JP5140285B2 - 組換え微生物 - Google Patents

Description

本発明は、セルラーゼの生産に用いる組換え微生物、及びこれを用いたセルラーゼの製造方法に関する。

セルロースは植物細胞壁の主成分であり、衣料、紙、建築材料などに有効利用されるバイオマスの代表的存在である。またバイオマスの有効的な利用方法としてセルロースを分解する酵素を用い糖類や更にエネルギー物質に変換しようとする試みが以前から行われている。また、掘越によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以来（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）、困難とされていたセルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となり、好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（例えば、特許文献２〜４参照）が衣料用洗剤へ配合されるに至っている。

近年、遺伝子工学の発展に伴い、微生物による有用物質の工業的生産が広く行われるようになり、洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになってきている。こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。その為の手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えに適した宿主微生物の開発が進められている。

一方、枯草菌をはじめとするBacillus属細菌やそれらを含むグラム陽性菌、更には大腸菌等のグラム陰性菌において、細胞内で合成されたタンパク質（未成熟な分泌タンパク質）の細胞外への輸送は、主としてSec経路と呼ばれる輸送システムを経由して行われる。枯草菌におけるSec経路は、分泌タンパク質を細胞外へ押し出すモーターの役割を担うSecA、また分泌タンパク質が通過する輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの３つのタンパク質のほか、輸送チャネルの補助因子であるSecDF等によって、その機能が担われている。

このうち、SecGタンパク質をコードするsecG遺伝子を過剰発現し得る発現ベクター（特許文献５）や、secG遺伝子のリボソーム結合部位を改変することによりsecG遺伝子の発現を変化させたグラム陽性菌（特許文献６）に関する報告がなされており、secG遺伝子を破壊した枯草菌の生育が、異種タンパク質生産時に阻害されること等が示されている。また大腸菌において、secY遺伝子の変異が低温での生育やタンパク質の分泌を阻害することが報告されている（非特許文献２）。

しかしながら、secG遺伝子やsecY遺伝子の生菌内での過剰発現による目的タンパク質の分泌生産性向上を示すデータはこれまでに報告されておらず、またその他のSec経路に関わる遺伝子の過剰発現についても、目的タンパク質の分泌生産に如何なる影響を与えるかについては、これまでのところ充分な知見は得られていない。
特公昭５０−２８５１５号公報 特公昭６０−２３１５８号公報 特公平６−０３０５７８号公報 米国特許第４９４５０５３号明細書 特表２００１−５１００４６号公報 米国特許出願公開第２００３／０１５７６４２号明細書 Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin (1982） Cell, 32, :789 (1983)

本発明は、セルラーゼの生産性が向上しセルラーゼの工業的生産に有用な微生物、及び当該微生物を利用したセルラーゼの製造方法を提供することに関する。

本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、枯草菌の分泌装置の主要構成因子をコードするsecY遺伝子を過剰発現した微生物が、セルラーゼの生産性向上に特に有用であることを見出した。

すなわち、本発明は、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築された微生物に、セルラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物に係るものである。

また本発明は、当該組換え微生物を用いたセルラーゼの製造方法に係るものである。

本発明の組換え微生物は、セルラーゼの生産に特に有用なものであり、これを用いることによりセルラーゼの生産性向上を図ることができる。

本発明において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。

本発明において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。

本発明において、アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。

本発明の微生物を構築するための親微生物としては、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。

本発明の枯草菌のsecY遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌のsecY遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌のsecY遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各secY遺伝子、及びSecYタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。尚、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）の様に当該遺伝子が２種類同定されているものもある。また枯草菌のsecY遺伝子に相当する遺伝子としては以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられる。
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor LaboratoryPress］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
なお、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、secY遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能を有し、分泌タンパク質が通過する輸送チャネルの主要部分を構成することのできるタンパク質をいう。

枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現させる手段としては、例えば微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子の上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入することが挙げられる。

ここで、微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主となる微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位であれば特に限定されないが、例えば、枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましく、特に枯草菌spoVG遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましい。

枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としては、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）により、遺伝子番号BG101126として開示されたspoVG遺伝子の転写を制御する領域が挙げられる。より具体的には、配列番号７の塩基番号38〜210で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAが挙げられる。また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、配列番号７の塩基番号38〜230で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAが挙げられる。

配列番号７の塩基番号38〜210で示される塩基配列や塩基番号38〜230で示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、（Ａ）配列番号７の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる塩基配列、（Ｂ）配列番号７の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列等が挙げられる。
尚、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、上記したものと同様の条件が挙げられる。

また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するとは、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流に導入した際に、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現され、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上し、しかも、その向上の程度が、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流に導入した時と同等に向上するものをいう。

当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流への導入には、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。

当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、斯かる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片の上流にsecY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にsecY遺伝子を含むオペロンの先頭の遺伝子であるrpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、rpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのsecY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域、及びrpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のsecY遺伝子を含むオペロンの上流へ導入された当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55,135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。

また、当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域と当該転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。或いは、かかる転写開始制御領域の上流に、secY遺伝子の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流にsecY遺伝子の一部又は全部を含むDNA断片を結合させたDNA断片を調製して用いることにより、当該転写開始制御領域がsecY遺伝子の直上流に導入された状態で安定に保持されることとなる。

本発明において、微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、secY遺伝子を含むオペロンの先頭の遺伝子であるrpsJ遺伝子の開始コドンの上流側、或いはsecY遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。

本発明における当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の導入は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得た当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing byoverlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結して得た遺伝子断片を用いて行うことができる。かかる断片は、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。

導入するsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列は、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列である限り、その微生物が本来有するsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列と一致しないものであってもよい。また導入する枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位等、微生物において機能する転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列は、当該塩基配列である限り、その微生物が本来有する塩基配列と一致しないものであってもよい。核酸断片の宿主への導入方法としては、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
またかかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができる。尚、後記実施例に示す様に、かかる断片は1菌体当たり１コピーの導入で目的タンパク質又はポリペプチドの生産に対し充分な効果を発揮することから、プラスミドによって導入した場合、生産培養中に一部のプラスミドが脱落しても、その影響を受け難い。

なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。

本発明においては、セルラーゼの生産性の向上に影響を与えない範囲で、上記枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現することに加え、枯草菌のSec経路に関する他の遺伝子、例えばsecE遺伝子等の過剰発現を行ってもよいし、Sec経路以外の機能に関与する遺伝子の過剰発現、或いは１又は２以上の遺伝子の不活性化や欠失を併せて行っても良い。尚、遺伝子の不活性化や欠失には当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。

以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いたspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による宿主のゲノム上への導入方法について説明するが、本発明に於ける導入方法は下記に限定されるものではない。
本方法で用いる導入用DNA断片は、宿主のゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（２））の間に、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、secY遺伝子断片（以下、断片（４））、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を順に挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に断片（５）の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加された断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加された断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じるので、PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。

ここで行うPCR反応は、表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子の他には、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。

本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的とするセルラーゼをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。尚、ここで、セルラーゼをコードする遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物が本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。

本発明におけるセルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号４のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号６のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。

本発明の微生物に導入されるべきセルラーゼの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的セルラーゼ遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域がセルラーゼの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号３で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、又は配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、セルラーゼの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。

このような目的とするセルラーゼをコードする遺伝子の導入は、例えば、（１）ベクターによる導入、（２）ゲノムへの挿入により行うことができる。（１）ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域」が適正な形で結合されている目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的とする遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、YAC,BACなどの人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、pUB110、pHY300PLKが挙げられる。

また、（２）ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、セルラーゼをコードする遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したDNA断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。

かくして作製された微生物は、セルラーゼの生産に特に有用であり、目的セルラーゼの生産性が高いものである。

本発明の組換え微生物を用いたセルラーゼの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。

以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。

また、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。

枯草菌の形質転換は以下の様に行った。
すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。

実施例１ secY遺伝子過剰発現株の構築
以下の様に、secY遺伝子を過剰発現する変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-R、及びsecY/PVG-FとsecY/Cm-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びsecY遺伝子を含む1.3kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型として、表１に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子を含む0.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とcatr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がsecY遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にsecY遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にCm耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Cm2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5'側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.2kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.2kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とsecY/Cm-R、及びsecY/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.5kb及び3.1kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をsecY-K株と命名した。

実施例２ アルカリセルラーゼ分泌生産評価
実施例１にて得られたsecY-K株、及び対照として枯草菌168株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）断片（3.1 kb）を表１に示した237UB1と237DB1のプライマーセットを用いて増幅した後BamHI制限酵素処理し、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの２×Ｌ−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。

アルカリセルラーゼ活性測定の結果、表２に示した様に、宿主としてsecY-K株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。これはsecY-K株にてsecY遺伝子の発現が野生株より高まり、分泌装置であるSecYタンパク質量が増加したことにより、セルラーゼの分泌効率が向上した結果によるものと推測された。

比較例１ 他のsec遺伝子過剰発現株の構築−１
secY遺伝子と共にsecE遺伝子を過剰発現する菌株の構築を以下の様に行った（図３参照）。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したsecE/Y-F2とsecE/Ne-R、secY/PVG-FとsecY/Cm-R、及びamyE/Nm-FとamyErv2のプライマーセットを用いて、secE遺伝子及びそのリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ｈ）、secY遺伝子を含む1.3kb断片（Ｉ）、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｊ）をPCRにより増幅した。また表１に示したrneofとrepUr-Nmとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110（Plasmid 15, 93 (1986)）を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片と、表１に示したNmUf-repとNmrとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したネオマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子領域を含む0.8kb断片とを混合して鋳型とし、表１に示したプライマーrneofとNmrのプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって1.2kbのネオマイシン耐性カセット断片（Ｋ）を調製した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）（Ｊ）（Ｋ）の4断片を混合して鋳型とし、表１に示したsecY-F2とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、4断片を（Ｉ）（Ｈ）（Ｋ）（Ｊ）の順になる様に結合させ、secY遺伝子の下流にリボソーム結合部位を伴うsecE遺伝子が連結し、更にその下流にネオマイシン耐性カセットとamyE遺伝子の3'側領域が連結した総塩基長3.7kbのDNA断片（Ｌ）を得た。得られた3.7kbのDNA断片（Ｌ）を用いてコンピテントセル法により実施例１にて構築したsecY-K株を形質転換し、ネオマイシン（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とsecE/Ne-R、及びsecE/Y-F2とamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.6kb及び2.4kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結し、更にその下流にsecE遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。尚、secY遺伝子とsecE遺伝子との間に転写終結部位は存在せず、secE遺伝子はsecY遺伝子と同一転写単位として、spoVG遺伝子転写開始制御領域の機能により転写されるものと考えられた。この様にして得られた菌株をsecYE-K株と命名した。また実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecG遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたsecG-K株を作成した。secG-K株の構築には表１に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとsecY-K株の構築に用いたプライマーとの対応を表３に示した。

比較例２ アルカリセルラーゼ分泌生産評価
比較例１にて構築した菌株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したsecY-K株についても評価を行った。

その結果、表４に示した様に、secG遺伝子を過剰発現するsecG-K株のセルラーゼ生産性は野生株168株よりは若干高いものの、secY-K株の生産性には及ばなかった。またsecY遺伝子と同時にsecE遺伝子を過剰発現するsecYE-K株のセルラーゼ生産性はsecY-K株と同等であり、secE遺伝子を過剰発現することの効果は認められなかった。すなわち、分泌タンパク質の輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの3つのタンパク質のうち、特にSecYタンパク質を増加させることが、セルラーゼの分泌効率の向上には有効であることが明らかとなった。

比較例３ アルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例１にて構築したsecY-K株、及び比較例１にて構築したsecG-K菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、K38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., 67, 1744, (2001)）をコードする1.5kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、S237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られた2断片を混合して鋳型とし、S237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片を得た。得られた2.1kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
構築したプラスミドpHYK38(S237ps)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。対照として枯草菌168株についてもプラスミドを導入した。これによって得られた組換え菌株を、上記実施例２と同様の条件にて５日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。

その結果表５に示した様に、secG遺伝子を過剰発現したsecG-K株のアミラーゼ生産性は野生株168株より若干低い程度であったが、secY-K株のアミラーゼ生産性は野生株と比較して著しく低下していた。即ち、SecYタンパク質の増加はアミラーゼ生産性に対してはむしろ悪影響を及ぼすことが明らかとなり、secY遺伝子の過剰発現は、セルラーゼに対して特にその生産性向上に寄与することが示唆された。
本発明に関連のある遺伝子について、遺伝子番号、及び機能を表６に示した。

なお、これら各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997）、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。

比較例４ 他のsec遺伝子発現強化株の構築−２
secY遺伝子と共にsecG遺伝子の発現を強化した菌株の構築を比較例１と同様に行った。すなわち、secYE-K株の構築に用いたプライマーのうち、secE/Y-F2を表７に示すsecG/Y-F2に、またsecE/Ne-Rを表７に示すsecG/Ne-Rに替えて用いることにより、secYG-K株を構築した。
また、実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecE遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたsecE-K株を作成した。secE-K株の構築にはsecY-K株の構築に用いたプライマーのうち、secY/PVG-Fを表７に示すsecE/PVG-Fに、またsecY/Cm-Rを表７に示すsecE/Cm-Rに替えて用いた。
構築した上記菌株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したsecY-K株についても評価を行った。

その結果、表８に示した様に、secY遺伝子と同時にsecG遺伝子の発現を強化したsecYG-K株のセルラーゼ生産性はsecY-K株と同等であり、secG遺伝子を発現強化することの効果は認められなかった。また表９に示した様に、secE遺伝子の発現を強化したsecE-K株のセルラーゼ生産性は野生株168株よりは若干高いものの、secY-K株の生産性には及ばなかった。すなわち、分泌タンパク質の輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの3つのタンパク質のうち、特にSecYタンパク質を増加させることが、セルラーゼの分泌効率の向上には有効であることが明らかとなった。

比較例５ アルカリプロテアーゼ分泌生産評価
実施例１にて構築したsecY-K株のアルカリプロテアーゼ生産性評価を以下の様に行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。即ち、バチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995)）をコードする1.3kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域を含む0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られた2断片を混合して鋳型とし、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した1.8 kbのDNA断片を得た。得られた1.8 kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP(S237p)を構築した。

構築したプラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの２×Ｌ−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。培養上清中のプロテアーゼの活性測定は以下のとおり行った。すなわち、2mM 塩化カルシウム溶液で適宜希釈した培養上清50μlに、7.5mMのSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA；ペプチド研究所)を基質として含む75mM ほう酸-KCl緩衝液（pH10.5）を100μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロアニリンを遊離させる酵素量を1Uとした。

その結果、表１１に示すように、宿主としてsecY-K株を用いた場合、そのアルカリプロテアーゼ生産性は対照の168株（野生型）と同等であり、特に生産性向上は認められなかった。即ち、SecYタンパク質の増加はプロテアーゼ生産性に対して影響を与えず、比較例３の結果と合わせ、secY遺伝子の過剰発現は、セルラーゼ生産性向上に対して特異的に寄与するものであることが示唆された。

SOE-PCR法により調製した結合核酸断片を用いた遺伝子導入を模式的に示したものである。 spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結したsecY遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。 amyE遺伝子部位に導入したsecY遺伝子と共にsecE遺伝子が転写される様、secY遺伝子の下流にsecE遺伝子が連結した遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。

Claims (10)

1. 枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築された微生物に、セルラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
2. 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子の上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入することにより、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現させる請求項１記載の組換え微生物。
3. 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、枯草菌のspoVG遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位である請求項２記載の組換え微生物。
4. 微生物がバチルス属（Bacillus）細菌である請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
5. バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項４記載の組換え微生物。
6. セルラーゼをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合した請求項１〜５のいずれか１項記載の組換え微生物。
7. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項６記載の組換え微生物。
8. 分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである請求項６又は７記載の組換え微生物。
9. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号５で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと９０%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項６〜８のいずれか１項記載の組換え微生物。
10. 請求項１〜９のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるセルラーゼの製造方法。