TWI820716B

TWI820716B - 重組抗體、包含重組抗體之套組及其於診斷流感病毒的用途

Info

Publication number: TWI820716B
Application number: TW111118774A
Authority: TW
Inventors: 楊安綏; 余忠銘; 董昭萍; 許鴻儒; 彭洪斌; 陳奇雍; 黃鈺琄; 蔡沛勳; 林思宇; 洪霏虹
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2022-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2023-11-01
Also published as: TW202346331A

Abstract

本揭示內容是關於用於檢測A型流感病毒(influenza A virus, IAV)或B型流感病毒(influenza B virus, IBV)的重組抗體或其片段。本揭示內容亦提供包含該重組抗體的套組，以及利用該重組抗體或套組來診斷IAV或IBV感染的方法。

Description

重組抗體、包含重組抗體之套組及其於診斷流感病毒的用途

本揭示內容係關於疾病診斷的領域。具體來說，本揭示內容係關於對A型流感病毒(influenza A virus, IAV)或B型流感病毒(influenza B virus, IBV)具有專一性的重組抗體，以及其於診斷IAV或IBV感染的用途。

流行性感冒通稱為流感，是一種由流感病毒所導致的傳染性疾病。流感的症狀包含發燒、流鼻涕或鼻塞、喉嚨痛、肌肉及關節痠痛、頭痛、咳嗽、疲勞、嘔吐及下痢。該些症狀一般是在接觸流感病毒兩天後開始出現，並持續數天至數週。依據疾病管制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)的報導，自2010年起每年約有900-4500萬人感染流感，約140,000-810,000人因流感住院，以及約12,000-61,000人死於流感。

主要有兩種類型(A型及B型)的流感病毒經常性地於人類之間傳播(即人類流感病毒)，造成每年季節性流行。基於表面蛋白血球凝集素(hemagglutinin, HA)及神經胺糖酸酶(neuraminidase, NA)，可進一步將IAV區分為數種亞型，其中共有18種不同的HA亞型(H1至H18)和11種不同的NA亞型(N1至N11)。目前於人群間流行的IAV亞型包括H1N1及H3N2。快速偵測該些新興的流感病毒株是反應流感大規模爆發及季節性流感對人類社會及經濟所造成之威脅的關鍵方法。用以偵測流感病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)的快速流感診斷測試(rapid influenza diagnostic test, RIDT)可協助健康照護的專業人員做出立即且有效的治療決策，避免給予非必要的抗生素及抗病毒藥物之處方。目前可以RIDT的型式廣泛取得用以檢測IAV及IBV的側流式免疫檢定法(lateral flow immunoassay, LFIA)的試驗，然而受限於持續增加且變異的流感病毒株，該些試驗僅具有40%至70%的靈敏度。

有鑑於此，本發明相關領域亟需一種用以偵測IAV或IBV的試劑及/或方法，以建立可預防及/或治療感染的診斷平臺。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。

如在本文中所實施及廣泛描述的，本揭示內容的一態樣是關於一種重組抗體或其片段。依據本揭示內容的實施方式，該重組抗體或抗體片段包含一輕鏈變異(light chain variable, VL)域及一重鏈變異(heavy chain variable, VH)域，其中該VL域包含一第一輕鏈互補決定區(first light chain complementarity determining region, CDR-L1)、一第二輕鏈互補決定區(second light chain CDR, CDR-L2)以及一第三輕鏈互補決定區(third light chain CDR, CDR-L3)；且該VH域包含一第一重鏈互補決定區(first heavy chain CDR, CDR-H1)、一第二重鏈互補決定區(second heavy chain CDR, CDR-H2)以及一第三重鏈互補決定區(third heavy chain CDR, CDR-H3)。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IAV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：1-3的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：4-6的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：42具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：43具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在一例示性實施例中，該抗-IAV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：42及43具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IAV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：7-9的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：10-12的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：44具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：45具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些例示性實施例中，該抗-IAV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：44及45具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IAV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：13、2及14的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：15-17的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：46具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：47具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些實施例中，該抗-IAV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：46及47具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IAV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：18-20的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：21-23的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：48具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：49具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在一例示性實施例中，該抗-IAV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：48及49具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IAV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：24-26的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：27-29的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：50具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：51具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作實施例中，該抗-IAV重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：50及51具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IAV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：30-32的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：33-35的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：52具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：53具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作實施例中，該抗-IAV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：52及53具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IAV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：36-38的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：39-41的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：54具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：55具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些特定實施例中，該抗-IAV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：54及55具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IBV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：56-58的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：59-61的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：91具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：92具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作實施例中，該抗-IBV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：91及92具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IBV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：62-64的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：65-67的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：93具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：94具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作實施例中，該抗-IBV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：93及94具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IBV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：68-70的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：71-73的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：95具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：96具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些實施例中，該抗-IBV重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：91及92具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IBV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：74-76的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：77、10及78的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：97具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：98具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些實施例中，該抗-IBV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：97及98具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IBV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：79-81的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：82-84的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：99具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：100具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作性實施例中，該抗-IBV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含與序列編號：99及100具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，該重組抗體或抗體片段對IBV具有專一性，其中CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：85-87的胺基酸序列，且CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：88-89的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，該VL域包含與序列編號：101具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含與序列編號：102具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。在某些操作性實施例中，該抗-IBV之重組抗體或抗體片段的VL域及VH域分別包含序列編號：101及102具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以偵測一生物樣本是否存在IAV或IBV的套組。所述套組包含一第一重組抗體、一第二重組抗體以及一包含該第一和第二重組抗體的容器。依據某些實施方式，用以偵測IAV之套組的第一及第二重組抗體是個別選自前述抗-IAV的重組抗體。

在一例示性實施方式中，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：1-3及4-6的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：18-20及21-23的胺基酸序列。較佳的，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：42及43具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：48及49具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

在另一例示性實施方式中，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：7-9及10-12的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：13、2、14及15-17的胺基酸序列。較佳的，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：44及45具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：46及47具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

在另一例示性實施方式中，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：24-26及27-29的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：36-38及39-41的胺基酸序列。較佳的，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：50及51具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：54及55具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

在另一例示性實施方式中，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：24-26及27-29的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：30-32及33-35的胺基酸序列。較佳的，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：50及51的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：52及53具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據某些實施方式，用以偵測IBV之套組的第一及第二重組抗體是個別選自前述抗-IBV的重組抗體。

在一例示性實施方式中，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：74-76及77、10、78的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：79-81及82-84的胺基酸序列。較佳的，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：97及98具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：99及100具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

在另一例示性實施方式中，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：62-64及65-67的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：85-87及88-90的胺基酸序列。較佳的，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：93及94具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：101及102具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

在另一例示性實施方式中，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：56-58及59-61的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含序列編號：68-70及71-73的胺基酸序列。較佳的，該第一重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：91及92具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二重組抗體的VL域及VH域分別包含與序列編號：95及96具有100%之序列相似度的胺基酸序列。

依據某些實施方式，第一及第二重組抗體其中之一是作為偵測技術中的補捉抗體，另一個則是作為偵測技術中的偵測抗體；例示性的偵測技術包含，但不限於，酵素連結免疫吸附檢定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、側流式免疫檢定法(lateral flow immunoassay, LFIA)以及西方墨點法(western blotting, WB)。

本揭示內容亦提供一種藉由一分離自一個體的生物樣本來診斷該個體是否受IAV或IBV感染的方法。該方法包含利用本揭示內容的抗體片段、重組抗體或套組來檢測該生物樣本中是否存在IAV或IBV的核蛋白(即檢測NPA或NPB存在或不存在)，其中該核蛋白存在於該生物樣本中，則診斷該個體受到IAV或IBV感染。

基於上述結果，本發明領域具有通常知識者或臨床從業人員可及時對有需要的個體(例如受IAV或IBV感染的個體)投予適當的治療。具體來說，若病毒蛋白(例如p30蛋白)存在於一個體的生物樣本中，則可對該個體投予一有效量的抗-病毒治療(例如，奧司他韋(oseltamivir)、瑞樂沙(Zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)、巴羅沙韋瑪波西酯(baloxavir marboxil)、金剛胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)或其組合)，據以減輕及/或改善該些與IAV或IBV感染相關的症狀。

該個體為一哺乳類；較佳地，該個體為人類。

在參閱以下的詳細說明及隨附圖式後，本揭示內容諸多伴隨的特徵及優點當可輕易瞭解。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I.　定義

為方便起見，本說明書、實施例及所附申請專利範圍中所使用的特定專有名詞集中於此。除非本書名書另有定義，否則此處所使用的科學及技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。並且，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體來說，在本說明書與申請專利範圍中，單數形式「一」(a及an)包括複數參考值，但依據上下文而有明確表示者除外。此外，本說明書與申請專利範圍中，「至少一」(at least one)與「一或多」(one or more)表述方式的意義相同，兩者都代表包含一、二、三或更多。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍及參數皆是約略的數值，此處已盡可能精準地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所導致的標準偏差。並且，在此處，「約」(about)一詞通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實施例之外，或除非另有明確地說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值以及百分比(例如，用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他類似者)均經過「約」的修飾。據此，除非另有相反的說明，本說明書與申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，可視需求而更動。至少，應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

「抗體」(antibody)一詞在本揭示內容中具有最廣泛的意義，具體來說包含單株抗體(包括全長的單株抗體)、多株抗體、多功(multi-specific)或多效(multivalent)抗體(例如，雙功(bi-specific)抗體)以及具有欲求之生物活性的抗體片段。「抗體片段」(antibody fragment或the fragment of an antibody)一詞是指全長抗體的一部分，一般為一全長抗體的抗原結合域或變異域(即VL域及VH域)。例示性的抗體片段包含抗原結合片段(fragment antigen-binding, Fab)、Fab’、F(ab’)2、單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)、雙鏈抗體(diabody)、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體分子，以及由抗體片段所形成的多功抗體。

「互補決定區」(complementarity determining region, CDR)一詞是指抗體分子的高變區(hypervariable region)，其形成一個與所結合之抗原的3維表面互補的表面。從N-端到C-端，每個抗體的重鏈和輕鏈包含三個CDR (即CDR-1、CDR-2和CDR-3)。因此，一人類白血球抗原-DR (human leukocyte antigen-DR, HLA-DR)的結合位點總共包括六個CDR，其中包含三個來自重鏈變異域的CDR (即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，以及三個來自輕鏈變異域的CDR (即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。CDR的胺基酸殘基與所結合的抗原緊密接觸，其中與抗原最密切接觸的通常是重鏈CDR3。

本文所使用之抗體的「變異區」(variable region)一詞是指抗體重鏈或輕鏈的胺基末端區域。該些區域通常是一抗體中最具變異性的部份，包含抗原結合位點。「變異的」(variable)一詞是指該變異區的某些部分在不同抗體之間在序列上有很大差異的事實，其係用於決定每個特定抗體對其特定抗原的結合和專一性。然而，該變異性(variability)並非均勻分布於抗體的變異區內。它是集中在輕鏈及重鏈的互補決定區或高變區的三個區段中。變異區中具有高度保守的部分稱為框架(framework, FR)。天然重鏈及輕鏈的變異區包含4個FR區，其主要採用β-折板(β-sheet)的配置，並由三個CDR連接，該三個CDR形成連接β-折板結構的環，在某些情況下會形成β-折板結構的一部分。各個鏈中的CDR由FR區緊密連接在一起，並且與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但表現出各種效應子(effector)的功能，例如參與在抗體的抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular toxicity)效應中。

「序列相似度百分比(%)」(percentage (%) sequence identity)在本揭示內容所揭示的任一種胺基酸序列中是定義為候選序列中的胺基酸殘基與特定參考序列中的胺基酸殘基相同的百分比，在比對序列時可視需要來引入間隙(gap)，藉以達到最大的序列相似度百分比，並且不考慮任何保守性置換(conservative substitution)作為序列相似度的一部分。可利用各種本領域技術人員所熟知的方法來進行比對，以確認序列相似度百分比，舉例來說，可利用例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等公開的電腦軟體來進行比對。本技術領域相關人士可以決定測量比對的適當參數，包含任一種所需的運算法以使所比對的全長序列達到最大比對值。爲達本文的目的，兩個胺基酸序列之間的序列比對是利用國家生物技術資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)提供的電腦程式Blastp (protein-protein BLAST)來分析。一特定序列A及一特定序列B之間的序列相似度百分比(亦可表述為一特定序列A與一特定序列B具有某特定百分比的序列相似度)是利用下列公式來計算： % 其中X是經序列比對程式BLAST後，在該程式中的A和B比對中被評定為相同匹配的胺基酸殘基數量(identical matches)，Y則是特定序列B中的胺基酸殘基總數。

如在本文中所討論的，抗體的胺基酸序列中具有些微變化亦視為涵蓋在本揭示內容和請求保護的發明構思中，只要該胺基酸序列的變異度保持至少85％的序列相似度，例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列相似度。本揭示內容的抗體可進行特定修飾，來改變與其生理活性無關的該胜肽的特徵。舉例來說，可以改變及/或剔除某些胺基酸，而不影響本發明抗體的生理活性(亦即與IAV或IBV結合的能力)。特別是，保守性胺基酸發生置換是可以預期的。保守性置換(conservative replacement)是指在其側鏈具有相關性的胺基酸家族中所發生的置換。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1)酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基(aliphatic-hydroxy)類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺(amide-containing)類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香(aromatic)類。舉例來說，可以合理預期將白胺酸單獨置換成異白胺酸或纈胺酸，將天門冬胺酸置換成麩胺酸，將蘇胺酸置換成絲胺酸，或是將一胺基酸進行類似的置換並換成一結構相關的胺基酸而不會對所得分子的結合或特性產生重大影響，特別是當該置換並未涉及框架位點內的胺基酸時。藉由測定胜肽衍生物的比活性(specific activity)，可以很容易地確認胺基酸變化是否會產生功能性胜肽。本領域具有通常知識者可以容易地製備抗體的片段或類似物。較佳的片段或類似物的胺基末端和羧基末端會出現在功能性區域的邊界附近。

「個體」(subject)一詞是指包含人類在內可適用本揭示內容之診斷方法的哺乳類。除非特別指明一種性別，否則「個體」(subject)一詞意指雄性和雌性兩者。

II.　發明說明

(II-1) 篩選對 IAV 或 IBV 具有專一性的抗體片段的方法

本揭示內容的第一態樣是關於一種用以篩選對IAV或IBV具有專一性的抗體片段的方法。依據本揭示內容實施方式，該方法包含以下步驟： (a) 提供一噬菌體表現的單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)抗體庫，其包含複數個由噬菌體表現的scFv，其中每個由噬菌體表現的scFv之VH域對蛋白A具有結合親和力，以及每個噬菌體表現的scFv之VL域對蛋白L具有結合親和力； (b) 將步驟(a)之該由噬菌體表現的scFv抗體庫暴露於IAV或IBV之至少一核蛋白中； (c) 從步驟(b)之該由噬菌體表現的scFv抗體庫中篩選出複數個噬菌體，其分別表現對該核蛋白具有結合親和力的scFv； (d) 分別使步驟(c)中篩選出的複數個噬菌體表現出複數個可溶的scFv； (e) 將步驟(d)的複數個可溶的scFv暴露於該核蛋白中； (f) 分別確認步驟(e)中的複數個可溶的scFv對該核蛋白的結合親和力；以及 (g) 基於步驟(f)中所確定的結果，從複數個可溶的scFv中選取一個對核蛋白之結合親和力優於其他可溶的scFv的可溶的scFv作為抗體片段。

本發明方法可用以篩選對IAV或IBV具有結合親和力及/或專一性的抗體片段，據以提供一種可偵測不同流感病毒亞型的方法，其中該些流感病毒具有高度抗原相似度；例如，H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2及H10N7。

在步驟(a)中，是提供一種由噬菌體表現的scFv抗體庫。依據本揭示內容的實施方式，噬菌體表現的scFv抗體庫的骨架是基於人類IGKV1-NL1*01/IGHV3-23*04生殖細胞序列，並以特定引子利用PCR反應來多樣化其CDR序列，包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列。經蛋白A及蛋白L篩選後，可製得由噬菌體表現的scFv抗體庫(以下稱為「GH2抗體庫」)，其中該複數個由噬菌體表現的scFv抗體庫中的每一個scFv具有一可結合至蛋白A的VH域，以及一可結合至蛋白L的VL域。可利用PCT申請案PCT/US2016/19128和PCT/US2018/56627中所描述的方法來建構該些由噬菌體表現的scFv抗體庫。該申請案在此通過引用而併入其全文。

在步驟(b)中，是將該GH2抗體庫暴露於NPA (即IAV的核蛋白)或NPB (即IBV的核蛋白)中。依據某些實施方式，該NPA包含序列編號：103-110的任一胺基酸序列(分別命名為「NPA1」至「NPA8」)。在某些操作實施例中，GH2抗體庫是暴露於NPA1-NPA8的混合物(比例為1：1：1：1：1：1：1：1)中。依據某些實施方式，該NPB包含序列編號：111或112的任一胺基酸序列(分別命名為「NPB1」及「NPB2」)。在某些操作實施例中，GH2抗體庫是暴露於NPB1與NPB2的混合物(比例為1：1)中。依據某些操作性實施例，IAV或IBV的核蛋白是被固定在一基質(例如，瓊脂糖樹脂或聚丙烯醯胺)上，接著與本揭示內容GH2抗體庫混合。

在步驟(c)中，自該GH2抗體庫選出複數個噬菌體(即第一複數個噬菌體)，其中經篩選出的複數個噬菌體會分別表現對IAV或IBV的核蛋白具有結合親和力的scFv。具體來說，是以沖提緩衝液處理步驟(b)的產物，該緩衝液通常為酸性溶液(例如，甘胺酸溶液，pH 2.2)，據以破壞該核蛋白與由噬菌體表現的scFv之間的結合。藉由此方式，收集複數個分別表現對該核蛋白具有結合親和力之scFv的噬菌體。

非必要性地，步驟(c)是在酸性條件下進行。具體來說，步驟(b)的產物可進行酸處理(例如，利用pH值在5-7之間的洗滌緩衝液，例如，利用pH為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7的洗滌緩衝液；較佳地，利用pH值為5.0的洗滌緩衝液)，接著進行前述沖提步驟以收集該些複數個噬菌體。

非必要性地，為了增加對核蛋白具有結合親和力之scFv的量，是在一或多個擾亂核蛋白(scrambled nucleoprotein)存在的情況下以核蛋白處理步驟(c)中選出來的該複數噬菌體(為非必要的步驟(c)-1)，其中每個擾亂核蛋白包含一與該核蛋白的胺基酸序列不同的胺基酸序列。舉例來說，在核蛋白包含序列編號：103的胺基酸序列(即NPA1)的情況下，該擾亂核蛋白包含任一序列編號：104-112的胺基酸序列(即NPA2至NPA8、NPB1及NPB2任一種)；較佳地，該擾亂核蛋白包含任一序列編號：104-110的胺基酸序列(即NPA2至NPA8任一種)。或者是，在核蛋白包含序列編號：106的胺基酸序列(即NPA4)的情況下，該擾亂核蛋白包含任一序列編號：103-105及107-112的胺基酸序列(即NPA1至NPA3、NPA5至NPA8、NPB1及NPB2任一種)；較佳地，該擾亂核蛋白包含任一序列編號：103-105及107-110的胺基酸序列(即NPA1至NPA3、NPA5至NPA8任一種)。又或者是，在核蛋白包含序列編號：110的胺基酸序列(即NPA8)的情況下，該擾亂核蛋白包含任一序列編號：103-109、111及112的胺基酸序列(即NPA1至NPA7、NPB1及NPB2任一種)；較佳地，該擾亂核蛋白包含任一序列編號：103-109的胺基酸序列(即NPA1至NPA7任一種)。依據依實施方式，IAV及IBV的核蛋白被固定於一基質(像是瓊脂糖樹脂或聚丙烯醯胺)上，接著在具有一或多個擾亂核蛋白的情況下，與本揭示內容GH2抗體庫混合。

又非必要性地，自該複數個噬菌體(其在具有擾亂核蛋白存在的情況下，分別表現對標的核蛋白具有結合專一性的scFv)篩選複數個噬菌體(即第二複數個噬菌體)(為非必要的步驟(c)-2)。在類似步驟(c)方法中，以酸性沖提緩衝液(例如pH 2.2的甘胺酸溶液)處理非必要的步驟(c)-1的產物，藉以破壞核蛋白與噬菌體表現之scFv之間的結合。藉此，收集分別表現與核蛋白具有結合專一性之scFv的第二複數個噬菌體。

接著，在步驟(d)中，將步驟(c)篩選出的複數個噬菌體(即第一複數個噬菌體)或非必要的步驟(c)-2篩選出的複數個噬菌體(即第二複數個噬菌體)置於適當的條件下，使其可生產複數個可溶的scFv。此步驟可利用本技術領域具有通常知識者熟知的方法來完成。依據本揭示內容某些實施方式，VH域及VL域的表現可由一乳糖操縱組(lactose operon或lac operon)來驅動；如本發明所屬領域具有通常知識者所熟知，可藉由添加異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactoside, IPTG)誘導該乳糖操縱組表現，進而驅動下游基因(即編碼產生VH域及VL域的基因)表現。然後，據以生產的scFv會分泌至培養基的上清液中，並且可從中來收集。

在步驟(e)中，是將步驟(d)所生產的可溶的scFv分別與IAV或IBV的核蛋白混合，以形成蛋白質-scFv複合物。

接著，在步驟(f)中，可利用本領域普通技術人員所熟知之用於分析兩個分子之間的結合親和力(例如，抗體對抗原的結合親和力)的方法來確認步驟(e)中所形成的蛋白質-scFv複合物的量；舉例來說，可利用ELISA、西方墨點法、流式細胞儀(flow cytometry)、表面電漿共振(surface plasmon resonance, SPR)或LFIA等方法來檢測。一般來說，蛋白質-scFv複合物的量會與scFv和核蛋白之間的結合親和力成正比。依據一操作性實施例，是以ELISA來確認蛋白質-scFv複合物的量(即可溶的scFv與核蛋白之間的結合親和力)。

最後，在步驟(g)中，是基於步驟(f)中所確定的結合親和力來選出抗體片段。更具體來說，是自複數個可溶的scFv中選出一可溶的scFv作為抗體片段，其中該可溶的scFv是對核蛋白展現出優於其他可溶的scFv之結合親和力。

依據本揭示內容某些實施方式，用以篩選抗體片段的核蛋白是源自IAV (即NPA)，其中經過不同篩選程序篩選出來的7種抗體片段分別命名為「NPA-008 scFv」、「NPA-020 scFv」、「NPA-045 scFv」、「NPA-058 scFv」、「NPA-064 scFv」、「NPA-065 scFv」以及「NPA-066 scFv」。

依據本揭示內容某些實施方式，用以篩選抗體片段的核蛋白是源自IBV (即NPB)，其中經過不同篩選程序篩選出來的6種抗體片段分別命名為「NPB-010 scFv」、「NPB-020 scFv」、「NPB-034 scFv」、「NPB-042 scFv」、「NPB-046 scFv」以及「NPB-055 scFv」。

(II-2) 製備重組抗體的方法

本揭示內容 (II-1)部分篩選出的抗體片段(即任一抗-NPA抗體片段和抗-NPB抗體片段)可用於製備一重組抗體，其中該重組抗體在結構上包含一VL域、一輕鏈恆定(light chain constant, CL)域、一VH域以及一重鏈恆定(heavy chain constant, CH)域。藉由篩選得到的抗體片段來製備重組抗體的方法包含以下步驟： (1) 提供表現特定抗體片段的噬菌體； (2) 萃取與步驟(1)的噬菌體相對應的噬質體(phagemid) DNA； (3) 將步驟(2)的噬質體DNA作為模板，以PCR來分別擴增一用以編碼VH域的第一核酸序列，以及一用以編碼VL域的第二核酸序列； (4) 將該第一和第二核酸序列插入一包含一第三和第四核酸序列的表現載體中，其中該第三核酸序列用以編碼一免疫球蛋白的CH域，以及該第四核酸序列用以編碼該免疫球蛋白的CL域；以及 (5) 將步驟(4)的表現載體(包含該第一、第二、第三以及第四核酸序列)轉染宿主細胞以生產該重組抗體。

在本揭示內容方法中，是將會表現該抗體片段的噬菌體用作製備重組抗體的起始材料(即步驟(1))。

接著，如步驟(2)所述，是萃取與會表現抗體片段的噬菌體相對應的噬質體DNA。依據所欲目的不同，可藉由裂解(lysing)該噬菌體來萃取噬質體；或者是，可以從細菌植株(即含有噬質體的細菌殖株)來獲得噬質體。可藉由任一種常規的DNA萃取技術來達成從噬菌體或細菌植株中萃取噬質體DNA的目的；舉例來說，以苯酚/氯仿法，以及界面活性劑(例如，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate)、TWEEN ^®-20、NP-40和TRITON ^®X-100)/乙酸法來進行萃取。

在步驟(3)中，將所萃取出的噬質體DNA作為模板，來分別擴增用以編碼CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的第一核酸序列(其中使用專一性引子(正向引子：序列編號：113；反向引子：序列編號：114)來進行PCR)；以及用以編碼CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的第二核酸序列(其中使用專一性引子(正向引子：序列編號：115；反向引子：序列編號：116)來進行PCR)。

在步驟(4)中，是將經擴增的第一和第二核酸序列插入一表現載體中，其中該表現載體包含一用以編碼一免疫球蛋白之重鏈恆定域的第三核酸序列，以及一用以編碼該免疫球蛋白的輕鏈恆定域的第四核酸序列。當可理解的是，該免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE以及IgM中的任一種。在本揭示內容一較佳的實施方式中，該免疫球蛋白是IgG。具體來說，該第一和第二核酸序列是先藉由一鏈結物(limker)來連接，其中該鏈結物是利用PCR擴增自plgG載體。依據本揭示內容實施方式，該鏈結物依序包含：CL域、牛生長激素(bovine growth hormone, BGH)、多腺苷酸化(polyadenylation, polyA)訊號、人類CMV啟動子，以及IgG重鏈訊息肽。對於存在於第二核酸序列的3’-端和鏈接物的5’-端之間的互補序列、存在於鏈接物的3’-端和第一個核酸序列的5’-端之間的互補序列、該第二核酸序列、該鏈接物和該第一核酸序列可藉由重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlap extension polymerase chain reaction, OE-PCR)來依序組裝。然後，藉由使用限制酶將該組裝產物插入至pIgG表現載體中。在結構上來說，該建構的表現載體依序包含：第一人類CMV啟動子、IgG輕鏈的訊號肽、第二核酸序列、CL域、第一BGH-polyA訊號、第二人類CMV啟動子、IgG重鏈的訊號肽、第一核酸序列、CH域以及第二BGH-polyA訊號，其中該第二核酸序列和該CL域是由第一人類CMV啟動子所驅動，據以表現該重組抗體的輕鏈，以及該第一核酸序列和該CH域是由第二人類CMV啟動子所驅動，據以表現該重組抗體的重鏈。

在步驟(5)中，是將步驟(4)所建構的表現載體轉染至宿主細胞中，據以生產本揭示內容的重組抗體。通常所使用的宿主細胞是一種哺乳類細胞，例如HEK293細胞。可藉由本領域技術人員熟知的方法來進行轉染，包括基於化學的方法(例如，磷酸鈣、微脂體(liposome)以及陽離子聚合物)、非化學的方法(例如，電穿孔、細胞擠壓(cell squeezing)、聲穿孔(sonoporation)、光學轉染(optical transfection)、原生質體融合(protoplast fusion)和流體動力傳遞(hydrodynamic delivery))、基於粒子的方法(例如，基因槍(gene gun)、磁轉染(magnetofection)和穿刺轉染(impalefection))，以及利用病毒的方法(例如，腺病毒載體、辛德比斯(sindbis)病毒載體和慢病毒載體)。由此所製備的重組抗體會分泌到培養基的上清液中，並且可藉由任何本領域技術人員所熟知的任一種純化方法來從中純化；舉例來說，可藉由與蛋白A或蛋白G的親和性結合來達成純化的目的。

依據本揭示內容某些實施方式，是將由本揭示內容 (II-1)所述之抗-NPA抗體片段製得的7個重組抗體分別命名為「NPA-008 IgG」、「NPA-020 IgG」、「NPA-045 IgG」、「NPA-058 IgG」、「NPA-064 IgG」、「NPA-065 IgG」以及「NPA-066 IgG」。

依據本揭示內容某些實施方式，是將由本揭示內容 (II-1)所述之抗-NPB抗體片段製得的6個重組抗體分別命名為「NPB-010 IgG」、「NPB-020 IgG」、「NPB-034 IgG」、「NPB-042 IgG」、「NPB-046 IgG」以及「NPB-055 IgG」。

(II-3) 重組抗體或其片段

依據某些實施方式，自本揭示內容 (II-1)部分篩選出的每個抗體片段(包含NPA-008、NPA-020、NPA-045、NPA-058、NPA-064、NPA-065、NPA-066、NPB-010、NPB-020、NPB-034、NPB-042、NPB-046和NPB-055 scFv)以及自本揭示內容 (II-2)部分篩選出的重組抗體(包含NPA-008、NPA-020、NPA-045、NPA-058、NPA-064、NPA-065、NPA-066、NPB-010、NPB-020、NPB-034、NPB-042、NPB-046和NPB-055 IgG)，在結構上皆包含一VL域及一VH域，其中VL域包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，以及VH域包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。

(A) 抗 -NPA scFv 和 IgG

依據某些實施方式，NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：1-3的胺基酸序列(即分別具有與序列編號：1-3具有100%之序列相似度的胺基酸序列)，且NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：4-6的胺基酸序列(即分別具有與序列編號：4-6具有100%之序列相似度的胺基酸序列)。依據某些實施方式，NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的VL域包含與序列編號：42具有至少85% (例如，85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之序列相似度的胺基酸序列；且NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的VH域包含與序列編號：43具有至少85% (例如，85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之序列相似度的胺基酸序列。當可理解，該VL域及VH域的序列(例如框架序列)可能會有所不同(例如，經保守性或非保守性的胺基酸殘基所置換)，但不影響本揭示內容之抗體的結合親和力及/或專一性。較佳地，該VL域及VH域的序列是經一或多個具有相似特性的適當胺基酸進行保守性置換；舉例來說，將白胺酸(一種非極性胺基酸殘基)置換成異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸或色胺酸(另一種非極性胺基酸殘基)；將天門冬胺酸(一種酸性胺基酸殘基)置換成麩胺酸(另一種酸性胺基酸殘基)；或是將離胺酸(一種鹼性胺基酸殘基)置換成精胺酸或組胺酸(另一種鹼性胺基酸殘基)。依據較佳的實施方式，NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：42及43具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：42及43具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的VL域具有序列編號：42的胺基酸序列(即具有一與序列編號：42具有100%之序列相似度的胺基酸序列)，且NPA-008 scFv或NPA-008 IgG的VH域具有序列編號：43的胺基酸序列(即具有一與序列編號：43具有100%之序列相似度的胺基酸序列)。

依據某些實施方式，NPA-020 scFv或NPA-020 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：7-9的胺基酸序列，且NPA-020 scFv或NPA-020 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：10-12的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPA-020 scFv或NPA-020 IgG的VL域包含與序列編號：44具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPA-020 scFv或NPA-020 IgG的VH域包含與序列編號：45具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPA-02 scFv或NPA-020 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：44及45具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPA-020 scFv或NPA-020 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：44及45具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPA-020 scFv或NPA-020 IgG的VL域具有序列編號：44的胺基酸序列，且NPA-020 scFv或NPA-020 IgG的VH域具有序列編號：45的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：13、2和14的胺基酸序列，且NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：15-17的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的VL域包含與序列編號：46具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的VH域包含與序列編號：47具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：46及47具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：46及47具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的VL域具有序列編號：46的胺基酸序列，且NPA-045 scFv或NPA-045 IgG的VH域具有序列編號：47的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPA-058 scFv或NPA-058 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：18-20的胺基酸序列，且NPA-058 scFv或NPA-058IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：21-23的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPA-058 scFv或NPA-058 IgG的VL域包含與序列編號：48具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPA-058 scFv或NPA-058 IgG的VH域包含與序列編號：49具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPA-058 scFv或NPA-058 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：48及49具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPA-058 scFv或NPA-058 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：48及49具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPA-058 scFv或NPA-058 IgG的VL域具有序列編號：48的胺基酸序列，且NPA-058 scFv或NPA-058 IgG的VH域具有序列編號：49的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：24-26的胺基酸序列，且NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：27-29的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的VL域包含與序列編號：50具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的VH域包含與序列編號：51具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：50及51具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：50及51具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的VL域具有序列編號：50的胺基酸序列，且NPA-064 scFv或NPA-064 IgG的VH域具有序列編號：51的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：30-32的胺基酸序列，且NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：33-35的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的VL域包含與序列編號：52具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的VH域包含與序列編號：53具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：52及53具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：52及53具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的VL域具有序列編號：52的胺基酸序列，且NPA-065 scFv或NPA-065 IgG的VH域具有序列編號：53的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：36-38的胺基酸序列，且NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：39-41的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的VL域包含與序列編號：54具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的VH域包含與序列編號：55具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：54及55具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：54及55具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的VL域具有序列編號：54的胺基酸序列，且NPA-066 scFv或NPA-066 IgG的VH域具有序列編號：55的胺基酸序列。

(B) 抗 -NPB scFv 和 IgG

依據某些實施方式，NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：56-58的胺基酸序列，且NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：59-61的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的VL域包含與序列編號：91具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的VH域包含與序列編號：92具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：91及92具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：91及92具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的VL域具有序列編號：91的胺基酸序列，且NPB-010 scFv或NPB-010 IgG的VH域具有序列編號：92的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：62-64的胺基酸序列，且NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：65-67的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的VL域包含與序列編號：93具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的VH域包含與序列編號：94具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：93及94具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：93及94具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的VL域具有序列編號：93的胺基酸序列，且NPB-020 scFv或NPB-020 IgG的VH域具有序列編號：94的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：68-70的胺基酸序列，且NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：71-73的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的VL域包含與序列編號：95具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的VH域包含與序列編號：96具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：95及96具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：95及96具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的VL域具有序列編號：95的胺基酸序列，且NPB-034 scFv或NPB-034 IgG的VH域具有序列編號：96的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：74-76的胺基酸序列，且NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：77、10及78的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的VL域包含與序列編號：97具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的VH域包含與序列編號：98具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：97及98具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：97及98具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的VL域具有序列編號：97的胺基酸序列，且NPB-042 scFv或NPB-042 IgG的VH域具有序列編號：98的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：79-81的胺基酸序列，且NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：82-84的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的VL域包含與序列編號：99具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的VH域包含與序列編號：100具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：99及100具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：99及100具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的VL域具有序列編號：99的胺基酸序列，且NPB-046 scFv或NPB-046 IgG的VH域具有序列編號：100的胺基酸序列。

依據某些實施方式，NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有序列編號：85-87的胺基酸序列，且NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有序列編號：88-90的胺基酸序列。依據某些實施方式，NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的VL域包含與序列編號：101具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列；且NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的VH域包含與序列編號：102具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列。依據某些較佳的實施方式，NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：101及102具有至少90%之序列相似度的胺基酸序列。更佳地，NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的VL域及VH域分別包含與序列編號：101及102具有至少95%之序列相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作性實施例中，NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的VL域具有序列編號：101的胺基酸序列，且NPB-055 scFv或NPB-055 IgG的VH域具有序列編號：102的胺基酸序列。

(II-4) 抗體片段及重組抗體於診斷 IAV 或 IBV 感染的用途

依據本揭示內容某些實施例，本發明各抗-NPA抗體片段及重組抗體皆可用以偵測IAV，且本發明各抗-NPB抗體片段及重組抗體皆可用以偵測IBV。據此，該些抗體片段及重組抗體可作為診斷IAV或IBV感染的偵測試劑。

因此，本揭示內容的另一態樣是提供一種用以偵測一個體(即人類個體)中IAV或IBV感染的套組。該套組至少包含，一第一抗體、一第二抗體以及一包含該第一及第二抗體的容器。依據某些實施方式，用以偵測IAV感染之套組的第一及第二抗體是個別選自如本揭示內容 (II-1)至 (II-3)所述的抗-NPA抗體片段(包括NPA-008、NPA-020、NPA-045、NPA-058、NPA-064、NPA-065及NPA-066 scFv)以及抗-NPA重組抗體(包括NPA-008、NPA-020、NPA-045、NPA-058、NPA-064、NPA-065及NPA-066 IgG)。依據某些實施方式，用以偵測IBV感染之套組的第一及第二抗體是個別選自如本揭示內容 (II-1)至 (II-3)所述的抗-NPB抗體片段(包括NPB-010、NPB-020、NPB-034、NPB-042、NPB-046和NPB-055 scFv)以及抗-NPB重組抗體(NPB-010、NPB-020、NPB-034、NPB-042、NPB-046和NPB-055 IgG)。本揭示內容套組可用於任一種本領域技術人員所熟知的檢測技術(例如，ELISA、LFIA、SPR、西方墨點法及流式細胞儀)，以檢測一生物樣本中的IAV或IBV感染。依據某些操作性實施例，本揭示內容套組的第一以及第二抗體片段/重組抗體於ELISA、西方墨點法或LFIA中分別作為補捉抗體及偵測抗體。

依據某些實施方式，該套組是用以偵測IAV。在一實施例中，該套組是命名為「D08C58」，其包含NPA-058 IgG作為第一抗體，以及NPA-008 IgG作為第二抗體。在另一實施例中，該套組是命名為「D45C20」，其包含NPA-020 IgG作為第一抗體，以及NPA-045 IgG作為第二抗體。在另一實施例中，該套組是命名為「D64C66」，其包含NPA-066 IgG作為第一抗體，以及NPA-064 IgG作為第二抗體。又另一實施例中，該套組是命名為「D64C65」，其包含NPA-065 IgG作為第一抗體，以及NPA-064 IgG作為第二抗體。又另一實施例中，該套組是命名為「D65C64」，其包含NPA-064 IgG作為第一抗體，以及NPA-065 IgG作為第二抗體。

依據某些實施方式，該套組是用以偵測IBV。在一實施例中，該套組是命名為「D46C42」，其包含NPB-042 IgG作為第一抗體，以及NPB-046 IgG作為第二抗體。在另一實施例中，該套組是命名為「D55C20」，其包含NPB-020 IgG作為第一抗體，以及NPB-055 IgG作為第二抗體。又另一實施例中，該套組是命名為「D34C10」，其包含NPB-010 IgG作為第一抗體，以及NPB-034 IgG作為第二抗體。

非必要性地，該套組可進一步包含一使用說明，據以指示使用者如何使用該抗體片段或重組抗體來檢測IAV或IBV感染。

此外，本揭示內容亦提供一種藉由一分離自一個體的生物樣本來診斷該個體是否受IAV或IBV感染的方法。該方法包含利用本揭示內容抗體片段、重組抗體或套組來檢測該生物樣本中是否存在IAV或IBV之核蛋白(即偵測NPA或NPB的存在)，其中當該核蛋白存在於該生物樣本中，則診斷該個體受IAV或IBV感染。本揭示方法可偵測之NPA的非限制性實例，包含NPA1 (序列編號：103)、NPA2 (序列編號：104)、NPA3 (序列編號：105)、NPA4 (序列編號：106)、NPA5 (序列編號：107)、NPA6 (序列編號：108)、NPA7 (序列編號：109)、NPA8 (序列編號：110)，以及其變異或衍生物(例如，一NPA突變與序列編號：103-110任一胺基酸序列具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列)。本揭示方法可偵測之NPB的實例包含，但不限於，NPB1 (序列編號：111)、NPB2 (序列編號：112)，以及其變異或衍生物(例如，一NPB突變與序列編號：111或112具有至少85%之序列相似度的胺基酸序列)。

基本上，該生物樣本是取自一個體之呼吸道的樣本；較佳地，是取自該個體的上呼吸道。適用於本揭示方法的生物樣本的非限制性實例包含，自該個體的口腔、鼻腔、氣管、支氣管或肺部分離的黏膜組織、體液或分泌物(例如痰)。

基於診斷結果，本技術領域具有通常知識者或一臨床從業人員可對一有需要的個體(例如，受到IAV或IBV感染的個體)投予適當的治療(例如，抗-病毒治療)，據以緩和及/或減輕與IAV或IBV感染相關的症狀。適用於本發明方法的抗-病毒治療的實例包含，但不限於，奧司他韋、瑞樂沙、帕拉米韋、巴羅沙韋瑪波西酯、金剛胺、金剛乙胺、干擾素-α (interferon-alpha, IFN-α)、干擾素-β (interferon-beta, IFN-β)或其組合。

可以本發明方法診斷及/或治療的個體為一哺乳類；例如，人類、小鼠、大鼠、猴子、綿羊、山羊、貓、狗、馬或猩猩。較佳地，該個體為人類。

下文提出多個實施例來說明本揭示內容的某些態樣，以利本發明所屬技術領域具有通常知識者實踐本發明。不應將該些實施例是為對本發明範圍的限制。據信本發明所屬技術領域具有通常知識者在閱讀此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。本文引用的所有公開文獻在此藉由引用而併入全文。

實施例

材料與方法

製備 IAV 及 IBV 的重組核蛋白 (NPA 及 NPB)

本揭示內容製備八種代表性的NPA (亦即NPA1至NPA8；序列編號：103-110)以及兩種代表性的NPB (亦即NPB1及NPB2；序列編號：111及112)。具體來說，是優化NPA/NPB基因的編碼區域使其適合以 E.coli表現，並連接至以 Nde I及 Xho I限制酶截切後呈線形的表現載體pET15b上；該重組NPA/NPB蛋白包含一位於其序列上游的His ₆標籤和凝血酶截切序列。於16°C的溫度下，添加0.5毫莫耳濃度IPTG以誘導BL21 (DE3)細胞過量表現該些NPA/NPB載體。以Ni ²⁺帶電螯合瓊脂管柱(用以結合His ₆標籤)、肝素管柱(用以結合不含RNA的NP)以及粒徑篩析分離(緩衝溶液：40毫莫耳濃度Tris，pH 7.5；600毫莫耳濃度NaCl)純化由 E.coli表現的該些NPA/NPB重組蛋白。利用RNaseA (每毫升20微克)處理 E.coli的細胞裂解液，以得到不含RNA之NPA/NPB蛋白，並接續純化程序。以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)確認純化的NPA/NPB蛋白。

細胞株

將293-T細胞(ATCC CRL-3216)培養於包含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及青黴素-鏈黴素(100x)的DMEM培養基中。將懸浮性Expi293F™細胞培養在Expi293™表現培養基中，以110每分鐘轉速(rpm)震盪，並置於37°C之8% CO ₂的培養箱中。

辨認由噬菌體表現的合成 scFv 抗體庫中篩選的 IgG1

依據PCT申請案PCT/US2016/19128以及PCT/US2018/56627所述的相同流程來建構及確認該些由噬菌體表現的合成scFv抗體庫。用以淘選(panning)噬菌體表現抗體庫、篩選噬菌體表現的scFv結合物(binder)、利用ELISA確認與同源抗原(cognate antigen)和蛋白A/L結合的scFv、將scFv重製(reformatting)為IgG1，以及表現和純化IgG等的相關實驗步驟皆已揭露於PCT申請案PCT/US2016/19128和PCT/US2018/56627之記載內容。

以免疫墨點法來檢測 NPA/NPB

以12% SDS-PAGE分離250奈克(ng)的NPA/NPB，接著將其轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，並以專一性IgG抗體(1微克/毫升)進行檢測。藉由與山葵過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)鍵結的抗體(1毫克/毫升，1：2,500倍稀釋)偵測特定條帶，並以化學發光受質及化學發光影像系統顯示訊號。

以 EC ₅₀ 檢測抗體 - 抗原交互作用

以IgG抗體於ELISA中對固定的重組NPA/NPB的效價來決定IgG的EC ₅₀。具體來說，將NPA/NPB(每孔洞5微克)以PBS緩衝液(pH7.4)稀釋後，塗佈於96孔洞之免疫培養盤上，接著以5%之溶於PBST的脫脂牛奶阻斷1小時。同時，以含有5%脫脂牛奶的PBST連續2倍稀釋抗體(原液濃度：0.5微克/毫升)，據以產生11種不同濃度的抗體。在阻斷步驟之後，將100微升經稀釋的抗體樣本加入各孔洞中，並搖晃反應1小時。以300微升的PBST洗滌各孔洞三次，再加100微升之與HRP鍵結的山羊抗-人類IgG抗體(以含有5%脫脂牛奶的PBST進行1：5000倍稀釋)反應一小時。以300微升的PBST緩衝液洗滌各孔洞三次後，再以300 微升的PBS洗滌兩次，接著以3,3'5,5'-四甲基聯苯胺(3,3'5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)受質呈色5分鐘，並藉由1.0 M的HCl終止反應，最後測量波長450奈米時的吸光值。

以三明治ELISA偵測NPA/NPB

將以PBS緩衝液(pH7.4)稀釋的補捉抗體(1微克每孔洞)塗布在96孔洞之免疫培養盤上反應過夜。於培養盤中加入5%之溶於PBST的脫脂牛奶阻斷1小時。接著，加入連續2倍稀釋的NPA/NPB (原液濃度：1微克/毫升)至培養盤中(每孔洞100微升)，並於室溫下搖晃反應1小時。以300微升的PBST洗滌各孔洞三次，接著加入100微升之以含有5%脫脂牛奶之PBST 稀釋的偵測抗體(稀釋比例為1：2000)，並於室溫下搖晃反應1小時。以300微升的PBST緩衝液洗滌各孔洞三次後，以300微升的PBS洗滌兩次，接著以TMB受質呈色5分鐘，並藉由1.0 M的HCl終止反應，最後測量波長450奈米時的吸光值。

製備與膠體金 - 鍵結的 AL2C 及 IgG

混合50微升的0.2 M之K ₂CO ₃(pH11.5)與10毫升之膠體金溶液(pH 5-6)以調整pH (最終pH8)，然後加入500公克的IgG或167公克的AL2C至膠體金溶液中，於室溫反應40分鐘。加入1毫升阻斷緩衝液(10%之牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)溶於20毫莫耳濃度硼酸鈉，pH9.3)於室溫反應15分鐘以中止反應，然後離心(15,000 xg，30分鐘，4°C)反應物。倒掉上清液，並將沉澱物重新懸浮於10毫升的洗滌緩衝液(1% BSA溶於20毫莫耳濃度硼酸鈉，pH9.3)中，然後離心(15,000 xg，30分鐘，4°C)懸浮物。重複該洗滌步驟兩次，並將沉澱物重新懸浮於1毫升溶於20毫莫耳濃度硼酸鈉的1% BSA (pH9.3)中，以製備共軛墊。

組裝 LFIA 條帶

以注射輸液磊驅動的橫向流動分配器，將PBS緩衝液中1微克的捕捉抗體、抗原或AL2C，在硝化纖維素膜(nitrocellulose membrane)上以每公分為間隔形成條帶。依照前述方法來製備其他具有固定抗原或補捉抗體的硝化纖維素膜、共軛墊與樣品墊，以及組裝LFIA條帶。

實施例 1 確認重組抗體

合成NPA及NPB，並依據PCT申請案PCT/US2016/19128以及PCT/US2018/56627所述方法來篩選抗-NPA及抗-NPB抗體。

自噬菌體表現的scFv抗體庫中篩選出7種抗-NPA scFv及6種抗-NPB scFv，並將其重製成IgG。將該些抗-NPA IgG分別命名為「NPA-008 IgG」、「NPA-020 IgG」、「NPA-045 IgG」、「NPA-058 IgG」、「NPA-064 IgG」、「NPA-065 IgG」和「NPA-066 IgG」，以及該些抗-NPB IgG分別命名為「NPB-010 IgG」、「NPB-020 IgG」、「NPB-034 IgG」、「NPB-042 IgG」、「NPB-046 IgG」和「NPB-055 IgG」。將該些抗-NPA IgG及抗-NPB IgG的VL域及VH域序列總結於表1及表2。該些IgG對NPA和NPB的ELISA EC ₅₀分別總結於表3及表4。

表1　特定抗-NPA抗體的VL域及VH域序列

名稱	結構域	胺基酸序列	序列編號
NPA-008	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGWGVAWYQQKPGKAPKLLI SSPPFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYDFPITFGQGTKVEIKR	42
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIDGYGIHWVRQAPGKGLEWVA GIGPSWGSTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARFFGSSGYMDYWGQGTLVTVSSASAAA	43
NPA-020	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SGSSSNIGFSGVYWYQQKPGKAPKLLI SGPTWLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC AAYSYNNNGITFGQGTKVEIKR	44
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIGGWGIHWVRQAPGKGLEWVA GIWPYWGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARFYSYYSNMDYWGQGTLVTVSSASAAA	45
NPA-045	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVNNDVAWYQQKPGKAPKLLI SSPPFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYGSPVTFFGQGTKVEIKR	46
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTINSYYIHWVRQAPGKGLEWVA SIWPYGGSTFYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSWSSSYWDYWGQGTLVTVSSASAAA	47
NPA-058	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGGFVAWYQQKPGKAPKLLI SGSRFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYSNSPLTFGQGTKVEIKR	48
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTISSYFIHWVRQAPGKGLEWVA SIWPYGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSYFGSYWDYWGQGTLVTVSSASAAA	49
NPA-064	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVDDDVAWYQQKPGKAPKLLI SSARGLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGYNSPMTFGQGTKVEIKR	50
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTINDYGIHWVRQAPGKGLEWVA GIWPSGGSTFYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARFHSYSGNMDYWGQGTLVTVSSASAAA	51
NPA-065	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGFGVAWYQQKPGKAPKLLI SFPGSLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSFPITFGQGTKVEIKR	52
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTINSWGIHWVRQAPGKGLEWVA GIGPSWGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSSGSFWYDYWGQGTLVTVSSASAAA	53
NPA-066	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGYSVAWYQQKPGKAPKLLI SWTASLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQWFSSPFTFGQGTKVEIKR	54
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIGDSGIHWVRQAPGKGLEWVA SIWPSGGSTFYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSYGYFDYWGQGTLVTVSSASAAA	55

* 以粗體標示CDR序列，包含三個VL域的CDR (即從N-端到C-端依序為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，以及三個VH域的CDR (即從N-端到C-端依序為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)。

表2　特定的抗-NPB抗體的VL域及VH域序列

名稱	結構域	胺基酸序列	序列編號
NPB-010	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYTTPPTFGQGTKVEIKR	91
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIGGFGIHWVRQAPGKGLEWVA GIGPFWGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARFDSHSSYSYGDSLMDYWGQGTLVTVSSASAAA	92
NPB-020	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVWGGVAWYQQKPGKAPKLLI FGTGWLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYNYPVTFFGQGTKVEIKR	93
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTISDSSIHWVRQAPGKGLEWVA GIWPSWGYTFYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARFHSYSGSGVMDYWGQGTLVTVSSASAAA	94
NPB-034	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGDSVAWYQQKPGKAPKLLI YSTSWLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSYPITFGQGTKVEIKR	95
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTINNSGIHWVRQAPGKGLEWVA WIGPYWGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC AREYSFWSFDYWGQGTLVTVSSASAAA	96
NPB-042	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVGSSVAWYQQKPGKAPKLLI YGTSSLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQFYNFPVTFGQGTKVEIKR	97
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIGGWGIHWVRQAPGKGLEWVA GIGPFWGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARFDGYSSYSSSHGLMDYWGQGTLVTVSSASAAA	98
NPB-046	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC LLNSDGWTSLNWYQQKPGKAPKLLI YWTSFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SQSNDFPYTFGQGTKVEIKR	99
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC TFSHWSMHWVWVRQAPGKGLEWVA DISPNFGHTHYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGIWLDYWGQGTLVTVSSASAAA	100
NPB-055	VL	MADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVYFGVAWYQQKPGKAPKLLI SYSASLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYSSFPLTFGQGTKVEIKR	101
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTIDNSGIHWVRQAPGKGLEWVA GIWPSWGSTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSYWSDYWGQGTLVTVSSASAAA	102

表3　特定的IgG對NPA的結合親和力(EC ₅₀)

	抗-NPA IgG (奈克/毫升)的EC ₅₀
名稱	NPA-008	NPA-020	NPA-045	NPA-058	NPA-064	NPA-065	NPA-066
NPA1	186.1	30.7	＞ 2000	3.1	5.1	＞ 2000	84.1
NPA2	30.1	＞ 2000	＞ 2000	2.2	2.4	＞ 2000	5.0
NPA3	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	2.7	399.4	1191.0
NPA4	＞ 2000	＞ 2000	222.1	＞ 2000	3.0	10.1	15.4
NPA5	290.9	192.4	＞ 2000	7.5	2.7	814.5	18.2
NPA6	＞ 2000	74.3	＞ 2000	＞ 2000	2.3	＞ 2000	＞ 2000
NPA7	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA8	2.3	9.8	3.2	2.7	3.4	182.8	29.7
NPB1	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPB2	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000

表4　特定的IgG對NPB的結合親和力(EC ₅₀)

	抗-NPB IgG (奈克/毫升)的EC ₅₀
名稱	NPB-010	NPB-020	NPB-034	NPB-042	NPB-046	NPB-055
NPA1	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA2	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA3	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA4	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA5	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA6	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA7	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPA8	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000	＞ 2000
NPB1	2.2	3.2	2.0	1.9	5.7	1.1
NPB2	2.2	3.0	2.2	2.1	6.6	1.2

進一步以三明治ELISA檢測本發明IgG對NPA或NPB的結合親和力。依據分析結果，抗體對(antibody pair) D08C58、D45C20、D64C66、D64C65以及D65C64皆可用以偵測至少三種NPA (表5)，抗體對D46C42、D55C20及D34C10可用以偵測NPB (表6)。該些數據表示，本發明抗體可作為偵測IAV或IBV的偵測及補捉抗體。

表5　在三明治ELISA中特定抗體對對NPA的結合親和力(EC ₅₀)

	抗體對(奈克/毫升)的EC ₅₀
名稱	D08C58	D45C20	D64C66	D64C65	D65C64
NPA1	653.7	779.7	55.4	58.1	482.8
NPA2	711.1	564.5	127	124.3	935.5
NPA3	＞ 2,000	＞ 2,000	53.8	37.1	480.8
NPA4	＞ 2,000	＞ 2,000	29.6	14.6	22.9
NPA5	729	＞ 2,000	47.4	22.6	120.8
NPA6	＞ 2,000	＞ 2,000	64.2	53.9	654.9
NPA7	638	＞ 2,000	＞ 2,000	＞ 2,000	＞ 2,000
NPA8	63.3	122.8	35	17.3	66.6

抗體對D08C58包含作為補捉抗體的NPA-058 IgG及作為偵測抗體的NPA-008 IgG。抗體對D45C20包含作為補捉抗體的NPA-020 IgG及作為偵測抗體的NPA-045 IgG。抗體對D64C66包含作為補捉抗體的NPA-066 IgG及作為偵測抗體的NPA-064 IgG。抗體對D64C65 包含作為補捉抗體的NPA-065 IgG及作為偵測抗體的NPA-064 IgG。抗體對D65C64包含作為補捉抗體的NPA-064 IgG 及作為偵測抗體的NPA-065 IgG。

表6　在三明治ELISA中特定抗體對對NPB的結合親和力(EC ₅₀)

	抗體對(奈克/毫升)的EC ₅₀
名稱	D46C42	D55C20	D34C10
NPB1	95.7	100.7	154.5

抗體對D46C42包含作為補捉抗體的NPB-042 IgG及作為偵測抗體的NPB-046 IgG。抗體對D55C20 包含作為補捉抗體的NPB-020 IgG及作為偵測抗體的NPB-055 IgG。抗體對D34C10包含作為補捉抗體的NPB-010 IgG及作為偵測抗體的NPB-034 IgG。

除了ELISA以外，本發明抗體亦可用於西方墨點法中作為IAV或IBV的偵測抗體。依據第1A圖的數據指出，NPA-008、NPA-020、NPA-045、NPA-058、NPA-064、NPA-065以及NPA-066 IgG (7種代表性的抗-NPA的抗體)皆可專一性的辨認一或多種NPA (即NPA1至NPA8)，且不與NPB (即NPB1及NPB2)結合。依據第1B圖的數據表示，NPB-010、NPB-020、NPB-042、NPB-046、NPB-055及NPB-034皆可辨認NPA (即NPA1至NPA8)及NPB (即NPB1及NPB2)的構象表位(conformational epitope)，但不會辨認該些NPA及NPB的線性表位(linear epitope)。

實施例 2 建構用以偵測 IAV 或 IBV 的 LFIA 裝置

為了建構LFIA裝置，依照本揭示內容的「材料與方法」所述流程，將7種代表性的抗-NPA抗體及6種代表性的抗-NPB抗體與膠體金鍵結。表7及表8的數據闡述本發明抗體可有效率的與膠體金鍵結。

表7　抗-NPA IgG與金鍵結前的SB緩衝液交換效率

No.	IgG名稱	輸入 (毫克)	輸出體積 (毫升)	濃度 (毫克/毫升)	輸出 (毫克)	回收率(%)
1	NPA-008	2.00	0.35	5.62	1.97	98.35
2	NPA-020	2.00	0.29	6.64	1.93	96.28
3	NPA-045	2.00	0.31	5.63	1.75	87.27
4	NPA-058	2.00	0.44	3.86	1.70	84.92
5	NPA-064	2.00	0.44	4.38	1.93	96.36
6	NPA-065	2.00	0.33	5.56	1.83	91.74
7	NPA-066	2.00	0.38	5.13	1.95	97.47

表8　抗-NPB抗體與金鍵結前的SB緩衝液交換效率

No.	IgG名稱	輸入 (毫克)	輸出體積 (毫升)	濃度 (毫克/毫升)	輸出 (毫克)	回收率(%)
1	NPB-010	2.00	0.4	5.16	2.06	103.20
2	NPB-020	2.00	0.45	5.59	2.52	125.78
3	NPB-034	2.00	0.48	4.29	2.06	102.96
4	NPB-042	2.00	0.45	4.8	2.16	108.00
5	NPB-046	2.00	0.45	4.31	1.94	96.98
6	NPB-055	2.00	0.44	4.84	2.13	106.48

在此實施例中建構5種用以偵測IAV的LFIA裝置原型，其中LFIA原型D08C58 是以NPA-058 IgG作為補捉抗體，且以NPA-008 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體；LFIA原型D45C20是以NPA-020 IgG作為補捉抗體，且以NPA-045 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體；LFIA原型D64C66是以NPA-066 IgG作為補捉抗體，且以NPA-064 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體；LFIA原型D64C65是以NPA-065 IgG作為補捉抗體，且以NPA-064 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體；LFIA原型D65C64是以NPA-064 IgG作為補捉抗體，且以NPA-065 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體。藉由兩種包含NPA (即NPA1-NPA6及NPA8任一種)的樣品製備(sample preparation)來確認各LFIA原型的偵測極限。第一種樣品製備包含由Expi293細胞表現的NPA，以及第二種樣品製備包含由 E.coli表現的NPA。兩種樣品製備的偵測極限都介於2-62.5奈克/每試驗(數據未顯示)。

此外，在此實施例中建構3種用以偵測IBV的LFIA裝置原型，其中LFIA原型D46C42是以NPB-042 IgG作為補捉抗體，且以NPB-046 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體；LFIA原型D55C20是以NPB-020 IgG作為補捉抗體，且以NPB-055 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體；LFIA原型D34C10是以NPB-010 IgG作為補捉抗體，且以NPB-034 IgG作為與膠體金-鍵結的偵測抗體。藉由兩種包含NPB的樣品製備來確認各LFIA原型的偵測極限。第一種樣品製備包含由Expi293細胞表現的NPB，以及第二種樣品製備包含由 E.coli表現的NPB。兩種樣品製備的偵測極限都介於1.0-3.9奈克/每試驗(數據未顯示)。

總結上述，篩選自GH合成抗體庫的抗體被證實可與IAV或IBV的核蛋白具有高度的結合親和力及專一性。本揭示內容源自於該GH抗體庫的抗體(包括7種抗-NPA的IgG及6種抗-NPB的IgG)不需更進一步的親和力成熟，即可用於三明治ELISA及LFIA中偵測相應的NPA或NPB的核蛋白，且其偵測極限為1-2奈克/每試驗。據此，本揭示內容抗體可用以偵測IAV或IBV，據以診斷IAV或IBV感染。

應當理解的是，前述實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本發明所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍以附隨申請專利範圍界定者為準。

無

在參閱以下的詳細說明及隨附圖式後，本揭示內容當更加明顯易懂，其中：

第1A及1B圖是依據本揭示內容實施例1之西方墨點法所繪示的結果，其中是以特定抗體來檢測NPA (即源自IAV的核蛋白，包含NPA1至NPA8)及NPB (即源自IBV的核蛋白，包含NPB1和NPB2)。

<110> 中央研究院

<120> 重組抗體、包含重組抗體之套組及其於診斷流感病毒的用途

<130> P4158-PCT

<140> 111118774

<141> 2022-05-19

<160> 116

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_CDR-L1

<400> 1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_CDR-L2

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_CDR-L3

<400> 3

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_CDR-H1

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_CDR-H2

<400> 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_CDR-H3

<400> 6

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020_CDR-L1

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020_CDR-L2

<400> 8

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020_CDR-L3

<400> 9

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020 CDR-H1

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020_CDR-H2

<400> 11

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020_CDR-H3

<400> 12

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-045_CDR-L1

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-045_CDR-L3

<400> 14

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-045_CDR-H1

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-045_CDR-H2

<400> 16

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-045_CDR-H3

<400> 17

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_CDR-L1

<400> 18

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_CDR-L2

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_CDR-L3

<400> 20

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_CDR-H1

<400> 21

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_CDR-H2

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_CDR-H3

<400> 23

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_CDR-L1

<400> 24

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_CDR-L2

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_CDR-L3

<400> 26

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_CDR-H1

<400> 27

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_CDR-H2

<400> 28

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_CDR-H3

<400> 29

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_CDR-L1

<400> 30

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_CDR-L2

<400> 31

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_CDR-L3

<400> 32

<210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_CDR-H1

<400> 33

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_CDR-H2

<400> 34

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_CDR-H3

<400> 35

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_CDR-L1

<400> 36

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_CDR-L2

<400> 37

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_CDR-L3

<400> 38

<210> 39

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_CDR-H1

<400> 39

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_CDR-H2

<400> 40

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_CDR-H3

<400> 41

<210> 42

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_VL

<400> 42

<210> 43

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-008_VH

<400> 43

<210> 44

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020_VL

<400> 44

<210> 45

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-020_VH

<400> 45

<210> 46

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-045_VL

<400> 46

<210> 47

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-045_VH

<400> 47

<210> 48

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_VL

<400> 48

<210> 49

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-058_VH

<400> 49

<210> 50

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_VL

<400> 50

<210> 51

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-064_VH

<400> 51

<210> 52

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_VL

<400> 52

<210> 53

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-065_VH

<400> 53

<210> 54

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_VL

<400> 54

<210> 55

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA-066_VH

<400> 55

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_CDR-L1

<400> 56

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_CDR-L2

<400> 57

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_CDR-L3

<400> 58

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_CDR-H1

<400> 59

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_CDR-H2

<400> 60

<210> 61

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_CDR-H3

<400> 61

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_CDR-L1

<400> 62

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_CDR-L2

<400> 63

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_CDR-L3

<400> 64

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_CDR-H1

<400> 65

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_CDR-H2

<400> 66

<210> 67

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_CDR-H3

<400> 67

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_CDR-L1

<400> 68

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_CDR-L2

<400> 69

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_CDR-L3

<400> 70

<210> 71

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_CDR-H1

<400> 71

<210> 72

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_CDR-H2

<400> 72

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_CDR-H3

<400> 73

<210> 74

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-042_CDR-L1

<400> 74

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-042_CDR-L2

<400> 75

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-042_CDR-L3

<400> 76

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-042_CDR-H2

<400> 77

<210> 78

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-042_CDR-H3

<400> 78

<210> 79

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_CDR-L1

<400> 79

<210> 80

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_CDR-L2

<400> 80

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_CDR-L3

<400> 81

<210> 82

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_CDR-H1

<400> 82

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_CDR-H2

<400> 83

<210> 84

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_CDR-H3

<400> 84

<210> 85

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_CDR-L1

<400> 85

<210> 86

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_CDR-L2

<400> 86

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_CDR-L3

<400> 87

<210> 88

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_CDR-H1

<400> 88

<210> 89

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_CDR-H2

<400> 89

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_CDR-H3

<400> 90

<210> 91

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_VL

<400> 91

<210> 92

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-010_VH

<400> 92

<210> 93

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_VL

<400> 93

<210> 94

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-020_VH

<400> 94

<210> 95

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_VL

<400> 95

<210> 96

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-034_VH

<400> 96

<210> 97

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-042_VL

<400> 97

<210> 98

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-042_VH

<400> 98

<210> 99

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_VL

<400> 99

<210> 100

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-046_VH

<400> 100

<210> 101

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_VL

<400> 101

<210> 102

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB-055_VH

<400> 102

<210> 103

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA1

<400> 103

<210> 104

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA2

<400> 104

<210> 105

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA3

<400> 105

<210> 106

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA4

<400> 106

<210> 107

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA5

<400> 107

<210> 108

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA6

<400> 108

<210> 109

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA7

<400> 109

<210> 110

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPA8

<400> 110

<210> 111

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB1

<400> 111

<210> 112

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_NPB2

<400> 112

<210> 113

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_F引子

<400> 113

<210> 114

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_R引子

<400> 114

<210> 115

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_F引子

<400> 115

<210> 116

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的_R引子

<400> 116

Claims

一種重組抗體或其片段，包含一輕鏈變異(variable light chain,VL)域以及一重鏈變異(variable heavy chain,VH)域，其中該VL域包含一第一輕鏈互補決定區(first light chain complementarity determining region,CDR-L1)、一第二輕鏈互補決定區(second light chain CDR,CDR-L2)以及一第三輕鏈互補決定區(third light chain CDR,CDR-L3)；且該VH域包含一第一重鏈互補決定區(first heavy chain CDR,CDR-H1)、一第二重鏈互補決定區(second heavy chain CDR,CDR-H2)以及一第三重鏈互補決定區(third heavy chain CDR,CDR-H3)，其中該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：1-3的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：4-6的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：7-9的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：10-12的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：13、2及14的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：15-17的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：18-20的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：21-23的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：24-26的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：27-29的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：30-32的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：33-35的胺基酸序列；或是該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：36-38的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：39-41的胺基酸序列。
如請求項1所述之重組抗體，其中該VL域包含一與序列編號：42具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：43具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：44具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：45具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：46具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：47具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：48具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：49具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：50具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：51具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：52具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：53具有100%之序列相似度的胺基酸序列；或是該VL域包含一與序列編號：54具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：55具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
一種用於偵測A型流感病毒(influenza A virus,IAV)的套組，包含一第一重組抗體和一第二重組抗體，其個別選自如請求項1所述之重組抗體；以及一包含該第一重組抗體及該第二重組抗體的容器。
如請求項3所述之套組，其中該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：1-3的胺基酸序列，且該第一重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：4-6的胺基酸序列；以及該第二抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：18-20的胺基酸序列，且該第二抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：21-23的胺基酸序列。
如請求項4所述之套組，其中該第一抗體的VL域包含一與序列編號：42具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第一抗體的VH域包含一與序列編號：43具有100%之序列相似度的胺基酸序列；以及該第二抗體的VL域包含一與序列編號：48具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二抗體的VH域包含一與序列編號：49具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
如請求項3所述之套組，其中該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：7-9的胺基酸序列，且該第一重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：10-12的胺基酸序列；以及該第二抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：13、2及14的胺基酸序列，且該第二抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：15-17的胺基酸序列。
如請求項6所述之套組，其中該第一抗體的VL域包含一與序列編號：44具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第一抗體的VH域包含一與序列編號：45具有100%之序列相似度的胺基酸序列；以及該第二抗體的VL域包含一與序列編號：46具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二抗體的VH域包含一與序列編號：47具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
如請求項3所述之套組，其中該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：24-26的胺基酸序列，且該第一重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：27-29的胺基酸序列；以及該第二抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：36-38的胺基酸序列，且該第二抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：39-41的胺基酸序列。
如請求項8所述之套組，其中該第一抗體的VL域包含一與序列編號：50具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第一抗體的VH域包含一與序列編號：51具有100%之序列相似度的胺基酸序列；以及該第二抗體的VL域包含一與序列編號：54具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二抗體的VH域包含一與序列編號：55具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
如請求項3所述之套組，其中該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：24-26的胺基酸序列，且該第一重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：27-29的胺基酸序列；以及該第二抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：30-32的胺基酸序列，且該第二抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：33-35的胺基酸序列。
如請求項10所述之套組，其中該第一抗體的VL域包含一與序列編號：50具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第一抗體的VH域包含一與序列編號：51具有100%之序列相似度的胺基酸序列；以及該第二抗體的VL域包含一與序列編號：52具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二抗體的VH域包含一與序列編號：53具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
一種藉由一分離自一個體的生物樣本來確認該個體是否受IAV感染的方法，包含利用如請求項1所述之重組抗體或如請求項3所述之套組來檢測該生物樣本中是否存在該IAV的核蛋白，其中該核蛋白存在表示該個體受到IAV感染。
一種重組抗體或其片段，包含一輕鏈變異(variable light chain,VL)域以及一重鏈變異(variable heavy chain,VH)域，其中該VL域包含一第一輕鏈互補決定區(first light chain complementarity determining region,CDR-L1)、一第二輕鏈互補決定區(second light chain CDR,CDR-L2)以及一第三輕鏈互補決定區(third light chain CDR,CDR-L3)；且該VH域包含一第一重鏈互補決定區(first heavy chain CDR,CDR-H1)、一第二重鏈互補決定區(second heavy chain CDR,CDR-H2)以及一第三重鏈互補決定區(third heavy chain CDR,CDR-H3)，其中該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：56-58的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：59-61的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：62-64的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：65-67的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：68-70的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：71-73的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：74-76的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：77、10及78的胺基酸序列；該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：79-81的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：82-84的胺基酸序列；或是該CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：85-87的胺基酸序列，且該CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：88-90的胺基酸序列。
如請求項13所述之重組抗體，其中該VL域包含一與序列編號：91具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：92具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：93具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：94具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：95具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：96具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：97具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：98具有100%之序列相似度的胺基酸序列；該VL域包含一與序列編號：99具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：100具有100%之序列相似度的胺基酸序列；或是該VL域包含一與序列編號：101具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該VH域包含一與序列編號：102具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
一種用於偵測B型流感病毒(influenza B virus,IBV)的套組，包含一第一重組抗體以及一第二重組抗體，其個別選自如請求項13所述之重組抗體；以及一包含該第一重組抗體及該第二重組抗體的容器。
如請求項15所述之套組，其中該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：74-76的胺基酸序列，且該第一重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：77、10及78的胺基酸序列；以及該第二抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：79-81的胺基酸序列，且該第二抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：82-84的胺基酸序列。
如請求項16所述之套組，其中該第一抗體的VL域包含一與序列編號：97具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第一抗體的VH域包含一與序列編號：98具有100%之序列相似度的胺基酸序列；以及該第二抗體的VL域包含一與序列編號：99具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二抗體的VH域包含一與序列編號：100具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
如請求項15所述之套組，其中該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：62-64的胺基酸序列，且該第一重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：65-67的胺基酸序列；以及該第二抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：85-87的胺基酸序列，且該第二抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：88-90的胺基酸序列。
如請求項18所述之套組，其中該第一抗體的VL域包含一與序列編號：93具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第一抗體的VH域包含一與序列編號：94具有100%之序列相似度的胺基酸序列；以及該第二抗體的VL域包含一與序列編號：101具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二抗體的VH域包含一與序列編號：102具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
如請求項15所述之套組，其中該第一重組抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：56-58的胺基酸序列，且該第一重組抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：59-61的胺基酸序列；以及該第二抗體的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別包含序列編號：68-70的胺基酸序列，且該第二抗體的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別包含序列編號：71-73的胺基酸序列。
如請求項20所述之套組，其中該第一抗體的VL域包含一與序列編號：91具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第一抗體的VH域包含一與序列編號：92具有100%之序列相似度的胺基酸序列；以及該第二抗體的VL域包含一與序列編號：95具有100%之序列相似度的胺基酸序列，且該第二抗體的VH域包含一與序列編號：96具有100%之序列相似度的胺基酸序列。
一種藉由一分離自一個體的生物樣本來確認該個體是否受IBV感染的方法，包含利用如請求項13所述之重組抗體或如請求項15所述之套組來檢測該生物樣本中是否存在該IBV的核蛋白，其中該核蛋白存在表示該個體受到IBV感染。