JP5361428B2 - 枯草菌変異株 - Google Patents
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Description
1)枯草菌変異株MGB874株に対して、rocRを導入せず且つrocD、rocE及びrocFから選ばれる1以上の枯草菌遺伝子を導入するか、又はrocD及びrocRを導入した枯草菌変異株。
2)上記1)の枯草菌変異株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌。
3)異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる1以上の領域を結合した上記1)又は2)の組換え枯草菌。
4)転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域を結合した上記3)の組換え枯草菌。
5)分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ0.6〜1kbの上流領域由来のものである上記3)又は4)の組換え枯草菌。
6)転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である上記4)の組換え枯草菌。
7)2)〜6)のいずれかの組換え枯草菌を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
rocD遺伝子は、ornithine aminotransferase、rocE 遺伝子は、arginine permease、rocF 遺伝子は、arginaseと推定されている[J. Mol. Biol. 249, 843(1995)]。
斯かる遺伝子は、枯草菌MGB874株の作製において削除されたpdp-rocR領域に属するものであり、従って、本発明の枯草菌変異株は、枯草菌MGB874株の作製において削除された遺伝子のうちrocRを復帰させることなく、少なくともrocD、rocE、及びrocFから選ばれる1以上の遺伝子を復帰させた株、又はrocD及びrocRを復帰させた株と言える。
rocD、rocE、及びrocFの各遺伝子は、1種又はそれ以上を適宜組み合わせて導入すればよく、3遺伝子を全て導入してもよく、rocD及びrocRを復帰させる場合は2遺伝子を導入する。さらに、rocRを復帰させることなく少なくともrocD、rocE、及びrocFから選ばれる1以上の遺伝子を復帰させる場合において、異種タンパク質又はポリペプチドの生産性を抑制しない他の遺伝子を導入してもよい。
例えば、rocD、rocE、及びrocFから選ばれる1以上の遺伝子を含むゲノムDNAを供与体DNAとして利用する場合、アルギニン分解系の遺伝子rocF、rocE、rocD、rocRを含むpdp-rocR領域を有する枯草菌菌株例えばMGB625株のゲノムDNAを利用して、枯草菌MGB874株ゲノムにrocF、rocE、rocD、rocRを含むpdp-rocR領域全体を復帰させることもできる。MGB625株は、枯草菌168株を元に、表1に示された領域の一部であるprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域、yeeK-yesX領域を削除して構築された株である(前記特許文献9参照)。
あるいは、MGB625株からpdp-rocR領域の一部を削除した菌株のゲノムDNAを供与体DNAとして、pdp-rocR領域のうちrocF、rocE、rocD、rocRの一部を含む領域のみを復帰させることもできる。
以下に、rocF、rocE、rocD、rocRの一部を含む領域のみを枯草菌MGB874株ゲノムに復帰させるために用いる供与体DNAを、MGB625株を利用して構築する例を説明する。
ただし、利用する枯草菌株は特にMGB625株に限定するものではなく、rocRを含まず且つrocF、rocE、rocD遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子を含むか、又はrocD及びrocRを含む枯草菌であればよい。また、rocRのみを復帰させる実験は比較のために行う。
例えば、薬剤耐性遺伝子マーカーとしてクロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、後記表2に示す“pdpfw2”と“pdprv/Cm”のプライマーセットを用いて、ゲノム上の当該遺伝子の上流に隣接する断片(A)を調製する。また、“削除領域下流に隣接する遺伝子名fw/Cm”と“削除領域下流に隣接する遺伝子名rv2”のプライマーセットを用いて、下流に隣接する断片(B)をそれぞれ調製する。
スミドpCBB31を鋳型とし、表2に示したCmFとCmRプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む1kb断片(C)を調製する。
次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表2のプライマー“pdpfw1”と“削除領域下流に隣接する遺伝子名rv1”を用いたSOE−PCRを行うことによって、3断片を(A)(C)(B)の順になる様に結合させたDNA断片を得る(図1参照)。
すなわち、(B)がプライマー番号14と6のプラマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、5を用いてSOE−PCRを行い、(B)がプライマー番号15と8のプライマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、7を用いてSOE−PCRを行い、(B)がプライマー番号16と10のプライマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、9を用いてSOE−PCRを行い、(B)がプライマー番号17と12のプライマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、11を用いてSOE−PCRを行う。
これらのDNA断片のそれぞれを用いてコンピテントセル法[J.Bacteriol.,81,741(1960)]により枯草菌MGB625株の形質転換を行う。すなわち、枯草菌をSPI培地(0.20 % 硫酸アンモニウム、1.40 % リン酸水素二カリウム、0.60 % リン酸二水素カリウム、0.10 % クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50 % グルコース、0.02 % カザミノ酸(Difco)、5 mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン)において37℃で、生育度(OD 600)の値が1程度になるまで振盪培養する。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地(0.20 % 硫酸アンモニウム、1.40 % リン酸水素二カリウム、0.60 % リン酸二水素カリウム、0.10 % クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50 % グルコース、0.01 % カザミノ酸(Difco)、5 mM 硫酸マグネシウム、0.4 0μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン)に接種し、更に生育度(OD 600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌のコンピテントセルを調製する。次いで調製したコンピテントセル懸濁液(SPII培地における培養液)100μLに上記DNA断片を含む溶液(上記SOE−PCRの反応液)5μLを添加し、37℃で1時間振盪培養後、クロラムフェニコール含むLB寒天培地(1 % トリプトン、0.5 % 酵母エキス、1 % NaCl、1.5 % 寒天) に全量を塗沫する。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離する。
形質転換体のゲノムDNAを抽出し、これを鋳型DNAとしたPCRにより、目的の領域削除が行われていることを確認することができる。ゲノムDNAの抽出は、斉藤と三浦(Saito & Miura)の方法[Saito & Miura Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)
]、あるいは、市販のゲノムDNA抽出キット、例えば、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories, Inc.)を用いて行うことができる。
更に、MGB874+rocDEFR株、MGB874+rocEFR株MGB874+rocDR株から以下の方法によりネオマイシン耐性遺伝子をマーカー遺伝子としてrocRを削除することで、MGB874株に対して、rocF-rocE-rocDが復帰した株、rocE-rocDが復帰した株、rocDが復帰した株を構築する。
一方、プラスミドpBEST501[Nucleic Acids Res. 17、4410(1989)]のネオマイシン耐性遺伝子を鋳型とし、表2に示したneofとneorプライマーセットを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含む1.3kb断片(C)を調製する。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表のプライマーrocRFW2とrocR-RV2を用いたSOE−PCRを行うことによって、3断片を(A)(C)(B)の順になる様に結合させたDNA断片を得る(図1参照)。
このDNA断片を用いてコンピテントセル法によりMGB874+rocDEFR株、MGB874+rocEFR株、MGB874+rocDR株の形質転換を行い、得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってrocR遺伝子が欠失され、ネオマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認する。斯くして、rocF-rocE-rocDが復帰した株(以降、MGB874+rocDEF株)、rocE-rocDが復帰した株(以降、MGB874+rocDE株)、rocDが復帰した株(以降、MGB874+rocD株)を取得することができる。
目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は特に限定されず、洗浄剤用、食品用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。
中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ、又は、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-64株(FERM BP-2886)由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号2又は配列番号4で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。
また、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、1乃至10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、また、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
まず、MGB874株にrocF、rocE、rocD、rocRを復帰させるために利用する菌株を、MGB625株のゲノム構造を改変して構築した。すなわち、MGB625株から、以下に示す方法によりクロラムフェニコール耐性遺伝子をマーカー遺伝子としてpdp-rocR領域の一部にあたるpdp-phrG領域を削除して、rocF-rocE-rocD-rocRがゲノム上に残存する菌株を構築した。同様にpdp- rocF領域を削除してrocE-rocD-rocRがゲノム上に残存する菌株、pdp-rocE領域を削除してrocD-rocRがゲノム上に残存する菌株、pdp-rocF領域を削除してrocRがゲノム上に残存する菌株を構築した。
領域削除の方法としては、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示した“pdpfw2”と“pdprv/Cm” のプライマーセットを用いて、ゲノム上の当該遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(A)をPCRにより調製した。
ラスミドpCBB31を鋳型とし、表2に示したCmFとCmRプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む1kb断片(C)をPCRにより調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表2のプライマー“pdpfw1”と“削除領域下流に隣接する遺伝子名rv1”を用いたSOE−PCRを行うことによって、3断片を(A)(C)(B)の順になる様に結合させ、3.0kbのDNA断片を得た(図1参照)。すなわち、(B)がプライマー番号14と6のプラマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、5を用いてSOE−PCRを行い、(B)がプライマー番号15と8のプライマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、7を用いてSOE−PCRを行い、(B)がプライマー番号16と10のプライマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、9を用いてSOE−PCRを行い、(B)がプライマー番号17と12のプライマーセット由来断片の場合はプライマー番号2、11を用いてSOE−PCRを行った。
市販のゲノムDNA抽出キット、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories,Inc.)を用いて形質転換体のゲノムDNAを抽出し、これを鋳型DNAとしたPCRにより、目的の領域がクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。
各ゲノムDNAを用いてコンピテントセル法によりMGB874株を形質転換した。クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた各形質転換体のゲノムを抽出し、ゲノム上のpdp-rocR領域が削除された位置に、クロラムフェニコール耐性遺伝子とrocF-rocE-rocD-rocRが挿入していること、又は、クロラムフェニコール耐性遺伝子とrocE-rocD-rocRが挿入していること、又は、クロラムフェニコール耐性遺伝子とrocD-rocRが挿入していること、、又は、クロラムフェニコール耐性遺伝子とrocRが挿入していることをPCRにより確認した。
更に、MGB874+rocDEFR株、MGB874+rocEFR株MGB874+rocDR株から以下の方法によりネオマイシン耐性遺伝子をマーカー遺伝子としてrocRを削除することで、MGB874株に対して、rocF-rocE-rocDが復帰した株、rocE-rocDが復帰した株、rocDが復帰した株を構築した。
アルカリセルラーゼ分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)断片(3.1 kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L−マルトース培地(2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃にて3日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
Claims (7)
- 枯草菌変異株MGB874株に対して、rocRを導入せず且つ1)rocD、2)rocD及びrocE、並びに3)rocD、rocE及びrocFから選ばれる枯草菌遺伝子を導入するか、又は枯草菌遺伝子rocD及びrocRを導入した枯草菌変異株。
- 請求項1記載の枯草菌変異株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌。
- 異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる1以上の領域を結合した請求項2記載の組換え枯草菌。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域を結合した請求項3記載の組換え枯草菌。
- 分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ0.6〜1kbの上流領域由来のものである請求項3又は4記載の組換え枯草菌。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項4記載の組換え枯草菌。
- 請求項2〜6のいずれか1項記載の組換え枯草菌を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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