WO2022071581A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド - Google Patents

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秀和 正木
重文 熊地
涼 米原
佑太 松村
響 河野
卓人 東條
拓也 森本
和彦 片山
慧 芳賀
玲子 戸高
成史 澤田
友美 高野
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株式会社Epsilon Molecular Engineering
学校法人北里研究所
花王株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide that binds to SARS-CoV-2.
  • SARS coronavirus-2 (Severe acute respiratory syndrome 2,; SARS-CoV-2) belongs to the genus Beta coronavirus like SARS coronavirus (SARS-CoV) and MERS coronavirus (MERS-CoV), and acute respiration. It is a SARS-related coronavirus that causes organ disease. The virus that causes acute respiratory disease, which was first confirmed to occur near Wuhan City, Hubei City, China in 2019, was subsequently identified as a new type of coronavirus and named COVID-19, but it has various variations. However, it is causing a global epidemic (pandemic).
  • SARS-CoV-2 like common coronaviruses, has a large positive sense RNA genome encoding 4 structural proteins, 16 nonstructural proteins (nsp1-16), and some accessory proteins.
  • the structural protein consists of a spike protein, nucleocapsid, membrane protein, and envelope protein, and the spike protein is composed of an N-terminal S1 subunit responsible for receptor binding and a C-terminal S2 subunit responsible for membrane fusion.
  • the S1 subunit is further divided into an N-terminal domain (NTD), a receptor binding domain (RBD), subdomain 1 (SD1), and subdomain 2 (SD2).
  • NTD N-terminal domain
  • RBD receptor binding domain
  • SD1 subdomain 1
  • SD2 subdomain 2 subdomain 2
  • FP fusion peptide
  • HR1 heptadripeto 1
  • HR2 heptadripete 2
  • SARS-CoV-2 binds to the host cell receptor angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) via its spike protein and invades the cell. Binding to the receptor is triggered by a structural change in the spike protein, which changes it to an activated state. Activated spikes are cleaved by proteases (TMPRSS2 in SARS-CoV and SARS-CoV-2) at the S1 / S2 site, releasing the S1 subunit and exposing the FP on the S2 subunit. It is known that FP is inserted into the target cell membrane and HR1 and HR2 refold to form a post-fusion conformation and promote viral membrane fusion with the target cell (see Non-Patent Document 2).
  • TMPRSS2 proteases
  • SARS-CoV-2 trimer spike by low temperature electron microscope and crystal analysis and structural analysis of SARS-CoV-2 spike RBD and full-length human ACE2 have been advanced, and the binding mode to ACE2 has been advanced. Elucidation and findings of key mutations on RBD that form stronger contact with human ACE2, as well as insight into epitopes for the identification of cross-reactive antibodies targeting the RBD of SARS-CoV and SARS-CoV2. Is provided. Furthermore, from the sugar chain analysis of SARS-CoV-2 spike protein, SARS-CoV-2 spike protein has many glycosylation sites like SARS-CoV, and among them, SARS-CoV is unique. Glycosylation sites have also been reported, and it has also been reported that such specific sugar chains may promote immune avoidance through masking of epitopes (see Non-Patent Document 3).
  • the SARS-CoV-2 spike protein plays an essential role in the invasion of the virus into the host cell and is a major target for neutralizing antibodies. Due to the functionality and high immunogenicity of the coronavirus S1 subunit, most neutralizing antibodies characterized against coronavirus have been reported to target S1, especially S1-RBD. There is. Several neutralizing antibodies have also been developed during previous SARS and MERS infection epidemics, demonstrating their potential use in the treatment of coronavirus infections. However, many known neutralizing antibodies specific for SARS-CoV RBD (S230, m396, 80R, etc.) do not bind to SARS-CoV-2 even at concentrations up to 1 ⁇ M, while single B cells.
  • the virological diagnosis of COVID-19 is mainly performed by gene detection (PCR test) of SARS-CoV-2 by gene amplification method (PCR) (hereinafter referred to as "conventional technique 1").
  • PCR test gene detection
  • ventional technique 1 gene amplification method
  • One of them is an antigen test that does not detect a genetic substance of a virus but detects a fragment of a protein on the surface of the virus (hereinafter referred to as "conventional technique 2"). If the antigen can be detected, it can be diagnosed in a few minutes whether or not it is infected, without the need for expensive machines, training to master the technique required for the tester, and a great deal of labor required for the test.
  • an immunochromatography method for detecting a virus-specific antibody in serum a serological diagnostic method using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (hereinafter referred to as "conventional technique 3"), and the like are known. ..
  • Antibodies in the immune response are immunoglobulin M (hereinafter, may be abbreviated as "IgM”) that increases in the blood of the patient relatively early in the infection after the living body comes into contact with the antigen by infection, and IgG that increases thereafter.
  • IgM immunoglobulin M
  • IgG immunoglobulin G
  • a general Ig is composed of a light chain and a heavy chain, but it is known that a camelid animal produces a heavy chain antibody containing no light chain.
  • the single domain containing the variable region of a heavy chain antibody is a natural single domain and itself functions as an antibody. For this reason, it is called a “single domain antibody” (hereinafter, may be abbreviated as "VHH antibody”).
  • the three-dimensional epitope of the virus contains, for example, a hole-like structure such as an enzyme pocket or a structural portion of a split between domains, conventional IgG cannot bind to such an epitope due to its size. ..
  • the molecular weight of the above-mentioned VHH antibody is as small as 1/10 of that of the IgG antibody, it can bind to an epitope having the above-mentioned structure, and the virus particles modified with many sugar chains can be used. Since it can be bound to the surface or the like, the width of the molecule that can be the target molecule is widened.
  • VHH is also excellent in acid resistance and heat resistance, and unlike IgG, it does not need to be produced in cultured cells and can be produced in Escherichia coli, yeast, etc. Therefore, there are advantages that mass production is easy and purification is easy. Furthermore, since the VHH antibody is composed of a single-stranded peptide, it is easy to modify its function by using a technique such as protein engineering or a technique such as chemical modification, and it is easy to prepare an antibody drug complex (ADC). (Hereinafter referred to as "conventional technique 4").
  • Non-Patent Document 1 Neutralizing nanobodies bind SARS-CoV-2 spike RBD and block interaction with ACE2. Nature Structural & Molecular Biology 2020
  • Non-Patent Document 2 Development of multi-specific humanized llama antibodies blocking SARS-CoV-2 / ACE2 interaction with high affinity and avidity. Emerging Microbes & Infections 2020; 9; 1034-1036
  • Non-Patent Document 3 Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell 2020; 181: 1004-1015.
  • Non-Patent Document 4 Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2. Cell Host & Microbe 2020; 27: 891-898
  • the conventional technique 1 is a method for detecting a genetic substance of a virus, which is said to be the most accurate among the virus tests that can be used at present, and is an excellent technique in terms of high accuracy.
  • it takes time and effort to carry out the test and there is a problem that it is difficult to increase the number of PCR tests performed to the number really required.
  • the conventional technique 2 can diagnose whether or not an infection has occurred in a few minutes without the need for expensive machines, training for mastering the techniques required of the inspector, and a great deal of labor required for the inspection. In that respect, it is an excellent technology. Therefore, if a reliable antigen test method is established, the number of tests can be easily increased.
  • the prior art 3 is considered to have a long incubation period from infection to onset in many cases, and has a long clinical course, such as a rapid deterioration of symptoms after about one week from the onset, leading to severe pneumonia.
  • COVID-19 infection for which cases have been reported, it is an excellent method in that the situation can be grasped over time.
  • an antibody since an antibody is used for the test, it has the same problem as the antigen test.
  • a typical example of an antibody used for serological diagnosis is IgG, but it is purified from the serum of an animal to which the antigen has been administered, or a gene fragment encoding the nucleotide sequence of the desired IgG is incorporated into a cultured cell or the like and introduced into cultured cells. , It is a general manufacturing method to obtain by culturing. For this reason, there has been a strong social demand for molecules that function as antibodies, which do not require time and effort to purify.
  • VHH has various advantages as described above, it is difficult to obtain VHH having a high affinity with a substrate. Therefore, regarding the acquisition of VHH that has a high affinity with the substrate, is easy to produce and purify, and can correspond to a substrate (nucleotide sequence of virus) that is easily mutated, in particular, VHH that binds to SARS-CoV-2. There was a strong social demand. Further, since the IgG antibody is premised on systemic administration by intravenous administration or subcutaneous administration, there is a problem that a sufficient therapeutic effect cannot be expected as compared with local administration. On the other hand, there is also concern about the risk of antibody-dependent enhancement (ADE) due to systemic exposure.
  • ADE antibody-dependent enhancement
  • VHH-72-Fc does not show sufficient neutralizing activity by VHH alone, and Fc fusion causes the physical superiority of the single domain antibody to be lost, as well as the Fc-mediated antibody.
  • the risk of antibody-dependent enhancement (ADE) is also a concern.
  • the present invention has one or more structural domains comprising CDR3 consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 9 or an amino acid sequence in which one amino acid is replaced with another amino acid.
  • -It relates to a CoV-2 binding peptide.
  • the peptide is one selected from the group consisting of VHH antibodies, heavy chain antibodies and VHH antibody multimers.
  • the VHH antibody multimer is a multimer in which a plurality of the structural domains are linked.
  • the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 9 has a KD of 3.6 x 10 -9 M or less with respect to SARS-CoV-2.
  • the structural domain further comprises CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 10 to 18 or an amino acid sequence in which at least one amino acid is replaced with another amino acid in the amino acid sequence, and SEQ ID NO: 19. It contains CDR2 consisting of the amino acid sequence represented by ⁇ 27 or an amino acid sequence in which at least one amino acid in the amino acid sequence is replaced with another amino acid.
  • another aspect of the present invention is a nucleic acid encoding the above-mentioned peptide.
  • Another aspect of the present invention is a method for detecting SARS-CoV-2 in a sample, which comprises contacting any of the above-mentioned peptides with a test sample.
  • Another aspect of the present invention is a SARS-CoV-2 detection kit containing any of the peptides described above.
  • another aspect of the present invention is a medicine containing any of the above-mentioned peptides.
  • another aspect of the present invention is the use of any of the peptides described above for producing a pharmaceutical.
  • another aspect of the present invention is any of the peptides described above for use as a pharmaceutical.
  • another aspect of the present invention is a method for preventing or treating a SARS-CoV-2 infection, which is administered to a subject in need of any of the above-mentioned peptides.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in the number of CDR3 clusters of anti-SARS-CoV-2 antibody candidates that appeared after each round of selection.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of ELISA evaluation of the binding properties of VHH clones selected by selection.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding characteristics of VHH clones by the biolayer interferometry.
  • FIG. 4 is a sensorgram of competitive inhibition between the obtained VHH clones.
  • FIG. 5 is a graph showing the infection inhibition rate of SARS-CoV-2 in VHH clones.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding activity to the SARS-CoV-2 mutant strain.
  • FIG. 7 is a graph showing the binding activity of VHH-COVE6 to the SARS-CoV-2 mutant strain.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding activity to the SARS-CoV-2 UK / Nigeria mutant strain.
  • FIG. 9 is a graph showing the binding activity to the SARS-CoV-2 California mutant and the Indian mutant.
  • FIG. 10 is a graph showing competitive inhibition of each VHH clone against the binding of RBD and ACE2.
  • FIG. 11 is SDS-PAGE showing the binding activity of VHH-COVE3 to RBD derived from an Indian mutant strain.
  • FIG. 12 is a graph showing the neutralizing activity of VHH-COVE3 against SARS-CoV-2 alpha type and delta type mutant strains.
  • FIG. 13 is a graph showing competitive inhibition of VHH-COVE3 against the binding of RBD (L452R, E484Q) and ACE2.
  • FIG. 14 is a graph showing competitive inhibition of VHH-COVE3 against the binding of RBD (L452R, T478K) and ACE2.
  • FIG. 15 is a graph showing the neutralizing activity of VHH-COVE9 against the SARS-CoV-2alpha type mutant strain in the animal body.
  • FIG. 16 is SDS-PAGE showing the binding activity of VHH-COVE3 to RBD derived from a lambda mutant strain.
  • FIG. 17 is a graph showing the neutralizing activity of VHH-COVE3 against a SARS-CoV-2 alpha mutant strain in an animal body.
  • FIG. 18 is a graph showing the neutralizing activity of VHH-COVE3 against the SARS-CoV-2 delta type mutant strain in the animal body.
  • the present invention relates to providing a peptide that binds to SARS-CoV-2 and a method for using the same.
  • the present inventors examined SARS-CoV from a VHH antibody library containing CDR1 to 3 having a specific number of amino acids in a construct by screening by the cDNA display method. We succeeded in obtaining a highly reactive clone of -2.
  • SARS-CoV-2 binding peptide that can contribute to the creation of an antibody drug having a strong neutralizing ability that cannot be obtained with a conventional antibody.
  • SARS-CoV-2 can be detected, that is, the new coronavirus infection (COVID-19), which is a SARS-CoV-2 infection, can be rapidly detected.
  • COVID-19 new coronavirus infection
  • the SARS-CoV-2 binding peptide of the present invention (hereinafter referred to as "the peptide of the present invention") has the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 9 or at least one amino acid in the amino acid sequence.
  • SARS-CoV-2 is a SARS-related coronavirus (COVID-19) that causes acute respiratory disease, and its viral genome is a single-stranded plus-strand RNA virus with 29,903 bases.
  • the peptide of the present invention is a peptide that binds to SARS-CoV-2, and more specifically, a peptide that binds to the S1 subunit of the spike protein of SARS-CoV-2.
  • Examples of the peptide of the present invention include peptides having the ability to potentially bind to an epitope, and typically an antibody or an antibody fragment corresponds to this.
  • the "antibody” includes a CDR3 sequence of a heavy chain antibody, a single chain antibody, ScFv, and a heavy chain antibody, in addition to IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM produced from antibody-producing cells responsible for humoral immunity. It shall include single domain antibodies (hereinafter sometimes referred to as "VHH” or "VHH antibodies”), aptamers capable of binding to foreign substances such as pathogens that have invaded the body, and those in which some of these have been modified or modified. ..
  • CDR3 cluster refers to the amino acid sequence of CDR3, which is one of the complementarity determining regions, using a CD-HIT (Cruster Database at High Identity with Origin) or other sequence clustering program. It is assumed that 80% Identity (clustering threshold) is defined as a group.
  • the peptides of the invention include at least three complementarity determining regions (hereinafter sometimes referred to as "CDRs") and a plurality of framework regions.
  • CDR is also referred to as a hypervariable region, and refers to a region containing a sequence-variable antigen recognition site or a random sequence region.
  • the positional relationship of each CDR is in the order of CDR1, CDR2, and CDR3 from the N-terminal side.
  • the framework region (Flamework Region, hereinafter, sometimes referred to as “FR”) refers to a region excluding complementarity determining regions in the variable region of an antibody molecule, that is, a region having high conservativeness, and refers to the frame. It may be located on both the 5'side and the 3'side of the above CDR1 to CDR3.
  • CDR3 is, for example, one of the sequences shown in Table 1 below, or at least one of these amino acid sequences is replaced with another amino acid. ..
  • the position of the amino acid to be substituted and the type of amino acid after the substitution are not limited, but are preferably one substitution, unless the dissociation constant of these amino acid sequences from the antigen is 100 nM or more.
  • the peptide having such CDR3 is a highly reactive clone of SARS-CoV-2 obtained by screening by the cDNA display method in Examples described later, that is, a SARS-CoV-2 binding peptide (anti-SARS-CoV). -2 antibody (CoVHH)).
  • SARS-CoV-2 binding peptide anti-SARS-CoV. -2 antibody (CoVHH)
  • the binding ability to SARS-CoV-2 can be evaluated by a method known to those skilled in the art. Specifically, as shown in Examples described later, it can be evaluated by obtaining the dissociation constant KD by the biolayer interferometry.
  • the dissociation constant KD in the present invention is determined by the biolayer interferometry.
  • VHH-COVE1-9 VHH-COVE2, VHH-COVE5, VHH-COVE8, and VHH-COVE9 are preferable from the viewpoint of neutralizing activity against SARS-CoV-2.
  • CDR1 may be the amino acid sequence set forth by any of SEQ ID NOs: 10-18
  • CDR2 may be the amino acid sequence set forth by any of SEQ ID NOs: 19-27. There may be.
  • These amino acid sequences may be those in which at least one amino acid of the amino acid sequence constituting these amino acid sequences is replaced with another amino acid.
  • amino acid sequences of the three complementarity determining regions in the structural domains of VHH-COVE 1-9 are as follows.
  • FR1 may be the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 34
  • FR2 may be the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 35 to 42
  • FR3 may be the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 43 to 50
  • FR4 may be the amino acid sequence defined by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 51 to 53.
  • FR1 to FR4 preferably contain an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 53 above.
  • the amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 53 is a sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 53. It is preferable, more preferably 90% or more. It is more preferred that it is a framework region consisting of an amino acid sequence having 99% or more identity.
  • the identity of the amino acid sequence means the ratio (%) of the number of positions where the same amino acid residue exists in both sequences to the total number of amino acid residues when the two amino acid sequences are aligned. Specifically, it can be calculated by performing analysis using, for example, BLAST (Basic Local Element Search Tool) of National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • BLAST Basic Local Element Search Tool
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Examples of the peptide containing the sequence of CDR3 of the present invention include those linked in the order of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 from the N-terminal side to the C-terminal side. As described above, the amino acid sequences of these regions are shown by SEQ ID NOs: 1 to 53 in the sequence listing, and the amino acid sequences of the regions of VHH-COVE1 to VHH-COVE9 described above are SEQ ID NO: 65 (VHH-COVE1).
  • SEQ ID NO: 66 VHH-COVE2
  • SEQ ID NO: 67 VHH-COVE3
  • SEQ ID NO: 68 VHH-COVE4
  • SEQ ID NO: 69 VHH-COVE5
  • SEQ ID NO: 70 VHH-COVE6
  • SEQ ID NO: 71 VHH.
  • -COVE7 SEQ ID NO: 72 (VHH-COVE8)
  • SEQ ID NO: 73 VHH-COVE9
  • the peptide of the present invention is not limited in its form as long as it has at least one of the above structural domains, and is not limited to a variable region fragment (also called a nanobody) such as a VHH antibody, a single-chain antibody, or a heavy chain. It may be a multimer in which an antibody or a variable region fragment is bound with a peptide linker or the like, for example, a dimer.
  • the method for producing the peptide of the present invention is not particularly limited, and it can be easily produced by a known technique in the art.
  • it can be prepared by combining a peptide solid phase synthesis method and a native chemical ligation (NCL) method, or can be genetically engineered, but the nucleic acid encoding the peptide of the present invention is suitable.
  • a method of incorporating into a vector for example, a plasmid
  • introducing the vector into a host cell, and producing it as a recombinant peptide is preferable.
  • plasmid for expressing the peptide of the present invention a plasmid suitable for various host cells can be used.
  • virus lentivirus, vaccinia virus, bacteriophage virus and other virus vectors, vectors obtained by appropriately modifying these can be used.
  • expression plasmids have an origin of replication, a selectable marker and a promoter suitable for each plasmid, and if necessary, enhancers, transcriptional concentrating sequences (terminators), ribosome binding sites, polyadenylation signals, etc. You may have. Further, in order to facilitate the purification of the expressed polypeptide, the expression plasmid may be inserted with a base sequence for expressing by fusing FLAG tag, His tag, HA tag, GST tag and the like.
  • the peptide-producing bacterium of the present invention can be prepared by introducing the above-mentioned expression plasmid into a desired bacterium by a desired method, for example, electroporation.
  • Host cells used for the production of recombinant peptides include, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corine, various molds, animal cells, plant cells and other cells, baculovirus / insect cells, yeast cells and the like. can.
  • Corynebacterium and Bacillus subtilis can be preferably used, and Bacillus subtilis with high productivity is more preferable.
  • the expressed peptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cultured cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and ultrasonically or lysoteam. And / or after destroying the cells or cells by freezing and thawing, a soluble extract is obtained by centrifugation or filtration. From the obtained extract, the desired peptide can be obtained by appropriately combining known separation / purification methods.
  • Known separation and purification methods include methods that utilize solubility such as salting out and solvent precipitation, methods that mainly utilize differences in molecular weight such as dialysis method, ultrafiltration method, gel filtration method, and SDS-PAGE, and ions.
  • a method that utilizes the difference in charge such as exchange chromatography, a method that utilizes a specific affinity such as affinity chromatography, a method that utilizes a difference in hydrophobicity such as reverse phase high-speed liquid chromatography, or an isoelectric focusing method.
  • a method that utilizes the difference in isoelectric focusing such as, etc. is used.
  • the peptide of the present invention was found by selecting a VHH antibody candidate sequence using a cDNA display method, as shown in Examples described later. The acquisition of the antibody when this method is used will be described below.
  • SARS-CoV-2 2019-nCoV
  • SARS-CoV-2 Spike S1 protein Sino Biological
  • alpaca-derived naive VHH library gene provided by RePHAGEN
  • two gene fragments in the CDR1-2 region or CDR3 region are amplified by PCR with a VHH-specific primer, and an overlap PCR primer is used.
  • Elongation PCR is performed to elongate to create a full-length VHH-encoded DNA library.
  • VHH-specific primer used here examples include SEQ ID NOs: 54 and 55 in the sequence listing. Further, as the primer for overlap PCR, for example, SEQ ID NOs: 56 and 57 in the sequence listing can be mentioned.
  • the DNA fragment constituting the above library preferably contains a T7 promoter, an omega ( ⁇ ) enhancer, a Kozak consensus sequence, a VHH gene, a His tag, and a linker hybridization region (Y tag).
  • the obtained mRNA is ligated by irradiating a puromycin linker containing a photocrosslinking base such as cnvK or an analog thereof with light of a desired wavelength for a desired time, for example, light of 330 to 370 nm for 1 to 10 minutes.
  • a puromycin linker containing a photocrosslinking base such as cnvK or an analog thereof
  • light of a desired wavelength for a desired time for example, light of 330 to 370 nm for 1 to 10 minutes.
  • Cell-free translation is performed using the obtained mRNA-linker conjugate to synthesize an mRNA-VHH conjugate from the mRNA-linker conjugate.
  • commercially available products such as Rabbit Reticulocyte Lysate System and Nuclease Treated (Promega) can be used.
  • the resulting mRNA-VHH conjugate is then immobilized on magnetic beads.
  • beads for example, Dynabeads My One Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific) or the like can be used.
  • the cDNA-VHH conjugate is synthesized by performing a reverse transcription reaction except for the mRNA-VHH conjugate that was not immobilized on the magnetic beads.
  • the cDNA-VHH conjugate immobilized on the magnetic beads was eluted by adding, for example, a His-tag wash buffer containing RNase T1, His-tag purification was performed, and the purified cDNA-VHH linkage was performed. You can get a body.
  • the target molecule is biotinylated according to a conventional method. Since the biotinylated target protein binds to the streptavidin immobilized on the beads, the target molecule can be immobilized on the beads. The yield of the above-mentioned immobilization reaction can be confirmed by measuring the protein concentration of the solution before and after immobilization and comparing the band intensity ratio on SDS-PAGE.
  • the cDNA display method is used in this selection, it is preferable to perform preselection in order to adjust the amount of mRNA-linker conjugate used in each round and, if necessary, remove non-specific adsorbates.
  • the eluate used for elution in each round and the number of elutions can be appropriately selected. For example, the number of elutions in round 1 and subsequent rounds may be changed, or a plurality of elution buffers may be used in each round.
  • the obtained eluate can be purified using, for example, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) to obtain a purified product.
  • the purified product obtained by selection can be subjected to PCR and amplified to obtain a PCR amplified product.
  • the obtained PCR amplification product can be immobilized on the magnetic beads described above in the same manner as described above to obtain beads for FACS sorting labeled with FITC.
  • the region of the target protein-immobilized beads is identified. Sorting is performed under optimum preparative conditions to recover a desired number of particles, for example, 500,000 particles each, and purify in the same manner as described above.
  • the obtained particles are amplified using, for example, PrimeSTAR HS DNA Polymerase, and purified in the same manner as described above.
  • sequence analysis using the next-generation sequencer is performed, and the degree of convergence of the DNA library by the in vitro selection cycle is confirmed in detail.
  • the sequence sample can be prepared according to, for example, 2-step PCR Amplicon Library Preparation provided by Illumina. Using the PCR product after each selection as a template, amplicon PCR can be performed using the desired primers, for example, the primers shown in SEQ ID NOs: 60 and 61.
  • the sequence can be performed using MiSeq (Illumina) and MiSeq Reagent Nano Kit v2500 cycle (Illumina).
  • the obtained Demultipulated sequence data is subjected to analysis, and the base sequence region in which the VHH antibody is encoded is extracted and translated into an amino acid sequence. From these translation data, the number of amino acid sequences that completely match each amino acid sequence is measured, and then one of the complementarity determining regions, for example, the sequence of CDR3, is targeted, for example, the above-mentioned sequence clustering program CD-HIT, etc.
  • the number of clones can be measured with the desired similarity of 80% or more as the same cluster, and the number of clusters in each round can be obtained.
  • VHH antibody candidate sequences that bind to the target molecule are selected.
  • the selected VHH antibody candidate sequence is amplified by PCR using a desired primer, for example, the primers represented by SEQ ID NOs: 63 and 64, and the obtained PCR amplification product is purified to obtain a gene for VHH antibody preparation.
  • a desired primer for example, the primers represented by SEQ ID NOs: 63 and 64
  • the obtained PCR amplification product is purified to obtain a gene for VHH antibody preparation.
  • a polyclonal VHH antibody is prepared from the obtained gene by a cell-free translation system.
  • the antibody titer of the obtained polyclonal VHH antibody can be evaluated by ELISA according to a conventional method, for example.
  • each VHH gene from the above-mentioned in vitro screening R5 DNA library and introduce it into the expression plasmid.
  • the DNA of the target fragment is excised using a restriction enzyme and ligated to an expression plasmid to prepare a recombinant plasmid, and a desired bacterium, for example, Escherichia coli is transformed.
  • the above recombinant plasmid can be extracted from the transformed Escherichia coli to obtain an expression plasmid.
  • the obtained expression plasmid is introduced into a desired bacterium, the obtained antibody-producing bacterium is precultured in a medium containing an antibiotic, and then main culture is performed to collect the culture supernatant.
  • the production of VHH can be confirmed by gel electrophoresis or the like.
  • the collected culture supernatant can be purified by His-tag to obtain a VHH antibody sample.
  • the peptide of the present invention binds to SARS-CoV-2, it is contained in the sample by contacting it with a test sample containing or may contain SARS-CoV-2. -It can be confirmed that CoV-2 exists or does not exist. Specifically, in the detection of SARS-CoV-2 using the peptide of the present invention, the peptide of the present invention is brought into contact with the test sample, and the peptide of the present invention and SARS-CoV-2 in the test sample are combined. It is provided with a step of forming a conjugate of SARS-CoV-2 and a step of detecting SARS-CoV-2 in the conjugate.
  • the peptide of the present invention has a SARS-CoV against an anti-SARS-CoV-2 antibody (for example, a serum antibody) contained in an immobilized test sample (serum) in the detection of a virus-specific antibody in serum.
  • an anti-SARS-CoV-2 antibody for example, a serum antibody
  • an immobilized test sample serum
  • -It can also be used as a peptide for confirming the presence of the SARS-CoV-2 antigen in the bound state by adding a part of the -2 antigen and binding the antibody.
  • Test samples include tracheal swabs, nasal swabs, pharyngeal swabs, nasal lavage fluids, nasal suction fluids, nasal juices and nasal chews, saliva, sputum, blood, serum, urine, feces, tissues, cells, tissues or crushed cells.
  • a sample collected from a solid surface to which a virus may be attached for example, a door knob, a nasal cavity, or the like can be mentioned.
  • the peptide of the present invention may or may not be immobilized on the solid phase.
  • the step of detecting SARS-CoV-2 in the above-mentioned conjugate is, for example, reacting the above-mentioned conjugate with an anti-SARS-CoV-2 antibody that recognizes an epitope different from the peptide of the present invention in the conjugate. It can be done by letting it. Alternatively, a homogenius assay may detect SARS-CoV-2 in the above conjugate in the liquid phase.
  • the peptide of the present invention can be a component of the SARS-CoV-2 detection kit.
  • the kit can be used as a diagnostic agent for SARS-CoV-2 infection (COVID-19) and as a tool for developing a therapeutic agent for SARS-CoV-2 infection.
  • the detection kit can include reagents and instruments necessary for detection, such as antibodies, solid phase carriers, buffers, enzyme reaction terminators, microplate readers, and the like. ..
  • the peptide of the present invention may be immobilized on a solid phase.
  • solid phase examples include beads, a membrane, side surfaces and bottom surfaces of a reaction vessel, a plate-like substrate such as a slide glass, and a substrate having wells such as an immunoplate (hereinafter referred to as “well substrate”), and the present invention includes the present invention.
  • the peptide is fixed directly or indirectly.
  • the peptide of the present invention When the peptide of the present invention binds to the S1 subunit of SARS-CoV-2 and inhibits the binding of the virus to cells, the peptide of the present invention is administered to a mammal to cause a SARS-CoV-2 infection. It can be used as a medicine for the prevention or treatment of SARS. Examples of the mammal include humans, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, cows, horses, pigs and the like, but humans are preferable.
  • the administration form may be oral or parenteral, and it can be appropriately used in combination with a well-known pharmaceutically acceptable excipient, diluent and the like. ..
  • parenteral administration include intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and the like, and administration to the mucous membrane by spraying or the like.
  • the content of the peptide of the present invention contained in the drug may be appropriately adjusted, and the effective amount may be administered at intervals of about 1 to several times a week.
  • SARS- having one or more structural domains including CDR3 consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 9 or an amino acid sequence in which at least one amino acid in the amino acid sequence is replaced with another amino acid.
  • CoV-2 binding peptide ⁇ 2> The peptide according to ⁇ 1>, wherein the SARS-CoV-2 binding peptide is one selected from the group consisting of a VHH antibody, a heavy chain antibody, and a VHH antibody multimer.
  • VHH antibody multimer is a multimer in which a plurality of the structural domains are linked.
  • ⁇ 4> The amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 9 is described in any of ⁇ 1> to ⁇ 3>, which has a KD of 3.6 x 10 -9 M or less with respect to SARS-CoV-2. Peptide.
  • the structural domain is further represented by CDR1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 10 to 18 or an amino acid sequence in which at least one amino acid is replaced with another amino acid in the amino acid sequence, and SEQ ID NOs: 19 to 27.
  • ⁇ 6> A structure comprising CDR1, CDR2, and CDR3 consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 27 shown in Table 2 or an amino acid sequence in which at least one amino acid is replaced with another amino acid in the amino acid sequence.
  • the peptide according to ⁇ 5> which has one or more domains and is selected from 1) to 9).
  • ⁇ 7> A nucleic acid encoding the peptide according to ⁇ 1>.
  • ⁇ 8> A method for detecting SARS-CoV-2 in a sample, which comprises a step of contacting the peptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> with a test sample.
  • ⁇ 9> A SARS-CoV-2 detection kit containing the peptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • ⁇ 10> A drug containing the peptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • ⁇ 11> The drug according to ⁇ 10> for the prevention or treatment of SARS-CoV-2 infection.
  • ⁇ 12> Use of the peptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> for producing a drug.
  • ⁇ 13> The use according to ⁇ 12>, wherein the drug is a drug for the prevention or treatment of SARS-CoV-2 infection.
  • ⁇ 14> The peptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> for use as a medicine.
  • ⁇ 15> The peptide according to ⁇ 14>, wherein the drug is a drug for the prevention or treatment of SARS-CoV-2 infection.
  • ⁇ 16> A method for preventing or treating a SARS-CoV-2 infection, which is administered to a subject requiring the peptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • SARS-CoV-2 2019-nCoV
  • SARS-CoV-2 Spike S1 protein SinoBiological
  • VHH single Variable domine of the Heaby chain of a Heaby-chain antibody: VHH
  • VHH-specific primers SEQ ID NOs: 54 and 55
  • extension PCR was performed using overlap PCR primers (SEQ ID NOs: 56 and 57) to extend the DNA fragment.
  • SEQ ID NOs: 56 and 57 overlap PCR primers
  • the PCR product was purified using Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter). 1.8 ⁇ L of beads per 1 ⁇ L of PCR product was added, mixed by pipetting, and allowed to stand for 5 minutes. After allowing to stand on a magnetic plate until it became transparent, the supernatant was removed. After adding 1.4 mL of 70% ethanol and allowing to stand for 30 seconds, the supernatant was removed. This ethanol washing was performed 3 times, and after removing the supernatant, the beads were allowed to stand on a magnetic plate for 3 minutes, and the beads were air-dried. The tube was removed from the magnetic plate, 100 ⁇ L of Nuclease free water was added, and the beads were suspended by pipetting and allowed to stand for 5 minutes. The tube was allowed to stand on a magnetic plate for 2 minutes, and then the supernatant was collected.
  • Binding buffer (10 mM Tris-HCl, 1M NaCl, 0.1% Tween 20, 1 mM EDTA, pH 8) was added, pipetting for 1 minute, and then the supernatant was removed. This wash was performed twice.
  • His-tag wash buffer (20 mM Sodium phosphate, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazole, 0.05% Tween 20). , PH 7.4) was added and suspended by pipetting for 1 minute. It was allowed to stand on a magnetic plate for 1 minute, and the supernatant was discarded. Subsequently, 30 ⁇ L of His-tag wash buffer containing 10U RNase T1 (Thermo Fisher Scientific) was added, suspended by pipetting for 1 minute, and then allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes for cDNA-VHH ligation. The body was eluted.
  • the cDNA-VHH conjugate was eluted by adding 10 ⁇ L of His-tag elution buffer (20 mM Sodium phosphate, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 7.4) and incubating at room temperature for 15 minutes.
  • His-tag elution buffer (20 mM Sodium phosphate, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 7.4
  • the prepared cDNA display molecule was made into a diluted solution of 100 ⁇ L with PBST, bound to streptavidin-bound magnetic beads previously washed with 1x Binding buffer, stirred at room temperature for 1 to 2 hours, and then allowed to stand on a magnetic stand for 2 minutes. The supernatant was collected. After performing this operation once or twice, the obtained supernatant was subjected to PBST of 1 ⁇ M for (R1) and 100 nM for (R2) to (R4) with respect to the immobilized amount of SARS-CoV-2 Spike S1 protein. After diluting to the above, it was bound to SARS-CoV-2 Spike S1 immobilized beads and stirred at room temperature for 1 to 2 hours. After standing on a magnetic stand for 2 minutes, the supernatant was removed and the magnetic beads were washed with 100 ⁇ L PBST.
  • the T7omega_New primer had the sequence of SEQ ID NO: 58, and the NewYtag for polyA cnvK primer had the sequence of SEQ ID NO: 59 (see Table 6).
  • the obtained PCR product was purified using Agencourt AMPure XP according to the instruction manual for the product.
  • Biotin 5-Fluorescein
  • Sigma-Aldrich 20 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL Biotin (5-Fluorescein) (Sigma-Aldrich) was added, the mixture was stirred at room temperature for 1 hour, and then allowed to stand on a magnetic plate for 1 minute to remove the supernatant.
  • 100 ⁇ L of PBST was added, pipetting was performed for 1 minute, and then the mixture was allowed to stand on a magnetic plate for 1 minute to remove the supernatant. After repeating this operation twice, 1.8 ⁇ L of PBST was added to obtain a FITC bead solution.
  • cDNA display solution (6 pmol) prepared from the PCR amplification product of (R5) was mixed with the obtained beads, stirred at room temperature for 30 minutes, allowed to stand on a magnetic stand for 2 minutes, and the supernatant was removed. 100 ⁇ L of PBST was added and pipetting was performed for 1 minute. Then, it was allowed to stand on a magnetic plate for 1 minute to remove the supernatant. After repeating this operation three times, 1 mL of PBST was added to prepare a sorting solution.
  • the obtained sorting solution was set in FACS (Cell Sorter SH800: SONY), the sample flow path and the droplet formation conditions at the time of sorting were set up, and sorting was performed.
  • the region of the magnetic beads is identified from the particle size
  • the region of the FITC beads and the SARS-CoV-2 Spike S1 protein-immobilized beads is identified from the fluorescence intensity of 488 nm laser irradiation, and sorting is performed under the optimum preparative conditions. And each 500,000 particles were collected in Eppendorf. Then, centrifugation was performed at 13,000 xg for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was purified using Agencoat AMPure XP according to the instruction manual of the product, and then Index PCR was performed.
  • a PCR reaction solution having the composition shown in Table 9 below was prepared, and Index PCR was performed.
  • the PCR conditions were 98 ° C. for 1 minute, then 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 17 seconds for 10 cycles, and 72 ° C. for 1 minute.
  • Example 2 Preparation of polyclonal VHH antibody by cell-free translation system (1) Preparation of gene Using the PCR product obtained by R5 for in vitro screening as a template, Newleft primer (SEQ ID NO: 62) and CDR3 selected above. PCR was performed using 9 specific primers containing the sequence. Then, the C-terminal is extended with the above-mentioned Newreft primer and a primer containing the FR4 sequence after CDR3 and the His tag sequence, and finally, the PURE_System_FW primer (SEQ ID NO: 63) and PURE_System_Rv primer (SEQ ID NO: 64) designed for PUREflex system synthesis are used. PCR was performed using (see Table 11 below). The obtained PCR product was purified using Agencourt AMPure XP, and 9 kinds of genes for producing polyclonal VHH antibody were prepared.
  • the tube was allowed to stand on a magnetic plate for 1 minute and the supernatant was discarded. This cleaning operation was performed twice. 20 ⁇ L of His-tag elution buffer (20 mM Sodium phosphate, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 7.4) was added to this tube and incubated for 15 minutes at room temperature. It was allowed to stand on a magnetic plate for 1 minute, and the supernatant was collected. This elution operation was performed twice. A PBS solution containing 1% BSA was added to the tube and diluted to 200 ⁇ L to obtain a polyclonal VHH antibody sample solution.
  • His-tag elution buffer (20 mM Sodium phosphate, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 7.4
  • Example 3 Evaluation by ELISA
  • SARS-CoV-2 S1 subunit-Fc solution The Native Antigen Company
  • PBS solution containing 1% BSA 100 ⁇ L was added to each well of an immunomodule (Immuno Clear Standard Modules_C8_MaxiSorp (cat # 445101, Thermo Scientific)), and after sealing, the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. to solidify the above S1 protein.
  • the module was washed 3 times with 200 ⁇ L PBST, then 300 ⁇ L of 3% BSA-containing PBS solution was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature.
  • This module was then washed 3 times with 200 ⁇ L PBST (0.05% Room 20) and then the polyclonal VHH prepared in Example 2 (3) for each well of the module immobilized on S1 protein. 100 ⁇ L of the antibody sample solution was added, and the mixture was shaken at room temperature. The module was then washed 3 times with 200 ⁇ L PBST.
  • Anti-FLAG-tag mAb conjugated with HRP (cat # A8592, Sigma) was diluted to 1 / 10,000 with a PBS solution containing 1% BSA. Then, 100 ⁇ L of this diluted solution was added to each of the above wells, the well plate was shielded from light, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour. The module was washed 3 times with 200 ⁇ L PBST.
  • OPD tablets (cat # 155-021611, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) were dissolved in 10 mL of 0.1 M NaH 2 PO 4 and 5 ⁇ L of 30% H 2 O 2 was added to prepare an OPD tablet solution.
  • VHH-COVE9 was produced with recombinant Corine bacteria.
  • VHH antibody SEQ ID NO: 90
  • VHH-COVE5 derived from Corine bacteria VHH-COVE6
  • VHH-COVE6 SEQ ID NO: 70
  • VHH-COVE6 derived from Corine bacteria
  • VHH-COVE7 VHH antibody having the same CDR1, 2, 3 as VHH-COVE7
  • VHH-COVE7 derived from Corine bacteria VHH antibody (SEQ ID NO: 93) having the same CDR1, 2, 3 as VHH-COVE8 (SEQ ID NO: 72) (hereinafter “VHH-derived from Corine bacteria”)
  • VHH antibody (SEQ ID NO: 94) having the same CDRs 1, 2 and 3 as VHH-COVE9 (SEQ ID NO: 73) was prepared by ELISA evaluation.
  • each VHH gene was prepared from the R5 DNA library for in vitro screening and introduced into an expression plasmid containing a His tag.
  • the synthesized VHH clone gene and an empty expression plasmid were treated with two restriction enzymes SfiI and NotI (both are Thermo Fisher), and the DNA of the target fragment was isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
  • the VHH clone gene treated with the restriction enzyme and the expression plasmid were ligated using Ligation Mix (Toyobo), and the ligation product was used to transform into the cloning competent cell JM109.
  • the plasmid was extracted from the transformed E. coli. A plasmid for expressing the VHH clone was obtained.
  • the collected culture supernatant was filtered using a PVDF membrane (Merck Millipore), and then purified using Ni Sepharose 6 Fast Flow (Cytiva) according to the instruction manual for the product.
  • 400 ⁇ L of His-tag elution buffer 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 7.5
  • TOMY centrifuge
  • VHH-COVE1 having a His tag sequence (SEQ ID NO: 74) containing an Ala residue at the N-terminal and a linker at the C-terminal (SEQ ID NO: 95 (hereinafter referred to as "VHH-COVE1 derived from Bacillus subtilis").
  • VHH-COVE2 (SEQ ID NO: 96) (hereinafter referred to as "VHH-COVE2 derived from Bacillus subtilis")
  • VHH-COVE3 (SEQ ID NO: 97) (hereinafter referred to as "VHH-COVE3 derived from Bacillus subtilis”)
  • VHH-COVE4 (sequence)
  • An artificially synthesized gene of No. 98) (hereinafter referred to as "VHH-COVE4 derived from Bacillus subtilis”) was synthesized.
  • a termination codon was added to the 3'end of the base sequence encoding SEQ ID NOs: 95 to 98, and GCAGCTCTTGCAGCA (SEQ ID NO:) was further added.
  • VHH-COVE1 expression construct for VHH-COVE1 expression
  • SEQ ID NO: 78 construct for expressing VHH-COVE2
  • SEQ ID NO: 79 75
  • TCTATTAAACTAGTT SEQ ID NO: 76
  • PCR was performed using the primer sets of 5'-GAATTCCCGGGGATCTAAGAAAAGTGATTCTGGGAGAG-3'(SEQ ID NO: 83) and 5'-CTTTCTTAACATCATAGTAGTTCACCACCTTTTCCC-3' (SEQ ID NO: 84), and the promoter DNA derived from the spoVG gene was obtained. Amplified. The obtained promoter DNA was incorporated into a plasmid sequence using an In-Fusion HD Cloning Kit (Takara) to construct a plasmid for VHH expression linked to the spoVG promoter.
  • PCR was performed using 5'-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-3'(SEQ ID NO: 85) and 5'-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 86), and PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa) to amplify the above plasmid sequence.
  • DNA containing the artificially synthesized gene prepared in (1) was incorporated into the obtained PCR product using an In-Fusion HD Cloning Kit (Takara), and a His-tagged VHH expression plasmid containing each artificially synthesized VHH gene was incorporated into the obtained PCR product.
  • Takara In-Fusion HD Cloning Kit
  • the culture was collected in a 15 mL tube and centrifuged at 1,2000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant.
  • 500 ⁇ L SMMP containing 4 mg / mL lysozyme (SIGMA) was added to suspend the resulting pellet and the tube was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • this tube was centrifuged at 3,500 rpm for 10 minutes to remove the supernatant. 400 ⁇ L of SMMP was added to this tube and the resulting pellet was suspended to make a suspension. 33 ⁇ L of the obtained suspension was added to another tube, each plasmid was added thereto and mixed, and 100 ⁇ L of 40% PEG was further added and vortexed to prepare a mixed solution. 350 ⁇ L of SMMP was added to this mixed solution, mixed by inversion, and shaken at 30 ° C. and 210 rpm for 1 hour to obtain a shake culture.
  • the whole amount of the shaking culture was applied on the agar medium of the plate containing the DM3 agar medium prepared in advance, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 2 to 3 days to obtain recombinant Bacillus subtilis.
  • Each VHH contained in the collected supernatant was purified using Ni-NTA agarose beads (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the protocol attached to the kit. As the eluate during purification, PBS containing 50 mM imidazole was used.
  • a 6x-His Tag monoclonal antibody (3D5), HRP (Invitrogen) or ANTI-FLAG M2-peroxidase (HRP) conjugate was used, and an antibody reaction was performed using iBind Western System (Invitrogen). rice field.
  • the target protein was detected using 1-Step Ultra TMB-Blotting Solution (Thermo Scientific).
  • Example 6 Measurement of binding activity by biolayer interferometry Using biolayer interferometry (hereinafter, may be abbreviated as "BLI"), VHH-COVE1 to VHH-COVE4 derived from Bacillus subtilis and VHH-COVE5 derived from Corine bacteria. -VHH-COVE9 binding activity to SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 protein was measured.
  • BLI used Octet 384 (Fortebio) to prepare each VHH clone with kinetic buffer (PBS containing 0.05% Tween 20, pH 7.4) at 10-20 ⁇ g / mL Anti-Penta-HIS (HIS1K, Forestbio).
  • Baseline step Baseline measurement in kinetic buffer (60 seconds)
  • Loading step Immobilization of VHH antibody on the sensor (240 seconds)
  • Baseline step Baseline measurement in kinetic buffer (30 seconds)
  • Association step Meeting with Spike S1 protein solution (180 seconds)
  • Dissociation step Measured in kinetic buffer (240 seconds)
  • Regeneration step Measurement in Glycine-HCl (pH 2.2) for 5 seconds, measurement in Kinetics buffer for 5 seconds is repeated 3 times.
  • Example 7 Measurement of competitive inhibition activity by biolayer interferometry Octet 384 was used to analyze competitive inhibition of SARS-CoV-2 Spike S1 protein between each VHH clone.
  • the competitive inhibitory activity was adjusted to a constant concentration with respect to the sensor chip on which any one of VHH-COVE1 to VHH-COVE4 derived from Bacillus subtilis and VHH-COVE5 to VHH-COVE9 derived from Corine bacteria was immobilized as the first antibody.
  • the first competitive VHH antibody prepared at 100 ⁇ g / mL with kinetic buffer (PBS containing 0.05% Tween 20, pH 7.4) was immobilized on a HIS1K sensor chip.
  • a second competing VHH clone of 100 ⁇ g / mL and 20 ⁇ g / mL, 10 ⁇ g / mL, 5 and 0 ⁇ g / mL SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-Fc recombinant protein (SinoBiological) are mixed, respectively.
  • the reaction was carried out for 5 minutes to prepare a binding solution.
  • the measurement order for each run was as follows.
  • Baseline step Baseline measurement in kinetic buffer (60 seconds)
  • Loading step Immobilization of VHH antibody on the sensor (60 seconds)
  • Baseline step Baseline measurement in kinetic buffer (30 seconds)
  • Association step Association in Spike S1 protein solution and competitive VHH antibody mixed solution (120 seconds)
  • Dissociation step Measured in kinetic buffer (30 seconds)
  • Regeneration step Measurement in Glycine-HCl (pH 2.2) for 5 seconds, measurement in Kinetics buffer for 5 seconds is repeated 3 times.
  • the competitive inhibition rate is such that the binding signal obtained by the first antibody and the Spike S1 protein is 100%, and when the signal intensity in the presence of the second antibody is reduced to less than 25% of the maximum binding ability, competition occurs and the binding occurs. If it exceeds 75%, it is defined as non-competitive. Levels of 25% to 75% were considered intermediate competition. From the results of the binding competition signal of each clone, a VHH clone with high binding activity was obtained, and it was considered that the VHH clone in which the activity was confirmed this time can be divided into at least 5 competing groups (see Table 14 below). ..
  • Example 8 Measurement of neutralization activity against SARS-CoV-2 The neutralization activity of Bacillus subtilis-derived VHH-COVE2 against SARS-CoV-2 was measured. Antibodies were prepared to a concentration of 15 ⁇ g / mL by mixing with 2% Fetal Bovine Serum (FBS) / Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM). Further, 100 ⁇ L of VHH clone mixture and 100 ⁇ L of 2% FBS / DMEM were mixed to prepare a 3-fold diluted solution, and a 3-fold diluted series solution of the antibody was prepared.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle's Medium
  • the infection inhibition rate of SARS-CoV-2 at each concentration of VHH clone was calculated (Fig. 5). As a result, it was found that VHH-COVE2 showed neutralizing activity against SARS-CoV-2 and thus could bind to particles of SARS-CoV-2.
  • the IC50 determined from the infection inhibition rate was 0.05 ⁇ g / mL, and it was found that VHH-COVE2 has a high neutralizing activity against SARS-CoV-2.
  • VHH-COVE5 SEQ ID NO: 99
  • VHH-COVE5 derived from Bacillus subtilis VHH-COVE5 derived from Bacillus subtilis
  • VHH-COVE8 (SEQ ID NO: 100) (hereinafter referred to as "VHH-COVE8 derived from Bacillus subtilis")
  • VHH-COVE9 (SEQ ID NO: 101) (hereinafter referred to as "VHH-COVE9 derived from Bacillus subtilis”) bottom.
  • a sequence number in which a stop codon is added to the 3'end of the base sequence encoding SEQ ID NOs: 99 to 101 GCAGCTCTTGCAGCA (SEQ ID NO: 75) is added to the 5'end, and TCTATTAAACTAGTT (SEQ ID NO: 76) is added to the 3'end.
  • Example 10 Measurement of neutralization activity against SARS-CoV-2
  • the VHH clones to be used were obtained from VHH-COVE2, VHH-COVE5 derived from Bacillus subtilis, and VHH-COVE8 derived from Bacillus subtilis, respectively.
  • VHH-COVE9 derived from Bacillus subtilis was changed, and the neutralizing activity against SARS-CoV-2 was evaluated.
  • the IC50 determined from the infection inhibition rate was 3.048 ⁇ g / mL (VHH-COVE5), less than 1.733 ⁇ g / mL (VHH-COVE8), and less than 0.58 ⁇ g / mL (VHH-COVE9).
  • VHH-COVE6 and VHH-COVE7 having a His tag sequence attached to the C-terminal were produced by protease-deficient recombinant Bacillus subtilis.
  • VHH-COVE6 SEQ ID NO: 102 having a His tag sequence (SEQ ID NO: 74) containing an Ala residue at the N-terminal and a linker at the C-terminal (hereinafter referred to as "VHH-COVE6 derived from Bacillus subtilis").
  • VHH-COVE7 (SEQ ID NO: 103) (hereinafter referred to as "VHH-COVE7 derived from Bacillus subtilis") was synthesized. A stop codon was added to the 3'end of the base sequence encoding SEQ ID NO: Q and SEQ ID NO: R, GCAGCTCTTGCAGCA (SEQ ID NO: 75) was added to the 5'end, and TCTATTAAACTAGTT (SEQ ID NO: 76) was added to the 3'end.
  • SEQ ID NO: 104 construct for expressing VHH-COVE6
  • SEQ ID NO: 105 construct for expressing VHH-COVE7 were artificially synthesized by Eurofin and used for experiments. Subsequent operations for the production of VHH by protease-deficient recombinant Bacillus subtilis were carried out according to Example 5.
  • Example 12 Measurement of binding activity to SARS-CoV-2 mutant strain SARS-CoV-2 mutation with respect to 8 types of VHH antibodies, VHH-COVE1 to VHH-COVE5 and VHH-COVE7 to VHH-COVE9 derived from Bacillus subtilis.
  • the binding activity of the strain to the Spike protein was measured by the ELISA method.
  • target proteins Trimeric SARS-CoV-2 Spike Antigen, Full-length (denoted as “Wuhan type”), SARS-CoV-2 full-length Spike Recombinant Antigen B. 1.1.7 Mutation (denoted as "British type”), SARS-CoV-2 full-length Spike Recombinant Antigen B.
  • the South African type is a mutation of Y144 deletion, K417N, E484K, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H to the Wuhan type.
  • the Brazilian type is a mutation of L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, H655Y, T1027I, V1176F with respect to the Wuhan type.
  • each VHH antibody prepared at 20 ⁇ g / mL was added to each well of Pierce TM Nickel Coated Plates, Clear, and 96-well (Thermo Fisher Scientific), and incubated at room temperature for 1 hour to solidify. Then, after carefully removing the VHH antibody using a pipette, 200 ⁇ L of PBST was added, and the operation of carefully removing with a pipette (denoted as “washing”) was repeated three times. Next, 200 ⁇ L of 5% skim milk / PBST was added to each well, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour for blocking.
  • skim milk / PBST was carefully removed using a pipette, and then the washing operation was repeated 3 times.
  • 100 ⁇ L of the target protein prepared at an appropriate concentration was added to each well, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour.
  • the washing operation was repeated three times.
  • Ms mAb to Rhodopsin [1D4] (Abcam) diluted 1 / 5,000 with PBST was prepared, and 100 ⁇ L was added to each well. After incubating at room temperature for 1 hour, the primary antibody was carefully removed using a pipette, and then the washing operation was repeated 3 times.
  • Example 13 Measurement of binding activity to SARS-CoV-2 mutant strain Following the method of Example 11 described above, regarding VHH-COVE6 derived from Bacillus subtilis, the binding activity of SARS-CoV-2 mutant strain to Spike protein was determined. It was measured by the ELISA method. Similar to Example 11, Trimeric SARS-CoV-2 Spike Antigen, Full-length (denoted as “Wuhan type”), SARS-CoV-2 full-length Spike Recombinant Antigen B. 1.1.7 Mutation (denoted as "British type”), SARS-CoV-2 full-length Spike Recombinant Antigen B.
  • Example 14 Measurement of binding activity to SARS-CoV-2 mutant strain Following the method of Example 11 described above, SARS-CoV- 2 The binding activity of the British / Nigerian mutant strain to the Variant of concern was measured by the ELISA method.
  • SARS-CoV-2 full-length Spice Recombinant Antigen B. 1.525 Mutation (hereinafter referred to as "UK / Nigerian type") (Bio-serv) diluted with PBST (Phosphate Buffered Saline with 0.05% Tween 20) (0, 5, 50, 500 ng / mL) was used.
  • the UK / Nigerian mutant strain is a mutation of H69-V70 deletion, Y144 deletion, Q52R, E484K, Q667H, F888L to the Wuhan type.
  • the results of the ELISA test are shown in FIG.
  • the binding activity to the British / Nigerian spike protein was confirmed for all VHH antibodies used in the test.
  • VHH-COVE3, VHH-COVE8, and VHH-COVE9 very good binding activity (absorbance of 1 or more) was confirmed.
  • Good binding activity (absorbance of 0.5 or more) was also confirmed for VHH-COVE5, VHH-COVE6, and VHH-COVE7.
  • Example 15 Measurement of binding activity to SARS-CoV-2 mutant strain Following the method of Example 11 described above, SARS-CoV- 2 The binding activity of the California mutant strain and the Indian mutant strain to the Variant of concern protein was measured by the ELISA method.
  • SARS-CoV-2 full-length Spice Recombinant Antigen B. 1.429 Mutation hereinafter referred to as "California type"
  • SARS-CoV-2 full-length Spike Recombinant Antigen B SARS-CoV-2 full-length Spike Recombinant Antigen B.
  • the California mutant strain is a mutation of S13l, W152C, L452R, D1183Y with respect to the Wuhan type.
  • the Indian mutant strain is a mutation of G142D, E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, Q1071H with respect to the Wuhan type.
  • VHH-COVE3 recognizes an epitope that is not easily affected by mutations in the Spike protein, and exhibits a wide range of binding activity to mutant strains of SARS-CoV-2. Became clear.
  • Example 16 Measurement of binding activity to SARS-CoV-2 Spike RBD Binding activity to SARS-CoV-2 Spike RBD recombinant protein was carried out for 9 types of VHH antibodies of VHH-COVE1 to VHH-COVE9 derived from Bacillus subtilis. It was measured by the same method as in Example 7.
  • the dissociation rate was measured by binding to SARS-CoV-2 Spike RBD recombinant protein (40592-VNAH, SinoBiological, Wuhan type) prepared from nM by 2-fold serial dilution.
  • SARS-CoV-2 Spike RBD recombinant protein (40592-VNAH, SinoBiological, Wuhan type) prepared from nM by 2-fold serial dilution.
  • the tip of the sensor chip was immersed in 200 ⁇ L kinetic buffer for 10 minutes to hydrate the sensor chip. Then, 50 ⁇ L of each measuring solution was added to a 384-well black plate (Fortebio), and the measurement was carried out in steps 1) to 6) shown below.
  • Baseline step Baseline measurement in kinetic buffer (30 seconds) 2) Loading step: Immobilization of VHH antibody on the sensor (120 seconds) 3) Baseline step: Baseline measurement in kinetic buffer (60 seconds) 4) Association step: Association with RBD protein solution (180 seconds) 5) Dissociation step: Measured in kinetic buffer (240 seconds) 6) Regeneration step: Measurement in Glycine-HCl (pH 2.2) for 5 seconds, measurement in Kinetics buffer for 5 seconds is repeated 3 times.
  • VHH-COVE1 and VHH-COVE4 From the equilibrium dissociation constant (KD) for RBD, other VHH antibodies except VHH- COVE1 and VHH-COVE4 showed strong binding activity similar to S1 protein. On the other hand, VHH-COVE1 and VHH-COVE4 did not show a clear bond. Since it has been confirmed that VHH-COVE1 and VHH-COVE4 bind to the S1 protein and compete with VHH-COVE2 and the like that bind to RBD, those that recognize the vicinity site (NTD) of RBD as an epitope. It was inferred.
  • Example 17 Measurement of competitive inhibitory activity against binding between SARS-CoV-2 Spike RBD and ACE2 VHH-COVE2 derived from Bacillus subtilis whose binding to RBD was confirmed in Example 15 by the same method as in Example 7. , VHH-COVE3 derived from Bacillus subtilis, VHH-COVE5 to VHH-COVE9 derived from Bacillus subtilis, competitive inhibition evaluation for binding between SARS-CoV-2 Spike RBD and human ACE2 was carried out using Octet 384. bottom.
  • VHH-COVE3, VHH-COVE5, VHH-COVE6, VHH-COVE7 and VHH-COVE8 clearly inhibited the binding to ACE2 and showed competitiveness.
  • VHH-COVE3, VHH-COVE5, VHH-COVE6, VHH-COVE7 and VHH-COVE8 show neutralizing activity to SARS-CoV-2.
  • VHH-COVE9 did not show competition with ACE2, and VHH-COVE2 showed partial competition with ACE2.
  • the change of each sensorgram with respect to ACE2 is shown in FIG. From this result, it is shown that VHH-COVE9 has an epitope other than the ACE2 binding site on RBD, and its neutralizing activity is different from that of a general antibody showing neutralizing activity by directly competing with ACE2. It was thought that there was.
  • Example 18 Measurement of binding activity to SARS-CoV2 Spike RBD mutant strain VHH-COVE2 derived from Bacillus subtilis, VHH-COVE3 derived from Bacillus subtilis, VHH-COVE5 to VHH-COVE9 derived from Bacillus subtilis by the same method as in Example 7. The binding activity of the six VHH antibodies to the SARS-CoV-2 Spike RBD mutant strain was measured.
  • each SARS-CoV-2 Spike RBD mutant strain (SPD-C52Hn, Acro Biosystems, N501Y), SARS-CoV2 Spike RBD mutant strain (SRD-C52H3, Acro Biosystems, E484K) SR -C52H2, Acro Biosystems, N440K), SARS-CoV2 Spike RBD mutant strain (SPD-C52Hp, Acro Biosystems, K417N, E484K, N501Y) converted to EZ-Link It was adjusted to 10-20 ⁇ g / mL with a kinetic buffer (PBS containing 0.05% Tween 20, pH 7.4).
  • PBS kinetic buffer
  • the RBD mutant strain was immobilized on a SA sensor chip (Fortebio), bound to each VHH adjusted from 666.7 nM with 2-fold serial dilution, and the dissociation rate was measured.
  • the tip of the sensor chip was immersed in 200 ⁇ L kinetic buffer for 10 minutes to hydrate the sensor chip. Then, 50 ⁇ L of each measuring solution was added to a 384-well black plate (Fortebio), and the measurement was carried out in steps 1) to 5) shown below.
  • Baseline step Baseline measurement in kinetic buffer (60 seconds) 2) Loading step: Immobilization of VHH antibody on the sensor (300 seconds) 3) Baseline step: Baseline measurement in kinetic buffer (60 seconds) 4) Association step: Meeting with Spike RBD protein solution (120 seconds) 5) Dissociation step: Measured in kinetic buffer (240 seconds)
  • VHH-COVE2 As a result of binding analysis, all VHH antibodies used in this test bound to each RBD mutant strain. However, it was confirmed that VHH-COVE2, VHH-COVE3, VHH-COVE5, VHH-COVE7, and VHH-COVE8, which have been found to be competitive with ACE2 and epitopes, have an effect on binding activity depending on the position of the mutation. Was done. On the other hand, VHH-COVE9 that binds to an epitope different from ACE2 did not show a decrease in binding activity associated with these mutations. This suggests that VHH-COVE9 may exert neutralizing activity against the above mutant strain.
  • Example 19 Measurement of binding activity of SARS-CoV-2 Indian mutant strain to RBD Regarding VHH-COVE3 whose binding activity to spike protein derived from Indian mutant strain was confirmed in Example 15, derived from Indian mutant strain was evaluated for its binding activity to RBD.
  • Dynabeads TM MyOne Carboxylic Acid Thermo Fisher
  • Thermo Fisher which had been returned to room temperature for 30 minutes or more, was stirred well, and 250 ⁇ L was separated into a 1.5 mL tube. Then, the supernatant was removed using a magnet rack. After adding 250 ⁇ L of 15 mM MES buffer (pH 6.0), vortexing was performed for 10 seconds. Then, the supernatant was removed using a magnet rack.
  • the beads were suspended in 50 ⁇ L of 15 mM MES buffer (pH 6.0), 50 ⁇ L of 1-ethyl-3- (-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride prepared at 10 mg / mL was added and mixed, and then at room temperature. The mixture was stirred for 30 minutes. Then, the supernatant was removed using a magnet rack. Next, 120 ⁇ L of 15 mM MES buffer (pH 6.0) containing 50 ng of VHH-COVE3 was prepared and the beads were suspended in the solution. After stirring overnight at room temperature, the supernatant was removed using a magnet rack. The beads were suspended in 500 ⁇ L PBST and stirred for 10 minutes.
  • VHH-COVE3 immobilized beads were suspended in a 200 ⁇ L Indian RBD in a 1.5 mL tube and then slowly stirred. Ten minutes after the start of stirring, 30 ⁇ L of the reaction solution was separated and allowed to stand on a magnet rack until the solution became transparent, and then the supernatant was separated and subjected to SDS-PAGE. SDS-PAGE was applied to each well of Bolt® Bis-Tris Plus gel (Thermo Fisher) with a sample containing 20 ⁇ L of supernatant and then run at 200 V for 35 minutes. For molecular weight markers. Novex TM Sharp Pre-stained Protein Standard (Thermo Fisher) was used. For staining, GelCode TM Blue Safe Protein Stein (Thermo Fisher) was used.
  • VHH-COVE9 mutant by recombinant Corine bacteria
  • VHH- VHH-COVE9-R108K SEQ ID NO: 106
  • VHH-COVE9-N109D SEQ ID NO: 107
  • VHH-COVE9-Y110S SEQ ID NO: 108 in which the Y110S mutation occurred was selected.
  • VHH-COVE9-R108K (SEQ ID NO: 109), in which an Ala residue is added to the N-terminal and a His tag sequence (SEQ ID NO: 74) containing a linker is added to the C-terminal.
  • VHH-COVE9-N109D (SEQ ID NO: 110)
  • VHH-COVE9-Y110S (SEQ ID NO: 111) were expressed.
  • the gene for each VHH was synthesized by Eurofins Scientific and introduced into an expression plasmid.
  • the synthesized VHH clone gene and an empty expression plasmid were treated with two restriction enzymes SfiI and ApaI (both Thermo Fisher), and the DNA of the target fragment was isolated and purified by agarose gel electrophoresis. Then, the restriction enzyme-treated VHH clone gene and the expression plasmid were ligated using Ligation Mix (Toyobo), and the ligation product was transformed into the cloning competent cell JM109 strain. A plasmid was extracted from the transformed Escherichia coli to obtain a plasmid for expressing a VHH clone.
  • SfiI and ApaI both Thermo Fisher
  • the collected culture supernatant was filtered using a PVDF membrane (Merck Millipore), and then purified using Ni-NTA agarose beads (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the instruction manual for the product.
  • His-tag elution buffer 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 7.5
  • TOMY centrifuge
  • Example 21 Measurement of binding activity by biolayer interferometry VHH-COVE9-R108K (sequence) for SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-Fc recombinant protein (SinoBiological) by the same method as in Example 6.
  • the equilibrium dissociation constants ( KD ) for the Spike S1 protein of each VHH clone are shown in Table 20.
  • Example 22 Measurement of neutralizing activity of VHH-COVE3 against SARS-CoV-2 mutant strains The neutralizing activity of Bacillus subtilis-derived VHH-COVE3 against SARS-CoV-2 alpha type and delta type mutant strains was measured.
  • Antibodies were prepared to a concentration of 150 ⁇ g / mL by mixing with 2% Fetal Bovine Serum (FBS) / Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM). Further, 100 ⁇ L of VHH clone mixture and 100 ⁇ L of 2% FBS / DMEM were mixed to prepare a 3-fold diluted solution, and a 3-fold diluted series solution of the antibody was prepared.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle's Medium
  • the culture supernatant was collected 1 day after the start of the culture, and the number of copies of the virus genome in the supernatant was quantified by quantitative PCR.
  • SARS-CoV-2 Detection Kit (Toyobo) was used for quantitative PCR.
  • 3 ⁇ L of the culture supernatant is mixed with 3 ⁇ L of the pretreatment solution, and 3 ⁇ L of the mixture is added to the RT-PCR reaction solution (15 ⁇ L of the reaction solution, 2.5 ⁇ L of the enzyme solution, 2.5 ⁇ L of the primer / probe solution), and LightCycler (registered trademark).
  • Quantitative PCR was performed at 96.
  • the reaction conditions were reverse transcription reaction 42 ° C. for 5 minutes, pre-denaturation 95 ° C. for 10 seconds, cycle reaction [denaturation 95 ° C. for 1 second, association 50 ° C. for 3 seconds, extension 55 ° C. for 10 seconds] for 45 cycles. gone.
  • Figure 12 shows the results of the number of viruses in cells obtained by the quantitative PCR method. As a result, it was clarified that VHH-COVE3 exhibits neutralizing activity against both SARS-CoV-2 alpha type and delta type, and also exhibits binding activity to these viruses.
  • Example 23 Measurement of competitive inhibitory activity against binding of SARS-CoV-2 kappa type mutant strain (L452R, E484Q, B.1.617.1 strain) and ACE2
  • SARS-CoV-2 kappa type mutant strain L452R, E484Q, B.1.617.1 strain
  • ACE2 ACE2
  • a competitive inhibition evaluation for the binding between RBD (L452R, E484Q) derived from the SARS-CoV-2 kappa type mutant strain and human ACE2 was carried out.
  • VHH-COVE3 prepared at 20 ⁇ g / mL in Kinetics buffer (PBS containing 0.05% Protein20, pH 7.4) was immobilized by incubating it in an Anti-Penta-HIS (HIS1K, Forestbio) sensor chip for 120 seconds.
  • SPD-C525e SARS-CoV-2 Spike RBD recombinant protein
  • AcroBiosystems AcroBiosystems
  • the mixture was immersed in a mixed solution of SPD-C525e and AcroBiosystems solution (25 ⁇ L) and 20 ⁇ g / mL ACE2 (50 ⁇ L, reference well), respectively, and after 120 seconds, binding was confirmed, and then the mixture was immersed in a buffer solution for 120 seconds.
  • FIG. 13 shows the result of data processing using the sensor chip with the ACE2 fixed as a reference.
  • the response to the binding response between VHH-COVE3 and RBD fixed to the sensor chip clearly disappeared in the mixed solution of RBD and ACE2. Since VHH-COVE3 clearly inhibited the binding between ACE2 and RBD derived from the kappa-type mutant strain, it was found that VHH-COVE3 also has neutralizing activity against the kappa-type mutant strain.
  • Example 24 Measurement of competitive inhibitory activity against binding of RBD (L452R, T478K, B.1.617.2 strain) derived from SARS-CoV-2 delta type mutant strain Octet 384 with respect to VHH-COVE3 derived from bacillus.
  • RBD L452R, T478K, B.1.617.2 strain
  • VHH-COVE3 prepared at 20 ⁇ g / mL in Kinetics buffer (PBS containing 0.05% Protein20, pH 7.4) was immobilized by incubating it in an Anti-Penta-HIS (HIS1K, Forestbio) sensor chip for 120 seconds.
  • SPD-C525e SARS-CoV-2 Spike RBD recombinant protein
  • AcroBiosystems AcroBiosystems
  • the mixture was immersed in a mixed solution of SPD-C525e and AcroBiosystems solution (25 ⁇ L) and 20 ⁇ g / mL ACE2 (50 ⁇ L), respectively, and after 120 seconds of confirmation of binding, the mixture was immersed in a buffer solution for 120 seconds.
  • FIG. 14 shows the result of data processing using the sensor chip with the ACE2 fixed as a reference.
  • the response to the binding response between VHH-COVE3 and RBD fixed to the sensor chip clearly disappeared in the mixed solution of RBD and ACE2. Since VHH-COVE3 clearly inhibited the binding between ACE2 and RBD derived from the delta type mutant strain, it was found that VHH-COVE3 also has neutralizing activity against the delta type mutant strain.
  • Example 25 Measurement of sedative activity of VHH-COVE9 against SARS-CoV-2 alpha mutant strain in hamster body
  • 12 male Syrian hamsters hereinafter referred to as hamsters
  • 3 anesthetics hydrochloride
  • SARS-CoV-2 alpha mutant strain (10 3.5 TCID 50 / head)
  • atipamezole was intraperitoneally administered to the hamster to recover from sedation.
  • VHH-COVE9 was administered by concentration (20 mg / kg, 4 mg / kg, 0.8 mg / kg).
  • concentration 20 mg / kg, 4 mg / kg, 0.8 mg / kg.
  • albumin-added PBS used to dilute VHH-COVE9 was nasally administered to 3 hamsters.
  • Hamsters were weighed daily from immediately after virus administration to 4 days later.
  • FIG. 15 shows the results of the evaluation of the neutralization activity of VHH-COVE9 in the hamster body.
  • Controls without VHH-COVE9 confirmed a clear weight loss associated with SARS-CoV-2 infection.
  • Administration of 0.8 mg / kg VHH-COVE9 was confirmed to alleviate weight loss.
  • the weight loss associated with SARS-CoV-2 infection was clearly suppressed. That is, it was clarified that VHH-COVE9 has a neutralizing activity (therapeutic effect) on the SARS-CoV-2 alpha type mutant strain.
  • Example 26 Measurement of binding activity of SARS-CoV-2 lambda type mutant strain to RBD With respect to VHH-COVE3, the binding activity of lambda type mutant strain to RBD was evaluated.
  • VHH-COVE3 immobilized beads were prepared according to Example 19.
  • VHH non-fixed beads and VHH-COVE9 immobilized beads were also prepared for control.
  • 12.5 ⁇ g of SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD (L452Q, F490S) Protein (His Tag) (hereinafter referred to as “lambda type RBD”) (Sino Biological) using PBST. Prepared to / mL.
  • VHH-COVE3 immobilized beads, VHH-COVE9 immobilized beads, and VHH non-fixed beads were suspended in a 200 ⁇ L lambda RBD in a 1.5 mL tube, and then slowly stirred. Ten minutes after the start of stirring, 100 ⁇ L of the reaction solution was separated and allowed to stand on a magnet rack until the solution became transparent, and then the supernatant was removed. Next, after suspending the recovered beads in 40 ⁇ L of distilled water, the mixture mixed with the sample buffer of SDS-PAGE is allowed to stand at 100 ° C. for 5 minutes, and the lambda-type RBD adsorbed on the beads is eluted in the sample buffer. Therefore, it was prepared as an elution fraction.
  • No band derived from lambda RBD was confirmed in the elution fractions of the control VHH non-fixed beads and VHH-COVE9 immobilized beads (lanes 2 and 4).
  • a band derived from lambda type RBD was confirmed in the elution fraction of the VHH-COVE3 immobilized beads (lane 3).
  • the above results indicate that the VHH-COVE3 immobilized beads adsorbed the lambda type RBD. That is, it was clarified that VHH-COVE3 has a binding activity with lambda type RBD.
  • Example 27 Measurement of sedative activity of VHH-COVE3 against SARS-CoV-2alpha type mutant strain in hamster body 6 weeks old, 6 male Syrian hamsters (hereinafter referred to as hamsters) mixed with 3 anesthetics (hydrochloride) After intraperitoneal administration of medetomidine (0.15 mg / kg, midazolam 2.0 mg / kg, butorphanol tartrate 2.5 mg / kg) and sedation, SARS-CoV-2 alpha mutant strain (10 3.5 TCID 50 / head) ) was administered nasally. After nasal administration, atipamezole was intraperitoneally administered to the hamster to recover from sedation.
  • VHH-COVE3 was nasally administered to three animals.
  • albumin-added PBS used to dilute VHH-COVE3 was nasally administered to 3 hamsters.
  • Hamsters were weighed daily from immediately after virus administration to 4 days later.
  • FIG. 17 shows the results of the evaluation of the neutralization activity of VHH-COVE3 in the hamster body.
  • a clear weight loss associated with SARS-CoV-2 infection was confirmed.
  • Administration of 8 mg / kg VHH-COVE3 suppressed weight loss. That is, it was clarified that VHH-COVE3 has a neutralizing activity (therapeutic effect) on the SARS-CoV-2 alpha type mutant strain.
  • Example 28 Measurement of sedative activity of VHH-COVE3 against SARS-CoV-2 delta type mutant strain in hamster body 6 weeks old, 6 male Syrian hamsters (hereinafter referred to as hamsters) mixed with 3 anesthetics (hydrochloride) After intraperitoneal administration of medetomidine (0.15 mg / kg, midazolam 2.0 mg / kg, butorphanol tartrate 2.5 mg / kg) and sedation, SARS-CoV-2 delta mutant strain (10 3.5 TCID 50 / head) ) was administered nasally. After nasal administration, atipamezole was intraperitoneally administered to the hamster to recover from sedation.
  • VHH-COVE3 was nasally administered to three animals.
  • albumin-added PBS used to dilute VHH-COVE3 was nasally administered to 3 hamsters.
  • Hamsters were weighed daily from immediately after virus administration to 4 days later.
  • FIG. 18 shows the results of the evaluation of the neutralization activity of VHH-COVE3 in the hamster body.
  • a clear weight loss associated with SARS-CoV-2 infection was confirmed.
  • Administration of 8 mg / kg VHH-COVE3 suppressed weight loss. That is, it was clarified that VHH-COVE3 has a neutralizing activity (therapeutic effect) on the SARS-CoV-2 delta type mutant strain.
  • the present invention is useful in the fields of pharmaceuticals and diagnostic agents.

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Abstract

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチド及びその利用法を提供する。　配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチド。

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド
　本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドに関する。
　ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　２，；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認された急性呼吸器疾患を惹起するウイルスは、その後、新型のコロナウイルスであると同定され、ＣＯＶＩＤ－１９と命名されたが、多様に変異しつつ世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、一般的なコロナウイルスと同様に、４つの構造タンパク質、１６の非構造タンパク質（ｎｓｐ１－１６）、およびいくつかの付属タンパク質をコードする大きなポジティブセンスＲＮＡゲノムを有している。構造タンパク質は、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシド、膜タンパク質、エンベロープタンパク質から成り、スパイクタンパク質は、受容体結合を担うＮ末端のＳ１サブユニットと膜融合を担うＣ末端のＳ２サブユニットから構成される。Ｓ１サブユニットはさらに、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン１（ＳＤ１）、サブドメイン２（ＳＤ２）に分割されている。Ｓ２サブユニットは、さらに、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピート１（ＨＲ１）およびヘプタドリピート２（ＨＲ２）に分割されていることが知られている（非特許文献１参照）。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのスパイクタンパク質を介して宿主細胞受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と結合して細胞内に侵入する。受容体との結合は、スパイク蛋白質の構造変化を引き金とし、活性化状態へと変化させる。活性化されたスパイクは、Ｓ１／Ｓ２部位でプロテアーゼ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではＴＭＰＲＳＳ２）によって切断され、Ｓ１サブユニットが放出され、Ｓ２サブユニット上のＦＰが露出する。ＦＰは標的細胞膜に挿入され、ＨＲ１とＨＲ２とがリフォールドして融合後のコンフォメーションを形成し、標的細胞とのウイルス膜融合を促進することが知られている（非特許文献２参照）。
　最近、低温電子顕微鏡や結晶解析によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２三量体スパイクのプレフュージョンコンフォメーションやＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤと完全長ヒトＡＣＥ２の構造解析が進んでおり、ＡＣＥ２への結合様式の解明やヒトＡＣＥ２とのより強い接触を形成するＲＢＤ上の重要な変異点の知見、更には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤを標的とする交差反応性抗体の同定に向けたエピトープの洞察が提供されている。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質の糖鎖解析から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ同様に多くのグリコシル化部位を有しており、その中でもＳＡＲＳ－ＣｏＶには無い、ユニークなグリコシル化部位も報告されており、この様な特異な糖鎖がエピトープのマスキングを介した免疫回避を促進する可能性があることも報告されている（非特許文献３参照）。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、宿主細胞にウイルスが侵入する際に不可欠な役割を果たしており、中和抗体の主要な標的となる。コロナウイルスＳ１サブユニットの機能性と高い免疫原性のため、これまでにコロナウイルスに対して特徴づけられたほとんどの中和抗体は、Ｓ１、特にＳ１－ＲＢＤを標的としていることが報告されている。また、以前のＳＡＲＳおよびＭＥＲＳの感染の流行中にもいくつかの中和抗体が開発され、コロナウイルス感染症の治療での使用の可能性が証明されている。
　しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　ＲＢＤに特異的な多くの既知の中和抗体（Ｓ２３０、ｍ３９６、８０Ｒなど）は、１μＭまでの濃度でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合せず、一方で、単一のＢ細胞の選別によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者から単離されたモノクローナル抗体はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤと交差反応を示さないことが報告されている。この様に、多くの既存の中和抗体は交差反応性に乏しいが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の両方に中和活性を示す４７Ｄ１１やＳ３０９といったＩｇＧ抗体やシングルドメイン抗体としてＶＨＨ－７２－Ｆｃ等が存在することも報告されている（非特許文献３参照）。
　ＣＯＶＩＤ－１９のウイルス学的診断は、主として遺伝子増幅法（ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子検出（ＰＣＲ検査）によって行われている（以下、「従来技術１」という。）。
　一方で、ウイルスの検出にはＰＣＲとは異なる検査方法があることも知られている。その１つは、ウイルスの遺伝物質を検出するのではなく、ウイルス表面のタンパク質の断片を検出する抗原検査である（以下、「従来技術２」という。）。抗原が検出できれば、高価な機械、検査を行う者に要求される技術に習熟するための訓練、検査に要する多大な労力等がなくても、感染しているかどうかが数分で診断できる。
　その他の検査方法として、血清中のウイルス特異的抗体を検出するイムノクロマト法、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）を利用した血清学的診断法（以下、「従来技術３」という。）等が知られている。
　免疫応答における抗体は、生体が感染によって抗原と接触した後、比較的感染初期に患者の血中で増加するイムノグロブリンＭ（以下、「ＩｇＭ」と略すことがある）と、その後に増加するＩｇＧ等があることが知られている。
　ここで、一般的なＩｇは軽鎖と重鎖とで構成されているが、ラクダ科の動物は、軽鎖を含まない重鎖抗体を産生することが知られている。また、重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメインは、天然のシングルドメインであり、それ自身でも抗体として機能する。このため、「シングルドメイン抗体」（以下、「ＶＨＨ抗体」と略すことがある。）と呼ばれている。
　ウイルスの立体構造エピトープが、例えば、酵素ポケットのような穴状の構造や、ドメイン間の割目の構造部分を含む場合、従来のIgGではその大きさからこうしたエピトープに結合することができなかった。これに対し、上記のVHH抗体は、その分子量がIgG抗体の１０分の１と小さいため、上記のような構造のエピトープにも結合することができ、多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る分子の幅が広くなる。
　さらに、ＶＨＨは耐酸性や耐熱性にも優れており、ＩｇＧとは異なって培養細胞で産生させる必要がなく、大腸菌、酵母等で生産することができる。このため、量産しやすく、精製も容易であるという利点がある。さらに、ＶＨＨ抗体は１本鎖のペプチドで構成されているため、蛋白質工学の技術又は化学修飾等の技術を用いて機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有することが知られている（以下、「従来技術４」という。）。
　　〔非特許文献１〕Neutralizing nanobodies bind SARS-CoV-2 spike RBD and block interaction with ACE2.　Nature Structural & Molecular Biology 2020
　　〔非特許文献２〕Development of multi-specific humanized llama antibodies blocking SARS-CoV-2/ACE2 interaction with high affinity and avidity. Emerging Microbes & Infections 2020; 9; 1034-1036
　　〔非特許文献３〕Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell 2020; 181: 1004-1015.
　　〔非特許文献４〕Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2. Cell Host & Microbe 2020; 27: 891-898
　従来技術１は、ウイルスの遺伝物質を検出する方法で、現時点で使えるウイルス検査の中では最も正確といわれており、精度が高いという点では優れた技術である。しかし、検査を実施するには時間と手間とがかかり、ＰＣＲ検査の実施数を、本当に必要な数まで増加させるのが難しいという問題がある。
　また、従来技術２は、高価な機械、検査を行う者に要求される技術に習熟するための訓練、検査に要する多大な労力等がなくても、感染しているかどうかが数分で診断できるという点では優れた技術である。したがって、信頼できる抗原検査法が確立されれば、検査数の拡大を容易に行うことができる。また、自宅や診療現場においてＣＯＶＩＤ－１９感染の診断ができるようになることから、一刻も早い臨床現場への導入が求められている。しかし、抗体の調製にコストがかかり、検査に必要とされる量を確保することが容易ではないという問題がある。
　従来技術３は、多くの症例において感染から発症までの潜伏期間が長いと考えられているとともに、発症から１週間程度経過した後に症状が急速に悪化して重症肺炎に至るなど、臨床経過が長い症例も報告されているＣＯＶＩＤ－１９の感染においては、経時的に状況を把握できるという点では優れた方法である。しかし、こうした血清学的方法においても、検査には抗体を使用するため、抗原検査と同じ問題を抱えている。
　血清学的診断に用いられる抗体の代表例はＩｇＧであるが、抗原を投与した動物の血清から精製するか、目的のＩｇＧのヌクレオチド配列をコードする遺伝子断片をプラスミド等組み込んで培養細胞に導入し、培養して得るのが一般的な製造法である。このため、精製に時間と手間がかからない、抗体として機能する分子に対する強い社会的要請があった。
　ＶＨＨは、上述したように種々の利点を有しているが、基質との親和性が高いＶＨＨを取得するのが難しい。このため、基質との親和性が高く、産生及び精製がし易く、かつ変異しやすい基質（ウイルスのヌクレオチド配列）に対応できるＶＨＨ、とりわけ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するＶＨＨを取得することについての強い社会的要請があった。
　また、ＩｇＧ抗体は、静脈内投与や皮下投与による全身投与を前提とするため、局所投与に比較して十分な治療効果は望めないという問題がある。一方で、全身への暴露による抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）のリスクも懸念される。さらに、ＶＨＨ－７２－Ｆｃについては、ＶＨＨ単独では十分な中和活性を示さないことが報告されており、Ｆｃフュージョン化によりシングルドメイン抗体の物理的優位性が失われる他、Ｆｃを介した抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）のリスクも懸念される。
　以上から、ＳＡＲＳ関連のコロナウイルスに対して優れた治療効果を示す薬剤を開発するために、多様なエピトープを認識するシングルドメイン抗体の開発についての強い社会的要請があった。
　本発明は、配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドに係るものである。
　一態様として、前記ペプチドは、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体及びＶＨＨ抗体多量体からなる群から選ばれるいずれかである。
　また別の一態様として、前記ＶＨＨ抗体多量体は、前記構造ドメインを複数連結した多量体である。
　また別の一態様として、前記配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して３．６ｘ１０-9Ｍ以下のＫＤを有するものである。
　また別の一態様として、前記構造ドメインは、さらに配列番号１０～１８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号１９～２７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２を含むものである。
　また、本発明の別の態様は、上述したペプチドをコードする核酸である。
　また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法である。
　また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キットである。
　また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを含有する医薬である。
　また、本発明の別の態様は、医薬を製造するための、上述したいずれかのペプチドの使用である。
　また、本発明の別の態様は、医薬として使用するための、上述したいずれかのペプチドである。
　また、本発明の別の態様は、上述したいずれかのペプチドを必要とする対象に投与する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療方法である。
図１は、各ラウンドのセレクション後に出現した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体候補のＣＤＲ３クラスター数の推移を示すグラフである。 図２は、セレクションにより選抜されたＶＨＨクローンの結合性をＥＬＩＳＡで評価した結果を示すグラフである。 図３は、バイオレイヤー干渉法によるＶＨＨクローンの結合特性を示すグラフである。 図４は、得られたＶＨＨクローン間での競合阻害のセンサーグラムである。 図５は、ＶＨＨクローンのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染阻害率を表すグラフである。 図６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性を示すグラフである。 図７は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性を示すグラフである。 図８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イギリス／ナイジェリア変異株に対する結合活性を示すグラフである。 図９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カリフォルニア変異株およびインド変異株に対する結合活性を示すグラフである。 図１０は、ＲＢＤとＡＣＥ２の結合に対する各ＶＨＨクローンの競合阻害を示すグラフである。 図１１は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のインド型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を示すＳＤＳ―ＰＡＧＥである。 図１２は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型およびデルタ型変異株に対する中和活性を示すグラフである。 図１３は、ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｅ４８４Ｑ）とＡＣＥ２の結合に対するＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の競合阻害を示すグラフである。 図１４は、ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｔ４７８Ｋ）とＡＣＥ２の結合に対するＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の競合阻害を示すグラフである。 図１５は、動物体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株に対する中和活性を示すグラフである。 図１６は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のラムダ型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を示すＳＤＳ―ＰＡＧＥである。 図１７は、動物体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株に対する中和活性を示すグラフである。 図１８は、動物体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株に対する中和活性を示すグラフである。
発明の詳細な説明
　本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチド及びその利用法を提供することに関する。
　本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドを得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するＣＤＲ１～３をコンストラクトに含むＶＨＨ抗体ライブラリーから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローンを得ることに成功した。
　本発明によれば、従来の抗体では得られない強力な中和能などを有する抗体医薬の創出に寄与し得る、反応性の高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドを提供することができる。当該ペプチドを用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の迅速な検出が可能となる。
　また、感染部位である上気道や肺に直接吸入器で局所投与できる、呼吸器感染症治療剤の創薬に寄与できるペプチドを提供することができる。
　本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド（以下、「本発明のペプチド」と称する）は、配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドである。
　ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）であり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。本発明のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するペプチドであるが、詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のうちのＳ１サブユニットに結合するペプチドである。
　本発明のペプチドとしては、エピトープに潜在的に結合する能力を有するペプチドが挙げられ、代表的には抗体又は抗体フラグメントが該当する。「抗体」とは、液性免疫を担う抗体産生細胞から産生される、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの他、重鎖抗体、一本鎖抗体、ＳｃＦｖ、重鎖抗体のＣＤＲ３配列を含むシングルドメイン抗体（以下、「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨ抗体」ということがある。）、体内に侵入した病原体などの異物に結合し得るアプタマー、及びこれらの一部が修飾・改変されたものを含むものとする。
　本明細書において、「ＣＤＲ３クラスター」とは、相補性決定領域の一つであるＣＤＲ３のアミノ酸配列を対象として、ＣＤ－ＨＩＴ（Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｄａｔａｂａｓｅ　ａｔ　Ｈｉｇｈ　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）その他の配列クラスタリングプログラムを用いて、８０％　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ（クラスタリングの閾値）を一集団として定義したものとする。
　本発明のペプチドは、少なくとも３つの相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」ということがある。）及び複数のフレームワーク領域を含む。ＣＤＲは超可変領域とも云われ、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含む領域をいう。そして、各ＣＤＲの位置関係は、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順番となっている。また、上記フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　Ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＦＲ」ということがある。）は、抗体分子の可変領域における相補性決定領域を除く領域、すなわち、保存性の高い領域をいい、上記フレーム指す上記のＣＤＲ１～ＣＤＲ３の５’側及び３’側の双方に位置していてもよい。
　本発明のペプチドは、上記ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のうち、ＣＤＲ３が、例えば、下記表１に示す配列のうちのいずれか、又はこれらのアミノ酸配列の少なくとも１つが他のアミノ酸に置換されているものである。ここで、置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類は、これらのアミノ酸配列の抗原との解離定数が１００ｎＭ以上とならない限り、限定されないが好ましくは１個の置換である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　斯かるＣＤＲ３を有するペプチドは、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（ＣｏＶＨＨ））である。
　なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価することができる。具体的には、後述する実施例に示すように、バイオレイヤー干渉法により、解離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、表面プラズモン共鳴測定法等を用いた方法によっても評価することができる。本発明における解離定数ＫＤは、バイオレイヤー干渉法によって求めたものとする。
　上記ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～９のうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性の点から、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９が好ましい。
　本発明のペプチドの構造ドメインにおいて、例えば、ＣＤＲ１は、配列番号１０～１８のいずれかで示されるアミノ酸配列であってもよく、ＣＤＲ２は、配列番号１９～２７のいずれかで示されるアミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸配列は、これらのアミノ酸配列を構成するアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。
　例えば、上記ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～９の構造ドメインにおける３つの相補性決定領域のアミノ酸配列は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、ＦＲ１は配列番号２８～３４に示すアミノ酸配列であってもよく、ＦＲ２は配列番号３５～４２に示すアミノ酸配列であってもよい。ＦＲ３は、配列番号４３～５０に示すアミノ酸配列であってもよく、ＦＲ４は配列番号５１～５３に示すヌクレオチド配列で規定されるアミノ酸配列であってもよい。
　また、ＦＲ１～ＦＲ４は、上記の配列番号２８～５３に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。ここで、配列番号２８～５３に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号２８～５３に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有する配列であることがより好ましく、さらに好ましくは９０％以上である。９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域であることが、さらに好ましい。
　ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、例えばＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
　本発明のＣＤＲ３の配列を含むペプチドとしては、例えば、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に連結されたものを挙げることができる。これらの領域のアミノ酸配列は、上述したとおり、配列表の配列番号１～５３で示され、前述したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の当該領域のアミノ酸配列は、配列番号６５（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１）、配列番６６（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２）、配列番号６７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３）、配列番号６８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４）、配列番号６９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５）、配列番号７０（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６）、配列番号７１（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７）、配列番号７２（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８）、配列番号７３（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９）に示すものとなっている。
　本発明のペプチドは、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、ＶＨＨ抗体のような可変領域断片（ナノボディーとも呼ばれる）の他、一本鎖抗体、重鎖抗体、可変領域断片をペプチドリンカーなどで結合させた多量体、例えば二量体であってもよい。
　本発明のペプチドの作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明のペプチドをコードする核酸を適当なベクター（例えば、プラスミド）に組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換えペプチドとして産生させる方法が好ましい。
　ここで、本発明のペプチドの発現用プラスミドとしては、各種の宿主細胞に適したプラスミドを用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３その他の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４その他の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５その他の酵母由来ベクター；λファージその他のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスその他のウイルスベクターの他、これらを適宜改変したベクターを用いることができる。
　これらの発現プラスミドは、各々のプラスミドに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現プラスミドには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
　本発明のペプチド産生菌は、所望の方法、例えば、エレクトロポレーションによって、上記の発現プラスミドを所望の菌に導入することにより作製できる。組換えペプチドの産生に使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、コリネ菌、各種のカビ、動物細胞、植物細胞その他の細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等を挙げることができる。これらのうちでも、コリネ菌と枯草菌が好適に使用でき、生産性が高い枯草菌がより好ましい。
　発現させた本発明のペプチドを培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のペプチドを取得することができる。
　公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
　本発明のペプチドは、後述する実施例に示すように、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いてＶＨＨ抗体候補配列を選抜することにより見い出されたものである。以下にこの方法を用いた場合の抗体の取得について、記載する。
　標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１－Ｈｉｓリコンビナントタンパク（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク」と略す、Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をスクリーニング用の標的分子として用いた。ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されているアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリー遺伝子を鋳型として、ＣＤＲ１－２領域またはＣＤＲ３領域の２つの遺伝子断片をＶＨＨ特異的プライマーにてＰＣＲで増幅し、オーバーラップＰＣＲ用プライマーを用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを作製する。
　ここで使用するＶＨＨ特異的プライマーとしては、例えば、配列表の配列番号５４及び５５を挙げることができる。また、オーバーラップＰＣＲ用プライマーしては、例えば、配列表の配列番号５６及び５７を挙げることができる。上記のライブラリーを構成するＤＮＡ断片は、Ｔ７プロモーター、オメガ（Ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）を含むことが好ましい。
　以上のようにして得られたライブラリ（ＰＣＲ産物）を精製し、引き続き転写を行う。上記ライブラリーの精製には、市販のキット、例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）等を用いることができる。また、転写には、市販のキット、例えば、Ｔ７　ＲｉｂｏＭＡＸ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等を使用することができる。その後、例えば、ＮａｎｏＰａｄ　ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）等を使用して、ＲＮＡを定量する。
　得られたｍＲＮＡをｃｎｖＫ又はその類縁体等の光架橋塩基を含むピューロマイシンリンカーと、所望の波長の光を所望の時間、例えば、３３０～３７０ｎｍの光を１～１０分間照射して連結させ、ｍＲＮＡ－リンカー連結体を得る。得られたｍＲＮＡ－リンカー連結体を用いて無細胞翻訳を行い、ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成する。この無細胞翻訳には、例えば、Ｒａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の市販品を使用することができる。
　次いで得られたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を磁性ビーズに固定化する。こうしたビーズとしては、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍｙ　Ｏｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などを使用することができる。上記磁性ビーズに固定されなかった上記ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を除き、逆転写反応を行うことによって、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成する。
　次いで、磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を、例えば、ＲＮａｓｅ　Ｔ１を含むＨｉｓ－ｔａｇ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを添加して溶出させ、Ｈｉｓ－ｔａｇ精製を行い、精製後したｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を得ることができる。
　所望の標的分子、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクを、例えば、上述した磁性体ビーズに固定化するために、常法に従って上記標的分子をビオチン化する。このようにビオチン化された標的タンパクは、上記のビーズに固定されたストレプトアビジンと結合するため、標的分子をビーズ上に固定することができる。固定化前後の溶液のタンパク濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のバンド強度比を比較することによって、上記の固定化反応の収率を確認することができる。
　次いで、上記のようにして得られたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイ分子）と、標的分子、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク、を固定化したビーズとを用いて、試験管内淘汰セレクションを行う。このセレクションは複数回繰り返すことが得られるＶＨＨの配列が収束することから好ましく、３～６ラウンド繰り返すことがセレクションの効率を上げるために好ましい。
　このセレクションでは、ｃＤＮＡディスプレイ法を使用するが、各ラウンドで使用するｍＲＮＡ－リンカー連結体の量を調節するとともに、必要に応じて非特異的吸着物を除去するためプレセレクションを行うことが好ましい。また、各ラウンドでの溶出に使用する溶出液及び溶出回数は、適宜選択することができる。例えば、ラウンド１とそれ以降のラウンドの溶出回数を変えてもよく、また、各ラウンドで複数の溶出バッファーを用いてもよい。得られた溶出液は、例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、精製産物を得ることができる。
　次いで、セレクションで得られた精製産物をＰＣＲに供し、増幅させてＰＣＲ増幅産物を得ることができる。得られたＰＣＲ増幅産物を、例えば、上記の磁性ビーズに上記と同様にして固定化し、ＦＩＴＣで標識されたＦＡＣＳソーティング用ビーズを得ることができる。上記標的タンパク固定化ビーズの領域の同定を行う。最適な分取条件にてソーティングを行って、所望の粒子数、例えば、それぞれ５０万粒子を回収し、上記と同様に精製する。得られた粒子を、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅し、上記と同様に精製する。
　その後、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を利用したシーケンス解析を行い、試験管内淘汰サイクルによるＤＮＡライブラリーの収束度を詳細に確かめる。シーケンスサンプルの調製は、例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が提供している２－ｓｔｅｐ　ＰＣＲ　Ａｍｐｌｉｃｏｎ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎに準じて行うことができる。各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、所望のプライマーを、例えば、配列番号６０及び６１に示すプライマーを用いて、アンプリコンＰＣＲを行うことができる。
　以上のようにしてＡｍｐｌｉｃｏｎ　ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を上記と同様にして精製し、その後、Ｉｎｄｅｘ　ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を上記と同様に精製した後、ゲル電気泳動によってＰＣＲ産物のサイズを確認する。この後、例えば、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＰＣＲ産物の定量を行い、例えば、下記の式（１）に従ってモル濃度を算出し、得られた値に基づいて、ＮＦＷで希釈して所望の濃度、例えば、４ｎＭに調製する。
（数１）
　ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０6＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］　　（１）
　推奨プロトコルに従ってライブラリー濃度を調整し、変性・希釈済みのサンプルライブラリー及びコントロールの濃度を所望の最終濃度に調製する。その後、例えば、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｎａｎｏ　Ｋｉｔ　ｖ２５００　ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行うことができる。
　引き続き、得られたＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供し、ＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳する。これらの翻訳データから、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測し、その後、相補性決定領域の一つ、例えば、ＣＤＲ３の配列を対象とし、例えば、上記配列クラスタリングプログラムＣＤ－ＨＩＴ等を用いて、所望の類似度を８０％以上を同一クラスターとしてクローン数を計測し、各ラウンドのクラスター数を求めることができる。
　ＦＡＣＳソーティングのデータ比較等から非特異的結合と考えられるクローンを除去した後、標的分子に結合するＶＨＨ抗体候補配列を選抜する。選抜されたＶＨＨ抗体候補配列を所望のプライマー、例えば、配列番号６３及び６４で表されるプライマーを用いてＰＣＲで増幅させ、得られたＰＣＲ増幅産物を精製して、ＶＨＨ抗体作成用の遺伝子を調製する。得られた遺伝子から無細胞翻訳系でポリクローナルＶＨＨ抗体を作製する。得られたポリクローナルＶＨＨ抗体の抗体価は、例えば、常法に従ってＥＬＩＳＡにより評価することができる。
　ＥＬＩＳＡ評価で結合が認められたＣＤＲ３配列を含むＶＨＨクローンをタンパク発現させるには、上述した試験管内スクリーニングのＲ５のＤＮＡライブラリーから各ＶＨＨの遺伝子を調製し、発現用プラスミドに導入する。目的断片のＤＮＡは制限酵素を用いて切り出し、発現プラスミドにライゲーションさせて組換えプラスミドを調製し、所望の菌、例えば、大腸菌を形質転換する。形質転換した大腸菌から上記組換えプラスミドを抽出して発現プラスミドを得ることができる。得られた発現プラスミドを所望の菌に導入し、得られた抗体産生菌を抗生物質を含む培地で前培養し、その後本培養して培養上清を回収する。ＶＨＨの産生はゲル電気泳動等で確認することができる。回収した培養上清をＨｉｓ－タグ精製し、ＶＨＨ抗体試料とすることができる。
　本発明のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することから、これを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
　具体的には、本発明のペプチドを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明のペプチドと被検試料とを接触させ、本発明のペプチドと前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
　また、本発明のペプチドは、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認するペプチドとして使用することもできる。
　被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液，咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。本発明のペプチドは固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
　上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明のペプチドとは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
　また、本発明のペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断薬として、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
　当該検出キットは、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドの他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
　当該検出キットにおいて、本発明のペプチドは固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェルを有する基板（以下、「ウェル基板」という）が挙げられ、本発明のペプチドが直接的又は間接的に固定される。
　本発明のペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１サブユニットに結合し、ウイルスの細胞への結合を阻害する場合には、本発明のペプチドは、哺乳動物に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療するための医薬として利用することができる。上記哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等を挙げることができるが、ヒトであることが好ましい。
　本発明のペプチドを医薬として用いる場合には、その投与形態は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤等と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、静脈内、皮下、皮内、筋肉内等への投与、噴霧その他による粘膜への投与等を挙げることができる。
　こうした投与は、医薬中に含まれる本発明のペプチドの含有量を適宜調整し、また、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で投与することとしてもよい。
　本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
　＜１＞配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド。
　＜２＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドが、ＶＨＨ抗体、及び重鎖抗体及びＶＨＨ抗体多量体からなる群から選ばれるいずれかである、＜１＞に記載のペプチド。
　＜３＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、請求項２に記載のペプチド。
　＜４＞配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して３．６ｘ１０-9Ｍ以下のＫＤを有する、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のペプチド。
　＜５＞構造ドメインが、さらに配列番号１０～１８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号１９～２７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２を含む、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載のペプチド。
　＜６＞前記表２に記載の配列番号１～２７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む構造ドメインを１つ以上有する、１）～９）から選ばれる、＜５＞に記載のペプチド。
　＜７＞＜１＞に記載のペプチドをコードする核酸。
　＜８＞＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のペプチドを被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
　＜９＞＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のペプチドを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
　＜１０＞＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のペプチドを含有する医薬。
　＜１１＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための＜１０＞に記載の医薬。
　＜１２＞医薬を製造するための、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のペプチドの使用。
　＜１３＞医薬がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための医薬である、＜１２＞に記載の使用。
　＜１４＞医薬として使用するための、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のペプチド。
　＜１５＞医薬がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための医薬である、＜１４＞に記載のペプチド。
　＜１６＞＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のペプチドを必要とする対象に投与する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療方法。
（実施例１）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シングルドメイン抗体のスクリーニング
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
　標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１－Ｈｉｓリコンビナントタンパク（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク」と略す、Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。
２．ｃＤＮＡディスプレイの合成
（１）完全長アルパカ由来抗体の可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ａ　Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＶＨＨ）コード化ＤＮＡライブラリーの作製
　ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されているアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリー遺伝子を鋳型として、ＣＤＲ１－２領域またはＣＤＲ３領域の２つの遺伝子断片をＶＨＨ特異的プライマー（配列番号５４、５５）にてＰＣＲで増幅した後、Ｔ７プロモーター、オメガ（ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）からなるＤＮＡ断片へと調整するため、オーバーラップＰＣＲ用プライマー（配列番号５６、５７）を用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。１．４ｍＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った上清の除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、１００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で２分間静置した後、上清を回収した。
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写
　Ｔ７　ＲｉｂｏＭＡＸ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｔ７　２ｘ　Ｂｕｆｆｅｒ，２０ｐｍｏｌ　ＰＣＲ産物、５μＬのＥｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘを混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１　ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮＡｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。チューブに入れた転写産物μＬあたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングして混合し、その後５分間静置した。磁性プレート上で静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置してビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ　ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
（３）ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーの連結
　４μＬの０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４μＬの１Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのｃｎｖＫ　ｒｉｂｏ　Ｇ　ｌｉｎｋｅｒを混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒで２０μＬになるように反応液を調製した。アニーリングは、ＰｒｏＦｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートという条件下で行った。Ｒａｍｐ　ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ　ＵＶ　Ｌａｍｐ（６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、測定波長を２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ；Ａｎａｌｙｔｉｋ　ｊｅｎａ　ＵＳ、Ａｎ　Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて３６５ｎｍの波長の光を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
（４）無細胞翻訳
　ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＲａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。１０．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ、１５μＬの２０ｘ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｍｉｘ，５２５μＬのＲａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ、１５μＬのＲＮａｓｉｎ（商標）　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、９μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ　ＫＣｌ、１Ｍ　ＭｇＣｌ2）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
（５）ストレプトアビジン磁性体ビーズへの固定化
　６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍｙ　Ｏｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２ｘ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ　ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
（６）逆転写反応
　５５．５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ、１．５μＬの５ｘ　ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３μＬの２５ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ、１．５μＬのＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（１００Ｕ／μＬ）（Ｔｏｙｏｂｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を混合した。上記の反応液にストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
（７）磁性体ビーズからの切り出し
　ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して，Ｈｉｓ－ｔａｇ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ　ＲＮａｓｅ　Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
（８）Ｈｉｓタグ精製
　３０μＬのＨｉｓ　Ｍａｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｎｉ　Ｂｅａｄｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ペプチド連結体の溶出液とＨｉｓ　Ｍａｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｎｉ　Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作を２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出した。
３．セレクション
（１）標的分子の磁性ビーズへの固定化
　標的分子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクを固定化するため、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍｙ　Ｏｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃ１を使用し、以下の手順にて固定化した。まず、２５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクに１００μＬの１ｘ　ＰＢＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、本溶液に１ｍＭのＥＺ－ＬｉｎｋTM　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎ溶液を６．５μＬ加え、室温にて３０分間インキュベートした。反応溶液をＺｅｂａTM　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）にて精製し、Ｂｉｏｔｉｎ化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク１１６μＬを回収した。
　２０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍｙ　Ｏｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃ１をエッペンドルフチューブにとり、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１ｘ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ　ＮａＣｌ，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を１００μＬ加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。２５μＬのビオチン化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク溶液を加え、室温にて３０分間撹拌し、磁気プレート上に１分間静置した後、１００μＬの１ｘ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ、１００μＬのＰＢＳＴで順次洗浄し、１００μＬのＰＢＳＴを加え、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク固定化ビーズ溶液を得た。固定化反応の収率は、ＮａｎｏＰａｄ　ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）を用いて固定化前後の溶液のタンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のバンド強度比を比較することにより推定した。
（２）試験管内淘汰セレクション
　上記２－（８）にて合成されるｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイ分子）と上記３－（１）にて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク固定化ビーズを用いて、試験管内淘汰セレクションを下記表４に示す条件、以下の手順にてＲｏｕｎｄ　１～５（Ｒ１～Ｒ５）まで繰り返し行った。ｃＤＮＡディスプレイ合成では、（Ｒ１）では１９２ｐｍｏｌ、Ｒ２では、１２ｐｍｏｌ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５では６ｐｍｏｌのｍＲＮＡ／Ｌｉｎｋｅｒ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔを用いた。（Ｒ２）～（Ｒ５）においては、非特異的吸着物を除去するためプレセレクションを実施した。すなわち、調製したｃＤＮＡディスプレイ分子をＰＢＳＴで１００μＬの希釈溶液とし、予め１ｘ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄したストレプトアビジン結合磁性体ビーズに結合させ、室温にて１～２時間撹拌した後、磁気スタンドに２分間静置し、上清を回収した。この操作を１～２回行った後、得られた上清をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクの固定化量に対して、ＰＢＳＴで（Ｒ１）は１μＭ、（Ｒ２）～（Ｒ４）は１００ｎＭになるように希釈した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１固定化ビーズに結合させ、室温にて１～２時間撹拌した。磁気スタンドに２分間静置した後、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴで磁気ビーズを洗浄した。
　洗浄操作を１～３回繰り返した後、４０μＬの１０ｍＭ　ＴＣＥＰバッファー（ｐＨ　７～８）、１０ｍＭ　ＮａＯＨ溶液、１％ＳＤＳ含有ＰＢＳＴ溶液、もしくは、２０μＬの１μＭ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク溶液を溶出バッファーとして加え、室温で５～３０分間インキュベートし、溶出液を回収した。各ラウンドの溶出回数は、（Ｒ１）で４回、（Ｒ２）～（Ｒ５）で３回行った。尚、（Ｒ１）及び（Ｒ２）は、最初の２回はＴＣＥＰバッファーで溶出し、３回目にＮａＯＨ溶液、（Ｒ１）の４回目は、１％ＳＤＳ含有ＰＢＳＴで溶出した。（Ｒ３）～（Ｒ５）については、最初の２回は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク溶液で溶出し、３回目はＴＣＥＰバッファーで溶出した。得られた溶出液をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（３）セレクションサンプルのＰＣＲ増幅
　上記の淘汰セレクションで得られた溶出サンプルをＰＣＲに供した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）を用いて、下記表５に示す組成のＰＣＲ反応液を調製して、これを加え、ＰＣＲを行った。反応条件は、９８℃で２分間の後、９８℃で１０秒、６２℃で５秒、７２℃で３５秒を２５サイクル行い、７２℃で１分反応させた後に１０℃まで冷却した。Ｔ７ｏｍｅｇａ＿Ｎｅｗプライマーは、配列番号５８、ＮｅｗＹｔａｇ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙＡ　ｃｎｖＫプライマーは配列番号５９の配列を有するものを使用した（表６参照）。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（４）ＦＩＴＣビーズの作製
　２０μＬのストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍｙ　Ｏｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をエッペンドルフチューブにとり、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１ｘ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。１０μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ（５－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２０μＬ加え、室温で１時間撹拌した後、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。ＰＢＳＴを１００μＬ加え、ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。この操作を２回繰り返した後、１．８μＬのＰＢＳＴを加え、ＦＩＴＣビーズ溶液を得た。
（５）ＦＡＣＳによるソーティング
　上記の手法で調整した８μＬのＦＩＴＣビーズと４μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク固定化ビーズを混合し、磁気プレート上に１分間静置した後、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴを加え、再懸濁した。ピペッティングを１分間行った後に、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去し、ＦＡＣＳソーティング用ビーズを調整した。得られたビーズに（Ｒ５）のＰＣＲ増幅産物から調整した５０μＬのｃＤＮＡ　ｄｉｓｐｌａｙ溶液（６ｐｍｏｌ）を混合し、室温で３０分間撹拌した後、磁気スタンドに２分間静置し、上清を除去し、１００μＬのＰＢＳＴを加えて、ピペッティングを１分間行った。その後、磁気プレート上に１分間静置して上清を除去した。この操作を３回繰り返した後、１ｍＬのＰＢＳＴを加えてソーティング用溶液とした。
　得られたソーティング用溶液をＦＡＣＳ（Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ　ＳＨ８００：ＳＯＮＹ）にセットし、サンプル流路、分取時のドロップレット形成条件のセットアップを行い、ソーティングを実施した。粒子径から磁性体ビーズの領域を同定し、４８８ｎｍのレーザー照射による蛍光強度からＦＩＴＣビーズとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク固定化ビーズの領域の同定を行い、最適な分取条件にてソーティングを行って、それぞれ５０万粒子をエッペンドルフにて回収した。その後、１３，０００ｘｇで１０分間、遠心分離を行った。遠心後、磁気プレート上に１０分間静置し、その後、上清を除去し、４０μＬの溶出バッファーを加えて１０分間振とうした。引き続き、磁気プレート上に２分間静置した後、溶出液を回収した。得られた溶出液をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。
（６）ＦＡＣＳ分離サンプルのＰＣＲ増幅
　上記と同様の手法により、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰを用いて、当該製品の使用説明書に従って、得られたＰＣＲ産物を精製した。
（７）アンプリコンシーケンスの実施
　試験管内淘汰サイクルによるＤＮＡライブラリーの収束度を詳細に確かめるために、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を利用したシーケンス解析を行った。シーケンスサンプルの調製は、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が提供している２－ｓｔｅｐ　ＰＣＲ　Ａｍｐｌｉｃｏｎ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの方法を参考に実施した。最初に、各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、下記表７に示す組成のＰＣＲ反応液を調製し、下記の配列番号６０及び６１に示すプライマー（表８参照）を用いて、Ａｍｐｌｉｃｏｎ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６２℃で５秒間、７２℃で３５秒を１５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した後、Ｉｎｄｅｘ　ＰＣＲを行った。Ａｍｐｌｉｃｏｎ　ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳型として、下記表９に示す組成のＰＣＲ反応液を調整して、Ｉｎｄｅｘ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１７秒を１０サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰを用いて当該製品の使用説明書に従って精製した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認した。その後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＦＷで希釈することで４ｎＭに調製した。
　ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０6＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
　４ｎＭライブラリーを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルライブラリーの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また，サンプルライブラリー中のＰｈｉＸ　Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｎａｎｏ　Ｋｉｔ　ｖ２５００　ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
（８）ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列の抽出とＣＤＲ３クラスター解析
　ＭｉＳｅｑ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。得られた翻訳データから、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測後、ＣＤＲ３クラスター数を計測し、各ラウンドのクラスター数を求めた。結果、ラウンドを重ねる毎にクローン数が減少し、良好な淘汰セレクションが実行できていることが確認できた（図１）。
（９）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶＨＨ抗体候補配列の選抜
　ＦＡＣＳソーティングのデータ比較等から非特異的結合と考えられるクローンを除去した後、Ｒ５に出現したＣＤＲ３クラスターを対象として、ラウンド間での頻度上昇率（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を算出し、Ｒ４からＲ５にかけて出現頻度が１０倍以上上昇したＣＤＲ３クラスターを抽出した結果、下記表１０に示す９個のＣＤＲ３クラスターが該当した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（実施例２）無細胞翻訳系によるポリクローナルＶＨＨ抗体の作製
（１）遺伝子の調製
　試験管内スクリーニングのＲ５で得られたＰＣＲ産物を鋳型として、Ｎｅｗｌｅｆｔプライマー（配列番号６２）と上記で選択されたＣＤＲ３配列を含む特異的プライマー９種類を用いて、ＰＣＲを行った。その後、上記ＮｅｗｌｅｆｔプライマーとＣＤＲ３以降のＦＲ４配列とＨｉｓタグ配列を含むプライマーでＣ末端を延長し、最後にＰＵＲＥｆｌｅｘシステム合成用に設計したＰＵＲＥ＿Ｓｙｓｔｅｍ＿ＦＷプライマー（配列番号６３）、ＰＵＲＥ＿Ｓｙｓｔｅｍ＿Ｒｖプライマー（配列番号６４）を用いてＰＣＲを行った（下記表１１参照）。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰを用いて精製し、ポリクローナルＶＨＨ抗体作製用の遺伝子を９種類調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（２）無細胞翻訳合成
　上記（１）で調製した遺伝子を鋳型ＤＮＡとし、ＰＵＲＥｆｌｅｘ１．０（Ｇｅｎｅｆｒｏｎｔｉｅｒ）のプロトコルに従って、下記表１２の組成にて反応溶液を調製し、３７℃で３～４時間インキュベートし、ポリクローナルＶＨＨ抗体を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（３）Ｈｉｓタグ精製
　３０μＬのＨｉｓ　Ｍａｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｎｉ　Ｂｅａｄｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。その後、２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作を２回行った。上記（１）で調製した無細胞翻訳液２０μＬをＨｉｓ　Ｍａｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｎｉ　Ｂｅａｄｓを入れたチューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。このチューブに２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングして懸濁させた。このチューブを磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作を２回行った。２０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０、ｐＨ７．４）をこのチューブに添加し、室温で１５分間インキュベートした。磁気プレート上で１分間静置し、上清を回収した。この溶出操作を２回行った。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液をチューブに加えて２００μＬとなるように希釈し、ポリクローナルＶＨＨ抗体試料溶液を得た。
（実施例３）ＥＬＩＳＡでの評価
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓ１　ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ溶液（Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｖｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で２μｇ／ｍＬに希釈した。この溶液を、イムノモジュール（Ｉｍｍｕｎｏ　Ｃｌｅａｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｏｄｕｌｅｓ＿Ｃ８＿ＭａｘｉＳｏｒｐ（ｃａｔ＃４４５１０１，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の各ウェルに１００μＬ添加し、シーリング後、４℃で一晩静置して上記のＳ１タンパクを固相化した。このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、各ウェルに３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を３００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、その後、Ｓ１タンパク質を固相化した上記モジュールの各ウェルに対して上記実施例２（３）で調整したポリクローナルＶＨＨ抗体試料溶液を１００μＬ添加し、室温で振盪した。その後、このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。
　１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を用いてＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ｔａｇ　ｍＡｂ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨＲＰ（ｃａｔ＃　Ａ８５９２，　Ｓｉｇｍａ）を１／１０，０００に希釈した。次いで、上記各ウェルに対して、この希釈液を１００μＬずつ添加し、ウェルプレートを遮光し、室温で１時間振盪した。このモジュールを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。ＯＰＤタブレット（ｃａｔ＃　１５５－０２１６１，　ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、１０ｍＬの０．１Ｍ　ＮａＨ2ＰＯ4で溶解し、５μＬの３０％Ｈ2Ｏ2を加えてＯＰＤタブレット溶液を調製した。洗浄後、各ウェルに対してＯＰＤタブレット溶液を１００μＬずつ添加し、遮光下で５分間インキュベートした。１００μＬの１Ｍ　硫酸を添加し、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ　Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　２００Ｐｒｏ　Ｍ　ＰＬＥＸ（ＴＥＣＡＮ）を用いて各ウェルの吸光度を４９０ｎｍで測定した（図２）。このＥＬＩＳＡ試験の結果、選択した９種類全てのポリクローナルＶＨＨ抗体が、良好な結合活性を有することが確認された。
（実施例４）組換えコリネ菌によるモノクローナルＶＨＨ抗体の生産
（１）ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
　リンカーとＨｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を組換えコリネ菌にて生産した。具体的には、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５（配列番号６９）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９０）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６（配列番号７０）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９１（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７（配列番号７１）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９２）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８（配列番号７２）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９３）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号７３）と同じＣＤＲ１，２，３を有するＶＨＨ抗体（配列番号９４）（以降「コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９」と表記）を作製した。ＥＬＩＳＡ評価で結合が認められたＣＤＲ３配列を含むＶＨＨクローンをタンパク発現させるため、試験管内スクリーニングのＲ５のＤＮＡライブラリーから各ＶＨＨの遺伝子を調製し、Ｈｉｓタグを含むような様式の発現用プラスミドに導入した。合成したＶＨＨクローンの遺伝子と空の発現用プラスミドを、２種類の制限酵素ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、アガロースゲル電気泳動により目的断片のＤＮＡをそれぞれ単離精製した。その後、制限酵素処理したＶＨＨクローン遺伝子と発現用プラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてライゲーションし、そのライゲーション産物を用いてクローニング用コンピテントセルＪＭ１０９に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミド抽出を行い、ＶＨＨクローンの発現用プラスミドを取得した。
（２）組換えコリネバクテリウム　グルタミカム株の作成
　コリネバクテリウム　グルタミカム株へのプラスミド導入は以下に示す電気穿孔法により実施した。ＣＭ２Ｇ液体培地にグリセロールストックしたコリネバクテリウム　グルタミカム株を植菌し、３０℃、１６０ｒｐｍで数時間振とう培養した。この培養液をマイクロチューブに回収し、遠心機（ＴＡＩＴＥＣ）で１５，０００ｒｐｍ（２０，３８０ｘｇ）、１分間遠心し、上清を除去したペレットを滅菌水にて懸濁した。再度、上記と同様の操作により、滅菌水による菌体の洗浄を行ったのちに、１００μＬの滅菌水で得られたペレットを懸濁し、懸濁液とした。この懸濁液を各種ＶＨＨ発現用プラスミドと混合し、エレクトロポレーションを実施した。この液に１ｍＬのＣＭ２Ｇ培地を加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１時間浸透した後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ寒天培地プレートに適量塗布し、３０℃で１～２日間インキュベートした。
（３）ＶＨＨ産生
　上記（２）で作成した組換えコリネバクテリウム　グルタミカム株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃で一晩振とうし、前培養液とした。前培養液の全量をＰＭ１Ｓ培地に５％接種し、２５℃で７２時間振とう培養した。培養終了後に、遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４，１００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し、培養上清を回収した。各培養上清中におけるＶＨＨの産生を確認するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。各ウェルに４μＬ分のサンプルをアプライした後、１５０Ｖで１時間の条件で電気泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　ＰｒｏｔｅｉｎTM　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色し、培養上清中にＶＨＨが合成されていることを確認した。
　回収した培養上清に対してＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてろ過した後、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。４００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）を添加し、遠心機（ＴＯＭＹ）で５００×ｇ、３０秒間遠心した。溶出液を回収し、ＶＨＨ抗体サンプルとした。
（実施例５）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
（１）遺伝子配列の人工合成
　Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基を、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ１（配列番号９５（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２（配列番号９６）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３（配列番号９７）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４（配列番号９８）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号９５～９８をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号７７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１発現用コンストラクト）、配列番号７８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２発現用コンストラクト）、配列番号７９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３発現用コンストラクト）、配列番号８０（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
（２）Ｈｉｓタグ付きＶＨＨ発現用プラスミドの構築
　ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０参照）をテンプレートとし、プライマーとして５’-GATCCCCGGGAATTCCTGTTATAAAAAAAGG-３’（配列番号８１）と５’-ATGATGTTAAGAAAGAAAACAAAGCAG-３’（配列番号８２）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲを行い、上記発現用プラスミド構築用のプラスミド配列を増幅した。
　１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’-GAATTCCCGGGGATCTAAGAAAAGTGATTCTGGGAGAG-３’（配列番号８３）と５’-CTTTCTTAACATCATAGTAGTTCACCACCTTTTCCC-３’（配列番号８４）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。
　得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
　プライマーとして５’-TGCTGCAAGAGCTGCCGGAAATAAA-３’（配列番号８５）及び５’-TCTATTAAACTAGTTATAGGG-３’（配列番号８６）、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲを行い、上記プラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ産物に、（１）で作製した人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてそれぞれ組み込み、各人工合成ＶＨＨ遺伝子を含むＨｉｓタグ付きのＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。構築したプラスミドを、下記（３）に示す手順に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、８種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ）を欠損させ、さらに特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させることにより得られた株（Ｄｐｒ８ΔｓｉｇＦ）に導入した。
（３）組換え枯草菌の作製
　枯草菌株への上記プラスミド導入は、以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地を入れたチューブ中に、グリセロールを含む溶液中でストックしておいた枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍにて一晩振とう培養した。翌日、このチューブ中の培養液１０μＬを新鮮な１ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。培養終了後、この培養液を１５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含む５００μＬのＳＭＭＰを加えて、得られたペレットを懸濁させ、このチューブを３７℃で１時間インキュベートした。
　インキュベート終了後、このチューブを３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。４００μＬのＳＭＭＰをこのチューブに加え、得られたペレットを懸濁させて懸濁液とした。別のチューブに得られた懸濁液３３μＬを加え、そこに上記のようにして作製したに各プラスミドを加えて混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを添加し、ボルテックスして混合液とした。この混合液に３５０μＬのＳＭＭＰを加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうして振盪培養物を得た。その後、あらかじめ準備しておいたＤＭ３寒天培地を含むプレートの寒天培地上に、振盪培養物を全量塗布し、３０℃にて２～３日間インキュベートし、組換え枯草菌を得た。
（４）ＶＨＨの産生
　（３）で作製した組換え枯草菌を、５０ｐｐｍのテトラサイクリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌し、３２℃で一晩往復振とうし、前培養液を得た。得られた前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養物をマイクロチューブに取り、４℃、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清中に含まれる各ＶＨＨについては、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットに添付されたプロトコルに従って精製した。精製時の溶出液としては、５０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを用いた。
　培養上清中に含まれる抗体の生産量を確認するために、以下の条件でウエスタンブロッティングを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、スーパーセップエース又は１５－２０％（トリシンゲル）（いずれも富士フィルム和光純薬）を用いた。各ウェルに０．５μＬの培養上清を含むサンプルをアプライし、その後１２０Ｖで３時間泳動した。分子量マーカーには、ｘＬ　ｌａｄｄｅｒ（Ｂｒｏａｄ）（アプロサイエンス）を用いた。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｔｕｒｂｏ　Ｍｉｎｉ　ＰＶＤＦ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐａｃｋｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　Ｔｕｒｂｏ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いて、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体として、６ｘ－Ｈｉｓ　Ｔａｇモノクローナル抗体（３Ｄ５）、ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）またはＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ　Ｍ２－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンンジュゲート（シグマアルドリッチ）を用い、ｉＢｉｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抗体反応を行った。１－Ｓｔｅｐ　Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて目的タンパク質を検出した。
（実施例６）バイオレイヤー干渉法による結合活性測定
　バイオレイヤー干渉法（以下、「ＢＬＩ」と略すことがある）を用いて、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク質に対する結合活性測定を行った。ＢＬＩは、Ｏｃｔｅｔ　３８４（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、キネティックスバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに固相化し、４９５ｎＭから２倍連続希釈で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１－Ｆｃリコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～６）のステップで測定を実行した。
　１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒），
　２）Ｌｏａｄｉｎｇ　ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（２４０秒），
　３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒），
　４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク溶液中と会合（１８０秒），
　５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒），
　６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
　上記測定が終了後、実測値からＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（キネティックスバッファーのみ）を差し引き、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いて、１：１の結合モデルを用いてＧｌｏｂａｌ　Ｆｉｔｔｉｎｇを行い，結合活性を算出した（図３）。各ＶＨＨクローンのＳｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクに対する平衡解離定数（ＫＤ）を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（実施例７）バイオレイヤー干渉法による競合阻害活性測定
　Ｏｃｔｅｔ　３８４を用いて、各ＶＨＨクローン間でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクに対する競合阻害を解析した。競合阻害活性は、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のいずれかを第１抗体として固相化したセンサーチップに対して、一定の濃度に調製したＳｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクと、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ４、コリネ菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のいずれかである第２抗体との混合液に一定時間浸漬させて得られる結合シグナルとＳｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクのみで結合させた際の結合シグナルを比較することで算出した。
　まず、キネティックスバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ　７．４）で１００μｇ／ｍＬに調製した第一の競合ＶＨＨ抗体をＨＩＳ１Ｋセンサーチップに固相化した。次に、１００μｇ／ｍＬの第二の競合ＶＨＨクローンと２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５及び０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１－Ｆｃ　リコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をそれぞれ混合し、５分間反応させて結合溶液を調製した。ラン毎の測定順は以下の通りとした。
　１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒），
　２）Ｌｏａｄｉｎｇ　ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（６０秒），
　３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒），
　４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１タンパク溶液と競合ＶＨＨ抗体混合溶液中での会合（１２０秒），
　５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（３０秒），
　６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
　競合阻害率は、第１抗体とＳｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクで得られる結合シグナルを１００％として、第２抗体存在下でのシグナル強度が最大結合能の２５％未満に減少させる場合には競合し、結合が７５％を超える場合には非競合と定義した。２５％～７５％のレベルは、中間競合とした。各クローンの結合競合シグナルの結果から、結合活性の高いＶＨＨクローンが得られ、今回活性が認められたＶＨＨクローンについては、少なくとも５つの競合グループに分割できるものと考えられた（下記表１４参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（実施例８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性の測定
　枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を測定した。抗体は２％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、１５μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。さらに、１００μＬのＶＨＨクローン混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで３倍希釈液を調製し、抗体の３倍希釈系列溶液を調製した。
　９６ウェルプレートにＶＨＨクローンの３倍希釈系列溶液を１００μＬ添加し、さらに２．５×１０6ＲＮＡコピー／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２溶液（国立感染症研究所から入手）をそれぞれ１００μＬずつ添加した。その後、３７℃で２時間インキュベートした後、４℃で一晩インキュベートし、抗体とウイルスを接触させた。Ｖｅｒｏ－Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を播種したウェルに、抗体とウイルスを接触させた溶液２００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。培養開始３日後に培養上清を回収し、定量ＰＣＲにより、上清中のウイルスゲノムのコピー数を定量した。
　定量ＰＣＲ法により得られた結果をもとに、ＶＨＨクローンの各濃度におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染阻害率を算出した（図５）。その結果、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、中和活性を示したため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の粒子に対しても結合可能であることがわかった。また、感染阻害率から求められたＩＣ５０は０．０５μｇ／ｍＬであり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、高い中和活性を有していることがわかった。
（実施例９）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
　Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ５（配列番号９９）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８（配列番号１００）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号１０１）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号９９～１０１をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号８７（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５発現用コンストラクト）、配列番号８８（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８発現用コンストラクト）、配列番号８９（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。以降のプロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産の操作は実施例５に従い行った。
（実施例１０）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性の測定
　上述した実施例８に記載の方法に従い、使用するＶＨＨクローンをＶＨＨ－ＣＯＶＥ２からそれぞれ枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９に変更し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を評価した。その結果、感染阻害率から求められたＩＣ５０は３．０４８μｇ／ｍＬ（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５）、１．７３３μｇ／ｍＬ未満（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８）、０．５８μｇ／ｍＬ未満（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９）となった。
（実施例１１）プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
　Ｈｉｓタグ配列をＣ末端に付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７をプロテアーゼ欠損組換え枯草菌にて生産した。具体的には、Ｎ末端にＡｌａ残基、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与したＶＨＨ－ＣＯＶＥ６（配列番号１０２）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６」と表記）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７（配列番号１０３）（以降「枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７」と表記）の人工合成遺伝子を合成した。配列番号Ｑ、配列番号Ｒをコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与し、さらにGCAGCTCTTGCAGCA（配列番号７５）が５’末端に、TCTATTAAACTAGTT（配列番号７６）が３’末端に付加された配列番号１０４（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６発現用コンストラクト）、配列番号１０５（ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７発現用コンストラクト）をユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。以降のプロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産の操作は実施例５に従い行った。
（実施例１２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
　枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の８種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、Ｔｒｉｍｅｒｉｃ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ，　Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ（「武漢型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．１．１．７　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「イギリス型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．１．３５１　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「南アフリカ型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｐ．１　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「ブラジル型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。イギリス型とは武漢型に対してＨ６９－Ｖ７０欠失，Ｙ１４４欠失，Ｎ５０１Ｙ，Ａ５７０Ｄ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｈ，Ｔ７１６Ｉ，Ｓ９８２Ａ，Ｄ１１１８Ｈの変異が生じたものである。南アフリカ型とは武漢型に対してＹ１４４欠失，Ｋ４１７Ｎ，Ｅ４８４Ｋ，Ｎ５０１Ｙ，Ａ５７０Ｄ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｈ，Ｔ７１６Ｉ，Ｓ９８２Ａ，Ｄ１１１８Ｈの変異が生じたものである。ブラジル型とは武漢型に対して、Ｌ１８Ｆ，Ｔ２０Ｎ，Ｐ２６Ｓ，Ｄ１３８Ｙ，Ｒ１９０Ｓ，Ｋ４１７Ｔ，Ｅ４８４Ｋ，Ｎ５０１Ｙ，Ｈ６５５Ｙ，Ｔ１０２７Ｉ，Ｖ１１７６Ｆの変異が生じたものである。
　ＰｉｅｒｃｅTM　Ｎｉｃｋｌｅ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｌｅａｒ、９６－ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに、２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨ抗体を１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートし固相化を行った。その後、ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ抗体を除去したのち、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットで丁寧に除去する操作（「洗浄」と表記）を３回繰り返した。次に、各ウェルに２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートしブロッキングを行った。その後、ピペットを用いて丁寧にスキムミルク／ＰＢＳＴを除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。続いて、各ウェルに適切な濃度に調製した１００μＬの標的タンパク質を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ピペットを用いて丁寧に標的タンパク質溶液を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。
　一次抗体として、Ｍｓ　ｍＡｂ　ｔｏ　Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ［１Ｄ４］（Ａｂｃａｍ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に一次抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。二次抗体としてＧｏａｔ　ｐＡｂ　ｔｏ　Ｍｓ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ）をＰＢＳＴで１／５，０００希釈したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。室温かつ遮光条件で１時間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に二次抗体を除去したのち、洗浄の操作を３回繰り返した。発光基質として、ＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解したものを調製し、各ウェルに１００μＬ添加した。その後、室温かつ遮光条件で２０分間インキュベートし、吸光度（４５０ｎｍ）をＧｌｏＭａｘ（登録商標）　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。
　ＥＬＩＳＡ試験の結果を図６に示す。試験に供した全てのＶＨＨ抗体に関して、４種のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性が確認された。なおＥ１とＥ４以外のＶＨＨ抗体に関しては、いずれのＳｐｉｋｅタンパク質に対しても特に良好な結合活性（吸光度が０．９７以上）が確認された。
（実施例１３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
　上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。実施例１１と同様に、標的タンパク質としてＴｒｉｍｅｒｉｃ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ，　Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ（「武漢型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．１．１．７　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「イギリス型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．１．３５１　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「南アフリカ型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｐ．１　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（「ブラジル型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）のいずれかをＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。なお、各変異株における変異箇所は実施例１２において記載したものと同じである。図７にＥＬＩＳＡ試験の結果を示すが、いずれの変異株のｓｐｉｋｅタンパク質に対しても、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６の明瞭な結合活性が確認された。
（実施例１４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
　上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イギリス／ナイジェリア変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．１．５２５　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「イギリス／ナイジェリア型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）をＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。イギリス／ナイジェリア変異株とは武漢型に対して、Ｈ６９－Ｖ７０欠失，Ｙ１４４欠失，Ｑ５２Ｒ，Ｅ４８４Ｋ，Ｑ６６７Ｈ，Ｆ８８８Ｌの変異が生じたものである。
　ＥＬＩＳＡ試験の結果を図８に示す。試験に供した全てのＶＨＨ抗体に関して、イギリス／ナイジェリア型のｓｐｉｋｅタンパク質への結合活性が確認された。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９に関しては、非常に良好な結合活性（吸光度が１以上）が確認された。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７に関しても、良好な結合活性（吸光度が０．５以上）が確認された。
（実施例１５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する結合活性の測定
　上述した実施例１１の方法に倣い、枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カリフォルニア変異株およびインド変異株のＳｐｉｋｅタンパク質への結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお標的タンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．１．４２９　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「カリフォルニア型」と表記）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　Ｓｐｉｋｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｂ．１．６１７　Ｍｕｔａｔｉｏｎ（以降「インド型」と表記）（Ｂｉｏ－ｓｅｒｖ社）のそれぞれを、ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０）で希釈したもの（０、５、５０、５００ｎｇ／ｍＬ）を用いた。カリフォルニア変異株とは武漢型に対してＳ１３ｌ，Ｗ１５２Ｃ，Ｌ４５２Ｒ，Ｄ１１８３Ｙの変異が生じたものである。インド変異株とは武漢型に対してＧ１４２Ｄ，Ｅ１５４Ｋ，Ｌ４５２Ｒ，Ｅ４８４Ｑ，Ｄ６１４Ｇ，Ｐ６８１Ｒ，Ｑ１０７１Ｈの変異が生じたものである。
　ＥＬＩＳＡ試験の結果を図９に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を除く全てのＶＨＨ抗体に関して、カリフォルニア型およびインド型のｓｐｉｋｅタンパク質への結合活性がいずれも確認されなかった。一方ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関しては、カリフォルニア型およびインド型のｓｐｉｋｅタンパク質に対する高い結合活性が確認された。実施例１１、実施例１３も踏まえると、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がＳｐｉｋｅタンパク質の変異による影響を受けにくいようなエピトープを認識しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株に対して幅広く結合活性を示すことが明らかになった。
（実施例１６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤに対する結合活性測定
　枯草菌由来のＶＨＨ－ＣＯＶＥ１～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の９種のＶＨＨ抗体に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤリコンビナントタンパク質への結合活性を実施例７と同様の方法にて測定した。キネティックスバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ　７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに固相化し、１９９．２　ｎＭから２倍連続希釈で調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤリコンビナントタンパク（４０５９２－ＶＮＡＨ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、武漢型）と結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～６）のステップで測定を実行した。
　１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（３０秒）
　２）Ｌｏａｄｉｎｇ　ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（１２０秒）
　３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
　４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：ＲＢＤタンパク溶液中と会合（１８０秒）
　５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒）
　６）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ　２．２）中で５秒間測定、キネティックスバッファー中で５秒間の測定を３回繰り返す。
　上記測定が終了後、実測値からＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（キネティックスバッファーのみ）を差し引き、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いて、１：１の結合モデルを用いてＧｌｏｂａｌ　Ｆｉｔｔｉｎｇを行い，結合活性を算出した。各ＶＨＨ抗体のＲＢＤタンパクに対する平衡解離定数（ＫD）を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　ＲＢＤに対する平衡解離定数（ＫD）より、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１とＶＨＨ－ＣＯＶＥ４を除くその他のＶＨＨ抗体はＳ１タンパクと同様に強力な結合活性を示した。一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１とＶＨＨ－ＣＯＶＥ４については、明確な結合を示さなかった。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ１とＶＨＨ－ＣＯＶＥ４は、Ｓ１タンパクに結合し、ＲＢＤに結合するＶＨＨ－ＣＯＶＥ２等と競合することが確認されていることから、ＲＢＤの近傍部位（ＮＴＤ）をエピトープとして認識しているものと推察された。
（実施例１７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤとＡＣＥ２の結合に対する競合阻害活性測定
　実施例７と同様の方法にて、実施例１５にてＲＢＤへの結合が確認された枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の７種のＶＨＨ抗体に関して、Ｏｃｔｅｔ　３８４を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤとヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した各ＶＨＨクローンをＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、１ｓｔアナライトとして１９９．２ｎＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤリコンビナントタンパク（２０μｇ／ｍＬ，４０５９２－ＶＮＡＨ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、武漢型）溶液に浸し、１８０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に２４０秒間浸した。３０秒間のベースラインステップを挟んで、センサーチップを２０ｎｇ／ｍＬに調整したＡＣＥ２－Ｆｃのウェルに浸し、１８０秒間後の結合の有無を確認した。
　センサーチップに固定した各ＶＨＨ抗体と１ｓｔアナライトであるＲＢＤ間の結合レスポンスを確認した後、２ｎｄアナライトであるＡＣＥ２－Ｆｃを結合させたところ、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８は、ＡＣＥ２との結合を明確に阻害し、競合性を示した。この結果は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ６、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への中和活性を示すことを示唆する。
　一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、ＡＣＥ２と競合性を示さず、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２は、ＡＣＥ２と部分的に競合性を示した。ＡＣＥ２に対する各センサーグラムの変化を図１０に示す。本結果から、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、ＲＢＤ上におけるＡＣＥ２結合サイト以外をエピトープとしていることが示され、その中和活性はＡＣＥ２と直接競合して中和活性を示す一般的な抗体とは異なる作用であると考えられた。
（実施例１８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ変異株に対する結合活性測定
　実施例７と同様の方法にて、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５～ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の６種のＶＨＨ抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ変異株への結合活性を測定した。予め、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ変異株（ＳＰＤ－Ｃ５２Ｈｎ，Ａｃｒｏ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｎ５０１Ｙ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ変異株（ＳＲＤ－Ｃ５２Ｈ３，Ａｃｒｏ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｅ４８４Ｋ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ変異株（ＳＲＤ－Ｃ５２Ｈ２，Ａｃｒｏ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｎ４４０Ｋ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ変異株（ＳＰＤ－Ｃ５２Ｈｐ，Ａｃｒｏ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｋ４１７Ｎ，　Ｅ４８４Ｋ，　Ｎ５０１Ｙ）をＥＺ－Ｌｉｎｋ　ＮＨＳ－ＰＥＧ１２－ｂｉｏｔｉｎ化試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化し、キネティックスバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１０～２０μｇ／ｍＬに調製した。ＲＢＤ変異株をＳＡセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に固相化し、６６６．７ｎＭから２倍連続希釈で調整した各ＶＨＨと結合させ、解離速度を測定した。測定準備として、センサーチップを水和するため、センサーチップの先端を２００μＬのキネティックスバッファーに１０分間浸漬させた。その後、５０μＬの各測定液を３８４ウェルブラックプレート（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に添加し、以下に示す１）～５）のステップで測定を実行した。
　１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
　２）Ｌｏａｄｉｎｇ　ｓｔｅｐ：ＶＨＨ抗体のセンサーへの固定化（３００秒）
　３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中でのベースライン測定（６０秒）
　４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤタンパク溶液中と会合（１２０秒）
　５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ：キネティックスバッファー中で測定（２４０秒）
　上記測定が終了後、実測値からＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（キネティックスバッファーのみ）を差し引き、Ｏｃｔｅｔソフトウェアを用いて、１：１の結合モデルを用いてＧｌｏｂａｌ　Ｆｉｔｔｉｎｇを行い，結合活性を算出した。各ＶＨＨクローンのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ変異株に対する平衡解離定数（ＫD）を表１６、表１７、表１８、及び表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　結合解析の結果、本試験に供した全てのＶＨＨ抗体が各ＲＢＤ変異株に対して結合した。しかし、ＡＣＥ２とエピトープの競合性が認められているＶＨＨ－ＣＯＶＥ２、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ５、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ７、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ８については、変異の位置によっては結合活性への影響が生じることが確認された。一方、ＡＣＥ２と異なるエピトープに結合するＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は、これら変異に伴う結合活性の低下は認められなかった。このことから、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９は上記変異株に対しても、中和活性を発揮する可能性が示唆された。
（実施例１９）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ―２インド型変異株のＲＢＤに対する結合活性測定
　実施例１５においてインド型変異株由来のｓｐｉｋｅタンパク質への結合活性が確認されたＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、インド型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を評価した。まず、３０分以上常温に戻したＤｙｎａｂｅａｄｓTM　ＭｙＯｎｅ　Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をよく撹拌し、２５０μＬを１．５ｍＬチューブに分取した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。２５０μＬの１５ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　６．０）を加えたのち、１０秒間ボルテックスした。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。５０μＬの１５ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　６．０）でビーズを懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬに調製した１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を５０μＬ加えて混合したのち、常温で３０分撹拌した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。次に、５０ｎｇのＶＨＨ―ＣＯＶＥ３を含む１５ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　６．０）を１２０μＬ調製し、その溶液でビーズを懸濁した。常温下で一晩の間撹拌した後、磁石ラックを用いて上清を除去した。５００μＬのＰＢＳＴでビーズを懸濁し、１０分間攪拌した。その後、磁石ラックを用いて上清を除去した。なお、この操作は２回繰り返した。３％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ５００μＬで懸濁したのち、３０分撹拌した。その後ＰＢＳＴによる洗浄を３回行った。以上の操作により、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを調製した。またコントロールとして、ＶＨＨ非固定化ビーズの調製も併せて行った。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ，Ｅ４８４Ｑ）Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ　Ｔａｇ）（以降、「インド型ＲＢＤ」と表現）（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を、ＰＢＳＴを用いて１２．５μｇ／ｍＬに調製した。１．５ｍＬチューブ内で、２００μＬのインド型ＲＢＤでＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを懸濁したのち、ゆっくり撹拌させた。撹拌開始１０分後に３０μＬの反応液を分取して、溶液が透明になるまで磁石ラック上に静置したのち、その上清を分取してＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｂｏｌｔ（登録商標）　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｐｌｕｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに２０μＬの上清を含むサンプルをアプライし、その後２００Ｖで３５分間泳動した。分子量マーカーには。ＮｏｖｅｘTM　Ｓｈａｒｐ　Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。染色には、ＧｅｌＣｏｄｅTM　Ｂｌｕｅ　Ｓａｆｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。
　ＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した結果を図１１に示す。初発のサンプルとして２５０ｎｇ相当のインド型ＲＢＤをＳＤＳ―ＰＡＧＥに供しており、このバンドとの比較により当該ＶＨＨの結合活性を評価した。コントロールとして、ＶＨＨ非固定化ビーズとインド型ＲＢＤを反応させた場合には、初発のサンプルと同様に位置にバンドが確認された（レーン１と２の比較）。つまり、ＶＨＨ非固定化ビーズとインド型ＲＢＤとの結合活性が無いことが確認された。一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズとインド型ＲＢＤを反応させると、インド型ＲＢＤ由来のバンドが消失した（レーン１と３の比較）。この結果は、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズがインド型ＲＢＤを吸着したことを意味する。以上を総合すると、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がインド型ＲＢＤとの明瞭な結合活性を有することが明らかになった。
（実施例２０）組換えコリネ菌によるＶＨＨ－ＣＯＶＥ９変異体の生産
（１）ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９変異体発現用プラスミドの構築
　試験管内淘汰セレクションのＲ５のＤＮＡライブラリー内の配列を考慮して、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９（配列番号７３）のＣＤＲ３領域内にＲ１０８Ｋの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０６）、同じくＣＤＲ３領域内にＮ１０９Ｄの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１０７）とＹ１１０Ｓの変異が生じたＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１０８）を選抜した。これらＶＨＨを組換えコリネ菌で作製するにあたって、Ｎ末端にＡｌａ残基を、Ｃ末端にリンカーを含むＨｉｓタグ配列（配列番号７４）を付与した形でＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０９）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１１０）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１１１）を発現させた。各ＶＨＨの遺伝子をユーロフィン社で合成し、発現用プラスミドに導入した。合成したＶＨＨクローンの遺伝子と空の発現用プラスミドを、２種類の制限酵素ＳｆｉＩ及びＡｐａＩ（いずれもＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、アガロースゲル電気泳動により目的断片のＤＮＡをそれぞれ単離精製した。その後、制限酵素処理したＶＨＨクローン遺伝子と発現用プラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてライゲーションし、そのライゲーション産物を用いてクローニング用コンピテントセルＪＭ１０９株に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミド抽出を行い、ＶＨＨクローンの発現用プラスミドを取得した。
（２）組換えコリネバクテリウム　グルタミカム株の作製
　コリネバクテリウム　グルタミカム株へのプラスミド導入は、実施例４の条件と同様に実施した。
（３）ＶＨＨ産生
　上記（２）で作製した組換えコリネバクテリウム　グルタミカム株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ培地に植菌し、３０℃で一晩振とうし、前培養液とした。前培養液を９６ディープウェルプレートに入れた７００μＬのＰＭ１Ｓ培地に５％接種し、２５℃で７２時間振とう培養した。培養終了後に、遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し、培養上清をチューブに回収した。
　回収した培養上清に対してＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてろ過した後、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用いて当該製品の使用説明書に従って精製した。ＶＨＨの溶出には、７００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）を添加し、遠心機（ＴＯＭＹ）で５００×ｇ、３０秒間遠心した。溶出液を回収し、ＶＨＨ抗体サンプルとした。
　精製したＶＨＨの純度を確認するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。各ウェルに４μＬ分のサンプルをアプライした後、１５０Ｖで１時間の条件で電気泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　ＰｒｏｔｅｉｎTM　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色し、培養上清中にＶＨＨが合成されていることを確認した。
（実施例２１）バイオレイヤー干渉法による結合活性測定
　実施例６と同様の方法にて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）　Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１－Ｆｃリコンビナントタンパク（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対するＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｒ１０８Ｋ（配列番号１０６）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｎ１０９Ｄ（配列番号１０７）、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９－Ｙ１１０Ｓ（配列番号１０８）の結合活性を測定した。各ＶＨＨクローンのＳｐｉｋｅ　Ｓ１タンパクに対する平衡解離定数（ＫD）を表２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
（実施例２２）ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性の測定
　枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型およびデルタ型変異株に対する中和活性を測定した。抗体は２％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、１５０μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。さらに、１００μＬのＶＨＨクローン混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで３倍希釈液を調製し、抗体の３倍希釈系列溶液を調製した。
　９６ウェルプレートにＶＨＨクローンの３倍希釈系列溶液を１００μＬ添加し、さらに２．５×１０6ＲＮＡコピー／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型・デルタ型変異株の溶液（国立感染症研究所から入手）をそれぞれ１００μＬずつ添加した。その後、３７℃で２時間インキュベートした後、４℃で一晩インキュベートし、抗体とウイルスを接触させた。Ｖｅｒｏ－Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を播種したウェルに、抗体とウイルスを接触させた溶液１００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。培養開始１日後に培養上清を回収し、定量ＰＣＲにより、上清中のウイルスゲノムのコピー数を定量した。定量ＰＣＲにはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いた。培養上清３μＬを前処理液３μＬと混合し、そのうちの３μＬをＲＴ―ＰＣＲ反応液（反応液１５μＬ、酵素液２．５μＬ、プライマー・プローブ液２．５μＬ）に加えて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６にて定量ＰＣＲを行った。反応条件は、逆転写反応４２℃・５分、プレ変性９５℃・１０秒、サイクル反応［変性９５℃・１秒、会合５０℃・３秒、伸長５５℃・１０秒］４５サイクルで検出を行った。
　定量ＰＣＲ法により得られた細胞中のウイルス数の結果を図１２に示す。その結果、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型、デルタ型のいずれに対しても中和活性を示すこと、またそれらウイルスへの結合活性を示すことが明らかになった。
（実施例２３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ型変異株由来の（Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｂ．１．６１７．１株）とＡＣＥ２の結合に対する競合阻害活性測定
　枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、Ｏｃｔｅｔ　３８４を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ）とヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ　７．４）で２０μｇ／ｍＬに調製したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３をＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤリコンビナントタンパク（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（５０μＬ）、２０μｇ／ｍＬＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤリコンビナントタンパク（２５μＬ）と４０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（２５μＬ）の混合溶液、２０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（５０μＬ、リファレンスウェル）にそれぞれ浸し、１２０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に１２０秒間浸した。
　ＡＣＥ２を固定したセンサーチップをリファレンスとしてデータ処理した結果を図１３に示す。結果、センサーチップに固定したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３とＲＢＤ間の結合レスポンスに対して、ＲＢＤとＡＣＥ２の混合液ではレスポンスが明確に消失した。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３は、ＡＣＥ２とカッパ型変異株由来のＲＢＤとの結合を明確に阻害したため、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３はカッパ型変異株に対しても中和活性を有することがわかった。
（実施例２４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｂ．１．６１７．２株）とＡＣＥ２の結合に対する競合阻害活性測定
　枯草菌由来ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、Ｏｃｔｅｔ　３８４を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株由来のＲＢＤ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ変異株）とヒトＡＣＥ２の結合に対する競合阻害評価を実施した。キネティックスバッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、ｐＨ　７．４）で２０μｇ／ｍＬに調製したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３をＡｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）センサーチップに１２０秒間インキュベートすることで固相化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤリコンビナントタンパク（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（５０μＬ）、２０μｇ／ｍＬＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤリコンビナントタンパク（２５μＬ）と４０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（ＳＰＤ－Ｃ５２５ｅ、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（２５μＬ）の混合溶液、２０μｇ／ｍＬのＡＣＥ２（５０μＬ）にそれぞれ浸し、１２０秒間後の結合を確認した後、緩衝溶液に１２０秒間浸した。
　ＡＣＥ２を固定したセンサーチップをリファレンスとしてデータ処理した結果を図１４に示す。結果、センサーチップに固定したＶＨＨ－ＣＯＶＥ３とＲＢＤ間の結合レスポンスに対して、ＲＢＤとＡＣＥ２の混合液ではレスポンスが明確に消失した。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３は、ＡＣＥ２とデルタ型変異株由来のＲＢＤとの結合を明確に阻害したため、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３はデルタ型変異株に対しても中和活性を有することがわかった。
（実施例２５）ハムスター体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株に対する中和活性の測定
　６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）１２匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　アルファ型変異株（１０3.5ＴＣＩＤ50／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を濃度別（２０ｍｇ／ｋｇ，４ｍｇ／ｋｇ，０．８ｍｇ／ｋｇ）に３匹ずつ経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
　ハムスター体内でのＶＨＨ－ＣＯＶＥ９の中和活性評価の結果を図１５に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９未投与のコントロールでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う明瞭な体重減少が確認された。０．８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を投与すると、体重減少の緩和が確認された。また、４ｍｇ／ｋｇ，２０ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ９を投与した際には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う体重減少が明瞭に抑制された。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株への中和活性（治療効果）を有することが明らかになった。
（実施例２６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ―２ラムダ型変異株のＲＢＤに対する結合活性測定
　ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３に関して、ラムダ型変異株由来のＲＢＤへの結合活性を評価した。実施例１９に倣ってＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズを調製した。またコントロール用として、ＶＨＨ非固定ビーズおよびＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズの調製も併せて行った。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ（Ｌ４５２Ｑ，Ｆ４９０Ｓ）Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ　Ｔａｇ）（以降、「ラムダ型ＲＢＤ」と表現）（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を、ＰＢＳＴを用いて１２．５μｇ／ｍＬに調製した。１．５ｍＬチューブ内において、２００μＬのラムダ型ＲＢＤでＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズ、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズ、ＶＨＨ非固定ビーズをそれぞれ懸濁したのち、ゆっくり撹拌させた。撹拌開始１０分後に１００μＬの反応液を分取して、溶液が透明になるまで磁石ラック上に静置したのち、その上清を除去した。次に、回収したビーズを４０μＬの蒸留水で懸濁したのち、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプルバッファーと混合したものを１００℃で5分間静置し、ビーズに吸着したラムダ型ＲＢＤをサンプルバッファーに溶出することで、溶出画分として調製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｂｏｌｔ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｐｌｕｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに４０μＬの溶出画分を含むサンプルをアプライし、その後２００Ｖで３５分間泳動した。分子量マーカーには。ＮｏｖｅｘTM　Ｓｈａｒｐ　Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。染色には、ＧｅｌＣｏｄｅTM　Ｂｌｕｅ　Ｓａｆｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。
　ＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した結果を図１６に示す。初発のサンプルとして２５０ｎｇ相当のラムダ型ＲＢＤをＳＤＳ―ＰＡＧＥに供した（レーン１）。コントロールであるＶＨＨ非固定ビーズ、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ９固定化ビーズの溶出画分には、ラムダ型ＲＢＤ由来のバンドは確認されなかった（レーン２，４）。一方、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズの溶出画分にはラムダ型ＲＢＤ由来のバンドが確認された（レーン３）。以上の結果はＶＨＨ－ＣＯＶＥ３固定化ビーズがラムダ型ＲＢＤを吸着したことを示す。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がラムダ型ＲＢＤとの結合活性を有することが明らかになった。
（実施例２７）ハムスター体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株に対する中和活性の測定
　６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）６匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　アルファ型変異株（１０3.5ＴＣＩＤ50／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を３匹に経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
　ハムスター体内でのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の中和活性評価の結果を図１７に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３未投与のコントロールでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う明瞭な体重減少が確認された。８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を投与すると、体重減少が抑制された。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ型変異株への中和活性（治療効果）を有することが明らかになった。
（実施例２８）ハムスター体内におけるＶＨＨ－ＣＯＶＥ３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株に対する中和活性の測定
　６週齢、オスのシリアンハムスター（以下、ハムスター）６匹に３種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２．０ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇの混合剤）を腹腔内投与して鎮静後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　デルタ型変異株（１０3.5ＴＣＩＤ50／ｈｅａｄ）を経鼻投与した。経鼻投与後、アチパメゾールをハムスターに腹腔内投与して鎮静状態から回復させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２投与の１日後、再び３種混合麻酔薬を全てのハムスターに腹腔内投与して鎮静後、８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を３匹に経鼻投与した。コントロールとして、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の希釈に使用したアルブミン加ＰＢＳのみを３匹のハムスターに経鼻投与した。ウイルス投与直後からその４日後まで毎日ハムスターの体重を測定した。
　ハムスター体内でのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３の中和活性評価の結果を図１８に示す。ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３未投与のコントロールでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に伴う明瞭な体重減少が確認された。８ｍｇ／ｋｇのＶＨＨ－ＣＯＶＥ３を投与すると、体重減少が抑制された。つまり、ＶＨＨ－ＣＯＶＥ３がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ型変異株への中和活性（治療効果）を有することが明らかになった。
　本発明は、医薬及び診断薬の分野において有用である。

Claims (16)

  1. 　配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド。
  2. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチドが、ＶＨＨ抗体、及び重鎖抗体及びＶＨＨ抗体多量体からなる群から選ばれるいずれかである、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、請求項２に記載のペプチド。
  4. 　配列番号１～９のいずれかで示されるアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して３．６ｘ１０-9Ｍ以下のＫＤを有する、請求項１～３のいずれかに記載のペプチド。
  5. 　構造ドメインが、さらに配列番号１０～１８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号１９～２７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２を含む、請求項１～４のいずれかに記載のペプチド。
  6. 　下記の配列番号１～２７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む構造ドメインを１つ以上有する、１）～９）から選ばれる、請求項５に記載のペプチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
  7. 　請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
  8. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドを被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
  9. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
  10. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドを含有する医薬。
  11. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための請求項１０に記載の医薬。
  12. 　医薬を製造するための、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
  13. 　医薬がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための医薬である、請求項１２に記載の使用。
  14. 　医薬として使用するための、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド。
  15. 　医薬がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための医薬である、請求項１４に記載のペプチド。
  16. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチドを必要とする対象に投与する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療方法。
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