JP2014158430A - セルラーゼの生産方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【解決手段】recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌(Bacillus subtilis)を用いてセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産方法。前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させるセルラーゼの生産方法。前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌であるセルラーゼの生産方法。
【選択図】なし
Description
そこで、不要な或いは有害な働きをすると考えられる遺伝子を欠失又は不活性化することによって、有用物質(例えば異種タンパク質)の生産性を向上させるといった試みが行われている。例えば、特許文献2には、転移因子を有する納豆菌(Bacillus subtilis var.natto)のrecA遺伝子を欠損させることにより、植え継ぎを繰り返した場合であっても転移因子の抑制によりポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性を安定に保持できることが記載されている。
これに対して、特許文献3には、枯草菌においてrecA遺伝子を欠損させた場合、導入するプラスミドが宿主細胞内で不安定となる場合があることが記載されている。
また、本発明は、セルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、異種セルラーゼの生産効率に優れた、異種セルラーゼ生産用組換え微生物を提供することを課題とする。
そこで、本発明者等はセルラーゼの生産方法について鋭意検討を行った。その結果、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を培養してセルラーゼを生産させることで、セルラーゼの生産性が上昇することを見出した。本発明はこの知見に基づき完成されたものである。
また、本発明は、枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてセルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法に関する。
さらに、本発明は、枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された、異種セルラーゼ生産用組換え微生物に関する。
また、本発明のセルラーゼの生産性向上方法は、recA遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失及び不活性化させない場合と比較してセルラーゼの生産性を向上させることができる。
さらに、本発明の異種セルラーゼ生産用組換え微生物は、異種セルラーゼを効率良く生産することができる。
上記SSCおよび温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。
遺伝子の導入方法は、前記遺伝子の発現が可能であれば制限はないが、プラスミド等のベクターを用いて前記遺伝子の導入することが好ましい。当該ベクターの種類は、適宜選択することができるが、宿主内で自己複製可能なベクター(例えばプラスミド)であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。好ましいプラスミドの例としては、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等が挙げられる。
なお、本発明においてrecA遺伝子は配列番号9に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号10に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号10に示すアミノ酸配列において1又は数個、好ましくは1〜100個、より好ましくは1〜70個、より好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への1〜数個、好ましくは1〜100個、より好ましくは1〜70個、より好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号10に示すアミノ酸配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号9に示す塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号9に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。本明細書において、これらの遺伝子をrecA遺伝子に相当する遺伝子とする。
(a)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号10のアミノ酸配列において1又は数個(好ましくは1〜100個、より好ましくは1〜70個、より好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
(c)配列番号10のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
特に、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり(Itaya,M.,Tanaka,T.,Mol.Gen.Genet.,1990,vol.223,p.268-272)、このような方法を繰り返すことによって、目的の組換え微生物を得ることができる。また、ランダムな遺伝子の不活性化方法としては、変異誘発剤の使用や親微生物への紫外線、ガンマ線等の照射によっても実施可能である。この場合、標的とする構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは一部欠失といった変異導入の他に、プロモーター領域等の制御領域への同様の変異導入、または標的遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様の変異導入によっても同等の効果が期待できる。さらに、より効率的な手法として、標的とする遺伝子の上流、下流領域を含むが標的とする遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をSOE(splicing by overlap extension)-PCR法(Horton,RM.,et al.,Gene,1989,vol.77,p.61-68)によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノム上の標的とする遺伝子の外側の2箇所で二回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的とする遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能である(図1参照)。
なお、本発明において好ましく用いられる異種セルラーゼ遺伝子は配列番号11に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号12に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号12に示すアミノ酸配列において1又は数個(好ましくは1〜12個、より好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個、より好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、セルラーゼ遺伝子には、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、セルラーゼ遺伝子には、配列番号11に示す塩基配列に対して80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、セルラーゼ遺伝子には、配列番号11に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。本明細書において、これらの遺伝子をセルラーゼ遺伝子に相当する遺伝子とする。
(d)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号12のアミノ酸配列において1又は数個(好ましくは1〜12個、より好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個、より好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質
(f)配列番号12のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質
<2>枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてセルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法。
(a)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号10のアミノ酸配列において1又は数個(好ましくは1〜100個、より好ましくは1〜70個、より好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
(c)配列番号10のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
<4>前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、前記<1>〜<3>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<5>前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させる、前記<1>〜<4>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<6>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター(好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK)を用いて枯草菌に導入された、前記<5>項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<7>前記異種セルラーゼが、野生型の枯草菌が有さないセルラーゼ又は野生型の枯草菌が有しているセルラーゼに変異が導入されているセルラーゼである、前記<5>又は<6>項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<8>前記セルラーゼ又は異種セルラーゼがファミリー5に属するセルラーゼである、前記<1>〜<7>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<9>前記セルラーゼ又は異種セルラーゼをコードする遺伝子が下記(d)〜(f)のいずれか1つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記<1>〜<8>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
(d)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号12のアミノ酸配列において1又は数個(好ましくは1〜12個、より好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個、より好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質
(f)配列番号12のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質
<10>前記セルラーゼ又は異種セルラーゼが、配列番号12のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号12のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性をもつアミノ酸配列からなるセルラーゼであって、配列番号12のアミノ酸配列において、111位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアルギニンであり、151位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、190位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、262位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、264位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、255位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がチロシンであるセルラーゼである、前記<1>〜<9>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<11>前記セルラーゼ又は異種セルラーゼをコードする遺伝子が、その上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる群より選ばれる少なくとも1種を有する、前記<1>〜<10>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<12>前記セルラーゼ又は異種セルラーゼをコードする遺伝子に、前記転写開始制御領域、前記翻訳開始制御領域及び前記分泌シグナル領域からなる3領域が結合している、前記<11>項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<13>前記分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域がセルラーゼをコードする遺伝子の開始コドンから始まる長さ0.6〜1kbの上流領域であるものがセルラーゼをコードする遺伝子と適正な形で結合されている、前記<11>又は<12>項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<14>前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記<1>〜<13>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<15>前記枯草菌が転移因子(好ましくはトランスポゾン及び挿入配列)を有さない、前記<1>〜<14>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<16>前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No.168系統株である、前記<1>〜<15>のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法又はセルラーゼの生産性向上方法。
<19>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター(好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK)を用いて枯草菌に導入された、前記<17>又は<18>項記載の微生物。
<20>前記異種セルラーゼが、野生型の枯草菌が有さないセルラーゼ又は野生型の枯草菌が有しているセルラーゼに変異が導入されているセルラーゼである、前記<17>〜<19>のいずれか1項記載の微生物。
<21>前記異種セルラーゼがファミリー5に属する異種セルラーゼである、前記<17>〜<20>のいずれか1項記載の微生物。
<22>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が前記(d)〜(f)のいずれか1つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記<17>〜<21>のいずれか1項記載の微生物。
<23>前記異種セルラーゼが、配列番号12のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号12のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性をもつアミノ酸配列からなるセルラーゼであって、配列番号12のアミノ酸配列において、111位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアルギニンであり、151位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、190位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、262位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、264位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、255位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がチロシンであるセルラーゼである、前記<17>〜<22>のいずれか1項記載の微生物。
<24>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、その上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる群より選ばれる少なくとも1種を有する、前記<17>〜<23>のいずれか1項記載の微生物。
<25>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子に、前記転写開始制御領域、前記翻訳開始制御領域及び前記分泌シグナル領域からなる3領域が結合している、前記<24>項記載の微生物。
<26>前記分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域がセルラーゼをコードする遺伝子の開始コドンから始まる長さ0.6〜1kbの上流領域であるものが異種セルラーゼをコードする遺伝子と適正な形で結合されている、前記<24>又は<25>項記載の微生物。
<27>前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記<17>〜<26>のいずれか1項記載の微生物。
<28>前記枯草菌が転移因子(好ましくはトランスポゾン及び挿入配列)を有さない、前記<17>〜<27>のいずれか1項記載の枯草菌。
<29>前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No.168系統株である、前記<17>〜<28>のいずれか1項記載の微生物。
<31>異種セルラーゼの生産のための、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌の使用。
<32>recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された枯草菌を、異種セルラーゼ生産用組換え微生物として使用する方法。
<34>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が、プラスミドベクター(好ましくは多コピーのベクター、より好ましくはpT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、又はpHY300PLK)を用いて枯草菌に導入された、前記<30>〜<33>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<35>前記異種セルラーゼが、野生型の枯草菌が有さないセルラーゼ又は野生型の枯草菌が有しているセルラーゼに変異が導入されているセルラーゼである、前記<30>〜<34>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<36>前記異種セルラーゼがファミリー5に属する異種セルラーゼである、前記<30>〜<35>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<37>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子が前記(d)〜(f)のいずれか1つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記<30>〜<36>項記載の使用又は方法。
<38>前記異種セルラーゼが、配列番号12のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号12のアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)の同一性をもつアミノ酸配列からなるセルラーゼであって、配列番号12のアミノ酸配列において、111位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がアルギニンであり、151位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、190位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸であり、262位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、264位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、255位のアミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基がチロシンであるセルラーゼである、前記<30>〜<37>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<39>前記異種セルラーゼ遺伝子が、その上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる群より選ばれる少なくとも1種を有する、前記<30>〜<38>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<40>前記異種セルラーゼをコードする遺伝子に、前記転写開始制御領域、前記翻訳開始制御領域及び前記分泌シグナル領域からなる3領域が結合している、前記<39>項記載の使用又は方法。
<41>前記分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域がセルラーゼをコードする遺伝子の開始コドンから始まる長さ0.6〜1kbの上流領域であるものが異種セルラーゼをコードする遺伝子と適正な形で結合されている、前記<39>又は<40>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<42>前記枯草菌が納豆菌を除く枯草菌である、前記<30>〜<41>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<43>前記枯草菌が転移因子(好ましくはトランスポゾン及び挿入配列)を有さない、前記<30>〜<42>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<44>前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No.168系統株である、前記<30>〜<43>のいずれか1項記載の使用又は方法。
なお、表1には、本実施例で使用したプライマーの名称、その塩基配列及び配列番号をまとめて示した。ここで、表1に示す塩基配列において、下線部分は制限酵素認識配列を示している。また、本実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)には、GeneAmp PCR System(アプライドバイオシステムズ社製)及びKOD-Plus-Neo DNA Polymerase(東洋紡績社製)、並びに付属の試薬類を用いた。
図1に示す手順に従い、recA遺伝子を欠失させた枯草菌改変体を作製した。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したRECA-F1(配列番号1)及びRECA-R1(配列番号2)のプライマーセットを用いて、ゲノム上のrecA遺伝子の上流領域に隣接する約0.9kbの断片(A)をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、RECA-F2(配列番号3)及びRECA-R2(配列番号4)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のrecA遺伝子の下流領域に隣接する約0.8kbの断片(B)をPCRにより増幅した。また、プラスミドpDG1727(Guerout-Fleury et al.,Gene.,1995,vol.167,p.335-336;Bacillus Genetic Stock Center[http://www.bgsc.org/]より入手可能)のDNAを鋳型とし、表1に示したSPC-F(配列番号5)及びSPC-R(配列番号6)のプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子(Spc)を含む約1.0kbの断片(C)を調製した。
枯草菌168株をCI培地(0.20質量%硫酸アンモニウム、1.40質量%リン酸水素二カリウム、0.60質量%リン酸二水素カリウム、0.10質量%クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50質量%グルコース、0.03質量%アミケース(SIGMA社製)、5mM塩化マグネシウム、50μg/mLトリプトファン)において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部(0.5mL)を分取し、遠心分離にて菌体のみを回収後、1mLのCII培地(0.20質量%硫酸アンモニウム、1.40質量%リン酸水素二カリウム、0.60質量%リン酸二水素カリウム、0.10質量%クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50質量%グルコース、0.015質量%アミケース(SIGMA社製)、5mM塩化マグネシウム、5μg/mLトリプトファン)に菌体を再懸濁することで、枯草菌株のコンピテントセル懸濁液を調製した。
前記(2)で調製したコンピテントセル懸濁液100μLに、前記(1)で得られたDNA断片(D)を最終濃度が15μg/mL以上となるよう添加し、37℃で90分間振盪培養後、100μLのLB液体培地(1質量%トリプトン、0.50質量%酵母エキス、0.50質量%NaCl)を加え、37℃で1時間振盪培養を行った。その後、スペクチノマイシン(100μg/mL)を含むLB寒天培地(1質量%トリプトン、0.50質量%酵母エキス、0.50質量%NaCl、1.5質量%寒天)に培養液10μL又は100μLを塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCR及びシークエンスによってrecA遺伝子がSpc耐性遺伝子に置換した目的とする枯草菌改変体であることを確認した。以上のようにして、recA遺伝子欠失株(kao119株)を構築した。
バチルス・エスピーKSM-S237株(FERM BP-7875)から調製した染色体DNAを鋳型とし、237UB1プライマー(配列番号7)及び237DB1プライマー(配列番号8)のプライマーセットを用いて、KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報参照)の断片(3.1kb)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。このPCR反応では、GeneAmp PCR System(アプライドバイオシステムズ)を使用し、Pyrobest DNA Polymerase(タカラバイオ)と付属の試薬類を用いた。
増幅したDNA断片をBamHI制限酵素処理し、断片をシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入し、組換えプラスミドpHY-S237を作成した。
野生株である枯草菌168株、及び製造例1で作製した枯草菌変異株(kao119株)に対し、製造例2で作製した組換えプラスミドpHY-S237を用い、プロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,1979,vol.168,p.111)によって各菌株に導入した。
製造例3にて得られた形質転換体を5mLのLB培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、15ppmテトラサイクリン)で一夜30℃で振盪培養を行った。この培養液0.4mLをそれぞれ2×L−マルトース培地(2質量%トリプトン、1質量%酵母エキス、1質量%NaCl、7.5質量%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物)20mLに接種し、30℃にて3日間振盪培養を行った(N=3)。
Claims (10)
- recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌(Bacillus subtilis)を用いてセルラーゼを生産する、セルラーゼの生産方法。
- 前記recA遺伝子が下記(a)〜(c)のいずれか1つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項1記載のセルラーゼの生産方法。
(a)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号10のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
(c)配列番号10のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質 - 前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項1又は2記載のセルラーゼの生産方法。
- 前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させる、請求項1〜3のいずれか1項記載のセルラーゼの生産方法。
- 枯草菌(Bacillus subtilis)のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてセルラーゼの生産性を向上させる、セルラーゼの生産性向上方法。
- 前記recA遺伝子が下記(a)〜(c)のいずれか1つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項5記載のセルラーゼの生産性向上方法。
(a)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号10のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
(c)配列番号10のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質 - 前記枯草菌が、セルラーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項5又は6記載のセルラーゼの生産性向上方法。
- 前記枯草菌に異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入されており、前記枯草菌に異種セルラーゼを生産させる、請求項5〜7のいずれか1項記載のセルラーゼの生産性向上方法。
- 枯草菌(Bacillus subtilis)のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、且つ異種セルラーゼをコードする遺伝子が導入された、異種セルラーゼ生産用組換え微生物。
- 前記recA遺伝子が下記(a)〜(c)のいずれか1つのタンパク質をコードする遺伝子である、請求項11記載の微生物。
(a)配列番号10のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号10のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
(c)配列番号10のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
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