JP2022535523A - Ｐａｎ－ノイラミニダーゼ阻害抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、インフルエンザノイラミニダーゼに対する抗体、その抗体を含有する組成物、およびその抗体を使用する方法に関する。

Description

連邦政府が後援する研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与されたＨＨＳＮ２７２２０１４００００８ＣおよびＡＩ１４１９９０の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに対して選択的である抗体または抗原結合フラグメントに関する。注目すべきことに、この抗体または抗原結合フラグメントは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルスの両方のノイラミニダーゼに対して選択的である。本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントを使用してインフルエンザを処置する医薬組成物および方法も提供される。
季節性インフルエンザウイルス感染は、世界中で毎年顕著な罹患率および死亡率をもたらす。さらに、パンデミックは不規則な間隔で発生し、数百万の生命を奪い得る。現在の季節性インフルエンザワクチンは、狭い株特異的免疫応答を誘導し、それらが循環株とどの程度よく適合するかによってその有効性が変動し得る（１）。加えてこれらのワクチンは、新たなパンデミックウイルスを防御しない。したがって、広く防御的またはユニバーサルなインフルエンザウイルスワクチンを開発することが緊急に必要とされている（２）。現在のワクチンは、ウイルスの主要な表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ：ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）に対する抗体応答を誘導するように設計されている（３）。ＨＡに対する抗体、その球状ヘッドドメインに対して特異的な抗体は、ウイルスがそのシアル酸受容体に結合することを遮断できるが、こうした活性はしばしばそのワクチン株に限定されて幅を欠く。ＨＡストークに対する抗体は、インフルエンザＡグループ１および２内およびそれらにわたってはるかに大きな幅を有することが示されており、稀にはインフルエンザＢウイルスにも及ぶ（４～７）。
ウイルスの第２の主要な表面糖タンパク質はノイラミニダーゼ（ＮＡ：ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）であり、これは、Ｎ結合グリカンから末端シアル酸を切断する受容体破壊酵素である（８）。この活性は、粘膜表面上の天然防御タンパク質のグリカンによって捕捉された流入ウイルスを放出するため、および感染細胞から出芽した新生ウイルスを放出するために重要である。抗ＮＡ抗体は、ＮＡの酵素部位に直接結合することによって、またはＮＡとその基質との間の相互作用を立体的に妨害することによって、この活性を遮断することができる（９、１０）。抗ＮＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＮＡワクチン接種は、動物モデルにおいてインフルエンザウイルスの致死的チャレンジに対する防御を行うことが示されている（９～１５）。さらに、モルモットにおけるＮＡワクチン接種はウイルス伝播を防止することができる（１６）。最も重要なことに、抗ＮＡ抗体力価は、野外研究およびヒトチャレンジ研究において、感染からの防御と独立的に相関することが示されている（１７～１９）。ヒトインフルエンザウイルスは、免疫圧力、ポリメラーゼのエラー率、およびその球状ヘッドドメインの高い可塑性のために、ＨＡ中の優性抗原部位を高比率で突然変異させ得る（２０）。一方、ＮＡは、ＨＡと一致しないより遅いドリフトを示すことが示されている（２１、２２）。したがって、ＮＡに対する抗体応答は、典型的にはより広い交差反応性を示すが、この幅は、それぞれのサブタイプ（インフルエンザＡウイルスについてはＮ１～Ｎ９）に限定されると想定されている（８）。
インフルエンザに対するより効果的な抗ウイルス療法が緊急に必要とされている。
本発明は、ａ）配列番号１、２、３、７、１０、１３、１４、４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ｂ）配列番号４、５、６、８、９、１１、１２、１５、１６、４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；あるいは（ｃ）それらの組み合わせを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
加えて本発明は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ａ）配列番号１もしくは１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２もしくは７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３、１０、もしくは１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、もしくはそれらのいずれかの組み合わせを含む免疫グロブリン重鎖可変領域；（ｂ）配列番号４、８、１１、もしくは１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５もしくは９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、配列番号６、１２、もしくは１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、もしくはそれらのいずれかの組み合わせを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；または（ｃ）それらの組み合わせを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
加えて、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに結合する抗体または抗原結合フラグメントが提供され、この抗体または抗原結合フラグメントは配列番号４０、４２、または４４の少なくとも約７０％を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
さらに、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに結合する抗体または抗原結合フラグメントが提供され、この抗体または抗原結合フラグメントは配列番号４１、４３、または４５の少なくとも約７０％を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
加えて、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントのいずれかと構造的に類似している抗体または抗原結合フラグメントが提供される。
加えて、インフルエンザウイルスのＮ１ノイラミニダーゼに対する特異的親和性を有する抗体または抗原結合フラグメントが提供され、この抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４６の少なくとも約７０％を含み、かつ配列番号４６のアミノ酸番号付けに従うＲ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１３４、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｒ１５６、Ｗ１７８、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６から選択される少なくとも１つの残基を含有するＮ１ノイラミニダーゼの活性部位残基に結合する。
さらに、本明細書において提供される任意の抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域および／または免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。加えて、その核酸を含む発現ベクター、その発現ベクターを含む宿主細胞、ならびに本明細書における抗体および抗原結合フラグメントを産生する方法が提供される。
加えて、（ａ）本明細書に記載される抗体もしくは任意の抗原結合フラグメント、および／または（ｂ）ポリペプチドもしくはそのポリペプチドをコードする核酸を含むインフルエンザワクチンが提供され、このポリペプチドは、本明細書に記載される任意の抗体または抗原結合フラグメントによって標的とされるエピトープに対する少なくとも約７０％の同一性を含むアミノ酸配列を含む。
加えて、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が開示される。
加えて、必要とする対象においてインフルエンザを予防または処置する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載される任意の抗体もしくは抗原結合フラグメント、本明細書における抗体もしくは抗原結合フラグメントの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む任意の核酸、本明細書に記載される任意の発現ベクター、本明細書に記載される任意のワクチン、または本明細書に開示される抗体の少なくとも１つを含む任意の組成物を対象に投与することを含む。
その他の目的および特徴は、以下で部分的に明らかになり、かつ部分的に指摘されることとなる。
インフルエンザＡおよびＢウイルスＮＡの系統樹を示す図である。３つのｍＡｂの反応性の幅が示されている。スケールバーは、アミノ酸の６％の変化を表す。ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａにおけるアミノ酸配列を使用してツリーを構築し、ＦｉｇＴｒｅｅにおいて可視化した。 推定される非変異共通祖先（ＵＣＡ：ｕｎｍｕｔａｔｅｄ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｃｅｓｔｏｒ）に対する各ｍＡｂのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ＥＬＩＳＡにおける組み換えタンパク質への抗体結合のヒートマップを示す図である。最小結合濃度が示されている。 ＥＬＬＡ ＮＩアッセイにおける抗体活性のヒートマップを示す図である。ＩＣ５０が示されている。 Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対するＥＬＬＡアッセイ（大基質、立体障害感受性）におけるＮＡの代表的な阻害曲線を示す図である。 ＮＡスターアッセイ（小基質、立体障害非感受性）におけるＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対する同じｍＡｂの活性を示す図である。 Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対するＥＬＬＡアッセイにおけるｍＡｂ １Ｇ０１のＦａｂの活性を示す図である。 ３つのｍＡｂの生殖系列（ＧＬ：ｇｅｒｍｌｉｎｅ）バージョンもＨ３Ｎ２株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対して活性であることを示す図である。 ３つのｍＡｂがＨ３Ｎ２株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４に対するマイクロ中和アッセイにおいて活性であることを示す図である。 ３つのｍＡｂのＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ活性を示す図である。Ｈ３Ｎ２に対する既知のＡＤＣＣレポーター活性を有するＭＡｂ ＣＲ９１１４を陽性対照として使用した。 ３．４５Å分解能でのＨｕｎａｎ Ｎ９ ＮＡを伴う１Ｇ０４の結晶構造を示す図である。左上：ＮＡ四量体の各プロトマーに結合した１つのＦａｂを有するＮＡ四量体。左下：１つのＦａｂを有するＮＡプロトマー。右上：ＮＡ上のエピトープ。右下：ＮＡ上のＦａｂパラトープ。左パネルについては、１つのＮＡ－Ｆａｂプロトマーを、ＮＡを薄灰色で、Ｆａｂ軽鎖（Ｌ鎖）を薄灰色で、Ｆａｂ重鎖（Ｈ鎖）を濃灰色で着色している。右パネルのＮＡおよびＦａｂは、それぞれ濃灰色および薄灰色である。Ｎ結合グリカンは、灰色の炭素原子によるスティック表示で示されている。カルシウムイオンは黒色の球として示されている。エピトープを示す分子表面は黒色／濃灰色で着色されている。 ２．４５Å分解能でのＪａｐａｎ５７ Ｎ２ ＮＡを伴う１Ｅ０１の結晶構造を示す図である。左上：ＮＡ四量体の各プロトマーに結合した１つのＦａｂを有するＮＡ四量体。左下：１つのＦａｂを有するＮＡプロトマー。右上：ＮＡ上のエピトープ。右下：ＮＡ上のＦａｂパラトープ。左パネルについては、１つのＮＡ－Ｆａｂプロトマーを、ＮＡを薄灰色で、Ｆａｂ軽鎖（Ｌ鎖）を薄灰色で、Ｆａｂ重鎖（Ｈ鎖）を濃灰色で着色している。右パネルのＮＡおよびＦａｂは、それぞれ濃灰色および薄灰色である。Ｎ結合グリカンは、灰色の炭素原子によるスティック表示で示されている。カルシウムイオンは黒色の球として示されている。エピトープを示す分子表面は黒色／濃灰色で着色されている。 ３．２７Å分解能でのＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡを伴う１Ｇ０１の結晶構造を示す図である。左上：ＮＡ四量体の各プロトマーに結合した１つのＦａｂを有するＮＡ四量体。左下：１つのＦａｂを有するＮＡプロトマー。右上：ＮＡ上のエピトープ。右下：ＮＡ上のＦａｂパラトープ。左パネルについては、１つのＮＡ－Ｆａｂプロトマーを、ＮＡを薄灰色で、Ｆａｂ軽鎖（Ｌ鎖）を薄灰色で、Ｆａｂ重鎖（Ｈ鎖）を濃灰色で着色している。右パネルのＮＡおよびＦａｂは、それぞれ濃灰色および薄灰色である。Ｎ結合グリカンは、灰色の炭素原子によるスティック表示で示されている。カルシウムイオンは黒色の球として示されている。エピトープを示す分子表面は黒色／濃灰色で着色されている。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 感染後３日目および６日目に（図４Ａについて記載したとおりに）ｍＡｂで予防的に処置した動物の肺力価を示す図である。グループ当たり３匹のマウスを使用した。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ３）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ６）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ７）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ９）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ１ノイラミニダーゼ（Ｎ１）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ１ノイラミニダーゼ（Ｎ１）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ１ノイラミニダーゼ（Ｎ４）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ１ノイラミニダーゼ（Ｎ５）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ１ノイラミニダーゼ（Ｎ８）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を、鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで腹腔内処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 インフルエンザＢウイルスノイラミニダーゼを発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで処置した。鼻腔内ウイルスチャレンジの２時間前の腹腔内で、体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントがそれぞれの図の凡例に示されている。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を感染の４８時間後に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 グループ２ノイラミニダーゼ（Ｎ２）を発現するウイルスによるチャレンジに対するマウスモデルにおける３つのｍＡｂの有効性を示す図である。動物を感染の７２時間後に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで処置した。グループ当たり５匹の動物を使用した。体重減少パーセントが示されており、生存率パーセントが図の凡例に示されている。 ＩｇＧ抗体の一般的構造を示す図である。 小基質ＮＡ－スターアッセイにおける（Ａ）ｐＨ１Ｎ１ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５に対するｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の阻害効果を示す図である。阻害曲線が示されており、点線はＮＡ活性の５０％阻害を表す。無関係のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。 小基質ＮＡ－スターアッセイにおけるＨ５Ｎ１ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に対するｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の阻害効果を示す図である。阻害曲線が示されており、点線はＮＡ活性の５０％阻害を表す。無関係のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。 小基質ＮＡ－スターアッセイにおけるＨ７Ｎ９ Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３に対するｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の阻害効果を示す図である。阻害曲線が示されており、点線はＮＡ活性の５０％阻害を表す。無関係のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。 小基質ＮＡ－スターアッセイにおけるＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４に対するｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の阻害効果を示す図である。阻害曲線が示されており、点線はＮＡ活性の５０％阻害を表す。無関係のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。 阻害曲線として示されるｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１による野生型ウイルス（Ｅ１１９）の阻害パーセントを示す図である。 オセルタミビル耐性Ｈ３Ｎ２ウイルス（Ｅ１１９Ｖ）の阻害を示す図である。技術的重複を行った。 Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／１９８２ウイルスに対するｍＡｂの最小中和濃度を示す図である。無関係のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。抗体は、技術的重複において実行された。 Ｈ９Ｎ２ Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／１９９７ウイルスに対するｍＡｂの最小中和濃度を示す図である。無関係のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。抗体は、技術的重複において実行された。 Ｈ７Ｎ２ Ａ／ｆｅｌｉｎｅ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１６－０４００８２－１／２０１６ウイルスに対するｍＡｂの最小中和濃度を示す図である。無関係のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。抗体は、技術的重複において実行された。 ｐＨ１Ｎ１ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ウイルスを試験するＡＤＣＣアッセイにおいて測定された１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の曲線下面積値を示す図である。ヒトｍＡｂ ＣＲ９１１４を陽性対照として使用し、無関係のヒトＩｇＧ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。全てのｍＡｂを技術的重複において実行した。 Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５ウイルスを試験するＡＤＣＣアッセイにおいて測定された１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の曲線下面積値を示す図である。ヒトｍＡｂ ＣＲ９１１４を陽性対照として使用し、無関係のヒトＩｇＧ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。全てのｍＡｂを技術的重複において実行した。 Ｈ７Ｎ９ Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３ウイルスを試験するＡＤＣＣアッセイにおいて測定された１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の曲線下面積値を示す図である。ヒトｍＡｂ ＣＲ９１１４を陽性対照として使用し、無関係のヒトＩｇＧ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。全てのｍＡｂを技術的重複において実行した。 Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウイルスを試験するＡＤＣＣアッセイにおいて測定された１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の曲線下面積値を示す図である。ヒトｍＡｂ ＣＲ９１１４を陽性対照として使用し、無関係のヒトＩｇＧ ｍＡｂを陰性対照抗体として使用した。全てのｍＡｂを技術的重複において実行した。 ３．４５Å分解能での結晶構造からの１Ｇ０４Ｆａｂ ＣＤＲとＨｕｎａｎ Ｎ９ ＮＡとの相互作用を示す図である。１Ｇ０４軽鎖は薄灰色の炭素原子で示されており（ＣＤＲＬ１またはＣＤＲＬ２と標識された各パネルの左側）、重鎖は灰色の炭素原子で示されている（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２と標識された各パネルの左側、またはＣＤＲＨ３と標識されたパネルの中央）。ＮＡ側鎖は、濃灰色の炭素原子で示されている（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＨ２と標識されたパネルの右側、またはＣＤＲＨ３と標識されたパネルの周囲方向）。水素結合または塩橋は黒色の点線である。 ２．４５Å分解能での結晶構造からの１Ｅ０１ Ｆａｂ ＣＤＲとＪａｐａｎ５７ Ｎ２ ＮＡとの相互作用を示す図である。１Ｅ０１軽鎖は薄灰色の炭素原子で示されており（ＣＤＲＬ１またはＣＤＲＬ２と標識された各パネルの左側）、重鎖は灰色の炭素原子で示されている（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２と標識された各パネルの左側、またはＣＤＲＨ３と標識されたパネルの中央）。ＮＡ側鎖は、濃灰色の炭素原子で示されている（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＨ２と標識されたパネルの右側、またはＣＤＲＨ３と標識されたパネルの周囲方向）。水素結合または塩橋は黒色の点線である。 ３．２７Å分解能での結晶構造からの１Ｇ０１ Ｆａｂ ＣＤＲとＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡとの相互作用を示す図である。１Ｇ０１軽鎖は薄灰色の炭素原子で示されており（ＣＤＲＬ１またはＣＤＲＬ２と標識された各パネルの左側）、重鎖は灰色の炭素原子で示されている（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２と標識された各パネルの左側、またはＣＤＲＨ３と標識されたパネルの中央）。ＮＡ側鎖は、濃灰色の炭素原子で示されている（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１、およびＣＤＲＨ２と標識されたパネルの右側、またはＣＤＲＨ３と標識されたパネルの周囲方向）。水素結合または塩橋は黒色の点線である。１Ｇ０１ Ｆａｂは、隣接するＮＡプロトマー由来の残基Ｗ４５６と相互作用するＦＲ Ｌ３由来のＹ６７を除き、１つのＮＡプロトマーを認識する。
本発明は、種々のインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに対して広範な特異性を示す新規の抗体および抗原結合フラグメントに関する。本明細書における抗体および抗原結合フラグメントは、有利なことに任意の公知のノイラミニダーゼに結合することができる（かつタイプによって限定されない）。様々な実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、ａ）配列番号１、２、３、７、１０、１３、１４、４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ｂ）配列番号４、５、６、８、９、１１、１２、１５、１６、４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；あるいは（ｃ）それらの組み合わせを含む。付加的な実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、配列番号１、２、３、７、１０、１３、および１４のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに／または配列番号４、５、６、８、９、１１、１２、１５、および１６のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。様々な実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、または４４の少なくとも約７０％を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。様々な実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、または４５の少なくとも約７０％を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。本発明の抗体の特定の軽鎖および重鎖は、本明細書においてより詳細に説明される。
定義
本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語は、インタクトな抗体、または改変、遺伝子操作、もしくは化学的にコンジュゲートされた抗原結合フラグメントを含む、抗体の任意の抗原結合フラグメントを意味する。改変または遺伝子操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、および多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）である。抗原結合フラグメントとしては、とりわけＦａｂ、Ｆ（ａｂ´）、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、（ポリ）ペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも１つのフラグメントを含有する（ポリ）ペプチドなど）が挙げられる。構造にかかわらず、抗原結合フラグメントは、インタクトな免疫グロブリンによって認識されるものと同じ抗原に結合する。抗原結合フラグメントは、結合分子のアミノ酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含み得る。上記のフラグメントは、合成によって生成されてもよいし、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって生成されてもよいし、それらは組み換えＤＮＡ技術によって遺伝子操作されてもよい。生成方法は当技術分野で周知であり、例えば「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｅ．ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびＤ，レーン（Ｌａｎｅ）編（１９８８）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），Ｎ．Ｙ．などに記載されている。
本明細書で使用される「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗原上で認識されるエピトープに対して形状および電荷分布が相補的である抗原結合部位に通常大部分寄与する抗体の可変領域内の配列を意味する。ＣＤＲ領域は、天然立体構造のタンパク質上に存在するか、または場合によっては例えばＳＤＳにおける可溶化などによって変性されたタンパク質上に存在するかのいずれかの、タンパク質またはタンパク質フラグメントの線状エピトープ、不連続エピトープ、または立体構造エピトープに対して特異的であり得る。加えて、エピトープはタンパク質の翻訳後修飾からなっていてもよい。
本明細書で使用される「インフルエンザＡウイルス」は、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の様々な組み合わせによって特徴付けられる異なる「サブタイプ」にさらに特徴付けることができるインフルエンザウイルスのタイプを指す。インフルエンザＡウイルスには、１８の異なるヘマグルチニンサブタイプおよび９の異なるノイラミニダーゼサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８およびＮ１～Ｎ９）が存在する。インフルエンザＡノイラミニダーゼは、サブタイプ（グループ１およびグループ２）にさらに分けられる。グループ１はＮ１、Ｎ４、Ｎ５、およびＮ８を含み、グループ２はＮ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、およびＮ９を含む。本発明によると、インフルエンザＡウイルスのサブタイプは、それらのＨ数によって例えば「Ｈ１またはＨ５サブタイプのＨＡを含むインフルエンザウイルス」、または「Ｈ１インフルエンザウイルス」、「Ｈ５インフルエンザウイルス」などと示されてもよいし、それらのＮ数を示すことによって例えば「Ｎ１またはＮ２サブタイプのＮＡを含むインフルエンザウイルス」などと示されてもよいし、Ｈ数とＮ数との組み合わせによって例えば「インフルエンザウイルスサブタイプ「Ｈ５Ｎ１またはＨ３Ｎ２」などと示されてもよい。インフルエンザウイルス「サブタイプ」という用語は、具体的には、通常は突然変異から生じ、異なる病原性プロファイルを示す、各サブタイプ内の全ての個々のインフルエンザウイルス「株」を含む。こうした株は、ウイルスサブタイプの種々の「単離株」とも呼ばれることがある。したがって、本明細書で使用される「株」および「単離株」という用語は、交換可能に使用されてもよい。ヒトインフルエンザウイルス株または単離株に対する現在の命名法は、最初の単離の地理的位置、株番号、および単離年を含み、通常は括弧内にＨＡおよびＮＡの抗原性の記載が与えられ、例えばＡ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）などとなる。非ヒト株は、命名法に起源の宿主も含む。
本明細書で使用される「インフルエンザＢウイルス」は、インフルエンザウイルスの第２のカテゴリー（タイプ）を指す。インフルエンザＡとは異なり、インフルエンザＢウイルスはサブタイプに分けられないが、系統および株に分解され得る（例、Ｂ／ＹａｍａｇａｔａおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）。しかし、インフルエンザＢウイルスは、本明細書においてそれぞれ「Ｂ型ヘマグルチニン」および「Ｂ型ノイラミニダーゼ」と分類されるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質を含有する。
本明細書で使用される「宿主」という用語は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターなどのベクターが導入された生物または細胞を指すことが意図される。生物または細胞は、原核または真核であり得る。好ましくは、宿主は単離された宿主細胞、例えば培養された宿主細胞などである。「宿主細胞」という用語は、その細胞が本発明の抗体の（過剰）発現のために改変されていることのみを意味し、これらの抗体を元々発現しているＢ細胞であって、不死化、増幅、発現の増強などによって結合分子を過剰発現するように改変されている細胞を含む。
アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、２つの配列を整列させたときに、参照配列と比較して候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基と同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして理解される。同一性パーセントを決定するために、配列を整列させ、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入する。同一性パーセントを決定するための配列アラインメント手順は、当業者に周知である。配列を整列させるために、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアがしばしば使用される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。配列を整列させるとき、所与の配列Ｂに対する所与の配列Ａの配列同一性パーセント（所与の配列Ｂに対する特定の配列同一性パーセントを有するかまたは含む所与の配列Ａと言い換えることができる）は、配列同一性パーセント＝（Ｘ／Ｙ）＊１００として算出でき、ここでＸは、配列アラインメントプログラムまたはアルゴリズムのＡおよびＢのアラインメントによって同一マッチとしてスコア付けされた残基の数であり、Ｙは、Ｂの残基の総数である。配列Ａの長さと配列Ｂの長さとが等しくないとき、ＡのＢに対する配列同一性パーセントは、ＢのＡに対する配列同一性パーセントと等しくならない。
「動作可能に連結された」という用語は、通常は物理的に連結され、互いに機能的関係にある２つ以上の核酸配列要素を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現を開始または調節することができるとき、プロモーターはコード配列に動作可能に連結されており、その場合、コード配列はプロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである。
「薬学的に許容される賦形剤」とは、好ましいかまたは好都合な剤形を調製するために、例えば薬物、薬剤、または抗体などの活性分子と組み合わされる任意の不活性物質を意味する。「薬学的に許容される賦形剤」は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、かつ薬物、薬剤、または結合分子を含む製剤の他の成分と適合性である賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤は広く適用されており、当技術分野で公知である。
抗体と、例えば抗原などのその結合パートナーとの相互作用に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、その相互作用が、結合パートナー上の例えば抗原決定基またはエピトープなどの特定の構造の存在に依存することを意味する。言い換えると、たとえ結合パートナーが他の分子または生物の混合物中に存在するときにも、抗体は結合パートナーに優先的に結合するか、またはそれを認識する。結合は、共有もしくは非共有相互作用または両方の組み合わせによって媒介されてもよい。さらに言い換えると、「特異的に結合する」という用語は、抗原決定基またはエピトープに免疫特異的に結合し、他の抗原決定基またはエピトープに免疫特異的に結合しないことを意味する。抗原に免疫特異的に結合する抗体は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、または当技術分野において公知の他のアッセイなどによって決定されるときに、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドに結合してもよい。抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、同じエピトープを保有する関連抗原と交差反応性であってもよい。好ましくは、抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、他の抗原と交差反応しない。
本発明の抗体に関連して本明細書で使用される「中和する」という用語は、中和が達成される機構、または中和活性を測定するために使用されるアッセイにかかわらず、インビトロおよび／またはインビボでインフルエンザウイルスの複製を阻害する抗体を指す。
「治療上の有効量」という用語は、インフルエンザＡウイルスによる感染から生じる状態を予防、改善、および／または処置するために有効な、本明細書で定義される抗体の量を指す。本明細書で使用される改善とは、インフルエンザ感染の目に見えるかもしくは知覚できる疾患症状、ウイルス血症、または任意のその他の測定可能な徴候の低減を指してもよい。
「処置」という用語は、疾患の進行を治癒または停止または少なくとも遅延させるための治療的処置および予防的または防止的方策を指す。処置を必要とする者には、インフルエンザウイルスによる感染から生じる状態を既に患っている者、およびインフルエンザウイルスによる感染を予防されるべき者が含まれる。インフルエンザウイルスによる感染から部分的にまたは完全に回復した対象も処置を必要とし得る。予防とは、インフルエンザウイルスの伝播を阻害もしくは低減すること、またはインフルエンザウイルスによる感染に関連する症状のうちの１つ以上の発症、発生、もしくは進行を阻害もしくは低減することを包含する。
「ベクター」という用語は、第２の核酸分子を宿主に導入してそこで複製および場合によっては発現させるために、第２の核酸分子を挿入することができる核酸分子を意味する。言い換えると、ベクターは、自身が連結された核酸分子を輸送することができる。本明細書で使用される「ベクター」という用語によって、クローニングベクターおよび発現ベクターが意図される。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、ならびにバクテリオファージまたは植物もしくは動物（ヒトを含む）ウイルスに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、提案される宿主によって認識される複製起点を含み、かつ発現ベクターの場合には、宿主によって認識されるプロモーターおよびその他の調節領域を含む。第２の核酸分子を含むベクターは、形質転換、トランスフェクション、またはウイルス侵入機構の利用によって、細胞に導入される。特定のベクターは、自身が導入された宿主中で自律複製することができる（例、細菌の複製起点を有するベクターは、細菌中で複製できる）。他のベクターは、宿主への導入時に宿主のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。
ポリペプチド（例、抗体またはその抗原結合フラグメント）に関する「構造的に類似する」という用語は、参照ポリペプチドと比較して１つ以上の保存的置換および／または化学修飾を有するが、参照ポリペプチドまたはタンパク質の全体的な二次、三次、および／または四次構造を保持するポリペプチドまたはタンパク質を指す。別のポリペプチドまたはタンパク質と「構造的に類似する」ポリペプチドまたはタンパク質は、参照タンパク質の結合標的に対して類似の結合親和性を有することが予期される。
一般的に、保存的置換は、必要な活性が保持される限り、任意の位置で行われ得る。置換されるアミノ酸が元のアミノ酸と類似の特性を有する、いわゆる保存的交換が行われてもよく、それは例えばＧｌｕのＡｓｐによる交換、ＧｌｎのＡｓｎによる交換、ＶａｌのＩｌｅによる交換、ＬｅｕのＩｌｅによる交換、およびＳｅｒのＴｈｒによる交換などである。例えば、類似の特性を有するアミノ酸は、脂肪族アミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）；ヒドロキシルもしくは硫黄／セレン含有アミノ酸（例、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン）；環状アミノ酸（例、プロリン）；芳香族アミノ酸（例、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；塩基性アミノ酸（例、ヒスチジン、リジン、アルギニン）；または酸性およびそれらのアミド（例、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）であり得る。欠失は、直接結合によるアミノ酸の置換である。欠失の位置には、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメイン間の結合部が含まれる。挿入は、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入であり、直接結合が形式的に１つ以上のアミノ酸によって置換される。アミノ酸配列は、例えば改善された活性または変更された調節などを有するポリペプチドを生成し得る当技術分野で公知のコンピュータシミュレーションプログラムの助けを借りて調節され得る。この人工的に生成されたポリペプチド配列に基づいて、こうした調節されたポリペプチドをコードする対応の核酸分子を、所望の宿主細胞の特異的コドン使用を用いてインビトロで合成できる。
ノイラミニダーゼ特異性および抗体特性
本発明は、インフルエンザＡおよびＢウイルスを阻害できる高活性ヘテロサブタイプ抗ＮＡ抗体の発見に基づくものである。過去の抗体特徴付けおよびワクチン接種の研究は、サブタイプ内の防御は非常に広範であり得るが、ＮＡに対する免疫はヘテロサブタイプではないことを示唆していた（通常異なるサブタイプにわたって結合する抗ＨＡストーク抗体と比較したとき）（９～１５）。保存された線状ペプチドに対してウサギにおいてヘテロサブタイプ抗ＮＡ ｍＡｂを生じさせる試みによって、低いＮＩ活性およびわずかな防御効果を有するｍＡｂがもたらされた（２８、２９）。いくらかの交差反応性結合を示すが、インビトロまたはインビボでいかなる抗ウイルス活性も有さない少数のヒト抗ＮＡ ｍＡｂが近年報告されている（１０）。これに対し、本明細書で報告される本発明のモノクローナル抗体は高活性であり、インビボで強力な防御を媒介する。
したがって、様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに選択的に結合することができる。本明細書に記載される抗体および抗原結合フラグメントは、インフルエンザ感染の治療的処置および予防的処置の両方のための重要な用途を有し得る。
急性感染に対処するための治療的使用
ノイラミニダーゼは検証された薬物標的であり、その活性を阻害するいくつかの小分子はインフルエンザ治療薬である。ここに報告される３つのｍＡｂと同様に、これらの小分子はＮＡの活性部位を標的とする。したがって、かつこれらのｍＡｂの広範な幅のために、それらはヒトにおける季節性、パンデミック、および人畜共通感染性のインフルエンザウイルス感染の処置のための抗ウイルス剤として使用され得る可能性がある。小分子は確かに利点を有するが、これらの薬物の治療ウィンドウは症状の発症後４８時間に制限される。マウスモデルにおいて、本発明者らのｍＡｂは、致死的インフルエンザウイルスチャレンジの７２時間後という遅さで投与されたときにも堅固な防御を示し、それらがより長い治療ウィンドウを有し得ることを示唆した。この効果の基礎は、それらの強力なＮＩ活性が、エフェクター機能およびおそらくは感染に対する免疫応答の調節と組み合わされたものであり得る（３０）。
予防的処置のためのワクチン
これらのｍＡｂが治療薬として役立つ可能性に加えて、それらは抗体誘導ワクチン設計にも有用であり得る。不活化および弱毒化生ワクチンを含む、現在認可されているインフルエンザウイルスワクチンは、抗ＮＡ免疫の誘導が不十分である（８）。しかし、組み換えＮＡベースのワクチンおよびＮＡウイルス様粒子は、致死的なマウスおよびフェレットチャレンジモデルにおける広範な防御が可能な高力価の抗ＮＡ抗体を誘導することが示されている（１３～１５）。さらに、組み換えＮＡベースのワクチンは、モルモットモデルにおいてインフルエンザウイルス伝播を阻害することが示されている（１６）。これらの研究においてはサブタイプ内の広範な防御が観察されたが、ヘテロサブタイプ免疫は、マウスモデルにおいて明確に試験されたにもかかわらず検出されなかった（１３）。しかし、異なるサブタイプを含む組み換えＮＡワクチンによる連続的なプライムブーストレジメンは、１Ｇ０１様抗体の誘導をもたらし得る。さらに、１Ｇ０１エピトープを表すスカフォールド／安定化された構築物も、同様のヘテロサブタイプ抗体を誘導できる可能性がある。これらのワクチンの開発に伴う１つの問題は、インフルエンザウイルスワクチンの動物モデルとして使用される多くの種が、報告された３つのｍＡｂの特徴である長いＣＤＲ Ｈ３領域を有する抗体を有さないことであり得る。したがって、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、これらのワクチンを試験するためのより良好なモデルであり得る。
要約すると、酵素活性部位に長いＣＤＲ Ｈ３を挿入し、通常シアル酸によって占有される空間を占有することによって、クローン的に関連し、かつインフルエンザウイルスＮＡに結合する３つのｍＡｂを合成した。３つのｍＡｂは全て広範な結合を示し、１Ｇ０１は全てのインフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプおよびインフルエンザＢウイルスＮＡを阻害し、そのことはこれらのｍＡｂを治療薬開発の有望な候補としている。これらの抗体は、インビトロではＮＡ活性の高活性の阻害剤であり、インビボでは死亡率および罹患率からの広範な防御を提供する。これらのｍＡｂの発見は、適切なワクチン接種レジメンが与えられれば集団において類似の抗体が誘導され得るという希望をもたらす。次いで、これらのｍＡｂの結合様式およびエピトープについての知識は、ＮＡベースのユニバーサルインフルエンザウイルスワクチンの開発を導き得る。
抗体構造およびその配列
ＩｇＧ抗体の一般的構造を図５に示している。簡潔には、２つの主要なサブユニット、すなわちジスルフィド結合を介して接続された重鎖および軽鎖が存在する。各重鎖および軽鎖は、可変領域または定常領域にさらに分けられる。可変領域は、抗原と最も直接的に相互作用し、かつ３つの超可変領域（相補性決定ドメイン、ＣＤＲ）をさらに含む。よって、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む単一の抗体は、合計１２のＣＤＲ（各重鎖および各軽鎖に対して３つ）を含む。しかし、各々の可変領域、特にＣＤＲは、抗原に対してある程度の親和性を有し、単一の軽鎖に結合した単一の重鎖は最大の親和性を達成できる。このため、典型的なＩｇＧ抗体は二価であると考えられ、おそらくは重鎖および軽鎖の同一性に応じて２つの異なる抗原を同時に標的とすることができる。抗体の可変領域（重鎖および軽鎖の両方）は、集合的にＦａｂフラグメントとして公知であり、定常領域（Ｆｃ部分として公知である）から切断されて抗原結合フラグメントを形成することができる。加えて注記したとおり、各々のＣＤＲは抗原に対してある程度の親和性を有し、各々が抗原結合フラグメントとみなされ得る。抗体フラグメントは、標的に対して親抗体と等価の結合親和性を有し得る。二価および一価抗体フラグメントの両方が本発明に含まれる。
したがって、様々な実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、重鎖可変領域（またはそのフラグメント）および／または軽鎖可変領域（またはそのフラグメント）を含む。重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３として分類される３つの相補性定義領域（ＣＤＲ）を含む。同様に、軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３として分類される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の抗体および抗体フラグメントに組み込まれ得る好適なＣＤＲ配列は、それらの全ておよびそれらが由来する抗体に類似する仮説的な「共通祖先」に対応する配列とともに表１に記載されている。「共通祖先」配列に対する配列中のアミノ酸置換は、太字の下線付きの文字によって識別される。
Figure 2022535523000002
ＣＤＲは、軽鎖および重鎖に沿って間隔を空けて配置され、フレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）として公知である４つの比較的保存された領域に隣接する。すなわち、重鎖可変領域はＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４として分類される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、軽鎖可変領域はＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４として分類される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。本明細書に記載される抗体におけるフレームワーク領域の代表的な配列を以下の表２に示す。上と同様に、仮説的な「共通祖先」も含まれており、「共通祖先」配列に対するアミノ酸置換は、太字および下線で示されている。
Figure 2022535523000003
ＣＤＲＨ領域のいずれかを、上述のＦＲＨ配列の１つ以上と組み合わせて、重鎖可変領域を形成してもよい。様々な実施形態では、好適な重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４のいずれか１つを含み得る。さらに、多くの保存的置換が当業者によって想定され得るため、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含む重鎖可変領域を含み得る。例えば、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の配列同一性を含む重鎖可変領域を含み得る。同様に、ＣＤＲＬ領域のいずれかを、上述のＦＲＬ配列の１つ以上と組み合わせて、軽鎖可変領域を形成してもよい。様々な実施形態では、好適な軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つを含み得る。さらに、抗体の活性に影響を及ぼすことなく多くの保存的置換が当業者によって想定され得るため、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つの少なくとも約７０％の配列同一性を含む軽鎖可変領域を含み得る。例えば、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の配列同一性を含む軽鎖可変領域を含み得る。
参照を容易にするために、配列番号４０～４５に対する配列を以下の表３に記載する。この表では、各鎖内のＣＤＲ配列に下線が引かれており、「共通祖先」に対する点突然変異は太字の斜字体にされている。
Figure 2022535523000004
当業者によって想定され得るとおり、種々のＣＤＲ配列およびＦＲ配列が様々なやり方で組み合わされて、新たな抗体が形成されてもよい。表３の完全な重鎖または軽鎖可変領域内であるか、またはそれを除いたＣＤＲ配列の特定の組み合わせについて、以下により詳細に説明する。
様々な実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ａ）配列番号１、２、３、７、１０、１３、１４、４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ｂ）配列番号４、５、６、８、９、１１、１２、１５、１６、４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；あるいは（ｃ）それらの組み合わせを含む。
様々な実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１もしくは１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２もしくは７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３、１０、もしくは１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む免疫グロブリン重鎖を含む。
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４、８、１１、もしくは１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５もしくは９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、配列番号６、１２、もしくは１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ａ）配列番号１もしくは１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２もしくは７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、または配列番号３、１０、もしくは１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号４、８、１１、もしくは１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５もしくは９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、または配列番号６、１２、もしくは１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１または１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３、１０、または１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る。
なおさらなる実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１または１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含み得る。
さらなる実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含み得る。
なおさらなる実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号３、１０、または１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１０を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン重鎖可変領域は、
ａ）配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３もしくは配列番号１０を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、または
ｂ）配列番号１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る。
さらなる実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４、８、１１、または１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５または９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６、１２、または１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４、８、１１、または１５のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号８を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含み得る。
別の例として、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含み得る。
さらなる例として、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号５または９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含み得る。
さらなる実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号６、１２、または１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る。
例えば、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る。
別の例として、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る。
例えば、様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域は、
ａ）配列番号８を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、または
ｂ）配列番号１１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、または
ｃ）配列番号１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る。
したがって、様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号１または１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３、１０、または１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに（ｂ）配列番号４、８、１１、または１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５または９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６、１２、または１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。
本発明の例示的な抗体は、ａ）配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびにｂ）配列番号８を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。
本発明の第２の例示的な抗体は、ａ）配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１０を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびにｂ）配列番号１１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。
本発明の第３の例示的な抗体は、ａ）配列番号１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびにｂ）配列番号１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。
様々な実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２、３、７、１０、１３、１４、４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。例えば、様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ配列番号１、３、７、１０、１３、または１４のうちの少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ配列番号１、３、または７のうちの少なくとも１つをさらに含む。例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１、３、および７を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ配列番号１、７、または１０のうちの少なくとも１つをさらに含む。例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１、７、および１０を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ配列番号７、１３、または１４のうちの少なくとも１つをさらに含む。例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号７、１３、および１４を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ配列番号１または１３を含むＣＤＲＨ１をさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ配列番号２または７を含むＣＤＲＨ２をさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ配列番号３、１０、または１４を含むＣＤＲＨ３をさらに含む。
様々な実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４、５、６、８、９、１１、１２、１５、１６、４１、４３、または４５に対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。例えば、様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、または４５の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつ配列番号４、６、８、９、１１、１２、１５、または１６のうちの少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつ配列番号６、８、または９のうちの少なくとも１つをさらに含む。例えば、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号６、８、および９を含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつ配列番号９、１１、または１２のうちの少なくとも１つをさらに含む。例えば、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号９、１１、および１２を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつ配列番号９、１５、または１６のうちの少なくとも１つをさらに含む。例えば、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号９、１５、および１６を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつ配列番号４、８、１１、または１５のいずれか１つを含むＣＤＲＬ１をさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつ配列番号５または９を含むＣＤＲＬ２をさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４１、４３、または４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつ配列番号６、１２、または１６のいずれか１つを含むＣＤＲＬ３をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の配列同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の配列同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つを含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含み得る。
例えば、いくつかの実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１、４３、および４５を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４２を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１、４３、および４５を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含み得る。
さらなる実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１、４３、および４５を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含み得る。
他の実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０、４２、または４４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０、４２、または４４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０、４２、または４４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４５を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む。
本明細書において提供される例示的な抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４０を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでもよい。
本明細書において提供される第２の例示的な抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４２を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでもよい。
本明細書において提供される第３の例示的な抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４５を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでもよい。
誘導体および合成的に合成された抗体または結合部分。
本明細書に記載される抗体または抗体結合フラグメントのいずれかに由来するペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質も提供される。一般的に、本明細書で使用されるとき、本明細書で提供される誘導体は、本明細書に記載される抗体または抗体結合フラグメントと実質的に類似のものである。例えば、誘導体は、自身のアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含んでいてもよいし、化学的修飾を含んでいてもよい。誘導体および修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は全て「構造的に類似している」と考えられ、これは、それらが親分子の構造を保持しており、親分子と同じやり方で抗原と相互作用すると予想されることを意味する。
合成的に誘導された抗体または抗原結合部分のクラスは、親分子の残基を保存的に変異させて、親分子と同じ活性を維持するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生成することによって生成され得る。代表的な保存的置換は当技術分野で公知であり、本明細書でも要約されている。
一般的に、保存的置換は、必要な活性が保持される限り、任意の位置で行われ得る。置換されるアミノ酸が元のアミノ酸と類似の特性を有する、いわゆる保存的交換が行われてもよく、それは例えばＧｌｕのＡｓｐによる交換、ＧｌｎのＡｓｎによる交換、ＶａｌのＩｌｅによる交換、ＬｅｕのＩｌｅによる交換、およびＳｅｒのＴｈｒによる交換などである。例えば、類似の特性を有するアミノ酸は、脂肪族アミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）；ヒドロキシルもしくは硫黄／セレン含有アミノ酸（例、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン）；環状アミノ酸（例、プロリン）；芳香族アミノ酸（例、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；塩基性アミノ酸（例、ヒスチジン、リジン、アルギニン）；または酸性およびそれらのアミド（例、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）であり得る。欠失は、直接結合によるアミノ酸の置換である。欠失の位置には、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメイン間の結合部が含まれる。挿入は、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入であり、直接結合が形式的に１つ以上のアミノ酸によって置換される。アミノ酸配列は、例えば改善された活性または変更された調節などを有するポリペプチドを生成し得る当技術分野で公知のコンピュータシミュレーションプログラムの助けを借りて調節され得る。この人工的に生成されたポリペプチド配列に基づいて、こうした調節されたポリペプチドをコードする対応する核酸分子を、所望の宿主細胞の特定のコドン使用を用いてインビトロで合成することができる。
本明細書で提供される配列に基づいて機能性ペプチド／ポリペプチドまたはタンパク質を生成する第２のやり方は、コンピュータによる「インシリコ」設計の使用によるものである。例えば、当技術分野の標準的な方法を使用して、コンピュータ設計された抗体または抗原結合フラグメントが設計されてもよい。例えば、各々がその全体にわたって引用により援用される、ストラウチ（Ｓｔｒａｕｃｈ）ＥＭら、（「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．）」２０１７年７月；３５（７）：６６７－６７１）、フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎ）ＳＪら、（「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）」２０１１年５月１３日；３３２（６０３１）：８１６－２１）、およびコダーイ（Ｋｏｄａｙ）ＭＴら（「プロス・パソジェンズ（ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．）」２０１６年２月４日；１２（２）：ｅ１００５４０９）などを参照されたい。
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体のいずれかと構造的に類似している抗体またはその抗体結合フラグメントが提供される。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、単一のＣＤＲループと構造的に類似であり得る。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、例えば配列番号３、１０、１４、またはそれらの任意の組み合わせを含むループなどのＣＤＲＨ３ループと構造的に類似であり得る。
配列番号１～４５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと構造的に類似した三次構造を有するポリペプチドを含む抗体または抗原結合フラグメントも提供される。具体的には、このポリペプチドは、配列番号３、１０、および１４のいずれか１つを含む単一のＣＤＲＨ３ループと構造的に類似した三次構造を有してもよい。
抗体および抗原結合フラグメントの結合および機能
本明細書に記載される抗体およびその抗原結合フラグメントは、インフルエンザウイルスに結合できる。様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに結合できる。様々な実施形態では、ノイラミニダーゼはインフルエンザＡ型ノイラミニダーゼである。様々な実施形態では、ノイラミニダーゼは、Ｎ１～Ｎ９型ノイラミニダーゼのいずれか１つである。上述のとおり、Ａ型インフルエンザウイルスは、自身のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼに基づいて分類される。したがって、様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ＨＸＮ１、ＨＸＮ２、ＨＸＮ３、ＨＸＮ４、ＨＸＮ５、ＨＸＮ６、ＨＸＮ７、ＨＸＮ８、またはＨＸＮ９によって発現されるノイラミニダーゼに対する結合親和性を有し、ここで「Ｘ」は１～１８の任意の整数である。様々な実施形態では、ノイラミニダーゼはＢ型ノイラミニダーゼである。本発明の利点は、これらの抗体および／または抗原結合フラグメントが全てのノイラミニダーゼに対して全般的な親和性を有することである（すなわち、それらはＢ型を除外してＡ型ノイラミニダーゼのみに対して選択的なのではない）。様々な実施形態では、ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスの表面上に発現されてもよい。さらに、本明細書中の抗体および抗原結合フラグメントは、ノイラミニダーゼ上の特異的エピトープに対して特定の親和性を有してもよい。エピトープは、例えば本明細書において配列番号４６として提供されるものなどの、Ｎ１ノイラミニダーゼの活性部位などを含んでもよい。
様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ノイラミニダーゼの少なくとも１つの活性部位残基と相互作用する。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、Ｎ１残基の少なくとも１つの活性部位残基と相互作用し得る。Ｎ１ノイラミニダーゼ（ＣＡ０４Ｎ１）の活性部位の代表的なアミノ酸配列（配列番号４６）を以下の表に示す。
Figure 2022535523000005
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４６のアミノ酸番号付けに従うＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６からなる群より選択される１つ以上の残基と相互作用し得る。好ましくは、抗体または抗体結合フラグメントがこれらの残基の１つ以上と相互作用するとき、それは配列番号３を含むＣＤＲＨ３領域を含む。
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４６のアミノ酸番号付けに従うＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６からなる群より選択される１つ以上の残基と相互作用し得る。好ましくは、抗体または抗体結合フラグメントがこれらの残基の１つ以上と相互作用するとき、それは配列番号１０を含むＣＤＲＨ３領域を含む。
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗体結合フラグメントは、配列番号４６のアミノ酸番号付けに従うＲ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１３４、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｒ１５６、Ｗ１７８、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６からなる群より選択される１つ以上の残基と相互作用し得る。好ましくは、抗体または抗体結合フラグメントがこれらの残基の１つ以上と相互作用するとき、それは配列番号１４のＣＤＲＨ３領域を含む。
したがって、インフルエンザウイルスのＮ１ノイラミニダーゼに対する特異的親和性を有する抗体または抗原結合フラグメントが提供され、この抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４６の少なくとも約７０％を含み、かつ配列番号４６のアミノ酸番号付けに従うＲ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１３４、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｒ１５６、Ｗ１７８、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６から選択される少なくとも１つの残基を含有するＮ１ノイラミニダーゼの活性部位残基に結合する。
抗体または抗原結合フラグメントの結合は、ノイラミニダーゼが、シアル酸受容体を切断して感染細胞からのウイルス粒子の放出を促進するという自身の正常な機能を果たす能力を中和または阻害できる。様々な実施形態では、抗体および／または結合フラグメントは、ノイラミニダーゼが自身の基質を切断する機能を、約０．０００１μｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害する。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、約０．００１μｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有し得る。抗体または抗原結合フラグメントの阻害機能は、例えば、抗体または抗原結合フラグメントの存在下または非存在下でノイラミニダーゼが自身の基質（シアル酸）を切断する能力を測定することなどによって決定され得る。
ヒト化抗体、モノクローナル抗体、およびＩｇＧ抗体
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントはヒト化されている。「ヒト化」抗体とは一般的に、ヒト定常および／もしくは（ｉｒ）可変領域ドメインまたは特異的変化を有するマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはその他の種由来のキメラまたは突然変異モノクローナル抗体である。いわゆる「ヒト化」抗体を生成するための技術は、当業者に周知である。
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントはモノクローナル抗体である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、抗原の同じエピトープに結合する抗体または抗原結合フラグメントを指す。
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントはＩｇＧ型抗体である。
様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、野生型ヒンジ領域または野生型Ｆｃ領域の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有するヒンジ領域またはＦｃ領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、野生型Ｆｃ領域の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有するＦｃ領域を含む。様々な実施形態では、置換、欠失、または挿入は、抗体または抗原結合フラグメントの再利用を防止または低減する。
様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０～４６のいずれかと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
抗体産生
本発明の抗体を産生するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子を化学的に合成できる。合成ＤＮＡ分子を、例えば定常領域コード配列および発現制御配列などを含む他の適切なヌクレオチド配列に連結して、所望の抗体をコードする従来の遺伝子発現構築物を生成できる。定義された遺伝子構築物の生成は、当技術分野における日常的な技術の範囲内である。
所望の抗体をコードする核酸を発現ベクターに組み込む（連結する）ことができ、これを従来のトランスフェクションまたは形質転換技術によって宿主細胞に導入することができる。例示的な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例、Ｈｅｐ Ｇ２）、および他様ではＩｇＧタンパク質を産生しない骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞が免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖可変領域をコードする遺伝子を発現することを可能にする条件下で増殖され得る。
特定の発現および精製条件は、使用される発現系に依存して変化するだろう。例えば、遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるとき、最初に、遺伝子操作された遺伝子を例えばＴｒｐまたはＴａｃなどの好適な細菌プロモーターおよび原核生物シグナル配列の下流に配置することによって、その遺伝子を発現ベクターにクローニングする。発現された分泌タンパク質は、屈折体または封入体中に蓄積し、フレンチプレスまたは超音波処理による細胞破壊後に回収され得る。次いで、屈折体を可溶化し、当技術分野で公知の方法によってタンパク質をリフォールディングおよび切断する。
遺伝子操作された遺伝子が、例えばＣＨＯ細胞などの真核宿主細胞において発現されるとき、それは最初に発現ベクターに挿入され、この発現ベクターは好適な真核生物プロモーターと、分泌シグナルと、ポリＡ配列と、終止コドンとを含み、かつ必要に応じてエンハンサーおよび種々のイントロンを含んでもよい。この発現ベクターは、重鎖または軽鎖の全体または一部が発現されることを可能にする定常領域の全体または一部をコードする配列を必要に応じて含む。遺伝子構築物は、従来の技術を用いて真核宿主細胞に導入され得る。宿主細胞は、ＶＬもしくはＶＨフラグメント、ＶＬ－ＶＨヘテロ二量体、ＶＨ－ＶＬもしくはＶＬ－ＶＨ単鎖ポリペプチド、完全な免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの一部分を発現し、それらの各々は、別の機能（例、細胞毒性）を有する部分に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、重鎖（例、重鎖可変領域）または軽鎖（例、軽鎖可変領域）の全体または一部を発現するポリペプチドを発現する単一ベクターでトランスフェクトされる。他の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）重鎖可変領域を含むポリペプチドおよび軽鎖可変領域を含むポリペプチド、または（ｂ）免疫グロブリン重鎖全体および免疫グロブリン軽鎖全体をコードする単一のベクターでトランスフェクトされる。さらに他の実施形態では、宿主細胞は、２つ以上の発現ベクター（例、重鎖または重鎖可変領域の全体または一部を含むポリペプチドをコードする１つの発現ベクター、および軽鎖または軽鎖可変領域の全体または一部を含むポリペプチドをコードする別の発現ベクター）で同時トランスフェクトされる。
免疫グロブリン重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドは、こうした可変領域をコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖（培養）させることによって産生され得る。発現の後、例えばグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）およびヒスチジンタグなどの親和性タグを用いることなどの、当技術分野で公知の技術を用いて、ポリペプチドを回収して精製または単離できる。
ノイラミニダーゼタンパク質に結合するモノクローナル抗体、または抗体の抗原結合フラグメントは、（ａ）完全もしくは部分的な免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクター、および完全もしくは部分的な免疫グロブリン軽鎖をコードする別個の発現ベクター；または（ｂ）両方の鎖（例、完全もしくは部分的な重鎖および軽鎖）をコードする単一の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、両方の鎖の発現を可能にする条件下で増殖（培養）させることによって産生され得る。インタクトな抗体（または抗体の抗原結合フラグメント）は、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、例えばグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒスチジンタグなどの親和性タグなどの、当技術分野で公知の技術を用いて、回収および精製または単離され得る。単一の発現ベクターまたは２つの別個の発現ベクターから重鎖および軽鎖を発現させることは、当業者の技術の範囲内である。
したがって、様々な実施形態では核酸が提供され、この核酸は、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。当業者は、これらの核酸分子の機能的変異体も本発明の一部であることが意図されることを理解するであろう。機能的変異体は、標準的な遺伝子コードを用いて直接翻訳されて、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供し得る核酸配列である。
核酸は、例えば、以下の表に記載される配列番号４７～５２のいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸は、配列番号４７～４９のいずれか１つを含み得る。例えば、核酸は、配列番号５０～５２のいずれか１つを含み得る。
Figure 2022535523000006
Figure 2022535523000007
様々な実施形態では、核酸は、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする。上述のとおり、２つ以上のタンパク質産物（例、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖）をコードする単一の核酸が提供されてもよい。代替的には、抗体および／または抗原結合フラグメントの１つの成分（例、軽鎖または重鎖）を各々がコードする２つ以上の別個の核酸が提供されてもよい。
様々な実施形態では、本明細書に記載される核酸のうちの１つ以上を含む発現ベクターが提供される。ベクターは、例えばＦ、Ｆ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉなど；コスミド；ファージ、例えばラムダ、ラムドイド、Ｍ１３、Ｍｕ，Ｐ１、Ｐ２２、Ｑβ、Ｔ偶数系、Ｔ奇数系、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７など；または植物ウイルスなどのプラスミドに由来し得る。ベクターは、本発明の結合分子のクローニングおよび／または発現のために使用されてもよく、遺伝子治療の目的のためにも使用され得る。本発明による１つ以上の核酸分子が１つ以上の発現調節核酸分子に動作可能に連結されたものを含むベクターも、本発明によって包含される。ベクターの選択は、その後の組み換え手順および使用される宿主に依存する。宿主細胞へのベクターの導入は、とりわけ、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって行われ得る。ベクターは、自律的に複製してもよいし、自身が組み込まれた染色体と一緒に複製してもよい。好ましくは、ベクターは１つ以上の選択マーカーを含む。マーカーの選択は、選択した宿主細胞に依存してもよい。マーカーとしては、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ＴＫ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、マウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ：ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト結合分子を単離するために使用され得るタンパク質またはペプチドをコードする１つ以上の核酸分子に動作可能に連結された上述のヒト結合分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターも、本発明によって包含される。これらのタンパク質またはペプチドとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、金属結合ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域への核酸の翻訳および発現を誘導してもよい。したがって、本明細書に記載される任意の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、真菌、または細菌起源の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌細胞としては、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のいくつかの種、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などに由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真菌細胞のグループにおいて、好ましくは酵母細胞が使用される。酵母における発現は、例えば、とりわけピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母株を使用することによって達成され得る。さらに、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびＳｆ９由来の細胞などの昆虫細胞が、宿主細胞として使用され得る。それに加えて、宿主細胞は、例えばとりわけ、例えば森林植物などの作物植物由来の細胞、または例えば穀物植物もしくは薬用植物などの食物および原料を提供する植物由来の細胞、または観賞植物由来の細胞、または花球作物由来の細胞などの植物細胞であり得る。形質転換された（トランスジェニック）植物または植物細胞は、例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介遺伝子移入、葉片の形質転換、ポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ移入によるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、またはボリスティック（ｂｏｌｉｓｔｉｃ）遺伝子移入などの公知の方法によって産生される。加えて、好適な発現系はバキュロウイルス系であり得る。例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、またはボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞などの哺乳動物細胞を使用する発現系が、本発明において好ましい。哺乳動物細胞は、哺乳動物起源の天然分子に最も類似した翻訳後修飾を有する発現タンパク質を提供する。本発明はヒトに投与する必要があり得る分子を取り扱うため、完全なヒト発現系が特に好ましいだろう。したがって、さらにより好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。ヒト細胞の例は、とりわけＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
さらに、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに結合する抗体または抗原結合フラグメントを産生するための方法が提供され、この方法は、宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む１つまたは複数のポリペプチドを発現するような条件下で本明細書に記載される宿主細胞を増殖させることによって抗体または抗原結合フラグメントを産生することと、抗体または抗原結合フラグメントを精製することとを含む。
医薬組成物
本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも１つと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。
本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントのうちの１つ以上を含有する医薬組成物は、任意の従来の方式で製剤化され得る。適切な製剤は、選択された投与経路に部分的に依存する。投与経路としては、非経口投与（例、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、直腸投与、皮下投与、筋肉内投与、眼窩内投与、嚢内投与、脊髄内投与、腹腔内投与、または胸骨内投与）、局所投与（経鼻投与、経皮投与、眼内投与）、膀胱内投与、髄腔内投与、腸内投与、経肺投与、リンパ内投与、腔内投与、膣内投与、経尿道投与、皮内投与、耳内投与、乳房内投与、頬側投与、同所投与、気管内投与、病変内投与、経皮投与、内視鏡的投与、経粘膜投与、舌下投与、および腸内投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、組成物は非経口的に投与されるか、または吸入される（例、鼻腔内）。
本発明の組成物における使用のための薬学的に許容される賦形剤は、使用される特定の化合物、ならびにその濃度、安定性、および意図されるバイオアベイラビリティ；対象、その年齢、サイズ、および全身状態；ならびに投与経路を含むいくつかの因子に基づいて選択される。
加えて医薬組成物は、非経口投与のために製剤化されてもよく、例えば静脈内、動脈内、皮下、直腸、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊髄内、腹腔内、または胸骨内などの経路を介した注入のために製剤化され得る。非経口投与に好適な剤形としては、溶液、懸濁物、分散物、エマルション、または非経口投与され得る任意のその他の剤形が挙げられる。
薬学的に許容される賦形剤は、例えば「薬品添加物ハンドブック（Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）」（米国薬剤師会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ），Ｄ．Ｃ．および英国薬剤師会（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）、イングランド（Ｅｎｇｌａｎｄ）、１９６８）などにおいて同定されている。様々な目的のために、本発明の医薬組成物に付加的な賦形剤が含まれ得る。これらの賦形剤は、投与部位における化合物の保持の増強、組成物の安定性の保護、ｐＨの調節、および化合物の医薬組成物への加工の促進などの特性を付与することができる。その他の賦形剤としては、例えば充填剤または希釈剤、界面活性剤、湿潤剤または乳化剤、保存剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤、増粘剤、着色剤、染料、流動助剤、不揮発性シリコーン、接着剤、増量剤、香味料、甘味料、吸着剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、および抗酸化剤などが挙げられる。
様々な実施形態では、本発明による医薬組成物は、インフルエンザウイルスを標的とする少なくとも１つの付加的な抗体または抗原結合フラグメントを含み得る。これらの実施形態では、医薬組成物は抗体のカクテルまたは混合物を含む。付加的な抗体は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質またはインフルエンザウイルス上に存在する異なる免疫原性構造（Ｍ２など）に対して選択的であってもよい。付加的な抗体は、ヘマグルチニンタンパク質のヘッドまたはストークに選択的に結合してもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの他の治療剤、予防剤、および／または診断剤をさらに含んでもよい。好ましくは、前記治療剤および／または予防剤は、インフルエンザウイルス感染および／またはこうした感染から生じる状態を予防および／または処置できる薬剤である。治療剤および／または予防剤としては抗ウイルス剤が挙げられるが、これに限定されない。こうした薬剤は、結合分子、小分子、有機または無機化合物、酵素、ポリヌクレオチド配列、抗ウイルスペプチドなどであり得る。治療剤および／または予防剤は、Ｍ２阻害剤（例、アマンタジン、リマンタジン）および／またはノイラミニダーゼ阻害剤（例、ザナミビル、オセルタミビル）を含み得る。様々な実施形態では、抗ウイルス剤は、バロキサビル、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
付加的な抗体または治療剤／予防剤および／もしくは診断剤を、本発明の抗体および抗原結合フラグメントと組み合わせて使用してもよい。本明細書において「組み合わせて」とは、同時に、別個の製剤として、または１つの単一の組み合わされた製剤として、または別個の製剤としての逐次投与レジメントに従って、任意の順序でということを意味する。実験段階にある、インフルエンザウイルスによる感染および／またはこうした感染から生じる状態を予防および／または処置することができる薬剤も、本発明において有用なその他の治療剤および／または予防剤として使用されることがある。
医薬組成物は、血液、血漿、または血液もしくは血漿の主要成分（例、血球、フィブリン、ヘモグロビン、アルブミンなど）を伴わずに製剤化され得る。医薬組成物は、血液、血漿、または血液もしくは血漿の主要成分を含まないか、または実質的に含まない（例、１ｗｔ．％未満またはさらに０．１ｗｔ．％未満）ことも可能である。
ユニバーサルインフルエンザワクチン
様々な実施形態では、インフルエンザ感染を予防するためのワクチンが提供される。有利なことに、このワクチンは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルスからの防御を提供し得る。様々な実施形態では、ワクチンは、ノイラミニダーゼに対して選択的な本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含む。様々な実施形態では、ワクチンは、例えば本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントが標的とする残基を含むポリペプチドなどのユニバーサルノイラミニダーゼエピトープを含んでもよい。例えば、エピトープは、配列番号４６に対して少なくとも約７０％の配列同一性を含み、かつＲ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１３４、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｒ１５６、Ｗ１７８、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６からなる群より選択される残基の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合には、エピトープは、配列番号４６に対して少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ以下の残基、すなわちＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６を含む。いくつかの場合には、エピトープは、配列番号４６に対して少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ以下の残基、すなわちＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６を含む。いくつかの場合には、エピトープは、配列番号４６に対して少なくとも約７０％の同一性を含み、かつ以下の残基、すなわちＲ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１３４、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｒ１５６、Ｗ１７８、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６を含む。本明細書に記載されるエピトープの全てにおいて、残基は、配列番号４６のアミノ酸番号付けに従って番号付けされている。いくつかの実施形態では、ワクチンは、上述のエピトープ（例、ポリペプチド）のいずれかをコードする核酸（例、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでもよい。
様々な実施形態では、ワクチンは、免疫応答を刺激するアジュバントをさらに含む。好適なアジュバントは当技術分野で公知であり、例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）、またはそれらの組み合わせなどを含み得る。さらに、ワクチンは、本明細書で上述した医薬組成物に従う好適な担体および賦形剤を使用して調製されてもよい。
様々な実施形態では、ワクチンは、インフルエンザ感染を予防するための免疫学的応答を誘発できる。インフルエンザ感染は、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスによって引き起こされ得る。いくつかの実施形態では、インフルエンザ感染は、ＨＸＮ１、ＨＸＮ２、Ｈ２Ｎ３、ＨＸＮ４、ＨＸＮ５、ＨＸＮ６、ＨＸＮ７、ＨＸＮ８、ＨＸＮ９、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるインフルエンザＡウイルスによって引き起こされ、ここでＸは１～１８の任意の整数である。
処置の方法
様々な実施形態では、必要とする対象においてインフルエンザを予防または処置する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される任意の抗体もしくは抗原結合フラグメント（抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードする任意の核酸もしくは発現ベクターを含む）、任意のワクチン、または任意の組成物を対象に投与することを含み得る。
様々な実施形態では、組成物は非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）（例、全身的に）投与される。他の実施形態では、組成物は経口的に（例、鼻腔内に）吸入される。両方の場合において、組成物は、上述の投与様式に従って（例、賦形剤とともに）製剤化される。
様々な実施形態では、組成物は、鼻腔内、筋肉内、静脈内、および／または皮内の経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、組成物はエアロゾル（例、経鼻投与用）として提供される。
投与レジメントは、最適な所望の応答（例、予防的または治療的応答）を提供するように調整され得る。したがって、本明細書における方法で使用される用量は、意図される使用（例、予防的使用対治療的使用）に応じて変動し得る。それにかかわらず、本明細書に記載される組成物は、約１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、または約１～約７０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されてもよい。さらに、単回ボーラスが投与されてもよいし、数回に分割した用量が経時的に投与されてもよいし、治療状況の治療の緊急性によって示されるとおりに用量を相対的に減少または増加させてもよい。
様々な実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、遺伝子治療技術を使用して送達される。こうした技術は当技術分野で周知であり、一般的に、目的の遺伝子産物をコードする核酸を含むウイルスベクターを、必要とする対象に投与することを含む。したがって、特定の実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントをインビボで発現させるために必要な核酸（例えば本明細書で提供される核酸など）のうちの１つ以上を含有するウイルスベクターまたは複数のベクター（例、アデノウイルス）を投与することによって、本明細書に記載される抗体または抗原結合フラグメントがそれを必要とする対象に送達される。同様の送達方法は、他の疾患状況における防御抗体の発現に成功している。例えば、その全開示が本明細書において引用により援用されるソーフェル－ポデスタ（Ｓｏｆｅｒ－Ｐｏｄｅｓｔａ）Ｃ．ら、「抗Ｖ抗原モノクローナル抗体のアデノウイルス媒介送達は致死性ペスト菌チャレンジに対してマウスを防御する（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉ－Ｖ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ａ Ｌｅｔｈａｌ Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」インフェクション・アンド・イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）２００９年３月、７７（４）１５６１－１５６８などを参照されたい。
様々な実施形態において、処置されるべきインフルエンザは、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスである。いくつかの実施形態では、処置されるべきインフルエンザは、ＨＸＮ１、ＨＸＮ２、Ｈ２Ｎ３、ＨＸＮ４、ＨＸＮ５、ＨＸＮ６、ＨＸＮ７、ＨＸＮ８、ＨＸＮ９、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、ここでＸは１～１８の任意の整数である。
本発明を詳細に説明してきたが、添付の請求項において定義された本発明の範囲から逸脱することなく修正および変形が可能であることは明らかであろう。
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示するために提供されるものである。
材料および方法
以下の材料および方法を使用して、実施例１～４に記載の実験を行った。
患者
ヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を、バーンズ・ジューイッシュ病院救急部門インフルエンザ（Ｂａｒｎｅｓ Ｊｅｗｉｓｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（ＥＤＦＬＵ）前向き観察コホート研究に登録された単一の対象１７１８００３から得た。ＥＤＦＬＵ研究は、セントルイス・ワシントン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ）の機関審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）によって審査および承認された（承認＃２０１７－１０－２２０）。１７１８００３は、２０１７～２０１８年のＨ３Ｎ２優勢インフルエンザシーズン中に採用され、バーンズ・ジューイッシュ病院救急部門への治療提示後の症候性疾患の５日目にＰＢＭＣが得られた。対象は、疾患の発症前に２０１７～２０１８年の季節性インフルエンザワクチンを受けており、過去のインフルエンザシーズンには他の季節性インフルエンザワクチンを受けていた。対象は短期間入院し、合併症は伴わずに入院の１．５日後に退院した。
ＰＢＭＣ単離
標準的な静脈切開技術を用いて、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で抗凝固剤処理したサンプルチューブに血液を採取した。採取から８時間以内に、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）上での層化および４００ｇにて３０分間の遠心分離によって、ＰＢＭＣを調製した。フィコール界面のＰＢＭＣ層を回収し、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ：Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）－１６４０培地に再懸濁した。細胞カウントが得られ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）および４０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞を低温保存した。
細胞選別
２％ＦＢＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ中に再懸濁した凍結保存ＰＢＭＣを使用して、選別のための染色を行った。細胞を、ＣＤ７１－ＦＩＴＣ（バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、クローンＣＹ１Ｇ４）、ＣＤ１９－ＰＥ（バイオレジェンド、クローンＨＩＢ１９）、ＩｇＤ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（バイオレジェンド、クローンＩＡ６－２）、ＣＤ３８－ＢＶ６０５（バイオレジェンド、クローンＨＩＴ２）、およびＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（バイオレジェンド）によって４℃で３０分間染色した。次いで細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを使用して、単一のＡＳＣ（生シングレットＣＤ１９＋ＣＤ４－ＩｇＤｌｏ ＣＤ３８＋ＣＤ７１＋）を、１Ｕ／μＬのＲＮアーゼ阻害剤（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を補充した１０μＬの１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）を含有する９６ウェルプレート中に選別し、直ちにドライアイス上で凍結させた。
モノクローナル抗体生成
以前に記載されたとおりに抗体をクローニングした（１）。一般的に、ＩｇＡ抗体を発現する３つの抗体分泌細胞（ＡＳＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）を上述のとおりに対象から単離した。可変遺伝子（ＶＨおよびＶκ）を細胞ｃＤＮＡからＩｇＧ１発現ベクターにクローニングして、インビボでＩｇＡ抗体の特異性を有する天然に存在しないＩｇＧ抗体を発現させた。簡潔には、ＶＨおよびＶκ遺伝子を、（２）に詳述されるプライマーセットを使用して、ＩｇＧおよびＩｇκに特異的なプライマーのカクテルを使用して、単一に選別された抗体分泌細胞（ＡＳＣ）からの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）およびネステッドＰＣＲ反応によって増幅し、次いで配列決定した。組み換え抗体を生成するために、ＶＨ３－２０、ＪＨ２、ＶＫ１－９、およびＪＫ３遺伝子に対するプライマーによるＰＣＲによって制限部位を組み込んだ。増幅されたＶＨおよびＶκ遺伝子を、以前に記載されたとおりに、それぞれＩｇＧ１およびＩｇκ発現ベクターにクローニングした（１～３）。抗体を発現させるために使用したヌクレオチド配列を以下の表に示す。重鎖および軽鎖プラスミドを発現のためにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））に同時トランスフェクトし、抗体をプロテインＡアガロース（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で精製した。
Figure 2022535523000008
Figure 2022535523000009
細胞、ウイルス、およびタンパク質
ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ；ジブコ）にペニシリン－ストレプトマイシン抗生物質混合物（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン；ジブコ）およびＦＢＳ（１０％；コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））を含ませて完全ＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＭＥＭ）とした培地中で、ヒト胎児腎臓細胞（２９３Ｔ）を増殖させた。メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）細胞をｃＤＭＥＭ中で増殖させて維持した。ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４（イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ））細胞を、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン；ジブコ）を補充した無血清ＳＦＸ培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））中で増殖させた。Ｓｆ９（ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））細胞を、１０％ＦＢＳおよびｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ抗生物質混合物の存在下でＴＮＭ－ＦＨ培地（ジェミニ・バイオプロダクツ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））中で維持した。ＡＤＣＣバイオエフェクターＦｃγＲＩＩＩａ細胞（プロメガ）の単回使用アリコートを使用前に解凍した。インフルエンザウイルスを、８～１０日齢の発育鶏卵（チャールズリバーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））において、３３℃（インフルエンザＢウイルス）で３日間、または３７℃（インフルエンザＡウイルス）で２日間、それぞれ増殖させた。ウイルスリアソータントを、以前に記載されたとおりのプラスミドベースの逆遺伝学技術によってレスキューした（４）。この研究で使用したウイルスの完全なリストが表６に見出され得る。以前に詳細に記載されたとおりのバキュロウイルス発現系において組み換えタンパク質を発現させた（５）。全てのＮＡを、Ｎ末端血管拡張剤刺激リンタンパク質四量体化ドメインおよび精製のためのヘキサヒスチジンタグを有する外部ドメインとして発現させた。組み換えノイラミニダーゼの完全なリストが以下の表４に見出され得る。
Figure 2022535523000010
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。
９６ウェルマイクロタイタープレート（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））を、１×コーティング緩衝液（ＫＰＬコーティング溶液；セラケア（ＳｅｒａＣａｒｅ））中の２μｇ／ｍＬの濃度の組み換えＮＡ５０μＬで、４℃にて一晩コーティングした。２２０μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ（ジブコ）に０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｔ－ＰＢＳ；フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、３％ヤギ血清（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、および０．５％粉乳（アメリカン－バイオ（Ａｍｅｒｉｃａｎ－Ｂｉｏ））を補充したもの）を全てのウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ｍＡｂを３０μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、１：３で連続希釈し、室温で２時間インキュベートした。プレートをＴ－ＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング溶液で１：３０００に希釈した５０μＬの抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）抗体（ＨＲＰ、ヤギで産生；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、＃Ａ０２９３）を全てのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを４回洗浄し、１００μＬのＳｉｇｍａＦａｓｔ ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＯＰＤ；シグマ）を全てのウェルに加えた。１０分後に５０μＬの３Ｍ塩酸（サーモフィッシャー）で反応を停止させ、マイクロタイタープレートリーダー（バイオテック（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ））によって４９０ｎｍの波長でプレートを読み取った。マイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータを分析した。カットオフ値は、全てのブランクウェルの平均にブランクウェルの標準偏差の３倍を足したものとして定義した。最小結合濃度は、カットオフ値より高いシグナルを有する最後のウェルとして定義した。
酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ：Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｌｅｃｔｉｎ ａｓｓａｙ）
９６ウェルマイクロタイタープレート（サーモフィッシャー）を、１×コーティング緩衝液（ＫＰＬコーティング溶液；セラケア）中の２５μｇ／ｍＬの濃度のフェチュイン（シグマ）１００μＬ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。翌日、プレートをＴ－ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）（ＢＳＡ、バイオメディカルズ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ））中で室温にてブロッキングした。別個の９６ウェルプレートにおいて、ウイルスをＰＢＳで１：２に連続希釈した。７５μＬのＰＢＳを全てのウェルに加え、プレートを振とう機上で室温で１．５時間インキュベートした。ブロッキング後、プレートをＴ－ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの連続希釈ウイルスを、フェチュインでコーティングしたプレートにウェルごとに移し、プレートをウイルスのタイプに応じて３３℃または３７℃で２時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、５μｇ／ｍＬの濃度のＨＲＰにコンジュゲートしたピーナッツ凝集素（ＰＮＡ：ｐｅａｎｕｔ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）１００μＬを全てのウェルに加えた。プレートを暗所で２時間インキュベートし、プレートを４回洗浄し、１００μＬのＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤで発色させた。５分後に５０μＬの３Ｍ塩酸（サーモフィッシャー）で反応を停止させ、マイクロタイタープレートリーダー（バイオテック）によって４９０ｎｍの波長でプレートを読み取った。マイクロソフト・エクセルおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータを分析し、各ウイルスに対する５０％有効濃度（ＥＣ５０：５０％ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を計算した。
ノイラミニダーゼ阻害アッセイを行うために、マイクロタイタープレートを上述のとおりにコーティングおよびブロッキングした。フェチュインコーティングプレートのブロッキング中に、ｍＡｂを３０μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、別個の９６ウェルプレートにおいてＰＢＳで１：２に連続希釈した。２×有効濃度５０（ＥＣ５０）に希釈した７５μＬのウイルスを連続希釈したｍＡｂのウェルに加え、振とう機上で１．５時間インキュベートした。フェチュインコーティングプレートをＴ－ＰＢＳで３回洗浄し、ウイルス／ｍＡｂ混合物をプレートに加え、３３℃または３７℃で２時間インキュベートした。残りのアッセイは上述のとおりに行った。マイクロソフト・エクセルおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータを分析し、阻害濃度５０（ＩＣ５０：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０）を計算した。
ＮＡ－スターアッセイ
ＮＡ－Ｓｔａｒ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して、抗ＮＡ ｍＡｂによるウイルスＮＡの小さな可溶性の化学発光基質の切断に対する阻害を測定した。製造者のプロトコルに従ってアッセイを行った。簡潔には、ｍＡｂを３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、１：２で連続希釈し、２５μＬを白色の平底９６ウェル細胞培養プレートに移した。決定された２×ＥＣ５０濃度の２５μＬのウイルスを各ウェルに加え、プレートを振とうし、３７℃で２０分間インキュベートした。ＮＡ－スター基質を使用直前に調製し、１０μＬ／ウェルの基質を全てのウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートし、マイクロタイタープレートリーダー（バイオテック）を使用してプレートを読み取る直前に、６０μＬ／ウェルのＮＡ－スター促進剤溶液を全てのウェルに加えた。マイクロソフト・エクセルおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７を用いてデータを分析し、阻害曲線を可視化した。
マイクロ中和アッセイ
１．５×１０５細胞／ｍＬの濃度の１００μＬ／ウェルのＭＤＣＫ細胞を９６ウェル細胞培養プレート（シグマ）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、別個の９６ウェル細胞培養プレートにおいて、ｍＡｂを３０μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、１μｇ／ｍＬの濃度のトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ：ｔｏｓｙｌ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ）処理トリプシンを補充したＵｌｔｒａＭＤＣＫ培地（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））（感染培地；シグマ）で１：２に連続希釈した。ウイルスを感染培地で１００×ＴＣＩＤ５０／５０μＬの濃度に希釈し、６０μＬのウイルス希釈液を６０μＬの連続希釈ｍＡｂとともにインキュベートし、振とう機上で室温で１時間インキュベートした。次に、ＭＤＣＫ細胞プレートをＰＢＳ（ジブコ）で洗浄し、１００μＬのウイルス／ｍＡｂ混合物を加えた。プレートを３３℃で１時間インキュベートし、インキュベーション時間後にウイルス／ｍＡｂ混合物を除去し、前の濃度の希釈ｍＡｂと交換した。プレートを３３℃で４８時間インキュベートし、古典的な血球凝集アッセイによって読み出しを行った。簡潔には、ニワトリ赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（ＲＢＣ；ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））をＰＢＳで０．５％の濃度に希釈し、ｖ底９６ウェルプレート（コーニング）中の５０μＬの細胞上清に加えた。プレートを４℃で３０～４５分間インキュベートし、スキャンし、結果をマイクロソフト・エクセルで分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７で可視化した。
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ
１．５×１０５細胞／ｍＬの濃度の１００μＬ／ウェルのＭＤＣＫ細胞を白色の平底９６ウェル細胞培養プレート（コーニング）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清ＵｌｔｒａＭＤＣＫ培地で１．５×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ：ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）／ｍＬ（約５の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に相当する）に希釈したウイルス１００μＬを各ウェルに加え、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。別個の９６ウェル細胞培養プレートにおいて、ｍＡｂを６０μｇ／ｍＬの出発濃度に希釈し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ）で１：２に連続希釈した。ヒトＡＤＣＣバイオエフェクターＦｃγＲＩＩＩａ細胞（プロメガ）を３７℃の水浴中で解凍した。培地をＭＤＣＫ細胞プレートから除去し、２５μＬのＲＰＭＩ１６４０培地、２５μＬの連続希釈ｍＡｂ、および２５μＬのバイオエフェクター細胞（６．２５×１０４細胞／２５μＬ）を加えた。３７℃で６時間インキュベートした後、７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ（プロメガ）を各ウェルに加えた。プレートを暗所で１０分間インキュベートし、ルシフェラーゼ誘導発光をマイクロプレートリーダー（バイオテック）で測定した。マイクロソフト・エクセルおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７で結果を分析し、曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）値を決定した。カットオフ値は、ブランクウェルの値の平均にブランクウェルの標準偏差の３倍を足したものとして定義した。
結晶構造決定のためのノイラミニダーゼのクローニング、バキュロウイルス発現、および精製。
Ｈｕｎａｎ Ｎ９、Ｊａｐａｎ５７ Ｎ２、およびＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡの外部ドメインを、本質的に以前に記載されたとおりにバキュロウイルス系において発現させた（６）。簡潔には、Ａ／Ｈｕｎａｎ／０２６５０／２０１６（Ｈ７Ｎ９）（Ｈｕｎａｎ Ｎ９、ＧＩＳＡＩＤアクセッション番号ＥＰＩ９６１１８９）由来のＮ９ ＮＡの外部ドメイン（残基８３～４７０、Ｎ２番号付けで８２～４６８）と、Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７（Ｈ２Ｎ２）（Ｊａｐａｎ Ｎ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＹ０４５８０６）由来のＮ２ ＮＡの外部ドメイン（残基８２～４６９）と、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ＣＡ０４ Ｎ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＪ９６９５１７）由来のＮ１ ＮＡの外部ドメイン（残基８２～４６９、Ｎ２番号付けで８２～４７０）とを構造解析のためにバキュロウイルス系で発現させた。ＮＡ外部ドメインに対応するｃＤＮＡを、Ｎ末端ｇｐ６７シグナルペプチド、トロンビン切断部位、およびヘキサヒスチジンタグとともにバキュロウイルストランスファーベクターｐＦａｓｔｂａｃＨＴ－Ａ（インビトロジェン）に組み込んだ（６）。構築されたプラスミドを使用して、部位特異的転位（Ｔｎ－７媒介）によってＤＨ１０ｂａｃコンピテント細菌細胞を形質転換して、ベータ－ガラクトシダーゼ青白受容体選択を有する組み換えバクミドを形成した。精製した組み換えバクミドを用いて、過剰発現のためにＳｆ９昆虫細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））をトランスフェクトした。５～１０のＭＯＩの組み換えバキュロウイルスによってＳｆ９細胞の懸濁培養物中でＮＡタンパク質を産生させ、１分当たり１１０回転で振とうしながら２８℃でインキュベートした。７２時間後、Ｓｆ９細胞を遠心分離によって除去し、分泌された可溶性ＮＡタンパク質を含有する上清を濃縮し、２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌに緩衝液交換し、次いでＮｉ－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ：Ｎｉ－ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）樹脂（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いた金属アフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。結晶化のために、ＮＡ外部ドメインをトロンビンで消化してヘキサヒスチジンタグを除去し、２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０２％ＮａＮ３中でＨｉｌｏａｄ１６／９０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））でのサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製されたＮＡを２８０ｎｍにおける光学吸光度によって測定し、純度および完全性を還元および非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分析した。
結晶構造決定のための哺乳動物細胞における組み換え抗体Ｆａｂの発現。
ヒト抗体１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の軽鎖および重鎖可変領域を、それぞれ対応するラムダまたはカッパＣＬ領域、およびヘキサヒスチジンタグに付加されたヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域を含むベクターｐｈＣＭＶにクローニングした。重鎖および軽鎖を含有する発現ベクターのＥｘｐｉＣＨＯ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック）への一過性同時トランスフェクションによって、Ｆａｂを発現させた。ＮＴＡ樹脂（キアゲン）を使用する金属アフィニティークロマトグラフィーを使用し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、培養上清から組み換えＦａｂを精製した。２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０２％ＮａＮ３中の精製Ｆａｂを２８０ｎｍにおける光学吸光度によって測定し、純度および完全性を還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
結晶構造決定
結晶化実験は、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて設定した。６．０ｍｇ／ｍｌの１Ｇ０４ＦａｂとＨｕｎａｎ Ｎ９ ＮＡとの複合体の回折品質結晶を、０．１Ｍ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ：４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ｐＨ７．５、５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３０００、３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４００、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中で２０℃で成長させた。６．０ｍｇ／ｍｌの１Ｅ０１ ＦａｂとＪａｐａｎ５７ Ｎ２ ＮＡとの複合体を、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび２４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００中で２０℃で結晶化させた。最後に、３．０ｍｇ／ｍｌの１Ｇ０１ ＦａｂとＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡとの複合体を、０．１Ｍトリス、ｐＨ８．５、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００、および５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００中で２０℃で結晶化させた。全ての結晶を、付加的な凍結保護物質なしで１００Ｋでフラッシュ冷却した。
回折データをシンクロトロンビームラインで収集した（表５）。全ての結晶についてのデータを統合し、ＨＫＬ２０００でスケーリングした（７）。データ収集の統計を表５に概説する。
Figure 2022535523000011
Figure 2022535523000012
全ての結晶構造は、プログラムＰｈａｓｅｒを用いた分子置換によって決定した（８）。１Ｅ０１ ＦａｂとＪａｐａｎ５７ Ｎ２ ＮＡとの複合体構造を、Ａ／ＲＩ／５＋／１９５７（Ｈ２Ｎ２）由来のＮ２ ＮＡ（ＰＤＢ ３ＴＩＡ）ならびにＦａｂ軽鎖および重鎖（それぞれＰＤＢコード５ＩＴＢおよび４ＦＱＬ）を入力ＭＲモデルとして使用して決定した。１Ｇ０４ ＦａｂとＨｕｎａｎ Ｎ９ ＮＡとの複合体構造を、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（ＰＤＢ５Ｌ１４）由来のＮ９ ＮＡおよび精密化した１Ｅ０１ Ｆａｂ構造を入力ＭＲモデルとして使用して決定した。最後に、１Ｇ０１ ＦａｂとＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡとの複合体構造を、アポＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡ構造（ＰＤＢコード３ＮＳＳ）および精密化した１Ｅ０１ Ｆａｂ構造を入力ＭＲモデルとして使用して決定した。Ｊａｐａｎ５７ Ｎ２ ＮＡを伴う１Ｅ０１ Ｆａｂの構造精密化およびＨｕｎａｎ Ｎ９ ＮＡを伴う１Ｇ０４Ｆａｂの構造精密化のために、ＲＥＦＭＡＣ５で初期剛体精密化を行い（９）、ＰＨＥＮＩＸで模擬アニーリングおよび拘束精密化（ＴＬＳ精密化を含む）を行った（１０）。ＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡとの複合体における１Ｇ０１ Ｆａｂの構造精密化のために、ａがｃにほぼ等しい双晶Ｐ２１空間群（表５）およびＣ中心斜方晶空間群に対応するより高い見かけの対称性によって擬メロヘドラル双晶が検出された。初期剛体精密化ならびにツインオペレータ－ｌ、－ｋ、－ｈおよび精密化ツインフラクション０．３３５による拘束ツイン精密化は全てＲＥＦＭＡＣ５で実施した（９）。これら３つの構造の精密化ラウンドの間に、プログラムＣｏｏｔによってモデル構築を行った（１１）。これらの構造に対する最終的な統計を表５に要約する。ＪＣＳＧ検証スイートを使用して構造の品質を分析した。全ての図はＰｙＭｏｌによって生成した。
マウスにおける受動移入実験
ｍＡｂの予防的および治療的有効性を試験するための受動移入実験を、以前に記載されたとおりに行った（１２）。手短に言えば、予防的設定のために、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５マウス／グループ）または６～８週齢の雌ＤＢＡ／２Ｊマウス（ｎ＝５マウス／グループ）に、１００μＬのｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、または１Ｇ０１を５ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内投与した。陰性対照マウスには、１００μＬの無関係なヒトＩｇＧ対照ｍＡｂを５ｍｇ／ｋｇの濃度で与えた。移入の２時間後、マウスをケタミン－キシラジン－水混合物（０．１５ｍｇケタミン／ｋｇおよび０．０３ｍｇ／ｋｇ体重のキシラジン；腹腔内１００μｌ）で麻酔し、５×ＬＤ５０のチャレンジウイルスで鼻腔内チャレンジし、例外としてＨ７Ｎ２ Ａ／ｆｅｌｉｎｅ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１６－０４００８２／２０１６およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４チャレンジ実験についてはそれぞれ２×ＬＤ５０または７．５×ＬＤ５０を与えた。トリＨ４Ｎ６ウイルスはＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて体重減少を誘導しないためにＤＢＡ／２Ｊマウスを使用したＨ４Ｎ６ Ａ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１９５６ウイルスチャレンジを除いて、全てのチャレンジ実験にＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。チャレンジに使用したウイルスの完全なリストおよび対応するＬＤ５０情報は表１０（実施例５）に見出され得る。体重減少を１４日間毎日モニターし、人道的エンドポイントを最初の０日目の体重の２５％の減少と定義した。
治療効果を試験するために、マウスを５×ＬＤ５０のＨ３Ｎ２ Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／１９８２ウイルスに感染させた。ｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、１Ｇ０１、およびヒト陰性対照ｍＡｂを感染の４８または７２時間後に５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した。体重減少を１４日間毎日測定し、０日目の体重の２５％以上が減少したマウスを施設ガイドラインに従って安楽死させた。
肺ウイルス力価の低下を決定するために、マウスに５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、１Ｇ０１、および陰性対照ヒトＩｇＧを腹腔内注射により与え、２時間後に０．１×ＬＤ５０のＨ３Ｎ２ Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／１９８２ウイルスを感染させた。感染後３日目（ｎ＝３マウス／ｍＡｂ）および６日目（ｎ＝３マウス／ｍＡｂ）に、肺を採取し、ＢｅａｄＢｌａｓｔｅｒ２４（ベンチマーク（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ））を用いてホモジナイズした。肺ウイルス力価を、以前に記載されたとおりの標準的プラークアッセイによって評価した（１３）。マイクロソフト・エクセルおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７で結果を分析した。
ＮＡ配列
系統樹を作成するための配列は、インフルエンザ・リソース・データベース（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）および鳥インフルエンザデータ共有のグローバル・イニシアチブ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）からダウンロードした。
実施例１：季節性インフルエンザの感染後のヒトモノクローナル抗体の単離および同定。
症候性疾患の発症後５日目に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から形質芽球を単一細胞選別し、以前に記載されたとおりに対応する免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）（ＩＧＨＶおよびＩＧＬＶ）遺伝子をクローニングして発現させた（２３）。次いで、ｍＡｂの組み換えＨ３ ＨＡ、Ｎ２ ＮＡ、核タンパク質、およびマトリックスタンパク質１への結合をスクリーニングした。このスクリーニングからの３つの抗体、ｍＡｂ １Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１は、季節性インフルエンザウイルス株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４のＮ２ ＮＡ（Ｈ３Ｎ２）に結合し、これはおそらく感染を引き起こした株に密接に関連する。１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１は、ＩＧＨＶ３－２０およびＩＧＫＶ１－９がそれぞれＩＧＨＶおよびＩＧＬＶ遺伝子をコードする３メンバークローンファミリーを形成する（図１Ａ）。特にＩＧＨＶ遺伝子における多数の体細胞超変異の蓄積によって証明されるとおり、３つのｍＡｂは、メモリーＢ細胞に由来する可能性が最も高い。推定される非変異共通祖先（ＵＣＡ）に対する各ｍＡｂのアミノ酸配列のアラインメントは、１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１の重鎖がそれぞれ１２、１４、および１９位でＵＣＡと異なることを示した（図１Ｂ）。
実施例２：ＥＬＩＳＡを用いた組み換えＮ２タンパク質への単離ｍＡｂ結合の特徴付け。
本発明者らは最初に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、種々の季節性インフルエンザウイルスおよびトリインフルエンザウイルス由来の組み換えノイラミナーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎａｓｅｓ）（ＮＡ）に対する３つのｍＡｂの結合親和性および交差反応性を測定した。さらなる特徴付けの際に、本発明者らは、３つの抗体が季節性インフルエンザウイルスおよびトリインフルエンザウイルス由来の組み換えＮ２ ＮＡ（グループ２）への広範な結合を示すことを見出した（図１Ｃ、表４）。さらに、１Ｇ０４は、Ｎ３およびＮ６（グループ２）ならびにＮ１、Ｎ５、およびＮ８（グループ１）に対するいくらかの交差反応性を示し、かつインフルエンザＢ ＮＡに対する弱い結合を示した（図１Ｃ）。１Ｅ０１は、グループ２のＮＡ Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、およびＮ９、グループ１のＮＡ Ｎ１、Ｎ５、およびＮ８を含むさらに広範な結合パターンを示し、かつＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７系統由来のインフルエンザＢ ＮＡへの強い結合およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８系統のＮＡへの弱い結合を示した。最後にｍＡｂ １Ｇ０１は、グループ１のＮＡ（Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、およびＮ８）およびグループ２のＮＡ（Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、およびＮ９）の全て、ならびに両方のインフルエンザＢウイルス系統由来のＮＡを包含する最も広い結合活性を示した（図１Ｃ）。
実施例３：ノイラミニダーゼを阻害するｍＡｂの機能的能力。
本発明者らは次に、ノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ：ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を測定する酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）において、３つのｍＡｂの機能的能力を調べた（図１Ｄおよび図２Ａ）。評価したウイルス株を以下の表６に列挙する。１Ｇ０４はＮ２、Ｎ３および特定のＮ１ ＮＡを阻害したのに対し、１Ｅ０１はグループ２のＮＡ、Ｎ１およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７系統のＮＡを阻害した。１Ｇ０１は、全てのＡ／グループ２およびグループ１ＮＡならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７系統ＮＡの活性を顕著に阻害した（図１Ｄおよび図２Ａ）。ＮＡ活性は、酵素活性部位内のエピトープに直接結合する抗体によって阻害され得るか、または抗体が活性部位の近位に結合するときの立体障害によって阻害され得る。しかし、立体障害によるＮＩは、フェチュインなどの大きな天然基質を使用したときのＥＬＬＡでのみ観察される。ＮＡ－スターアッセイのように小分子が基質として使用されるとき、活性部位に直接結合しない抗体は阻害しない（９、１０）。ＮＡ－スターアッセイで試験したとき、３つ全てのｍＡｂがＮＡ活性を強力に阻害し、ＮＡ活性部位内の結合フットプリントを示唆した（図２Ｂおよび図６Ａ～６Ｄ）。１Ｇ０１については、阻害に対する立体障害の寄与の可能性も除去するＥＬＬＡにおける完全抗体の代わりに抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を使用することによってこのことをさらに確認した。１Ｇ０１ Ｆａｂは依然として強力な阻害を示し、抗体が活性部位を直接標的とし得ることをさらに示唆した（図２Ｃ）。興味深いことに、これら３つのｍＡｂの生殖系列バージョンも、ＥＬＬＡアッセイにおいてＮＡ活性を強力に阻害した（図２Ｄ）。
重要なことに、３つの抗体は全て、感受性対照ウイルスと同様の効力でオセルタミビル耐性Ｈ３Ｎ２ウイルスを阻害した（図７Ａ～７Ｂ）。典型的には、抗ＮＡ抗体はインビトロ中和アッセイにおいて活性を示さないが（９）、ここでの３つのｍＡｂは全て、様々なＮ２ウイルスに対するアッセイにおいて強力な阻害活性を示した（図２Ｅおよび図８Ａ～８Ｃ）。この効果は、全てが細胞へのウイルス侵入の阻害によるものではないかもしれないが、そのアッセイにおける陽性読み出しに必要なウイルス放出およびその後のウイルス複製を効率的に遮断するｍＡｂの強いＮＩ活性を反映しているかもしれない。Ｆａｂベースの抗ウイルス活性に加えて、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などのＦｃ－ＦｃＲ媒介性エフェクター機能は、広範に防御的な抗ＨＡ抗体にとって重要であることが示されており、抗ＮＡ抗体についても検出されている（９、２４）。３つのｍＡｂは全て、それらがより高い濃度でのみ結合したときでさえ（例、インフルエンザＢ ＮＡへの１Ｇ０４結合）、ＡＤＣＣバイオレポーターアッセイにおいて異なるＮＡのパネルに対する活性を示した（図２Ｆおよび図９Ａ～９Ｄ）。
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Figure 2022535523000014
実施例４：モノクローナル抗体に対する結合エピトープの構造決定。
３つのｍＡｂのエピトープおよびそれらの広範な防御の構造的根拠を解明するために、本発明者らは、３．４５Åでの最近のＨ７Ｎ９流行単離株Ａ／Ｈｕｎａｎ／０２６５０／２０１６（Ｈｕｎａｎ Ｎ９）由来のＮ９ ＮＡを伴う１Ｇ０４と、２．４５Åでの１９５７Ｈ２Ｎ２パンデミック単離株Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７（Ｊａｐａｎ５７Ｎ２）のＮ２ ＮＡと複合した１Ｅ０１と、３．２７Å分解能での２００９パンデミックＨ１Ｎ１単離株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（ＣＡ０４ Ｎ１）のＮ１ ＮＡと複合した１Ｇ０１との結晶構造を決定した（図３、ＮＡ株を表４に列挙する）。３つ全てのＦａｂ－ＮＡ複合体構造において、１つのＦａｂがＮＡ四量体の１つのＮＡプロトマーに結合した。重要なことに、３つのＦａｂは全て、ＮＡ活性部位を完全に遮断するようにＮＡに結合した（図３）。１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１は、重鎖および軽鎖の両方を用いてそれらのエピトープを認識した。３つの抗体における重鎖、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３がそれらのＮＡ相互作用において支配的な役割を果たした。１Ｇ０４、１Ｅ０１、および１Ｇ０１によるＮＡ上の総埋没表面積は、それぞれ１０３０Å２、９００Å２、および８００Å２であり、その８７％、８４％、および７７％が重鎖から生じ、６７％、６６％、および７７％が伸長ＣＤＲ Ｈ３ループから生じた。
抗体１Ｇ０４は、ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を使用してＨｕｎａｎ Ｎ９ ＮＡと相互作用した（図３Ａ、図１０、表７）。１Ｇ０４の長い２１残基ＣＤＲ Ｈ３は、１０の活性部位残基を含む２０のＮ９ ＮＡ残基に対するＦａｂ相互作用のほとんどに寄与しており、これらの活性部位残基は、グループ１、グループ２、およびインフルエンザＢ ＮＡにおいて保存されたＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６である。ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２は、いくつかの非保存Ｎ９ ＮＡ残基と接触した。同様に、１Ｅ０１は、１Ｇ０４と同じ５つのＣＤＲループを用いてＪａｐａｎ５７ Ｎ２と相互作用した。１Ｅ０１の２１残基ＣＤＲ Ｈ３は、Ｅ２７６を除いて１Ｇ０４によって認識される保存された活性部位エピトープ残基の全てを含む１６Ｎ２ ＮＡ残基との相互作用を支配した（図３Ｂ、図１１、表８）。興味深いことに、１Ｇ０１は、ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、およびＨ３ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）Ｌ３由来の１つの残基Ｙ６７のみを使用してＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡに結合した。１Ｇ０１の２１残基ＣＤＲ Ｈ３は、１９のＣＡ０４ Ｎ１ ＮＡ残基と相互作用し、これは１３のＮＡ保存活性部位（そのうち１０は１Ｇ０４で保存されている）またはＬ１３４、Ｒ１５６、Ｗ１７８を含む第２シェル残基を含む（図３Ｃ、図１２、表９）。これらの３つの抗体のエピトープは、活性部位から離れたエピトープまたは活性部位の縁上のエピトープに結合する、構造的に特徴付けられたマウスＮＡ抗体と比較して独特である（１２、２５～２７）。
これらの反応性プロファイルは、これらの抗体が最初にＨ３Ｎ２感染によって誘導され、その後この個体がＨ１Ｎ１およびインフルエンザＢウイルスに曝露することによってＮ１およびインフルエンザＢウイルスＮＡ抗原に対する親和性を獲得したことを示唆している。次いで、この個体の最近のＨ３Ｎ２感染が、これらのクローンをリコールした。この個体における実際の血清抗体力価は、防御を媒介するほど十分に高くなかったと考えられ、それによってこの人物が感染した理由が説明されるだろう。したがって、この抗体クローンは個体のメモリーＢ区画に存在するが、骨髄中の長寿命の形質細胞区画には存在しない可能性がある。
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実施例５：インフルエンザのマウスモデルにおけるモノクローナル抗体の防御能力。
次に、本発明者らは、マウスモデルにおいてインビボでの３つのｍＡｂの防御能力を評価した。本発明者らは、ヒトＮ２、トリＮ２、ブタＮ３、ならびにトリＮ６、Ｎ７、およびＮ９ ＮＡ（全てグループ２）、ヒトＮ１、トリＮ１、ならびにトリＮ４、Ｎ５、およびＮ８ ＮＡ（全てグループ１）、ならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８８系統由来のインフルエンザＢウイルスを発現するウイルスに対する防御効果を試験した（図４Ａ、図４Ｃ～４Ｍ、表１０）。対照抗体を受けた動物において重篤な体重減少のみが観察されたが死亡は観察されなかったトリＮ２およびＮ６を除くと、全てが致死的チャレンジモデルであった。感染の２時間前に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂを動物に投与し、次いで罹患率（体重減少）および死亡率を１４日間モニターした。ｍＡｂは、それらの反応性パターンと一致した方式で体重減少および死亡率の両方からの防御を行い、これは結合が観察された場合にそれらは防御的でもあったことを意味する。特に１Ｇ０１は、全ての単一チャレンジウイルスに対して致死性からの完全な防御を提供した。いくらかの一過性の体重減少が観察されたＮ４チャレンジ（図４Ｊ）を除いて、１Ｇ０１は体重減少に対する堅固な防御を提供した。Ｈ３Ｎ２チャレンジについて、本発明者らは、感染後３日目および６日目のチャレンジを受けた動物の肺におけるウイルス複製もモニターし、複製ウイルスを何ら検出できず、このことは、３つのｍＡｂの強力なインビトロ阻害および中和活性が、少なくともサンプリングした日においてはインビボでの殺菌免疫に変換されたことを示唆するものである（図４Ｂ）。ｍＡｂが治療薬として与えられた場合に有用であり得るかどうかを決定するために、本発明者らは、マウスに致死量のＨ３Ｎ２ウイルスを感染させ、それらを感染の４８時間または７２時間後にそれぞれの抗体で処置した（図４Ｎおよび図４Ｏ）。一時的な体重減少が観察されたが、低用量の５ｍｇ／ｋｇ ｍＡｂで処置したときに全ての動物が回復し、これらの抗ＮＡ ｍＡｂが治療可能性を有することが示唆された。
Figure 2022535523000021
参考文献:
1. F. Krammer, P. Palese, Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov 14, 167-182 (2015).
2. E. J. Erbelding et al., A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. J Infect Dis 218, 347-354 (2018).
3. F. Krammer, The human antibody response to influenza A virus infection and vaccination. Nat Rev Immunol, (2019).
4. D. C. Ekiert et al., A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses. Science 333, 843-850 (2011).
5. D. C. Ekiert et al., Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science 324, 246-251 (2009).
6. C. Dreyfus et al., Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science 337, 1343-1348 (2012).
7. D. Corti et al., A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science 333, 850-856 (2011).
8. F. Krammer et al., NAction! How Can Neuraminidase-Based Immunity Contribute to Better Influenza Virus Vaccines? MBio 9, (2018).
9. T. J. Wohlbold et al., Broadly protective murine monoclonal antibodies against influenza B virus target highly conserved neuraminidase epitopes. Nat Microbiol 2, 1415-1424 (2017).
10. Y. Q. Chen et al., Influenza Infection in Humans Induces Broadly Cross-Reactive and Protective Neuraminidase-Reactive Antibodies. Cell 173, 417-429.e410 (2018).
11. L. Jiang et al., Comparative Efficacy of Monoclonal Antibodies That Bind to Different Epitopes of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus Neuraminidase. J Virol 90, 117-128 (2016).
12. H. Wan et al., Structural characterization of a protective epitope spanning A(H1N1)pdm09 influenza virus neuraminidase monomers. Nat Commun 6, 6114 (2015).
13. T. J. Wohlbold et al., Vaccination with Adjuvanted Recombinant Neuraminidase Induces Broad Heterologous, but Not Heterosubtypic, Cross-Protection against Influenza Virus Infection in Mice. MBio 6, (2015).
14. G. E. Smith et al., Neuraminidase-based recombinant virus-like particles protect against lethal avian influenza A(H5N1) virus infection in ferrets. Virology 509, 90-97 (2017).
15. W. C. Liu, C. Y. Lin, Y. T. Tsou, J. T. Jan, S. C. Wu, Cross-Reactive Neuraminidase-Inhibiting Antibodies Elicited by Immunization with Recombinant Neuraminidase Proteins of H5N1 and Pandemic H1N1 Influenza A Viruses. J Virol 89, 7224-7234 (2015).
16. M. McMahon et al. (mBio, 2019, in press).
17. A. S. Monto et al., Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis 212, 1191-1199 (2015).
18. R. B. Couch et al., Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase. J Infect Dis 207, 974-981 (2013).
19. M. J. Memoli et al., Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. MBio 7, e00417-00416 (2016).
20. N. S. Heaton, D. Sachs, C. J. Chen, R. Hai, P. Palese, Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 20248-20253 (2013).
21. M. R. Sandbulte et al., Discordant antigenic drift of neuraminidase and hemagglutinin in H1N1 and H3N2 influenza viruses. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 20748-20753 (2011).
22. Y. Abed, I. Hardy, Y. Li, G. Boivin, Divergent evolution of hemagglutinin and neuraminidase genes in recent influenza A:H3N2 viruses isolated in Canada. J Med Virol 67, 589-595 (2002).
23. J. Wrammert et al., Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature 453, 667-671 (2008).
24. D. J. Dilillo, G. S. Tan, P. Palese, J. V. Ravetch, Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med 20, 143-151 (2014).
25. W. R. Tulip, J. N. Varghese, W. G. Laver, R. G. Webster, P. M. Colman, Refined crystal structure of the influenza virus N9 neuraminidase-NC41 Fab complex. J Mol Biol 227, 122-148 (1992).
26. R. L. Malby et al., The structure of a complex between the NC10 antibody and influenza virus neuraminidase and comparison with the overlapping binding site of the NC41 antibody. Structure 2, 733-746 (1994).
27. L. Venkatramani et al., An epidemiologically significant epitope of a 1998 human influenza virus neuraminidase forms a highly hydrated interface in the NA-antibody complex. J Mol Biol 356, 651-663 (2006).
28. T. M. Doyle et al., A monoclonal antibody targeting a highly conserved epitope in influenza B neuraminidase provides protection against drug resistant strains. Biochem Biophys Res Commun 441, 226-229 (2013).
29. T. M. Doyle et al., Universal anti-neuraminidase antibody inhibiting all influenza A subtypes. Antiviral Res 100, 567-574 (2013).
30. W. He et al., Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nat Commun 8, 846 (2017).
本発明またはその好ましい実施形態（単数または複数）の要素を導入するときの冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「前記（ｓａｉｄ）」は、１つ以上のその要素が存在することを意味することが意図される。用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の付加的な要素が存在し得ることを意味する。
上記を考慮すると、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法、プロセス、および組成物において様々な変更を行うことができるため、上記の説明に含まれ、添付の図面に示される全ての事項は、例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。
Figure 2022535523000067
Figure 2022535523000068

Claims (118)

  1. 抗体または抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントは、
    ａ）配列番号１、２、３、７、１０、１３、１４、４０、４２、または４４に対する少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；
    ｂ）配列番号４、５、６、８、９、１１、１２、１５、１６、４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；または
    ｃ）それらの組み合わせを含む、抗体または抗原結合フラグメント。
  2. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、
    （ａ）配列番号１もしくは１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２もしくは７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３、１０、もしくは１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、もしくはそれらのいずれかの組み合わせを含む免疫グロブリン重鎖可変領域；
    （ｂ）配列番号４、８、１１、もしくは１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５もしくは９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、配列番号６、１２、もしくは１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、もしくはそれらのいずれかの組み合わせを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；または
    （ｃ）それらの組み合わせを含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  3. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１もしくは１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２もしくは７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、または配列番号３、１０、もしくは１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  4. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１または１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  5. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  6. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  7. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号２または７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  8. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含む、請求項７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  9. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含む、請求項７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  10. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号３、１０、または１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  11. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  12. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１０を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  13. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  14. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１または１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３、１０、または１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  15. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、
    ａ）配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３；
    ｂ）配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、およびアミノ酸配列もしくは配列番号１０を有するＣＤＲＨ３；または
    ｃ）配列番号１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  16. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４、８、１１、もしくは１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５もしくは９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、または配列番号６、１２、もしくは１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  17. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４、８、１１、または１５のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  18. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、請求項１７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  19. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号８を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、請求項１７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  20. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、請求項１７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  21. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、請求項１７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  22. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号５または９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  23. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含む、請求項２２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  24. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含む、請求項２２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  25. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号６、１２、または１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  26. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、請求項２５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  27. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、請求項２５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  28. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、請求項２５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  29. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４、８、１１、または１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５または９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６、１２、または１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  30. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、
    ａ）配列番号８を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、または
    ｂ）配列番号１１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、または
    ｃ）配列番号１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  31. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、
    （ａ）配列番号１または１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３、１０、または１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号４、８、１１、または１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５または９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６、１２、または１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  32. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、
    ａ）配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
    ｂ）配列番号８を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項３１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  33. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、
    ａ）配列番号１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１０を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
    ｂ）配列番号１１を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項３１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  34. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、
    ａ）配列番号１３を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号１４を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
    ｂ）配列番号１５を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１６を含むアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項３１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  35. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  36. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  37. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１または３６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  38. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  39. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  40. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  41. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  42. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  43. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  44. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  45. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  46. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  47. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  48. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７５％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  49. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約８０％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  50. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約８５％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  51. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９０％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  52. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９５％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  53. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９６％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  54. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９７％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  55. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９８％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  56. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９９％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  57. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９９．５％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  58. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約９９．９％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  59. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つに対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％配列、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つに対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  60. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０、４２、および４４のいずれか１つを含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１、４３、および４５のいずれか１つを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む、請求項５９に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  61. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  62. 抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４２を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  63. 抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  64. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４１を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  65. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  66. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４５を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  67. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４１を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  68. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４２を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  69. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４４を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４５を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む、請求項６０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  70. 配列番号１～４６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと構造的に類似した三次構造を有するポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
  71. 前記ポリペプチドは、配列番号３、１０、および１４のいずれか１つを含む単一のＣＤＲＨ３ループと構造的に類似した三次構造を有する、請求項７０に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  72. 前記抗体または抗原結合フラグメントはインフルエンザウイルスに結合する、請求項１～７１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  73. 前記抗体または抗原結合フラグメントはノイラミニダーゼに特異的に結合する、請求項７２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  74. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、約０．０００１μｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌのＩＣ５０で前記ノイラミニダーゼを阻害する、請求項７３に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  75. 前記抗体または抗原結合フラグメントの前記ＣＤＲＨ３領域は、前記ノイラミニダーゼの少なくとも１つの活性部位残基と相互作用する、請求項７３または７４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  76. 前記ノイラミニダーゼはＮ１ノイラミニダーゼであり、前記ＣＤＲＨ３領域は配列番号３を含み、前記Ｎ１ノイラミニダーゼの前記活性部位残基はＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６のうちの少なくとも１つを含み、ここでアミノ酸番号付けは配列番号４６に従う、請求項７５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  77. 前記ノイラミニダーゼはＮ１ノイラミニダーゼであり、ＣＤＲＨ３は配列番号１０を含み、前記活性部位残基はＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６のうちの少なくとも１つを含み、ここでアミノ酸番号付けは配列番号４６に従う、請求項７５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  78. ノイラミニダーゼはＮ１ノイラミニダーゼであり、前記ＣＤＲＨ３は配列番号１４を含み、前記活性部位残基はＲ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１３４、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｒ１５６、Ｗ１７８、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６のうちの少なくとも１つを含み、ここでアミノ酸番号付けは配列番号４６に従う、請求項７５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  79. 前記ノイラミニダーゼはインフルエンザＡ型ノイラミニダーゼを含む、請求項７３～７８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  80. 前記ノイラミニダーゼはＮ１～Ｎ９のいずれか１つを含む、請求項７９に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  81. 前記ノイラミニダーゼはインフルエンザＢ型ノイラミニダーゼを含む、請求項７３～７８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  82. 前記ノイラミニダーゼは、前記インフルエンザウイルスの表面上に発現される、請求項７３～８１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  83. 前記抗体または抗原結合フラグメントはヒト化されている、請求項１～８２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  84. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体および／またはＩｇＧ抗体である、請求項１～８３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  85. インフルエンザウイルスのＮ１ノイラミニダーゼに対する特異的親和性を有する抗体または抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４６の少なくとも約７０％を含み、かつ配列番号４６のアミノ酸番号付けに従うＲ１１８、Ｅ１１９、Ｌ１３４、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｒ１５６、Ｗ１７８、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６から選択される少なくとも１つの残基を含有する前記Ｎ１ノイラミニダーゼの活性部位残基に結合する、抗体または抗原結合フラグメント。
  86. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、野生型ヒンジ領域または野生型Ｆｃ領域の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有するヒンジ領域またはＦｃ領域を含む、請求項１～８５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  87. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、野生型Ｆｃ領域の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有するＦｃ領域を含む、請求項１～８６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  88. 前記置換、欠失、または挿入は、前記抗体または抗原結合フラグメントの再利用を防止または低減する、請求項８７に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  89. 前記抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０～４６のいずれかと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、請求項１～８８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  90. 請求項１～８９のいずれか一項に記載の抗体。
  91. 請求項１～８９のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
  92. 請求項１～９１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントの前記免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
  93. 前記核酸は配列番号４７～４９のいずれか１つを含む、請求項９２に記載の核酸。
  94. 請求項１～９１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
  95. 前記核酸は配列番号５０～５２を含む、請求項９４に記載の核酸。
  96. 請求項９２もしくは９３に記載の核酸、および／または請求項９４もしくは９５のいずれか一項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  97. 請求項９６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  98. インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに結合する抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法であって、前記方法は、宿主細胞が前記免疫グロブリン重鎖可変領域および前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む１つまたは複数のポリペプチドを発現するような条件下で請求項９７に記載の宿主細胞を増殖させることによって前記抗体または抗原結合フラグメントを産生することと、前記抗体または抗原結合フラグメントを精製することとを含む、方法。
  99. 請求項１～９１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む、ワクチン。
  100. ポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸を含むワクチンであって、前記ポリペプチドは、請求項１～９１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントによって標的とされるエピトープに対する少なくとも約７０％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  101. 前記ポリペプチドは、配列番号４６を含む参照配列に従うＲ１１８、Ｅ１１９、Ｄ１５１、Ｒ１５２、Ｗ１７８、Ｒ１５６、Ｉ２２２、Ｒ２２４、Ｅ２７６、Ｅ２７７、Ｒ３７１、およびＹ４０６から選択されるアミノ酸残基を含む、請求項１００に記載のワクチン。
  102. 前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１００または１０１に記載のワクチン。
  103. 前記ワクチンは、対象に投与されたときにインフルエンザウイルスに対する有効な免疫学的応答を提供する、請求項９９～１０２のいずれか一項に記載のワクチン。
  104. 医薬組成物であって、前記組成物は、請求項１～９１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
  105. 前記組成物は、前記インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する選択的なモノクローナル抗体をさらに含む、請求項１０４に記載の医薬組成物。
  106. 前記組成物は抗ウイルス薬をさらに含む、請求項１０４または１０５に記載の医薬組成物。
  107. 前記抗ウイルス薬は、バロキサビル、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０６に記載の医薬組成物。
  108. 前記薬学的に許容される担体または賦形剤は、充填剤、希釈剤、界面活性剤、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、染料、流動助剤、不揮発性シリコーン、接着剤、増量剤、香味料、甘味料、吸着剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、または抗酸化剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０４～１０７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  109. 前記組成物は、血液、血漿、または血液もしくは血漿の主要成分を伴わずに製剤化される、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  110. 前記組成物は、血液、血漿、または血液もしくは血漿の主要成分を含まないか、または実質的に含まない、請求項１０４～１０９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  111. 必要とする対象においてインフルエンザを予防または処置する方法であって、前記方法は、請求項１～９１のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、請求項９２～９５のいずれか一項に記載の核酸、請求項９６に記載の発現ベクター、請求項９９～１０３のいずれか一項に記載のワクチン、または請求項１０４～１１０のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  112. 前記インフルエンザ感染はインフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスによって引き起こされる、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記インフルエンザＡウイルスの血清型は、ＨＸＮ１、ＨＸＮ２、Ｈ２Ｎ３、ＨＸＮ４、ＨＸＮ５、ＨＸＮ６、ＨＸＮ７、ＨＸＮ８、ＨＸＮ９、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、ここでＸは１～１８の整数である、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、ワクチン、または組成物は非経口的に投与される、請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、ワクチン、または組成物は、筋肉内、静脈内、もしくは皮内送達を介して投与されるか、またはエアロゾルを介して鼻腔内に投与される、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、ワクチン、または組成物は、活性インフルエンザ感染を処置するために治療的に投与される、請求項１１１～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記抗体もしくは抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、ワクチン、または組成物は、インフルエンザ感染を予防するために予防的に投与される、請求項１１１～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 抗体もしくは抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、ワクチン、または組成物は、約１～７０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１１１～１１７のいずれか一項に記載の方法。
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