JP4842749B2 - 組換え微生物 - Google Patents
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Description
しかしながら、prsA遺伝子を過剰発現しており、且つ、斯かるアミノ酸代謝に関与する遺伝子を改変した微生物はこれまで知られておらず、特にその様な微生物がprsA遺伝子を過剰発現している微生物に比べ、有用なタンパク質又はポリペプチドの優れた生産性を示すことは予想すらされていない。
Nature,390,249,1997 Science,277,1453,1997 Mol. Microbiology, 8,:727 (1993) Mol. Gene. Genet., 209:335 (1987) J. Bacteriol., 175:2501 (1993) J. Bacteriol., 171:4718 (1989)
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開(http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
なお、ここで、配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
なお、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、prsA遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能を有し、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有すると考えられるタンパク質をいう。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。
ここで用いる導入用DNA断片は、親微生物ゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片(以下、断片(1))と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片(以下、断片(2))の間に、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片(以下、断片(3))、prsA遺伝子断片(以下、断片(4))、及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片(以下、断片(5))を挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片(1)〜断片(5)の5断片を調製する。
この際、例えば、断片(1)の下流末端に断片(3)の上流側10〜30塩基対配列、断片(4)の上流末端に断片(3)の下流側10〜30塩基対配列、断片(4)の下流末端に断片(5)の上流側10〜30塩基対配列、更に断片(2)の上流側に断片(5)の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる(図1)。
また、gltA遺伝子、gltB遺伝子若しくはgltC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化は、グルタミン酸合成(L-グルタミンと2-オキソグルタル酸からのグルタミン酸合成)を中心とするアミノ酸代謝に変化を引き起こす改変である。すなわち、gltC遺伝子は、gltABオペロンの発現を正に制御する転写制御因子(LysRファミリー)をコードしているが、当該遺伝子の不活性化や欠失はgltABオペロンの発現抑制をもたらすことにより当該アミノ酸代謝に変化を引き起こし、またgltA遺伝子、gltB遺伝子の不活性化や欠失もそれと同様の変化を引き起こすと考えられる。
本発明に関連する各遺伝子の遺伝子番号、遺伝子機能は、表6に示した。
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5'側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3'側に続く領域を示す。
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った(図2参照)。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片(A)、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片(B)をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4(Microbiology. 144, 3097 (1998))を鋳型として、表1に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン(Em)耐性遺伝子を含む1.3kb断片(C)をPCRにより増幅した。次いで、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(A)(B)(C)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し(spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結)、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片(D)を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Em2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5'側領域を含む1.0kb断片(E)、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片(F)をPCRにより増幅した。次いで、得られた(E)(F)(D)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(E)(D)(F)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片(G)を得た。得られた4.3kbのDNA断片(G)を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン(1μg/mL)とリンコマイシン(25μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示すamyEfw2とprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.4kb及び3.3kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Ka株と命名した。
実施例1にて得られたprsA-Ka株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ(特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001)をコードする配列番号3で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片(H)を増幅した。またバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表1に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片(I)を増幅した。次いで、得られた(H)(I)の2断片を混合して鋳型とし、表1に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片(J)を得た。得られた2.2kbのDNA断片(J)をシャトルベクターpHY300PLK(ヤクルト)のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
図3に基づいて、ゲノム中ansR遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。尚、ansR遺伝子はL-アスパラギン酸−L-アスパラギンを中心としたアミノ酸代謝に関与するansABオペロン(ansA遺伝子とansB遺伝子から成る)の発現を負に制御する転写制御因子をコードする遺伝子である(J. Bacteriol., 175:2501 (1993))。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したansR-FW及びansR/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のansR遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片(A)をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、ansR/Cm-F及びansR-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のansR遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片(B)をPCRにより増幅した。
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表1に示したcatf及びcatrのプライマーセットを用いて、0.85kbのクロラムフェニコール(Cm)耐性遺伝子領域(C)をPCRにより調製した。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片(D)を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール(10μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってansR遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、ansR遺伝子欠失株(ΔansR株)を構築した。また上記形質転換における168株に替えて実施例1にて構築したprsA-Ka株を用いることにより、prsA-Ka株ゲノム中のansR遺伝子をCm耐性遺伝子にて置換した菌株(prsAKΔansR株)を構築した。
実施例3に示したansR遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のgltC遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子による置換を行い、gltC遺伝子欠失株(ΔgltC株)を構築した。各菌株の構築には表3に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔansR株の構築に用いたプライマーとの対応を表4に示した。尚、gltC遺伝子はグルタミン酸合成に関与するgltABオペロン(gltA遺伝子とgltB遺伝子から成る)の正に制御する転写制御因子をコードする遺伝子である(J. Bacteriol., 171:4718 (1989))。ansR遺伝子とgltC遺伝子、及びそれぞれが制御する遺伝子の機能は表6に示すとおりである。
実施例3及び4にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例2と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例1にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。図4に示した様に、prsAKΔansR株、prsAKΔgltC株においてprsA-Ka株より高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、それぞれの株のprsA-Ka株に対する生産量の増加(図4の斜線部分に相当)は、ΔansR株、ΔgltC株各々で示された枯草菌168株に対する生産量増加(図4の黒塗りで示す部分に相当)より顕著であった。即ち、prsAKΔansR株、prsAKΔgltC株では、prsA遺伝子発現強化と各々の遺伝子欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。
枯草菌168株ゲノム上のpurR遺伝子を、実施例3に示したansR遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、クロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換してΔpurR株を構築した。使用したプライマーを表1に示し、それぞれのプライマーとΔansR株の構築に用いたプライマーとの対応を表4に示した。また実施例1にて構築したprsA-Ka株のゲノム上のpurR遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔpurR株を構築した。尚、purR遺伝子は枯草菌プリン(ヌクレオチド)代謝に関与するpurオペロン(purE、purK、purB、purC、purS、purQ、purL、purF、purM、purN、purH、purD)及びpurA遺伝子の発現を抑制する負の転写制御因子をコード遺伝子である(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 92:7455 (1995))。
比較例1にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例2と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例1にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。表5に示した様に、ΔpurR株において野生株168株以上の生産性が認められているにも関わらず、prsA-Ka株に対してpurR遺伝子欠失を行った効果は認められなかった。即ち、prsA遺伝子発現強化とpurR遺伝子欠失(プリン代謝の変化)との組合せでは、prsA遺伝子発現強化とアミノ酸代謝の変化をもたらす遺伝子欠失との組合せで認められた様な酵素生産性に対する相乗効果は認められないことが確認された。
バチルス セレウス(Bacillus cereus)由来のprsA遺伝子(配列番号47)は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例1の方法と同様の方法にて、バチルス セレウス(Bacillus cereus)由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。すなわち、バチルス セレウス(Bacillus cereus)から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表7に示したBce/PVG-FとBce/emf2-Rのプライマーセットを用いてバチルス セレウス(Bacillus cereus)由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片(A)をPCRにより増幅した。また上記比較例にて構築したprsA-Ka株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したamyEfw2とPVG-R、及びemf2とamyErv2のプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む領域が連結した1.2kb断片(B)、及びエリスロマシン耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3'側領域が連結した2.3kb断片(C)をPCRにより増幅した。次いで、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表1に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を(B)(A)(C)の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にバチルス セレウス(Bacillus cereus)由来prsA遺伝子が連結し、更にその下流にエリスロマイシン耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片(D)を得た。得られた4.3kbDNA断片(D)を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsAbc-K株を構築した。
次いで、実施例3および4と同様の方法にて、prsAbc-K株のゲノム上よりansR遺伝子、或いはgltC遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換したprsAbcKΔansR株、及びprsAbcKΔgltC株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株、prsAbcKΔansR株、及びprsAbcKΔgltC株について、実施例2と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株、ΔansR株、及びΔgltC株についても評価を行った。その結果、図5に示すようにprsAbc-K株にて168株を大きく上回る分泌生産が認められた。更にprsAbc-K株よりansR遺伝子、或いはgltC遺伝子を欠失した菌株においては一層顕著な生産性向上が認められ、実施例5で見られたのと同様、バチルス セレウス(Bacillus cereus)由来のprsA遺伝子発現強化と各遺伝子欠失との組み合わせがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。すなわち、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子を用いれば、枯草菌prsA遺伝子を用いた場合と同様の有効性が得られることが確認された。
Claims (9)
- 枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片をゲノム上に導入し、且つ枯草菌ansR遺伝子、gltA遺伝子、gltB遺伝子、gltC遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる1以上の遺伝子を欠失又は不活性化してなる微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子と、当該遺伝子の上流に結合された転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域とを導入した組換え微生物であって、当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に結合された転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域のうち、分泌シグナル領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである、組換え微生物。
- 転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、枯草菌のspoVG遺伝子の上流に位置するものである請求項1記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域が配列番号9の塩基番号38〜210の塩基配列からなる領域であり、転写開始制御領域とリボソーム結合部位が配列番号9の塩基番号38〜230の塩基配列からなる領域である、請求項2記載の組換え微生物。
- 微生物がバチルス属(Bacillus)細菌である請求項1〜3のいずれか1項記載の組換え微生物。
- バチルス(Bacillus)属細菌が枯草菌(Bacillus subtilis)である請求項4記載の組換え微生物。
- ansR遺伝子、gltA遺伝子、gltB遺伝子又はgltC遺伝子に相当する遺伝子が、当該遺伝子と実質的に同じ機能を有し、且つ塩基配列において90%以上の同一性を有するバチルス属細菌由来の遺伝子である請求項1〜5のいずれか1項記載の組換え微生物。
- prsA遺伝子に相当する遺伝子が、以下(1)〜(4)から選択される遺伝子である請求項1〜6のいずれか1項記載の組換え微生物。
(1)配列番号1で示される塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
(2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
(3)配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
(4)配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 - 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に結合された転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号5で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号7で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項1〜7のいずれか1項記載の組換え微生物。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載の組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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