CN111094335B - 广泛中和的抗流感单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及广泛中和的抗流感单克隆抗体或其抗原结合片段。本发明进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段的治疗用途。

Description

广泛中和的抗流感单克隆抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月15日提交的美国临时申请62/506,256的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。
政府关注
本申请是在国立卫生研究院授予的AI116285号政府支持下做出的。政府对本申请享有一定权利。
发明领域
本发明涉及广泛中和的抗流感单克隆抗体(mAbs)或其抗原结合片段。本发明进一步涉及所述抗体或其抗原结合片段的治疗用途。
发明背景
流行性感冒(通常被称为“流感”)是一种由流感病毒引起的传染病。有四种类型的流感病毒：甲型、乙型、丙型和丁型。人甲型和乙型流感病毒引起疾病的季节性流行。预防流感的第一步也是最重要的一部是每年接受流感疫苗接种。尽管获得许可的流感疫苗已有70多年，但流感感染仍是主要的公共卫生问题。在美国，每年流感导致～15,000例死亡和～300,000例住院治疗，全球每年有～300至500万严重病例和200,000至500,000例死亡(Girard MP et al.,2005.Vaccine 23:5708-5724；Nogales A et al.,2016.Int J MolSci 18；Dushoff J et al.,2006.Am J Epidemiol 163:181-187；Doshi P.2008.Am JPublic Health 98:939-945；和Thompson WW et al.,2009.Am J Public Health 99Suppl2:S225-230)。此外，由于医院成本或者上课日或工作日缺勤导致的美国的经济负担平均每年超过800亿美元(Molinari NA et al.,2007.Vaccine 25:5086-5096；Gasparini R etal.,2012.Hum Vaccin Immunother 8:21-28；和Keech M et al.,2008.Pharmacoeconomics 26:911-924)。一项关键弱点是需要每年选择季节性流感疫苗组成以充分匹配在即将到来的季节期间预计最为突出的病毒株。如果季节性疫苗与循环病毒株不匹配，则疫苗可能无效。由于流感具有抗原漂移和转变的倾向，以及其引起主要病毒株特异性抗体的倾向，人类仍然容易受到可能会导致有限免疫力或无免疫力的大范围流行新病毒株潮的影响，就像1918年的情况那样——当时“西班牙流感”杀死了～3000-5000万人(Taubenberger JK et al.,2006.Emerg Infect Dis 12:15-22)。
甲型流感病毒(IAV)有18个HA亚型，它们进一步分为两个系统发育组：1组(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18亚型)和2组(H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型)。季节性疫苗接种包括甲型流感病毒H1、H3和乙型流感病毒。近年来的流行[包括最近一次的2009年新型H1N1流行(Smith GJ et al.,2009.Nature 459:1122-1125and KilbourneED.2006.Emerg Infect Dis 12:9-14)，其在不足1年内在世界范围内感染了超过600,000人，在超过200个国家中引起近16,000例死亡(Centers for Disease C,Prevention.2009.Update：infections with a swine-origininfluenza A(H1N1)virus--United States and other countries,April 28,2009.MMWR Morb Mortal Wkly Rep 58:431-433)]。需要新的疫苗策略和治疗剂以赋予针对多种流感病毒株的广泛保护。
发明内容
本发明通过提供流感广泛中和的抗流感单克隆抗体或其抗原结合片段解决了此需要。
在一个方面，本发明提供了特异性结合至甲型流感病毒(IAV)H1亚型的血凝素(HA)的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NOs:3-5的氨基酸序列；和(ii)轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NOs:6-8的氨基酸序列。在上述分离的抗体或抗原结合片段中，重链可变区可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。轻链可变区可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
本发明还提供了特异性结合至IAV H1亚型的HA的分离的抗体或其抗原结合片段。当结合至HA时，抗体结合至如下构象表位：所述构象表位依赖于(或包含)与pH1N1(SEQ IDNO:13)的HA的E129和K180相对应的E和K氨基酸残基。进一步提供的是如下的分离的抗体或其抗原结合片段：其在与上述抗体或抗原结合片段的交叉阻断实验中竞争与IAV H1亚型的HA的结合。
上面所述的抗体或抗原结合片段可包含Fc恒定区变异。分离的抗体或抗原结合片段可为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体或片段可缀合至治疗剂、聚合物、可检测标签或酶。聚合物的实例包括聚乙二醇(PEG)。治疗剂的实例包含细胞毒性剂。
在第二方面，本发明提供了分离的核酸，其编码上述抗体或抗原结合片段中任一个的CDRs、重链或轻链可变区或者抗原结合部分中的一个或多个。核酸可用于表达具有上面所述的HCDRs或LCDRs中的一组或两组、抗体或抗原结合片段的链或者抗体或片段的多肽。为此，可将核酸可操作地连接至合适的调控序列以产生表达载体。因此，在本发明的范围内还有包含载体的培养宿主细胞以及产生多肽、抗体或其抗原结合部分的方法。所述方法包括：获取包含载体的培养宿主细胞，所述载体编码上面所述的抗体或其抗原结合部分的CDRs、多肽或者重链可变区或轻链可变区中的一个或多个的核酸序列；在允许表达由该载体编码的多肽并组装抗体或其片段的体积下在培养基中培养细胞，并从培养的细胞或细胞培养基中纯化抗体或片段。
上面所述的抗体或片段可用于中和IAV的方法或治疗、预防或控制IAV感染的方法中。所述方法包括对需要其的受试者施用治疗有效量的抗体或片段。因此，本发明还提供了药物组合物，其包含(i)抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的载体。
在以下描述中阐述本发明的一个或多个实施方式的细节。本发明的其他特征、目标和优点将从该描述和权利要求书中显而易见。
附图简述
图1A、1B和1C是一组显示KPF1人单克隆抗体(hmAb)的分离和分子表征的图表。(图1A)免疫后7天，采用设门方法(gating strategy)分离外周血浆母细胞(CD19+IgD-CD38+CD27++)。(图1B)KPF1VH和Vk(SEQ ID NOs:1和9)与假定的谱系氨基酸序列(SEQ ID NOs:10和11)的比对。(图1C)编码来自用于形成KPF1的扩增B细胞谱系的抗体的恒定区(SEQ IDNO:22)和IgA1恒定区(SEQ ID NO:23)的核酸的比对。.
图2A、2B和2C是显示KPF1 hmAb对H1流感具有高特异性的图表。通过ELISA检测KPF1 hmAb和同种型对照hmAb与(图2A)多种重组流感H1、H3、H5、H7、H9和IBV HA以及阴性对照蛋白(RSV-F)，和(图2B)尿素浓度逐渐增加的H1 HA蛋白的结合。符号代表一式三份±SEM。(图2C)在蛋白质G新品上捕获纯化KPF1，其中pH1N1 HA以逐渐降低的浓度在每个通道上通过。数据点以黑色显示，与1:1结合模型的拟合以红色显示。给出了两个代表性实验之一的结果。
图3是显示mPLEX-Flu结合曲线的图表。通过多重测定以逐渐降低的浓度检测免疫前(D0)和免疫后7天(D7)以及免疫后3个月(M3)的患者血浆和KPF1 hmAb，以检测其对多种重组H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和IBV HA蛋白的结合。
图4A、4B和4C是显示KPF1 hmAb的有效体外中和活性的图表和表格。使用基于荧光的微中和测定法来测量病毒中和(Nogales A et al.,2016.病毒Res 213:69-81；和Nogales A et al.,2015.Virology 476:206-216)。用表达mCherry的A/California/04/2009(pH1N1)和A/Puerto Rico/08/1934(PR8)H1N1、A/Wyoming/3/2003(H3N2)或B/Brisbane/60/2008(IBV)病毒感染MDCK细胞，所述病毒用两倍连续稀释的KPF1 hmAb预先温育。在感染后24h，使用荧光酶标仪评价和量化病毒中和(图4A)，并使用S形剂量响应曲线计算感染性百分比(图4B)。在没有Ab(无Ab)的情况下模拟感染的细胞和病毒用作内部对照。将中和百分比标准化为没有抗体情况下的感染。数据显示了对于一式三份测定的结果的平均值±SD。(图4C)通过基于荧光的测定法的测得的KPF1 hmAb的NT50。*，没有可检测的中和作用的mAb的最大量。
图5A、5B、5C和5D是显示KPF1 hmAb限制pH1N1体外复制的图表。在感染前24h将雌性C57BL/6小鼠(N＝11)用0.1、1或10mg/kg的KPF1 hmAb或用10mg/kg的同种型对照(IgG)或PBS进行腹膜内注射治疗。随后将小鼠用10x MLD50的pH1N1攻击，并且在2周内每日监测体重减轻(图5A)和存活(图5B)。将其体重减轻25％的小鼠处死。数据表示平均值±SD(N＝5)。为评价肺中的病毒复制(图5C)，在腹膜内注射2(N＝3)和4(N＝3)天时处死小鼠，并将全肺用于通过免疫聚焦测定来定量病毒滴度(FFU/ml)。*表明使用单向ANOVA和Dunnett检验进行多重比较校正，p<0.05。Ns，无统计学显著差别。(d)评价KPF1针对多种H1流感病毒株的预防活性。雌性C57BL/6小鼠(N＝6)在病毒感染之前24h接受10mg/kg of KPF1或IgG同种型对照(IC)。随后将小鼠用10x MLD50的PR8H1N1(圆圈)、TX H1N1(正方形)或NC H1N1(三角形)攻击，并如上所述评价感染后2天(N＝3)和4天(N＝3)(分别为黑色和灰色符号)的肺内病毒复制。对于(C)和(D)，符号代表个体小鼠的数据。条形，几何平均的肺病毒滴度；虚线，检出限(200FFU/ml)，并且表示未检出病毒或仅在3只小鼠中的1只中检出病毒。
图6A和6B是显示KPF1在感染小鼠中的治疗活性的图表。将雌性C57BL/6小鼠用10xMLD50的pH1N1感染，并随后在感染后6，24或72h用10mg/kg的KPF1 hmAb或者用同种型对照hmAb(IgG，在感染后6h)或PBS(在感染后6h)腹膜内注射治疗。随后，在2周内每日监测小鼠的体重减轻(图6A)和存活(图6B)。将其体重减轻25％的小鼠处死。数据表示平均值±SD(N＝5)。
图7A、7B、7C、7D和7E是显示MARMs的产生和表征的表格、一组照片和图表。(图7A)在存在(MARMs)或不存在(WT)hmAb KPF1情况下进行5轮选择之后WT或mAb-耐受性突变体(MARMs 1、2和3)的HAs和NAs中的氨基酸突变。还通过微中和测定(NT50)和HAI评价了突变对于hmAb KPF1反应性的影响。(图7B)通过免疫荧光法表征MARMs。用pH1N1WT或MARMs(1、2和3)模拟感染(Mock)或感染(MOI 0.01)MDCK细胞。在感染后36h，固定细胞并使用hmAb KPF1或小鼠mAbs 29E3(抗-HA)和HB-65(抗-NP)通过IFA评价蛋白表达。使用DAPI进行核染色。包含来自代表性图像的合并(10X放大)。比例尺50nm。(图7C)MDCK细胞中pH1N1WT和MARMs的多周期生长动力学。在感染后指定小时数通过免疫聚焦测定(FFU/ml)使用抗-NP小鼠mAb HB-65分析用pH1N1WT或MARMs病毒感染(MOI,0.001)的MDCK细胞的组织培养上清液中的病毒滴度。数据代表一式三份孔测定的结果的平均值±SDs。*表示使用Student’s t检验的p<0.05(WT vs.MARM 3)。(图7D)pH1N1的HA的球状头部的三维蛋白结构。使用软件程序PyMol和pH1N1的HA的已公布结构来生成图像(3LZG,Xu R et al.,2010.Science 328:357-360)。MARMs中氨基酸置换的位置(E129和K180)被着色为黄色。每个抗原位点处的残基被如下着色：Sa位点为红色，Sb位点为橙色，Ca位点为绿色，并且Cb位点为品红色。表明了结构中的受体结合位点(RBS)的位置。(图7E)用于TX H1N1的MARMs的生成。在存在(MARMs)或不存在(WT)hmAb KPF1的情况下进行5轮选择之后TX H1N1WT或MARMs(1、2和3)中HA和NA的氨基酸变化。还使用WT TX H1N1作为内部对照，在HAI测定中评价E129K突变对与KPF1反应性的作用。
图8A和8B是一组显示氨基酸129和180对于KPF1 hmAb结合的相关性的照片和图表。(8A)KPF1 hmAb与WT和突变HA蛋白的结合。表达WT或氨基酸置换E129K、K180N、K180Q或E129K/K180N突变Has pCAGGS质粒来瞬时转染HEK293T细胞。使用模拟转染的细胞作为内部对照。在转染后24h，固定细胞，并使用hmAb KPF1或山羊pH1N1抗-HA多克隆抗体作为对照通过IFA评价蛋白表达。使用DAPI进行核染色。包含来自代表性图像的合并(10x放大)。比例尺，50nm。(8B)在IAV H1N1 HA中发现的氨基酸随时间变化的频率。分析在2000-2009年(n＝8,585；黑色)或2010-2018年(n＝8,417；灰色)之间分离的IAV H1N1 HA蛋白的公众可知序列(Influenza Research Database)，并根据在129位(右)或180位(左)包含所指明的氨基酸的序列的百分比绘图。
发明详述
本发明至少部分基于某些单克隆抗体或其抗原结合片段的出乎意料的广泛中和的抗流感活性。这些抗体和抗原结合片段构成了保护免受流感感染的新的治疗策略。
抗体
本文所公开的发明涉及广泛中和的抗流感单克隆抗体或其抗原结合片段。这些抗体是指一类中和多种流感病毒株的中和抗体。抗体能预防性和治疗性地保护受试者(例如，如以下实施例中所示的小鼠)免受流感病毒[诸如A/California/04/2009H1N1(pH1N1)]的致病性攻击。每个抗体均结合至受体结合位点(RBS)附近的HA球状头部的保守表位区，这不同于先前所述的对其他交叉反应性的H1mAbs的结合。更具体地，这些抗体识别H1流感病毒株的HA1球状头部中高度保守的、新的、不连续的(或构象的)表位，所述表位依赖于Sa抗原位点内的残基(K180)和Ca抗原位点附近的残基(E129)，涵盖了RBS附近的区域。
如本文所公开的，为了鉴定如果靶向其则可赋予普遍保护性体液免疫以及产生可能具有广谱活性的人单克隆抗体(hmAbs)的HA表位，发明人检测了来自用2014-2015年度季节性灭活流感疫苗免疫的受试者的浆母细胞。出乎意料的是，使用深层免疫球蛋白库测序和单细胞免疫球蛋白克隆的组合，获得了针对H1流感病毒的具有广泛和有效中和活性的hmAbs(诸如，下文中详细描述的KPF1)。抗体的中和滴度50(NT50)可低至10.0、5.0、1.0、0.5、0.10、0.05、0.04、0.03或0.02μg/ml，甚至在8M尿素中也能保持与HA的大部分结合(～50-70％)，表明了很高的亲和力。
如本文所公开的，本发明的抗体可识别大量H1分离株，包括A/California/07/2009H1N1、A/New Caledonia/20/1999H1N1、A/Texas/36/1991 H1N1、A/South Carolina/01/1918H1N1和A/Puerto Rico/08/1934H1N1中的一个、两个、三个、四个或五个。例如，KPF1识别所测试的全部H1分离株的83％，包括1918种H1。在一些实施方式中，抗体不识别1μg/ml的A/USSR/1977H1N1，或不具有针对H3或B HAs的反应性.
出乎意料地，在体内，本发明的抗体(例如，KPF1)可以如以下实施例中所示的测试方式预防性地导致高百分比(例如，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％)存活的小鼠免受致病性的A/California/07/2009H1N1攻击。同样出乎意料地，当最晚在致病性攻击后72h给予时，本发明的抗体(例如，KPF1)可导致高百分比(例如，40％，50％，60％，70％或80％)的存活。本发明的抗体(例如，KPF1)识别HA球形头部中的表位，其取决于Sa抗原位点内和抗原结合位点附近的残基。
由于对多种流感病毒株具有更广泛反应性的多种最近的mAbs是HA茎部特异性的，出乎意料的是识别HA球形头部中的表位的本发明的抗体能中和多种流感病毒株。如本文所公开的，本发明的抗体(诸如，KPF1)具有更有效的中和的抗流感活性。
下面列出的是一种示例性抗体(即，上面提到的KPF1抗体)的重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的氨基酸序列，其中重链CDR1-3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR1-3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)为黑体。
Figure BDA0002313028950000071
Figure BDA0002313028950000081
如上所述，保护免受流感感染的关键弱点是需要每年选择与即将到来的季节的预期病毒株充分匹配的疫苗组成。流感的抗原漂移和转变倾向及其引起主要病毒株特异性抗体的倾向使人类容易受到可能会导致有限免疫力或无免疫力的具有大范围流行潜力的新病毒株潮的影响。
下面显示了这些流感分离株的一些实例的血凝素(HA)蛋白的核苷酸和氨基酸序列，包括2014-2015年度的Fluzone疫苗：A/California/07/2009 X-179A(H1N1)、A/Texas/50/2012X-223A(H3N2)、B/Massachusetts/02/2012(B Yamagata谱系)和B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)。
A/California/7/2009H1N1
核苷酸序列(SEQ ID NO:12):
atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta
tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat
gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa
ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga
aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacacct
agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag
caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg
cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc
ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa
tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct
actagtgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg catatgtttt tgtggggtca
tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggatcaa
gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa
gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcgcaa tggaaagaaa tgctggatct
ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca aacacccaag
ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt
ccaaaatatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tatcccgtct
attcaatcta gaggcctatt tggggccatt gccggtttca ttgaaggggg gtggacaggg
atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc
gacctgaaga gcacacagaa tgccattgac gagattacta acaaagtaaa ttctgttatt
gaaaagatga atacacagtt cacagcagta ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga
atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc
gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accacgattc aaatgtgaag
aacttatatg aaaaggtaag aagccagcta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc
tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact
tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaagaaat agatggggta
aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca
ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta
cagtgtagaa tatgtattta a
蛋白质序列(SEQ ID NO:13):
Figure BDA0002313028950000101
(下划线和黑体：E129和K180)
A/Texas/50/2012(H3N2)
核苷酸序列(SEQ ID NO:14):
atgaagacta tcattgcttt gagctacatt ctatgtctgg ttttcgctca aaaacttcct
ggaaatgaca atagcacggc aacgctgtgc cttgggcacc atgcagtacc aaacggaacg
atagtgaaaa caatcacgaa tgaccgaatt gaagttacta atgctactga actggttcag
aattcctcaa taggtgaaat atgcgacagt cctcatcaga tccttgatgg agaaaactgc
acactaatag atgctctatt gggagaccct cagtgtgatg gcttccaaaa taagaaatgg
gacctttttg ttgaacgaag caaagcctac agcaactgtt acccttatga tgtgccggat
tatgcctccc ttaggtcact agttgcctca tccggcacac tggagtttaa caatgaaagc
ttcaattgga atggagtcac tcaaaacgga acaagttctg cttgcataag gagatctaat
aatagtttct ttagtagatt aaattggttg acccacttaa acttcaaata cccagcattg
aacgtgacta tgccaaacaa tgaacaattt gacaaattgt acatttgggg ggttcaccac
ccggttacgg acaaggacca aatcttcctg tatgctcaac catcaggaag aatcacagta
tctaccaaaa gaagccaaca agctgtaatc ccgaatatcg gatttagacc cagaataagg
aataacccta gcagaataag catctattgg acaatagtaa aaccgggaga catacttttg
attaacagca cagggaatct aattgctcct aggggttact tcaaaatacg aagtgggaaa
agctcaataa tgagatcaga tgcacccatt ggcaaatgca agtctgaatg catcactcca
aatggaagca ttcccaatga caaaccattc caaaatgtaa acaggatcac atacggggcc
tgtcccagat atgttaagca aagcactctg aaattggcaa caggaatgcg gaatgtacca
gagaaacaaa ctagaggcat atttggcgca atagcgggtt tcatagaaaa tggttgggag
ggaatggtgg atggttggta cggtttcagg catcaaaatt ctgagggaag aggacaagca
gcagatctca aaagcactca agcagcaatc gatcaaatca atgggaagct gaatcgattg
atcgggaaaa ccaacgagaa attccatcag attgaaaaag aattctcaga agtagaaggg
agaattcagg accttgagaa atatgttgag gacactaaaa tagatctctg gtcatacaac
gcggagcttc ttgttgccct ggagaaccaa catacaattg atctaactga ctcagaaatg
aacaaactgt ttgaaaaaac aaagaagcaa ctgagggaaa atgctgagga tatgggcaat
ggttgtttca aaatatacca caaatgtgac aatgcctgca taggatcaat cagaaatgga
acttatgacc acgatgtata cagagatgaa gcattaaaca accggttcca gatcaaggga
gttgagctga agtcagggta caaagattgg atcctatgga tttcctttgc catatcatgt
tttttgcttt gtgttgcttt gttggggttc atcatgtggg cctgccaaaa gggcaacatt
aggtgcaaca tttgcatttg a
蛋白质序列(SEQ ID NO:15):
MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEVTNATELVQNSSIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWNGVTQNGTSSACIRRSNNSFFSRLNWLTHLNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPVTDKDQIFLYAQPSGRITVSTKRSQQAVIPNIGFRPRIRNNPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
B/Massachusetts/02/2012(B Yamagata谱系)
核苷酸序列(SEQ ID NO:16):
atgaaggcaa taattgtact actaatggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact
gggataacat cttcaaactc acctcatgtg gtcaaaacag ctactcaagg ggaggtcaat
gtgactggtg tgataccact aacaacaaca ccaacaaaat cttattttgc aaatctcaaa
ggaacaaaga ccagagggaa actatgccca gactgtctca actgtacaga tctggatgtg
gccctgggca ggccaatgtg tgtgggaact acaccttctg cgaaagcttc aatacttcac
gaagtcagac ctgttacatc cgggtgcttc cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg
caactagcca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggt tatcaaccca aaacgttatc
gatgcagaaa aggcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac
gctaccagta aaagcggatt tttcgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaacaac
aaaaatgcaa cgaacccatt aacagtagaa gtaccataca tttgtgcaga aggggaagac
caaattactg tttgggggtt ccattcagat gacaaaaccc aaatgaagaa cctctatgga
gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ttatgtttct
cagattggcg gcttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcagaatt
gtcgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta tcaaagaggt
gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtcc
ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc
aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtgaaa
acacctttga agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctgcaaaact attaaaggaa
aggggtttct tcggagctat tgctggtttc ctagaaggag gatgggaagg aatgattgca
ggttggcacg gatacacatc tcacggagca catggagtgg cagttgctgc agaccttaag
agcacacaag aagctataaa caagataaca aaaaatctca actctttgag tgagctagaa
gtaaagaatc ttcaaaggct aagtggtgcc atggatgaac tccacaacga aatactcgag
ctggatgaga aagtggatga cctcagagct gacactataa gttcacaaat agaacttgca
gtcttgcttt ccaacgaagg aataataaac agtgaagacg agcatctatt ggcacttgag
agaaaactaa agaaaatgct gggtccctct gctgtagaca taggaaatgg atgcttcgaa
accaaacaca aatgcaacca gacctgctta gacaggatag ctgctggcac ctttaatgca
ggagagtttt ctctccccac ttttgattca ttgaacatta ctgctgcatc tttaaatgat
gatggattgg ataaccatac tatactgctc tattactcaa ctgctgcttc tagtttggct
gtaacattga tgctagctat ttttattgtt tatatggtct ccagagacaa cgtttcatgc
tccatctgtc tataa
蛋白质序列(SEQ ID NO:17):
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTKTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLANLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICAEGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVSRDNVSCSICL
B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)
核苷酸序列(SEQ ID NO:18):
atgaagg caataattgt actactcatg gtagtaacat ccaatgcaga tcgaatctgcactgggataa
catcgtcaaa ctcaccacat gtcgtcaaaa ctgctactca aggggaggtc aatgtgactggtgtaatacc
actgacaaca acacccacca aatctcattt tgcaaatctc aaaggaacag aaaccagggggaaactatgc
ccaaaatgcc tcaactgcac agatctggac gtagccttgg gcagaccaaa atgcacggggaaaataccct
cggcaagagt ttcaatactc catgaagtca gacctgttac atctgggtgc tttcctataatgcacgacag
aacaaaaatt agacagctgc ctaaccttct ccgaggatac gaacatatca ggttatcaacccataacgtt
atcaatgcag aaaatgcacc aggaggaccc tacaaaattg gaacctcagg gtcttgccctaacattacca
atggaaacgg atttttcgca acaatggctt gggccgtccc aaaaaacgac aaaaacaaaacagcaacaaa
tccattaaca atagaagtac catacatttg tacagaagga gaagaccaaa ttaccgtttgggggttccac
tctgacaacg agacccaaat ggcaaagctc tatggggact caaagcccca gaagttcacctcatctgcca
acggagtgac cacacattac gtttcacaga ttggtggctt cccaaatcaa acagaagacggaggactacc
acaaagtggt agaattgttg ttgattacat ggtgcaaaaa tctgggaaaa caggaacaattacctatcaa
aggggtattt tattgcctca aaaggtgtgg tgcgcaagtg gcaggagcaa ggtaataaaaggatccttgc
ctttaattgg agaagcagat tgcctccacg aaaaatacgg tggattaaac aaaagcaagccttactacac
aggggaacat gcaaaggcca taggaaattg cccaatatgg gtgaaaacac ccttgaagctggccaatgga
accaaatata gacctcctgc aaaactatta aaggaaaggg gtttcttcgg agctattgctggtttcttag
aaggaggatg ggaaggaatg attgcaggtt ggcacggata cacatcccat ggggcacatggagtagcggt
ggcagcagac cttaagagca ctcaagaggc cataaacaag ataacaaaaa atctcaactctttgagtgag
ctggaagtaa agaatcttca aagactaagc ggtgccatgg atgaactcca caacgaaatactagaactag
atgagaaagt ggatgatctc agagctgata caataagctc acaaatagaa ctcgcagtcctgctttccaa
tgaaggaata ataaacagtg aagatgaaca tctcttggcg cttgaaagaa agctgaagaaaatgctgggc
ccctctgctg tagagatagg gaatggatgc tttgaaacca aacacaagtg caaccagacctgtctcgaca
gaatagctgc tggtaccttt gatgcaggag aattttctct ccccaccttt gattcactgaatattactgc
tgcatcttta aatgacgatg gattggataa tcatactata ctgctttact actcaactgctgcctccagt
蛋白质序列(SEQ ID NO:19):
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASS
下面显示了的pH1N1 HA的核苷酸和氨基酸序列。
核苷酸序列(SEQ ID NO:20):
Figure BDA0002313028950000151
Figure BDA0002313028950000161
ORF以下划线标出。
ATG和终止密码子以黑体显示。
氨基酸序列(SEQ ID NO:21):
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPNTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPPTSADQQSLYQNADTYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRGQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
本文公开的抗体(例如，hmAb KPF1)具有针对H1流感分离株的广泛活性以及有效的预防性和治疗性的体内活性，这是由对H1血凝素球形头部中的保守残基的识别所介导的。每种抗体均对流感H1 HA是高度特异性的，和识别除了A/USSR/1977之外的测试的所有H1分离株，这可能是因为这种大范围流行的病毒株的独特的HA结构(KilbourneED.2006.Emerg Infect Dis 12:9-14；和Rozo M et al.,2015.MBio 6)。通过以下在体外证实了诸如KPF1的抗体的高有效性：其中和及HAI活性低于1.0μg/ml(图4)，其在尿素存在下保持与HA结合的能力，以及其高亲和力和亲和性(图2)。几乎没有hmAbs被报道为具有低于1μg/ml的与H1流感类似的体外中和活性(Sparrow E et al.,2016.Vaccines 34:5442-5448；Whittle JR et al.,2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108:14216-14221；KrauseJC et al.,2011.J Virol 85:10905-10908；Ren H et al.,2016.Curr Opin Immunol 42:83-90；Lee PS et al.,2012.Proc Natl Acad Sci U S A 109:17040-17045；Yoshida Ret al.,2009.PLoS Pathog 5:e1000350；Ekiert DC et al.,2012.Nature 489:526-532；和Yu x et al.,2008.Nature 455:532-536)，突出显示了本发明抗体(诸如KPF1)的独特有效性。
本发明抗体(诸如KPF1)的有效活性可延伸到其在体内保护和治疗H1感染的能力(图5和6)。例如，下文中所示的研究中所用的10x MLD50pH1N1攻击剂量比其他人所用的超出2-5倍(Heaton NS et al.,2013.J Virol 87:8272-8281；Wang SF et al.,2016.Dev CompImmunol doi:10.1016/j.dci.2016.10.010；Marjuki H et al.,2016.J Virol 90:10446-10458；Song A et al.,2014.Antiviral Res 111:60-68；DiLillo DJ et al.,2014.NatMed 20:143-151；和Wrammert J et al.,2011.J Exp Med 208:181-193)以评价mAbs针对H1流感的体内活性。使用pH1N1的这种高剂量攻击，1mg/kg本发明的抗体(诸如KPF1)在预防模型中完全保护免受感染(图5)，并且在感染后最晚72h给予10mg/kg的治疗显著增强了存活(图6)。明显地，KPF1能针对多种流感病毒株的致病性攻击进行保护(图5)。抗体用于治疗流感H1感染的真实潜力可能被低估了，因为尚未进一步评价KPF1剂量或治疗延迟。这些结果共同显示了本发明抗体(诸如KPF1)针对H1流感的体外和体内活性迄今尚未被其他mAbs击败。
本发明的抗体(诸如KPF1)识别H1流感病毒株的HA1球形头部中高度保守的新表位(图8)，所述表位依赖于靠近Ca和Cb抗原位点的E129残基(图7)。识别1918和pH1N1 HA1但针对大多数流感H1病毒株具有有限活性的hmAb 2D1识别中心在Sa(其包含K180)上的表位(XuR et al.,2010.Science 328:357-360)，并且被选择用于该残基处的逃逸突变株(KrauseJC et al.,2010.J Virol 84:3127-3130)。未有报道称2D1与E129相互作用，显示了本发明抗体(诸如KPF1)所识别的精确表位不同于2D1。从pH1N1免疫小鼠生成的mAb GC0587是H1-特异性的，并且识别包含E129和K180残基的表位(Cho KJ et al.,2014.PLoS One 9:e89803)。然而，与本发明抗体(诸如KPF1)不同，其缺乏对1918H1的反应性(Cho KJ et al.,2014.PLoS One 9:e89803)，表明两个mAbs所识别的表位不完全一致。尽管病毒中和被认为是H1特异性Ab的主要保护功能，H1特异性Abs实质性有助于Fc-介导的病毒清除机制[诸如Ab-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)]的能力仍然是可能的(DiLillo DJ et al.,2014.Nat Med 20:143-151；Chai N et al.,2017.Nat Commun 8:14234；和Srivastava V et al.,2013.J Virol 87:5831-5840)。有趣地，E129残基位于先前描绘的ADCC表位中(Srivastava V et al.,2013.J Virol 87:5831-5840)，表明对本发明抗体的Fc-介导的活性的评价是有保证的。总体上，这些结果显示，本发明抗体的表位识别在H1病毒株中是广泛保守的，并且该表位的识别能够介导中和HAI，以及潜在地介导ADCC活性。寻求表位的进一步分辨及其作为免疫原诱导对H1流感的广泛保护的潜力。
本发明抗体(诸如KPF1)的体外和体内活性特性以及E129氨基酸保守性显示了其具有治疗和预防H1流感感染的治疗价值。尽管已经鉴定了若干具有针对多种流感类型和亚型的广泛中和活性的靶向HA茎部表位的hmAbs，其有效性通常低于靶向HA球形头部的hmAbs，并且其临床功效尚未确定。在历史上，引起大范围流行的流感病毒具有亚型(例如，H1N1、H2N2或H3N2)特异性，因此具有更有效的球形头部广泛中和抗体而不是特异性较低且效价较低的中和茎部反应性抗体代表了大流行防范的更好方法。因此，多种高亲和力的类型特异性hmAbs(包括本发明的抗体，诸如KPF1)的混合物(其通过识别数个表位而共同赋予了广泛性宽度和保护)可做种作为流感感染的有效临床疗法。
片段
在某些实施方式中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段以及下文中描述的片段，例如，双链抗体、三链抗体、四链抗体和单结构域抗体。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthun,in The Pharmacology ofMonoclonal抗体,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York)，pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。
双链抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。在Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)中还描述了三链抗体和四链抗体。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变区或者全部或部分轻链可变区的抗体片段。在某些实施方式中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见，例如，美国专利6,248,516)。
抗体片段可通过多种技术制成，包括但不限于完整抗体的蛋白质消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中所述。
嵌合和人源化抗体
在某些实施方式中，本文提供的抗体是嵌合抗体。在例如美国专利4,816,567和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中描述了某些嵌合抗体。在一个实例中，嵌合抗体包含非-人可变区[例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴子)]和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是"类别转换"抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方式中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非-人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和性。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs(例如，CDRs(或其部分)来源于非-人抗体且FRs(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体将任选还包含至少部分人恒定区。在一些实施方式中，人源化抗体中的一些FR残基被来源于非人抗体的相应残基置换(例如，HVR残基的来源抗体)，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并在例如以下文献中进一步描述：Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了"表面重设")；Dall'Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(描述了"FR"重排)；以及Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)和Klimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了对FR重排的"导向选择"方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”法选择的框架区(参见，例如，Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；来源于特定轻链或重链可变区亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人谱系框架区(参见，例如，Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosoket al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
人抗体
在某些实施方式中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术或使用本文所述技术生产。人抗体通常在以下中描述：van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)，和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应于免疫原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述人免疫球蛋白基因座置换了内源性免疫球蛋白基因座或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，美国专利6,075,181和6,150,584，其描述了XENO小鼠技术；美国专利5,770,429，其描述了HUMAB技术；美国专利7,041,870，其描述了K-M小鼠技术；以及美国专利申请公布US 2007/0061900，其描述了VE基因座小鼠技术)。可例如通过与不同的人恒定区结合来进一步修饰来自由这种动物产生的完整抗体的人可变区。
还可通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner et al.,J.Immunol.,147：86(1991))。经由人B-细胞杂交瘤技术生产的人抗体也在Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中描述。其他方法包括在例如以下中描述的那些：美国专利7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Trioma技术)还在如下中描述：Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)，以及Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体。随后可将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域结合。从抗体文库选择人抗体的技术在下文中描述。
可通过筛选组合组合文库中具有所需活性或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，在本发明中已知多种用于产生噬菌体展示文库和筛选这种文库中具有所需结合特性的抗体的方法。这种方法在例如以下中综述：Hoogenboom等in Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)，并在例如以下中进一步描述：McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks andBradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004).
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL的所有组成部分，并在噬菌体文库中随机重组，随后在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体，如Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自经免疫来源的文库提供了免疫原的高-亲和力抗体而无需构建杂交瘤。可替代地，可对未免疫组成部分
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repertoire)进行克隆(例如，从人类)，从而为多种非自身抗原也为自身抗原提供单一抗体来源，而无需进行任何免疫，如Griffiths et al.,EMBO J,12：725-734(1993)所述。最后，还可通过从干细胞克隆未重排V基因片段和使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区域并完成体外重排来合成天然文库，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)。描述了人抗体噬菌体文库的专利公布包括，例如：美国专利5,750,373和美国专利公开2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中称为人抗体或人抗体片段。
变体
在某些实施方式中，设想了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。可通过向编码抗体的核苷酸序列中引入合适的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或置换。可进行缺失、插入和置换的任何结合以得到最终构建物，条件是最终构建物具有所需的特性，例如，抗原结合性。
置换、插入和缺失变体
在某些实施方式中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换突变的感兴趣的位点包括HVRs和FRs。在本文中定义了保守性置换。可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中并筛选具有所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合性，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
因此，本发明的抗体可包含本文所述的CDRs、重链可变区或轻链可变区(例如，SEQID NOs:1-8)的一个或多个保守性修饰。本文中所公开的肽、多肽或蛋白质的保守性修饰或功能等价物是指肽、多肽或蛋白质的多肽衍生物，例如，具有一个或多个点突变、插入、缺失、截断的蛋白，融合蛋白，或其组合。其显著保持了亲本肽、多肽或蛋白质(诸如，本发明中公开的那些)的活性。通常，保守性修饰或功能性等价物至少60％(例如，60％和100％(含)之间的任何数字，例如，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，和99％)相同于亲本(例如，SEQ ID NOs:1-8之一)。因此，本发明范围内可包括具有一个或多个点突变、插入、缺失、截断的重链可变区或轻链可变区或融合蛋白或其组合，以及具有变体区域的抗体。
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数x 100)，考虑了需要引入以得到两个序列的最佳比对的空位数和每个空位的长度。可使用数学算法来实现序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定，如同下文中的非限制性实例中所述。
可使用E.Meyers and W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120残基权重表，空位长度补偿为12，空位补偿为4。此外，可使用Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已被合并到GCG软件包(可在www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外地或可选地，本发明的蛋白质序列可进一步用作"查询序列"以针对公众数据库进行检索，从而，例如，鉴定相关序列。此类检索可使用Altschul,et al.,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST蛋白检索可使用XBLAST程序进行，分数＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可如Altschul et al.,(1997)Necleic Acid Res.25(17):3389-3402中所述使用空位BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序的(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所用，术语"保守性修饰"是指不会明显影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸置换、插入和缺失。可通过本领域中已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体中，诸如定点突变和PCR-介导的突变。保守性氨基酸置换是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括：
具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，
具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，
具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，
具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，
具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，和
具有芳香性侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
非-保守性置换将需要将这些类别之一的成员变为另一个类别。
示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，其可方便地例如使用基于噬菌体展示的突变技术来生成，诸如，例如，Hoogenboom等在Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,(2001)中所述的那些。氨基酸序列插入包括在一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端融合至增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽。
糖基化变体
在某些实施方式中，将本文提供的抗体改变以增加或减少抗体的糖基化程度。可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现抗体的糖基化位点添加或缺失。
例如，可制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。可通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来实现此类糖修饰。例如，可进行一个或多个导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点的氨基酸置换，从而消除该位点的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在Co et al的美国专利5,714,350和6,350,861中进一步详细描述了这种方法。
可通过将N297残基突变为另一个残基(例如N297A)和/或通过使相邻的氨基酸(例如298)突变来防止N297上恒定区的糖基化，从而减少N297上的糖基化。
另外地或可替代地，可制备具有不同糖基化类型的抗体，例如岩藻糖基残基量减少的次岩藻糖基化抗体或二等分GlcNac结构增加的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现这种糖修饰。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述，并且可用作在其中表达本文所述重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。例如，Hanai等的EP1,176,195。美国专利5,775,573描述了具有功能性被破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO03/035835描述了一种变体CHO细胞系Led 3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的糖的能力降低，还导致该宿主细胞中表达的抗体的岩藻糖基化(另见Shields,R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公开WO 99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，从而导致抗体的ADCC活性增加(也参见Umanaet al.(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
Fc区变体
本文所述抗体的可变区可连接(例如，共价连接或融合)至Fc，例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc，其可为任何同种异型或异同种异型，例如，对于IgGl：G1m，G1m1(a)，G1m2(x)，G1m3(f)，G1m17(z)；对于IgG2：G2m，G2m23(n)；对于IgG3：G3m，G3m21(gl)，G3m28(g5)，G3m11(b0)，G3m5(b1)，G3m13(b3)，G3m14(b4)，G3m10(b5)，G3m15(s)，G3m16(t)，G3m6(c3)，G3m24(c5)，G3m26(u)，G3m27(v)；和对于K：Km，Km1，Km2，Km3(参见，例如，Jefferies etal.,(2009)mAbs 1:1)。在某些实施方式中，将本文所述的抗体可变区连接到结合至一个或多个激活性Fc受体(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)的Fc，从而刺激ADCC，并且可能导致T细胞衰竭。在某些实施方式中，将本文所述的抗体可变区连接至导致衰竭的Fc。
在某些实施方式中，本文所述的抗体可变区可被连接至包含一种或多种修饰的Fc，所述修饰通常改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本文所述的抗体可被化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分连接至抗体)，或可被修饰以改变其糖基化，从而改变抗体的一个或多个功能特性。Fc区中的残基编号是Kabat的EU索引编号。
Fc区包含来源于免疫球蛋白(优选人免疫球蛋白)的恒定区的结构域，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其他类别，例如IgA、IgD、IgE和IgM。免疫球蛋白的恒定区被定义为与免疫球蛋白C末端区同源的天然存在或合成产生的多肽，并且可单独地或组合地包括CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域。在一些实施方式中，本发明的抗体具有不同于野生型IgA1的Fc区。抗体可以具有来自IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或其他类别如IgA2、IgD、IgE和IgM的Fc区。Fc可以是IgA1的突变形式。
免疫球蛋白的恒定区负责许多重要的抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合和补体固定。有五种主要类别的重链恒定区，分类为IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，各自具有由同种型确定的特征性效应子功能。例如，IgG分为四个子类，分别称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
Ig分子与多种细胞受体相互作用。例如，IgG分子与对IgG类抗体有特异性的三类Fcγ受体(FcγR)相互作用，即FcγRI、FcγRII和FcγRIII。据报道，IgG与FcγR受体结合的重要序列位于CH2和CH3结构域中。抗体的血清半衰期受该抗体与Fc受体(FcR)结合的能力的影响。
在某些实施方式中，Fc区是变体Fc区，例如相对于亲本Fc序列(例如，未修饰的Fc多肽，其随后被修饰以产生变体)已进行修饰(例如，通过氨基酸置换、缺失和/或插入)以提供所需的结构特征和/或生物学活性的Fc序列。例如，可在Fc区进行修饰以产生Fc变体，其中(a)增加或减少了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加或减少了补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)相对于亲本Fc，对Clq的亲和力增加或减少，和/或(d)对Fc受体的亲和力增加或降低。此类Fc区变体通常将在Fc区中包含至少一种氨基酸修饰。结合氨基酸修饰被认为是特别期望的。例如，变体Fc区可在其中包括两个、三个、四个、五个置换et al.,例如在本文所鉴定的特定Fc区位置处。
变体Fc区还可包括如下序列变化：其中将参与二硫键形成的氨基酸去除或替换为其他氨基酸。此类去除可避免与用于产生本文所述抗体的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸的蛋白质反应。甚至当去除了半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍然能形成非共价地保持在一起的二嵌体Fc结构域。在其他实施方式中，可对Fc区进行修饰以使其与所选择的宿主细胞更相容。例如，可去除典型天然Fc区的N-末端附近的PA序列，其可通过大肠杆菌中的消化酶(诸如脯氨酸亚氨基肽酶)来识别。在其他实施方式中，可去除Fc结构域内的一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可赋予溶细胞反应。可使此类残基确实或用未糖基化的残基(例如，丙氨酸)替换。在其他实施方式中，可从Fc去去除涉及与补体相互作用的位点(诸如Clq结合位点)。例如，可缺失或置换人IgG1的EKK序列。在某些实施方式中，可去除影响与Fc受体结合的位点，优选非补救受体结合位点的位点。在其他实施方式中，可修饰Fc区以去除ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的；参见，例如，Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)，设计IgG1中的ADCC位点。变体Fc结构域的具体实例在例如WO 97/34631和WO 96/32478中公开。
在一个实施方式中，修饰Fc的铰链区，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。Bodmer等的美国专利5,677,425中进一步描述了这种方法。改变Fc的铰链区中的半胱氨酸残基的数目以例如有利于轻链和重链的组装或者有利于增加或降低抗体的稳定性。在一个实施方式中，使抗体的Fc铰链区突变以减少抗体的生物学半衰期。更具体地，将一种或多种氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得相对于天然Fc-铰链域SpA结合，抗体的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合受损。这种方法在Ward等的美国专利6,165,745中有更详细的描述。
在其他实施方式中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可用不同的氨基酸替换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或者补体的CI成分。该方法在Winter等的美国专利5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。
在另一个实例中，可用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，以使抗体具有改变的C1q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在Idusogie等的美国专利6,194,551中有更详细的描述。
在另一实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。Bodmer等的PCT公开WO 94/29351中进一步描述了这种方法。
在又一个实例中，可以通过修饰以下位置的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性置换包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F7324T。用于增强FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于置换298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。这些和其他修饰在Strohl，2009，Current Opinion in Biotechnology 20：685-691中综述。
增加与Fcγ受体结合的Fc修饰包括在Fc区的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439中的任何一个或多个处的氨基酸修饰，其中Fc区中的残基编号是abat中的EU索引中的编号(WO00/42072)。
可以对Fcs进行的其他Fc修饰是用于减少或消除与FcγR和/或补体蛋白的结合从而减少或消除Fc介导的效应子功能(例如ADCC、ADCP和CDC)的那些修饰。示例性修饰包括但不限于在位置234、235、236、237、267、269、325和328的置换、插入和缺失，其中编号是根据EU索引。示例性置换包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R，其中编号是根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于减少FcγR和补体相互作用的其他修饰包括置换297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V，以及通过突变或酶促方式或通过在不糖基化蛋白质的生物体(诸如细菌)中生产来去除位置297处的糖基化。这些和其他修饰在Strohl，2009，Current Opinionin Biotechnology 20：685-691中进行了综述。
任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的额外和/或可替代的位置处包含非天然存在的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,624,821；6,277,375；6,737,056；6,194,551；7,317,091；8,101,720；WO00/42072；WO01/58957；WO02/06919；WO04/016750；WO04/029207；WO04/035752；WO04/074455；WO04/099249；WO04/063351；WO05/070963；WO05/040217；WO05/092925和WO06/020114)。
还可使用增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体。此类变体可提供具有与FcγRIIb细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白。在一个实施方式中，相对于一种或多种激活受体，Fc变体选择性地提供了对FcγRIIb的增强的亲和力。改变与FcγRIIb的结合的FcγRllb包括在选自下组的位置处的一个或多个修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332，根据EU索引。增强FcγRIIb亲和力的示例性置换包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性置换包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。增强与FcγRIIb的结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
Fc区与其配体的亲和力和结合特性可通过本领域已知的多种体外测定反复(生物化学或免疫类测定法)来测定，包括但不限于，平衡方法(例如，酶联免疫吸附检定法(ELISA)或放射免疫检定法(RIA))或动力学(例如，BIACORE分析)和其他方法，诸如间接结合检定法、竞争性抑制检定法、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其他方法可利用位于一个或多个要被检测的组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可见：Paul,W.E.,ed.,Fundamental immunology,4th Ed.,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其聚焦于抗体-免疫原相互作用。
在某些实施方式中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。有许多方法可用。例如，可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来实现这点。例如，可使以下残基中的一个或多个突变：252、254、256、433、435、436，如美国专利6,277,375中所述。具体的示例性置换包括以下中的一个或多个：T252L、T254S和/或T256F。可替代地，为增加生物学半衰期，可改变抗体的CH1或CL区以包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环(loops)中获取的补救受体结合表位，如Presta等的美国专利5,869,046和6,121,022中所述。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学特性的其他示例性变体包括在位置259、308、428和434处的置换，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton et al.,2004,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton et al.,2006Journal of Immunology 176:346-356)，256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields et al.,Journal ofBiological Chemistry,2001,276(9):6591-6604)，252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、4331、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua et al.,Journal ofImmunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua et al.,2006,Journal of BiologicalChemistry 281:23514-23524)。调节FcRn结合的其他修饰在Yeung et al.,2010,JImmunol,182:7663-7671中描述。在某些实施方式中，可使用具有特定生物学特性的杂合IgG同种型。例如，可通过在两个同种型的区别位置处用来自IgG3的氨基酸置换CH2和/或CH3区中的IgG1位置来构建IgGl/IgG3杂合变体。因此，可构建包含例如以下的一个或多个置换的杂合变体IgG抗体：例如，274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R和436F。在本文所述的其他实施方式中，可通过在两个同种型的区别位置处用来自IgG1的氨基酸置换CH2和/或CH3区中IgG2位置来构建IgGl/IgG2杂合变体。因此，可构建包含一个或多个置换、例如氨基酸置换中的一个或多个的杂合变体IgG抗体：233E、234L、235L、-236G(指在位置236处插入甘氨酸)和321h。
此外，已经定位了人IgG1上与FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields，RL等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示了位置256、290、298、333、334和339处的特定突变可改善与FcγRIII的结合。此外，显示了以下组合突变体可改善FcγRIII的结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A，已显示它们表现出增强的FcγRIIIa结合和ADCC活性(Shields et al.,2001)。已鉴定出与FcγRIIIa结合显著增强的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E和S239D/I332E/A330L突变的变体，这些变体显示出对FcγRIIIa的亲和力最大增加、FcγRIIb结合的减少以及在食蟹猴中的强细胞毒性活性(Lazar et al.,2006)。向诸如阿仑单抗(CD52特异性)、曲妥珠单抗(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(CD20特异性)和西妥昔单抗(EGFR特异性)的抗体中引入三重突变转化为体外ADCC活性的显著增强，并且S239D/I332E变体显示出使猴子的B细胞耗竭的增强能力(Lazar et al.,2006)。此外，在B细胞恶性肿瘤和乳腺癌模型中，已鉴定出含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgG1突变体，这些突变体在表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中显示出与FcγRIIIa的结合增强，并同时增强ADCC活性(Stavenhagen et al.,2007；Nordstrom et al.,2011)。可以使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L和M428L/N434S。在某些实施方式中，选择与FcγRs的结合减少的Fc。具有减少的FcγR结合的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下三个氨基酸置换：L234A、L235E和G237A。
在某些实施方式中，选择补体固定减少的Fc。补体固定减少的示例性Fc(例如IgG1Fc)具有以下两个氨基酸置换：A330S和P331S。
在某些实施方式中，选择基本上不具有效应子功能的Fc，即，其与FcγR的结合减少并且补体固定减少。无效应的示例性Fc(例如IgG1Fc)包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。
当使用IgG4恒定结构域时，通常优选包括置换S228P，其模拟IgG1中的铰链序列并由此稳定IgG4分子。
抗体衍生物
本文提供的抗体可被进一步修饰为包含额外的非蛋白质分子部分，其在本领域中是已知和容易获得的。适合用于抗体衍生化的分子部分包括但不限于水溶性聚合物。
水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧五环，聚-1,3,6-三氧杂环己烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规聚合物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于聚乙二醇丙醛在水中的稳定性，其在生产方面可能具有优势。聚合物可为任何分子量，并且可为分枝或无分枝的。连接到抗体的聚合物的数量可变，并且如果连接了多于一个聚合物，其可为相同或不同的分子。用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可根据包括但不限于以下的考虑来确定：要被改善的抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于规定条件下的治疗等。
在另一个实施方式中，可提供抗体和非蛋白质分子部分的缀合物，所述缀合物可通过暴露于辐照而被选择性地加热。在一个实施方式中，非蛋白质分子部分是碳纳米管(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐照可为任何波长，并且包括但不限于不会伤害普通细胞但将非蛋白质分子部分加热到杀死邻近该抗体-非蛋白质分子部分的细胞的温度。
本文所述抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可将抗体聚乙二醇化以，例如，增加抗体的生物学(例如，血清)半衰期。为聚乙二醇化抗体，通常将抗体或其片段在其中一个或多个PEG基团变得连接到抗体或抗体片段的条件下与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用，术语"聚乙二醇"旨在涵盖已被用于衍生化其它蛋白的任何形式的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，要被聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可用于本文所述抗体。参见，例如，Nishimura等的EP0154316和Ishikawa等的EP0401384。
本发明还包含了与治疗剂、聚合物、可检测标记或酶缀合的本文所述的人单克隆抗体。在一个实施方式中，治疗剂是细胞毒性剂。在一个实施方式中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。
生产方法
可使用方法和组合物来生产重组抗体，例如，如美国专利4,816,567中所述。在一个实施方式中，提供了编码本文所述的抗血凝素抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在进一步的实施方式中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方式中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方式中，宿主细胞包含以下(例如，已经用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列；或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码抗体的VL的氨基酸序列的核酸，并且所述第二载体包含编码抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方式中，宿主细胞是真核生物(例如，中国仓鼠卵巢(CHO))细胞或或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方式中，提供了制备抗血凝素抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗体并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体的条件下培养如上所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞。
对于抗血凝素抗体的重组生产，例如如上所述的编码抗体的核酸被分离和被插入到一个或多个抗体中以便进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此类核酸可以是容易分离的，并且可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合到编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)测序。
适合于编码抗体的载体的克隆或表达的宿主细胞包括本文所述的原核生物或真核生物细胞。例如，抗体可在细菌中制备，特别是当不需要糖基化和和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利5,648,237,5,789,199和5,840,523。(也见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,N.J.,2003)，pp.245-254，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达之后，可从细菌细胞糊中分离可溶级份的抗体，并且可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母菌)也是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”导致产生具有部分或完全的人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Liet al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是：用SV40(COS-7)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(例如在Graham et al.,J.Gen Virol.36：59(1977)中描述的293或293细胞(293或293细胞))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠赛尔托利氏细胞(例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather et al.,Annals NY Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。对于某些适合于抗体生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki and Wu,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.),pp.255-268(2003)。
组合物和制剂
本发明的抗体代表了抗病毒疗法的开发的极好方式，所述抗病毒疗法可单独或与另外的抗IAV抗体一起用于用于治疗人的人流感感染。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的本发明的抗体。该组合物可任选地包含一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或治疗剂。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗病毒剂或疫苗等以联合疗法的形式施用。在某些实施方式中，组合物包含抗HA抗体，其浓度至少为1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml。
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适的赋形剂的选择和使用在Gennaro,ed.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中教导，其公开内容通过引用并入本文。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物包被在一种材料中以保护其免受酸和可能使其失活的其他自然条件的作用。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本文所述的本发明的抗体可以通过非肠胃外途径(例如局部、表皮或粘膜途径)施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。
本发明的药物组合物可以是可药用盐的形式。“可药用盐”是指保留母体化合物所需的生物学活性并且不产生任何不希望的毒理作用的盐。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的那些(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及衍生自无毒有机酸的那些(诸如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的那些，以及衍生自无毒有机胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本发明的药物组合物可以是无菌水溶液或分散液的形式。也可以将其配制成适合高药物浓度的微乳剂、脂质体或其他有序结构。
本文所述的本发明的抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下，需要较少的施用频率。剂量和频率取决于患者体内抗体的半衰期。通常，人抗体显示最长的半衰期，其后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而不同。在预防性应用中，在长时间内以相对不频繁的间隔给予相对低的剂量。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔服用相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以对患者施用预防性方案。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化，并且通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之一百的情况下，该量可在如下范围内：活性成分与药学上可接受的载体的组合的约0.01％至约99％，优选约0.1％至约70％，最优选为约1％至约30％。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。为易于施用和剂量均一，特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物。如本文所用，剂量单位形式是指适合用于要被治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算会产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。可替代地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下，需要较不频繁地施用。对于抗体的施用，剂量在如下范围内：宿主体重的约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重，1mg/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每月一次，每三个月一次或每三到六个月一次施用。本发明抗HA抗体的优选剂量方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下施用方案之一给予抗体：(i)每四周一次给予六个剂量，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)一次给予3mg/kg体重，然后每三周给予1mg/kg体重。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中，达到约25-300μg/ml。本发明的抗HA抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度降低，疾病无症状时期的频率和持续时间的增加，或预防由疾病痛苦引起的损害或失能。例如，为治疗受试者的IAV感染，“治疗有效剂量”优选相对于未治疗的受试者使IAV病毒复制或被宿主细胞摄取抑制至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，仍然更优选至少约80％。治疗有效量的治疗化合物可以中和IAV病毒，或改善受试者的症状，所述受试者通常是人或可以是另一种哺乳动物。药物组合物可以是控制释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可通过诸如以下的医疗装置来施用治疗组合物：(1)无针皮下注射装置(例如，US5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(US 4,487,603)；(3)透皮装置(US 4,486,194)；(4)输注设备(US 4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透装置(US 4,439,196和4,475,196)；它们的公开内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，本文所述的本发明的人单克隆抗体可被配置为确保体内的适当分布。例如，为确保本发明的治疗性化合物越过血脑屏障，可将其配制为可额外包含增强对特定细胞或器官的选择性输送的靶向分子部分的脂质体。参见，例如，US 4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)/.Clin.Pharmacol.29:685；Umezawaet al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman et al.,(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais et al.,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180；Briscoeet al.,(1995)Am./.Physiol.1233:134；Schreier et al.,(1994)/.Biol.Chem.269:9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；and Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
用途和方法
目前用于流感的抗病毒治疗(例如，奥司他韦/达菲，金刚烷胺/金刚乙胺)较不理想，耐药性发生率上升并且治疗窗口有限(必须在症状发作之后<48小时开始)(BeigelJ.et al.,2008.Antiviral Res 78:91-102；Garcia-Sastre A.2006.Emerg Infect Dis12:44-47；和Marathe BM et al.,2016.Sci Rep 6:26742)。单克隆抗体继续成为药物的增长类别，这可部分归因于其高度特异性、有限的脱靶作用和极好的安全性特性。本文所述抗体、组合物和制剂可以用于中和流感病毒，从而治疗流感感染。
因此，在一个方面，本文所述的抗-HA抗体可用于中和IAV病毒。可经由以下来实现IAV病毒的中和：(i)抑制IAV病毒结合到靶细胞；(ii)抑制靶细胞的IAV病毒摄取；(iii)抑制IAV病毒复制；和(iv)抑制感染细胞释放IAV病毒粒子。本领域技术人员有能力进行任何评估IAV病毒中和的测定方法。值得注意的是，抗体的中和特性可通过多种测试来评估，它们全都可以评估以下的结果：(i)抑制IAV病毒结合到靶细胞；(ii)抑制靶细胞的IAV病毒摄取；(iii)抑制IAV病毒复制；和(iv)抑制感染细胞释放IAV病毒粒子。换言之，进行不同的测试可导致观察到相同的结果，即，IAV病毒感染性的丧失。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种中和受试者的IAV病毒的方法，包括对受试者施用治疗有效量的本文所述的本发明的抗体。
本发明的另一方面提供了一种治疗IAV相关疾病的方法。此类方法包括治疗性(IAV感染后)和预防性(IAV暴露、感染或病理之前)。例如，治疗个体的IAV感染的治疗性和预防性方法包括治疗有患IAV感染或病理的风险或者处于患IAV感染或病理的风险中的个体，治疗患有IAV感染的个体，以及保护个体免受IAV感染以减少或降低个体的IAV感染的可能性、减少或降低个体对IAV感染的易感性或者抑制或预防个体的IAV感染以及减少、降低、抑制或压制IAV从感染个体传播到未感染个体的方法。此类方法包括施用本发明的抗体或包含本文公开的抗体的组合物以治疗性或预防性地治疗(接种或免疫)患有IAV感染或病理的个体。因此，方法可以治疗IAV感染或病理，或为个体提供免受感染的保护(例如预防性保护)。
在一个实施方式中，治疗IAV-相关疾病的方法包括对需要其的个体施用本文所公开的抗-HA抗体或治疗组合物，其量足以减少与IAV感染或病理相关的一种或多种病理学状况或症状，从而治疗IAV-相关的疾病。
在一个实施方式中，本文中公开的抗-HA抗体或治疗组合物用于治疗IAV-相关疾病。使用本文所述抗-HA抗体或治疗组合物通过减少与IAV感染或病理相关的一种或多种病理学状况或症状来治疗IAV-相关疾病。在该实施方式的一个方面，本文所述的抗-HA或治疗组合物以足以减少与IAV感染或病理相关的一种或多种病理学状况或症状的量施用，从而治疗基于IAV的疾病。在该实施方面的其它方面，本文所公开的抗-HA抗体或治疗组合物以足以增加、诱导、增强、增大、促进或刺激IAV清除或去除；或者减少、降低、抑制、压制、防止、控制或限制IAV传播到另一个体的量施用。
与IAV感染或病理相关的一种或多种病理学状况或症状将响应于本文所公开的治疗方法。IAV感染或病理的症状将取决于感染阶段而不同。
在本发明的另一方面，本文所述的抗-HA抗体可用于多种检测方法中，所述检测方法用于，例如，监测IAV感染的进展；监测针对此类感染的治疗的患者反应等。本公开提供了检测由个体获得的生物学样品中的HA多肽的方法。该方法通常涉及：a)将生物学样品接触主题抗-HA抗体；和b)检测抗体是否与样品中存在的表位结合(如果有的话)。在一些情况中，抗体包含可检测标记。在生物学样品中检测到的HA多肽的水平可提供IAV感染阶段、程度或严重性的指征。在生物学样品中检测到的HA多肽的水平可提供对IAV感染治疗的个体反应的指征。
本文所述抗体可与一种或多种其它抗-流感病毒抗体共同用于中和流感病毒从而治疗流感感染。
对于这点，有几种其它人mAbs具有中和多种流感病毒株的能力。这些均靶向病毒粒子表面上表达的HA蛋白，并且包括，例如，hmAbs，诸如1F1(Tsibane T et al.,2012.PLoSPathog 8:e1003067)和CH65(Whittle JR et al.,2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108:14216-14221)，其结合多种H1分离株；hmAbs，诸如F10(Sui J et al.,Hwang等2009.NatStruct Mol Biol 16:265-273)和CR6261(Ekiert DC et al.,2009.Science 324:246-251)，其识别所有第1组病毒；hmAbs 3I14(Fu Y et al.,2016.Nat Commun 7:12780)，FI6/MEDI8852(Corti D et al.,2011.Science 333:850-856；和Kallewaard NL et al.,2016.Cells 166:596-608)和VS140(Tharakaraman K et al.,2015.Proc Natl Acad SciU S A 112:10890-10895)，其各自识别第1组(例如，H1、H2、H5)和第2组(例如，H3、H7)病毒；或hmAb CR9114(Dreyfus C et al.,2012.Science 337:1343-1348)，其识别甲型和乙型病毒。这些hmAbs中有几种现在处于临床实验中，此外它们的表征已导致鉴定出流感HA中的保守性表位，这作为开发通用型流感疫苗和/或治疗剂的靶点可能是有价值的。具有最大广度的mAbs始终靶向HA茎部区域，而靶向HA的球形头部的那些经常仅局限于亚型-特异性的广度(Laursen NS et al.,2013.Antiviral Res 98:476-483；Neu KE et al.,2016.CurrOpin Immunol 42:48-55；和Margine I et al.,2013.J Virol 87:10435-10446)。尽管HA茎部-特异性的mAbs具有更广泛的反应性，其效能却有很大限制。因此，本发明的广泛反应性和高有效性的HA球形头部-特异性的抗体具有更大的临床可行性。
定义
本文所提到的术语"抗体"包括完整抗体和及其任何抗原结合片段或单链。完整抗体是包含通过二硫键中间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(在本文中简称VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为多个高可变区(名为互补决定区(CDR))，其间穿插着名为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDRs和四个FRs组成，其从氨基末端到羧基末端以如下顺序排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链可变区CDRs和FRs是HFRl、HCDRl、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、HFR4。轻链可变区CDRs和FRs是LFRl、LCDRl、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、LFR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合到宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应子细胞)和经典互补系统的第一组件(CIq)。
如本文所用，术语抗体的"抗原结合片段或部分"(或简单地，"抗体片段或部分")，是指保留了与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段(例如，甲型流感病毒的HA)。已证实抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合片段或部分”中所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab'片段，其本质上是具有部分铰链区的Fab(参见，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul ed.,3rd ed.1993))；(iv)Fd片段，其由VH和CHI结构域组成；(v)Fv片段，其由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成，(vi)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，其是包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过单独的基因编码，但可使用重组方法通过合成连接基团能将它们接合起来，这使得它们可作为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链来制备(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Birdet al.,(1988)Science 242:423-426；和Huston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在包含在术语抗体的"抗原结合片段或部分"中。使用本领域技术人员抑制的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的可用性。
如本文所用，"分离的抗体"旨在表示基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合至甲型流感病毒的HA的分离的抗体基本不含特异性结合到非HA的抗原的抗体)。分离的抗体可基本不含其他细胞物质和/或化学品。
如本文所用，术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"是指单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物展示了单一结合特异性和对于特定表位的亲和力。
术语"人抗体"旨在包含具有其中框架区和CDR区均来源于人谱系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也来源于人谱系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人谱系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或定点突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语"人抗体"并不意图包含其中已将来源于另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的谱系的CDR序列接枝到人框架序列上的抗体。
术语"人单克隆抗体"是指具有来源于人谱系免疫球蛋白序列的框架区和CDR区的可变区的展示单一结合特异性的抗体。在一个实施方式中，可通过包含从具有包含融合至永生化细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞的杂交瘤来生产人单克隆抗体。
如本文所用，术语"重组人抗体"包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体：所述重组方式诸如，(a)从针对人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体(如以下进一步描述)，(b)从被转化以表达人抗体(例如从转染瘤表达)的宿主细胞中分离抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过设计将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有其中框架区和CDR区均来源于人谱系免疫球蛋白序列的可变区。在某些实施方式中，然而，此类重组人抗体可经历体外突变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，经历体内体细胞突变)，因此尽管来源于从人谱系VH和VL序列时，但重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可能并非天然存在于体内人抗体谱系库中。
术语"同种型"是指通过重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。短语"识别抗原的抗体"和"对抗原具有特异性的抗体"在本文中可与"特异性结合至抗原的抗体"互换使用。
术语"人抗体衍生物"是指任何修饰形式的人抗体，例如，抗体与另一种试剂或抗体的缀合物。术语"人源化抗体"旨在表示其中已将来源于另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的谱系的CDR序列接枝到人框架序列上的抗体。可在人框架序列中进行额外的框架区修饰。
术语"嵌合抗体"旨在表示其中可变区序列来源于一个物种且恒定区序列来源于另一物种的抗体，诸如其中可变区序列来源于小鼠抗体且恒定区序列来源于人抗体的抗体。术语还可表示其中其可变区序列或CDR(s)来源于一个来源(例如，IgA1抗体)并且恒定区序列或Fc来源于不同来源(例如，不同抗体，诸如IgG、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体)的抗体。
如本文所用，术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)与其结合伙伴(例如，抗原)的单个结合位点之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，"结合亲和力"是指结合对(例如，抗体和抗原)成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X与其伙伴Y的亲和力通常可通过解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的普通方法来测量，包括本文所述那些。
如本文所用，"特异性结合至甲型流感病毒的HA"的抗体是指结合至甲型流感病毒的HA但基本不与非甲型流感病毒HA结合的抗体。类似地，“特异性结合至甲型流感病毒H1亚型的”是指结合至甲型流感病毒H1亚型的HA但基本不与甲型流感病毒其它亚型的HA结合的抗体。
优选以“高亲和力”结合至HA的抗体，即，具有如下的KD：1x 10-7M或更低，更优选5x10-8M或更低，更优选3x 10-8M或更低，更优选1x 10-8M或更低，更优选5x 10-9M或更低，或者甚至更优选1x 10-9M或更低。如本文所用，术语"基本不与蛋白质或细胞结合"表示不结合或不以高亲和力结合至蛋白质或细胞，即，以如下的KD结合至蛋白质或细胞：1x 10-6M或更高，更优选1x 10-5M或更高，更优选1x 10-4M或更高，更优选1x 10-3M或更高，甚至更优选1x 10- 2M或更高。
如本文所用，术语"Kassoc"或"Ka"旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语"Kdis"或"Kd"旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语"KD"旨在表示解离常数，其可从Kd与Ka之比(即，Kd/Ka)获得，并且表达为分子浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域中公知的方法测定。测定抗体KD的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，诸如
Figure BDA0002313028950000431
系统。
如本文所用，术语"表位"是指与被称为补位的抗体分子可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有多于一个表位。因此，不同抗体可结合至抗原上的不同区域，并且可具有不同的生物学作用。术语"表位"也指B和/或T细胞所响应的抗原上的位点。其也指抗体所结合的抗原区域。表位可被定义为结构性或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接贡献于相互作用的亲和力的那些残基。表位也可以是构象性的，即，由非线性氨基酸构成。在某些实施方式中，表位可包含作为分子的化学活性表面分组的决定簇，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方式中，可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。表位通常包含具有独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。测定指定抗体结合哪个表位的方法(即表位定位)是本领域公知的，并且包括例如免疫印迹法和免疫沉淀测定，其中测试来自HA蛋白的重叠或连续肽与指定抗体的反应性。测定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术以及本文中所述的那些，例如，x-设想晶体学和2-维核磁共振(参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。
术语"表位定位"是指抗体-抗原识别的分子决定簇的鉴定方法。
当涉及抗体或抗体片段时术语"结合至表位"或"识别表位"是指抗原中连续或不连续的氨基酸链段。本领域技术人员理解该术语并非必然表示抗体或抗体片段与表位序列中的每个氨基酸直接接触。
当涉及两个或更多抗体时术语"结合至相同表位"表示抗体结合至相同的、重叠的或包含的连续或不连续的氨基酸链段。本领域技术人员理解短语"结合至相同表位"并非必然表示抗体结合至或接触完全相同的氨基酸。抗体所接触的精确的氨基酸可不同。例如，第一抗体可结合至被第二抗体所结合的氨基酸链段所完全包含的氨基酸链段。在另一个实例中，第一抗体所结合的一个或多个氨基酸链段与第二抗体所结合的链段基本重叠。就本文而言，此类抗体可被认为是"结合至相同表位"。
“与另一抗体竞争结合至靶点”的抗体是指(部分或完全)抑制另一抗体与靶的结合的抗体。可使用已知的竞争实验来测定两种抗体是否彼此竞争与靶的结合，即，一种抗体是否抑制另一抗体与靶的结合以及抑制到何种程度。在某些实施方式中，抗体竞争和抑制另一抗体与靶的结合程度为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。取决于那种抗体是“阻断抗体”(即首先用靶温育的冷抗体)，抑制或竞争水平可以不同。可如以下中所述进行竞争测定：例如，Ed Harlow and David Lane,Cold Spring HarbProtoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277or in Chapter 11of"Using Antibodies"by EdHarlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999。竞争抗体结合至相同表位、重叠表位或相邻表位(例如，如空间位阻所证实的)。其它竞争性结合测定法包括：固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)，夹心竞争测定法(sandwich competition assay)(参见Stahlietal.,Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirklandet al.,J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定法，固相直接标记夹心测定法(参见Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morelet al.,Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheunget al.,Virology 176:546(1990))；和直接标记RIA(Moldenhaueret al.,Scand.J.Immunol.32:77(1990))。如本文所用，术语“免疫反应”是指脊椎动物内针对外来因子的生物反应，该反应保护生物体免受这些因子和由它们引起的疾病影响。免疫反应是由免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞)和这些细胞或肝脏中任一个产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，其导致对侵袭病原体、收病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞或正常人体细胞或组织(在自体免疫或病理性炎症的情况下)的选择性靶向、结合、损害、破坏和/或从脊椎动物体内消除。免疫反应包括例如激活或抑制T细胞(例如，效应T细胞或Th细胞，例如CD4+或CD8+T细胞)，或抑制Treg细胞。
如本文所用，术语“可检测的标记”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素、亲和素、链霉亲和素或半抗原)、嵌入染料等。术语“荧光剂”是指能够显示可检测范围内的荧光的物质或其部分。
如本文所用，术语“受试者”是指动物。优选地，动物是哺乳动物。受试者还指例如灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在一个优选的实施方式中，受试者是人。
如本文所用，术语本发明化合物的“治疗有效量”是指将引起受试者的生物学或医学反应，或改善症状、减慢或延迟疾病进展，或预防疾病等的本发明化合物的量。在一个实施方式中，该术语是指抑制或减少微生物定殖或感染的量。在一个实施方式中，该术语是指抑制或减少感染，或预防或破坏细菌生物膜形成的量。当应用于单独施用的单独的活性成分时，该术语是指单独的该成分。当应用于组合时，该术语是指导致治疗作用的活性成分的组合量，无论它们是连续还是同时地组合施用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指在其施用浓度下不干扰组合物的一种或多种活性成分的生物学活性的效力并且对宿主没有过度毒性的载体介质或赋形剂。在本发明的上下文中，药学上可接受的载体或赋形剂优选适合于局部制剂。该术语包括但不限于溶剂、稳定剂、增溶剂、张力增强剂、结构形成剂、悬浮剂、分散剂、螯合剂、乳化剂、消泡剂、软膏基底、软化剂、皮肤保护剂、凝胶形成剂、增稠剂、pH调节剂、防腐剂、渗透增强剂、配合剂、润滑剂、缓和剂、增粘剂、生物粘附聚合物或其组合。此类试剂在配制药物活性物质中的用途是本领域公知的(参见，例如，"Remington's PharmaceuticalSciences",E.W.Martin,18th Ed.,1990,Mack Publishing Co.:Easton,PA，通过引用将其全部内容并入本文)。
如本文所用，在一个实施方式中，术语任何疾病或病症的“治疗(treating或treatment)”指改善疾病或病症(即，阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一实施方式中，“治疗(treating或treatment)”是指改善患者可能无法分辨的至少一个物理参数。在又一个实施方式中，“治疗(treating或treatment)”是指物理地(例如，稳定可辨别的症状)、生理地(例如，稳定物理参数)或者物理和生理地调节疾病或病症。在另一个实施方式中，“治疗(treating或treatment)”是指预防或延迟疾病或病症的发作或发展或进展。
如本文所用，除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”、“该/所述”和类似术语应被解释为涵盖单数和复数两者。本文中对数值范围的阐述仅旨在用作分别指代该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如/诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为表示任何未要求保护的要素对实施本发明必不可少。
术语“约”是指给定值或范围±10％以内，优选±5％，更优选±1％以内。可替代地，当由本领域普通技术人员考虑时，术语“约”是指在平均值的可接受的标准误差内。
实施例
实施例1：材料和方法
本实施例描述了在以下实施例2-5中使用的材料和方法。
细胞和病毒
犬Madin-Darby犬肾(MDCK；ATCC CCL-34)和人胚肾(HEK293T；ATCC CRL-11268)细胞在Dulbecco改良型伊格尔培养基(DMEM；Mediatech,Inc.)、10％胎牛血清(FBS)和1％PSG(青霉素，100单位/ml；链霉素，100μg/ml；L-谷氨酰胺，2mM)中于37℃和5％CO2条件下生长(Nogales A,et al.2014.J Virol 88:10525-10540)。以下甲型和乙型流感病毒在MDCK细胞中繁殖：A/California/04/2009(pH1N1)野生型(WT)病毒和表达mCherry的病毒(NogalesA,et al.2015.Virus Res 213:69-81；and Nogales A,et al.2014.Virology 476C:206-216)；A/Puerto Rico/08/1934H1N1(PR8H1N1)WT病毒和表达mCherry的病毒(Nogales A,etal.2014.Virology 476C:206-216),A/Texas/36/91 H1N1(TX H1N1),A/New Caledonia/20/99H1N1(NC H1N1),A/Wyoming/3/2003H3N2(H3N2)WT病毒和表达mCherry的病毒；以及B/Brisbane/60/2008(IBV)WT病毒和表达mCherry的病毒(Nogales A,et al.2015.Virus Res213:69-81)。对于感染，将病毒原液在磷酸盐缓冲液(PBS)、0.3％牛白蛋白(BA)和1％PS(PBS/BA/PS)中稀释。在病毒感染后，将细胞保持在感染后(p.i.)培养基中，所述培养基含有DMEM加上0.3％BA、1％PSG和1μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶(Sigma)(Martinez-SobridoL,et al.2010.J Vis Exp doi:10.3791/2057)。如先前所述，通过在MDCK细胞中的标准噬斑测定法(噬菌斑形成单位，PFU/ml)来确定原液的病毒滴度(Nogales A,et al.2014.JVirol 88:10525-10540)。
单克隆抗体的产生
在接受2014-2015年度季节性灭活四价流感疫苗(A/California/07/2009(H1N1)pdm09-样病毒，A/Texas/50/2012(H3N2)-样病毒，B/Massachusetts/2/2012-样病毒，B/Brisbane/60/2008-样病毒)之前以及接受之后7天和1个月，根据Rochester MedicalCenter的护理标准从健康受试者获取外周血。受试者提供了签字的书面知情同意书。所有程序和方法均已获得罗彻斯特大学医学中心的研究课题审查委员会的批准，并且所有实验均根据相关指南和规定进行。使用CPT管(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)分离PBMC和血浆。如先前所述，使用以下对免疫后7天的新鲜PBMC进行流式细胞术染色：抗CD45-Qdot800(HI30,Invitrogen,Carlsbad,CA)，抗CD19-APC-Cy7(SJ25C1,BDBiosciences,San Jose,CA)，抗CD20-AlexaFluor 700(2H7,Biolegend,San Diego,CA)，抗CD3-PacificOrange(UCHT1,Invitrogen)，抗IgD-FITC(IA6-2,BD)，抗CD27-Qdot655(CLB-27/1,Invitrogen)，抗CD4-Qdot705(S3.5,Invitrogen)，抗CD38-Qdot605(HIT2,Invitrogen)，抗CD126-PE(M5,BD)，以及活/死可固定水性死细胞染色(Invitrogen)。使用FACSAria(BD Biosciences)将成纤维细胞直接单细胞分选到96孔PCR板(Bio-Rad,Hercules,CA)中，该板含有含10μm MDTT(Invitrogen)和8U RiboLock(ThermoFisher)RNA酶抑制剂的4μL/孔0.5X PBS。将板用MICROSEAL F FILM(Bio-Rad)密封，并立即在-80℃冷冻，直到用于RT-PCR。如先前所述(Kobie JJ,et al.2015.Monoclon Antib ImmunodiagnImmunother 34:65-72)，合成cDNA并对其进行半巢式RT-PCK以得到IgH、Igλ和IgκV基因转录物。以Genewiz Sequences对纯化的PCR产物进行测序，并通过IgBlast(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)和IMGT/V-QUEST(www.imgt.org/IMGT_vquest)分析以鉴定具有最高同一性的谱系V(D)J基因片段并确定序列属性。如先前所述(Kobie JJ,etal.2015.Monoclon Antib Immunodiagn Immunother 34:65-72；and Tiller T,etal.2008.J Immunol Methods 329:112-124)进行人HEK293T细胞(ATCC,Manassas,VA)的表达载体克隆和转染。使用MAGNA PROTEIN G珠(Promega,Madison,WI)从培养上清液中纯化IgG。1069D6是用作同种型对照的人IgG1mAb。
深度测序免疫球蛋白库分析
使用在受试者接受2014–2015年度季节性灭活流感疫苗之后7天收集的样品，使用RNeasy试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从1x 107外周血单核细胞(PBMC)分离RNA，用DNA酶I(Turbo DNA-free Kit,Invitrogen,Vilnius,Lithuania)处理，并用于使用qScriptcDNA合成试剂盒(QuantaBio,Beverly,MA)合成cDNA。所得的cDNA用于随后的PCR中，其中使用Platinum Taq高保真聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)和降落式PCR方案，从95℃变性5分钟开始，然后进行两个周期的96℃+30秒、62℃+30秒和68℃+1分钟。退火温度每隔2个周期下降2℃，直到55℃，该温度用于最后的32个周期。在68℃进行10分钟的最后延伸，随后保持12℃。简并引物根据以下设计：Sheidet al.2011,Science 333,1633–1637，带有用于VH2、IgM(Richardson,C.et al.,2013,J Immunol 191,4926–4939)、IgG(Tiller,T.etal.,2008,J Immunol Methods 329,112–124)和IgA(GAGGCTCAGCGGGAAGACCTTG，SEQ IDNO:34)的补充引物。正向和反向引物也包括12nt索引和Illumina特异性连接基因：正向：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTG-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，SEQ ID NO:35；反向：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，SEQ ID NO:36)。通过Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成引物并进行PAGE纯化。对于VH1/7、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6，使用每种正向引物0.05mM和每种反向引物0.25mM的最终浓度完成单独的PCR反应。在PCR后，将产物在1％琼脂糖凝胶上拆分，并切出对应于约600nt的条带。使用E.Z.N.A.TM凝胶提取试剂盒(Omega Bio-Tek,Norcross,GA)来提取条带，并混合所有6个VH反应。PCR产品已提交给罗彻斯特大学基因组研究中心，在那里进行了Qubit荧光定量(ThermoFisher)和生物分析仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)分级、定量和质量控制，然后将其标准化为2nM，并进行针对MiSeq系统(Illumina,Inc.,San Diego,CA)的流通池杂交和簇生成。进行配对末端读取(300x 325bp)。
使用先前描述的内部定制分析管线进行序列分析(Tipton CM,et al.2015.NatImmunol 16:755-765)。将所有序列与IMGT.org/HighVquest(Aouinti S,etal.2016.Front Immunol 7:339)进行比对。通过识别包含相应mAb序列的谱系(相同的VH、JH、HCDR3长度和>85％的HCDR3相似性)来生成KPF1谱系树。作为避免包含可能因测序错误引起的多样性的保守方法，删除了具有独特核苷酸VDJ重排的序列(单例)，并使用Phylip’sprotpars tool(version 3.695,Felsenstein,J.PHYLIP(Phylogeny Inference Package)version 3.6.Distributed by the author.Department of Genome Sciences,University of Washington,Seattle(2005))，打开设置编号1、4和5来分析所得序列。然后使用内部自定义脚本解析输出文件；将任何重复的推断序列折叠到单个节点中，并使用Cytoscape可视化。
结合特征
ELISA板(NUNC MAXISORP,Thermo Fisher Scientific,Grand Island,NY)用0.5μg/mL的重组HA蛋白(Protein Sciences,Meriden,CT)或RSV融合(F)蛋白包被，将hMAbs在PBS中稀释，并用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch,WestGrove,PA)检测结合。在选择的ELISAs中，将递增浓度的尿素添加到ELISA板中，并于室温温育15分钟，然后用抗IgG-HRP检测以评估亲和力。如先前所述进行MPLEX-FLU测定免疫球蛋白定量方法(Wang J,et al.2015.PLoS One 10:e0129858)。在96孔黑壁微量滴定板(Millipore,Billerica,MA)中进行测定。在即将测定之前，将缀合的磁珠涡旋15秒，并稀释至每μl中每个珠子区域50个珠子，并以每孔25微升微珠添加。使用包含0.1％BSA(MPBiomedical,LLC,France)和0.1％Brij-35(Thermo Scientific,Waltham,MA)的PBS(pH7.2)进行所有血浆和hmAb稀释和洗涤。将25μl的稀释的测试血浆或hmAb一式两份地添加到25μl珠子中，并在旋转摇床(500rpm)上于室温避光温育2小时。然后将孔用150μl洗涤缓冲液洗涤两次，并添加50μl 1:400稀释的PE缀合抗人IgG(γ链特异性)特异性的次级Ab(SouthernBiotech,Birmingham,AL)，将板在旋转摇床(500rpm)上于室温避光温育2小时。在额外洗涤3次后，将每个孔中的珠子悬浮于100μl LUMINEX驱动溶液(Luminex,Austin,TX)中，并在MAGPIX多重读取器(Luminex,Austin,TX)上分析，结果以中值荧光强度(MFI)表达。
使用表面等离子体共振的结合亲和力研究
于25℃通过使用Biacore T200光学生物传感器(Biacore,Uppsala,Sweden)进行的SPR实验来测定KPF1对pH1N1A/California/04/2009(Protein Sciences Corp.,Meriden,CT)的重组(r)HA的结合亲和力。使用60秒接触时间、10μl/min流速和30秒稳定时间，将KPF1(50nM)穿过S系列传感器芯片蛋白质G(GE HealthCare,Uppsala,Sweden)的流通池2，捕获大约1800共振单位(RU)。流通池1保持空白(仅蛋白质G)作为参比。使用pH1N1rHA来分析结合，使用90s接触时间、75μl/m流速和700秒解离时间。在两次实验中，将0.625-10nM范围内的六种不同浓度的pH1N1rHA通过含有0.05％Tween 20的PBS(pH 7.4)的运行缓冲液中的每个通道。在每个结合事件后，通过用流速为30μl/min的10mM甘氨酸(pH 1.5)反复洗涤来再生传感器表面。在通过减去从阴性对照流动通道和缓冲液注入获得的信号来校正非特异性结合之后，分析每条结合曲线(Myszka,D.G.Improving biosensor analysis.JMol Recognit 12,279–284,https://doi.org/10.1002/(SICI)1099-1352(199909/10)12:5<279::AID-JMR473>3.0.CO；2-3(1999))。使用Biacore T200评估软件3.0(GEHealthcare)中的1:1 Langmuir相互作用模型，通过不同捕获水平的局部Rmax拟合来获得动力学参数。
病毒中和及基于荧光的微量中和测定
如先前所述，用WT病毒和表达mCherry的病毒进行病毒中和测定(Nogales A,etal.2015.Virus Res 213:69-81；and Nogales A,et al.2014.Virology 476C:206-216)。简言之，使用96孔板将KPF1 hmAb或IgG1同种型对照hmAb在PBS中连续两倍稀释(起始浓度为200μg)。然后将100PFUs的每种病毒添加到hmAb稀释液中，并于室温温育1小时。然后于室温用hmAb病毒混合物将MDCK细胞(96孔板格式，5x 104细胞/孔，一式三份)感染1h。在病毒吸附后，用1μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶将细胞保持在感染后培养基中(Martinez-Sobrido,L.&Garcia-Sastre,A.Generation of recombinant influenza virus fromplasmid DNA.Journal of visualized experiments:JoVE,https://doi.org/10.3791/2057(2010))，并于33℃温育。对于基于荧光的微量中和测定，在感染后24-48h用PBS洗涤细胞，随后使用荧光板读数器(DTX-880,Becton Dickenson)进行红色荧光定量。使用在不存在hmAb情况下的感染mCherry病毒的细胞的荧光值来计算100％病毒感染。使用没有病毒感染的细胞来计算荧光背景。使用一式三份的孔来计算中和的平均值和SD。通过在感染后48-72h的结晶紫染色来测定WT病毒中和。通过s形剂量响应曲线(GRAPHPAD PRISM,v7.0)来测定中和滴度50(NT50)。
KPF1在小鼠中的预防性和治疗性保护活性的测量
从国家癌症中心(NCI)购买五到七周龄雌性C57BL/6小鼠，并在罗切斯特大学的动物护理设施中在无特定病原体的条件下饲养。所有动物实验方案均已获得罗彻斯特大学动物资源委员会的批准，并符合美国国家研究委员会实验动物护理和使用指南(NationalResearch Council(U.S.).Committee for the Update of the Guide for the Care andUse of Laboratory Animals.,Institute for Laboratory Animal Research(U.S.),National Academies Press(U.S.).2011.Guide for the care and use of laboratoryanimals,8th ed.National Academies Press,Washington,D.C)中的建议。对于病毒感染，将小鼠用2,2,2-三溴乙醇(Avertin；240mg/kg体重)腹腔内(i.p.)麻醉，并用最终体积为30μl的10X小鼠致死剂量50(MLD50)的pH1N1鼻内(i.n.)接种。在病毒感染后，每天监测动物的发病率(体重减轻)和死亡率(存活率)。显示体重减轻超过25％的小鼠被认为已达到实验终点，并被人道安乐死。为测定KP4F1的预防效力，将11只一组的小鼠称重并腹膜内施用剂量分别为0.1、1和10mg/kg的hmAb，或10mg/kg的无关同种型对照1069D6hmAb，或PBS。在给药后二十四小时，用所指明的病毒鼻内(i.n.)感染小鼠并监测两周(N＝5)(H1N1)。通过在感染后第2天和第4天测量感染小鼠肺中的病毒滴度来测定病毒复制(pH1N1、PR8H1N1、TX H1N1和NC H1N1)。为此，对每组的三只小鼠实施安乐死，收集肺并匀浆化。通过给予致死剂量的Avertin和放血使小鼠安乐死。通过免疫聚焦测定法(荧光聚焦形成单位，FFU/ml)确定病毒滴度(Nogales A,et al.2014.J Virol 88:10525-10540and Nogales A,et al.2016.JVirol 90:6291-6302)，使用抗NP mAb HB-65(ATTC)和FITC缀合的抗小鼠次级Ab(Dako)。为研究治疗作用，在感染后6、24或72h对小鼠组(N＝5)给予10mg/kg KPF1或同种型对照IgG(于6h)或PBS(于6h)的腹膜内注射。使用(GRAPHPAD PRISM，v7.0)进行几何平均滴度和数据的表示。
单克隆抗体耐药性突变体(MARMs)的选择
通过在递增的KPF1 hmAb浓度下温育pH1N1或TX H1N1流感病毒来选择所有MARMs。简言之，在24孔板中用pH1N1以低感染复数(MOI 0.01)感染MDCK细胞。在吸附1小时后，将包含KPF1 hmAb的感染后培养基添加到孔中。将板于33℃温育2-3天，并每天观察其细胞病变作用(CPE)。一旦被感染的细胞表现出超过70％的CPE，就如上所述收集组织培养上清液(TCS)并用于感染新鲜的MDCK细胞(MOI 0.01)。以递增浓度(10、25、50、100和100μg/ml)的KPF1 hmAb重复五轮选择方案。MARM培养一式三份进行，并且将不含hmAb的培养物平行维持以控制细胞特异性突变。
质粒
使用含有pH1N1 HA的聚合酶I驱动的pPolI质粒(Baker,S.F.et al.J Virol 87,8591–8605,https://doi.org/10.1128/JVI.01081-13(2013))作为模板以使用定点诱变引入氨基酸改变E129K、K180N、K180Q和E129K/K180N。然后，使用标准克隆技术，使用BbsI和PmlI限制性酶切位点将含有氨基酸置换的HA片段亚克隆到聚合酶II驱动的pCAGGS蛋白表达质粒中(Niwa,H.,et al.Gene 108,193–199(1991))。可根据要求提供用于产生所述突变体的引物。通过DNA测序(ACGT Inc.)验证所有质粒构建体。
免疫荧光测定(IFA)
为表征MARM，将MDCK细胞的融合单层模拟感染或用WT病毒或MARM病毒感染(MOI0.01)。在感染后20h，将细胞用4％PFA固定，并用0.5％Triton X-100的PBS溶液于室温渗透15分钟。然后将细胞与hmAb KPF1或与pH1N1 HA小鼠mAb 29E3(Manicassamy B,etal.2010.PLoS Pathog 6:e1000745)或与NP(HB-65)在37℃温育1小时。用1X PBS洗涤后，将细胞用FITC缀合的次级抗小鼠Ab(Dako)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；ResearchOrganics)在37℃温育1小时。使用x10物镜的荧光显微镜(Olympus IX81)和相机(QIMAGING,RETIGA 2000R)将细胞可视化并拍照。为表征HA突变体，使用lipofectamine2000以及0.5μg所示pCAGGS质粒将HEK293T细胞瞬时转染，在转染后24小时，如上所述使用IFA分析HA表达，使用hmAb KPF1或山羊pH1N1抗HA多克隆抗体作为内部对照(BEIResources NR-15696)。
病毒RT-PCR
在感染后36h收集来自感染MDCK细胞的总RNA，并根据制造商的说明使用TRIZOL试剂(Invitrogen)纯化。使用
Figure BDA0002313028950000531
II逆转录酶(Invitrogen)和寡聚dT寡核苷酸(Invitrogen)进行HA和NA mRNAs的cDNA合成。此外，使用cDNAs作为PCR的模板，并且引物对病毒HA和NA开放阅读框(ORF)具有特异性。然后，测定来自MARMs和no-Ab对照组的核苷酸序列(ACGT,Inc)。可根据要求提供用于扩增pH1N1 HA和NA ORF的引物序列。
病毒生长动力学
在感染了指定病毒(MOI 0.001)的MDCK细胞的融合单层(12孔板形式，5x 105细胞/孔，一式三份)中进行了多周期病毒生长动力学。通过免疫聚焦测定法(FFU/ml)确定TCS中的病毒滴度(Nogales A,et al.2014.J Virol88:10525-10540and Nogales A,etal.2016.J Virol 90:6291-6302)。使用MICROSOFT EXCEL软件计算平均值和标准偏差(SD)。
HAI测定
使用血凝抑制(HAI)测定法测定KPF1的HA中和能力。如先前所述进行测定(Nogales A,et al.2014.J Virol 88:10525-10540and Nogales A,et al.2016.J Virol90:6291-6302)。简言之，将KPF1 hmAb在96孔V型底板中连续稀释(2倍)，并于室温与4个血凝单位(HAU)的pH1N1 1:1混合60分钟。通过在冰上向病毒-hmAb混合物中添加0.5％火鸡红细胞(RBC)30分钟来测定HAI滴度。HAI滴度定义为完全抑制血凝的最小hmAb量。
实施例2：KPF1 hmAb的生成
外周血浆母细胞(CD19+IgD-CD38+CD27++)是在用2014-2015年度季节性灭活四价流感疫苗免疫后7天从健康受试者分选的单一细胞。该受试者有强烈的浆母细胞反应，约占IgD区室的25％，主要是CD20-CD126(IL-6Rα)+(图1A)，这与抗原特异性反应一致(Gonzalez-Garcia I,et al.2006.J Immunol 176:4042-4050)。使浆母细胞经历单细胞RT-PCR和免疫球蛋白可变区测序，鉴定了占分离的浆母细胞的～10％的主要B细胞谱系，其由免疫球蛋白(Ig)重链VH3-23和κ轻链Vk1-33基因编码。由于该谱系在浆母细胞中占优势，因此该谱系的代表性成员被克隆为IgG1，以生成完全KPF1的hmAb。重链可变区(VH)包含来自谱系的14％氨基酸(8％NT)和κ轻链可变区(Vk)10％氨基酸(5％NT)突变，这与亲和力成熟一致(图1B)。有趣的是，该谱系仅包含IgA1。将一种来源于B细胞谱系的编码恒定区的核酸与编码野生型IgA1恒定区的核酸进行比对(图1C)。将该谱系的代表性成员克隆为IgG1，以生成完全KPF1的hmAb。
分离具有广泛反应性的流感单克隆抗体的能力表明，人类B细胞反应能够产生这种有价值的反应，现在的挑战在于以足够的频率、强度和持久性诱导这些反应以提供广泛的保护。
实施例3KPF1的体外活性
ELISA的初步表征显示KPF1对H1型流感病毒HAs具有高度特异性，且对H3型或乙型流感病毒HAs无反应性(图2A)。即使在8M尿素中也能保持其与HA的大部分结合(～50-70％)，表明其亲和力很高(图2B)。表面等离子体共振(SPR)测定KPF1以非常高的亲和力结合pH1N1 HA，结合的平衡解离常数(KD)为178pM(图2c)。通过先前已经描述过的基于荧光珠的MPLEX-FLU测定法来测定KPF1对23种HA的全面结合情况(Wang J,et al.2015.PLoS One10:e0129858)。KPF1仅与H1 HAs结合，包括A/South Carolina 01/1918H1N1，并且具有与最新H1N1病毒株反应性增强的趋势(图3)。KPF1结合了5/6H1 HA，未能识别1μg/ml的A/USSR/1977H1N1。KPF1的H1反应性特性反映了受试者的血浆Ab反应，包括其对TX H1N1的强反应性，这是受试者接种前(D0)血浆反应的主要部分。
另外，使用基于荧光的方法(Nogales A,et al.2016.Virus Res 213:69-81；andNogales A,et al.2015.Virology 476:206-216)或传统的微中和试验(分别为图4和表1)，KPF1能够中和广泛的H1病毒，包括有效中和pH1N1(NT50＝0.56μg/ml，图4；1.46μg/ml，表1)，NC H1N1(NT50＝4.56μg/ml，表1)和TX H1N1(NT50＝1.26μg/ml，表1)，而PR8H1N1的中和效率较低(NT50＝112μg/ml，图4C；145.6μg/ml，表1)。即使在最高浓度的KPF1(200μg/ml)中也未检测到甲型H3或乙型流感病毒的中和(图4A-4C和表1)。KPF1还表现出针对pH1N1的血凝抑制(HAI)活性(表1和图7A)。总体而言，KPF1对甲型H1流感有特异性，并在体外识别和功能性抑制多种H1流感病毒分离株。
表1.微量中和和HAI测定。
Figure BDA0002313028950000551
Figure BDA0002313028950000561
(a)该测定中所用的病毒：A/California/04/09H1N1(pH1N1)，A/Texas/36/91 H1N1(TX H1N1)，A/New Caledonia/20/99H1N1(NC H1N1)，A/Wyoming/3/03H3N2(H3N2)，A/Puerto Rico/08/34H1N1(PR8H1N1)，或B/Brisbane/60/08(IBV)。
(b)MDCK细胞用所指出的病毒感染(100PFU)，所述病毒用2-倍连续稀释(起始浓度为200μg/ml)的hmAb KPF1预温育。在感染后48–72h，将细胞用结晶紫染色，并使用s形剂量响应曲线测定NT50。使用不存在hmAbs的模拟-感染细胞和病毒作为内部对照。*没有可检测的中和作用的hmAb的最大量。
(c)使用两倍连续稀释(起始浓度为200μg/ml)的KPF1和4个凝血单位的所指出的病毒来进行4-HAI测定。通过向病毒-hmAbs混合物中添加0.5％火鸡RBCs来测定HAI滴度，并且测定为完全抑制红血球凝集的hmAb的最小量。
实施例4：KPF1的体内活性
为评估KPF1的保护活性，C57BL/6小鼠接受了递增剂量的KPF1，随后是pH1N1的致死性鼻内攻击剂量(10x MLD50)(图5)。用PBS或IgG同种型对照hmAb治疗的所有小鼠均出现严重的体重减轻，并在感染后10天内死于感染(图5A和5B)。但是，所有用10mg/kg或1mg/kg的KPF1治疗的小鼠均保持体重，并在感染后存活(图5A和5B)。用0.1mg/kg的KPF1治疗对体重减轻和存活率的影响很小，差异无统计学意义(图5A和5B)。与增加的存活率一致，用1mg/kg或10mg/kg治疗的小鼠在感染后第2天和第4天肺部病毒滴度显著降低，包括在用10mg/kg治疗的3只小鼠中有2只没有可检测水平的病毒，提示在这些小鼠中具有杀菌免疫力(图5C)。
鉴于KPF1能够使用微中和或HAI分析在体外中和其他H1流感病毒(图4和表1)，我们评估了KPF1对其他H1流感病毒株的体内保护活性。为此，用10mg/kg IgG同种型对照或KPF1治疗小鼠，然后用致死剂量(10x MLD50)的PR8、TX或NC H1N1流感病毒攻击(Pica,N.etal.J Virol 85,12825–12829,https://doi.org/10.1128/JVI.05930-11(2011)；andNogales,A.et al.J Virol 88,10525–10540,https://doi.org/10.1128/JVI.01565-14(2014))，并分析肺中的病毒复制(图5d)。与体外活性相关，接受KPF1 hmAb的小鼠被保护免受不同病毒攻击的影响，在用10mg/kg KPF1治疗的小鼠中没有可检测的病毒(图5d)。
接下来评估KPF1的治疗活性(图6)。为此目的，用致死剂量(10x MLD50)的pH1N1攻击小鼠，然后在感染后6h、24h或72h用10mg/kg KPF1治疗。用PBS或IgG同种型对照hmAb治疗的所有小鼠体重严重减轻，并在感染后8天内死于感染(图6A和6B)。早期治疗(感染后6小时)可以完全防止体重减轻和死亡，在感染后24小时的延迟治疗仅造成短暂体重减轻，并且所有小鼠从感染中存活。晚至感染后72小时的KPF1治疗赋予了80％存活率，且存活的小鼠仅具有短暂体重减轻(图6A和6B)。总体而言，这些结果表明KPF1在体内具有针对pH1N1的有效预防性和治疗性活性。
实施例5：针对KPF1的体外逃逸突变体的产生
为鉴定对KPF1表位形成至关重要的氨基酸残基，生成了pH1N1的mAb耐药性突变体(MARMs)(图7)。在递增浓度的KPF1存在下，将WT pH1N1病毒一式三份地传代五轮，并且对来自三种MARMs(MARM1、MARM2、MARM3)的NA和HA ORFs测序(图7A)。在NA中未检测到突变，并且所有三种MARMs都均有位于Ca和Cb抗原位点之间的点突变(E129K)。MARM3还具有位于Sa抗原位点内的另外的突变(K180N)(图7A和7D)。通过免疫荧光测定，KPF1不与MARM1-3结合，尽管保持了与NP特异性mAb和另一种pH1N1头部特异性HA mAb 29E3的结合(图7B)。尽管MARM3的生长显著低于pH1N1WT(p<0.05)，但MARM1和MARM2的体外病毒生长动力学与pH1N1WT相当，这表明K180N突变会影响病毒适应性(图7C)。尽管在HA蛋白的线性序列中位置129和180的氨基酸彼此远离，但是三维蛋白结构的分析表明，在折叠的HA蛋白中两个氨基酸是接近的(图7D)。
有趣的是，当TX H1N1在KPF1存在下繁殖时，在TX H1N1的所有MARMs中都观察到了对于pH1N1的MARMs鉴定出的相同点突变(E129K)(图7E)。另外，在NA中没有鉴定出突变。这些结果证实E129对于KPF1与HA的结合很重要。使用从每一轮病毒选择中获得的pH1N1或TXH1N1病毒进行HAI分析。HAI的结果表明，在pH1N1的传代1中，或者在TX H1N1的传代1和传代2之间，MARMs是主要病毒种群(数据未显示)。这些结果证实，E129对于KPF1与HA的结合很重要，并且表明KPF1识别H1 HA球状头部中的表位，该表位依赖于Ca和Cb抗原位点附近的残基(E129)(图7d)。此外，产生了编码WT，单个E129K、K180N、K180QHA突变体，或双重E129K/K180N HA突变体的pCAGGS蛋白表达质粒。接下来，在转染的293种T细胞中通过免疫荧光测定法评估了KPF1识别不同HAs的能力(图8a)。正如预期，KPF1无法识别包含氨基酸变化E129K(E129K和E129K/K180N)的HA蛋白，但是能够识别包含位置180处的氨基酸变化的HA蛋白(K180N和K180Q)。这表明位置180不是KPF1 hmAb足迹的一部分，在3个MARMs之一中观察到的位置180处的氨基酸变化可能是随机事件或补偿性突变。此外，还进行了计算机分析，以评估存储在从2000年到2018年的IAV H1N1数据库(https://www.fludb.org/brc/home.spg？decora-tor＝influenza)中的17,000多个病毒株中氨基酸残基E129和K180的频率(图8B)。我们的发现表明氨基酸E129是高度保守的，因为分析的IAV H1N1序列中的超过99.5％在该位置均包含氨基酸E。有趣的是，其他氨基酸(包括在我们的MARMs中观察到的K)的频率小于0.5％(图8B)。该数据表明该位置对IAV H1N1很重要，因此可能成为开发抗病毒疗法(例如我们描述的KPF1 hmAb)的合适靶标。另一方面，位置180具有较高的可变性，显示了最近十年中从K到Q的变化(图8B)。但是，这种可变性不会影响KPF1与HA的结合。
此外，为帮助解析被KPF-1 hmAb识别的HA蛋白的特定表位，使用覆盖完整HA蛋白的重叠线性肽(如下所列)进行PepScan-ELISA。发现KPF1对覆盖位置138-337的肽具有最大反应性。该区域包括在MARM分析中识别出的K180，并且该区域与在MARM分析中识别出的E129相邻。总体而言，这些结果表明，KPF1识别HA1球状头部中依赖于Sa抗原位点内和RDS附近的残基的抗原决定簇。
Figure BDA0002313028950000581
Figure BDA0002313028950000591
如上所述，尽管当前获得许可的流感疫苗和抗病毒剂大大减轻了流感感染的发病率和死亡率，但它们不是最理想的，因此我们在预防和治疗流感的能力方面存在着严重的公共卫生漏洞。增强疫苗和抗病毒药的活性广度，以保护其免受新出现的季节性分离株和具有大流行潜力的分离株的侵害是一个基本重点领域。KPF1抗体对H1流感分离株具有广泛的活性，并且在体内具有强大的预防和治疗活性，这是由H1血凝素球状头中保守残基的识别介导的。该抗体以及本文公开的其他抗体具有更大的临床可行性。
应当将前述示例和优选实施例的描述用作说明，而不是限制由权利要求书限定的本发明。如将容易理解的，在不脱离权利要求中所阐述的本发明的情况下，可以利用上述特征的多种变化和组合。这样的变型不被认为脱离本发明的范围，并且所有这样的变型旨在被包括在所附权利要求的范围内。本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。
序列表
<110> 罗切斯特大学
<120> 广泛中和的抗流感单克隆抗体及其用途
<130> 161118.00501
<150> US 62/506,256
<151> 2017-05-15
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Gly Asp Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Thr Ser Ala Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Ser Ser Gly Phe His Tyr Gly Arg Pro Gly Arg Asn
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr His Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr
20 25 30
Leu Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gly Ser Thr Phe Gly Asp Phe Ala
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Thr Ser Ala Gly Gly Asp Arg Thr
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ala Arg Leu Asp Ser Ser Gly Phe His Tyr Gly Arg Pro Gly Arg Asn
1 5 10 15
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Asp Ala Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gln Gln Tyr Lys Ser Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr His Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr
20 25 30
Leu Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr
<210> 10
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Pro Gly Arg Asn
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr
<210> 12
<211> 1701
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
<400> 12
atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 60
tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 120
gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 180
ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 240
aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacacct 300
agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 360
caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 420
cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 480
ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 540
tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct 600
actagtgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg catatgtttt tgtggggtca 660
tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggatcaa 720
gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa 780
gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcgcaa tggaaagaaa tgctggatct 840
ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca aacacccaag 900
ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt 960
ccaaaatatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tatcccgtct 1020
attcaatcta gaggcctatt tggggccatt gccggtttca ttgaaggggg gtggacaggg 1080
atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc 1140
gacctgaaga gcacacagaa tgccattgac gagattacta acaaagtaaa ttctgttatt 1200
gaaaagatga atacacagtt cacagcagta ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga 1260
atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc 1320
gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accacgattc aaatgtgaag 1380
aacttatatg aaaaggtaag aagccagcta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc 1440
tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact 1500
tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaagaaat agatggggta 1560
aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1620
ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta 1680
cagtgtagaa tatgtattta a 1701
<210> 13
<211> 566
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 13
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 14
<211> 1701
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
<400> 14
atgaagacta tcattgcttt gagctacatt ctatgtctgg ttttcgctca aaaacttcct 60
ggaaatgaca atagcacggc aacgctgtgc cttgggcacc atgcagtacc aaacggaacg 120
atagtgaaaa caatcacgaa tgaccgaatt gaagttacta atgctactga actggttcag 180
aattcctcaa taggtgaaat atgcgacagt cctcatcaga tccttgatgg agaaaactgc 240
acactaatag atgctctatt gggagaccct cagtgtgatg gcttccaaaa taagaaatgg 300
gacctttttg ttgaacgaag caaagcctac agcaactgtt acccttatga tgtgccggat 360
tatgcctccc ttaggtcact agttgcctca tccggcacac tggagtttaa caatgaaagc 420
ttcaattgga atggagtcac tcaaaacgga acaagttctg cttgcataag gagatctaat 480
aatagtttct ttagtagatt aaattggttg acccacttaa acttcaaata cccagcattg 540
aacgtgacta tgccaaacaa tgaacaattt gacaaattgt acatttgggg ggttcaccac 600
ccggttacgg acaaggacca aatcttcctg tatgctcaac catcaggaag aatcacagta 660
tctaccaaaa gaagccaaca agctgtaatc ccgaatatcg gatttagacc cagaataagg 720
aataacccta gcagaataag catctattgg acaatagtaa aaccgggaga catacttttg 780
attaacagca cagggaatct aattgctcct aggggttact tcaaaatacg aagtgggaaa 840
agctcaataa tgagatcaga tgcacccatt ggcaaatgca agtctgaatg catcactcca 900
aatggaagca ttcccaatga caaaccattc caaaatgtaa acaggatcac atacggggcc 960
tgtcccagat atgttaagca aagcactctg aaattggcaa caggaatgcg gaatgtacca 1020
gagaaacaaa ctagaggcat atttggcgca atagcgggtt tcatagaaaa tggttgggag 1080
ggaatggtgg atggttggta cggtttcagg catcaaaatt ctgagggaag aggacaagca 1140
gcagatctca aaagcactca agcagcaatc gatcaaatca atgggaagct gaatcgattg 1200
atcgggaaaa ccaacgagaa attccatcag attgaaaaag aattctcaga agtagaaggg 1260
agaattcagg accttgagaa atatgttgag gacactaaaa tagatctctg gtcatacaac 1320
gcggagcttc ttgttgccct ggagaaccaa catacaattg atctaactga ctcagaaatg 1380
aacaaactgt ttgaaaaaac aaagaagcaa ctgagggaaa atgctgagga tatgggcaat 1440
ggttgtttca aaatatacca caaatgtgac aatgcctgca taggatcaat cagaaatgga 1500
acttatgacc acgatgtata cagagatgaa gcattaaaca accggttcca gatcaaggga 1560
gttgagctga agtcagggta caaagattgg atcctatgga tttcctttgc catatcatgt 1620
tttttgcttt gtgttgcttt gttggggttc atcatgtggg cctgccaaaa gggcaacatt 1680
aggtgcaaca tttgcatttg a 1701
<210> 15
<211> 566
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 15
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile
50 55 60
Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
85 90 95
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Asn
130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Asn
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Phe Lys
165 170 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Val Thr Asp Lys Asp Gln Ile
195 200 205
Phe Leu Tyr Ala Gln Pro Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn Ile Gly Phe Arg Pro Arg Ile Arg
225 230 235 240
Asn Asn Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
385 390 395 400
Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser
405 410 415
Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
420 425 430
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
435 440 445
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
450 455 460
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser
485 490 495
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
500 505 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
515 520 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
530 535 540
Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
545 550 555 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210> 16
<211> 1755
<212> DNA
<213> 乙型流感病毒
<400> 16
atgaaggcaa taattgtact actaatggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact 60
gggataacat cttcaaactc acctcatgtg gtcaaaacag ctactcaagg ggaggtcaat 120
gtgactggtg tgataccact aacaacaaca ccaacaaaat cttattttgc aaatctcaaa 180
ggaacaaaga ccagagggaa actatgccca gactgtctca actgtacaga tctggatgtg 240
gccctgggca ggccaatgtg tgtgggaact acaccttctg cgaaagcttc aatacttcac 300
gaagtcagac ctgttacatc cgggtgcttc cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg 360
caactagcca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggt tatcaaccca aaacgttatc 420
gatgcagaaa aggcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac 480
gctaccagta aaagcggatt tttcgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaacaac 540
aaaaatgcaa cgaacccatt aacagtagaa gtaccataca tttgtgcaga aggggaagac 600
caaattactg tttgggggtt ccattcagat gacaaaaccc aaatgaagaa cctctatgga 660
gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ttatgtttct 720
cagattggcg gcttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcagaatt 780
gtcgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta tcaaagaggt 840
gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtcc 900
ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960
aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtgaaa 1020
acacctttga agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctgcaaaact attaaaggaa 1080
aggggtttct tcggagctat tgctggtttc ctagaaggag gatgggaagg aatgattgca 1140
ggttggcacg gatacacatc tcacggagca catggagtgg cagttgctgc agaccttaag 1200
agcacacaag aagctataaa caagataaca aaaaatctca actctttgag tgagctagaa 1260
gtaaagaatc ttcaaaggct aagtggtgcc atggatgaac tccacaacga aatactcgag 1320
ctggatgaga aagtggatga cctcagagct gacactataa gttcacaaat agaacttgca 1380
gtcttgcttt ccaacgaagg aataataaac agtgaagacg agcatctatt ggcacttgag 1440
agaaaactaa agaaaatgct gggtccctct gctgtagaca taggaaatgg atgcttcgaa 1500
accaaacaca aatgcaacca gacctgctta gacaggatag ctgctggcac ctttaatgca 1560
ggagagtttt ctctccccac ttttgattca ttgaacatta ctgctgcatc tttaaatgat 1620
gatggattgg ataaccatac tatactgctc tattactcaa ctgctgcttc tagtttggct 1680
gtaacattga tgctagctat ttttattgtt tatatggtct ccagagacaa cgtttcatgc 1740
tccatctgtc tataa 1755
<210> 17
<211> 584
<212> PRT
<213> 乙型流感病毒
<400> 17
Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp
1 5 10 15
Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys
20 25 30
Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr
35 40 45
Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr
50 55 60
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val
65 70 75 80
Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile
100 105 110
Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Ala Asn Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn
145 150 155 160
Ala Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro
165 170 175
Lys Asp Asn Asn Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro
180 185 190
Tyr Ile Cys Ala Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His
195 200 205
Ser Asp Asp Lys Thr Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro
210 215 220
Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser
225 230 235 240
Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln
245 250 255
Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Met Gln Lys Pro Gly Lys Thr
260 265 270
Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Val Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp
275 280 285
Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile
290 295 300
Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser
305 310 315 320
Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro
325 330 335
Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg
340 345 350
Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala
355 360 365
Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly
370 375 380
Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys
385 390 395 400
Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu
405 410 415
Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp
420 425 430
Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu
435 440 445
Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser
450 455 460
Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu
465 470 475 480
Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn
485 490 495
Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg
500 505 510
Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe
515 520 525
Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp
530 535 540
Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala
545 550 555 560
Val Thr Leu Met Leu Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp
565 570 575
Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580
<210> 18
<211> 1677
<212> DNA
<213> 乙型流感病毒
<400> 18
atgaaggcaa taattgtact actcatggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact 60
gggataacat cgtcaaactc accacatgtc gtcaaaactg ctactcaagg ggaggtcaat 120
gtgactggtg taataccact gacaacaaca cccaccaaat ctcattttgc aaatctcaaa 180
ggaacagaaa ccagggggaa actatgccca aaatgcctca actgcacaga tctggacgta 240
gccttgggca gaccaaaatg cacggggaaa ataccctcgg caagagtttc aatactccat 300
gaagtcagac ctgttacatc tgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaattaga 360
cagctgccta accttctccg aggatacgaa catatcaggt tatcaaccca taacgttatc 420
aatgcagaaa atgcaccagg aggaccctac aaaattggaa cctcagggtc ttgccctaac 480
attaccaatg gaaacggatt tttcgcaaca atggcttggg ccgtcccaaa aaacgacaaa 540
aacaaaacag caacaaatcc attaacaata gaagtaccat acatttgtac agaaggagaa 600
gaccaaatta ccgtttgggg gttccactct gacaacgaga cccaaatggc aaagctctat 660
ggggactcaa agccccagaa gttcacctca tctgccaacg gagtgaccac acattacgtt 720
tcacagattg gtggcttccc aaatcaaaca gaagacggag gactaccaca aagtggtaga 780
attgttgttg attacatggt gcaaaaatct gggaaaacag gaacaattac ctatcaaagg 840
ggtattttat tgcctcaaaa ggtgtggtgc gcaagtggca ggagcaaggt aataaaagga 900
tccttgcctt taattggaga agcagattgc ctccacgaaa aatacggtgg attaaacaaa 960
agcaagcctt actacacagg ggaacatgca aaggccatag gaaattgccc aatatgggtg 1020
aaaacaccct tgaagctggc caatggaacc aaatatagac ctcctgcaaa actattaaag 1080
gaaaggggtt tcttcggagc tattgctggt ttcttagaag gaggatggga aggaatgatt 1140
gcaggttggc acggatacac atcccatggg gcacatggag tagcggtggc agcagacctt 1200
aagagcactc aagaggccat aaacaagata acaaaaaatc tcaactcttt gagtgagctg 1260
gaagtaaaga atcttcaaag actaagcggt gccatggatg aactccacaa cgaaatacta 1320
gaactagatg agaaagtgga tgatctcaga gctgatacaa taagctcaca aatagaactc 1380
gcagtcctgc tttccaatga aggaataata aacagtgaag atgaacatct cttggcgctt 1440
gaaagaaagc tgaagaaaat gctgggcccc tctgctgtag agatagggaa tggatgcttt 1500
gaaaccaaac acaagtgcaa ccagacctgt ctcgacagaa tagctgctgg tacctttgat 1560
gcaggagaat tttctctccc cacctttgat tcactgaata ttactgctgc atctttaaat 1620
gacgatggat tggataatca tactatactg ctttactact caactgctgc ctccagt 1677
<210> 19
<211> 559
<212> PRT
<213> 乙型流感病毒
<400> 19
Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp
1 5 10 15
Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys
20 25 30
Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr
35 40 45
Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr
50 55 60
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val
65 70 75 80
Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys Thr Gly Lys Ile Pro Ser Ala Arg Val
85 90 95
Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile
100 105 110
Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu His Ile Arg Leu Ser Thr His Asn Val Ile Asn Ala Glu Asn
130 135 140
Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Lys Ile Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn
145 150 155 160
Ile Thr Asn Gly Asn Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro
165 170 175
Lys Asn Asp Lys Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Ile Glu Val
180 185 190
Pro Tyr Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe
195 200 205
His Ser Asp Asn Glu Thr Gln Met Ala Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Lys
210 215 220
Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val
225 230 235 240
Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asn Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro
245 250 255
Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln Lys Ser Gly Lys
260 265 270
Thr Gly Thr Ile Thr Tyr Gln Arg Gly Ile Leu Leu Pro Gln Lys Val
275 280 285
Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu
290 295 300
Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys
305 310 315 320
Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys
325 330 335
Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr
340 345 350
Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile
355 360 365
Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His
370 375 380
Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser
405 410 415
Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met
420 425 430
Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp
435 440 445
Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu
450 455 460
Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu
465 470 475 480
Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly
485 490 495
Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp
500 505 510
Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asp Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr
515 520 525
Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu
530 535 540
Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser
545 550 555
<210> 20
<211> 1777
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
<400> 20
agcaaaagca ggggaaaata aaagcaacaa aaatgaaggc aatactagta gttctgctat 60
atacatttgc aaccgcaaat gcagacacat tatgtatagg ttatcatgcg aacaattcaa 120
cagacactgt agacacagta ctagaaaaga atgtaacagt aacacactct gttaaccttc 180
tagaagacaa gcataacggg aaactatgca aactaagagg ggtagcccca ttgcatttgg 240
gtaaatgtaa cattgctggc tggatcctgg gaaatccaga gtgtgaatca ctctccacag 300
caagctcatg gtcctacatt gtggaaacac ctagttcaga caatggaacg tgttacccag 360
gagatttcat cgattatgag gagctaagag agcaattgag ctcagtgtca tcatttgaaa 420
ggtttgagat attccccaat acaagttcat ggcccaatca tgactcgaac aaaggtgtaa 480
cggcagcatg tcctcatgct ggagcaaaaa gcttctacaa aaatttaata tggctagtta 540
aaaaaggaaa ttcataccca aagctcagca aatcctacat taatgataaa gggaaagaag 600
tcctcgtgct atggggcatt caccatccac ctactagtgc tgaccaacaa agtctctatc 660
agaatgcaga tacatatgtt tttgtggggt catcaagata cagcaagaag ttcaagccgg 720
aaatagcaat aagacccaaa gtgaggggtc aagaagggag aatgaactat tactggacac 780
tagtagagcc gggagacaaa ataacattcg aagcaactgg aaatctagtg gtaccgagat 840
atgcattcgc aatggaaaga aatgctggat ctggtattat catttcagat acaccagtcc 900
acgattgcaa tacaacttgt caaacaccca agggtgctat aaacaccagc ctcccatttc 960
agaatataca tccgatcaca attggaaaat gtccaaaata tgtaaaaagc acaaaattga 1020
gactggccac aggattgagg aatatcccgt ctattcaatc tagaggccta tttggggcca 1080
ttgccggttt cattgaaggg gggtggacag ggatggtaga tggatggtac ggttatcacc 1140
atcaaaatga gcaggggtca ggatatgcag ccgacctgaa gagcacacag aatgccattg 1200
acgagattac taacaaagta aattctgtta ttgaaaagat gaatacacag ttcacagcag 1260
taggtaaaga gttcaaccac ctggaaaaaa gaatagagaa tttaaataaa aaagttgatg 1320
atggtttcct ggacatttgg acttacaatg ccgaactgtt ggttctattg gaaaatgaaa 1380
gaactttgga ctaccacgat tcaaatgtga agaacttata tgaaaaggta agaagccagc 1440
taaaaaacaa tgccaaggaa attggaaacg gctgctttga attttaccac aaatgcgata 1500
acacgtgcat ggaaagtgtc aaaaatggga cttatgacta cccaaaatac tcagaggaag 1560
caaaattaaa cagagaagaa atagatgggg taaagctgga atcaacaagg atttaccaga 1620
ttttggcgat ctattcaact gtcgccagtt cattggtact ggtagtctcc ctgggggcaa 1680
tcagtttctg gatgtgctct aatgggtctc tacagtgtag aatatgtatt taacattagg 1740
atttcagaag catgagaaaa acacccttgt ttctact 1777
<210> 21
<211> 566
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 21
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Asn Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Pro Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 22
<211> 207
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
gctggctgct cgtggtgtac aggtccccgg aggcatcctg gctgggtggg aagtttctgg 60
cggtcacgcc ctgtccgctt tcgctccagg tcacactgag tggctcctgg gggaagaagc 120
cctggaccag gcaggcgatg accacgttcc catctggctg ggtgctgcag aggctcagcg 180
ggaagacctt ggggctggtc ggggatg 207
<210> 23
<211> 207
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
gctggctgct cgtggtgtac aggtccccgg aggcatcctg gctgggtggg aagtttctgg 60
cggtcacgcc ctgtccgctt tcgctccagg tcacactgag tggctcctgg gggaagaagc 120
cctggaccag gcaggcgatg accacgttcc catctggctg ggtgctgcag aggctcagcg 180
ggaagacctt ggggctggtc ggggatg 207
<210> 24
<211> 80
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 24
Asp Thr Ile Ser Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val
1 5 10 15
Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu
20 25 30
Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Ser Leu Leu Lys Gly Ile Ala
35 40 45
Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn
50 55 60
Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile Val
65 70 75 80
<210> 25
<211> 80
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 25
Ile Leu Gly Asn Pro Glu Ser Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro
20 25 30
Gly Tyr Phe Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val
35 40 45
Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro
50 55 60
Asn His Thr Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys
65 70 75 80
<210> 26
<211> 80
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 26
Ser Ser Trp Pro Asn His Thr Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser
1 5 10 15
His Asn Gly Lys Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly
20 25 30
Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile
50 55 60
Gly Asn Gln Arg Ala Leu Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val
65 70 75 80
<210> 27
<211> 80
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 27
Pro Pro Asn Ile Gly Asn Gln Arg Ala Leu Tyr His Thr Glu Asn Ala
1 5 10 15
Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Glu
20 25 30
Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu Gly Arg Ile Asn Tyr
35 40 45
Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile Ile Phe Glu Ala Asn
50 55 60
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu Ser Arg Gly Phe
65 70 75 80
<210> 28
<211> 80
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 28
Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu
1 5 10 15
Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met Asp
20 25 30
Glu Ser Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser
35 40 45
Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
50 55 60
Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile
65 70 75 80
<210> 29
<211> 80
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 29
Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr
1 5 10 15
Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala
20 25 30
Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp
35 40 45
Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp
50 55 60
Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn
65 70 75 80
<210> 30
<211> 79
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 30
Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr
1 5 10 15
Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala
20 25 30
Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn
35 40 45
Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu
50 55 60
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp
65 70 75
<210> 31
<211> 80
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 31
Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu
1 5 10 15
Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser
20 25 30
Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Ser Phe Glu Phe
35 40 45
Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr
50 55 60
Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys
65 70 75 80
<210> 32
<211> 40
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 32
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu
1 5 10 15
Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr
20 25 30
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr
35 40
<210> 33
<211> 46
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 33
Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr
1 5 10 15
Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe
20 25 30
Trp Met Ser Ser Asn Gly Ser Leu Gln Ser Arg Ile Ser Ile
35 40 45
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
gaggctcagc gggaagacct tg 22
<210> 35
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Illumina特异性连接基因正向:
<400> 35
caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58
<210> 36
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Illumina特异性连接基因反向
<400> 36
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

Claims (16)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至甲型流感病毒(IAV)H1亚型的血凝素(HA)，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别由SEQ IDNOs:3-5的氨基酸序列组成，和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别由SEQ IDNOs:6-8的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中当结合至HA时，所述抗体结合至如下构象表位：所述表位依赖于与pH1N1(SEQ ID NO:13)的HA的E129和K180相对应的氨基酸残基。
4.权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含Fc恒定区变体。
5.权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
6.权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段缀合至治疗剂、聚合物、可检测标签或酶。
7.权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
8.权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述治疗剂是细胞毒性剂。
9.分离的核酸，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区。
10.表达载体，其包含权利要求9所述的核酸。
11.培养的宿主细胞，其包含权利要求10所述的表达载体。
12.制备抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
获取包含如下载体的培养宿主细胞，所述载体编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区；
在允许表达由所述载体编码的多肽并组装抗体或其片段的条件下在培养基中培养所述细胞，和
从培养的细胞或细胞培养基中纯化所述抗体或片段。
13.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
14.治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物在制备用于中和受试者中IAV的治疗性组合物中的用途。
15.治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗受试者中IAV感染的治疗性组合物中的用途。
16.权利要求13所述的药物组合物，其进一步包含第二抗体或其抗原结合片段。
CN201880038789.6A 2017-05-15 2018-05-10 广泛中和的抗流感单克隆抗体及其用途 Active CN111094335B (zh)

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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3170570A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 James J. KOBIE Monoclonal antibodies against the hemagglutinin (ha) and neuraminidase (na) of influenza h3n2 viruses

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103665156A (zh) * 2012-09-14 2014-03-26 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗流感病毒广谱中和性的结合分子3e1
CN104968367A (zh) * 2012-11-13 2015-10-07 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗血凝素抗体和使用方法

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
CN1763097B (zh) 1999-01-15 2011-04-13 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
CA2399832C (en) 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6725230B2 (en) 2000-07-18 2004-04-20 Aegis Analytical Corporation System, method and computer program for assembling process data of multi-database origins using a hierarchical display
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004016750A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 Macrogenics, Inc. FcϜRIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
WO2004035752A2 (en) 2002-10-15 2004-04-29 Protein Design Labs, Inc. ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
PL1706424T3 (pl) 2004-01-12 2010-04-30 Mentrik Biotech Llc Warianty regionu Fc
EP2053062A1 (en) 2004-03-24 2009-04-29 Xencor, Inc. Immunoglobin variants outside the Fc region
US7527791B2 (en) 2004-03-31 2009-05-05 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
JP5055603B2 (ja) 2004-08-04 2012-10-24 メントリック・バイオテック・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 変異Ｆｃ領域
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP3395826B1 (en) 2013-08-03 2020-10-14 Calder Biosciences Inc. Methods of making and using influenza virus hemagglutinin complexes
WO2015028478A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel influenza antigens and antibodies
US10435462B2 (en) * 2015-03-31 2019-10-08 Viro Dynamics Corporation Hybrid influenza seed viruses, compositions thereof, and use thereof in the diagnosis or therapy of influenza
WO2016205347A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103665156A (zh) * 2012-09-14 2014-03-26 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗流感病毒广谱中和性的结合分子3e1
CN104968367A (zh) * 2012-11-13 2015-10-07 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗血凝素抗体和使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Passive immunization for influenza through antibody therapies, a review of the pipeline, challenges and potential applications;Erin Sparrow,et al.;《Vaccine》;20161026;第34卷(第45期);第5442-5448页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018213097A1 (en) 2018-11-22
US20200140526A1 (en) 2020-05-07
EP3625251A1 (en) 2020-03-25
US11168129B2 (en) 2021-11-09
CN111094335A (zh) 2020-05-01

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