JP2022130332A - 抗SARS-CoV-2抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】SARS-CoV-2のNタンパク質に結合する抗体及びその利用法を提供する。【解決手段】以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体。(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3【選択図】なし
Description
本発明はSARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質に結合する抗体に関する。
SARSコロナウイルス-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,;SARS-CoV-2)は、SARSコロナウイルス(SARS-CoV)やMERSコロナウイルス(MERS-CoV)と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患(COVID-19)の原因となるSARS関連コロナウイルスである。2019年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、COVID-19の世界的流行(パンデミック)を引き起こしている。
SARS-CoV-2は、そのウイルスゲノムは29,903塩基程度で、一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。また、ウイルス粒子(ビリオン)は、50~200nmほどの大きさである。一般的なコロナウイルスと同様に、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質として知られる4つのタンパク質と、RNAより構成されている。このうちヌクレオカプシドタンパク質がRNAと結合してヌクレオカプシドを形成し、脂質と結合したスパイクタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する(非特許文献2、3)。
SARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質(以下、Nタンパク質)は、SARS-CoV-2のRNAゲノムに結合するタンパク質である。ウイルスゲノムのフォールディング・ウイルスタンパク質のアセンブリ・ウイルスの出芽といったウイルス粒子形成に関与するほか、宿主細胞の応答を抑制する機能があることが報告されている(非特許文献4)。
COVID-19のウイルス学的診断には主に遺伝子増幅法(PCR)によるSARS-CoV-2の遺伝子検出が行われている。PCR検査は、現時点で使えるウイルス検査の中では最も高感度に検出することができるとされている。また、その他の検出法として、ウイルス表面のタンパク質(例えば、スパイクタンパク質など)の断片を検出する抗原検査も存在する。抗原検査としては、イムノクロマト法やELISA法を原理とした検出キットが既に市販されており、一般的にPCR検査よりも検出感度は劣るものの、所要時間の短さや簡便性の点において優れている。
ウイルス検査においては、偽陽性及び偽陰性の無い検査法が求められる。偽陽性に関しては標的分子に対しての高い特異性をもつ測定原理であることが重要であり、また、偽陰性に関しては検査法の検出感度が重要となる。また、SARS-CoV-2感染者由来の体液(唾液や咽頭粘液など)や下水中にも、低濃度ながらウイルス構造体の一部が存在しており、これらのウイルスを検出するためには、既存のPCR検査及び抗原検査の方法では充分ではない場合もある。そのため、SARS-CoV-2のPCR検査及び抗原検査が既に汎用技術となっている一方、SARS-CoV-2をより特異的かつ高感度に検出するための技術開発が強く求められている。
SARS-CoV-2のNタンパク質は、そのウイルスを構成するタンパク質の中で最も数の多いタンパク質の一つであることが報告されている(非特許文献4)。Nタンパク質の数は、SARS-CoV-2の表面に露出しているスパイクタンパク質よりも遥かに多いため、SARS-CoV-2の抗原検査では、特に検出感度の点において、標的分子として好ましいタンパク質である。さらに、Nタンパク質はヌクレオカプシドとしてSARS-CoV-2のRNAゲノムと結合した状態で存在する。そのため、例えばNタンパク質を標的とし、選択的かつ強力に結合することができる抗体を開発し、SARS-CoV-2のNタンパク質-RNAゲノム複合体を濃縮すること出来れば、PCR検査においても、より高感度にSARS-CoV-2を検出することが可能になる。また、同様にNタンパク質を濃縮する工程を抗原検査と組み合わせることにより、SARS-CoV-2の抗原検査の高感度化も可能となる。
また、SARS-CoV-2のNタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。2002年11月より流行したSARS-CoVのNタンパク質に対するELISA法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている(非特許文献5)。
また、SARS-CoV-2のNタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。2002年11月より流行したSARS-CoVのNタンパク質に対するELISA法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている(非特許文献5)。
通常の抗体(IgG抗体など)は重鎖と軽鎖の2つの可変領域で抗原と結合するが、ラクダ科動物の血清中から見いだされた重鎖抗体は1つの可変領域のみで結合活性と抗原特異性を示す。この抗体の可変領域はVHH(Variable domain of Heavy chain of Heavy chain antibody) と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量(通常の抗体(IgG抗体など)の10分の1程度)とされる(非特許文献6)。VHH抗体の機能面における特徴として、1)通常の抗体同等以上の結合活性を有すること、2)通常の抗体ではアクセスできない部分に入り込めること、3)生理的構造の形成と再生の容易性が高いこと、4)一本鎖のペプチドであるため、非常にシンプルな構造をもつことが挙げられる。特に3)の理由からVHH抗体は熱や圧に対する安定性が非常に高く、また従来は困難であった機能的な抗体の原核生物(大腸菌、枯草菌、コリネ菌、酵母など)での大量生産が可能である。また4)の理由より、タンパク質工学や化学修飾による機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体(ADC)を作製しやすいという特徴を有する。
このように、VHH抗体は通常の抗体(IgG抗体など)と比較して性状面、生産面において多くの利点を有している。そのため、SARS-CoV-2のNタンパク質を標的とするVHH抗体を用いた検出技術は、従来のIgG抗体を用いた技術よりも性能面、価格面において有利に提供できると期待されている。
A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020 Mar;579(7798):270-273.
A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020 Mar;579(7798):265-269.
The Coronavirus Nucleocapsid Is a Multifunctional Protein. Viruses. Volume 6、Issue 8、August 2014、Pages 2991-3018.
The SARS-CoV nucleocapsid protein: A protein with multifarious activities. Infection, Genetics and Evolution. Volume 8、July 2008、Pages 397-405.
Diagnosis of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) by Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Antibodies in an Antigen-Capturing Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Clinical Microbiology. Volume 41、No. 12、December 2003、Pages 5781-5782.
The Therapeutic Potential of Nanobodies. BioDrugs. Volume 34、November 2019、Pages 11-26.
本発明は、SARS-CoV-2のNタンパク質に結合する抗体及びその利用法を提供することに関する。
本発明者らはSARS-CoV-2のNタンパク質に結合するVHH抗体を得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するCDR1~3をコンストラクトに含むVHH抗体ライブラリーから、cDNAディスプレイ法によるスクリーニングにより、SARS-CoV-2のNタンパク質に対して反応性の高いクローンを得ることに成功した。
すなわち、本発明は以下の1)~5)に係るものである。
1)以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
2)1)の抗体をコードする核酸。
3)以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のSARS-CoV-2の検出方法。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
4)1)の抗体を含有するSARS-CoV-2検出キット。
5)1)の抗体を含有する医薬。
1)以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
2)1)の抗体をコードする核酸。
3)以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のSARS-CoV-2の検出方法。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
4)1)の抗体を含有するSARS-CoV-2検出キット。
5)1)の抗体を含有する医薬。
本発明によれば、反応性の高い抗SARS-CoV-2 Nタンパク質抗体を提供することができる。当該抗体を用いることにより、SARS-CoV-2の検出、すなわちSARS-CoV-2感染症である急性呼吸器疾患(COVID-19)の迅速な検出が可能となる。
本発明のSARS-CoV-2に結合する抗体(以下、「本発明の抗体」と称する)は、下記(a)又は(b)で示されるCDR1~3を含む構造ドメインを1つ以上有する、抗SARS-CoV-2抗体である。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
SARS-CoV-2は、急性呼吸器疾患(COVID-19)の原因となる、SARS関連コロナウイルスであり、そのウイルスゲノムは29,903塩基程度の一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。本発明の抗体は、SARS-CoV-2に結合する抗体であるが、詳細には、SARS-CoV-2のNタンパク質に結合する抗体である。
本発明の抗体の構造ドメインは、CDR1、CDR2及びCDR3の3つのCDRを有する。CDR(Complementarity Determining Region;相補性決定領域)とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。本発明の抗体の構造ドメインにおいて、3つのCDRは、N末端側からCDR1、CDR2、CDR3の順で存在する。
本発明の抗体の一態様は、構造ドメインにおいて、
CDR1は、配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR2、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR3、配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号1で示されるアミノ酸配列はGFPFTKFWMYであり、配列番号2で示されるアミノ酸配列はFIDTTGTITNであり、配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるCDR3のアミノ酸配列はGPPGSTWVVDFHSである。
CDR1は、配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR2、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR3、配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号1で示されるアミノ酸配列はGFPFTKFWMYであり、配列番号2で示されるアミノ酸配列はFIDTTGTITNであり、配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるCDR3のアミノ酸配列はGPPGSTWVVDFHSである。
本発明の抗体の別の一態様は、構造ドメインにおいて、
CDR1は、配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR2、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR3、配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号4で示されるアミノ酸配列はGFTFDDHAVGであり、配列番号5で示されるアミノ酸配列AISGDGYTTVであり、配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるCDR3のアミノ酸配列はFRTDIVREYである。
CDR1は、配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR2、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
CDR3、配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号4で示されるアミノ酸配列はGFTFDDHAVGであり、配列番号5で示されるアミノ酸配列AISGDGYTTVであり、配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるCDR3のアミノ酸配列はFRTDIVREYである。
上記配列番号1~6で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDRは、配列番号1~6で示されるアミノ酸配列からなるCDRに変異が導入されたCDRを意味する。また、CDR1、CDR2、CDR3に変異が導入されていても、SARS-CoV-2に対する結合能を有している限り、本発明の抗体のCDRに包含される。
ここで、置換されるアミノ酸の位置は限定されないが、好ましい位置として、例えば配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるCDR1においては1、2、4、6、7、8又は9番目が挙げられ、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるCDR2においては1又は10番目が挙げられ、配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるCDR3においては1、6、9又は12番目が挙げられる。
ここで、置換されるアミノ酸の位置は限定されないが、好ましい位置として、例えば配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるCDR1においては1、2、4、6、7、8又は9番目が挙げられ、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるCDR2においては1又は10番目が挙げられ、配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるCDR3においては1、6、9又は12番目が挙げられる。
また、置換後のアミノ酸の種類は限定されないが、例えば、極性や大きさが類似のアミノ酸への置換が挙げられる。また、グリシン残基のアルギニン残基への置換、フェニルアラニン残基のロイシン残基又はシステイン残基への置換、リジン残基のアスパラギン残基への置換、トリプトファン残基のシステイン残基への置換、メチオニン残基のバリン残基又はアルギニン残基への置換、アスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換、グリシン残基のシステイン残基への置換、トレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、バリン残基のイソロイシン残基への置換、ヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換等が挙げられる。
置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類の好ましい組み合わせとしては、例えば、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるCDR1においては、1番目のグリシン残基のアルギニン残基への置換、2番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、4番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、6番目のリジン残基のアスパラギン残基への置換、7番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基又はシステイン残基への置換、8番目のトリプトファン残基のシステイン残基への置換、9番目のメチオニン残基のバリン残基又はアルギニン残基への置換、
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるCDR2においては、1番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、10番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換、
配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるCDR3においては、1番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、6番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、9番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、12番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換、が好ましい。
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるCDR2においては、1番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、10番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換、
配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるCDR3においては、1番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、6番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、9番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、12番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換、が好ましい。
なお、SARS-CoV-2に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価できる。具体的には、後述する実施例に示すように、表面プラズモン共鳴法により、平衡乖離定数KDを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したELISA法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、バイオレイヤー干渉法等を用いた方法によっても評価できる
本発明の抗体の構造ドメインは、CDR1、CDR2、CDR3の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第1フレームワーク領域(FR1)、CDR1、第2フレームワーク領域(FR2)、CDR2、第3フレームワーク領域(FR3)、CDR3及び第4フレームワーク領域(FR4)をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
FR1:配列番号7又は8で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR2:配列番号9又は10で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR3:配列番号11又は12で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR4:配列番号13で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第1フレームワーク領域(FR1)、CDR1、第2フレームワーク領域(FR2)、CDR2、第3フレームワーク領域(FR3)、CDR3及び第4フレームワーク領域(FR4)をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
FR1:配列番号7又は8で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR2:配列番号9又は10で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR3:配列番号11又は12で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR4:配列番号13で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
配列番号7~13で示されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、2つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合(%)をいう。配列の同一性は、例えばNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のBLAST(Basic Local Alignment Search Toolを用いて解析を行なうことにより算出できる。
本発明の抗体のうち、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4がこの順で連結され、CDR1が配列番号1で示されるアミノ酸配列、CDR2が配列番号2で示されるアミノ酸配列、CDR3が配列番号3で示されるアミノ酸配列であり、FR1が配列番号7で示されるアミノ酸配列、FR2が配列番号9で示されるアミノ酸配列、FR3が配列番号11で示されるアミノ酸配列、FR4が配列番号13で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン(配列番号14)を有する抗体、及びCDR1が配列番号4で示されるアミノ酸配列、CDR2が配列番号5で示されるアミノ酸配列、CDR3が配列番号6で示されるアミノ酸配列であり、FR1が配列番号8で示されるアミノ酸配列、FR2が配列番号10で示されるアミノ酸配列、FR3が配列番号12で示されるアミノ酸配列、FR4が配列番号13で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン(配列番号15)を有する抗体は、それぞれ、後述する実施例において、cDNAディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、SARS-CoV-2に反応性の高いクローン(前者:CoVHH―N1、後者:CoVHH―N2)であり、好適な抗SARS-CoV-2抗体である。
本発明の抗体は、上記の構造ドメインを少なくとも1つ有するものであればその形態は限定されず、VHH抗体のようなシングルドメイン抗体(ナノボディーとも呼ばれる)の他、一本鎖抗体、重鎖抗体、可変領域断片をペプチドリンカーなどで結合させた多量体、例えば二量体、更には、可変領域断片と抗原特異性の異なる可変領域断片の1または複数を連結した多量体であってもよい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
本発明の抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション(Native Chemical Ligation;NCL)法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明の抗体をコードする核酸を適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス/昆虫細胞または酵母細胞等が挙げられる。 抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等の大腸菌由来のベクター;pUB110、pTP5、pC194等の枯草菌由来のベクター;pHY300PLK等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター;pSH19、pSH15等の酵母由来ベクター;λファージ等のバクテリオファージ;アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス;及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列(ターミネーター)、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、FLAGタグ、Hisタグ、HAタグ及びGSTタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列(ターミネーター)、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、FLAGタグ、Hisタグ、HAタグ及びGSTタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
発現させた本発明の抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び/または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の抗体を取得することができる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
本発明の抗体は、SARS-CoV-2のNタンパク質に結合することから、これを、SARS-CoV-2を含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にSARS-CoV-2が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明の抗体を用いたSARS-CoV-2の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のSARS-CoV-2との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のSARS-CoV-2を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料(血清)中に含まれる抗SARS-CoV-2抗体(例えば血清抗体)に対して、SARS-CoV-2のNタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるSARS-CoV-2抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
具体的には、本発明の抗体を用いたSARS-CoV-2の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のSARS-CoV-2との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のSARS-CoV-2を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料(血清)中に含まれる抗SARS-CoV-2抗体(例えば血清抗体)に対して、SARS-CoV-2のNタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるSARS-CoV-2抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液,咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。被験試料は、Nタンパク質への結合の点から、被験試料中のウイルスを界面活性剤等を含む溶液で溶解し、当該溶液中で抗体と結合させるのが好ましい。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のSARS-CoV-2を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗SARS-CoV-2抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のSARS-CoV-2を検出してもよい。
上記の結合体中のSARS-CoV-2を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗SARS-CoV-2抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のSARS-CoV-2を検出してもよい。
また、本発明の抗体は、SARS-CoV-2検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、SARS-CoV-2感染症(COVID-19)の診断薬として、またSARS-CoV-2感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明の抗SARS-CoV-2抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するNタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明の抗SARS-CoV-2抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するNタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
また、本発明の抗体は、SARS-CoV-2のNタンパク質に結合し、細胞内でのウイルスの複製を阻害することが考えられる。したがって、本発明の抗体は、哺乳動物に投与し、SARS-CoV-2感染症の予防又は治療するための医薬として利用することも可能である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
斯かる医薬において、その組成物中における本発明の抗体の含有量は適宜調整できる。 また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を1週間に1~数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
<1>以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
<2>N-タンパク質に結合する、<1>の抗体。
<3>VHH抗体、重鎖抗体又はVHH抗体多量体である、<1>又は<2>の抗体。
<4>VHH抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である<3>の抗体。
<5>VHH抗体多量体が、前記構造ドメインを2つ連結した二量体である<3>の抗体。
<6>VHH抗体多量体が、前記構造ドメインの1又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの1又は複数を連結した多量体である<3>の抗体。
<1>以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
<2>N-タンパク質に結合する、<1>の抗体。
<3>VHH抗体、重鎖抗体又はVHH抗体多量体である、<1>又は<2>の抗体。
<4>VHH抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である<3>の抗体。
<5>VHH抗体多量体が、前記構造ドメインを2つ連結した二量体である<3>の抗体。
<6>VHH抗体多量体が、前記構造ドメインの1又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの1又は複数を連結した多量体である<3>の抗体。
<7>配列番号1で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、1番目のグリシン残基のアルギニン残基への置換、2番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、4番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、6番目のリジン残基のアスパラギン残基への置換、7番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基又はシステイン残基への置換、8番目のトリプトファン残基のシステイン残基への置換、又は9番目のメチオニン残基のバリン残基又はアルギニン残基への置換である、<1>~<6>のいずれかの抗体。
<8>配列番号2で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、1番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、又は10番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換である、<1>~<6>のいずれかの抗体。
<9>配列番号3で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、1番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、6番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、9番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、又は12番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換である、<1>~<6>のいずれかの抗体。
<10>構造ドメインが、第1フレームワーク領域(FR1)、CDR1、第2フレームワーク領域(FR2)、CDR2、第3フレームワーク領域(FR3)、CDR3及び第4フレームワーク領域(FR4)をこの順に有するものである、<1>~<9>のいずれかの抗体。
<11>FR1~FR4が以下のアミノ酸配列からなる、<10>の抗体。
FR1:配列番号7又は8で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR2:配列番号9又は10で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR3:配列番号11又は12で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR4:配列番号13で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
<12>FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4がこの順で連結され、CDR1が配列番号1で示されるアミノ酸配列、CDR2が配列番号2で示されるアミノ酸配列、CDR3が配列番号3で示されるアミノ酸配列であり、FR1が配列番号7で示されるアミノ酸配列、FR2が配列番号9で示されるアミノ酸配列、FR3が配列番号11で示されるアミノ酸配列、FR4が配列番号13で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、<10>の抗体。
<13>FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4がこの順で連結され、CDR1が配列番号4で示されるアミノ酸配列、CDR2が配列番号5で示されるアミノ酸配列、CDR3が配列番号6で示されるアミノ酸配列であり、FR1が配列番号8で示されるアミノ酸配列、FR2が配列番号10で示されるアミノ酸配列、FR3が配列番号12で示されるアミノ酸配列、FR4が配列番号13で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、<10>の抗体。
<14><1>の抗体をコードする核酸。
<15>以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のSARS-CoV-2の検出方法。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
<16><1>~<13>のいずれかの抗体を含有するSARS-CoV-2検出キット。
<17><1>~<13>のいずれかの抗体を含有する医薬。
<18>SARS-CoV-2感染症の予防又は治療のための<17>の医薬。
<8>配列番号2で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、1番目のフェニルアラニン残基のロイシン残基への置換、又は10番目のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換である、<1>~<6>のいずれかの抗体。
<9>配列番号3で示されるアミノ酸配列において1個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、1番目のグリシン残基のシステイン残基への置換、6番目のトレオニン残基のアラニン残基又はプロリン残基への置換、9番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、又は12番目のヒスチジン残基のアスパラギン残基又はアスパラギン酸残基への置換である、<1>~<6>のいずれかの抗体。
<10>構造ドメインが、第1フレームワーク領域(FR1)、CDR1、第2フレームワーク領域(FR2)、CDR2、第3フレームワーク領域(FR3)、CDR3及び第4フレームワーク領域(FR4)をこの順に有するものである、<1>~<9>のいずれかの抗体。
<11>FR1~FR4が以下のアミノ酸配列からなる、<10>の抗体。
FR1:配列番号7又は8で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR2:配列番号9又は10で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR3:配列番号11又は12で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
FR4:配列番号13で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
<12>FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4がこの順で連結され、CDR1が配列番号1で示されるアミノ酸配列、CDR2が配列番号2で示されるアミノ酸配列、CDR3が配列番号3で示されるアミノ酸配列であり、FR1が配列番号7で示されるアミノ酸配列、FR2が配列番号9で示されるアミノ酸配列、FR3が配列番号11で示されるアミノ酸配列、FR4が配列番号13で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、<10>の抗体。
<13>FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4がこの順で連結され、CDR1が配列番号4で示されるアミノ酸配列、CDR2が配列番号5で示されるアミノ酸配列、CDR3が配列番号6で示されるアミノ酸配列であり、FR1が配列番号8で示されるアミノ酸配列、FR2が配列番号10で示されるアミノ酸配列、FR3が配列番号12で示されるアミノ酸配列、FR4が配列番号13で示されるアミノ酸配列である構造ドメインを有する、<10>の抗体。
<14><1>の抗体をコードする核酸。
<15>以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のSARS-CoV-2の検出方法。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
<16><1>~<13>のいずれかの抗体を含有するSARS-CoV-2検出キット。
<17><1>~<13>のいずれかの抗体を含有する医薬。
<18>SARS-CoV-2感染症の予防又は治療のための<17>の医薬。
実施例1 抗SARS-CoV-2 Nタンパク質抗体のスクリーニング
<材料と方法>
1.スクリーニングの標的分子
標的分子として、SARS-CoV-2 Nucleoprotein、His-Tag (E.coli)(Hisタグ付きNタンパク質、The Native Antigen Company)を用いた。
<材料と方法>
1.スクリーニングの標的分子
標的分子として、SARS-CoV-2 Nucleoprotein、His-Tag (E.coli)(Hisタグ付きNタンパク質、The Native Antigen Company)を用いた。
2.cDNAディスプレイの合成
(1)初期DNAの合成
VHHをコードしたcDNAディスプレイを合成するためのDNAである4,500ngのAlipLib L hinge 2nd PCR product及び4,500ngのAlipLib S hinge 2nd PCR product(Epsilon Molecular Engineering)をPCRで増幅した。反応液は1サンプルあたり25μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、1.5μLの10μM Forward primer(5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’(配列番号16))、1.5μLの10μM Reverse index primer(5’-TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT-3’(配列番号17))、300ngのDNAを混合し、Nuclease Free Waterで50μLになるように調製した。PCRは95℃で5分間の後、98℃で20秒間、65℃で15秒間、72℃で30秒を5サイクル、そして72℃で5分間の条件で行った。PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLのPCR産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。1.4mLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は3回行った。上清の除去後、磁気プレート上で3分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、100μLのNuclease Free Waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で2分間静置した後、上清を回収した。精製後、NanoPad DS-11FX(DeNovix)によりDNAを定量し、AlipLib L hinge 2nd PCR product由来及び4,500ngのAlipLib S hinge 2nd PCR product由来のPCR産物を等量になるように混合した(これを初期DNAと呼ぶ)。
(1)初期DNAの合成
VHHをコードしたcDNAディスプレイを合成するためのDNAである4,500ngのAlipLib L hinge 2nd PCR product及び4,500ngのAlipLib S hinge 2nd PCR product(Epsilon Molecular Engineering)をPCRで増幅した。反応液は1サンプルあたり25μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、1.5μLの10μM Forward primer(5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’(配列番号16))、1.5μLの10μM Reverse index primer(5’-TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT-3’(配列番号17))、300ngのDNAを混合し、Nuclease Free Waterで50μLになるように調製した。PCRは95℃で5分間の後、98℃で20秒間、65℃で15秒間、72℃で30秒を5サイクル、そして72℃で5分間の条件で行った。PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLのPCR産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。1.4mLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は3回行った。上清の除去後、磁気プレート上で3分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、100μLのNuclease Free Waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で2分間静置した後、上清を回収した。精製後、NanoPad DS-11FX(DeNovix)によりDNAを定量し、AlipLib L hinge 2nd PCR product由来及び4,500ngのAlipLib S hinge 2nd PCR product由来のPCR産物を等量になるように混合した(これを初期DNAと呼ぶ)。
(2)in vitro転写
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega)を用いた。25μLのRiboMAX(商標)Express T7 2X Buffer,20pmol PCR産物(初期DNAまたは各セレクション後のPCR産物)、5μLのEnzyme Mixを混合し,37℃で30分間インキュベートした。続いて、5μLのRQ1 RNase-Free DNaseを添加し、37℃で15分間インキュベートした。転写産物の精製はRNAClean XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLの転写産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。200μLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は3回行った。上清の除去後、磁気プレート上で10分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、20μLのNuclease Free Waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で1分間静置した後、上清を回収した。精製後、NanoPad DS-11FX(DeNovix)によりRNAを定量した。
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega)を用いた。25μLのRiboMAX(商標)Express T7 2X Buffer,20pmol PCR産物(初期DNAまたは各セレクション後のPCR産物)、5μLのEnzyme Mixを混合し,37℃で30分間インキュベートした。続いて、5μLのRQ1 RNase-Free DNaseを添加し、37℃で15分間インキュベートした。転写産物の精製はRNAClean XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLの転写産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。200μLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は3回行った。上清の除去後、磁気プレート上で10分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、20μLのNuclease Free Waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で1分間静置した後、上清を回収した。精製後、NanoPad DS-11FX(DeNovix)によりRNAを定量した。
(3)mRNAとピューロマイシンリンカーの連結
4μLの0.25M Tris-HCl(pH7.5)、4μLの1M NaCl、20pmolのmRNA、20pmolのcnvK riboG linkerを混合し、Nuclease Free Waterで20μLになるように反応液を調製した。アニーリングはProFlex PCR System(Life technologies)を用いて、90℃で2分間、70℃で1分間、25℃で30秒、4℃でインキュベートの条件で行った。Ramp rateは0.1℃/秒に設定した。続いて、Handheld UV Lamp,6W、UVGL-58、254/365nm、100V(Analytik jena US、An Endress+Hauser Company)を用いて波長365nmの紫外線を5分間照射した。mRNA-リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
4μLの0.25M Tris-HCl(pH7.5)、4μLの1M NaCl、20pmolのmRNA、20pmolのcnvK riboG linkerを混合し、Nuclease Free Waterで20μLになるように反応液を調製した。アニーリングはProFlex PCR System(Life technologies)を用いて、90℃で2分間、70℃で1分間、25℃で30秒、4℃でインキュベートの条件で行った。Ramp rateは0.1℃/秒に設定した。続いて、Handheld UV Lamp,6W、UVGL-58、254/365nm、100V(Analytik jena US、An Endress+Hauser Company)を用いて波長365nmの紫外線を5分間照射した。mRNA-リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
(4)無細胞翻訳
mRNA-リンカー連結体からのmRNA-VHH連結体の合成にはRabbit Reticulocyte Lysate System、Nuclease Treated(Promega)を用いた。10.5μLのNUCLEASE FREE WATER、1.5μLの20x Translation Mix,52.5μLのRabbit Reticulocyte Lysate、1.5μLのRNasin(商標) Ribonuclease Inhibitor(40U/μL)(Promega)、9μLのmRNA-リンカー連結体を混合した。この反応液を37℃で15分間インキュベートした後、36μLのIVV formation buffer(3M KCl,1M MgCl2)混合液を加え、さらに37℃で20分間反応させることで、mRNA-VHH連結体を合成した。
mRNA-リンカー連結体からのmRNA-VHH連結体の合成にはRabbit Reticulocyte Lysate System、Nuclease Treated(Promega)を用いた。10.5μLのNUCLEASE FREE WATER、1.5μLの20x Translation Mix,52.5μLのRabbit Reticulocyte Lysate、1.5μLのRNasin(商標) Ribonuclease Inhibitor(40U/μL)(Promega)、9μLのmRNA-リンカー連結体を混合した。この反応液を37℃で15分間インキュベートした後、36μLのIVV formation buffer(3M KCl,1M MgCl2)混合液を加え、さらに37℃で20分間反応させることで、mRNA-VHH連結体を合成した。
(5)ストレプトアビジン磁性体ビーズへの固定化
60μLのDynabeads My One Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific)に60μLの2x Binding buffer(20mM Tris-HCl、2M NaCl、0.2%(w/v)Tween 20、2mM EDTA,pH8)を添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は2回行った。75μLのmRNA-VHH連結体、75μLの2xBinding buffer、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で30分間インキュベートした。磁性プレート上で1分間静置した後、上清を除去した。200μLのBinding buffer(10mM Tris-HCl、1M NaCl、0.1%(w/v)Tween 20、1mM EDTA,pH8)を添加し、1分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は2回行った。
60μLのDynabeads My One Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific)に60μLの2x Binding buffer(20mM Tris-HCl、2M NaCl、0.2%(w/v)Tween 20、2mM EDTA,pH8)を添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は2回行った。75μLのmRNA-VHH連結体、75μLの2xBinding buffer、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で30分間インキュベートした。磁性プレート上で1分間静置した後、上清を除去した。200μLのBinding buffer(10mM Tris-HCl、1M NaCl、0.1%(w/v)Tween 20、1mM EDTA,pH8)を添加し、1分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は2回行った。
(6)逆転写反応
55.5μLのNuclease free water、15μLの5x ReverTra Ace Buffer(Toyobo Life Science)、3μLの25mM dNTP Mix、1.5μLのReverTra Ace(100U/μL)(Toyobo Life Science)を混合した。上記の反応液にmRNA-VHH連結体が固定化されたストレプトアビジン磁性体ビーズを添加し、42℃、30分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、cDNA-VHH連結体を合成した。
55.5μLのNuclease free water、15μLの5x ReverTra Ace Buffer(Toyobo Life Science)、3μLの25mM dNTP Mix、1.5μLのReverTra Ace(100U/μL)(Toyobo Life Science)を混合した。上記の反応液にmRNA-VHH連結体が固定化されたストレプトアビジン磁性体ビーズを添加し、42℃、30分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、cDNA-VHH連結体を合成した。
(7)ビーズからの切り出し
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたcDNA-VHH連結体に対して,His-tag wash buffer(20mM Sodium phosphate、500mM NaCl、5mM Imidazole、0.05%(w/v)Tween 20、pH7.4)を添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。続いて、30μLの10U RNase T1(Thermo Fisher Scientific)含有His-tag wash bufferを添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた後、37℃で15分間静置することでcDNA-VHH連結体を溶出させた。
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたcDNA-VHH連結体に対して,His-tag wash buffer(20mM Sodium phosphate、500mM NaCl、5mM Imidazole、0.05%(w/v)Tween 20、pH7.4)を添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。続いて、30μLの10U RNase T1(Thermo Fisher Scientific)含有His-tag wash bufferを添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた後、37℃で15分間静置することでcDNA-VHH連結体を溶出させた。
(8)精製
30μLのHis Mag Sepharose Ni Beads(GE Health Care)を磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた後、His-tag wash bufferで再懸濁した。この洗浄操作は2回行った。cDNA-ペプチド連結体の溶出液とHis Mag Sepharose Ni Beads懸濁液を混合し、室温で30分間インキュベートした後、磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。200μLのHis-tag wash bufferを添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は2回行った。10μLのHis-tag elution buffer(20 mM Sodium phosphate、500mM NaCl、250mM Imidazole、0.05%(w/v)Tween 20、pH7.4)を添加し、室温で15分間インキュベートすることで、精製したcDNA-VHH連結体(cDNAディスプレイと呼ぶ)を溶出した。
30μLのHis Mag Sepharose Ni Beads(GE Health Care)を磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた後、His-tag wash bufferで再懸濁した。この洗浄操作は2回行った。cDNA-ペプチド連結体の溶出液とHis Mag Sepharose Ni Beads懸濁液を混合し、室温で30分間インキュベートした後、磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。200μLのHis-tag wash bufferを添加し、1分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で1分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は2回行った。10μLのHis-tag elution buffer(20 mM Sodium phosphate、500mM NaCl、250mM Imidazole、0.05%(w/v)Tween 20、pH7.4)を添加し、室温で15分間インキュベートすることで、精製したcDNA-VHH連結体(cDNAディスプレイと呼ぶ)を溶出した。
3.セレクション
(1)標的分子の固相化とブロッキング
Nunc-Immuno(商標)Plate II(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに100μLの50μg/mL(1ラウンド目)、10μg/mL(2ラウンド目)、5μg/mL(3ラウンド目)、1μg/mL(4ラウンド目及び5ラウンド目)になるようにPBSにて調整したHisタグ付きNタンパク質を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったHisタグ付きNタンパク質/PBSを取り除いた後、200μLの5%(w/v)スキムミルク/PBST(0.05%(w/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に5%(w/v)スキムミルク/PBST(0.05%(w/v)Tween20含有PBS)を取り除いた後、200μLのHBST(20mM HEPES、500mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.2)を添加し、5分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
(1)標的分子の固相化とブロッキング
Nunc-Immuno(商標)Plate II(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに100μLの50μg/mL(1ラウンド目)、10μg/mL(2ラウンド目)、5μg/mL(3ラウンド目)、1μg/mL(4ラウンド目及び5ラウンド目)になるようにPBSにて調整したHisタグ付きNタンパク質を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったHisタグ付きNタンパク質/PBSを取り除いた後、200μLの5%(w/v)スキムミルク/PBST(0.05%(w/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に5%(w/v)スキムミルク/PBST(0.05%(w/v)Tween20含有PBS)を取り除いた後、200μLのHBST(20mM HEPES、500mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.2)を添加し、5分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
(2)プレインキュベーション(セレクションの2ラウンド目以降に実施)
Nunc-Immuno(商標)Plate II(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに200μLの5%(w/v)スキムミルク/PBST(0.05%(w/v)Tween20含有PBS)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったスキムミルクを取り除いた後、200μLのHBST(20mM HEPES、500mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.2)を添加し、5分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
1ラウンド目のセレクションでは200pmol、2ラウンド目のセレクションでは12pmol、3ラウンド目以降のセレクションでは6pmolに調製されたcDNAディスプレイを用いた。各cDNAディスプレイはHBST(20mM HEPES、500mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.2)を添加し、100μLに調製した。このうち、2ラウンド目以降の各cDNAディスプレイはスキムミルクによりブロッキングしたウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。その後、上清を全て回収した。これにより、ブロッキング剤に対して結合性を示すcDNA-VHH連結体を除去した。
Nunc-Immuno(商標)Plate II(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに200μLの5%(w/v)スキムミルク/PBST(0.05%(w/v)Tween20含有PBS)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったスキムミルクを取り除いた後、200μLのHBST(20mM HEPES、500mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.2)を添加し、5分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
1ラウンド目のセレクションでは200pmol、2ラウンド目のセレクションでは12pmol、3ラウンド目以降のセレクションでは6pmolに調製されたcDNAディスプレイを用いた。各cDNAディスプレイはHBST(20mM HEPES、500mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.2)を添加し、100μLに調製した。このうち、2ラウンド目以降の各cDNAディスプレイはスキムミルクによりブロッキングしたウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。その後、上清を全て回収した。これにより、ブロッキング剤に対して結合性を示すcDNA-VHH連結体を除去した。
(3)セレクション
Nタンパク質が固相化されたウェルに、cDNAディスプレイ(2ラウンド目以降は、プレインキュベーション後のcDNAディスプレイ)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にcDNAディスプレイ溶液を取り除いた後、200μLのHBSTを添加し、室温で5分間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は10回行った。100μLの100mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane(pH11)を添加し、丁寧にピペッティングした後、室温で5分間静置した。静置後、上清を新しいチューブに回収した。
Nタンパク質が固相化されたウェルに、cDNAディスプレイ(2ラウンド目以降は、プレインキュベーション後のcDNAディスプレイ)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にcDNAディスプレイ溶液を取り除いた後、200μLのHBSTを添加し、室温で5分間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は10回行った。100μLの100mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane(pH11)を添加し、丁寧にピペッティングした後、室温で5分間静置した。静置後、上清を新しいチューブに回収した。
4.PCR増幅
溶出液をPCRに供した。反応液は1サンプルあたり25μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、1.5μLの10μM Forward primer、1.5μLの10μM Reverse index primer、12.5μLのセレクション後のcDNAディスプレイ、9.5μLのNuclease free waterを混合し調製した。プライマーは5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3’(配列番号18)と5’-TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT-3’(配列番号17)を用いた。PCRは95℃で2分間の後、98℃で20秒間、68℃で15秒間、72℃で20秒間を22サイクル(1ラウンド目)または24サイクル(2ラウンド目以降)、そして72℃で5分間の条件で行った。PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLのPCR産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。200μLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は2回行った。上清の除去後、磁気プレート上で5分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、45μLのNuclease Free Waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で1分間静置した後、上清を回収した。ここで得られたPCR産物を鋳型にして、次のセレクションラウンドで使用するためのcDNAディスプレイを合成した。
溶出液をPCRに供した。反応液は1サンプルあたり25μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、1.5μLの10μM Forward primer、1.5μLの10μM Reverse index primer、12.5μLのセレクション後のcDNAディスプレイ、9.5μLのNuclease free waterを混合し調製した。プライマーは5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3’(配列番号18)と5’-TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT-3’(配列番号17)を用いた。PCRは95℃で2分間の後、98℃で20秒間、68℃で15秒間、72℃で20秒間を22サイクル(1ラウンド目)または24サイクル(2ラウンド目以降)、そして72℃で5分間の条件で行った。PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLのPCR産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。200μLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は2回行った。上清の除去後、磁気プレート上で5分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、45μLのNuclease Free Waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で1分間静置した後、上清を回収した。ここで得られたPCR産物を鋳型にして、次のセレクションラウンドで使用するためのcDNAディスプレイを合成した。
5.VHH抗体候補配列の抽出
(1)PCR産物の定量と濃度調製
PicoGreen(商標)dsDNA reagent kit(Thermo Fisher Scientific)を用いてPCR産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を50ng/mLに調製した。
(1)PCR産物の定量と濃度調製
PicoGreen(商標)dsDNA reagent kit(Thermo Fisher Scientific)を用いてPCR産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を50ng/mLに調製した。
(2)シーケンスの調製
1st PCRを行った。反応液は1サンプルあたり12.5μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、0.5μLの10μM Forward primer、0.5μLの10μM Reverse primer、2.5μLの前段落記載のPCR産物、9μLのNuclease free waterを混合し調製した。プライマーは5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNATGGCTGAGGTGCAGCTCGTG-3’(配列番号19)と5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNTGATGATGATGGCTACCACCTCCCG-3’(配列番号20)を用いた。PCRは95℃で3分間の後、98℃で20秒間、62℃で15秒間、72℃で20秒を16サイクル、そして72℃で5分間の条件で行った。
PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLのPCR産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。200μLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は2回行った。上清の除去後、磁気プレート上で5分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、20μLのNuclease free waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で1分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Index PCRを行った。反応液は1サンプルあたり12.5μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、1μLの10μM Forward index primer(Nextera XT Index Kit v2、Illumina)、1μLの10 μM Reverse index primer(Nextera XT Index Kit v2、Illumina)、2.5μLのテンプレートDNA、8μLのNuclease free waterを混合し調製した。PCRは95℃で3分間の後、98℃で20秒間、55℃で15秒間、72℃で30秒を8サイクル、そして72℃で5分間の条件で行った。PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりPCR産物のサイズを確認後、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いてPCR産物の定量を行い、以下の式(1)に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、NUCLEASE FREE WATERで希釈することで4nMに調製した(これをサンプルと呼ぶ。)。
DNA濃度[ng/μL]/(660[g/mol]×550[bp])×106=DNA濃度[nM]・・・(1)
1st PCRを行った。反応液は1サンプルあたり12.5μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、0.5μLの10μM Forward primer、0.5μLの10μM Reverse primer、2.5μLの前段落記載のPCR産物、9μLのNuclease free waterを混合し調製した。プライマーは5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNATGGCTGAGGTGCAGCTCGTG-3’(配列番号19)と5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNTGATGATGATGGCTACCACCTCCCG-3’(配列番号20)を用いた。PCRは95℃で3分間の後、98℃で20秒間、62℃で15秒間、72℃で20秒を16サイクル、そして72℃で5分間の条件で行った。
PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。1μLのPCR産物あたり1.8μLのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、5分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。200μLの70%エタノールを添加し、30秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は2回行った。上清の除去後、磁気プレート上で5分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、20μLのNuclease free waterを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し5分静置した。チューブを磁気プレート上で1分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Index PCRを行った。反応液は1サンプルあたり12.5μLのKAPA HiFi HotStart Ready Mix(2X)(Kapa biosystems)、1μLの10μM Forward index primer(Nextera XT Index Kit v2、Illumina)、1μLの10 μM Reverse index primer(Nextera XT Index Kit v2、Illumina)、2.5μLのテンプレートDNA、8μLのNuclease free waterを混合し調製した。PCRは95℃で3分間の後、98℃で20秒間、55℃で15秒間、72℃で30秒を8サイクル、そして72℃で5分間の条件で行った。PCR産物の精製はAgencourt AMPure XP(Beckman Coulter)を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりPCR産物のサイズを確認後、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いてPCR産物の定量を行い、以下の式(1)に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、NUCLEASE FREE WATERで希釈することで4nMに調製した(これをサンプルと呼ぶ。)。
DNA濃度[ng/μL]/(660[g/mol]×550[bp])×106=DNA濃度[nM]・・・(1)
(3)シーケンス
4nMを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルの最終濃度は7pMになるように調製した。また、サンプル中のPhiX Controlは5%になるように調製した。MiSeq(Illumina)とMiSeq Reagent Nano Kit v2 500 cycle(Illumina)を用いてシーケンスを行った。
4nMを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルの最終濃度は7pMになるように調製した。また、サンプル中のPhiX Controlは5%になるように調製した。MiSeq(Illumina)とMiSeq Reagent Nano Kit v2 500 cycle(Illumina)を用いてシーケンスを行った。
(4)シーケンスデータからVHH抗体のアミノ酸配列の抽出と重複数の計測
MiSeq Controllerを用いてDemultiplexingされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからVHH抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。
MiSeq Controllerを用いてDemultiplexingされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからVHH抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。
(5)抗SARS-CoV-2 VHH抗体候補配列の選抜
4ラウンド目と5ラウンド目のセレクション後に共通して出現するVHH抗体のアミノ酸配列毎のクローン数に基づき、各VHH抗体の中における出現頻度を算出した。その結果、CoVHH―N1(配列番号14)、CoVHH―N2(配列番号15)の出現頻度が高く、Nタンパク質との親和性が高い抗体として選抜された(表1)。
4ラウンド目と5ラウンド目のセレクション後に共通して出現するVHH抗体のアミノ酸配列毎のクローン数に基づき、各VHH抗体の中における出現頻度を算出した。その結果、CoVHH―N1(配列番号14)、CoVHH―N2(配列番号15)の出現頻度が高く、Nタンパク質との親和性が高い抗体として選抜された(表1)。
CoVHH―N1のアミノ酸配列において、1~26番がFR1(配列番号7)、27~36番がCDR1(配列番号1)、37~50番がFR2(配列番号9)、51~60番がCDR2(配列番号2)、61~99番がFR3(配列番号11)、100~112番がCDR3(配列番号3)、113~123番がFR4(配列番号13)である。
CoVHH―N2のアミノ酸配列において、1~26番がFR1(配列番号8)、27~36番がCDR1(配列番号4)、37~50番がFR2(配列番号10)、51~60番がCDR2(配列番号5)、61~99番がFR3(配列番号12)、100~108番がCDR3(配列番号6)、109~119番がFR4(配列番号13)である。
CoVHH―N2のアミノ酸配列において、1~26番がFR1(配列番号8)、27~36番がCDR1(配列番号4)、37~50番がFR2(配列番号10)、51~60番がCDR2(配列番号5)、61~99番がFR3(配列番号12)、100~108番がCDR3(配列番号6)、109~119番がFR4(配列番号13)である。
(6)VHH抗体のCDR領域アミノ酸配列の抽出
4ラウンド及び5ラウンド後のセレクション後に共通して出現するVHHの中から、CoVHH―N1のアミノ酸配列との比較を行い、CoVHH―N1の各CDR領域に含まれる1つのアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたCoVHH―N1の変異体(CDR1変異体、またはCDR2変異体、またはCDR3変異体と呼ぶ)を選抜した(図1)。CDR1に1アミノ酸の置換をもつCoVHH―N1のCDR1変異体は、CoVHH―N1―1(配列番号21)、CoVHH―N1―2(配列番号22)、CoVHH―N1―3 (配列番号23)、CoVHH―N1―4(配列番号24)、CoVHH―N1―5(配列番号25)、CoVHH―N1―6(配列番号26)、CoVHH―N1―7(配列番号27)、CoVHH―N1―8(配列番号28)、CoVHH―N1―9(配列番号29)であり、CDR2に1アミノ酸の置換をもつCoVHH―N1のCDR1変異体は、CoVHH―N1―10(配列番号30)、CoVHH―N1―11(配列番号31)、CoVHH―N1―12(配列番号32)、CDR3に1アミノ酸の置換をもつCoVHH―N1のCDR1変異体は、CoVHH―N1―13(配列番号33)、CoVHH―N1―14(配列番号34)、CoVHH―N1―15(配列番号35)、CoVHH―N1―16(配列番号36)、CoVHH―N1―17(配列番号37)、CoVHH―N1―18(配列番号38)、CoVHH―N1―19(配列番号39)、CoVHH―N1―20(配列番号40)である。
4ラウンド及び5ラウンド後のセレクション後に共通して出現するVHHの中から、CoVHH―N1のアミノ酸配列との比較を行い、CoVHH―N1の各CDR領域に含まれる1つのアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたCoVHH―N1の変異体(CDR1変異体、またはCDR2変異体、またはCDR3変異体と呼ぶ)を選抜した(図1)。CDR1に1アミノ酸の置換をもつCoVHH―N1のCDR1変異体は、CoVHH―N1―1(配列番号21)、CoVHH―N1―2(配列番号22)、CoVHH―N1―3 (配列番号23)、CoVHH―N1―4(配列番号24)、CoVHH―N1―5(配列番号25)、CoVHH―N1―6(配列番号26)、CoVHH―N1―7(配列番号27)、CoVHH―N1―8(配列番号28)、CoVHH―N1―9(配列番号29)であり、CDR2に1アミノ酸の置換をもつCoVHH―N1のCDR1変異体は、CoVHH―N1―10(配列番号30)、CoVHH―N1―11(配列番号31)、CoVHH―N1―12(配列番号32)、CDR3に1アミノ酸の置換をもつCoVHH―N1のCDR1変異体は、CoVHH―N1―13(配列番号33)、CoVHH―N1―14(配列番号34)、CoVHH―N1―15(配列番号35)、CoVHH―N1―16(配列番号36)、CoVHH―N1―17(配列番号37)、CoVHH―N1―18(配列番号38)、CoVHH―N1―19(配列番号39)、CoVHH―N1―20(配列番号40)である。
実施例2 プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるVHHの生産
(1)遺伝子の人工合成
合成されるVHHのアミノ酸配列には、CoVHH-N1(配列番号14)またはCoVHH-N2(配列番号15)のC末端側にリンカー配列を介したHisタグ配列(配列番号41、GGGSHHHHHH)を付与した。これにより合成されるVHHをHisタグ付きCoVHH-N1(配列番号42)及びHisタグ付きCoVHH-N2(配列番号43)と呼ぶ。Hisタグ付きCoVHH-N1及びHisタグ付きCoVHH-N2を合成するための人工合成遺伝子として、Hisタグ付きCoVHH-N1用人工合成遺伝子(配列番号44)及びCoVHH-N2用人工合成遺伝子(配列番号45)をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
(1)遺伝子の人工合成
合成されるVHHのアミノ酸配列には、CoVHH-N1(配列番号14)またはCoVHH-N2(配列番号15)のC末端側にリンカー配列を介したHisタグ配列(配列番号41、GGGSHHHHHH)を付与した。これにより合成されるVHHをHisタグ付きCoVHH-N1(配列番号42)及びHisタグ付きCoVHH-N2(配列番号43)と呼ぶ。Hisタグ付きCoVHH-N1及びHisタグ付きCoVHH-N2を合成するための人工合成遺伝子として、Hisタグ付きCoVHH-N1用人工合成遺伝子(配列番号44)及びCoVHH-N2用人工合成遺伝子(配列番号45)をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
(2)VHH発現用プラスミドの構築
組換えプラスミドpHY-S237(特開2014-158430)をテンプレートとし、5’-GATCCCCGGGAATTCCTGTTATAAAAAAAGG-3’(配列番号46)と5’-ATGATGTTAAGAAAGAAAACAAAGCAG-3’(配列番号47)のプライマーセットとPrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を用いたPCRによりプラスミド配列を増幅した。168株のゲノムをテンプレートとし、5’-GAATTCCCGGGGATCTAAGAAAAGTGATTCTGGGAGAG-3’(配列番号48)と5’-CTTTCTTAACATCATAGTAGTTCACCACCTTTTCCC-3’(配列番号49)のプライマーセットを用いたPCRによりspoVG遺伝子由来のプロモーターDNAを増幅した。得られたプロモーターDNAを、In-Fusion HD Cloning Kit(Takara)を用いてプラスミド配列に組み込み、spoVGプロモーターと連結されたVHH発現用プラスミドを構築した。5’-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-3’(配列番号50)及び5’-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-3’(配列番号51)のプライマーセットとPrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を用いたPCRによりプラスミド配列を増幅した。得られたPCR断片に、(1)の人工合成遺伝子を含むDNAをIn-Fusion HD Cloning Kit(Takara)を用いて組み込み、人工合成VHH遺伝子の各々を含むVHH発現用プラスミドを構築した。
組換えプラスミドpHY-S237(特開2014-158430)をテンプレートとし、5’-GATCCCCGGGAATTCCTGTTATAAAAAAAGG-3’(配列番号46)と5’-ATGATGTTAAGAAAGAAAACAAAGCAG-3’(配列番号47)のプライマーセットとPrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を用いたPCRによりプラスミド配列を増幅した。168株のゲノムをテンプレートとし、5’-GAATTCCCGGGGATCTAAGAAAAGTGATTCTGGGAGAG-3’(配列番号48)と5’-CTTTCTTAACATCATAGTAGTTCACCACCTTTTCCC-3’(配列番号49)のプライマーセットを用いたPCRによりspoVG遺伝子由来のプロモーターDNAを増幅した。得られたプロモーターDNAを、In-Fusion HD Cloning Kit(Takara)を用いてプラスミド配列に組み込み、spoVGプロモーターと連結されたVHH発現用プラスミドを構築した。5’-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-3’(配列番号50)及び5’-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-3’(配列番号51)のプライマーセットとPrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ(TaKaRa)を用いたPCRによりプラスミド配列を増幅した。得られたPCR断片に、(1)の人工合成遺伝子を含むDNAをIn-Fusion HD Cloning Kit(Takara)を用いて組み込み、人工合成VHH遺伝子の各々を含むVHH発現用プラスミドを構築した。
(3)組換え枯草菌の作製
Bacillus subtilis 168株(以下、168株という)から、特開2006-174707号公報に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子(epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE)の欠損株を作製した。また、特許第4336082に記載されている方法に従い、上記8種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Dpr8から、胞子形成に関与するsigF遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をDpr8ΔsigFと記載する。
Dpr8ΔsigF株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。1mLのLB液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、30℃、210rpmで一晩振とう培養した。翌日、新たな1mLのLB液体培地にこの培養液を10μL植菌し、37℃、210rpmで約2時間振とう培養した。この培養液を1.5mLチューブに回収し、1,2000rpmで5分間遠心し、上清を除去したペレットをLysozyme(SIGMA)4mg/mLを含むSMMP500μLに懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、3,500rpmで10分間遠心し、上清を除去したペレットをSMMP400μLに懸濁した。この懸濁液33μLを各種プラスミドと混合し、さらに40%PEGを100μL添加してボルテックスした。この液にSMMPを350μL加えて転倒混和し、30℃、210rpmで1時間振とうした後、DM3寒天培地プレートに全量塗布し、30℃で2~3日間インキュベートした。
Bacillus subtilis 168株(以下、168株という)から、特開2006-174707号公報に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子(epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE)の欠損株を作製した。また、特許第4336082に記載されている方法に従い、上記8種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Dpr8から、胞子形成に関与するsigF遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をDpr8ΔsigFと記載する。
Dpr8ΔsigF株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。1mLのLB液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、30℃、210rpmで一晩振とう培養した。翌日、新たな1mLのLB液体培地にこの培養液を10μL植菌し、37℃、210rpmで約2時間振とう培養した。この培養液を1.5mLチューブに回収し、1,2000rpmで5分間遠心し、上清を除去したペレットをLysozyme(SIGMA)4mg/mLを含むSMMP500μLに懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、3,500rpmで10分間遠心し、上清を除去したペレットをSMMP400μLに懸濁した。この懸濁液33μLを各種プラスミドと混合し、さらに40%PEGを100μL添加してボルテックスした。この液にSMMPを350μL加えて転倒混和し、30℃、210rpmで1時間振とうした後、DM3寒天培地プレートに全量塗布し、30℃で2~3日間インキュベートした。
(4)VHH産生
(3)で作製した組換え枯草菌を1mLの50ppmテトラサイクリンを含むLB培地に植菌し、30℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Dpr8ΔsigFは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた20mLの2×L-mal培地に1%接種し、30℃で72時間振とう培養した。培養終了時に1mLの培養液をマイクロチューブにて4℃、15,000rpm、5分間遠心し、上清を回収した。各VHHについてはNi-NTAアガロースビーズ(富士フィルム和光純薬)を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質はPBS(30mM イミダゾール)に溶解した。
(3)で作製した組換え枯草菌を1mLの50ppmテトラサイクリンを含むLB培地に植菌し、30℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Dpr8ΔsigFは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた20mLの2×L-mal培地に1%接種し、30℃で72時間振とう培養した。培養終了時に1mLの培養液をマイクロチューブにて4℃、15,000rpm、5分間遠心し、上清を回収した。各VHHについてはNi-NTAアガロースビーズ(富士フィルム和光純薬)を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質はPBS(30mM イミダゾール)に溶解した。
(5)SDS-PAGEによる確認
6.5μLのHisタグ付きCoVHH-N1又はHisタグ付きCoVHH-N2の水溶液(共に200μg/mL)、2.5μLのNuPAGE(商標)LDS Sample Buffer(4X)(Thermo Fisher Scientific)、1μLのNuPAGE(商標)Sample Reducing Agent (10X)(Thermo Fisher Scientific)を混合し、100℃で加熱した。その後、10μLのサンプル溶液をゲルのウェルにアプライした。分子量マーカーとして、5μLのNovex(商標)Sharp Pre-stained Protein Standard(Thermo Fisher Scientific)もゲルのウェルにアプライした。ゲルはNuPAGE(商標)10%,Bis-Tris,1.0mm,Mini Protein Gel,12-well(Thermo Fisher Scientific)を用いた。泳動用緩衝液にはNuPAGE(商標)MES SDS Running Buffer (20X)(Thermo Fisher Scientific)を水で20倍希釈して調製した緩衝液を用いた。XCell SureLock(商標)ミニセル電気泳動システム(Thermo Fisher Scientific)を泳動槽として用い、PowerEase(商標)90W Power Supply(Thermo Fisher Scientific)に接続して200Vの電圧で40分間電気泳動を行った。その後、ゲルをGelCode(商標)Blue Stain Reagent(Thermo Fisher Scientific)を用いて染色し、目的タンパク質のバンドを確認した(図2)。その結果、Hisタグ付きCoVHH-N1とHisタグ付きCoVHH-N2が産生されていることが確認された。
6.5μLのHisタグ付きCoVHH-N1又はHisタグ付きCoVHH-N2の水溶液(共に200μg/mL)、2.5μLのNuPAGE(商標)LDS Sample Buffer(4X)(Thermo Fisher Scientific)、1μLのNuPAGE(商標)Sample Reducing Agent (10X)(Thermo Fisher Scientific)を混合し、100℃で加熱した。その後、10μLのサンプル溶液をゲルのウェルにアプライした。分子量マーカーとして、5μLのNovex(商標)Sharp Pre-stained Protein Standard(Thermo Fisher Scientific)もゲルのウェルにアプライした。ゲルはNuPAGE(商標)10%,Bis-Tris,1.0mm,Mini Protein Gel,12-well(Thermo Fisher Scientific)を用いた。泳動用緩衝液にはNuPAGE(商標)MES SDS Running Buffer (20X)(Thermo Fisher Scientific)を水で20倍希釈して調製した緩衝液を用いた。XCell SureLock(商標)ミニセル電気泳動システム(Thermo Fisher Scientific)を泳動槽として用い、PowerEase(商標)90W Power Supply(Thermo Fisher Scientific)に接続して200Vの電圧で40分間電気泳動を行った。その後、ゲルをGelCode(商標)Blue Stain Reagent(Thermo Fisher Scientific)を用いて染色し、目的タンパク質のバンドを確認した(図2)。その結果、Hisタグ付きCoVHH-N1とHisタグ付きCoVHH-N2が産生されていることが確認された。
実施例3 表面プラズモン共鳴(SPR)法共鳴法による結合活性の測定
Biacore(商標)T200(Cytiva)を用いてSeries S Sensor Chip NTA(Cytiva)に固相化したHisタグ付きCoVHH-N1又はHisタグ付きCoVHH-N2のNタンパク質に対する結合活性を測定した。Wizard、Kinetics/Affinityのモードで測定した。温度は25℃に設定した。ランニング緩衝液には10mM HEPES、300mM NaCl、50μM EDTA、0.05%(v/v)Tween20(pH 7.4)を用いた。ラン毎の測定順は以下の通りである;1)VHHの固相化:流速を10μL/mLに設定し、0.5mM NiCl2水溶液を60秒間添加し、その後、ランニング緩衝液で希釈したHisタグ付きVHH溶液を60秒間添加することで1000RU固定化した。2)結合活性の測定:流速を30μL/mLに設定し、ランニング緩衝液で希釈したSARS-CoV-2 Nucleocapsid-Fc fusion protein(Fcタグ付きNタンパク質、Invivogen)をAssociation Time120秒間、Dissociation Time400秒間に設定して相互作用させた。3)センサーチップ表面の再生:流速を30μL/mLに設定し、350mM EDTA溶液(pH 8.0)を60秒間添加することで固相化されたHisタグ付きVHHを溶離した。Biacore(商標)T200 Evaluation(ソフトウェアバージョン2.0)(Cytiva)を用いて1:1 binding modelによる解析を行い、結合活性を算出した(図3、図4)。その結果、Hisタグ付きCoVHH-N1のNタンパク質に対する平衡乖離定数(KD)は5.64x10-10M(ka=3.02x106(1/Ms)、kd=1.70x10-3(1/s))であった。Hisタグ付きCoVHH-N2のNタンパク質に対する平衡乖離定数(KD)は2.09x10-9M(ka=4.30x105(1/Ms)、kd=9.00x10-4(1/s))であった。
Biacore(商標)T200(Cytiva)を用いてSeries S Sensor Chip NTA(Cytiva)に固相化したHisタグ付きCoVHH-N1又はHisタグ付きCoVHH-N2のNタンパク質に対する結合活性を測定した。Wizard、Kinetics/Affinityのモードで測定した。温度は25℃に設定した。ランニング緩衝液には10mM HEPES、300mM NaCl、50μM EDTA、0.05%(v/v)Tween20(pH 7.4)を用いた。ラン毎の測定順は以下の通りである;1)VHHの固相化:流速を10μL/mLに設定し、0.5mM NiCl2水溶液を60秒間添加し、その後、ランニング緩衝液で希釈したHisタグ付きVHH溶液を60秒間添加することで1000RU固定化した。2)結合活性の測定:流速を30μL/mLに設定し、ランニング緩衝液で希釈したSARS-CoV-2 Nucleocapsid-Fc fusion protein(Fcタグ付きNタンパク質、Invivogen)をAssociation Time120秒間、Dissociation Time400秒間に設定して相互作用させた。3)センサーチップ表面の再生:流速を30μL/mLに設定し、350mM EDTA溶液(pH 8.0)を60秒間添加することで固相化されたHisタグ付きVHHを溶離した。Biacore(商標)T200 Evaluation(ソフトウェアバージョン2.0)(Cytiva)を用いて1:1 binding modelによる解析を行い、結合活性を算出した(図3、図4)。その結果、Hisタグ付きCoVHH-N1のNタンパク質に対する平衡乖離定数(KD)は5.64x10-10M(ka=3.02x106(1/Ms)、kd=1.70x10-3(1/s))であった。Hisタグ付きCoVHH-N2のNタンパク質に対する平衡乖離定数(KD)は2.09x10-9M(ka=4.30x105(1/Ms)、kd=9.00x10-4(1/s))であった。
実施例4 ELISA法による結合特異性の評価
F96 Cert.Maxisorp Nunc-Immuno(商標)Plate(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに50μLの10μg/mL SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid-His Recombinant Protein(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-229E)Nucleoprotein/NP Protein (His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-NL63)Nucleoprotein/NP Protein (His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-HKU1)Nucleoprotein/NP Protein(His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-OC43)Nucleoprotein/NP Protein(His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)(いずれもSinoBiological)、SARS-CoV nucleocapsid recombinant protein(His-SUMO tagged, Nter)(His-SUMOタグ付きNタンパク質)(Arigo Biolaboratories)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったNタンパク質分散液を取り除いた後200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。200μLのPierce(商標)Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。Nタンパク質を固相化した各ウェルに対して50μLの1μg/mL Hisタグ付きCoVHH-N1又はHisタグ付きCoVHH-N2/PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。VHH抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。検出抗体にはPeroxidase-AffiniPure Goat Anti-Alpaca IgG(H+L)(min X Bov,Hu,Ms,Rb,Rat Sr Prot)(Jackson Immuno Research Laboratories)(1.0mg/mL)を用いた。PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)により検出抗体を1/5,000に希釈した。各ウェルに50μLの検出抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。発色基質はOPDタブレット(Thermo Fisher Scientific)をStable Peroxide Substrate Buffer(Thermo Fisher Scientific)で溶解し調製した。各ウェルに100μLの発色基質を添加し,遮光下で30分間インキュベートした後、直ちにMicroplate Reader Infinite M1000 PRO(TECAN)を用いて吸光度450nmを測定した(図5)。その結果、CoVHH-N1及びCoVHH-N2ともにSARS-CoV-2のNタンパク質に特異的に結合することが確認された。
F96 Cert.Maxisorp Nunc-Immuno(商標)Plate(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに50μLの10μg/mL SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid-His Recombinant Protein(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-229E)Nucleoprotein/NP Protein (His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-NL63)Nucleoprotein/NP Protein (His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-HKU1)Nucleoprotein/NP Protein(His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)、Human coronavirus(HCoV-OC43)Nucleoprotein/NP Protein(His Tag)(Hisタグ付きNタンパク質)(いずれもSinoBiological)、SARS-CoV nucleocapsid recombinant protein(His-SUMO tagged, Nter)(His-SUMOタグ付きNタンパク質)(Arigo Biolaboratories)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったNタンパク質分散液を取り除いた後200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。200μLのPierce(商標)Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。Nタンパク質を固相化した各ウェルに対して50μLの1μg/mL Hisタグ付きCoVHH-N1又はHisタグ付きCoVHH-N2/PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。VHH抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。検出抗体にはPeroxidase-AffiniPure Goat Anti-Alpaca IgG(H+L)(min X Bov,Hu,Ms,Rb,Rat Sr Prot)(Jackson Immuno Research Laboratories)(1.0mg/mL)を用いた。PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)により検出抗体を1/5,000に希釈した。各ウェルに50μLの検出抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。発色基質はOPDタブレット(Thermo Fisher Scientific)をStable Peroxide Substrate Buffer(Thermo Fisher Scientific)で溶解し調製した。各ウェルに100μLの発色基質を添加し,遮光下で30分間インキュベートした後、直ちにMicroplate Reader Infinite M1000 PRO(TECAN)を用いて吸光度450nmを測定した(図5)。その結果、CoVHH-N1及びCoVHH-N2ともにSARS-CoV-2のNタンパク質に特異的に結合することが確認された。
実施例5 ELISA法による変異株Nタンパク質に対する結合活性の評価
F96 Cert.Maxisorp Nunc-Immuno(商標)Plate(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに50μlの10μg/ml SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid-His Recombinant Protein(Hisタグ付きNタンパク質)、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(R203K,G204R)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid(P13L)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(S194L)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid(I292T)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(D3L,R203K,G204R,S235F)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(D3L,S235F)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(T205I) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(P80R) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(D377Y) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2 Nucleocapsid(A12G,T205I) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2 Nucleocapsid(R203M,D377Y) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2 Nucleocapsid(A119S,R203K,G204R,M234I) Protein(His Tag)(いずれもSinoBiological)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったNタンパク質分散液を取り除いた後200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。200μlのPierce(商標)Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。Nタンパク質を固相化した各ウェルに対して50μlの1μg/mL CoVHH-N2(Hisタグ付き)/PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。VHH抗体を取り除いた後、200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。検出抗体にはPeroxidase-AffiniPure Goat Anti-Alpaca IgG(H+L)(min X Bov,Hu,Ms,Rb,Rat Sr Prot)(Jackson Immuno Research Laboratories)(1.0mg/mL)を用いた。PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)により検出抗体を1/10,000に希釈した。各ウェルに50μlの検出抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
発色基質はOPDタブレット(Thermo Fisher Scientific)をStable Peroxide Substrate Buffer(Thermo Fisher Scientific)で溶解し調製した。各ウェルに100μlの発色基質を添加し,遮光下で30分間インキュベートした後、直ちにMicroplate Reader Infinite M1000 PRO(TECAN)を用いて吸光度450nmを測定した(図6、図7)。
その結果、Hisタグ付きCoVHH-N2はSARS-CoV-2の変異株のNタンパク質に対して、普遍的に結合することが確認された。
F96 Cert.Maxisorp Nunc-Immuno(商標)Plate(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに50μlの10μg/ml SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid-His Recombinant Protein(Hisタグ付きNタンパク質)、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(R203K,G204R)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid(P13L)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(S194L)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid(I292T)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(D3L,R203K,G204R,S235F)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(D3L,S235F)-His Recombinant Protein、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(T205I) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(P80R) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2(2019-nCoV) Nucleocapsid(D377Y) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2 Nucleocapsid(A12G,T205I) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2 Nucleocapsid(R203M,D377Y) Protein(His Tag)、SARS-CoV-2 Nucleocapsid(A119S,R203K,G204R,M234I) Protein(His Tag)(いずれもSinoBiological)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったNタンパク質分散液を取り除いた後200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。200μlのPierce(商標)Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。Nタンパク質を固相化した各ウェルに対して50μlの1μg/mL CoVHH-N2(Hisタグ付き)/PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。VHH抗体を取り除いた後、200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。検出抗体にはPeroxidase-AffiniPure Goat Anti-Alpaca IgG(H+L)(min X Bov,Hu,Ms,Rb,Rat Sr Prot)(Jackson Immuno Research Laboratories)(1.0mg/mL)を用いた。PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)により検出抗体を1/10,000に希釈した。各ウェルに50μlの検出抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、200μlのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
発色基質はOPDタブレット(Thermo Fisher Scientific)をStable Peroxide Substrate Buffer(Thermo Fisher Scientific)で溶解し調製した。各ウェルに100μlの発色基質を添加し,遮光下で30分間インキュベートした後、直ちにMicroplate Reader Infinite M1000 PRO(TECAN)を用いて吸光度450nmを測定した(図6、図7)。
その結果、Hisタグ付きCoVHH-N2はSARS-CoV-2の変異株のNタンパク質に対して、普遍的に結合することが確認された。
実施例6 ELISA法によるオミクロン株Nタンパク質に対する結合活性の評価
F96 Cert.Maxisorp Nunc-Immuno(商標)Plate(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに50μLの10μg/mL SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid-His Recombinant Protein(Hisタグ付きNタンパク質)、SARS-CoV-2 B.1.529(Omicron)Nucleocapsid Protein(His Tag)(いずれもSinoBiological)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったNタンパク質分散液を取り除いた後200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。200μLのPierce(商標)Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。Nタンパク質を固相化した各ウェルに対して50μLの1μg/mL CoVHH-N1(Hisタグ付き)又はCoVHH-N2(Hisタグ付き)/PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。VHH抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。検出抗体にはPeroxidase-AffiniPure Goat Anti-Alpaca IgG(H+L)(min X Bov,Hu,Ms,Rb,Rat Sr Prot)(Jackson Immuno Research Laboratories)(1.0mg/mL)を用いた。PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)により検出抗体を1/10,000に希釈した。各ウェルに50μLの検出抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
発色基質はOPDタブレット(Thermo Fisher Scientific)をStable Peroxide Substrate Buffer(Thermo Fisher Scientific)で溶解し調製した。各ウェルに100μLの発色基質を添加し,遮光下で30分間インキュベートした後、直ちにMicroplate Reader Infinite M1000 PRO(TECAN)を用いて吸光度450nmを測定した(図8)。
その結果、Hisタグ付きCoVHH-N1とHisタグ付きCoVHH-N2はともにSARS-CoV-2のオミクロン株のNタンパク質に対しても結合することが確認された。
F96 Cert.Maxisorp Nunc-Immuno(商標)Plate(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに50μLの10μg/mL SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid-His Recombinant Protein(Hisタグ付きNタンパク質)、SARS-CoV-2 B.1.529(Omicron)Nucleocapsid Protein(His Tag)(いずれもSinoBiological)を添加し、シーリング後、4℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったNタンパク質分散液を取り除いた後200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。200μLのPierce(商標)Protein-Free(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。Nタンパク質を固相化した各ウェルに対して50μLの1μg/mL CoVHH-N1(Hisタグ付き)又はCoVHH-N2(Hisタグ付き)/PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。VHH抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。検出抗体にはPeroxidase-AffiniPure Goat Anti-Alpaca IgG(H+L)(min X Bov,Hu,Ms,Rb,Rat Sr Prot)(Jackson Immuno Research Laboratories)(1.0mg/mL)を用いた。PBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)により検出抗体を1/10,000に希釈した。各ウェルに50μLの検出抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、200μLのPBST(0.05%(v/v)Tween20含有PBS)を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は3回行った。
発色基質はOPDタブレット(Thermo Fisher Scientific)をStable Peroxide Substrate Buffer(Thermo Fisher Scientific)で溶解し調製した。各ウェルに100μLの発色基質を添加し,遮光下で30分間インキュベートした後、直ちにMicroplate Reader Infinite M1000 PRO(TECAN)を用いて吸光度450nmを測定した(図8)。
その結果、Hisタグ付きCoVHH-N1とHisタグ付きCoVHH-N2はともにSARS-CoV-2のオミクロン株のNタンパク質に対しても結合することが確認された。
Claims (10)
- 以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3 - N-タンパク質に結合する、請求項1記載の抗体。
- VHH抗体、重鎖抗体又はVHH抗体多量体である、請求項1又は2記載の抗体。
- VHH抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である請求項3記載の抗体。
- VHH抗体多量体が、前記構造ドメインの1又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの1又は複数を連結した多量体である請求項3記載の抗体。
- 請求項1又は2記載の抗体をコードする核酸。
- 以下の(a)又は(b)で示されるCDRを含む構造ドメインを1つ以上有する、SARS-CoV-2に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のSARS-CoV-2の検出方法。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3
(b)配列番号4で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において1個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるCDR3 - 請求項1~5のいずれか1項記載の抗体を含有するSARS-CoV-2検出キット。
- 請求項1~5のいずれか1項記載の抗体を含有する医薬。
- SARS-CoV-2感染症の予防又は治療のための請求項9記載の医薬。
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