~139號(序列編號29)、146~171號(序列編號30)、169~195號(序列編號31)及193~222號(序列編號32)構成之群組之胺基酸區之至少2種單株抗體或其抗原結合性片段。
  23. 如請求項19之SARS-CoV-2之檢測套組，含有能同時結合於E-蛋白質之1~19號(序列編號33)及50~75號(序列編號34)之胺基酸區之2種單株抗體或其抗原結合性片段。
  24. 一種單株抗體或其抗原結合性片段，係和SARS-CoV-2之結構蛋白質、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之結構蛋白質專一性地反應之單株抗體或其抗原結合性片段， 該SARS-CoV-2之結構蛋白質係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種，該SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之結構蛋白質係選自由S-蛋白質、N-蛋白質、M-蛋白質及E-蛋白質構成之群組中之至少1種。
  25. 如請求項24之單株抗體或其抗原結合性片段，其中，該SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒係MERS-CoV及/或SARS-CoV。
  26. 一種檢測檢體中之SARS-CoV-2及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之方法，包括下列步驟：使如請求項24或25之單株抗體或其抗原結合性片段和檢體接觸，利用免疫學的測定法檢測SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒。
  27. 一種SARS-CoV-2、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒之檢測套組，包括如請求項24或25之單株抗體或其抗原結合性片段。
  28. 一種多胜肽，係序列編號5~34中任一胺基酸序列。
  29. 一種檢測檢體中之抗SARS-CoV-2抗體之方法，包括使如請求項28之多胜肽和檢體接觸，利用免疫學的測定法檢測抗SARS-CoV-2抗體之步驟。
  30. 一種抗SARS-CoV-2抗體之檢測套組，包括如請求項28之多胜肽。
  31. 一種檢測檢體中之抗SARS-CoV-2抗體、及抗SARS-CoV-2抗體以外之抗人感染性冠狀病毒抗體之方法，包括使如請求項28之多胜肽和檢體接觸，利用免疫學的測定法檢測抗SARS-CoV-2抗體、及抗SARS-CoV-2抗體以外之抗人感染性冠狀病毒抗體之步驟。
  32. 一種抗SARS-CoV-2抗體、及抗SARS-CoV-2抗體以外之抗人感染性冠狀病毒抗體之檢測套組，包括如請求項28之多胜肽。
  33. 一種SARS-CoV-2用疫苗，包括如請求項28之多胜肽。
  34. 一種SARS-CoV-2用、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒用疫苗，包括如請求項28之多胜肽。
  35. 一種用於治療SARS-CoV-2感染症之抗體醫藥，包括和如請求項28之多胜肽專一性地反應之單株抗體或抗原結合性片段。
  36. 一種用於治療SARS-CoV-2感染症、及SARS-CoV-2以外之人感染性冠狀病毒感染症之抗體醫藥，包括和如請求項28之多胜肽專一性地反應之單株抗體或抗原結合性片段。
TW110108040A 2020-03-10 2021-03-08 對抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之結構蛋白質之抗體之抗原決定區、和該抗原決定區反應之抗體、使用該抗體檢測ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之方法、含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２檢測套組、檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２用疫苗以及含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２傳染病治療藥 TW202200603A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020040960 2020-03-10
JP2020-040960 2020-03-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202200603A true TW202200603A (zh) 2022-01-01

Family

ID=77670521

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110108040A TW202200603A (zh) 2020-03-10 2021-03-08 對抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之結構蛋白質之抗體之抗原決定區、和該抗原決定區反應之抗體、使用該抗體檢測ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之方法、含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２檢測套組、檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２用疫苗以及含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２傳染病治療藥

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230348570A1 (zh)
EP (1) EP4119575A1 (zh)
JP (1) JPWO2021181994A1 (zh)
CN (1) CN115867573A (zh)
TW (1) TW202200603A (zh)
WO (1) WO2021181994A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022008973A2 (en) * 2020-07-10 2022-01-13 Covid Diagnostics Ltd. Compositions, methods, and systems for detecting immune response
US20240117012A1 (en) * 2021-02-25 2024-04-11 Kao Corporation Anti-sars-cov-2 antibody
JP7105970B1 (ja) * 2021-06-16 2022-07-25 積水メディカル株式会社 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット
JP7216948B1 (ja) * 2021-06-16 2023-02-02 積水メディカル株式会社 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット、並びにモノクローナル抗体又はその抗体断片
WO2023068282A1 (ja) * 2021-10-21 2023-04-27 美幸 徳田 飲食品、食品添加物、サプリメント、化粧品、抗体、医薬、およびその製造方法
JPWO2023068343A1 (zh) * 2021-10-21 2023-04-27
CN113943349A (zh) * 2021-10-22 2022-01-18 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 靶向识别抗新冠病毒中和抗体N-IgY-pAbs的核心氨基酸序列组及应用
KR20230095025A (ko) * 2021-12-20 2023-06-28 아이진 주식회사 변이 SARS-CoV-2 백신 조성물 및 이의 용도
JP2023128698A (ja) * 2022-03-04 2023-09-14 公立大学法人横浜市立大学 変異株を含む、体液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、該抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法、および該抗体を含むキット
CN114560929B (zh) * 2022-03-21 2023-07-04 深圳国家感染性疾病临床医学研究中心 针对冠状病毒np蛋白的单克隆抗体及其应用
CN114790239B (zh) * 2022-03-29 2023-03-21 苏州东抗生物科技有限公司 一种抗冠状病毒n蛋白的抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20230348570A1 (en) 2023-11-02
CN115867573A (zh) 2023-03-28
WO2021181994A1 (ja) 2021-09-16
EP4119575A1 (en) 2023-01-18
JPWO2021181994A1 (zh) 2021-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW202200603A (zh) 對抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之結構蛋白質之抗體之抗原決定區、和該抗原決定區反應之抗體、使用該抗體檢測ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２之方法、含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２檢測套組、檢測含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體之方法、含有該抗原決定區之多胜肽之抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２抗體檢測套組、含有該抗原決定區之多胜肽之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２用疫苗以及含有該抗體之ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２傳染病治療藥
WO2022077613A1 (zh) 一种新型冠状病毒 s 蛋白的 b 细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方法及应用
JP2018173418A (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット
CN107407679B (zh) 肺炎支原体的免疫学检测法和试剂盒
US20230235028A1 (en) Antibody against sars-cov-2, method for detecting sars-cov-2 using antibody and kit containing antibody
JP2022048268A (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法及びキット
WO2022265065A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット、並びにモノクローナル抗体又はその抗体断片
US20240053338A1 (en) Adenovirus immunoassay method and adenovirus immunoassay instrument
JP2023052742A (ja) アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具
EP4116322A1 (en) Adenovirus immunoassay method and immunoassay instrument
WO2022265066A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット
GAO et al. A novel multi-epitope recombinant protein for diagnosis of African swine fever
TW202317610A (zh) 用於廣效性診斷急性呼吸道症候群冠狀病毒２之抗刺突蛋白單株抗體
CN115335398A (zh) 腺病毒的免疫测定方法及免疫测定器具
Chang A novel multi-epitope recombinant protein for diagnosis of African swine fever