TW201922778A

TW201922778A - 中和性抗體的高通量篩選方法、由該方法製備之中和性抗體，以及其用途

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Publication number: TW201922778A
Application number: TW107136858A
Authority: TW
Inventors: 楊安綏; 陳英謙; 邱奕凱; 余忠銘; 李政忠; 董昭萍; 鄒岳良; 黃怡仁; 林珈龍; 陳鴻森; 王惠鈞
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-06-16
Also published as: EP3697437A4; TWI728272B; EP3697437A1; WO2019079671A1; US11434277B2; CN111465409A; US20210070843A1

Abstract

本揭示內容是關於用以高通量篩選病毒專一之中和性抗體的方法。依據本揭示內容某些實施方式，該病毒為一流感病毒。本揭示內容亦提供以高通量篩選法篩選出的抗體，以及其於預防及/或治療病毒感染之用途。

Description

中和性抗體的高通量篩選方法、由該方法製備之中和性抗體，以及其用途

本揭示內容是關於用以篩選中和性抗體(neutralizing antibody)的方法。更具體來說，本揭示內容是關於以高通量篩選來製備抗流感病毒等不同病毒之中和性抗體。

每年爆發的流感病毒感染往往造成全球性的社會及經濟負擔。據估計，流感於2003年約造成美國871億美元的經濟損失。然而，相較於經濟上的損失，流感造成的死亡率更為嚴重；依據世界衛生組織的統計資料，全球年度季節性流感對成人的侵襲率約為5-10%，對孩童則為20-30%，導致每年約有10億流感感染病例，3-5百萬例重症，以及250,000-500,000人死亡，其中以老年人、嬰兒及患有慢性疾病的個體為高風險族群。

相較於季節性流感，大規模的A型流感病毒(influenza A virus, IAV)爆發對人類帶來更為嚴重的威脅。大規模流感具有高侵襲率(1918年流感大爆發超過50%的侵襲率)，且對20至40歲的年輕成人具有高致死率，該族群佔1918年流感大爆發死亡人數的一半以上。人口數量增加及相互連接的旅行模式重加了大規模爆發對人類的威脅性。在過去一世紀中，三次主要大規模流感爆發為：1918 H1N1西班牙株、1957 H2N2亞洲株，以及1968 H3N2香港株。三次大規模流感爆發估計造成全球5千萬到1億人口死亡，其中1918流感大爆發的致死率約為2%，造成2千萬到1億人口死亡。21世紀的第一次大規模爆發是由豬隻來源之2009 H1N1流感病毒(墨西哥株)所引起，世界衛生組織統計有數百萬的感染病例，並造成16,813人死亡(截至2010/3/19為止)。以目前現有知識並無法預測下一次的大規模感染，因此需對不同新興的禽流感病毒株有所防範，包含1997年的H5N1 (香港株)，2013年的H7N9 (中國株)、H10N8 (中國株)及H6N1 (台灣株)，以及2014年的H5N6 (香港株)，其中又以高致病性禽流感H5N1 (香港株)及H7N9 (中國株)最值得注意。若病毒基因重組或抗原漂流(antigenic shift)產生了新的H7N9/H5N1禽流感病毒，並於人類群體中散播，則有可能引起新一波的大規模爆發。

目前尚無可有效保護人類免於IAV大規模感染及爆發的方法。季節性三價或四價流感疫苗的功效會隨著預測疫苗病毒株與傳播病毒株的比對正確性而有所差異。更重要的是，多數人類個體對大規模爆發之流感病毒並不具有保護性的免疫力，而對抗大規模爆發病毒株的疫苗往往需於疫苗製造商取得疫苗病毒5-6個月後才可提供上巿。在疫苗上巿前，大規模爆發之流感可能已造成大量死亡率、致病率及經濟損失。目前醫藥領域仍致力研發廣效性疫苗，以期對抗各種流感病毒株；惟，即使具有有效的疫苗，其亦僅能於2週後產生保護性免疫力。利用抗病毒藥物(多數為奧斯他偉(oseltamivir，克流感(Tamiflu))等神經胺酸酶抑制劑)作為抑制流感大爆發的策略仍有待確認。此外，由抗原漂流及抗原漂移(antigenic drift)產生的抗藥性流感病毒株，亦有可能促使具有大規模感染威脅性的流感病毒株對抗病毒藥物產生抗藥性。

利用中和性抗體進行被動免疫治療以治療嚴重的IAV感染為流感大規模感染及大爆發提供了一種可行的防治策略。可藉由培養/轉殖人類單一記憶及漿母B細胞，以及利用噬菌體表現人類抗體群來製備具有潛力之人類中和性抗體；在該些抗體中，部分抗體為廣效型中和性抗體(broadly neutralizing antibody, bnAb)，且將於人類臨床試驗中進行被動免疫治療的試驗分析。然而，對感染病毒株(其具有人類免疫系統未知的基因組成)具有中和性功效的親和成熟人類抗體仍為相關領域於研發時面臨的一大挑戰。此外，以中和性抗體廣泛治療的篩選壓力，最終可能導致中和性脫逸變異株(neutralization escape variant)的產生。

有鑑於此，相關領域亟需一種可高通量篩選中和性抗體的方法，以針對新興病毒感染所造成之威脅產生立即性反應。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容的第一態樣是關於一種用以高通量篩選一對一病毒具有專一性之中和性抗體的方法。該方法包含： (a)提供一噬菌體表現之單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)抗體庫，其包含複數個噬菌體表現的scFv，其中各噬菌體表現之scFv的重鏈變異域(heavy chain variable domain, VH domain)對蛋白A具有結合親和力，且各噬菌體表現之scFv的輕鏈變異域(light chain variable domain, VL domain)對蛋白L具有結合親和力； (b)使步驟(a)之噬菌體表現之scFv抗體庫曝露於一源自該病毒的病毒抗原； (c)於一酸性環境中，由步驟(b)之噬菌體表現之scFv抗體庫篩選出複數個噬菌體，其會表現與該病毒抗體具有結合親和力的scFv； (d)分別使步驟(c)篩選之該複數個噬菌體表現複數個可溶形式的(soluble) scFv； (e)使步驟(d)之該複數個可溶形式的scFv曝露於該病毒； (f)分別決定步驟(e)之該複數個可溶形式之scFv的中和效力(neutralizing efficacy)；以及 (g) 基於步驟(f)決定的結果，篩選一可溶形式之scFv作為該中和性抗體，其相對於該複數個可溶形式scFv中其他可溶形式之scFv具有較佳的中和效力。

該病毒可以是流感病毒(influenza virus)、麻疹病毒(measles virus)、冠狀病毒(coronavirus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、馬堡病毒(marburg virus)、伊波拉病毒(ebola virus)、德國麻疹病毒(rubella virus)、鼻病毒(rhinovirus)、小兒麻痺病毒(poliovirus)、肝炎病毒(hepatitis virus)、天花病毒(smallpox virus)、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus)、嚴重急性呼吸綜合症病毒(severe acute respiratory syndrome virus)、反轉錄病毒(retrovirus)、輪狀病毒(rotavirus)、腺病毒(adenoviruses)、腺相關病毒(adeno-associated virus)或阿爾法病毒(alphavirus)。依據本揭示內容某些實施方式，該病毒是流感病毒；在該些實施方式中，於步驟(b)及(c)用以篩選scFv的病毒抗原較佳是血球凝集素(hemagglutinin, HA)或神經胺酸酶(neuraminidase, NA)。

依據本揭示內容某些實施方式，步驟(c)是以一pH值介於2-6.8的緩衝液來處理步驟(b)的產物。依據一操作實施例，該緩衝液的pH值為5.0。

本揭示內容亦提供一種由本發明方法所製備的中和性抗體。依據某些實施方式，該中和性抗體VL域的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：1-28之任一序列；且該中和性抗體VH域的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：29-56之任一序列。依據本揭示內容特定實施例，該中和性抗體VL域的胺基酸序列100%相似於序列編號：1-28之任一序列；且該中和性抗體VH域的胺基酸序列100%相似於序列編號：29-56之任一序列。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以製備一重組抗體的方法。該方法包含： (a)以本發明高通量篩選法來篩選一中和性抗體； (b)萃取一噬質體(phagemid) DNA，其對應於該會表現步驟(a)之中和性抗體的噬菌體； (c)以步驟(b)之噬質體DNA作為模版，利用聚合酶連鎖反應分別擴增一用以編碼一VL域的第一核酸序列，以及一用以編碼一VH域的第二核酸序列； (d)將該第一及第二核酸序列插入一表現載體中，其係包含一第三及一第四核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白之輕鏈恒定域(light chain constant domain, CL domain)，且該第四核酸序列係用以編碼該免疫球蛋白之重鏈恒定域(heavy chain constant domain, CH domain)；以及 (e)將步驟(d)之該包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞，以製備該重組抗體。

依據本揭示內容之實施方式，該第一核酸序列是位於該第三核酸序列的上游，且該第二核酸序列是位於該第四核酸序列的上游。較佳地，該免疫球蛋白為免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG).

依據某些實施方式，步驟(e)的宿主細胞為一哺乳動物細胞。

製得的重組抗體包含一VL域、一CL域、一VH域及一CH域。依據某些實施方式，該重組抗體VL域的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：1-28之任一序列；且該重組抗體VH域的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：29-56之任一序列。依據本揭示內容特定的實施例，該重組抗體VL域的胺基酸序列100%相似於序列編號：1-28之任一序列；且該重組抗體VH域的胺基酸序列100%相似於序列編號：29-56之任一序列。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以治療或預防一有需要個體之病毒感染的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本發明中和性抗體或本發明重組抗體。

可接受本發明方法治療的個體為一哺乳動物；較佳地，該個體是一人類。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

除非本說明書另有定義，否則本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

在本揭示內容中，「抗原」(antigen或Ag)一詞是指可引發免疫反應的分子。該免疫反應可以是產生抗體、活化特定之免疫勝任細胞，或二者。習知技藝人士當可了解包含幾乎所有蛋白及胜肽等大分子皆可作為抗原。此外，抗原亦可源自重組或基因體DNA。習知技藝人士當可了解可用以編碼一「抗原」(antigen或Ag)之DNA包含一用以編碼可引發免疫反應之蛋白的核酸序列或部分核酸序列。此外，本所屬領域具有通常知識者亦可了解抗原不必然是由基因中單一全長核酸序列編碼而成，而是有可能由源自多個基因、經不同重組方式排列之部分核酸序列編碼而成，藉以引發特定的免疫反應。此外，習知技藝人士當可了解抗原不必然是由一「基因」(gene)編碼而成；日漸增多的數據顯示抗原可以為合成或源自生物檢體的物質。所述生物檢體包含，但不限於，組織檢體、腫瘤檢體、細胞或生物體液。

「抗體」(antibody)一詞在本揭示內容泛指單株抗體(monoclonal antibody；包含全長單株抗體)、多株抗體(polyclonal antibody)、多效抗體(multi-specific antibody；例如雙效抗體)及能產生特定生物活性的抗體片段。「抗體片段」(antibody fragment)一詞在本揭示內容中包含全長抗體的一部分，該部分通常為抗體中與抗原結合的位置或變異區域。例示性的抗體片段包含Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、雙鏈抗體(diabody)、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule)及由抗體片段形成的多效抗體。

「抗體庫」(antibody library)一詞在本揭示內容是指一群經表現的抗體及/或抗體片段，用以篩選及/或組合成完整抗體。抗體及/或抗體片段可以表現於核醣體(ribosome)、噬菌體或細胞表面(特別是酵母菌細胞表面)。

在本揭示內容中，「單鏈變異片段」(single-chain variable fragment或scFv)是指包含一免疫球蛋白之重鏈變異域(variable domain of the heavy chain, VH)及輕鏈變異域(variable doamin of the light chain, VL)的融合蛋白，其中該VH及VL是共價鍵結以形成一VH::VL異二聚體(heterodimer)。該VH及VL可直接連結或透過一由胜肽編碼之連接子連結，其中該連接子可連接VH的N端及VL的C端，或是連接VH的C端及VL的N端。連接子通常為包含多個能增加可撓性之甘胺酸(glycine)及多個能增加溶解性之絲胺酸(serine)或蘇胺酸(threonine)的片段。即使移除抗體之恒定域且插入連接子，scFv蛋白仍保有原免疫球蛋白的專一性。可由包含用以編碼VH及VL序列的核酸來表現單鏈Fv多肽抗體。

在本揭示內容中，「EC₅₀ 」一詞是指一抗體或其抗原結合區域的濃度，該濃度在活體外或活體試驗中可引發一反應，其為最大反應的一半量(即最大反應及基準質的中間量)。

「噬質體」(phagemid)一詞在本揭示內容是指一結合細菌噬菌體及質體特性的載體。細菌噬菌體是指任何一種可感染細菌的病毒。

此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比」(Percentage (%) amino acid sequence identity)係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：% 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。

本揭示內容及請求保護之發明概念亦包含抗體之胺基酸序列的微小變異，其中胺基酸序列的變異維持至少85%序列相似度，例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似度。可藉由特定修飾來改變抗體的特性，而不影響其生理活性。舉例來說，可改變及/或刪除某些胺基酸而不影響本發明抗體的生理活性(即，其中和流感病毒的能力)。特別是，保留性胺基酸取代亦包含於其中。保留性取代為具有相似/相關側鏈之胺基酸間的相互取代。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1) 酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基(aliphatic-hydroxy)類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺(amide-containing)類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香(aromatic)類。舉例來說，當可想見若以異白胺酸或纈胺酸取代白胺酸、以麩胺酸取代天門冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸，或是以一結構相似的胺基酸取代另一胺基酸時，並不會造成分子結合或蛋白特性的顯著改變，特別是當該取代位置不是位於骨架區域時，胺基酸之間的取代更不會影響上述特性。可藉由檢測抗體衍生物之特定活性來瞭解一胺基酸的改變是否可形成一具功能性的抗體。可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來製備抗體片段或類似物。片段或類似物之較佳的胺基及羧基末端是鄰近功能域的邊界。在一實施例中，是對本發明抗體的一胺基酸殘基(例如纈胺酸)進行保留性置換(例如以白胺酸進行置換)。在其他實施例中，是以其他適合的胺基酸殘基來對本發明抗體的二個胺基酸殘基進行保留性置換；舉例來說，可以例示性之甲硫胺酸(M)及離胺酸(K)、離胺酸(K)及脯胺酸(P)、色胺酸(W)及異白胺酸(I)、異白胺酸(I)及脯胺酸(P)、天門冬醯胺(N)及纈胺酸(V)，以及麩醯胺酸(G)及離胺酸(K)等胺基酸對來置換纈胺酸(V)及精胺酸(R)。

「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其可接受本發明方法的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。

II. 發明說明

本揭示內容是關於一種高通量篩選法，其可用以確認一抗病毒之中和性抗體。該方法包含： (a)提供一噬菌體表現之scFv抗體庫，其包含複數個噬菌體表現的scFv，其中各噬菌體表現之scFv的重鏈變異域對蛋白A具有結合親和力，且各噬菌體表現之scFv的輕鏈變異域對蛋白L具有結合親和力； (b)使步驟(a)之噬菌體表現之scFv抗體庫曝露於一源自該病毒的病毒抗原； (c)於一酸性環境中，由步驟(b)之噬菌體表現之scFv抗體庫篩選出複數個噬菌體，其會表現與該病毒抗體具有結合親和力的scFv； (d)分別使步驟(c)篩選出之該複數個噬菌體表現複數個可溶形式之scFv； (e)使步驟(d)之該複數個可溶形式的scFv曝露於該病毒； (f)分別決定步驟(e)之該複數個可溶形式之scFv的中和效力；以及 (g)基於步驟(f)決定的結果，篩選一可溶形式之scFv作為該中和性抗體，其相對於該複數個可溶形式scFv中其他可溶形式之scFv具有較佳的中和效力。

一般來說，本發明方法可用以篩選一對一病毒具有專一性的中和性抗體，其中該病毒係利用胞飲作用(endocytosis)進入細胞。例示性之病毒包含流感病毒 (例如，A型流感病毒(IAV))、麻疹病毒、冠狀病毒、腮腺炎病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、德國麻疹病毒、鼻病毒、小兒麻痺病毒、肝炎病毒(例如，A型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV) 、B型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)及C型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)) 、天花病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、嚴重急性呼吸綜合症病毒、反轉錄病毒(例如，慢病毒)、輪狀病毒、腺病毒、腺相關病毒及阿爾法病毒。依據本揭示內容某些實施方式，該病毒是IAV，其可為H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7或H7N9病毒株。在一操作實施例中，該病毒是H1N1。

在步驟(a)中，先提供一由噬菌體所表現的scFv抗體庫。依據本揭示內容之實施方式，該由噬菌體所表現之scFv抗體庫的骨架為人類IGKV1-NL1*01/IGHV3-23*04生殖細胞系序列，並以特定引子利用PCR反應來多樣化其互補性決定區域(complementarity determining region，CDR，包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)。以蛋白A及蛋白L篩選後，可製得由噬菌體所表現之scFv抗體庫(以下稱為「GH2抗體庫」，包含如本揭示內容實施例所述之GH2-5、GH2-6、GH2-7、GH2-8、GH2-9、GH2-10、GH2-11、GH2-12、GH2-13、GH2-14、GH2-16、GH2-18、GH2-20、GH2-22及GH2-24抗體庫)，其中各噬菌體表現之scFv具有一可與蛋白A結合的VH域，以及一可與蛋白L結合的VL域。可依據PCT申請案(申請號：PCT/US2016/19128)及Ing-Chien Chen等人所發表的公開文獻(High throughput discovery of influenza virus neutralizing antibodies from phage-displayed synthetic antibody libraries, Scientific Reports 7, Article number: 14455 (2017))所述之方法來建構該由噬菌體所表現之scFv抗體庫。該申請案及文獻在此一併納入本揭示內容，以供參照。

在步驟(b)中，將GH2抗體庫曝露於一源自該病毒的病毒抗原。舉例來說，當病毒為HBV時，則該病毒抗原可以是HBV的表面抗原(surface antigen of HBV, HBsAg)。或者是，當病毒為冠狀病毒時，則病毒抗原可以是棘蛋白(spike protein, S protein)或膜蛋白(envelope protein, E protein)。依據本揭示內容某些實施方式，病毒為IAV，而病毒抗原則為血球凝集素或神經胺酸酶。依據一實施方式，是將病毒抗原血球凝集素固定於一基質(例如瓊脂糖樹脂或聚丙烯醯胺)上，之後再與本發明GH2抗體庫混合。

在步驟(c)中，係由GH2抗體庫篩選出複數個噬菌體，其會分別表現對病毒抗原具有結合親和力之scFv。具體來說，對步驟(b)的產物投予一模擬病毒進入細胞之環境的酸處理(舉例來說，一具有pH值介於2-7的洗滌緩衝液，例如pH2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7的緩衝液；較佳地，一pH值為5.0的緩衝液)。該酸處理可確保在膜融合過程(其發生於病毒膜與宿主細胞之胞內體膜(endosomal membrane)之間)中，篩選出的scFv可與病毒結合，進而阻斷病毒進入宿主細胞。經酸處理後，接著以沖提緩衝液(例如，pH 2.2的甘胺酸溶液)處理會表現對病毒抗體具有結合親和力之scFv的噬菌體，藉以破壞病毒抗原與噬菌體表現之scFv之間的結合。據此，收集複數個會表現對病毒抗原具有專一性之scFv的噬菌體。

接著，在步驟(d)中，使步驟(c)篩選出的複數個噬菌體表現/製備複數個可溶形式之scFv。可利用習知方法來進行此步驟。依據本揭示內容某些實施方式，VH及VL域的表現是由一乳糖操縱組(lactose operon, lac operon)所趨動；如本所屬領域具有通常知識者所熟知，添加異丙基-硫代β-D-半乳糖苷(isopropyl-thio-β-D-galactoside, IPTG)可引發乳糖操縱組表現，進而趨動下游基因(即，編碼VH及VL域的基因)表現。產生的scFv因此會分泌至培養液之上清液中，習知技藝人士可由此收集該些scFv。

在步驟(e)中，分別將步驟(d)製備之可溶形式scFv與病毒混合，以形成病毒-scFv複合體。

之後，在步驟(f)中，決定各可溶形式之scFv的中和效力。具體來說，分別將步驟(e)形成的病毒-scFv複合體加入可容許病毒複製的細胞(virus-permissive cell；例如，供IAV感染的MDCK細胞)中，培養一段時間(例如，24小時)。接著，利用任何習知方法來檢測該可容許病毒複製的細胞中病毒的活性(例如，病毒的表現或複製)；舉例來說，連結酶免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。一般來說，中和效力是與病毒活性成反比；換言之，當中和效力愈高時，則病毒的活性愈低。

或者是，可藉由分析經病毒-scFv複合體處理之可容許病毒複製之細胞的存活率來決定中和效力。當可理解，適用於本發明之分析方法並不侷限於此。

最後，在步驟(g)中，基於步驟(f)決定的中和效力來篩選中和性抗體。更具體來說，在複數個可溶形式scFv中，挑選相較於其他可溶形式之scFv，最具中和效力的可溶形式scFv作為中和性抗體。

本揭示內容之高通量篩選法的優點在於可降低製備對病毒專一之抗體時的勞動力及耗時流程。因此，可大幅改善研發及最佳化中和性抗體的效率。

經篩選之中和性抗體可用以製備一重組抗體，在結構上，該重組抗體包含一VL域、一CL域、一VH域及一CH域。利用中和性抗體來製備重組抗體的方法包含： (a)提供一會表現該中和性抗體的噬菌體； (b)萃取一噬質體DNA，其對應於步驟(a)之噬菌體； (c)以步驟(b)之噬質體DNA作為模版，利用聚合酶連鎖反應分別擴增一用以編碼一VL域的第一核酸序列，以及一用以編碼一VH域的第二核酸序列； (d)將該第一及第二核酸序列插入一表現載體中，其係包含一第三及一第四核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白之CL域，且該第四核酸序列係用以編碼該免疫球蛋白之CH域；以及 (e)將步驟(d)之該包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞，以製備該重組抗體。

在本揭示內容之方法中，係利用會表現抗病毒之中和性抗體的噬菌體作為起始材料，以製備重組抗體(即，步驟(a))。

之後，如步驟(b)所述，萃取對應於該會表現抗體之噬菌體的噬質體DNA。依據目的之不同，可分解該噬菌體以萃取其噬質體；或者是，由一細菌株(即，包含噬質體之細菌株)來製備噬質體。可利用任何習知DNA萃取技術由噬菌體或細菌株萃取噬菌體DNA；舉例來說，酚/氯仿萃取法，以及清潔劑(例如，十二烷基硫酸鈉、Tween-20、NP-40及Triton X-100)/醋酸萃取法。

在步驟(c)中，以萃取出之噬質體DNA作為模版，利用特定引子(正向引子 : CGTGTCGCATCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATCGGGA，序列編號：57；反向引子：GACCGATGGGCCCTTGGTGCTAGCCGAGCTCACGGTAACAAGGGTGCC，序列編號：58)進行PCR反應，據以擴增用以編碼CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的第一核酸序列，以及利用特定引子(正向引子：CAGGTGCACGATGTGATGGTACCGATATTCAAATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGC，序列編號：59；反向引子：TGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTGCC，序列編號：60)進行PCR反應，據以擴增用以編碼CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的第二核酸序列。

在步驟(d)中，將擴增的第一及第二核酸序列分別插入一表現載體中，其包含一第三及一第四核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白之CH域，而該第四核酸序列則係用以編碼該免疫球蛋白之CL域。當可想見，該免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在本揭示內容一較佳實施方式中，該免疫球蛋白是IgG。具體來說，第一及第二核酸序列是藉由一連接子來相互連接，其中該連接子是以pIgG載體作為模版，以PCR擴增而得。依據本揭示內容某些實施方式，該連接子依序包含以下序列：CL域、一牛生長激素之多腺苷酸化訊息片段(bovine growth hormone polyadenylation signal, BGA-polyA signal)、一人類細胞巨大病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子及一IgG重鏈的訊息胜肽(signal peptide)。基於第二核酸序列之3’端與連接子之5’端的互補序列，以及連接子之3’端與第一核酸序列之5’端的互補序列，可藉由交疊延伸聚合酶連鎖反應(overlap extension polymerase chain reaction, OE-PCR)來依序組合第二核酸序列、連接子及第一核酸序列。接著利用限制酶將重組產物插入表現載體pIgG中。結構上，建構後之表現載體依序包含：第一人類CMV啟動子、IgG輕鏈之訊息胜肽、第二核酸序列、CL域、第一BGH-polyA訊息片段、第二人類CMV啟動子、IgG重鏈之訊息胜肽、第一核酸序列、CH域及第二BGH-polyA訊息片段，其中是利用第一人類CMV啟動子來趨動第二核酸序列及CL域，以表現重組抗體的輕鏈，且利用第二人類CMV啟動子來趨動第一核酸序列及CH域，以表現重組抗體的重鏈。

在步驟(e)中，將步驟(d)建構的表現載體轉染至宿主細胞中，據以製備本發明重組抗體。常用的宿主細胞為哺乳動物細胞，例如HEK293細胞。可利用習知技藝人士熟知的方法進行轉染，包含化學方法(例如磷酸鈣、微脂體(liposome)及陽離子聚合物(cationic polymer))、非化學方法(例如電穿孔法、細胞擠壓法(cell squeezing)、聲孔法(sonoporation)、光轉染(optical transfection)、原生質體融合(protoplast fusion)及流體動力傳遞(hydrodynamic delivery))、顆粒法(例如基因槍(gene gun)、磁轉染(magnetofection)及穿刺轉染(impalefection))，以及病毒法(例如腺病毒載體(adenoviral vector)、辛得比斯病毒載體(sindbis viral vector)、及慢病毒載體(lentiviral vector))。製得的重組抗體會分泌到培養液之上清液中，習知技藝人士可利用任何熟知的方法由上清液中純化重組抗體；舉例來說，可利用與蛋白A或蛋白G的結合親和力來進行純化。

依據本揭示內容某些實施方式，本發明中和性抗體或重組抗體之VL域的胺基酸序列至少85% (例如，85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相似於序列編號：1-28之任一序列；且本發明中和性抗體或重組抗體之VH域的胺基酸序列至少85% (例如，85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相似於序列編號：29-56之任一序列。依據本揭示內容一操作實施例，本發明中和性抗體或重組抗體之VL域的胺基酸序列100%相似於序列編號：1-28之任一序列；且本發明中和性抗體或重組抗體之VH域的胺基酸序列100%相似於序列編號：29-56之任一序列。當可理解，可對VL及VH域的序列(例如，骨架序列)進行變異處理(例如，以保留性(conserved)或非保留性(non- conserved)胺基酸取代)，而不影響本發明抗體的結合親和力及/或專一性。較佳地，以一或多具有相似特性的胺基酸對VL及VH域的序列進行保留性取代；舉例來說，以異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸或色胺酸(一非極性胺基酸殘基)來取代白胺酸(另一非極性胺基酸殘基)；以麩胺酸(一酸性胺基酸殘基)來取代天門冬胺酸(另一酸性胺基酸殘基)；或是以精胺酸或組胺酸(一鹼性胺基酸殘基)來取代離胺酸(另一鹼性胺基酸殘基)。

本揭示內容亦提供本發明中和性抗體或重組抗體於製備用以治療或預防病毒感染之藥物或藥學組合物的用途。該藥物或藥學組合物包含一有效量之本發明中和性抗體或重組抗體，以及非必要地，一藥學上可接受的載體。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以治療或預防一有需要之個體之病毒感染的方法；該方法包含對該個體投予一有效量之本發明中和性抗體、重組抗體、藥物或藥學組合物。

可接受本發明方法治療之個體為一哺乳動物；舉例來說，一小鼠、大鼠、豬、猴子、兔子、狗及貓。較佳地，該個體為一人類。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例

材料及方法

細胞株

將MDCK (Madin-Darby犬腎臟，ATCC CCL-34)上皮細胞培養於包含非必需胺基酸(NEAA, non-essential amino acid)、2 mM L-麩醯胺酸及10%胎牛血清的MEM培養液中，置於37°C之5% CO₂ 潮溼培養箱中；利用MDCK細胞來分析微中和能力及IC₅₀ 。將293T細胞(ATCC CRL-3216)培養於包含10%胎牛血清及青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin, 100X)的DMEM培養液中。將懸浮HEK293細胞培養於無血清之293表現培養液中，置於37°C之以110 rpm轉速搖晃的8% CO₂ 培養箱中。

病毒

由台灣CDC 購買H1N1 CA/09 A型流感病毒(一種重組病毒NYMC X-181)。利用胚胎蛋(10天大)來擴增病毒原液。將H1N1 CA/09 A型流感病毒(1000 TCID₅₀ )注入尿囊腔以擴增病毒。培養60小時後，收集病毒液，以超高速離心(25000 xg ， 2小時)進行濃縮後，重新懸浮於PBS中。

TCID₅₀

利用MDCK細胞來分析H1N1 CA/09流感病毒效價的TCID₅₀ (50%組織培養感染劑量, tissue culture infectious dose)。簡單來說，以感染緩衝液(包含0.3% BSA的MEM/NEAA培養液) 10倍連續稀釋病毒。以稀釋病毒液感染經PBS洗滌之MDCK細胞(於96孔洞盤，每孔洞3×10⁴ 細胞)，反應1小時；再以PBS洗滌2次，以移除病毒液。感染3天後，利用冰甲醇-丙酮(1:1 (v/v))固定存活的MDCK細胞，並以0.5%結晶紫進行染色。各稀釋皆重複8次實驗，計算TCID₅₀ 。

表現及純化 HA 三聚體

基於H3編號，將對應於源自A/California/07/2009 (H1N1; 登錄號ACP41953.1)、A/Vietnam/1203/2004 (H5N1; 登錄號AY651334)、A/Wisconsin/67/2005 (H3N2; 登錄號AFH00648.1)及A/Anhui/1-BALF_RG17/2013 (H7N9, 登錄號AHZ59831.1)之H1N1 CA/09、H5N1 VN/04、H3N2 WN/05及H7N9 AH/13 血球凝集素(HA)之胞外域殘基11-329 (HA1)及1-176 (HA2)的cDNA進行密碼子最佳化處理，以利於真核細胞中表現，並藉由PCR與一N-端gp67訊號胜肽(MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFA，序列編號：61)、一C-端凝血酶切割位置、三聚體域及6-His-標記(ASLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH，序列編號：62)融合。將該些HA表現基因組插入pFastBac-1 (一種桿狀病毒轉移載體)中。以重組桿狀病毒(MOI=5)感染懸浮SF9細胞(每毫升3×10⁶ 細胞)(ATCC CRL-1711)，於27°C以110 rpm轉速搖晃培養72小時，以製備HA蛋白。利用二輪離心(1000 xg及12000 xg，各30分鐘，4°C)收集培養液。以0.8微米之過濾器過濾包含HA的上清液，之後進行純化。利用Ni²⁺ 共價鍵結管柱，以溶於TS溶液(Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0)之10 mM到500 mM濃度梯度的咪唑來純化HA。將包含HA之分液注入管柱色層分析，並以溶於Tris-HCl 20 mM (pH 8.0)之50 mM到1000 mM的梯度NaCl進行沖提。濃縮包含HA的分液，並以TS溶液進行粒徑篩除層析。收集包含HA的分液，並將其保存於4°C或-80°C。為產生結晶化，以凝血酶(每毫克HA投予0.2單位的凝血酶，於4°C反應至隔日)切割HA，以移除三聚體域及6-His-標記。直接以TS溶液進行粒徑篩除層析來純化經切割的材料。將純化的單體HA與1.5莫耳比的S40 Fab混合，於4°C輕微搖晃至隔日。藉由TS溶液進行粒徑篩除層析來純化HA-Fab複合體，據以移除過量的Fab。

建立噬菌體表現之 scFv 抗體庫

本研究建立15種由噬菌體表現的scFv抗體庫。該些由噬菌體表現之scFv抗體庫的骨架為人類IGKV1-NL1*01/IGHV3-23*04生殖細胞系序列，其中依PCT申請案(案號PCT/US2016/19128)及Ing-Chien Chen等人所發表的公開文獻(High throughput discovery of influenza virus中和性抗體from phage-displayed synthetic antibody libraries,Scientific Reports 7, Article number: 14455 (2017))所述之方法，使CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列產生多樣性變異。

將製得之噬菌體表現抗體庫分別命名為GH2-5、GH2-6、GH2-7、GH2-8、GH2-9、GH2-10、GH2-11、GH2-12、GH2-13、GH2-14、GH2-16、GH2-18、GH2-20、GH2-22及GH2-24抗體庫，其中各抗體庫的複雜度(complexity)皆超過10⁹ 。

由噬菌體表現之 scFv 抗體庫挑選及篩選抗 -HA 單株抗體

(1) 噬菌體表現篩選及擴增循環

將重組H1N1 CA/09 HA (每孔洞10微克)塗佈於96孔洞免疫盤後，以溶於PBST (包含0.05% (v/v) Tween 20的1×PBS，pH 7.4)之5%脫脂牛奶阻斷1小時。之後，將100微升之經聚乙二醇/NaCl沉澱處理的噬菌體抗體庫(於阻斷緩衝液中，每毫升10¹³ cfu)加入各孔洞中，輕微搖晃反應1小時。接著以PBST及PBS洗滌免疫盤三輪。具體來說，在以酸性洗滌相進行生物篩選時，是(1)以200微升PBST (pH7.4)洗滌免疫盤12次後，以200微升PBS (pH7.4)洗滌免疫盤2次，作為第一輪生物篩選；(2)以200微升PBST (pH5.0)洗滌免疫盤12次後，以200微升PBS (pH7.4)洗滌免疫盤2次，作為第二輪生物篩選；以及(3)以200微升 PBST (pH5.0)洗滌免疫盤12次後，以200微升PBS (pH7.4)洗滌免疫盤2次，作為第三輪生物篩選。在對照組(即，以中性洗滌相進行生物篩選)部分，則是(1)以200微升PBST (pH7.4)洗滌免疫盤12次後，以200微升PBS (pH7.4)洗滌免疫盤2次，作為第一輪生物篩選；(2)以200微升PBST (pH7.4)洗滌免疫盤12次後，以200微升PBS (pH7.4)洗滌免疫盤2次，作為第二輪生物篩選；以及(3)以200微升PBST (pH7.4)洗滌免疫盤12次後，以200微升PBS (pH7.4)洗滌免疫盤2次，作為第三輪生物篩選。

洗滌後，以100微升之0.1 M HCl/甘胺酸(pH 2.2)沖提結合的噬菌體，並立即以8微升之2 M Tris-鹼緩衝液(pH 9.1)進行中和。將沖提出的噬菌體與1毫升大腸桿菌(E. coli ，A_{600 nm} = 0.6)混合，並於37°C反應30分鐘；加入胺苄青黴素(ampicillin)清除未經感染的細菌。以胺苄青黴素處理30分鐘後，以100微升M13KO7輔助噬菌體(總量約為10¹¹ CFU)感染細菌，於37°C反應1小時，之後加入50毫升之包含康黴素(kanamycin，每毫升50微克)及胺苄青黴素(每毫升100微克)的2X YT培養液，於37°C劇烈搖晃反應至隔日。以20%聚乙二醇/NaCl沉澱噬菌體抗體庫後，將其懸浮於PBS中。以濃縮的噬菌體溶液進行下一輪的篩選。

(2) 噬菌體抗體庫效價的輸出 / 輸入比值

在各生物篩選流程中，利用新鮮製備的大腸桿菌來分析輸出(沖提)及輸入噬菌體的效價，並計算輸出/輸入的效價比值。

(3) 利用 ELISA 來評估於大腸桿菌培養液中多株可溶形式 scFv 與抗原的結合

將50微升之由上述各輪生物篩選出的噬菌體與750微升之大腸桿菌(A_{600 nm} = 0.6)混合，於37°C劇烈搖晃。一小時後，加入100微升胺苄青黴素，使其最終濃度為每毫升100微克之胺苄青黴素。待A_{600 nm} ＞ 1.0後，加入100微升之10 mM IPTG (最終濃度為1 mM)，於37°C劇烈搖晃至隔日。以3000 xg的轉速離心10分鐘，取上清液進行ELISA結合試驗。

(4) 以 ELISA 試驗分析可溶形式 scFv- 抗原結合

經2-3輸之篩選-擴增循環後，挑選單一菌株，並製備分泌於大腸桿菌培養液的可溶形式單株scFv。將每孔洞0.5微克的CA/09 H1 HA 塗佈於96孔洞免疫盤中，以溶於PBST之5%脫脂牛奶阻斷1小時。加入100微升之包含經分泌之scFv的培養液進行結合。1小時後，以PBST洗滌免疫盤6次，再加入100微升之抗E-標記-HRP (1:4000稀釋)。反應1小時後，以PBST緩衝液洗滌免疫盤6次，以3,3’,5,5’-四甲基-聯苯胺過氧化酶受質(3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidine peroxidase substrate, TMB substrate)反應3分鐘，利用1.0 M HCl中止反應後，讀取波長為450奈米時的分光光度值。

(5) 利用蛋白 L/ 蛋白 A 進行 ELISA 試驗以分析可溶形式 scFv 的折疊

除了測試經分泌之scFv的抗原結合性外，亦確認經折疊之scFv與蛋白L及蛋白A的結合。以蛋白L (每孔洞0.1微克)塗佈96孔洞免疫盤後，以上述流程阻斷，並加入scFv培養液。利用與蛋白A鍵結之山葵過氧化酶(1:5000稀釋)來偵測訊號。

微中和試驗

將MDCK細胞(每孔洞3×10⁴ 細胞)種植於96孔洞盤，培養16小時後，以PBS洗滌二次，之後以病毒-scFv混合液進行感染。將經過濾之scFv溶液與100 TCID₅₀ 病毒液(1:1 (v/v))混合後，於37°C培養1小時。以病毒-scFv混合液感染經PBS洗滌之MDCK細胞，於37°C反應1小時。移除病毒-scFv混合液，再以PBS洗滌細胞二次。將經感染的MDCK細胞培養於感染緩衝液24小時，再與甲醇-丙酮(1:1 (v/v))混合。固定後，將溶於PBS之0.5% TRITON X-100加入MDCK細胞反應5分鐘，之後加入阻斷緩衝液作用1小時。利用小鼠抗-A型流感病毒核蛋白IgG抗體(1:2000稀釋)、山羊抗-小鼠抗體-HRP (1:1000稀釋)及TMB過氧化酶受質來偵測病毒核蛋白的表現量。重複檢測各經過濾之scFv二次，每試驗皆為二次獨立實驗。利用ELISA讀值來計算相對病毒活性；分別將僅有病毒之正對照組的ELISA讀值，以及負對照組(無病毒且無scFv)的ELISA讀值設定為100%及0%。利用加入scFv所減少之病毒感染量來計算中和百分比。

決定 IC₅₀

利用MDCK細胞來決定經純化之IgG候選抗體的半最大抑制濃度(IC₅₀ )。簡單來說，將2倍連續稀釋的IgG與100 TCID₅₀ 病毒液混合，於37°C培養1小時。於37°C以病毒IgG溶液感染經PBS洗滌之細胞1小時。經甲醇-丙酮(1:1 (v/v))固定後，以溶於PBS之0.5% TRITON X-100處理MDCK細胞，再加入阻斷緩衝液。藉由小鼠抗-A型流感病毒核蛋白IgG抗體(1:2000稀釋)及與HRP鍵結之山羊抗-小鼠抗體(1:1000稀釋)來偵測擴增的病毒。加入TMB受質(每孔洞100微升)，接著以1N HCl (每孔洞100微升)中止反應後，讀取波長為450奈米時的吸光值。三次重複測試各稀釋IgG的濃度。依據Stewart及Watson方法來計算IC₅₀ (奈克/毫升)。

由 scFv 製備及表現 IgG

將scFv噬質體的VL及VH基因轉殖至IgG表現質體pIgG (美國專利號5736137)，藉以表現分泌型人類IgG。以Nhe I及Kpn I限制酶線性化pIgG載體。以PCR分別擴增VL及VH基因後，重組為一1.8Kb片段，並轉殖至線性化之pIgG載體。以pIgG表現載體轉染293-F細胞，以蛋白A瓊脂糖純化培養液中分泌IgG。以相同方法表現及純化正對照組IgG：F10、 FI6v3、C05及CR8020。

抗體 - 抗原結合之 EC₅₀

利用ELISA分析IgG抗體對經固定之重組HA蛋白的效價，以決定IgG的EC₅₀ 。將H1N1 CA/09、H3N2 WN/05、H5N1 VN/04及H7N9 AH/13 HA四種HA抗原分別溶於PBS緩衝液(pH7.4)後，塗佈於96孔洞免疫盤(每孔洞0.5微克)，之後以溶於PBST之5%脫脂牛奶阻斷1小時。同時，以包含5%牛奶之PBST二倍連續稀釋抗體，以得到11種不同濃度的抗體。阻斷後，加入100微升之經稀釋的抗體檢體，輕微搖晃反應1小時。以300微升之PBST洗滌6次後，加入100微升之1:2000稀釋的山葵過氧化酶/抗-人類IgG抗體共軛物(溶於包含5%牛奶的PBST)反應1小時。以PBST緩衝液洗滌6次後，以PBS洗滌2次，之後加入TMB受質反應3分鐘，並以1.0 M HCl中止反應，讀取波長為450奈米時的分光光度值。計算EC₅₀ 及S形曲線擬合相關係數。將介於背景值範圍(OD_450nm =0.04-0.05)之ELISA讀值為每毫升10微克的IgG設定為未結合(non-binding, NB)。

以流感偽病毒進行微中和試驗

共轉染可編碼螢光素酶之慢病毒核質體(pHR’CMV-Luc)、可編碼HIV Gag-Pol之質體pCMV-R8.2，以及可分別編碼TMPRSS2、H1 A/California/04/2009 (登錄號ACP41953.1)、H3 A/Wisconsin/67/2005 (登錄號AFH00648.1)、H7 A/Anhui/1-BALF_RG17/2013 (登錄號AHZ59831.1)之質體，及對應神經胺酸酶之質體(pHR’CMV-Luc、pCMV-R8.2，使用表現TMPRSS2、H1 A/California/04/2009及N1 A/California/04/2009的質體)，以製備H1N1 CA/09、H3N2 WN/05或H7N9 AH/13偽病毒。共轉染質體pLN4_3.Luc.R-E-、可編碼H5 A/Vietnam/1203/2004 (登錄號AY651334)及N1的質體，以製備H5N1偽病毒。轉染至隔日後，補入新鮮培養液，再培養48小時。之後，收集上清液，以0.45微米的過濾器過濾後，保存於-80°C以待後續使用。將連續稀釋的抗體與100 TCID₅₀ 偽病毒反應45分鐘，再感染1×10⁴ 293T細胞，以進行偽病毒的微中和分析試驗。於感染後16-18小時，補入新鮮培養液。感染60小時後，以分解緩衝液分解細胞，作用15分鐘。加入螢光素酶試劑。將細胞分解物轉移至96孔洞之白色微盤中，以分析螢光素酶的活性。分別將僅有病毒之正對照組的螢光素酶訊號，以及負對照組(無病毒且無scFv)的螢光素酶訊號設定為100%及0%。利用scFv中和所減少的病毒感染來計算中和百分比。重複分析各濃度之經稀釋的IgG。依據Stewart及Watson方法來計算IC₅₀ (奈克/毫升)。

以流式細胞試驗來分析抗體與穩定表現 HA 之轉染株的結合

將H1 A/California/07/2009 (登錄號ACP41953.1)及 H5 A/Vietnam/1203/2004 (登錄號AY651334)轉殖至pLAS2.PeGFP.Puro，其會表現綠色螢光蛋白GFP及抗嘌黴素(puromycin)基因。以聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)將全長A型流感pLAS2.H1 A/California/07/2009.PeGFP.Puro及pLAS2.H5 A/Vietnam/1203/2004.PeGFP.Puro轉染至293T細胞，以製備會穩定表垷HA的轉染株。轉染48小時後，以每毫升2微克的抗嘌黴素篩選轉染株，以得到混合之穩定轉染株。為分析抗體與天然HA蛋白的結合力，於4°C以連續稀釋的IgG染色293T H1及H5穩定轉染株30分鐘。之後，以FACS緩衝液(1× PBS + 0.05% FBS)洗滌細胞一次，再以與Alexa-Fluor 633鍵結之山羊抗-人類IgG二級抗體進行染色。將細胞培養於4°C 30分鐘。以FACS緩衝液洗滌二次後，利用流式細胞儀分析GFP⁺ 細胞的APC螢光訊號值。以與同型負對照抗體共同培養的細胞作為負對照組。利用軟體分析10,000個GFP⁺ 細胞的平均螢光強度(mean fluorescence intensity, MFI)。最大MFI為連續濃度之IgG染色的最高MFI。以軟體計算EC₅₀ 。將獨立試驗中，低於Do1負對照IgG 2.5倍的MFI，定義為無結合(NB)。

抗體 -HA 結合的競爭試驗

為分析篩選之抗-HA scFv的結合表位，利用一系列經純化之抗-HA IgG進行噬菌體ELISA，以偵測scFv與重組HA結合的競爭反應。新鮮製備待測試的噬菌體。將溶於PBS緩衝液(pH7.4)之H1N1 CA/09 HA抗原(每孔洞0.5微克)塗佈於 96孔洞免疫盤，於4°C放置至隔日。以溶於PBST之5%脫脂牛奶阻斷1小時後，加入1-3微克之經純化的抗-HA IgG，輕微搖晃反應30分鐘；之後加入50微升之待測噬菌體，培養1小時。以300微升之PBST洗滌6次後，加入山葵過氧化酶/抗-M13抗體共軛物(1:3000稀釋)反應1小時。以PBST緩衝液洗滌6次後，以PBS洗滌2次，加入TMB受質作用5分鐘，並以1.0 M HCl中止反應，之後讀取波長為450奈米時的分光光度值。比對未加入抗-HA IgG之各對照檢體以計算競爭值。

表現及純化 S40 Fab

以PEI進行轉染，利用哺乳動物細胞(293-F細胞)表現S40，其為一具有6-His-標記的Fab。Fab表現載體係源自IgG表現質體pIgG (美國專利號5736137)，其不包含重鏈之CH2及CH3域，而於與CL域形成雙硫鍵之重鏈CH1域的C端具有一6-His-標記。將輕鏈變異域次轉殖至pIgG質體的Kpn I位置，而將重鏈變異域次轉殖至pIgG質體的Nhe I位置。以293-F表現S40 Fab。將293-F細胞培養於293表現培養液中，細胞最終濃度為每毫升1-1.5×10⁶ 個細胞，置於37°C (8% CO₂ , 110 rpm)培養2-4小時。利用PEI將S40 Fab構建體轉染至293-F細胞。轉染7-9天後(或直到細胞存活率低於60%)，由上清液收集S40 Fab。利用Ni²⁺ 共價鍵結管柱，以溶於TS溶液(Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0)之10 mM到500 mM濃度梯度的咪唑來純化S40 Fab。濃縮包含S40 Fab的分液，並以TS溶液進行粒徑篩除層析。藉由波長為280奈米時之吸光度來檢測純化S40 Fab的濃度，並以還原及非還原SDS-PAGE來分析純度及完整性。收集包含S40 Fab的分液，並將其保存於4°C或-80°C。

收集結晶及資料

於293°K 利用坐滴蒸氣擴散法(sitting-drop vapor-diffusion method)混合1微升蛋白溶液及1微升沉澱溶液(reservoir solution)，以形成HA1/S40-Fab複合晶體。可於由8% (w/v) PEG 6000、1N NaOH、15% MPD及0.1 M Na HEPES所組成之沉澱溶液(pH 7.5)得到晶體。將所有晶體快速冷卻，並於記錄低溫繞射圖譜。利用MX-225 CCD 偵測器，收集日本SPring-8同步加速器之光束線BL44XU於0.90 Å波長時HA/S40-Fab複合晶體的繞射資料。處理繞射資料，使其解晰度達到3.35 Å。

確認結構及精化處理

以IgG1域片段(PDB條目3W9D及3HC4)及HA1片段(PDB條目3GBN)作為檢索模式，利用CCP4套組之MOLREP 以分子取代來決定HA1/S40-Fab複合晶體的結構。HA/S40-Fab複合晶體屬於空間群C2，於非對稱單位具有二個HA1/S40-Fab複合體。在精化處理過程中，隨機挑選5%的數據作為R _free 值的交叉驗證。藉由程式Coot 進行模式的手動修改。以REFMAC5精化複合體結構，藉以得到分別為23.0及27.5%的R _work 及R _free 值。表1總結收集的資料及最終的模式統計。表1 S40-HA複合體結構的結晶參數 ^a 括號中的數值為對應最高解晰結構的數值。^b 以PROCHECK驗證立體化學模式。

實施例 1 以噬菌體表現之合成抗體庫作為高通量平台，篩選抗 -IAV 之單株 scFv

高通量研發抗-IAV中和性抗體的關鍵取決於抗體庫的序列。由M13噬菌體表現之scFv抗體庫來研發抗體為最成功之高通量篩選方法之一。為充分利用噬菌體表現方法的優勢，本發明製備15種由噬菌體表現的合成scFv抗體庫，其中各scFv變異體皆可穩定折疊，且具有用以編碼對蛋白辨識具有高度傾向之胺基酸殘基的CDR序列。在建構抗體庫時，已先以蛋白A及蛋白L結合能力預先篩選經折疊的scFv變異體，以確保於噬菌體表現系統外，該些scFv分子作為融合蛋白或表現為可溶形式時的折疊能力。藉由該些於抗體庫建構流程中設定的預篩選條件可製得高功能性之合成scFv抗體庫，經由數輪生物篩選後，高通量篩選出可溶形式之scFv變異體；多數合成scFv變異體於 96孔洞深盤以大腸桿菌培養隔夜後，能以可溶形式之scFv分子存在，且其表現量超過每毫升1微克(或33 nM)，適用於多種高通量功能性試驗。相較於由傳統噬菌體表現之scFv抗體庫(由天然抗體基因群所建構)所篩選的scFv分子，通常無法表現為足夠濃度之可溶形式，功能性合成之scFv的穩定表現可使高通量篩選流程有效與用以篩選抗IAV感染之中和性抗體的高通量微中和試驗相容。

利用不同pH值的洗滌條件，以三輪生物篩選由15種噬菌體表現之scFv抗體庫篩選出抗-IAV抗體。在生物篩選的結合相中，是於相對中至弱鹼性pH值(例如pH=7.4)的環境使噬菌體表現之scFv結合至經固定之2009流行性IAV病毒株H1N1 CA/09的HA 三聚體；在由抗原表面移除未結合之噬菌體顆粒時，則是先以中性pH值的洗滌相進行第一輪生物篩選，而後以pH5的洗滌相進行第二輪及第三輪的生物篩選。pH條件模擬在晚期胞內體中，與宿主受器結合之IAV進行內吞作用時，環境由中性到微酸性的改變，其中曝露於酸性環境造成HA 三聚體的構型改變會促使IAV膜與宿主細胞膜融合，進而感染宿主細胞；因此，作為融合抑制劑，可中和IAV感染之scFv需可存活於酸性洗滌相中。在對照組實驗中，則是以中性結合及洗滌相(pH7.4)對scFv抗體庫之GH2-13進行三輪生物篩選，藉以比對在生物篩選流程中酸性洗滌相的功效。在二到三輪之生物篩選後，二種生物篩選流程皆可有效製備與HA結合的scFv (第1A到1D圖)；該生物篩選結果指出，15種scFv抗體庫皆包含可與HA三聚體結合的scFv變異體，其表現於大腸桿菌培養液中的可溶形式scFv分子可結合至表面固定之HA 三聚體。

以高通量方法篩選可折疊為分泌型之可溶性scFv、可結合至經固定之HA 三聚體，以及於微中和試驗中可中和IAV感染的單株scFv。利用大腸桿菌於96孔洞深孔盤中表現單株scFv，經隔夜培養後，可直接以培養上清液進行高通量試驗，而無需進一步純化。由合成之GH2-5~24 scFv抗體庫所製備的單一骨架scFv變異體的獨特性在於，該scFv分子於溶液中可同時與蛋白A及蛋白L結合，因此可以固定的蛋白L及與受器結合的蛋白A進行ELISA實驗，以確定完整折疊的scFv分子。僅挑選完整折疊的scFv (超過90%之篩選株)進行HA結合及IAV中和試驗。ELISA數據指出，酸性洗滌相(pH5.0)及中性洗滌相(pH7.4)可分別由15種scFv抗體庫中篩選出超過5,000單株scFv (包含表2列示之抗體P01至P58)及超過100單株scFv (包含表2列示之抗體S01至S51)，其中篩選出之各單株scFv皆對H1N1 CA/09 HA 三聚體具有結合親和力(結果未顯示)。相較於對照組實驗，酸性洗滌相僅會些微改善經篩選之scFv的IAV中和潛力(結果未顯示)。由二組scFv變異體中，挑選28株序列未重疊且具有IAV中和潛力的scFv，使其以IgG1形式表現。表2總結了該些IgG的VL及VH序列。表2 源自合成抗體庫之抗-流感IgG的VL及VH序列 *抗體P01到P58係以酸性洗滌相(pH5.0)篩選而得，抗體S01到S51則是以中性洗滌相(pH7.4)篩選而得。

測量28株IgG之抗原(HA 三聚體)結合親和力(50%最大有效濃度-EC₅₀ )及IAV中和能力(50%最大抑制濃度-IC₅₀ )後，確認可中和IAV之IgG的抗原結合親和力接近源自生物體免疫系統之親和力成熟抗-IAV抗體的上限(表3)。基於是以病毒株H1N1 CA/09之HA 三聚體來篩選IgG，該些IgG的EC₅₀ 亦達到已知抗體(F10及FI6v3)對H1N1 CA/09 HA 三聚體的結合上限(表3)。部分IgG會與第1群次亞型IAV H5N1 VN/04的HA 三聚體交叉結合，惟結合親和力較低(表3)。相較之下， 28株IgG皆不會與第2群次亞型H3N2 WN/05的HA 三聚體產生交叉結合(表3)，僅有三株IgG會交叉結合至第2群次亞型H7N9 AH/13的HA 三聚體(表3)。表3 評估源自合成抗體庫之抗-流感IgG的中和及結合潛力

為了解由ELISA觀察之EC₅₀ 的生物相關性，利用流式細胞儀測量於細胞表面會過量表現HA 三聚體之293T細胞中，IgG與HA三聚體結合的MFI，進而由MFI分析其EC₅₀ (表3)。定性分析後，所有與ELISA表面固定H1N1 CA/09 HA 三聚體結合的IgG皆會結合至表現H1N1 CA/09 HA 三聚體的293T細胞表面(表3)，意指將HA 三聚體固定於體態ELISA表面並不會大幅改變HA 三聚體的生物相關結構。如預期地，該些IgG亦會交叉結合至會表現H5N1 VN/05 HA 三聚體的細胞表面，惟具有顯著較低之抗體-HA親和力(表3)。此外，該些IgG皆不會交叉結合至會表現H3N2 WN/05 HA 三聚體的細胞表面。H7N9 AH/13 HA 三聚體無法表現於293T細胞表面，因此表3之ELISA測量無法於細胞結合試驗中確認IgG與H7N9 AH/13 HA 三聚體的交叉結合。然而，利用偽病毒進行的微中和試驗結果指出，該些具有交叉結合潛力的IgG無法中和H7N9 AH/13 IAV感染(表3)。

利用偽病毒進行的微中和試驗結果亦指出，約有四分之一之會與H1N1 CA/09 HA 三聚體結合的IgG可中和偽病毒感染，其IC₅₀ 可以微中和試驗進行偵測(表3)，且部分會交叉結合至H5N1 VN/04 HA 三聚體的IgG亦為抗-H5N1 VN/04偽病毒的中和性抗體(表3)。由結合試驗可預期，該些IgG對第2群偽病毒不具有中和效力(表3)。

為分析以偽病毒進行之微中和試驗的生物相關性，決定該些IgG對IAV病毒株H1N1 CA/09的IC₅₀ ，並比對二種微中和試驗所測得的IC₅₀ 。僅有部分由偽病毒中和試驗確認的中和性IgG可中和真正的病毒感染，其IC₅₀ 可以微中和試驗進行檢測(表3)；意指相較於以真正病毒進行的微中和試驗，偽病毒微中和試驗具有較高的敏感度。整體來說，僅有以酸性洗滌相製備的IgG為中和性抗體，代表於噬菌體表現篩選流程中，酸性洗滌條件可增加研發中和性抗體的機率。

實施例 2 源自合成抗體庫之抗 -IAV 中和性抗體對 HA 三聚體的莖部抗原表位具有結合親和力

重組IgG的中和機制是與抗原表位相關。表3所示之28株重組抗-HA IgG的競爭分析指出，該些與H1N1 CA/09 HA 三聚體結合的抗原表位可分為三群(表3)。源自酸性洗滌相之IgG的抗原表位分群與源自中性洗滌相之IgG的抗原表位分群極度相似(表3)；意指生物篩選流程及CDR-H3序列長度與胺基酸組成不會影響合成抗體庫之抗-HA抗體的抗原表位分群。除了本發明28種重組抗-HA IgG，唯有第I群抗原表位IgG為抗-IAV中和性抗體；基於偽病毒中和試驗，具有第II群及第III群抗原表位的IgG皆非中和性抗體(表3)。有鑑於正對照中和性抗體F10及FI6v3皆屬於第I群抗原表位，且會以次奈莫耳(sub-nanomolar)等級的親和力結合至HA三聚體的莖部區域，推測第I群IgG亦可高親和力地結合至HA三聚體的莖部區域；已知多種抗-IAV之中和性抗體會標的至HA三聚體的莖部抗原表位。

第III群抗原表位之抗體會結合至非屬預融合HA三聚體結構的抗原表位。基於以真正病毒進行之中和試驗結果，第III群IgG S40對IAV H1N1 CA/09具有弱中和潛力(表3)，因此選擇該群抗體作為具有Fab-HA複合體結構晶體研究的抗原表位圖譜。Fab(S40)-HA(H1N1 CA/09)複合體結構具有3.28 Å的解晰度(表1)，代表S40 Fab會結合至HA1頭部域的內表面，其會形成三聚體內表面的部分結構，且非屬預融合HA三聚體結構中的抗體抗原表位(結果未顯示)。如ELISA及MFI測試結果(表3)所示，S40 IgG對H1N1 CA/09 HA三聚體具有高結合親和力，意指HA三聚體上S40 IgG的抗原表位會出現於固定或於細胞表面表現之HA三聚體。此外，S40 IgG對IAV H1N1 CA/09的弱中和潛力(表3)亦顯示，HA三聚體之抗原表位會曝露出來(至少暫時性)，以與S40抗體結合，藉以中和IAV H1N1 CA/09感染。

總結上述，以抗-IAV中和性重組抗體進行被動免疫治療是一種減輕流行性及大規模爆發IAV感染的可行策略。當感染大規模爆發時，往往於造成顯著死亡率、發病率及經濟損失前，即需快速研發候選重組抗體(特別是當無適當之具有中和潛力的親和成熟人類抗體時)，因此用以高通量研發抗-IAV中和性重組抗體的技術平台十分重要。高通量篩選功能性中和性抗體需要製備上千株、濃度至少足以進行功能性試驗的單株抗體；如本揭示內容之實施例所示，由噬菌體表現之合成scFv抗體庫具有scFv表現品質控制，符合高通量篩選抗-IAV中和性重組抗體的要求。一旦獲得流行性IAV病毒株的重組HA三聚體及偽病毒，可於一個月內以高通量流程製備用以進行被動免疫治療的中和性IgG候選抗體。在持續改良設計及建構包含不同功能性抗體片段之合成scFv抗體庫時，本發明平台提供了一種用以減輕IAV大規模流行所造成之威脅的可行策略；本發明亦提供一種用以研發進行被動免疫治療之候選重組抗體，以治療其他新興的病毒感染。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A到1D圖分別闡述以H1N1 CA/09之經固定的HA 三聚體來生物篩選合成抗體庫，其中是以pH5.0 (第1A及1B圖)或pH7.4 (第1C及1D圖)的洗滌相(washing phase)來進行生物篩選。第1A及1C圖：篩選15種可與HA結合之GH2 噬菌體表現的scFv抗體庫。Y軸為各輪生物篩選 (x軸)中噬菌體抗體庫的輸入/輸出效價比值。第1B及1D圖：以輸出噬菌體抗體庫分泌至大腸桿菌培養液之多株可溶形式scFv來測試15種噬菌體表現之scFv抗體庫於各輪生物篩選 (x軸)中，與HA 三聚體於ELISA試驗的結合(y軸)。重複各實驗二次。詳細實驗步驟可見於材料及方法。

無

序列表

<110> 中央研究院

<120> 中和性抗體的高通量篩選方法、由該方法製備之中和性抗體，以及其用途

<130> P3061-TW

<150> US62574884
<151> 2017-10-20

<160> 72

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P01_VL

<400> 1
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Ser Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105

<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P03_VL

<400> 2
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Trp Gly Tyr
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P04_VL

<400> 3
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列

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<223> 合成-P05_VL

<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列

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<223> 合成-P06_VL

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<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P10_VL

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<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P11_VL

<400> 7
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<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P12_VL

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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P14_VL

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<213> 人工序列

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<223> 合成-P25_VL

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<210> 11
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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P26_VL

<400> 11
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Trp Ser Gly
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<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P28_VL

<400> 12
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<223> 合成-P37_VH

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Ala Gly Ile Trp Pro Tyr Trp Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe His Gly Ser Ser Tyr Tyr Ser Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 42
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P38_VH

<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asp Gly
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Phe Ile Gly Asp Tyr Ser Ser Tyr His Gly Val Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P44_VH

<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Gly Trp
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Trp Pro Phe Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115

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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P47_VH

<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Asn Ser
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P48_VH

<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120

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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-P58_VH

<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<213> 人工序列

<220>
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<400> 47
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
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<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Gly Gly
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Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asn Phe Gly Phe Trp Asn His Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S07_VH

<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Ser
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Gly Pro Ser Trp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Phe Gly Ile Gly Asp Ile Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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115 120

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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S10_VH

<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Gly Pro Ser Trp Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S11_VH

<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Asn Gly
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Trp Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S29_VH

<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S40_VH

<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Asp Phe
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Trp Pro Phe Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120

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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S45_VH

<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Gly Pro Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S48_VH

<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Ile Gly Asp Gly
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-S51_VH

<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Asp Trp
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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<210> 57
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> CDR-H_F引子

<400> 57
cgtgtcgcat ctgaagtgca gctggtggaa tcggga 36

<210> 58
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> CDR-H_R引子

<400> 58
gaccgatggg cccttggtgc tagccgagct cacggtaaca agggtgcc 48

<210> 59
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> CDR-L_F引子

<400> 59
caggtgcacg atgtgatggt accgatattc aaatgaccca gagcccgagc agcctgagc 59

<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列

<220>
<223> CDR-L_R引子

<400> 60
tgcagccacc gtacgtttga tttccacctt ggtgcc 36

<210> 61
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-signal peptide

<400> 61
Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr
1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala
35

<210> 62
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成-thrombin cutting site

<400> 62
Ala Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val
20 25 30
Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His His His His His
35 40 45

<210> 63
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_F10-VL

<400> 63
Ile Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg
1 5 10 15
Gln Thr Ala Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asn Ser Asn Asn Val Gly Asn
20 25 30
Gln Gly Ala Ala Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ser Tyr Arg Asn Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Thr

<210> 64
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_F10-VH

<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ser Ser Glu Val Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Pro Met Phe Gly Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ile Cys Ser Gly Gly Thr Cys Val Phe Asp
100 105 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ser
115 120 125

<210> 65
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_FI6V3-VL

<400> 65
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Thr Phe Asn
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Arg Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110

<210> 66
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_FI6V3-VH

<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Ala Asn Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser

<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_C05-VL

<400> 67
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Gly Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105

<210> 68
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_C05-VH

<400> 68
Pro Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Ser Ser Phe Gly Glu Ser
20 25 30
Thr Leu Ser Tyr Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Leu Glu Trp Leu Ser Ile Ile Asn Ala Gly Gly Gly Asp Ile Asp
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Glu Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr
85 90 95
Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Met Ser Met Gln Gln Val Val Ser
100 105 110
Ala Gly Trp Glu Arg Ala Asp Leu Val Gly Asp Ala Phe Asp Val Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135

<210> 69
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_CR8020-VL

<400> 69
Gln Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Ile
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
65 70 75 80
Glu Pro Ala Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser
85 90 95
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110

<210> 70
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_CR8020-VH

<400> 70
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Thr Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Met Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Pro Leu Phe Tyr Ser Ser Trp Ser Leu Asp Asn Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 71
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_Do1-VL

<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Trp Gly Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Phe Ser Arg Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Gly Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105

<210> 72
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列

<220>
<223> 合成_Do1-VH

<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asp Asn Gly
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Gly Pro Tyr Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Ser Phe Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims

一種用以高通量篩選一對一病毒具有專一性之中和性抗體的方法，包含： (a)提供一噬菌體表現之單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)抗體庫，其包含複數個噬菌體表現的scFv，其中各噬菌體表現之scFv的重鏈變異域(heavy chain variable domain, VH domain)對蛋白A具有結合親和力，且各噬菌體表現之scFv的輕鏈變異域(light chain variable domain, VL domain)對蛋白L具有結合親和力； (b)使步驟(a)之噬菌體表現之scFv抗體庫曝露於一源自該病毒的病毒抗原； (c)於一酸性環境中，由步驟(b)之噬菌體表現之scFv抗體庫篩選複數個噬菌體，其會表現與該病毒抗體具有結合親和力的scFv； (d)分別使步驟(c)篩選之該複數個噬菌體表現複數個可溶形式之scFv； (e)使步驟(d)之該複數個可溶形式的scFv曝露於該病毒； (f)分別決定步驟(e)之該複數個可溶形式之scFv的中和效力；以及 (g)基於步驟(f)決定的結果，篩選一可溶形式之scFv作為該中和性抗體，其相對於該複數個可溶形式scFv中其他可溶形式之scFv具有較佳的中和效力。
如請求項1所述之方法，其中該病毒可以是流感病毒、麻疹病毒、冠狀病毒、腮腺炎病毒、馬堡病毒、伊波拉病毒、德國麻疹病毒、鼻病毒、小兒麻痺病毒、肝炎病毒、天花病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、嚴重急性呼吸綜合症病毒、反轉錄病毒、輪狀病毒、腺病毒、腺相關病毒或阿爾法病毒。
如請求項2所述之方法，其中該病毒是該流感病毒。
如請求項3所述之方法，其中該病毒抗原是血球凝集素或神經胺酸酶。
如請求項3所述之方法，其中步驟(c)是以一pH值介於5.0-7.0的緩衝液來處理步驟(b)的產物。
如請求項5所述之方法，其中該緩衝液的pH值為5.0。
一種中和性抗體，包含：一VL域，其胺基酸序列至少85%相似於序列編號：1-28之任一序列；以及一VH域，其胺基酸序列至少85%相似於序列編號：29-56之任一序列。
如請求項7所述之中和性抗體，其中該VL域具有序列編號：1-28之任一胺基酸序列；以及該VH域具有序列編號：29-56之任一胺基酸序列。
如請求項7所述之中和性抗體，其中以請求項1所述之方法來製備該抗體。
一種用以製備一重組抗體之方法，包含： (a)以請求項1所述之方法篩選一中和性抗體； (b)萃取一噬質體DNA，其對應於該會表現步驟(a)之中和性抗體的噬菌體； (c) 以步驟(b)之噬質體DNA作為模版，利用聚合酶連鎖反應分別擴增一用以編碼一VL域的第一核酸序列，以及一用以編碼一VH域的第二核酸序列； (d) 將該第一及第二核酸序列插入一表現載體中，其係包含一第三及一第四核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一免疫球蛋白之輕鏈恒定域(light chain constant domain, CL domain)，且該第四核酸序列係用以編碼該免疫球蛋白之重鏈恒定域(heavy chain constant domain, CH domain)；以及 (e)將步驟(d)之該包含該第一、第二、第三及第四核酸序列的表現載體轉染至一宿主細胞，以製備該重組抗體。
如請求項10所述之方法，其中該第一核酸序列是位於該第三核酸序列的上游，且該第二核酸序列是位於該第四核酸序列的上游。
如請求項10所述之方法，其中該免疫球蛋白是免疫球蛋白G。
如請求項10所述之方法，其中該宿主細胞是一哺乳動物細胞。
一種重組抗體，包含一VL域、一CL域、一VH域，以及一CH域, 其中該VL域的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：1-28之任一序列；且該VH域的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：29-56之任一序列。
如請求項14所述之重組抗體，其中該VL域具有序列編號：1-28之任一胺基酸序列；以及該VH域具有序列編號：29-56之任一胺基酸序列。
如請求項14所述之重組抗體，其中以請求項9所述之方法來製備該重組抗體。
一種如請求項7所述之中和性抗體或請求項14所述之重組抗體於製備一藥物的用途，其中該藥物可用以治療或預防一個體的病毒感染。
如請求項17所述之用途，其中該病毒是流感病毒。
如請求項17所述之用途，其中該個體是一人類。