TWI775422B - 重組抗體、包含重組抗體之套組及其用途 - Google Patents
重組抗體、包含重組抗體之套組及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI775422B TWI775422B TW110116327A TW110116327A TWI775422B TW I775422 B TWI775422 B TW I775422B TW 110116327 A TW110116327 A TW 110116327A TW 110116327 A TW110116327 A TW 110116327A TW I775422 B TWI775422 B TW I775422B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- antibody
- region
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 44
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 claims abstract description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims description 58
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 21
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 12
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 56
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 127
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 39
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 27
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N disulfiram Chemical compound CCN(CC)C(=S)SSC(=S)N(CC)CC AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- BPBPYQWMFCTCNG-UHFFFAOYSA-N 2-(butan-2-yldisulfanyl)-1H-imidazole Chemical compound CCC(C)SSC1=NC=CN1 BPBPYQWMFCTCNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091006197 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Proteins 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 4
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003491 array Methods 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 Aspartamine Natural products 0.000 description 3
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 3
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 3
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 3
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001024637 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150044878 US18 gene Proteins 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229960002563 disulfiram Drugs 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- AEUAEICGCMSYCQ-UHFFFAOYSA-N 4-n-(7-chloroquinolin-1-ium-4-yl)-1-n,1-n-diethylpentane-1,4-diamine;dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 AEUAEICGCMSYCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- AXRYRYVKAWYZBR-UHFFFAOYSA-N Atazanavir Natural products C=1C=C(C=2N=CC=CC=2)C=CC=1CN(NC(=O)C(NC(=O)OC)C(C)(C)C)CC(O)C(NC(=O)C(NC(=O)OC)C(C)(C)C)CC1=CC=CC=C1 AXRYRYVKAWYZBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010019625 Atazanavir Sulfate Proteins 0.000 description 2
- AOCCBINRVIKJHY-UHFFFAOYSA-N Carmofur Chemical compound CCCCCCNC(=O)N1C=C(F)C(=O)NC1=O AOCCBINRVIKJHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DYEFUKCXAQOFHX-UHFFFAOYSA-N Ebselen Chemical compound [se]1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1=CC=CC=C1 DYEFUKCXAQOFHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N Kaletra Chemical compound N1([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)COC=2C(=CC=CC=2C)C)CC=2C=CC=CC=2)CCCNC1=O KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- UCHDWCPVSPXUMX-TZIWLTJVSA-N Montelukast Chemical compound CC(C)(O)C1=CC=CC=C1CC[C@H](C=1C=C(\C=C\C=2N=C3C=C(Cl)C=CC3=CC=2)C=CC=1)SCC1(CC(O)=O)CC1 UCHDWCPVSPXUMX-TZIWLTJVSA-N 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001024647 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- SUJUHGSWHZTSEU-UHFFFAOYSA-N Tipranavir Natural products C1C(O)=C(C(CC)C=2C=C(NS(=O)(=O)C=3N=CC(=CC=3)C(F)(F)F)C=CC=2)C(=O)OC1(CCC)CCC1=CC=CC=C1 SUJUHGSWHZTSEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960003277 atazanavir Drugs 0.000 description 2
- AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N atazanavir Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)[C@@H](O)CN(CC=1C=CC(=CC=1)C=1N=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 2
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 108010021331 carfilzomib Proteins 0.000 description 2
- BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N carfilzomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)[C@]1(C)OC1)NC(=O)CN1CCOCC1)CC1=CC=CC=C1 BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N 0.000 description 2
- 229960002438 carfilzomib Drugs 0.000 description 2
- 229960003261 carmofur Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002328 chloroquine phosphate Drugs 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229960005107 darunavir Drugs 0.000 description 2
- CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N darunavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1[C@@H]2CCO[C@@H]2OC1)C1=CC=CC=C1 CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229950010033 ebselen Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229960003586 elvitegravir Drugs 0.000 description 2
- JUZYLCPPVHEVSV-LJQANCHMSA-N elvitegravir Chemical compound COC1=CC=2N([C@H](CO)C(C)C)C=C(C(O)=O)C(=O)C=2C=C1CC1=CC=CC(Cl)=C1F JUZYLCPPVHEVSV-LJQANCHMSA-N 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229960003142 fosamprenavir Drugs 0.000 description 2
- MLBVMOWEQCZNCC-OEMFJLHTSA-N fosamprenavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](OP(O)(O)=O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1COCC1)C1=CC=CC=C1 MLBVMOWEQCZNCC-OEMFJLHTSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 description 2
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical compound C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229960004525 lopinavir Drugs 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229960005127 montelukast Drugs 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002640 oxygen therapy Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 229960004742 raltegravir Drugs 0.000 description 2
- CZFFBEXEKNGXKS-UHFFFAOYSA-N raltegravir Chemical compound O1C(C)=NN=C1C(=O)NC(C)(C)C1=NC(C(=O)NCC=2C=CC(F)=CC=2)=C(O)C(=O)N1C CZFFBEXEKNGXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWWYLEGWBNMMLJ-MEUHYHILSA-N remdesivir Drugs C([C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@](C#N)(O1)C=1N2N=CN=C(N)C2=CC=1)O)OP(=O)(N[C@@H](C)C(=O)OCC(CC)CC)OC1=CC=CC=C1 RWWYLEGWBNMMLJ-MEUHYHILSA-N 0.000 description 2
- RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N remdesivir Chemical compound NC1=NC=NN2C1=CC=C2[C@]1([C@@H]([C@@H]([C@H](O1)CO[P@](=O)(OC1=CC=CC=C1)N[C@H](C(=O)OCC(CC)CC)C)O)O)C#N RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 2
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 2
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 description 2
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 description 2
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 description 2
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960000838 tipranavir Drugs 0.000 description 2
- SUJUHGSWHZTSEU-FYBSXPHGSA-N tipranavir Chemical compound C([C@@]1(CCC)OC(=O)C([C@H](CC)C=2C=C(NS(=O)(=O)C=3N=CC(=CC=3)C(F)(F)F)C=CC=2)=C(O)C1)CC1=CC=CC=C1 SUJUHGSWHZTSEU-FYBSXPHGSA-N 0.000 description 2
- DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N trans-chalcone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCFYEAOKVJSACF-UHFFFAOYSA-N umifenovir Chemical compound CN1C2=CC(Br)=C(O)C(CN(C)C)=C2C(C(=O)OCC)=C1CSC1=CC=CC=C1 KCFYEAOKVJSACF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004626 umifenovir Drugs 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- KUDXTBCRESIJFH-FQEVSTJZSA-N (3R)-4-(3-methyl-1,2-oxazole-4-carbonyl)-3-(6-methylpyridin-3-yl)-1,4,7-triazatricyclo[7.3.0.03,7]dodeca-9,11-dien-8-one Chemical compound CC1=NOC=C1C(=O)N1[C@@]2(C=3C=NC(C)=CC=3)CN3C=CC=C3C(=O)N2CC1 KUDXTBCRESIJFH-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- HSTZMXCBWJGKHG-UHFFFAOYSA-N (E)-piceid Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC(O)=CC(C=CC=2C=CC(O)=CC=2)=C1 HSTZMXCBWJGKHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- NEZONWMXZKDMKF-JTQLQIEISA-N Alkannin Chemical compound C1=CC(O)=C2C(=O)C([C@@H](O)CC=C(C)C)=CC(=O)C2=C1O NEZONWMXZKDMKF-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- MFMQRDLLSRLUJY-DXKBKAGUSA-N Desoxyrhaponticin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)=C1 MFMQRDLLSRLUJY-DXKBKAGUSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101001037140 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-23 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100040220 Immunoglobulin heavy variable 3-23 Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001071917 Lithospermum Species 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 208000019202 Orthocoronavirinae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004748 abacavir Drugs 0.000 description 1
- MCGSCOLBFJQGHM-SCZZXKLOSA-N abacavir Chemical compound C=12N=CN([C@H]3C=C[C@@H](CO)C3)C2=NC(N)=NC=1NC1CC1 MCGSCOLBFJQGHM-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- UNNKKUDWEASWDN-UHFFFAOYSA-N alkannin Natural products CC(=CCC(O)c1cc(O)c2C(=O)C=CC(=O)c2c1O)C UNNKKUDWEASWDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000003339 best practice Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- RSUVYMGADVXGOU-BUHFOSPRSA-N cinanserin Chemical compound CN(C)CCCSC1=CC=CC=C1NC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 RSUVYMGADVXGOU-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 1
- 229950001684 cinanserin Drugs 0.000 description 1
- LXGJPDKYMJJWRB-IERUDJENSA-N cinanserin hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)CCCSC1=CC=CC=C1NC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 LXGJPDKYMJJWRB-IERUDJENSA-N 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229950000148 enzaplatovir Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- RZTBBIIHQWIBBU-UHFFFAOYSA-N herbaline Natural products O=C1NC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C11CCN2CC3C(C)OCC(C(=O)OC)C3CC21 RZTBBIIHQWIBBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007102 hereditary spastic paraplegia 6 Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000000530 impalefection Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229960003762 maribavir Drugs 0.000 description 1
- KJFBVJALEQWJBS-XUXIUFHCSA-N maribavir Chemical compound CC(C)NC1=NC2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O KJFBVJALEQWJBS-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- GOFXWTVKPWJNGD-UWJYYQICSA-N n-[2-[(2s)-2-[5-[(3s)-3-aminopyrrolidin-1-yl]-6-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-yl]piperidine-1-carbonyl]-4-chlorophenyl]methanesulfonamide Chemical compound CC1=CN2N=C([C@H]3N(CCCC3)C(=O)C=3C(=CC=C(Cl)C=3)NS(C)(=O)=O)C=C2N=C1N1CC[C@H](N)C1 GOFXWTVKPWJNGD-UWJYYQICSA-N 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229960003764 polydatin Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950007560 presatovir Drugs 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- PMJIHLSCWIDGMD-UHFFFAOYSA-N tideglusib Chemical compound O=C1SN(C=2C3=CC=CC=C3C=CC=2)C(=O)N1CC1=CC=CC=C1 PMJIHLSCWIDGMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950005284 tideglusib Drugs 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- HSTZMXCBWJGKHG-CUYWLFDKSA-N trans-piceid Polymers O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)=C1 HSTZMXCBWJGKHG-CUYWLFDKSA-N 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1002—Coronaviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1002—Coronaviridae
- C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
- G01N2470/04—Sandwich assay format
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本揭示內容是關於一種用以檢測嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)的重組抗體或其片段。依據某些實施方式,該SARS-CoV是SARS-CoV-1。依據某些可替代的實施方式,該SARS-CoV是SARS-CoV-2。本揭示內容亦涵蓋一種包含該重組抗體的套組,以及一種利用該重組抗體或該套組來診斷SARS-CoV感染的方法。
Description
本揭示內容整體上是關於疾病診斷的技術領域。更具體來說,本揭示內容是關於一種重組抗體,以及其於診斷嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)感染的用途,特別是用於診斷SARS-CoV-2感染。
世界衛生組織(World Health Organization,WHO)於2020年3月11日宣布,2019年底在中國武漢爆發的SARS-CoV-2疫情已經造成全球性COVID-19 (coronavirus infectious disease 2019,2019年新型冠狀病毒感染症)大流行。根據WHO的COVID-19儀表板(dashboard)的告示,截至2021年4月25日為止,大流行已經波及220多個國家/區域,並且造成至少146,054,107例確診病例,其中包括3,092,410例死亡。迄今為止,對許多國家和地區來說,SARS-CoV-2的疫情爆發已被證明在健康、社會和經濟等方面帶來前所未有的災難。在未來最壞的情況下,SARS-CoV-2的疫情爆發將會持續影響大多數國家,尤其是對於該些資源有限的低收入國家,因該些國家難以減輕與病毒傳染相關的負擔。
考量到在向大眾提供有效的治療和疫苗之前,預防是能夠減少大流行衝擊的最佳做法,因此對SARS-CoV-2感染進行大規模和廣泛的篩檢在遏制大流行的蔓延上顯得至關重要。迄今為止,大多數用於SARS-CoV-2的分子檢測程序是即時(real-time)逆轉錄酶PCR測定法(RT-PCR)。或者是,可利用快速和定量/半定量的分子檢測的強大技術如病毒抗原的免疫分析方法。特別是,可利用側流式免疫測定法(lateral flow immunoassay,LFIA),它符合WHO的ASSURED(可負擔(affordable)、靈敏度(sensitive)、特異度(specific)、方便使用(user-friendly)、快速且穩健(rapid and robust)、免設備(equipment free)和可交付(deliverable))準則。然而,到目前為止,市面上用於檢測SARS-CoV-2抗原的檢測試劑只有少數幾個,而且它們通常需要在有大量病毒存在的情況下才能有效檢出。
有鑑於此,相關領域亟需一種對SARS-CoV-2具有足夠專一性和親和力的抗體,據以建立一種用於預防感染和/或治療目的的診斷平臺。
下文呈現本揭示內容的簡單概要,以利讀者對本揭示內容有基本的理解。本概要並非對本揭示內容的廣泛性概觀,也非用以鑑別本揭示內容的關鍵性/決定性元件,或勾勒本揭示內容的範圍。它唯一的目的在於以一種簡化的形式呈現本揭示內容某些概念,以作為後續呈現更多詳細說明的序幕。
如在本文中所實施和廣泛描述的,本揭示內容的第一態樣是關於一種重組抗體或其片段。依據本揭示內容的實施方式,該重組抗體或該抗體片段包含一輕鏈變異(light chain variable,VL)區和一重鏈變異(heavy chain variable,VH)區,其中該VL區包含一第一輕鏈互補性決定區(first light chain complementarity determining region,CDR-L1)、一第二輕鏈互補性決定區(CDR-L2),以及一第三輕鏈互補性決定區(CDR-L3);以及該VH區包含一第一重鏈互補性決定區(first heavy chain CDR,CDR-H1)、一第二重鏈互補性決定區(CDR-H2),以及一第三重鏈互補性決定區(CDR-H3)。
依據本揭示內容的某些實施方式,該CDR-L1、該CDR-L2和該CDR-L3分別具有序列編號:1-3的胺基酸序列,以及該CDR-H1、該CDR-H2和該CDR-H3分別具有序列編號:4-6的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式,該VL區包含一與序列編號:43具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:44具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作實施例中,該重組抗體或該抗體片段的VL區和VH區分別包含序列編號:43和44的胺基酸序列。
依據本揭示內容的某些實施方式,該CDR-L1、該CDR-L2和該CDR-L3分別具有序列編號:7-9的胺基酸序列,以及該CDR-H1、該CDR-H2和該CDR-H3分別具有序列編號:10-12的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式,該VL區包含一與序列編號:45具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:46具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作實施例中,該重組抗體或該抗體片段的VL區和VH區分別包含序列編號:45和46的胺基酸序列。
依據本揭示內容的某些實施方式,該CDR-L1、該CDR-L2和該CDR-L3分別具有序列編號:13-15的胺基酸序列,以及該CDR-H1、該CDR-H2和該CDR-H3分別具有序列編號:16-18的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式,該VL區包含一與序列編號:47具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:48具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些實施例中,該重組抗體或該抗體片段的VL區和VH區分別包含序列編號:47和48的胺基酸序列。
依據本揭示內容的某些實施方式,該CDR-L1、該CDR-L2和該CDR-L3分別具有序列編號:19-21的胺基酸序列,以及該CDR-H1、該CDR-H2和該CDR-H3分別具有序列編號:22-24的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該VL區包含一與序列編號:49具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:50具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些實施例中,該重組抗體或該抗體片段的VL區和VH區分別包含序列編號:49和50的胺基酸序列。
依據本揭示內容的某些實施方式,該CDR-L1、該CDR-L2和該CDR-L3分別具有序列編號:25-27的胺基酸序列,以及該CDR-H1、該CDR-H2和該CDR-H3分別具有序列編號:28-30的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式,該VL區包含一與序列編號:51具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:52具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作實施例中,該重組抗體或該抗體片段的VL區和VH區分別包含序列編號:51和52的胺基酸序列。
依據本揭示內容的某些實施方式,該CDR-L1、該CDR-L2和該CDR-L3分別具有序列編號:31-33的胺基酸序列,以及該CDR-H1、該CDR-H2和該CDR-H3分別具有序列編號:34-36的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式,該VL區包含一與序列編號:53具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:54具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些特定的實施例中,該重組抗體或該抗體片段的VL區和VH區分別包含序列編號:53和54的胺基酸序列。
依據本揭示內容的某些實施方式,該CDR-L1、該CDR-L2和該CDR-L3分別具有序列編號:37-39的胺基酸序列,以及該CDR-H1、該CDR-H2和該CDR-H3分別具有序列編號:40-42的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該VL區包含一與序列編號:55具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:56具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些特定的實施例中,該重組抗體或該抗體片段的VL區和VH區分別包含序列編號:55和56的胺基酸序列。
本揭示內容亦涵蓋一種用以檢測一生物學樣本中是否存在SARS-CoV (例如,SARS-CoV-2)的套組。本揭示內容套組包含一第一重組抗體、一第二重組抗體,以及一含有該第一和該第二重組抗體的容器,其中該第一和該第二重組抗體個別是選自於本揭示內容的第一態樣中所述之重組抗體。依據某些實施方式,該第一和該第二重組抗體中的其中一抗體係作為一捕捉抗體,而該第一和該第二重組抗體中的另一抗體則作為一偵測抗體,其係用於一檢測技術中,例如,酵素免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、側流式免疫測定法(LFIA),以及西方墨點法(western blotting,WB)等。
依據某些實施方式,該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別包含序列編號:31-36的胺基酸序列,以及該第二重組抗體的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別包含序列編號:37-42的胺基酸序列。在某些例示性的實施方式中,該第一重組抗體的VL區和VH區分別包含一與序列編號:53和54具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該第二重組抗體的VL區和VH區分別包含一與序列編號:55和56具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在一特定的實施例中,該第一重組抗體的VL區和VH區分別包含序列編號:53和54的胺基酸序列,以及該第二重組抗體的VL區和VH區分別包含序列編號:55和56的胺基酸序列。
本揭示內容的另一態樣是關於一種藉由一分離自一個體的生物學樣本來確認該個體是否感染SARS-CoV的方法。該方法包含以下步驟,藉由使用本揭示內容重組抗體或套組來檢測該生物學樣本中存在或不存在該SARS-CoV的核鞘蛋白(nucleocapsid protein),其中該核鞘蛋白的存在表示該個體是感染SARS-CoV。依據某些實施方式,該SARS-CoV是SARS-CoV-1 (NCBI參考序列:NC_004718.3),此乃是在2002年至2004年間造成多國疫情爆發的冠狀病毒。依據某些實施方式,該SARS-CoV是SARS-CoV-2 (NCBI參考序列:NC_045512.2),此即是在2019年底造成COVID-19的冠狀病毒。
取決於目的的不同,該生物學樣本可以是支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)、痰液、鼻部組織、咽部組織、糞便或血液。
基於上述的結果,本領域技術人員或臨床從業人員可及時對一有需要之個體投予適當的治療。具體來說,在核鞘蛋白存在於一個體之生物學樣本中的情況下,將一補充供氧(supplemental oxygen)治療和/或一有效量之治療(例如,干擾素-α (IFN-α)、氯喹(chloroquine)、磷酸氯喹(chloroquine phosphate)、阿比朵爾(arbidol)、茚地那韋(indinavir)、沙奎那韋(saquinavir)、洛匹那韋(lopinavir)、卡非佐米(carfilzomib)、利托那韋(ritonavir)、利巴韋林(ribavirin)、瑞德西韋(remdesivir)、阿扎那韋(atazanavir)、地瑞那韋(darunavir)、替拉那韋(tipranavir)、福沙那韋(fosamprenavir)、恩扎普拉托韋(enzaplatovir)、普瑞沙韋(presatovir)、阿巴卡韋(abacavir)、硼替佐米(bortezomib)、艾替拉韋(elvitegravir)、馬利巴韋(maribavir)、雷替拉韋(raltegravir)、孟魯司特(montelukast)、去氧根皮苷(deoxyrhapontin)、虎杖苷(polydatin)、查耳酮(chalcone)、雙硫崙(disulfiram)、卡莫氟(carmofur)、紫草素(shikonin)、依布硒啉(ebselen)、替格魯司(tideglusib)、1-甲基丙基2-咪唑基二硫化物(1-methylpropyl 2-imidazolyl disulfide,PX12)、噻二唑烷-8 (thiadiazolidine-8,TDZD-8)、環孢素A(cyclosporin A)、肉桂硫胺(cinanserin),或是其組合)投予至該個體,據以減輕和/或改善該些與SARS-CoV感染相關的症狀。
該個體是一哺乳動物;較佳地,是人類。
在參閱以下的詳細說明及附隨圖式後,本揭示內容諸多伴隨的特徵及優點當可輕易瞭解。
為使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述,但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
I.
定義
為方便起見,本說明書、實施例及所附申請專利範圍中所使用的特定專有名詞集中在此。除非本說明書另有定義,否則此處所使用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。並且,在和上下文不相衝突的情形下,本說明書所使用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型,而所使用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體來說,在本說明書與申請專利範圍中,單數形式「一」(a及an)包括複數參考值,但依據上下文而另有明確表示者除外。此外,在本說明書與申請專利範圍中,「至少一」(at least one)與「一或多」(one or more)表述方式的意義相同,兩者都代表包含了一、二、三或更多。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值,此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而,任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所導致的標準偏差。並且,在此處,「約」(about)一詞通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是,「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差內,視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除實施例以外,或除非另有明確的說明,當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如,用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他類似者)均經過「約」的修飾。據此,除非另有相反的說明,本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值,且可視需求而更動。至少,應將此等數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
「抗體」(antibody)一詞在本揭示內容中具有最廣泛的意義,具體來說包含單株抗體(包括全長的單株抗體)、多株抗體、多功(multi-specific)或多效(multivalent)抗體(例如,雙功(bi-specific)抗體),以及具有欲求之生物活性的抗體片段。「抗體片段」(antibody fragment或the fragment of an antibody)一詞是指全長抗體的一部分,一般為全長抗體的抗原結合區或變異區(即VL區和VH區)。例示性的抗體片段包含抗原結合片段(fragment antigen-binding,Fab)、Fab’、F(ab’)2、單鏈變異片段(single-chain variable fragment,scFv)、雙鏈抗體(diabody)、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體分子,以及由抗體片段所形成的多功抗體。
本文所使用之「EC50
」一詞是指抗體或其抗原結合部分的濃度,在活體外(in vitro
)或活體內(in vivo
)試驗中所引發的反應為最大反應的50%,即,所引發的反應為最大反應和基線(baseline)之間的一半。
本文使用之「互補性決定區(complementarity determining region,CDR)」一詞是指抗體分子的高變區(hypervariable region),其形成一個與所結合之抗原的3維表面互補的表面。從N-端到C-端,每個抗體的重鏈和輕鏈包含三個CDR (即CDR-1、CDR-2和CDR-3)。因此,HLA-DR抗原結合位點總共包括六個CDR,其中包含三個來自重鏈變異區的CDR (即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3),以及三個來自輕鏈變異區的CDR (即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。CDR的胺基酸殘基與所結合的抗原緊密接觸,其中與抗原最密切接觸的通常是重鏈CDR3。
本文所使用之抗體的「變異區」(variable region)一詞是指抗體重鏈或輕鏈的胺基末端區域。該些區域通常是抗體中最具有變異性的部分,包含抗原結合位點。「變異的」(variable)一詞是指該變異區的某些部分在不同抗體之間在序列上有很大差異的事實,其係用於決定每個特定抗體對其特定抗原的結合和專一性。然而,所述變異性(variability)並非均勻分布在整個抗體的變異區內。它是集中在輕鏈和重鏈變異區中稱為互補性決定區(CDR)或高變區的三個區段中。變異區中具有高度保守的部分稱為框架(framework,FR)。天然重鏈和輕鏈的變異區各包含四個FR區,其主要採用β-折板(β-sheet)的配置,並由三個CDR連接,該三個CDR形成連接β-折板結構的環,在某些情況下會形成β-折板結構的一部分。各個鏈中的CDR由FR區緊密連接在一起,並且與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合,但表現出各種效應子(effector)的功能,例如參與在抗體的抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular toxicity)效應中。
「序列相似度百分比(%)」(percentage (%) sequence identity)在本揭示內容所揭示的任一種胺基酸序列中是定義為候選序列中的胺基酸殘基與特定參考序列中的胺基酸殘基相同的百分比,在比對序列時可視需要來引入間隙(gap),藉以達到最大的序列相似度百分比,並且不考慮任何保守性置換(conservative substitution)作為序列相似度的一部分。可利用各種本領域技術人員所熟知的方法來進行比對,以確認序列相似度百分比,舉例來說,可利用例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等公開的電腦軟體來進行比對。本領域技術人員可決定測量比對的適當參數,包括任一種所需的演算法以利使所比對的全長序列達到最大的比對值。為達本文的目的,兩條胺基酸序列之間的序列比對是利用國家生物技術訊息中心(Nation Center for Biotechnology Information,NCBI)於線上提供的電腦軟體Blastp (protein-protein BLAST)來分析。一特定序列A與一特定序列B之間的序列相似度百分比(亦可表述為一特定序列A與一特定序列B具有某特定百分比的序列相似度)是利用下列公式來計算:
其中X是經序列比對程式BLAST後,在該程式中的A和B比對中被評定為相同匹配的胺基酸殘基數量,Y則是特定序列B中的胺基酸殘基總數。
如在本文中所討論的,抗體的胺基酸序列中具有些微變化亦視為涵蓋在本揭示內容和請求保護的發明構思中,只要該胺基酸序列的變異度保持至少85%的序列相似度,例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列相似度。本揭示內容抗體可進行特定修飾,以改變與其生理活性無關的肽的特徵。舉例來說,可以改變和/或刪除某些胺基酸,而不影響本研究中的抗體生理活性(即,與冠狀病毒結合的能力)。特別是,保守性胺基酸發生置換是可以預期的。保守性置換(conservative replacement)是指在其側鏈具有相關性的胺基酸家族中所發生的置換。遺傳性編碼的胺基酸一般分為以下家族:(1) 酸性 = 天門冬胺酸、麩胺酸;(2) 鹼性 = 離胺酸、精胺酸、組胺酸;(3) 非極性 = 丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸;以及(4) 非帶電之極性 = 甘胺酸、天門冬醯胺、穀醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。更佳的家族分為:絲胺酸和蘇胺酸為脂肪羥基家族;天門冬醯胺和穀醯胺為含醯胺基家族;丙胺酸、纈胺酸、白胺酸和異白胺酸為脂肪族家族;以及苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸為芳香家族。舉例來說,可以合理預期將白胺酸單獨置換成異白胺酸或纈胺酸,將天門冬胺酸置換成麩胺酸,將蘇胺酸置換成絲胺酸,或是將一胺基酸進行類似的置換並換成一結構相關的胺基酸而不會對所得分子的結合或特性產生重大影響,特別是當該置換並未涉及框架位點內的胺基酸時。藉由測定胜肽衍生物的比活性(specific activity),可以很容易地確認胺基酸變化是否會產生功能性胜肽。本領域普通技術人員可以容易地製備抗體的片段或類似物。較佳的片段或類似物的胺基末端和羧基末端會出現在功能性區域的邊界附近。
「個體」(subject)一詞是指哺乳動物,包括可以接受本揭示內容重組抗體、套組和/或方法的人類物種。除非特別指明一種性別,否則「個體」一詞旨在指男性和女性兩者。
II.
發明詳述
(II-1)
用以選取專一性結合冠狀病毒之抗體片段的方法
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以選取可專一性結合至冠狀病毒之抗體片段的方法。依據本揭示內容的實施方式,該方法包含以下步驟:
(a) 提供一噬菌體展示單鏈變異片段(single-chain variable fragment,scFv)庫,其包含複數個噬菌體展示scFv,其中各別噬菌體展示scFv的VH區對蛋白A具有結合親和力,以及各別噬菌體展示scFv的VL區對蛋白L具有結合親和力;
(b) 將步驟(a)的噬菌體展示scFv庫暴露於一源自冠狀病毒之核鞘蛋白中;
(c) 從步驟(b)的噬菌體展示scFv庫中選取複數個分別對該核鞘蛋白展現出結合親和力的會表現scFv的噬菌體;
(d) 分別使步驟(c)中所選出的複數個噬菌體表現出複數個可溶性scFv;
(e) 將步驟(d)的複數個可溶性scFv暴露於該核鞘蛋白中;
(f) 分別確認步驟(e)中的複數個可溶性scFv對該核鞘蛋白的結合親和力;以及
(g) 基於步驟(f)中所確定的結果,從複數個可溶性scFv中選取一個親和力優於其他可溶性scFv的可溶性scFv作為抗體片段。
本揭示內容方法可用以選取一種對冠狀病毒展現出結合親和力和專一性的抗體片段。依據本揭示內容的某些實施方式,可藉由該選出的抗體片段來檢測的冠狀病毒是SARS-CoV-1。依據本揭示內容的某些實施方式,可藉由該選出的抗體片段來檢測的冠狀病毒是SARS-CoV-2。
在步驟(a)中,是提供一種噬菌體展示scFv庫。依據本揭示內容的實施方式,該噬菌體展示scFv庫的框架係基於人類IGKV1-NL1*01/IGHV3-23*04種系(germline)序列,以及其互補決定區(CDR,包括CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)係藉由使用特定引子的PCR反應進行多樣化(diversified)。在進行選汰(selection)蛋白A和蛋白L之後,可製得該噬菌體展示scFv庫(以下稱為「GH2庫」,包括如本揭示內容實施例所示之GH2-5庫、GH2-6庫、GH2-7庫、GH2-8庫、GH2-9庫、GH2-10庫、GH2-11庫、GH2-12庫、GH2-13庫、GH2-14庫、GH2-16庫、GH2-18庫、GH2-20庫、GH2-22庫,以及GH2-24庫),其中該複數個噬菌體展示scFv中的每一個scFv都具有能夠結合蛋白A的VH區和能夠結合蛋白L的VL區。該噬菌體展示scFv庫可使用PCT申請案PCT/US2016/19128和PCT/US18/56627,以及陳英謙(Ing-Chien Chen)等人的公開文獻(High throughput discovery of influenza virus neutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibody libraries, Scientific Reports 7, Article number: 14455 (2017))中所描述的方法來建構。該申請案和公開文獻在此通過引用而併入其全文。
在步驟(b)中,是將GH2庫暴露於一源自冠狀病毒之核鞘蛋白中。依據某些實施方式,該冠狀病毒是SARS-CoV-2;在該些實施方式中,該核鞘蛋白包含序列編號:58的胺基酸序列。依據某些實施方式,所述核鞘蛋白是固定在一基質(例如,瓊脂糖樹脂或聚丙烯醯胺)上,接著與本揭示內容GH2庫混和。
在步驟(c)中,從GH2庫中選取複數個分別對該核鞘蛋白展現出結合親和力的會表現scFv的噬菌體。具體來說,是將步驟(b)的產物經沖提緩衝液處理,該緩衝液通常是一種酸性溶液(例如,甘胺酸溶液,pH 2.2),據以破壞該核鞘蛋白與噬菌體展示scFv之間的結合。藉由這種方式,可以收集到複數個分別對該核鞘蛋白展現出結合親和力的會表現scFv的噬菌體。
非必要性地,步驟(c)是在酸性條件下進行。具體來說,可對步驟(b)的產物進行酸處理(舉例來說,利用pH值在5-7之間的洗滌緩衝液,例如,利用pH為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7的洗滌緩衝液;較佳地,利用pH值為5.0的洗滌緩衝液),接著進行前述的沖提步驟以收集該些複數個噬菌體。
接下來,在步驟(d)中,是將步驟(c)中所選出的複數個噬菌體置於適當條件下,使其能夠生產複數個可溶性scFv。其中所需的步驟可使用本領域普通技術人員所熟知的方法來進行。依據本揭示內容的某些實施方式,可利用乳糖操縱子(lac operon)來驅動VH區和VL區的表現;如本領域技術人員所熟知的,可藉由異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactoside,IPTG)來引發乳糖操縱子,進而驅動下游基因(即用以編碼VH區和VL區的基因)的表現。然後所生產的scFv會分泌到培養基的上清液中,並且可從中來收集。
在步驟(e)中,是將步驟(d)中所生產的可溶性scFv分別與核鞘蛋白混和,據以形成蛋白-scFv複合物。
接著,在步驟(f)中,可利用本領域普通技術人員所熟知之用於分析兩個分子之間的結合親和力(例如,抗體對抗原的結合親和力)的方法來確認步驟(e)中所形成的蛋白質-scFv複合物的量;舉例來說,可利用酵素免疫測定法(ELISA)、西方墨點法(WB)檢測、流式細胞分析法(flow cytometry)或側流式免疫測定法(LFIA)等方法來檢測。一般來說,蛋白質-scFv複合物的量會與scFv與核鞘蛋白之間的結合親和力成正比。依據一操作實施例,是利用ELISA來確認該蛋白-scFv複合物的量(即可溶性scFv與核鞘蛋白之間的結合親和力)。
最後,在步驟(g)中,是基於步驟(f)中所確定的結合親和力來選出抗體片段。更具體來說,是選取一個,相較於該複數個可溶性scFv中的其他可溶性scFv來說,對核鞘蛋白展現出優異的親和力的可溶性scFv來作為抗體片段。
(II-2)
用以製備重組抗體的方法
可將藉由(II-1)章節的方法所選出的抗體片段用於製備重組抗體,所述重組抗體在結構上包含一VL區、一輕鏈恆定(light chain constant,CL)區、一VH區,以及一重鏈恆定(heavy chain constant,CH)區。使用抗體片段來製備重組抗體的方法包含以下步驟:
(a) 提供一表現該抗體片段的噬菌體;
(b) 萃取一與步驟(a)的噬菌體相對應的噬質體(phagemid) DNA;
(c) 以PCR並使用步驟(b)的噬質體DNA作為模板來分別擴增一用以編碼VH區的第一核酸序列,以及一用以編碼VL區的第二核酸序列;
(d) 將該第一和該第二核酸序列插入一包含一第三和一第四核酸序列的表現載體中,其中該第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白的CH區,以及該第四核酸序列係用以編碼該免疫球蛋白的CL區;以及
(e) 將步驟(d)的表現載體(包含該第一、該第二、該第三和該第四核酸序列)轉染宿主細胞以生產該重組抗體。
在本揭示內容方法中,是將會表現該抗體片段的噬菌體用作製備重組抗體的起始材料(即步驟(a))。
接著,如步驟(b)中所述,是萃取與會表現該抗體片段的噬菌體相對應的噬質體DNA。依據預期目的的不同,可藉由裂解(lysing)該噬菌體來萃取噬質體;或者是,可以從一細菌殖株(即含有噬質體的細菌殖株)來獲得噬質體。可藉由任一種常規的DNA萃取技術來達成從噬菌體或細菌殖株中萃取噬質體DNA的目的;舉例來說,可藉由苯酚/氯仿方法,以及清潔劑(例如,十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate)、TWEEN®-20、NP-40和TRITON® X-100)/乙酸方法來進行萃取。
在步驟(c)中,以所萃取出的噬質體DNA為模板,來分別擴增:(1) 用以編碼CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的第一核酸序列(其中使用專一性引子(正向引子:序列編號:64;反向引子:序列編號:65)來進行PCR),以及(2) 用以編碼CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的第二核酸序列(其中使用專一性引子(正向引子:序列編號:66;反向引子:序列編號:67)來進行PCR)。
在步驟(d)中,將該擴增的第一和第二核酸序列插入一表現載體中,其中該表現載體包含用以編碼免疫球蛋白之重鏈恆定區的第三核酸序列和用以編碼免疫球蛋白之輕鏈恆定區的第四核酸序列。當可理解,該免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE及IgM中的任一種。在本揭示內容的一較佳實施方式中,該免疫球蛋白是IgG。具體來說,該第一和該第二核酸序列是先藉由一鏈接物(linker)來連接,接著利用PCR從pIgG載體擴增。依據本揭示內容的實施方式,該鏈接物依序包含:CL區、牛生長激素(bovine growth hormone,BGH)多腺苷酸化(polyadenylation,polyA)訊號、人類CMV啟動子,以及IgG重鏈訊息肽。對於存在於第二核酸序列的3’-端和鏈接物的5’-端之間的互補序列,以及鏈接物的3’-端和第一個核酸序列的5’-端之間的互補序列,該第二核酸序列、該鏈接物和該第一核酸序列可藉由重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlap extension polymerase chain reaction,OE-PCR)來依序組裝。然後,藉由使用限制酶將所組裝的產物插入至表現載體pIgG中。在結構上來說,該建構的表現載體依序包含:第一人類CMV啟動子、IgG輕鏈訊息肽、第二核酸序列、CL區、第一BGH-polyA訊號、第二人類CMV啟動子、IgG重鏈訊息肽、第一核酸序列、CH區,以及第二BGH-polyA訊號,其中該第二核酸序列和該CL區是藉由該第一人類CMV啟動子來驅動,據以表現該重組抗體的輕鏈,以及該第一核酸序列和該CH區是藉由該第二人類CMV啟動子來驅動,據以表現該重組抗體的重鏈。
在步驟(e)中,是將步驟(d)所建構的表現載體轉染至宿主細胞中,據以製備本揭示內容重組抗體。通常所使用的宿主細胞是一哺乳動物細胞,例如HEK293細胞。可藉由本領域技術人員所熟知的任一種方法來進行轉染,包括基於化學的方法(例如,磷酸鈣、微脂體(liposome)和陽離子聚合物);非化學的方法(例如,電穿孔、細胞擠壓(cell squeezing)、聲穿孔(sonoporation)、光學轉染(optical transfection)、原生質體融合(protoplast fusion)和流體動力傳遞(hydrodynamic delivery));基於粒子的方法(例如,基因槍(gene gun)、磁轉染(magnetofection)和穿刺轉染(impalefection));以及利用病毒的方法(例如,腺病毒載體、辛德比斯(sindbis)病毒載體和慢病毒載體)。由此所製備的重組抗體會分泌到培養基的上清液中,並且可藉由任何本領域技術人員所熟知的任一種純化方法來從中純化;舉例來說,可藉由與蛋白A或蛋白G的親和性結合來達成純化。
(II-3)
重組抗體
依據本揭示內容的某些實施方式,是藉由(II-1)章節的方法來選出七個抗體片段,以及從中製成七個重組抗體。因此,本揭示內容並揭示七個重組抗體,分別命名為「抗體#7」、「抗體#11」、「抗體#21」、「抗體#22」、「抗體#33」、「抗體#36」和「抗體#48」。在結構上,每個重組抗體都包含一VL區和一VH區,其中該VL區包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,以及該VH區包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
依據某些實施方式,該抗體#7的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別具有序列編號:1-3的胺基酸序列(即,分別具有與序列編號:1-3具有100%之序列相似度的胺基酸序列),以及該抗體#7的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別具有序列編號:4-6的胺基酸序列(即,分別具有與序列編號:4-6具有100%之序列相似度的胺基酸序列)。依據某些實施方式,該抗體#7的VL區包含一與序列編號:43具有至少85%(例如,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之序列相似度的胺基酸序列;以及該抗體#7的VH區包含一與序列編號:44具有至少85%(例如,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之序列相似度的胺基酸序列。當可理解,該VH區和該VL區的序列(例如,框架序列)可能會有所不同(例如,經保守性或非保守性的胺基酸殘基所置換),但不影響本揭示內容抗體的結合親和力和/或專一性。較佳地,該VH區和該VL區的序列係經一或多個具有相類似特性的適當胺基酸進行保守性置換;舉例來說,將白胺酸(一種非極性胺基酸殘基)置換成異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸或色胺酸(另一種非極性胺基酸殘基);將天門冬胺酸(一種酸性胺基酸殘基)置換成麩胺酸(另一種酸性胺基酸殘基);或是將離胺酸(一種鹼性胺基酸殘基)置換成精胺酸或組胺酸(另一種鹼性胺基酸殘基)。依據較佳的實施方式,該抗體#7的VL區和VH區分別包含一與序列編號:43和44具有至少90%之序列相似度的的胺基酸序列。更佳地,該抗體#7的VL區和VH區分別包含一與序列編號:43和44具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容的一操作實施例中,該抗體#7的VL區具有序列編號:43的胺基酸序列(即,具有與序列編號:43具有100%之序列相似度的胺基酸序列),以及該抗體#7的VH域具有序列編號:44的胺基酸序列(即,具有與序列編號:44具有100%之序列相似度的胺基酸序列)。
依據某些實施方式,該抗體#11的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別具有序列編號:7-9的胺基酸序列,以及該抗體#11的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別具有序列編號:10-12的胺基酸序列。依據某些實施方式,該抗體#11的VL區包含一與序列編號:45具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;以及該抗體#11的VH區包含一與序列編號:46具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該抗體#11的VL區和VH區分別包含一與序列編號:45和46具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地,該抗體#11的VL區和VH區分別包含一與序列編號:45和46具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容的一操作實施例中,該抗體#11的VL區具有序列編號:45的胺基酸序列,以及該抗體#11的VH區具有序列編號:46的胺基酸序列。
依據某些實施方式,該抗體#21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別具有序列編號:13-15的胺基酸序列,以及該抗體#21的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別具有序列編號:16-18的胺基酸序列。依據某些實施方式,該抗體#21的VL區包含一與序列編號:47具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;以及該抗體#21的VH區包含一與序列編號:48具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該抗體#21的VL區和VH區分別包含一與序列編號:47和48具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地,該抗體#21的VL區和VH區分別包含一與序列編號:47和48具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容的一操作實施例中,該抗體#21的VL區具有序列編號:47的胺基酸序列,以及該抗體#21的VH區具有序列編號:48的胺基酸序列。
依據某些實施方式,該抗體#22的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別具有序列編號:19-21的胺基酸序列,以及該抗體#22的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別具有序列編號:22-24的胺基酸序列。依據某些實施方式,該抗體#22的VL區包含一與序列編號:49具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;以及該抗體#22的VH區包含一與序列編號:50具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該抗體#22的VL區和VH區分別包含一與序列編號:49和50具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地,該抗體#22的VL區和VH區分別包含一與序列編號:49和50具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容的一操作實施例中,該抗體#22的VL區具有序列編號:49的胺基酸序列,以及該抗體#22的VH區具有序列編號:50的胺基酸序列。
依據某些實施方式,該抗體#33的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別具有序列編號:25-27的胺基酸序列,以及該抗體#33的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別具有序列編號:28-30的胺基酸序列。依據某些實施方式,該抗體#33的VL區包含一與序列編號:51具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;以及該抗體#33的VH區包含一與序列編號:52具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該抗體#33的VL區和VH區分別包含一與序列編號:51和52具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地,該抗體#33的VL區和VH區分別包含一與序列編號:51和52具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容的一操作實施例中,該抗體#33的VL區具有序列編號:51的胺基酸序列,以及該抗體#33的VH區具有序列編號:52的胺基酸序列。
依據某些實施方式,該抗體#36的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別具有序列編號:31-33的胺基酸序列,以及該抗體#36的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別具有序列編號:34-36的胺基酸序列。依據某些實施方式,該抗體#36的VL區包含一與序列編號:53具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;以及該抗體#36的VH區包含一與序列編號:54具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該抗體#36的VL區和VH區分別包含一與序列編號:53和54具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地,該抗體#36的VL區和VH區分別包含一與序列編號:53和54具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容的一操作實施例中,該抗體#36的VL區具有序列編號:53的胺基酸序列,以及該抗體#36的VH區具有序列編號:54的胺基酸序列。
依據某些實施方式,該抗體#48的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別具有序列編號:37-39的胺基酸序列,以及該抗體#48的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別具有序列編號:40-42的胺基酸序列。依據某些實施方式,該抗體#48的VL區包含一與序列編號:55具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;以及該抗體#48的VH區包含一與序列編號:56具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據較佳的實施方式,該抗體#48的VL區和VH區分別包含一與序列編號:55和56具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地,該抗體#48的VL區和VH區分別包含一與序列編號:55和56具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容的一操作實施例中,該抗體#48的VL區具有序列編號:55的胺基酸序列,以及該抗體#48的VH區具有序列編號:56的胺基酸序列。
依據本揭示內容的某些實施例,該七個抗體中的每一個(即,抗體#7、抗體#11、抗體#21、抗體#22、抗體#33、抗體#36和抗體#48中的每一個)可用於檢測SARS-CoV (例如,SARS-CoV-2),因此該些抗體可作為一種用以診斷SARS-CoV感染(例如,SARS-CoV-2感染)的檢測試劑。
(II-4)
用以檢測
SARS-CoV
的套組
因此,本揭示內容的另一態樣在於提供一種用以檢測SARS-CoV感染(例如,SARS-CoV-2感染)的套組。該套組至少包含一第一重組抗體、一第二重組抗體,以及一含有該第一和該第二重組抗體的容器。依據本揭示內容的某些實施方式,該第一和該第二重組抗體是個別選自如上文所述之抗體#7、抗體#11、抗體#21、抗體#22、抗體#33、抗體#36和抗體#48。本揭示內容套組可用於檢測一生物學樣本中的SARS-CoV感染(例如,SARS-CoV-2感染),並藉由任一種本領域技術人員所熟知的檢測技術(例如,酵素免疫測定法、側流式免疫測定法、西方墨點法,以及流式細胞分析法)來進行檢測。依據某些操作實施例,該第一和該第二重組抗體中的其中一抗體係作為一偵測抗體,以及該第一和該第二重組抗體中的另一抗體則作為一捕捉抗體,以用於酵素免疫測定法或側流式免疫測定法中。
在一實施方式中,該套組係包含抗體#11來作為偵測抗體,以及抗體#33來作為捕捉抗體(在本揭示內容中係命名為「D11C33抗體對」)。在另一實施方式中,該套組係包含抗體#21來作為偵測抗體,以及抗體#11來作為捕捉抗體(在本揭示內容中係命名為「D21C11抗體對」)。在另一實施方式中,該套組係包含抗體#22來作為偵測抗體,以及抗體#36來作為捕捉抗體(在本揭示內容中係命名為「D22C36抗體對」)。在再另一實施方式中,該套組係包含抗體#33來作為偵測抗體,以及抗體#7來作為捕捉抗體(在本揭示內容中係命名為「D33C07抗體對」)。在進一步的另一實施方式中,該套組係包含抗體#36來作為偵測抗體,以及抗體#48來作為捕捉抗體(在本揭示內容中係命名為「D36C48抗體對」)。
非必要性地,該套組可進一步包含一使用說明,以利說明如何使用該抗體片段或該重組抗體來檢測SARS-CoV感染(例如,SARS-CoV-2感染)。
(II-5)
用以診斷
SARS-CoV
感染的方法
本揭示內容亦涵蓋一種藉由一分離自一個體的生物學樣本來確認該個體是否感染SARS-CoV (例如,SARS-CoV-2)的方法。該方法包含,藉由使用本揭示內容重組抗體或套組來檢測該生物學樣本中存在或不存在該SARS-CoV (例如,SARS-CoV-2)的核鞘蛋白,其中該核鞘蛋白的存在表示該個體是感染SARS-CoV (例如,SARS-CoV-2),以及該核鞘蛋白的不存在表示該個體是未感染SARS-CoV (例如,SARS-CoV-2)。
依據某些較佳的實施方式,該冠狀病毒是SARS-CoV-2。
依據較佳的實施方式,該生物學樣本是取自於該個體的呼吸道;較佳地,是取自於該個體的上呼吸道。適用於本揭示內容方法中的生物學樣本之非限制性實例包含,從該個體的口腔、鼻腔、氣管、支氣管或肺中所分離出的黏膜組織、液體或分泌物(例如,痰)。
基於該診斷結果,本領域技術人員或臨床從業人員可對一有需要之個體(例如,一遭受SARS-CoV感染的個體)投予一補充供氧治療和/或一有效量之治療,從而改善和/或緩解該些與SARS-CoV感染相關的症狀。例示性之適用於本揭示內容方法中的治療包含,但不限於,IFN-α、氯喹、磷酸氯喹、阿比朵爾、茚地那韋、沙奎那韋、洛匹那韋、卡非佐米、利托那韋、利巴韋林、瑞德西韋、阿扎那韋、地瑞那韋、替拉那韋、福沙那韋、恩扎普拉托韋、普瑞沙韋、阿巴卡韋、硼替佐米、艾替拉韋、馬利巴韋、雷替拉韋、孟魯司特、去氧根皮苷、虎杖苷、查耳酮、雙硫崙、卡莫氟、紫草素、依布硒啉、替格魯司、1-甲基丙基2-咪唑基二硫化物(PX12)、噻二唑烷-8 (TDZD-8)、環孢素A、肉桂硫胺,以及其組合。
或者是,可對一具有SARS-CoV感染的個體及時採取隔離措施,據以防止可能的感染傳播。
可利用本揭示內容抗體、套組和/或方法來治療的個體為一哺乳動物,例如,人類、小鼠、大鼠、猴子、綿羊、山羊、貓、狗、馬或黑猩猩。較佳地,該個體為人類。
下文提出多個實施例來說明本揭示內容的某些態樣,以利本發明所屬領域技術具有通常知識者實踐本發明。不應將此等實施例視為對本發明範圍的限制。據信本發明所屬領域技術具有通常知識者在閱讀此處提出的說明後,可在不需過度解讀的情形下,完整利用並實踐本揭示內容。本文引用的所有公開文獻在此藉由引用而併入全文。
實施例
材料及方法
核鞘蛋白的製備
七個用以編碼人類冠狀病毒之核鞘蛋白的基因係來自於NCBI的蛋白數據庫。將這些基因進行密碼子優化和合成,以利分別用pET15b和pcDNA3.1載體在大腸桿菌和哺乳動物細胞中表現。在16°C下,將這些構建體利用0.5毫體積莫耳濃度(mM)之IPTG來誘發,並於大腸桿菌BL21 (DE3)細胞中過量表現。接著利用色層分析系統(使用Ni2+
帶電管柱(用以與His6
-標籤結合),結合緩衝液(含有50毫體積莫耳濃度之Tris-HCl (pH 8.0)和600毫體積莫耳濃度之NaCl),以及沖提緩衝液(含有50毫體積莫耳濃度之Tris-HCl (pH 8.0)、600毫體積莫耳濃度之NaCl和500毫體積莫耳濃度之咪唑(imidazole))),來純化該重組冠狀病毒之核鞘蛋白。接下來,將該些含有冠狀病毒之核鞘蛋白的餾分(fraction)合併,並進行粒徑排阻層析法(size exclusion separation)(使用管柱,以及沖提緩衝液(含有50毫體積莫耳濃度之Tris (pH 8.0)和600毫體積莫耳濃度之NaCl))純化。該些重組冠狀病毒之核鞘蛋白含有來自E. coli的RNA,且其A260/A280比例大於0.8。以蛋白質測定來分析該重組冠狀病毒之核鞘蛋白的濃度,是低於分光光度計的光學檢測極限和各個冠狀病毒之核鞘蛋白的消光係數(extinction coefficient)。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)來確認經純化的冠狀病毒之核鞘蛋白。藉由瞬時轉染(transient transfection)方式將該些構建體,包括pcDNA3.1-SARS-CoV-1-N-His、pcDNA3.1-SARS-CoV-2-N-His、pcDNA3.1-MERS-CoV-N-His、pcDNA3.1-OC43-N-His、pcDNA3.1-229E-N-His、pcDNA3.1-NL63-N-His和pcDNA3.1-HKU1-N-His,轉染至Expi-293細胞(濃度為2×108
個細胞/100毫升)中,並培養48小時。將10毫升之含有抑制劑的裂解緩衝液加入該細胞中,接著在4°C下離心(12,000 × g) 30分鐘。
該些由此所製備的核鞘蛋白分別命名為SARS-CoV-1-N蛋白、SARS-CoV-2-N蛋白、MERS-CoV-N蛋白、HCoV-OC43-N蛋白、HCoV-229E-N蛋白、HCoV-NL63-N蛋白和HCoV-HKU1-N蛋白,它們分別包含序列編號:57-63的胺基酸序列。
細胞株
將293T (美國菌種保存中心編號CRL-3216)培養在補充有10%之胎牛血清、青黴素-鏈黴素(100×)的培養基中。將懸浮性EXPI293F™細胞培養在EXPI293™表現培養基中,並培養在37°C下,以110每分鐘轉數(rpm)震盪,以及8%之CO2
的培養箱中。將Vero E6細胞培養在含有2%之FBS的培養基中。
病毒
將Vero E6細胞感染SARS-CoV-2 (TCDC#4)(使用劑量為半數組織培養感染劑量(TCID50
)的MOI 0.1,於含有2%之FBS的培養基中)。在感染後的第1、2和3天,收集經感染的細胞和培養上清液,分別用含有蛋白酶抑製劑混合物的裂解緩衝液和RNA套組來萃取病毒蛋白和RNA。
確認由噬菌體展示的合成scFv庫進行選汰和篩選步驟所衍生的IgG1
噬菌體展示的合成scFv庫的建構和確認係採用與PCT申請案PCT/US2016/19128和PCT/US18/56627,以及陳英謙等人的公開文獻(High throughput discovery of influenza virus neutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibody libraries, Scientific Reports 7, Article number: 14455 (2017))中所述之相同的步驟來建構和確認,沒有修改。用於淘選(panning)噬菌體展示庫、進行選汰和篩選噬菌體展示的scFv結合物(binder)、使用ELISA來確認與同源抗原(cognate antigen)和蛋白A/L結合的scFv、將scFv重製(reformatting)為IgG1、表現和純化IgG1,以及使用ELISA來確定抗體-抗原相互作用的EC50
等的相關實驗步驟,已經在共同申請審理中的PCT申請案PCT/US2016/19128和PCT/US18/56627中記載相關內容。
用三明治
ELISA (sandwich ELISA)
來檢測重組
N
蛋白
使用HRP耦接套組來將HRP耦接至偵測抗體上。將50微克之經純化的IgG以IgG:HRP = 1:2的體積莫耳比例(molar ratio)添加到HRP混合物中,並依據廠商的使用說明來淬滅(quenched)耦接反應。用96孔微量盤來進行三明治ELISA,將每孔用1微克之經純化的捕捉IgG來塗布,並在4°C下過夜。將重組核鞘蛋白加入到每個已用捕捉抗體塗布的孔中一小時。在洗滌後,每孔加入0.625微克/毫升之HRP耦接的偵測IgG (每孔100微升)。在每孔中加入基質(每孔100微升)使反應5分鐘,然後加入1 N之HCl (每孔100微升)以終止顯色反應,以進行呈色。接著測量450奈米下的吸光度。同時以三明治ELISA來測量成對之IgG的EC50
。將每孔用1微克之經純化的捕捉IgG來塗布,並在4°C下過夜。將重組核鞘蛋白以2倍連續稀釋來進行稀釋。將0.313微克/毫升之HRP耦接的偵測IgG (每孔100微升)添加到每孔中。計算EC50
。
用三明治陣列
(array)
來檢測重組
N
蛋白
將抗體陣列點在硝化纖維素膜(nitrocellulose membrane)上並進行三明治檢測的步驟。將抗體樣本以1毫克/毫升的濃度配製於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以用於陣列中,並依序列陣(arrayed)於10 × 10-點陣列中(使用網格化步驟(gridding protocol)與浮針工具(帶有FSP3針頭與100奈升之插槽的96針工具)。將每個抗體串聯戳印(tandemly stamped)在複寫點(duplicate spot)上。將抗體陣列用5%之脫脂牛奶(在PBST中)封閉1小時。在封閉之後,將重組SARS-CoV-2之核鞘蛋白,或表現SARS-CoV-2之核鞘蛋白的293F細胞裂解物填充(loaded)在陣列上。該重組SARS-CoV-2之核鞘蛋白的濃度為6微克/毫升。該細胞裂解物中的總蛋白濃度為800微克/毫升,相當於16微克/毫升之SARS-CoV-2之核鞘蛋白。將所有的陣列置於封閉緩衝液中反應30分鐘,其中每分鐘搖動15個循環。在填充抗原之後,將NC陣列用含有0.05%之TWEEN®
20的PBST清洗兩次,以去除多餘的抗原。以1,000倍稀釋之IgG-HRP耦接物溶液(在封閉緩衝液中)反應30分鐘來探測(probed)該填有抗原的陣列。在洗滌步驟之後,將該陣列以4-CN顯色基質反應5分鐘來進行檢測。用影像系統來定量測量該陣列上的斑點密度,並用於統計分析中。
膠體金
(colloidal gold)
耦
接的
AL2C
和
IgG
的製備
將100微升之0.2體積莫耳濃度之K2
CO3
(pH 11.5)與10毫升之膠體金溶液(pH 5-6)混和以調整pH (最終pH 9),然後將500微升之IgG (1毫克/毫升)或50微升之AL2C (3.35 毫克/毫升)加至該膠體金溶液中,並在室溫下反應40分鐘。加入1毫升之封閉緩衝液(10%之BSA,在20毫體積莫耳濃度之硼酸鈉中,pH 9.3),並在室溫下反應15分鐘,然後離心(15,000 g,30分鐘,4°C)。倒掉上清液,將沉澱物徹底地重新懸浮於10毫升之洗滌緩衝液(1%之BSA,在20毫體積莫耳濃度之硼酸鈉中,pH 9.3),然後離心(15,000 g,30 分鐘,4°C)。重複該洗滌的步驟兩次,並將沉澱物重新懸浮於1毫升之洗滌緩衝液(1%之BSA,在20毫體積莫耳濃度之硼酸鈉中,pH 9.3)中,以用於製備耦接物墊的程序中。
LFIA
條帶的
組裝
使用由注射器輸液泵浦(syringe infusion pump)所驅動的側向流動配發器(lateral flow dispenser),在每公分的NP膜上將1微克之捕捉抗體、抗原或AL2C (在PBS緩衝液中)上條(stripped)。所有其他的實驗步驟(例如使用固定抗原(immobilized antigen)或捕捉抗體來製備NC膜、耦接物墊和樣本墊的製備,以及LFIA條帶組裝的製備等)均採用於先前發表的程序。
實施例
1
重組抗體的製備和確認
為要開發抗體成為能夠辨認SARS-CoV-2之核鞘蛋白的親和性試劑,從七種人類冠狀病毒(包括SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)中建立一組核鞘蛋白。藉由該些核鞘蛋白來開發一組可用於三明治ELISA和LFIA中的抗-核鞘蛋白抗體,它們能夠用於檢測SARS-CoV-2之核鞘蛋白,並且不會與來自其他人類冠狀病毒株的核鞘蛋白發生交叉反應。
藉由本揭示內容的材料及方法中所描述的程序來篩選並選出對SARS-CoV-2之核鞘蛋白具有專一性的抗體。在噬菌體展示抗體庫進行選汰和篩選之後,大約選出2,000個候選scFv以用於測試與目標核鞘蛋白的結合特性,並與負控制組MERS-CoV的核鞘蛋白進行比較。大部分的候選scFv會與SARS-CoV-1和SARS-CoV-2兩者的核鞘蛋白結合,而只有一小部分的scFv僅會對這兩種密切相關的核鞘蛋白的其中之一展現出結合親和力(數據未顯示)。沒有一個scFv會與負控制組MERS-CoV的核鞘蛋白結合(數據未顯示)。從這些候選scFv中選出150個scFv進行定序,其中的120個scFv序列並未重複(non-redundant),並從中進一步選出7個未重複的序列在人類IgG1框架中進行重製,然後在HEK293表現系統中表現。將由此所獲得的IgG分別命名為抗體#7、抗體#11、抗體#21、抗體#22、抗體#33、抗體#36和抗體#48。這些IgG1抗體的VL區和VH區之序列總結在表1中,以及這些IgG1對核鞘蛋白的結合親和力(EC50
)(以ELISA測量得出)總結在表2中。
表1 特定抗體的VL區和VH區之序列
*CDR序列是以粗體和底線標示,包括三個在VL區中的CDR (即,從N-端到C-端依序為CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3),以及三個在VH區中的CDR (即,從N-端到C-端依序為CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。
名稱 | 胺基酸序列 * | 序列編號 |
抗體#7-VL | MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVEARVA WYQQKPGKAPKLLI FTSTRLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQIMPLPTT FGQGTKVEIKR | 43 |
抗體#7-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIEDRWIH WVRQAPGKGLEWVA SIWPMEGLTR YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGYYGFDY WGQGTLVTVSSASAAA | 44 |
抗體#11-VL | MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGGSVA WYQQKPGKAPKLLI SFPGGLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYFSWPIT FGQGTKVEIKR | 45 |
抗體#11-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIQDRMIH WVRQAPGKGLEWVA SILPFLGATW YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSWFSPFDY WGQGTLVTVSSASAAA | 46 |
抗體#21-VL | MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGSNVA WYQQKPGKAPKLLI FSAPFLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQFYDWPLT FGQGTKVEIKR | 47 |
抗體#21-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTINNGSIH WVRQAPGKGLEWVA WIWPFGGYTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSYGYDY WGQGTLVTVSSASAAA | 48 |
抗體#22-VL | MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVDDNVA WYQQKPGKAPKLLI SSSSGLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYNGPIT FGQGTKVEIKR | 49 |
抗體#22-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTISSGSIH WVRQAPGKGLEWVA SIWPFGGYTS YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSFGSDY WGQGTLVTVSSASAAA | 50 |
抗體#33-VL | MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVYSSVA WYQQKPGKAPKLLI FGSSFLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYDWPI TFGQGTKVEIKR | 51 |
抗體#33-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTINNGGIH WVRQAPGKGLEWVA GIWPFWGSTS YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSYGFDY WGQGTLVTVSSASAAA | 52 |
表1-續
*CDR序列是以粗體和底線標示,包括三個在VL區中的CDR (即,從N-端到C-端依序為CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3),以及三個在VH區中的CDR (即,從N-端到C-端依序為CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。
名稱 | 胺基酸序列 * ( 從 N- 端到 C- 端 ) | 序列編號 |
抗體#36-VL | MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVTTTVA WYQQKPGKAPKLLI NKGSWLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYNKWPLT FGQGTKVEIKR | 53 |
抗體#36-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTINRYSIH WVRQAPGKGLEWVA GIWPFGGDTT YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGATSHDY WGQGTLVTVSSASAAA | 54 |
抗體#48-VL | MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SGSSSNIGDNNVY WYQQKPGKAPKLLI FGPAYLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC AAGYSDNNGIT FGQGTKVEIKR | 55 |
抗體#48-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTISNFGIH WVRQAPGKGLEWVA GIWPYGGYTF YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARFDSYSYSGYMDY WGQGTLVTVSSASAAA | 56 |
表2 候選IgG對抗重組蛋白(包括SARS-CoV-2-N、SARS-CoV-N、MERS-CoV-N、NL63-CoV-N、OC43-CoV-N、229E-CoV-N和HKU1-CoV-N)的ELISA的EC50
標的\EC50 (奈克/毫升) | #7 | #11 | #21 | #22 | #33 | #36 | #48 |
SARS-CoV-2 N | 3.7 | 7.6 | 18.0 | 4.4 | 1.4 | 0.8 | 46.7 |
SARS-CoV N | 3.7 | 6.9 | 21.4 | 3.9 | 1.6 | 2.0 | 18.6 |
MERS-CoV N | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 |
NL63-CoV N | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 |
OC43-CoV N | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 |
229E-CoV N | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 |
HKU1-CoV N | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 | >2000 |
表2的數據表明,本研究的每個抗體都表現出對SARS-CoV的結合親和力和專一性,從而提供了一種用以檢測SARS-CoV感染(例如,SARS-CoV-2感染)的手段。
實施例
2
在三明治
ELISA
中重組抗體的結合親和力
使用三明治ELISA來檢測抗體#7、抗體#11、抗體#21、抗體#22、抗體#33、抗體#36和抗體#48與SARS-CoV-2之核鞘蛋白的結合親和力。如表3中所總結的數據,本揭示內容抗體可用作檢測SARS-CoV-2的偵測抗體和捕捉抗體,其中對抗SARS-CoV-2的D21C11抗體對的EC50
為54.41奈克/毫升,而對抗SARS-CoV-2的D11C33、D22C36、D33C07和D36C48抗體對的EC50
則低於30奈克/毫升。
表3 特定抗體對抗SARS-CoV-2之核鞘蛋白的三明治ELISA的EC50
抗體對 | EC50 (奈克/毫升) | 附註 |
D11C33 | 25.53 | 偵測抗體:抗體#11 捕捉抗體:抗體#33 |
D21C11 | 54.41 | 偵測抗體:抗體#21 捕捉抗體:抗體#11 |
D22C36 | 28.82 | 偵測抗體:抗體#22 捕捉抗體:抗體#36 |
D33C07 | 18.02 | 偵測抗體:抗體#33 捕捉抗體:抗體#7 |
D36C48 | 20.66 | 偵測抗體:抗體#36 捕捉抗體:抗體#48 |
實施例
3
建立一種用於快速檢測
SARS-CoV-2
之核鞘蛋白的
LFIA
裝置
將D36C48抗體對進一步用於建構LFIA裝置。選擇這組IgG1對是由於這兩個IgG1的表現品質和產量(數據未顯示)都適合大規模量產,並且IgG1 #36與膠體金在pH7.5和pH9.0之間的耦接效率表現優異。該LFIA裝置的原型是用抗體#48作為捕捉抗體和抗體#36作為膠體金耦接的偵測抗體來建構。LFIA原型的檢測極限是用兩種含有SARS-CoV-2之核鞘蛋白的樣本來確認。第一個樣本是含有HEK293細胞所表現之源自SARS-CoV-2、HCoV-OC43或HCoV-NL63的核鞘蛋白,其中將該些培養的細胞用含有1×蛋白裂解緩衝液和50%之總細胞蛋白的細胞裂解液的混合物來進行裂解(第1A圖)。根據第1A圖的實驗數據,D36C48抗體對會對SARS-CoV-2之核鞘蛋白展現出結合專一性,且對SARS-CoV-2的檢測極限約為7.8奈克。第二個樣本是含有經感染SARS-CoV-2的Vero E6細胞,且該些細胞是用含有50%之總細胞蛋白的蛋白裂解緩衝液來進行裂解(第1B圖)。本研究中的樣本其用意在於模擬鼻拭子的複雜混合物,在含有裂解緩衝液的情況下使其釋放出在完整的病毒和感染細胞中的核鞘蛋白。兩種樣本的檢測極限都在0.1奈克/測試的範圍內。
總結來說,從GH合成抗體庫中所選出的七種抗體,包括抗體#7、抗體#11、抗體#21、抗體#22、抗體#33、抗體#36和抗體#48,已經證明它們能夠與SARS-CoV-2之核鞘蛋白具有高親和力和功能性專一性的結合。所選出的抗體對其相對應的核鞘蛋白之最佳親和力的EC50
低於1奈體積莫耳濃度(nM),因此無需另行親和力成熟的步驟。該些源自GH合成抗體庫且未經進一步親和力成熟的抗體,可用於三明治ELISA和LFIA中,藉以檢測來自經裂解之病毒感染細胞中的相對應核鞘蛋白,在高度複雜的檢體中,其檢測極限為0.1奈克/測試。該檢測極限接近於RIDT在冠狀病毒檢測上一般可接受的檢測極限。本研究已經證明於開發診斷用的抗體之一般程序的可行性,這是動物抗體技術所無法提供的。
當可理解,上文有關實施方式的敘述僅作為例示性的實施方式,本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可對其進行各種更動與修飾。上文的說明書、實施例及實驗數據對本揭示內容作為例示性實施方式中的結構及使用方式做出完整的描述。儘管上文已描述本揭示內容中各樣的實施方式有一定程度的特性,或參照一或多個個別的實施方式,本發明所屬領域技術具有通常知識者仍可在不悖離本揭示內容精神及範圍情形下,對已揭示的實施方式進行眾多修改。
無
在參閱以下的詳細說明和附隨圖式後,本揭示內容當更加明顯易懂,其中:
第1A圖和第1B圖為依據本揭示內容實施例3所得之相片,分別闡述LFIA實驗結果,以及其於檢測SARS-CoV-2之核鞘蛋白的檢測極限。第1A圖:將2倍連續稀釋之核鞘蛋白(其係利用HEK293細胞來表現)置於LFIA裝置中,以測試該裝置對SARS-CoV-2之核鞘蛋白的檢測極限。SARS-CoV-2-N:SARS-CoV-2之核鞘蛋白。OC43-N:冠狀病毒HCoV-OC43核鞘蛋白。NL63-N:冠狀病毒HCoV-NL63核鞘蛋白。第1B圖:將2倍連續稀釋之核鞘蛋白(其係利用受SARS-CoV-2病毒感染的細胞來表現)置於LFIA裝置中,以測試該裝置對SARS-CoV-2之核鞘蛋白的檢測極限。Vero-E6/假性對照:未受病毒感染的Vero E6細胞;在研究中作為負控制組。Vero-E6/SARS-CoV-2:經感染SARS-CoV-2的Vero E6細胞。Expi293/假性對照:未受病毒感染的Expi293細胞;在研究中作為負控制組。Huh-7/假性對照:未受病毒感染的Huh-7細胞;在研究中作為負控制組。Huh-7/229E:經感染HCoV-229E的Huh-7細胞。
<110> 中央研究院
<120> 重組抗體、包含重組抗體之套組及其用途
<130> P4117-TW
<140> TW110116327
<141> 2021-05-06
<150> US63020775
<151> 2020-05-06
<160> 67
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_CDRL1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_CDRL2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_CDRL3
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_CDRH1
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_CDRH2
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_CDRH3
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_CDRL1
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_CDRL2
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_CDRL3
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_CDRH1
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_CDRH2
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_CDRH3
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_CDRL1
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_CDRL2
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_CDRL3
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_CDRH1
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_CDRH2
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_CDRH3
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_CDRL1
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_CDRL2
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_CDRL3
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_CDRH1
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_CDRH2
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_CDRH3
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_CDRL1
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_CDRL2
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_CDRL3
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_CDRH1
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_CDRH2
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_CDRH3
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_CDRL1
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_CDRL2
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_CDRL3
<210> 34
<21> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_CDRH1
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_CDRH2
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_CDRH3
<210> 37
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_CDRL1
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_CDRL2
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_CDRL3
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_CDRH1
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_CDRH2
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_CDRH3
<210> 43
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_VL
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#7_VH
<210> 45
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_VL
<210> 46
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#11_VH
<210> 47
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_VL
<210> 48
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#21_VH
<210> 49
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_VL
<210> 50
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#22_VH
<210> 51
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_VL
<210> 52
<21> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#33_VH
<210> 53
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_VL
<210> 54
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#36_VH
<210> 55
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_VL
<210> 56
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_#48_VH
<210> 57
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_SARS-CoV-1-N蛋白
<210> 58
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_SARS-CoV-2-N蛋白
<210> 59
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_MERS-CoV_N蛋白
<210> 60
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_HCoV-CC43_N蛋白
<210> 61
<211> 389
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_HCoV-229E_N蛋白
<210> 62
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_HCoV-NL63
<210> 63
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_HCoV-HKU1
<210> 64
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_F引子
<210> 65
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_R引子
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_F引子
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_R引子
Claims (14)
- 一種重組抗體或其片段,包含一輕鏈變異(light chain variable,VL)區和一重鏈變異(heavy chain variable,VH)區,其中 該VL區包含序列編號:1-3的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:4-6的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:7-9的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:10-12的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:13-15的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:16-18的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:19-21的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:22-24的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:25-27的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:28-30的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:31-33的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:34-36的胺基酸序列;或是 該VL區包含序列編號:37-39的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:40-42的胺基酸序列。
- 如請求項1所述之重組抗體,其中 該VL區包含一與序列編號:43具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:44具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列; 該VL區包含一與序列編號:45具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:46具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列; 該VL區包含一與序列編號:47具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:48具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列; 該VL區包含一與序列編號:49具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:50具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列; 該VL區包含一與序列編號:51具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:52具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列; 該VL區包含一與序列編號:53具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:54具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;或是 該VL區包含一與序列編號:55具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該VH區包含一與序列編號:56具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。
- 如請求項2所述之重組抗體,其中 該VL區包含序列編號:43的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:44的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:45的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:46的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:47的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:48的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:49的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:50的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:51的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:52的胺基酸序列; 該VL區包含序列編號:53的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:54的胺基酸序列;或是 該VL區包含序列編號:55的胺基酸序列,以及該VH區包含序列編號:56的胺基酸序列。
- 一種用以檢測嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)的套組,包含一第一重組抗體和一第二重組抗體,其個別選自於該請求項1所述之重組抗體;以及一含有該第一和該第二重組抗體的容器。
- 如請求項4所述之套組,其中 該第一重組抗體的VL區包含序列編號:31-33的胺基酸序列,以及該第一重組抗體的VH區包含序列編號:34-36的胺基酸序列;以及 該第二重組抗體的VL區包含序列編號:37-39的胺基酸序列,以及該第二重組抗體的VH區包含序列編號:40-42的胺基酸序列。
- 如請求項5所述之套組,其中 該第一重組抗體的VL區包含一與序列編號:53具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該第一重組抗體的VH區包含一與序列編號:54具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列;以及 該第二重組抗體的VL區包含一與序列編號:55具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列,以及該第二重組抗體的VH區包含一與序列編號:56具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。
- 如請求項6所述之套組,其中 該第一重組抗體的VL區包含序列編號:53的胺基酸序列,以及該第一重組抗體的VH區包含序列編號:54的胺基酸序列;以及 該第二重組抗體的VL區包含序列編號:55的胺基酸序列,以及該第二重組抗體的VH區包含序列編號:56的胺基酸序列。
- 如請求項4所述之套組,其中該SARS-CoV是SARS-CoV-1。
- 如請求項4所述之套組,其中該SARS-CoV是SARS-CoV-2。
- 一種藉由一分離自一個體的生物學樣本來確認該個體是否感染嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)的方法,包含藉由使用該請求項1所述之重組抗體或該請求項4所述之套組來檢測該生物學樣本中存在或不存在該SARS-CoV的核鞘蛋白(nucleocapsid protein),其中該核鞘蛋白的存在表示該個體是感染該SARS-CoV。
- 如請求項10所述之方法,其中該冠狀病毒是SARS-CoV-1。
- 如請求項10所述之方法,其中該冠狀病毒是SARS-CoV-2。
- 如請求項10所述之方法,其中該生物學樣本是支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)、痰液、鼻部組織、咽部組織、糞便或血液。
- 如請求項10所述之方法,其中該個體是人類。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202063020775P | 2020-05-06 | 2020-05-06 | |
US63020775 | 2020-05-06 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202204381A TW202204381A (zh) | 2022-02-01 |
TWI775422B true TWI775422B (zh) | 2022-08-21 |
Family
ID=78468378
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW110116327A TWI775422B (zh) | 2020-05-06 | 2021-05-06 | 重組抗體、包含重組抗體之套組及其用途 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230168249A1 (zh) |
TW (1) | TWI775422B (zh) |
WO (1) | WO2021226123A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023224635A1 (en) * | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Academia Sinica | Recombinant antibodies, kits comprising the same, and uses thereof in diagnosing african swine fever virus |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180009877A1 (en) * | 2015-02-24 | 2018-01-11 | Academia Sinica | A phage-displayed single-chain variable fragment library |
US10787501B1 (en) * | 2020-04-02 | 2020-09-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005016132A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-24 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Diagnostics for sars virus |
JPWO2005042579A1 (ja) * | 2003-10-31 | 2008-01-10 | 富士レビオ株式会社 | 抗sarsウイルス抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 |
WO2007043582A1 (ja) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Sysmex Corporation | Sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質を測定するための測定方法、測定用試薬キット、試験具、sarsウイルスヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
US10752673B2 (en) * | 2016-06-11 | 2020-08-25 | Academia Sinica | High-throughput screening of functional antibody fragments, immunoconjugate comprising the same, and adaptor-drug conjugate for screening |
-
2021
- 2021-05-04 WO PCT/US2021/030702 patent/WO2021226123A1/en active Application Filing
- 2021-05-04 US US17/922,590 patent/US20230168249A1/en active Pending
- 2021-05-06 TW TW110116327A patent/TWI775422B/zh active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180009877A1 (en) * | 2015-02-24 | 2018-01-11 | Academia Sinica | A phage-displayed single-chain variable fragment library |
US10787501B1 (en) * | 2020-04-02 | 2020-09-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
網路文獻 Hye-Yeon Kim et al, "Development of a SARS-CoV-2-specific biosensor for antigen detection using scFv-Fc fusion proteins", Biosens Bioelectron. 2021 Mar 1;175:112868. Epub 2020 Nov 30.; * |
網路文獻 Lars R Perk et al, "ELISA detection of SARS-CoV-2 antibodies in saliva.", Sci Rep. 2020 Nov 30;10(1): 20818. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021226123A1 (en) | 2021-11-11 |
US20230168249A1 (en) | 2023-06-01 |
TW202204381A (zh) | 2022-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Alsoussi et al. | A potently neutralizing antibody protects mice against SARS-CoV-2 infection | |
JP7235256B2 (ja) | 重症熱性血小板減少症候群ウイルスの外膜糖タンパク質に結合する抗体及びその用途 | |
WO2021244089A1 (zh) | 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用 | |
IL295310A (en) | Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) | |
CN110317267B (zh) | 针对狂犬病病毒的双特异性抗体及其用途 | |
CN112851804B (zh) | 一种人源抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的中和活性单克隆抗体 | |
CN113912710B (zh) | 抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
CN111748033B (zh) | 一种与新型冠状病毒np蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒 | |
WO2021195326A1 (en) | Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) | |
KR102671155B1 (ko) | Ns1 단백질의 결합 단백질 | |
WO2022061594A1 (zh) | 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用 | |
WO2022069232A1 (en) | Single domain antibodies against the nucleoprotein of sars-cov-2 | |
WO2021195385A1 (en) | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-GoV-2) | |
TW202204379A (zh) | 用以篩選抗體片段的方法、由此製備的重組抗體及其用途 | |
TWI775422B (zh) | 重組抗體、包含重組抗體之套組及其用途 | |
TW202140542A (zh) | 重組抗體、包含該重組抗體之套組、以及其用途 | |
WO2024016843A1 (zh) | 用于表达Fab片段库的重组系统 | |
WO2023224635A1 (en) | Recombinant antibodies, kits comprising the same, and uses thereof in diagnosing african swine fever virus | |
TWI820716B (zh) | 重組抗體、包含重組抗體之套組及其於診斷流感病毒的用途 | |
CN113461822B (zh) | Scl-70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒 | |
TW202346328A (zh) | 重組抗體、包含重組抗體之套組及其於診斷非洲豬瘟病毒的用途 | |
CN112079928B (zh) | 一种抗pd-l1的单克隆抗体 | |
WO2023224618A1 (en) | Recombinant antibodies, kits comprising the same, and uses thereof in diagnosing influenza virus | |
KR102709435B1 (ko) | SARS-CoV-2 특이적 신규 항체를 이용한 SARS-CoV-2의 검출방법 | |
WO2022188829A1 (zh) | 新型冠状病毒抗体及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
GD4A | Issue of patent certificate for granted invention patent |