ES2894777T3

ES2894777T3 - Neutralización de moléculas de unión anti-influenza y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2894777T3
Application number: ES16728534T
Authority: ES
Inventors: Nicole Kallewaard-Lelay; Qing Zhu; Godfrey Rainey; Cuihua Gao; Srinath Kasturirangan; Changshou Gao
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2036-05-31
Also published as: RU2017145094A; JP6867306B2; US10442854B2; EP3303384A1; PL3303384T3; US20200109187A1; AU2016271323A1; CY1125793T1; RU2017145094A3; EP3960761A1; US20180155413A1; JP2021112193A; HUE056407T2; RS62446B1; MX2022001220A; US11524993B2; LT3303384T; HK1253092A1; SI3303384T1; MX2017015189A

Abstract

Una molécula de unión aislada que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, en la que la molécula de unión aislada se selecciona de: (a) una molécula de unión aislada que comprende un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de influenza A, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv y en la que el primer dominio de unión comprende: (i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:7 y un VL de una cadena ligera de un anticuerpo de SEQ ID NO:2; o (ii) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:17 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:12; y un segundo dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza B y neutralizar el virus de la influenza B en al menos dos linajes filogenéticamente distintos, en la que el segundo dominio de unión comprende un scFv y en la que el segundo dominio de unión comprende: (i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:59 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:54; o (b) una molécula de unión aislada que comprende un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de la influenza A, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv y en la que el primer dominio de unión comprende: (i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:7 y un VL de una cadena ligera de un anticuerpo de SEQ ID NO:2; o (ii) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:17 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:12; y un segundo dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza B y neutralizar el virus de la influenza B en al menos dos linajes filogenéticamente distintos, en la que el segundo dominio de unión comprende un scFv y en la que el segundo dominio de unión comprende: (i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:27 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:22; o (c) una molécula de unión aislada que comprende un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de la influenza A, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv y en la que el primer dominio de unión comprende: (i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:7 y un VL de una cadena ligera de un anticuerpo de SEQ ID NO:2; o (ii) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:17 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:12; y un segundo dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza B y neutralizar el virus de la influenza B en al menos dos linajes filogenéticamente distintos, en la que el segundo dominio de unión comprende un scFv y en la que el segundo dominio de unión comprende: (i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:43 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:38; en la que el primer dominio de unión comprende una fórmula VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3, en la que L1 y L2 son independientemente un enlazador y scFv es el segundo dominio de unión; y en la que el VL del scFv, el segundo dominio de unión, comprende un residuo de cisteína en una posición selecionada de 43, 44, 46, 49, 50 o 100 y el VH del scFv del segundo dominio de unión comprende un residuo de cisteía en una posición seleccionada entre 43, 44, 100, 101 o 105 (numeración de acuerdo con Kabatt).

Description

DESCRIPCIÓN

Neutralización de moléculas de unión anti-influenza y usos de las mismas

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que tienen una amplia actividad neutralizante contra el virus de influenza A y B y a los usos de dichos anticuerpos.

Antecedentes de la invención

Los virus influenza producen epidemias de gripe anuales y pandemias ocasionales, que suponen una amenaza significativa para la salud pública en todo el mundo. La infección por gripe estacional está asociada con 200,000-500,000 muertes cada año, particularmente en niños pequeños, pacientes inmunocomprometidos y ancianos. Las tasas de mortalidad normalmente aumentan adicionalmente durante estaciones con brotes de gripe pandémicos. Sigue habiendo una necesidad médica insatisfecha significativa de agentes terapéuticos antivirales potentes para prevenir y tratar infecciones por influenza, en particular en poblaciones desatendidas.

Existen tres tipos de virus de influenza: tipos A, B y C. La mayor parte de la enfermedad de influenza es causada por los virus de influenza A y B (Thompson et al. (2004) JAMA. 292:1333-1340; y Zhou et al. (2012) Clin Infect. Dis. 54:1427-1436). La estructura global de los virus influenza A, B y C es similar, e incluye una envoltura viral que rodea un núcleo central. La envoltura viral incluye dos glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA); HA media la unión del virus a células diana y la entrada en células diana, mientras que NA está implicada en la liberación de virus progenie de células infectadas.

La proteína HA es responsable de la unión al receptor de la célula huésped, así como de la fusión de las membranas de las células virales y del huésped, y es el objetivo principal de las respuestas inmunitarias humorales protectoras. La proteína HA es de estructura trimérica e incluye tres copias idénticas de un único precursor polipeptídico, HA0, que, tras la maduración proteolítica, se escinde en un intermedio metaestable que contiene una cabeza globular (HA1) y una región de tallo (HA2) (Wilson et al. (1981) Nature. 289:366-373). La "cabeza globular" distal de la membrana constituye la mayoría de la estructura HA1 y contiene el bolsillo de unión al ácido siálico para la entrada del virus y los dominios antigénicos principales. La estructura del "tallo" proximal de la membrana, ensamblada a partir de los residuos HA2 y HA1, contiene la maquinaria de fusión, que sufre un cambio conformacional en el entorno de pH bajo de los endosomas tardíos para desencadenar la fusión y penetración de la membrana en las células. El grado de homología de secuencia entre los subtipos de influenza A es menor en la región HA1 (34% -59% de homología entre subtipos) que en la región HA2 (51% -80% de homología).

Los virus influenza A pueden clasificarse en subtipos basándose en variaciones genéticas en los genes de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Serológicamente, la influenza A se puede dividir en 18 subtipos HA que se dividen adicionalmente en dos grupos filogenéticos distintos: grupo 1 (subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 y H18) y el grupo 2 (subtipos H3, H4, H7, H10, H14, y H15). Actualmente, en las epidemias estacionales, los subtipos de HA de influenza A H1 y H3 están principalmente asociados con enfermedades humanas, mientras que los virus que codifican H5, H7, H9 y H10 causaron brotes humanos esporádicos debido a la transmisión directa de los animales. A diferencia de los virus de influenza A, los virus de influenza B están restringidos a la infección humana y los virus de influenza B no se dividen en subtipos basados en las dos glicoproteínas de superficie. De hecho, hasta la década de 1970, los virus de la influenza B se clasificaron como un único grupo homogéneo. Sin embargo, durante la década de 1970, los virus de la influenza B comenzaron a divergir en dos linajes antigénicamente distinguibles que se denominaron los linajes Victoria y Yamagata después de sus primeros representantes, B/Victoria/2/87 y B/Yamagata/16/88, respectivamente. (Biere et al. (2010) J Clin Microbiol. 48(4):1425-7; doi: 10.1128/JCM.02116-09. Epub. 27 de enero de 2010). Tanto el linaje Yamagata como Victoria contribuyen a las epidemias anuales. Aunque la morbilidad causada por virus influenza B es inferior que la asociada con influenza A H3N2, es mayor que la asociada con influenza A H1N1 (Zhou et al. (2012) Clin Infect. Dis. 54:1427-1436).

Los anticuerpos neutralizantes provocados por la infección por virus influenza se dirigen normalmente a la cabeza globular HA1 para impedir la unión al receptor viral y habitualmente son específicos de cepa. En general los anticuerpos con reactividad cruzada que neutralizan uno o más subtipos o linajes son raros. Recientemente, se han descubierto algunos anticuerpos que pueden neutralizar múltiples subtipos de virus de influenza A tanto en el grupo 1 como el 2 (Corti et al. (2011) Science 333(6044):850-856, Li et al. (2012) PNAS 109(46):18897-18902, Dreyfus et al. (2012) Science 337(6100):1343-1348, y Nakamura et al. (2013) Cell Host and Microbe 14:93-103), o virus de la influenza B de ambos linajes (Dreyfus et al. (2012) Science 337(6100):1343-1348 y Yasugi et al. (2013) PLoS Path 9(2): e1003150. doi: 10.1371/journal.ppat.1003150), aunque la mayoría tienen limitaciones en amplitud de cobertura, perfil de resistencia o potencia. Se ha descrito que solamente un anticuerpo se une a ambas proteínas HA de influenza A y B, aunque este anticuerpo no neutraliza funcionalmente los virus de influenza B ni atenúa la enfermedad cuando se administra de forma terapéutica (Dreyfus et al. (2012) Science 337(6100):1343-1348). El documento WO2013086052 describe anticuerpos útiles para la inmunización pasiva contra la influenza. El documento WO2015051010 describe anticuerpos anti-influenza A neutralizantes y usos de los mismos. El documento WO2013132007 describe moléculas de unión humanas que pueden unirse a los virus de la influenza B y neutralizarlos y usos de los mismos. Wagner et. al. (PNAS, 111:47, 2014, págs.

16820-16825) describe que un anticuerpo biespecífico generado con sortasa y química click tiene un amplia actividad anti-virus de la influenza. Friesen et. al. (PNAS, 111:1, 2014, págs. 445-450) describe la neutralización del grupo 2 del virus de la influenza. Hasta la fecha, no hay anticuerpos disponibles que neutralicen o inhiban ampliamente un amplio espectro de infecciones por virus de la influenza A y B o atenúen enfermedades causadas por el virus de la influenza A y B. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar nuevos anticuerpos que protejan contra múltiples virus de influenza.

Resumen de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones. Se proporciona una molécula de unión aislada de acuerdo con la reivindicación 1. En el presente documento se describe una molécula de unión aislada que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B. En una divulgación, la molécula de unión aislada incluye un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de influenza A; y un segundo dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza B y neutralizar el virus de la influenza B en al menos dos linajes filogenéticamente distintos. En una divulgación, el primer dominio de unión es capaz de neutralizar uno o más subtipos del grupo 1 del virus de influenza A seleccionados de: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 y variantes de los mismos; y uno o más subtipos del grupo 2 del virus de la influenza A seleccionados de entre: H3, H4, H7, H10, H14 y H15 y variantes de los mismos. En una divulgación, el segundo dominio de unión es capaz de neutralizar el virus de influenza B tanto en el linaje Yamagata como Victoria.

En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un anticuerpo del virus anti-influenza A o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una divulgación, el segundo dominio de unión de la molécula de unión incluye un anticuerpo del virus anti-influenza B o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos un VH de una cadena pesada del anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera del anticuerpo. En una divulgación, el primer dominio de unión incluye al menos un VH de una cadena pesada del anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera del anticuerpo. En una divulgación, el segundo dominio de unión incluye al menos un VH de una cadena pesada del anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera del anticuerpo.

En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en el que el conjunto de seis CDR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: HCDR1 de SEQ ID NO.: 8, HCDR2 de SEQ ID NO.: 9, HCDR3 de SEQ ID NO.: 10, LCDR1 de SEQ ID NO.: 3, LCDR2 de SEQ ID NO.: 4 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 5; (b) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 8, HCDR2 de SEQ ID NO.: 9, HCDR3 de SEQ ID NO.: 10, LCDR1 de SEQ ID NO.: 3, LCDR2 de SEQ ID NO.: 4 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 5;

(c) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: HCDR1 de SEQ ID NO.: 18, HCDR2 de SEQ ID NO.: 19, HCDR3 de SEQ ID NO.: 20, LCDR1 de SEQ ID NO.: 13, LCDR2 de SEQ ID NO.: 14, LCDR3 de SEQ ID NO.: 15; y

(d) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 18, HCDR2 de SEQ ID NO.: 19, HCDR3 de SEQ ID NO.: 20, LCDR1 de SEQ ID NO.: 13, LCDR2 de SEQ ID NO.: 14, LCDR3 de SEQ ID NO.: 15.

En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO.: 7; y SEQ ID NO.: 17. En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO.: 2; y un VL de SEQ ID NO.: 12. En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un VH y un VL que es al menos un 75% idéntico a una secuencia de aminoácidos de un VH y un VL, respectivamente, seleccionada de un VH de SEQ ID NO.: 7 y un VL de SEQ ID NO.: 2; y un VH de SEQ ID NO.: 17 y un VL de SEQ ID NO.: 12. En una divulgación, el primer dominio de unión incluye un VH y un VL seleccionados de: un VH de SEQ ID NO.: 7 y un VL de SEQ ID NO.: 2; y un VH de SEQ ID NO.: 17 y un VL de SEQ ID NO.: 12.

En una divulgación, el segundo dominio de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en el que el conjunto de seis CDR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: HCDR1 de SEQ ID NO.: 28, HCDR2 de SEQ ID NO.: 29, HCDR3 de SEQ ID NO.: 30, LCDR1 de SEQ ID NO.: 23, LCDR2 de SEQ ID NO.: 24 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 25;

(b) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 28, HCDR2 de SEQ ID NO.: 29, HCDR3 de SEQ ID NO.: 30, LCDR1 de SEQ ID NO.: 23, LCDR2 de SEQ ID NO.: 24 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 25;

(c) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 44, HCDR2 de SEQ ID NO.: 45, HCDR3 de SEQ ID NO.: 46, LCDR1 de SEQ ID NO.: 39, LCDR2 de SEQ ID NO.: 40 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 41;

(d) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 44, HCDR2 de SEQ ID NO.: 45, HCDR3 de SEQ ID NO.: 46, LCDR1 de SEQ ID NO.: 39, LCDR2 de SEQ ID NO.: 40 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 41;

(e) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: HCDR1 de SEQ ID NO.: 60, HCDR2 de SEQ ID NO.: 61, HCDR3 de SEQ ID NO.: 62, LCDR1 de SEQ ID NO.: 55, LCDR2 de SEQ ID NO.: 56, LCDR3 de SEQ ID NO.: 57; y

(f) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 60, HCDR2 de SEQ ID NO.: 61, HCDR3 de SEQ ID NO.: 62, LCDR1 de SEQ ID NO.: 55, LCDR2 de SEQ ID NO.: 56, LCDR3 de SEQ ID NO.: 57.

En una divulgación, el segundo dominio de unión de la molécula de unión incluye un VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un VH seleccionado de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 27;

(b) un VH de SEQ ID NO.: 33;

(c) un VH de SEQ ID NO.: 36;

(d) un VH de SEQ ID NO.: 43;

(e) un VH de SEQ ID NO.: 49;

(f) un VH de SEQ ID NO.: 52;

(g) un VH de SEQ ID NO.: 59; y

(h) un VH de SEQ ID NO.: 65.

En una divulgación, el segundo dominio de unión de la molécula de unión incluye un VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un VL seleccionado de:

(a) un VL de SEQ ID NO.: 22;

(b) un VL de SEQ ID NO.: 32;

(c) un VL de SEQ ID NO.: 35;

(d) un VL de SEQ ID NO.: 38;

(e) un VL de SEQ ID NO.: 48;

(f) un VL de SEQ ID NO.: 51;

(g) un VL de SEQ ID NO.: 54; y

(h) un VL de SEQ ID NO.: 64.

En una divulgación, el segundo dominio de unión de la molécula de unión incluye un VH y un VL que es al menos un 75% idéntico a la secuencia de aminoácidos de un VH y un VL, respectivamente, seleccionados de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 27 y un VL de SEQ ID NO.: 22;

(b) un VH de SEQ ID NO.: 33 y un VL de SEQ ID NO.: 32;

(c) un VH de SEQ ID NO.: 36 y un VL de SEQ ID NO.: 35;

(d) un VH de SEQ ID NO.: 43 y un VL de SEQ ID NO.: 38;

(e) un VH de SEQ ID NO.: 49 y un VL de SEQ ID NO.: 48;

(f) un VH de SEQ ID NO.: 52 y un VL de SEQ ID NO.: 51;

(g) un VH de SEQ ID NO.: 59 y un VL de SEQ ID NO.: 54; y

(h) un VH de SEQ ID NO.: 65 y un VL de SEQ ID NO.: 64.

En una divulgación, el segundo dominio de unión de la molécula de unión incluye un VH y un VL seleccionados de: (a) un VH de SEQ ID NO.: 27 y un VL de SEQ ID NO.: 22;

(b) un VH de SEQ ID NO.: 33 y un VL de SEQ ID NO.: 32;

(c) un VH de SEQ ID NO.: 36 y un VL de SEQ ID NO.: 35;

(d) un VH de SEQ ID NO.: 43 y un VL de SEQ ID NO.: 38;

(e) un VH de SEQ ID NO.: 49 y un VL de SEQ ID NO.: 48;

(f) un VH de SEQ ID NO.: 52 y un VL de SEQ ID NO.: 51;

(g) un VH de SEQ ID NO.: 59 y un VL de SEQ ID NO.: 54; y

(h) un VH de SEQ ID NO.: 65 y un VL de SEQ ID NO.: 64.

En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos dos cadenas pesadas del anticuerpo y al menos dos cadenas ligeras del anticuerpo. En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo biespecífico. En una divulgación, uno o más dominios de unión de la molécula de unión incluyen un dominio de fragmento variable (Fv). En una divulgación, uno o más dominios de unión de la molécula de unión incluyen una molécula scFv. En una divulgación, uno o más dominios de unión de la molécula de unión incluyen un dominio Fv y uno o más dominios de unión incluyen una molécula scFv. En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un dominio Fv del virus anti-influenza A. En una divulgación, la molécula de unión incluye un dominio Fv que incluye un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo, y específicamente se une al virus anti-influenza A. En una divulgación, el segundo dominio de unión de la molécula de unión incluye una molécula scFv del virus anti-influenza B.

En una divulgación, el primer dominio de unión incluye un dominio Fv del virus anti-influenza A y el segundo dominio de unión incluye una molécula scFv del virus anti-influenza B. En una divulgación, el dominio Fv del primer dominio de unión tiene una cadena pesada (HC) con una cadena polipeptídica que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y una cadena ligera (LC) con una cadena polipeptídica que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y

(a) el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo carboxi de la HC del primer dominio de unión; (b) el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo amino de la HC del primer dominio de unión; (c) el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo amino de la LC del primer dominio de unión; o

(d) el segundo dominio de unión está intercalado covalentemente en la cadena polipeptídica de la HC del primer dominio de unión.

En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene uno o más dominios N-terminales en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente a uno o más dominios N-terminales del anticuerpo o fragmento del mismo. En una divulgación, el dominio N-terminal del anticuerpo o fragmento del mismo incluye uno o más dominios Fv y una o más moléculas scFv están unidas covalentemente a uno o más dominios Fv del anticuerpo o fragmento del mismo. En una divulgación, el dominio N-terminal incluye un dominio Fv que incluye un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL). En una divulgación, una o más moléculas scFv están unidas covalentemente a uno o más dominios variables de cadena ligera (VL) del anticuerpo o fragmento del mismo. En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que incluye una cadena ligera de anticuerpo que tiene una fórmula scFv-L1-VL-CL, en la que scFv es una molécula scFv, L1 es un enlazador, VL es un dominio variable de cadena ligera, CL es un dominio constante de cadena ligera y VL es un dominio variable de cadena ligera. En una divulgación, una o más moléculas scFv están unidas covalentemente a uno o más dominios variables de cadena pesada (VH) del anticuerpo o fragmento del mismo. En una divulgación, la cadena pesada incluye una fórmula scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3, en la que scFv es una molécula scFv, L1 es un enlazador, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio constante de cadena pesada dominio-3.

En una divulgación, la molécula de unión incluye un dominio de cadena pesada variable (VH) con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de dominio VH de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 17. En una divulgación, la molécula de unión incluye un dominio de cadena ligera variable (VL) con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de dominio VL de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y Se Q ID NO: 12.

En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene un dominio C-terminal, en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio C-terminal del anticuerpo o fragmento del mismo. En una divulgación, la molécula de unión incluye a primera y segunda cadena pesada con primer y segundo dominios C-terminal, respectivamente, en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio C-terminal de la primera cadena pesada, la segunda cadena pesada, o combinaciones de las mismas. En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que incluye uno o más dominios constantes de cadena pesada, en la que una o más moléculas scFv se insertan en la cadena pesada entre uno o más dominios constantes de cadena pesada de una o más cadenas pesadas. En una divulgación, una o más cadenas pesadas incluyen una fórmula VH-CH1-CH2-CH3, en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio constante de cadena pesada dominio-3. En una divulgación, una o más cadenas pesadas incluyen una fórmula VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3, en la que L1 y L2 independientemente son un enlazador y un scFv es una molécula scFv. En una divulgación, una o más cadenas pesadas incluyen una fórmula VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3, en la que L1 y L2 independientemente son un enlazador y un scFv es una molécula scFv. En una divulgación, L1 y L2 incluyen independientemente (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, (SEQ ID NO:93) (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5 (SEQ ID NO:106), o una combinación de (a) y (b).

En una divulgación, el scFv incluye una fórmula: VH-LS-VL, y en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, LS es un enlazador, y VL es un dominio variable de cadena ligera. En una divulgación, LS incluye (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1,2, 3, 4, o 5 (SEQ ID NO:93), (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5 (SEQ ID No : 106), o una combinación de (a) y (b).

En una divulgación, la cadena pesada y la cadena ligera del primer dominio de unión se unen por uno o más enlaces disulfuro. En una divulgación, el scFv del segundo dominio de unión incluye un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) y el VH del scFv incluye un residuo de cisteína en una posición seleccionada de la posición 43, 44, 100, 101, 105, y combinaciones de las mismas, y el VL del scFv incluye un residuo de cisteína en una posición seleccionada de entre la posición 43, 44, 46, 49, 50, 100, y combinaciones de las mismas. En una divulgación, el v L y el VH del scFv se unen por un enlace disulfuro seleccionado de: VL100-VH44, VL43-VH105, VL46-VH101, VL49-VH100, VL50-VH100, y combinaciones de los mismos. En una divulgación, el VH y el VL del scFv se unen por un enlace disfulfuro seleccionado de: VH44-VL100, VH100-VL49, VH100-VL50, VH101-VL46, VH105-VL43, y combinaciones de los mismos.

En una divulgación, VH incluye un conjunto de tres CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, en las que el conjunto de tres CDR se selecciona de:

(a) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: HCDR1 de SEQ ID NO.: 28, HCDR2 de SEQ ID NO.: 29, HCDR3 de SEQ ID NO.: 30;

(b) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 28, HCDR2 de SEQ ID NO.: 29, HCDR3 de SEQ ID NO.: 30;

(c) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: HCDR1 de SEQ ID NO.: 44, HCDR2 de SEQ ID NO.: 45, HCDR3 de SEQ ID NO.: 46;

(d) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 44, HCDR2 de SEQ ID NO.: 45, HCDR3 de SEQ ID NO.: 46;

(e) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: HCDR1 de SEQ ID NO.: 60, HCDR2 de SEQ ID NO.: 61, HCDR3 de SEQ ID NO.: 62; y

(f) una secuencia de aminoácidos de: h Cd R1 de SEQ ID NO.: 60, HCDR2 de SEQ ID NO.: 61, HCDR3 de SEQ ID NO.: 62.

En una divulgación, VL incluye un conjunto de tres CDR: LCDR1, LCDR2, LCDR3 en las que el conjunto de tres CDR se selecciona de:

(a) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: LCDR1 de SEQ ID NO.: 23, LCDR2 de SEQ ID NO.: 24 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 25;

(b) una secuencia de aminoácidos de: LCDR1 de SEQ ID NO.: 23, LCDR2 de SEQ ID NO.: 24 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 25;

(c) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: LCDR1 de SEQ ID NO.: 39, LCDR2 de SEQ ID NO.: 40 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 41;

(d) una secuencia de aminoácidos de: LCDR1 de SEQ ID NO.: 39, LCDR2 de SEQ ID NO.: 40 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 41;

(e) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a: LCDR1 de SEQ ID NO.: 55, LCDR2 de SEQ ID NO.: 56, LCDR3 de SEQ ID NO.: 57; y

(f) una secuencia de aminoácidos de: LCDR1 de SEQ ID NO.: 55, LCDR2 de SEQ ID NO.: 56, LCDR3 de SEQ ID NO.: 57.

En una divulgación, el scFv tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:63.

En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, incluyendo una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68. En una divulgación, el anticuerpo biespecífico incluye una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, e incluye una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69. En una divulgación, la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, e incluye una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68 y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69.

En una divulgación, el anticuerpo biespecífico incluye:

(a) una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que incluye la SEQ ID NO:66 y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que incluye la SEQ ID NO:67; o

(b) una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que incluye la SEQ ID NO:68 y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que incluye la SEQ ID NO:69

También se proporciona una célula que incluye o produce una molécula de unión o un anticuerpo o fragmento biespecífico descrito en el presente documento.

También se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión o anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento. En una divulgación, se proporciona un vector que incluye un polinucleótido que codifica una molécula de unión o anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento.

En otra divulgación, se proporciona una célula huésped que incluye un polinucleótido que codifica una molécula de unión o anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento.

También se proporciona en el presente documento una composición que incluye una molécula de unión o anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo como se describe en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporciona un kit que incluye dicha composición. En otra divulgación, se proporciona dicha composición para su uso en un método para prevenir o tratar una infección por virus de la influenza A o el virus de la influenza B en un sujeto en el que el método incluye administrar a un sujeto una cantidad eficaz de tal composición.

También se proporciona en el presente documento un método para fabricar una molécula de unión o anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo como se describe en el presente documento. En una divulgación, el método incluye cultivar una célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión o anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo. En una divulgación, el método incluye además aislar la molécula de unión del cultivo de la célula huésped.

También se proporcionan métodos para usar una molécula de unión o anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo descrito en el presente documento. En una divulgación, la molécula de unión o un anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo es para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección por influenza A, infección por influenza B, o una combinación de los mismos en un sujeto.

En otra divulgación, una molécula de unión o un anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo descrito en el presente documento es adecuada para su uso en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de infección de influenza A, infección de influenza B, o una combinación de los mismos en un sujeto. En una divulgación, una molécula de unión o un anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo que se describe en el presente documento se usa en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de infección por influenza A e influenza B en un sujeto. En una divulgación, se proporciona una molécula de unión o un anticuerpo biespecífico para su uso en un método para la profilaxis o tratamiento de infección por influenza A, infección por influenza B, o una combinación del mismo en un sujeto, que incluye administrar una cantidad eficaz de una molécula de unión o un anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo que se describe en el presente documento al sujeto.

En una divulgación, se proporciona una molécula de unión o un anticuerpo biespecífico para su uso en un método para la profilaxis o tratamiento de una infección por influenza A e una infección por influenza B en un sujeto, que incluye administrar una cantidad eficaz de una molécula de unión o un anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo que se describe en el presente documento al sujeto.

En una divulgación, una molécula de unión o un anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo que se describe en el presente documento son adecuados para el diagnóstico in vitro de infección por influenza A, infección por influenza B, o una combinación de las mismas en un sujeto.

Breve Descripción de las figuras

La figura 1 representa el formato estructural general de cinco estructuras de anticuerpos biespecíficos diferentes (BiS), BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 y BiS5. El scFv se representa en gris oscuro y el IgG Fv se representa en gris claro.

Las figuras 2A-D muestran la actividad ADCC de células asesinas naturales humanas (NK) primarias incubadas en presencia de cantidades crecientes de GL20/39 BiS4 43/105 (BiS de gripe), GL20 o FBC39. La eliminación de células infectadas de (A) A/California/07/2009 H1N1 (B) A/Hong Kong/8/68 H3N2 (C) linaje victoria B/Malaysia/2506/2004 y (D) células A549 infectadas del linaje yamagata B/Sichuan/379/99 se midieron por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).

Las figuras 3A-C muestran la actividad de ADCP y CDC de anticuerpos anti-HA GL20/39 BiS443/105 (Flu BiS), GL20, o FBC39. La actividad de ADCP se representa por el porcentaje de macrófagos humanos que experimentaron fagocitosis de células diana MDCK que expresaban la proteína HA de (A) A/South Dakota/6/2007 H1N1 y (B) A/Hong Kong/8/68 H3N2. (C) La eliminación de células mediada por CDC se midió por la liberación de LDH a partir de células MDCK infectadas de A/Puerto Rico/8/34 en presencia de complemento de conejo bebé.

Las figuras 4A-D muestran la tasa de supervivencia (A y C) y los títulos víricos pulmonares el día 5 posterior a la inyección (B y D) en cada grupo de un estudio cuando se administraron diferentes concentraciones de GL20/39 BiS4 43/105 (Flu BiS), GL20, y un anticuerpo de control no relevante(Ctl. mAb) a ratones 4 horas antes de la infección con una dosis letal de virus de la influenza A/Wilson Smith N/33 H1N1 (A y B), rA/HK/68 H3N2 (C y D).

Las figuras 5A-D muestran la tasa de supervivencia (A y C) y los títulos víricos pulmonares el día 5 posterior a la infección (B y D) en cada grupo de un estudio cuando se administraron diferentes concentraciones de GL20/39 BiS4 43/105 (Flu BiS), FBC39, y un anticuerpo de control no relevante (Ctl. mAb) a ratones 4 horas antes de la infección con una dosis letal de (A y B) virus de la influenza del linaje yamagata B/Florida/4/2006 y (C y D) del linaje victoria B/Malaysia/2506/2004.

Las figuras 6A-F muestran la tasa de supervivencia (A y B), los títulos víricos pulmonares el día 5 posterior a la infección (C y D), y la función pulmonar medida por oximetría de pulsos el día 6 posterior a la infección (E y F) en cada grupo de un estudio en el que los ratones se infectaron con una dosis letal del virus de influenza A/Wilson Smith N/33 H1N1 (A, C, E) o un virus del linaje yamagata B/Florida/4/2006 (B, D, F). El tratamiento de 25 mg/kg dos veces al día (BID) de oseltamivir durante 5 días, 10 mg/kg de GL20/39 BiS443/105 (Flu BiS), o 10 mg/kg de anticuerpo de control no relevante (Ctl. mAb) se inició en diferentes puntos temporales (Día 1, Día 2, Día 3, Día 4 posterior a la infección).

Descripción detallada

Introducción

La presente invención está definida por las reivindicaciones. En el presente documento se describen moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanos, fragmentos de unión a antígeno, derivados o conjugados de los mismos que incluyen al menos dos dominios de unión anti-influenza. Se proporciona una molécula de unión aislada de acuerdo con la reivindicación 1. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que se une específicamente al virus de la influenza A y un segundo dominio de unión que se une específicamente al virus de la influenza B. Los anticuerpos que se unen específicamente al virus de la influenza A se describen en las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N.° 61/885,808, presentada el 2 de octubre de 2013 y 62/002,414, presentada el 23 de mayo de 2014, y los anticuerpos que se unen específicamente al virus de la influenza B se describen en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/024,804, presentada el 15 de julio de 2014.

En una divulgación, el primer dominio de unión se une específicamente al tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A. En una divulgación, el primer dominio de unión se une específicamente al tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutraliza al menos un subtipo del grupo 1 y al menos un subtipo del grupo 2 del virus de la influenza A.

En una divulgación, el segundo dominio de unión se une específicamente a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza B. En una divulgación, el segundo dominio de unión se une específicamente a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza B y neutraliza el virus de la influenza B en dos linajes filogenéticamente distintos. En una divulgación, el segundo dominio de unión se une específicamente a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza B y neutraliza el virus de la influenza B en los linajes Yamagata y Victoria. En otra divulgación, el segundo dominio de unión se une específicamente a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza B y a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutraliza al menos un virus de la influenza B del linaje Yamagata; al menos un virus de la influenza B del linaje Victoria; al menos un subtipo de virus de influenza A, y combinaciones de los mismos.

En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con actividad de neutralización mejorada contra una o más cepas del virus de influenza A y/o del virus de influenza B en comparación con cualquiera de los anticuerpos parentales. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con una actividad de neutralización mejorada contra una o más cepas de influenza A del grupo 1 o del grupo 2. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con actividad de neutralización mejorada contra una cepa del grupo 1 del virus de la influenza A seleccionada de los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 y H18. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con actividad de neutralización mejorada contra una cepa del grupo 2 del virus de la influenza A seleccionada de los subtipos H3, H4, H7, H10, H14, y H15. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con actividad de neutralización mejorada contra el subtipo H9 del virus de influenza A.

Como se usa en el presente documento, el término "neutralizar" se refiere a la capacidad de una molécula de unión, tal como un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de la misma, para unirse a un agente infeccioso, por ejemplo, virus de influenza A y/o B, y reducir actividad biológica del agente infeccioso, por ejemplo, virulencia. En una divulgación, la molécula de unión se une inmunoespecíficamente al menos a un epítopo específico o determinante antigénico del virus de influenza A; virus de la influenza B, o combinaciones de los mismos. Una molécula de unión puede neutralizar la actividad de un agente infeccioso, tal como el virus de la influenza A y/o el virus de la influenza B en diversos puntos durante el ciclo de vida del virus. Por ejemplo, un anticuerpo puede interferir con el acoplamiento del virus a una célula diana interfiriendo con la interacción del virus y uno o más receptores de la superficie celular. Alternativamente, un anticuerpo puede interferir con una o más interacciones tras el acoplamiento del virus con sus receptores, por ejemplo, interfiriendo con la internalización del virus mediante endocitosis mediada por receptor.

Terminología

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones específicas o etapas de procedimiento, ya que tales pueden variar. Debe señalarse que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, la forma en singular “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes en plural, a menos que el contexto claramente dictamine de otro modo.

El término "aproximadamente" se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, a través de procedimientos de medición y manipulación típicos usados para preparar compuestos, composiciones, concentrados o formulaciones; por error inadvertido en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los materiales de partida o ingredientes utilizados para realizar los métodos, y consideraciones similares. El término "aproximadamente" también incluye cantidades que difieren debido al envejecimiento de compuestos, composiciones, concentrados o formulaciones con una concentración o mezcla inicial particular, y cantidades que difieren debido a la mezcla o procesamiento de compuestos, composiciones, concentrados o formulaciones con una concentración inicial particular o mezcla. Al modificarse por el término "aproximadamente", las reivindicaciones adjuntas a la presente incluyen equivalentes a estas cantidades.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado al interpretado normalmente por un experto en la materia a la que se refiere la presente invención. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show (2002) 2a ed. CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed. (1999) Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado (2000) Oxford University Press, proporcionan al experto un diccionario general con muchos de los términos utilizados en esta invención.

En esta memoria se puede hacer referencia a los aminoácidos ya sea mediante sus símbolos de tres letras conocidos habitualmente o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. De modo similar, se puede hacer referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de una única letra aceptados habitualmente.

Definiciones

La expresión "ácido nucleico" o "polinudeótido" incluye cualquier cadena física de unidades monoméricas que corresponden a una cadena de nucleótidos, que incluyen, pero sin limitación, un polímero de nucleótidos, incluyendo polímeros de ADN y ARN, y oligonucleótidos modificados, por ejemplo, oligonucleótidos que tienen bases que no son típicas del ARN o ADN biológico en solución, tales como oligonucleótidos 2'-O-metilados. Un polinucleótido puede incluir enlaces fosfodiéster convencionales o enlaces no convencionales, por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico incluye secuencias complementarias, además de la secuencia explícitamente indicada.

El término "gen" se usa ampliamente para referirse a un ácido nucleico asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen secuencias codificantes y/o secuencias reguladoras requeridas para su expresión. El término "gen" se aplica a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o un ARNm codificado por esa secuencia genómica. Los genes también incluyen secuencias de ácidos nucleicos no expresadas que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen "promotores" y "potenciadores", a los que se unen proteínas reguladoras tales como factores de transcripción, que dan como resultado la transcripción de secuencias adyacentes o próximas. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. "Asociado operativamente" se refiere a una región codificante para un producto génico que está asociada con una o más secuencias reguladoras de tal manera que pone la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la secuencia o secuencias reguladoras. "Expresión de un gen" o "expresión de un ácido nucleico" se refiere a la transcripción de ADN en ARN, la traducción de ARN en un polipéptido, o tanto la transcripción como la traducción, como se indica en el contexto.

Como se usa en el presente documento, la expresión "región codificante" se refiere a una porción de ácido nucleico que incluye codones que pueden ser aminoácidos traducidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduzca en un aminoácido, generalmente se considera parte de una región de codificación. Sin embargo, las secuencias flanqueantes, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales e intrones, no se consideran parte de una región codificante. Un vector puede contener una única región codificante, o puede incluir dos o más regiones codificantes. Adicionalmente, un vector, polinucleótido o ácido nucleico puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica un producto génico de interés, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, pero sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.

El término "vector" se refiere a los medios por los cuales un ácido nucleico puede propagarse y/o transferirse entre organismos, células o componentes celulares. Los vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagémidos, transposones y cromosomas artificiales, que son capaces de replicarse de forma autónoma o integrarse en un cromosoma de una célula huésped. Los vectores también incluyen, pero sin limitación: un polinucleótido de ARN no conjugado, un polinucleótido de ADN no conjugado, un polinucleótido que incluye tanto ADN como ARN dentro de la misma cadena, un ADN o ARN conjugado con poli-lisina, un ADN o ARN conjugado con péptido, un ADN conjugado con liposomas, que no se replican de forma autónoma. Un "vector de expresión" es un vector, tal como un plásmido, que es capaz de promover la expresión, así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Típicamente, el ácido nucleico a expresar está "operativamente unido" a un promotor y/o potenciador, y está sujeto al control regulador de la transcripción por el promotor y/o potenciador.

El término "célula huésped" se refiere a una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, tal como un vector, y soporta la replicación y/o expresión del ácido nucleico. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, insecto, anfibio, de ave o de mamífero, incluyendo células humanas, por ejemplo, células HEp-2 y células Vero.

El término "introducido" cuando se refiere a un ácido nucleico heterólogo o aislado se refiere a la transferencia de un ácido nucleico a una célula eucariota o procariota en la que el ácido nucleico puede incorporarse al genoma de la célula, convertirse en un replicón autónomo o transitoriamente expresado. El término incluye métodos tales como "infección", "transfección", "transformación" y "transducción". Se pueden emplear una diversidad de métodos para introducir ácidos nucleicos en células huésped, incluyendo, pero sin limitación, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por lípidos y lipofección.

El término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual se usa información de un gen en la síntesis de un producto génico funcional. Los productos genéticos a menudo son proteínas, pero también pueden ser ARN funcionales. La expresión génica puede detectarse determinando la presencia del ARNr, ARNt, ARNm, ARNsn correspondiente y/o productos génicos a nivel de proteína.

Un "polipéptido" se refiere a una molécula que incluye dos o más residuos de aminoácidos linealmente unidos por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos), tales como un péptido o una proteína. El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. De esta manera, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, “proteínas”, “cadena de aminoácidos”, o cualquier otro término o expresión utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen en la definición de “polipéptido”, y el término “polipéptido” se puede usar en vez de,o de forma indistinta con cualquiera de estos términos. Se pretende que el término "polipéptido" también haga referencia a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido que incluyen, sin carácter limitante, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos bloqueadores/protectores conocidos, escisión proteolítica o modificación mediante aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede derivarse de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, y no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Un polipéptido se puede generar de cualquier forma, incluida la síntesis química. Los restos de aminoácidos del polipéptido pueden ser naturales o no naturales y pueden estar sin sustituir, no modificados, sustituidos o modificados. Una "secuencia de aminoácidos" es un polímero de residuos de aminoácidos, por ejemplo, una proteína o polipéptido, o una cadena de caracteres que representa un polímero de aminoácidos, dependiendo del contexto.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que incluyen al menos un dominio de unión que se forma a partir del plegamiento de cadenas polipeptídicas que tienen espacios de unión tridimensionales con formas de superficie internas y distribuciones de carga complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno. Un anticuerpo típicamente tiene una forma tetramérica, con dos pares de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" y una cadena "pesada", en el que las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman un sitio de unión a anticuerpo. Típicamente, cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Típicamente, cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes (CH) y cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante (CL) en su otro extremo en el que el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.

Los términos "anticuerpo", "anticuerpos" e "inmunoglobulinas" como se usan en el presente documento incluyen anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos fragmentos de unión a epítopo diferentes (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), injertados en CDR, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de camélidos, anticuerpos quiméricos, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpos que muestran una actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción de unión a antígeno), Fv unidos por disulfuro (dsFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti Id), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopo o derivados de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen al menos un sitio de unión al antígeno. Moléculas de inmunoglobulinas pueden ser de cualquier isotipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (p. ej., Gm, p. ej., G1m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b o c), Am, Em, y Km(1, 2 o 3)). Los anticuerpos se pueden derivar de cualquier especie de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, seres humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones, etc., u otros animales tales como aves (por ejemplo, pollos). Los anticuerpos se pueden fusionar a una secuencia polipeptídica heteróloga, por ejemplo, una etiqueta para facilitar la purificación.

El término "se une específicamente" se refiere a la unión de una molécula de unión, tal como un anticuerpo o fragmento, variante o derivado de los mismos a un epítopo a través de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo no relacionado aleatorio. El término “especificidad” se utiliza en esta memoria para cualificar la afinidad relativa mediante la cual una determinada molécula de unión se une a un determinado epítopo.

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a una medida de la resistencia de la unión de un epítopo individual con el dominio de unión de una molécula de inmunoglobulina.

El término "epítopo" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante de proteína capaz de unirse a un dominio de unión a anticuerpo. Los epítopos incluyen habitualmente agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen habitualmente características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se diferencian en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

El término "aislado" se refiere a un material biológico, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está sustancialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan o interactúan con él en su entorno natural. Por otro lado, el material aislado puede incluir material que no se encuentra con el material en su entorno natural. Por ejemplo, si el material se encuentra en su entorno natural, tal como una célula, el material puede haberse colocado en una ubicación en la celda no nativa con respecto al material encontrado en ese entorno. Por ejemplo, un ácido nucleico de origen natural puede considerarse aislado si se introduce por medios no naturales en un locus del genoma no nativo de ese ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos también se denominan ácidos nucleicos "heterólogos".

El término "recombinante" se refiere a un material que ha sido artificial o sintéticamente alterado por intervención humana. La alteración se puede realizar en el material dentro o fuera de su entorno o estado natural. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" puede referirse a un ácido nucleico que se obtiene mediante la recombinación de ácidos nucleicos, por ejemplo, durante la clonación, la transposición del ADN u otros procedimientos, o mediante mutagénesis química u otra mutagénesis; y un "polipéptido recombinante" o "proteína recombinante" puede referirse a un polipéptido o proteína que se produce por expresión de un ácido nucleico recombinante.

Como se usa en el presente documento, el término "diseñado" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos, incluyendo, por ejemplo, técnicas recombinantes, síntesis peptídica in vitro, acoplamiento enzimático o químico de péptidos o combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una composición terapéutica necesaria o suficiente para realizar un resultado clínico deseado para una afección y régimen de administración dados, por ejemplo, una cantidad suficiente para lograr un concentración de un compuesto que es capaz de prevenir o tratar la infección por influenza en un sujeto. Tales cantidades y concentraciones pueden determinarse por los expertos en la técnica. La cantidad de la composición terapéutica realmente administrada será típicamente determinada por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo, pero sin limitación, la afección a tratar, la vía de administración elegida, el compuesto real administrado, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual y la gravedad de los síntomas del paciente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "composición terapéutica" se refiere a un compuesto o composición con un uso terapéutico e incluye, pero sin limitación, compuestos biológicos, tales como anticuerpos, proteínas y ácidos nucleicos, así como compuestos de moléculas orgánicas pequeñas que son químicamente sintetizados.

Como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, si se desea, uno o más diluyentes o excipientes. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o se figura en la Farmacopea de Estados Unido, Farmacopea Europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, y más particularmente en seres humanos.

La expresión "efecto sinérgico" como se usa en el presente documento se refiere a un efecto terapéutico mayor que el aditivo producido por una combinación de compuestos en los que el efecto terapéutico obtenido con la combinación excede los efectos aditivos que de otro modo resultarían de la administración individual de los compuestos en solitario. Ciertas divulgaciones incluyen métodos para producir un efecto sinérgico en el tratamiento de infecciones por virus de influenza A y/o virus de influenza B, en los que dicho efecto es al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 500%, o al menos un 1000% mayor que el efecto aditivo correspondiente.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es estabilizar, prevenir, aliviar o reducir uno o más síntomas de la infección por influenza, o retrasar, prevenir, o inhibir la progresión de la infección por influenza. El tratamiento también puede referirse a la depuración o la reducción de un agente infeccioso tal como la influenza A y/o la influenza B en un sujeto, "Tratamiento" también puede referirse a la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. El tratamiento no necesariamente significa que la infección esté completamente curada.

Como uso aquí, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier miembro del subfilo de los cordados, incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos. Los animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas; aves, incluyendo aves domésticas, silvestres y de caza, tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares también son ejemplos no limitantes. Los términos "mamíferos" y "animales" están incluidos en esta definición. Tanto los mamíferos adultos como los recién nacidos pretenden incluirse.

Moléculas de unión

Las moléculas de unión proporcionadas están definidas por las reivindicaciones. En el presente documento se describen moléculas de unión que se unen específicamente al virus de la influenza A y/o al virus de la influenza B. Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de unión" se refiere a una molécula que es capaz de unirse a una molécula diana o antígeno de una manera similar a la de un anticuerpo que se une a un antígeno. Los ejemplos de moléculas de unión incluyen anticuerpos intactos así como fragmentos, variantes, análogos o derivados de tales anticuerpos que se unen a antígeno, por ejemplo, moléculas de anticuerpo o inmunoglobulina de origen natural o moléculas o fragmentos de anticuerpo modificados genéticamente, que incluyen anticuerpos biespecíficos. Una molécula de unión puede incluir uno o más dominios de unión. Mientras que una molécula de unión puede incluir la estructura canónica del anticuerpo, las moléculas de unión pueden tener otras estructuras que incluyen uno o más dominios de unión. En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos dos dominios de unión y al menos dos especificidades de unión.

Como se usa en el presente documento, un "dominio de unión" se refiere a la porción, región o sitio de una molécula de unión que es responsable de la unión específica a una molécula diana o antígeno. En una divulgación, el dominio de unión incluye un fragmento variable (Fv) de un anticuerpo. En una divulgación, el dominio de unión incluye una secuencia de cadena pesada (VH) variable y una secuencia de cadena ligera (VL) variable de un anticuerpo. En una divulgación, el dominio de unión incluye una o más, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo colocado con regiones de entramados (FR) adecuadas. Un dominio de unión puede derivar de una única especie o un dominio de unión puede incluir CDR de una especie y secuencias de entramado de otra especie, por ejemplo, como en un anticuerpo humanizado.

Las moléculas de unión pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo, pero sin limitación, aves y mamíferos. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la molécula de unión pueden ser anticuerpos humanos, murinos, de burro, conejo, cabra, cobaya, camello, llama, caballo o pollo. Como se usa en este documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas.

En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos un dominio de unión que es capaz de unirse y/o neutralizar el virus de influenza A. En otra divulgación, la molécula de unión incluye al menos un dominio de unión que es capaz de unirse y/o neutralizar el virus de influenza B. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que es capaz de unirse y/o neutralizar el virus de influenza A y un segundo dominio de unión que es capaz de unirse y/o neutralizar el virus de influenza B. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos un subtipo del grupo 2 del virus de influenza A; y un segundo dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza B y neutralizar el virus de la influenza B en al menos dos linajes filogenéticamente distintos. En una divulgación, el primer dominio de unión es capaz de neutralizar uno o más subtipos del grupo 1 del virus de influenza A seleccionados de: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 y variantes de los mismos; y uno o más subtipos del grupo 2 del virus de la influenza A seleccionados de entre: H3, H4, H7, H10, H14 y H15 y variantes de los mismos. En una divulgación, el segundo dominio de unión es capaz de neutralizar el virus de influenza B tanto en el linaje Yamagata como Victoria.

Anticuerpos

La molécula de unión puede incluir un anticuerpo de longitud completa o intacto, un fragmento de anticuerpo, incluyendo un fragmento de unión a antígeno, un anticuerpo humano, quimérico o de fusión humanizado, post-traduccionalmente modificado, inmunoconjugado o un fragmento funcional del mismo. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un anticuerpo de longitud completa o intacto, o uno o más fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos de unión a antígeno.

Los ejemplos "fragmentos de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que incluye un dominio VL, VH, CL y CH1 de un anticuerpo; (ii) un fragmento F (ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en una región bisagra; (iii) un fragmento Fd que incluye los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que incluye dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que incluye un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Los fragmentos de unión al antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante la escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

En una divulgación, el fragmento de unión a antígeno incluye un anticuerpo monocatenario, incluyendo, por ejemplo, un "fragmento variable monocatenario" o "scFv". La expresión "fragmento variable monocatenario" o "scFv" se refiere a una proteína de fusión que incluye al menos una región variable de una cadena pesada (VH) y al menos una región variable de una cadena ligera (VL) de una inmunoglobulina. Estos fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla pueden obtenerse usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los dominios VH y VL de un fragmento Fv, que están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite fabricarse como una sola cadena polipeptídica en la que las regiones VL y VH par para formar una molécula monovalente (véase, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). En una divulgación, las regiones VH y VL del scFv están conectadas con un péptido de enlace corto de al menos aproximadamente 5, 10, 15 o 20 y hasta aproximadamente 10, 15, 20, 25 o 30 aminoácidos. Los enlazadores ScFv son conocidos e incluyen enlazadores que son ricos en glicina (por flexibilidad), así como enlazadores que incluyen serina o treonina (por solubilidad). En una divulgación, el enlazador conecta el extremo N de un VH con el extremo C de un VL. En otras divulgaciones, el enlazador conecta el C-terminal de un VH con el N-terminal de un VL. En una divulgación, el scFv conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador. Los métodos para producir Fv monocatenarios incluyen los descritos en las Pat. de Estados Unidos N.° 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., (1991) Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., (1993) PNAS 90:7995-7999; y Skerra et al., (1988) Science 240:1038-1040.

En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos un dominio de unión que incluye un anticuerpo del virus anti influenza A o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra divulgación, la molécula de unión incluye al menos un dominio de unión que incluye un anticuerpo del virus anti-influenza B o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos un dominio de unión que incluye un anticuerpo del virus anti-influenza A o fragmento de unión a antígeno del mismo y al menos un dominio de unión que incluye un anticuerpo del virus anti influenza B o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Como se usa en el presente documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos", también conocidos como inmunoglobulinas, incluyen anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de camélidos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpos con una actividad biológica deseada, por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno, Fv ligados a disulfuro (dsFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), intracuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Las moléculas de inmunoglobulinas adecuadas pueden ser de cualquier isotipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (p. ej., Gm, p. ej., G1m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b o c), Am, Em, y Km(1,2 o 3)). Las moléculas de inmunoglobulina pueden incluir cadenas ligeras clasificadas como cadenas lambda o cadenas kappa basadas en la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera.

Una unidad estructural típica de inmunoglobulina (anticuerpo) es un tetrámero de aproximadamente 150 kD, que incluye dos pares de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). Típicamente, cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina puede variar. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. En la mayoría de los anticuerpos naturales, los dos pares de cadenas polipeptídicas son idénticos. Sin embargo, en los anticuerpos modificados genéticamente, los dos pares de cadenas polipeptídicas no son necesariamente idénticos, por ejemplo, como en los anticuerpos trifuncionales.

Tanto las cadenas ligeras como pesadas de un anticuerpo se pueden dividir en dominios "constantes" y "variables". La porción C-terminal de las cadenas pesada y ligera se conoce como un dominio constante. "Dominio CH1" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada localizado entre el dominio variable pesado (VH) y la región bisagra. "Dominio CH2" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada que está situado entre la región bisagra y el dominio CH3. "Dominio CH3" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada que se localiza C-terminalmente del dominio CH2. "Dominio CH4" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada que está situado en el extremo C del dominio CH3 en los anticuerpos IgM e IgE. La expresión "región de bisagra" se refiere a la porción de una molécula de cadena pesada que se une al dominio CH1 con el dominio CH2. El "dominio CL" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera que se localiza C-terminalmente al dominio ligero variable (VL).

El extremo N de cada cadena pesada y ligera define una región variable de sitio de unión a antígeno tridimensional denominada dominio variable. Los dominios variables tanto de la cadena ligera (VL) como pesada (VH) incluyen aproximadamente de 100 a 110 o más aminoácidos y son los principales responsables del reconocimiento y la especificidad del antígeno. Los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor de Fc y unión al complemento. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta para los dominios más distales del sitio de unión al antígeno o del extremo N del anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena pesada" se refiere a secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina que incluyen al menos uno de: un dominio VH, CH1, una región bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento del mismo. Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena ligera" se refiere a secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina que incluyen al menos uno de un dominio VL o CL.

Regiones variables de anticuerpos

En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos un dominio de unión a antígeno que incluye un dominio de fragmento variable (Fv). En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos un dominio de unión que incluye al menos un VH de una cadena pesada del anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera del anticuerpo. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que incluye al menos un VH de una cadena pesada de anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera de anticuerpo y un segundo dominio de unión que incluye al menos un VH de un anticuerpo pesado cadena y al menos un VL de una cadena ligera de anticuerpo. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que se une al virus de influenza A e incluye al menos un VH de una cadena pesada de anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera de anticuerpo y un segundo dominio de unión que se une al virus de influenza B e incluye al menos un VH de una cadena pesada de anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera de anticuerpo. Los dominios VH y VL de un anticuerpo que se unen al virus de la influenza A y al virus de la influenza B descritos en el presente documento se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente.

Tabla 1: Virus de anti-influenza A

Tabla 2: Virus de anti-influenza B

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios VH y/o VL que tienen al menos un porcentaje de identidad especificada con respecto a una o más de las secuencias de VH y/o VL desveladas en las Tablas 1 y 2. Como se usa en el presente documento, la expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia" u "homología" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia de referencia, tal como la secuencia de anticuerpo parental, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Las alineaciones de secuencia pueden producirse manualmente o usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman, (1981) Ads App. Math. 2, 482 o Neddleman y Wunsch, (1970) J. MoI. Biol. 48, 443, usando el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o usando programas informáticos basados en uno o más de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VH que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos VH descrita en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, las mostradas en la Tabla 1 o 2. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VH que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos VH descrita en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, las mostradas en la Tabla 1 o 2.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VL que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o que tiene un 100% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos VL descrita en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, las mostradas en la Tabla 1 o 2. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos VL descrita en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, las mostradas en la Tabla 1 o 2.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos VH y VL, respectivamente, descritas en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, las mostradas en la Tabla 1 o 2. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos VH y VL, respectivamente, descritas en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, las mostradas en la Tabla 1 o 2.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 1. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 1.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 2. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 2.

En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 1 y un segundo dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 2. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con un VH y un ^{V l}con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 1 y un segundo dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácidos VH y VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con un VH y un VL con una secuencia de aminoácidos, respectivamente, mostrada en la Tabla 2.

Regiones determinantes de complementariedad (CDR)

En los anticuerpos de origen natural, están presentes seis secuencias cortas, no contiguas de aminoácidos, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" en cada dominio de unión a antígeno. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión al antígeno se denominan regiones de "entramado". Las regiones de entramado funcionan como un andamio que posiciona las CDR en la orientación correcta mediante interacciones entre cadenas, no covalentes. Las tres CDR de la cadena pesada se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, y las tres CDR de la cadena ligera se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3.

Los aminoácidos que constituyen las CDR y las regiones de entramado pueden identificarse fácilmente por un experto en la técnica y han sido descritos por Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" y por Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. Las definiciones de Kabat et al. y Chothia et al. incluyen la superposición de residuos de aminoácidos. Los restos de aminoácidos que incluyen las CDR como se define por Kabat et al. y Chothia et al. se muestran a continuación en la Tabla 3. Los números de residuos exactos que incluyen una CDR particular pueden variar dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar rutinariamente qué residuos están en una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA 3: Definiciones de CDR ejemplares1

La aplicación de cualquiera de las definiciones pretende estar dentro del alcance del término "CDR" como se define y se usa en el presente documento. Sin embargo, a menos que se especifique otra cosa, las referencias a la numeración de posiciones de residuos de aminoácidos específicos en una molécula de unión, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado de la misma están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat et al.

En una realización, los aminoácidos en el dominio variable, región determinante de complementariedad (CDR) y regiones de entramado (FR) de un anticuerpo se identifican siguiendo a Kabat et al. La numeración de residuos de Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado por alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar". La alineación máxima de los residuos de entramado puede requerir la inserción de residuos "espaciadores" en el sistema de numeración. Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número correspondiente a un sitio de Kabat dado puede variar de una cadena de anticuerpo a otra cadena de anticuerpo debido a la divergencia alélica o entre especies diferentes.

De acuerdo con el sistema de numeración de Kabat et al., el HCDR1 comienza en aproximadamente el aminoácido 31 (es decir, aproximadamente 9 residuos después del primer residuo de cisteína), incluye aproximadamente 5-7 aminoácidos, y termina en el siguiente resto de tirosina. El HCDR2 comienza en el decimoquinto residuo después del final de CDRH1, incluye aproximadamente 16-19 aminoácidos y termina en el siguiente residuo de arginina o lisina. HCDR3 comienza en aproximadamente el treinta y tercer residuo de aminoácido después del final de HCDR2; incluye 3-25 aminoácidos; y termina en la secuencia W-G-X-G, donde X es cualquier aminoácido. La LCDR1 comienza aproximadamente en el residuo 24 (es decir, después de un residuo de cisteína); incluye aproximadamente 10-17 residuos; y termina en el próximo residuo de tirosina. El LCDR2 comienza aproximadamente al decimosexto residuo después del final de LCDR1 e incluye aproximadamente 7 residuos. LCDR3 comienza aproximadamente al treinta y tercer residuo después del final de l Cd r 2; incluye aproximadamente 7-11 residuos y termina en la secuencia F-G-X-G, donde X es cualquier aminoácido. Las CDR varían considerablemente de un anticuerpo a otro (y, por definición, no presentarán homología con las secuencias consenso de Kabat). Las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de CDR de anticuerpos de la invención, numerados usando el sistema de Kabat se muestran en las tablas 4 y 5, a continuación.

En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de cadena pesada (HCDR) mostradas en las Tablas 4 y 5. En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de cadena ligera (LCDR) mostradas en las Tablas 4 y 5. En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HCDR mostrados en las Tablas 4 y 5 y al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis LCDR mostrados en las Tablas 4 y 5.

Tabla 4: CDR de anticuerpos anti-influenza A según se identifican por Kabat et al.

Tabla 5: CDR de anticuerpos anti-influenza B según se identifican por Kabat

En otra divulgación, los aminoácidos en el dominio variable, regiones determinantes de complementariedad (CDR) y regiones de entramado (FR) de un anticuerpo pueden identificarse usando la base de datos de Immunogenetics (IMGT) (http://imgt.cines.fr). Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol. 27(1):55-77. La base de datos de IMGT se desarrolló usando información de secuencias para moléculas de inmunoglobulinas (IgG), receptores de células T (TcR) y complejo principal de histocompatibilidad (m Hc ) y unifica la numeración a lo largo de cadenas pesadas, cadenas ligeras lambda y kappa de anticuerpo y cadenas de receptores de células T y evita el uso de códigos de inserción para todos excepto para inserciones inusualmente largas. IMGT también considera y combina la definición de las regiones de entramado (FR) y determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat et al., la caracterización de los bucles hipervariables de Chothia et al., así como datos estructurales de estudios de difracción de rayos X. Las secuencias de cadenas pesadas y cadenas ligeras de CDR numeradas usando el sistema IMGT, se muestran en la Tabla 6, a continuación.

Tabla 6. CDR de anticuerpos anti-influenza B según se identifican por IMGT

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen uno o más, incluyendo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de HCDR1, HCDR2, Hc Dr 3, LCDR1, LCDR2, LCd R3. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, Lc Dr 3, en las que CDR se seleccionan de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, Lc DR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCd R3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR se seleccionan de las Hc DR y las LCDR mostradas en la Tabla 4. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en la Tabla 4. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en la Tabla 4.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, Lc Dr 3, en las que las CDR se selecciona de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 5 y 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, l Cd R3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 5 y 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCd R3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 5 y 6.

En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 mostradas en la Tabla 4 y un segundo dominio de unión que incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, l Cd R3, seleccionadas de las HCDR y las Lc DR mostradas en las Tablas 5 y 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en la Tabla 4 y un segundo dominio de unión que incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, h Cd R2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCd R3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 5 y 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en la Tabla 4 y un segundo dominio de unión que incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, h Cd R2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCd R3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 5 y 6.

En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en las que las CDR tienen individualmente una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de:

(a) HCDR1 de SEQ ID NO.: 8, HCDR2 de SEQ ID NO.: 9, HCDR3 de SEQ ID NO.: 10, LCDR1 de SEQ ID NO.: 3, l Cd R2 de SEQ ID NO.: 4 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 5, respectivamente; o

(b) HCDR1 de SEQ ID NO.: 18, HCDR2 de SEQ ID NO.: 19, HCDR3 de SEQ ID NO.: 20, LCDR1 de SEQ ID NO.: 13, LCDR2 de SEQ ID NO.: 14, LCDR3 de SEQ ID NO.: 15, respectivamente.

En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en las que las CDR tienen individualmente una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de:

(b) HCDR1 de SEQ ID NO.: 18, HCDR2 de SEQ ID NO.: 19, HCDR3 de SEQ ID NO.: 20, LCDR1 de SEQ ID NO.: 13, LCDR2 de SEQ ID NO.: 14, LCDR3 de SEQ ID NO.: 15; respectivamente.

En una divulgación, el segundo dominio de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en las que las CDR tienen individualmente una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de:

(a) HCDR1 de SEQ ID NO.: 28, HCDR2 de SEQ ID NO.: 29, HCDR3 de SEQ ID NO.: 30, LCDR1 de SEQ ID NO.: 23, LCDR2 de SEQ ID NO.: 24 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 25, respectivamente;

(b) HCDR1 de SEQ ID NO.: 44, HCDR2 de SEQ ID NO.: 45, HCDR3 de SEQ ID NO.: 46, LCDR1 de SEQ ID NO.: 39, LCDR2 de SEQ ID NO.: 40 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 41, respectivamente; o

(c) HCDR1 de SEQ ID NO.: 60, HCDR2 de SEQ ID NO.: 61, HCDR3 de SEQ ID NO.: 62, LCDR1 de SEQ ID NO.: 55, LCDR2 de SEQ ID NO.: 56, LCDR3 de SEQ ID NO.: 57, respectivamente.

En una divulgación, el segundo dominio de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en las que las CDR tienen individualmente una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de:

Regiones de entramado

Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera cada uno incluye cuatro regiones de entramado (FR1, FR2, FR3, FR4), que son las porciones más altamente conservadas de los dominios variables. Las cuatro FR de la cadena pesada se denominan FRH1, FRH2, FRH3 y FRH4, y las cuatro FR de la cadena ligera se denominan FRL1, FRL2, FRL3 y FRL4. Usando el sistema de numeración de Kabat, FRH1 comienza en la posición 1 y termina aproximadamente en el aminoácido 30; FRH2 es aproximadamente del aminoácido 36 a 49; FRH3 es aproximadamente del aminoácido 66 a 94; y FRH4 es aproximadamente el aminoácido 103 a 113. En una divulgación, se pueden introducir una o más modificaciones, tales como sustituciones, eliminaciones o inserciones de uno o más restos de FR, por ejemplo, para mejorar u optimizar la afinidad de unión de uno o más dominios de unión de la molécula de unión para virus de Influenza A y/o virus de influenza B. Los ejemplos de región de entramado que pueden modificarse incluyen aquellos que se unen no covalentemente al antígeno directamente (Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); interactúan con/realizan la conformación de una CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); y/o participan en la interfaz VL-VH (Patente de Estados Unidos N.° 5,225,539).

En una divulgación, la FR de uno o más dominios de unión de la molécula de unión incluye uno o más cambios de aminoácidos para los fines de realizar una "línea de germinación". En la línea de germinación, las secuencias de aminoácidos de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo se comparan con las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de la línea germinal. Cuando ciertos restos de entramado de la cadena pesada y/o cadena ligera difieren de la configuración de la línea germinal, por ejemplo, como resultado de la mutación somática de los genes de inmunoglobulina utilizados para preparar la biblioteca de fagos, puede ser deseable "retro-mutar" los restos de entramado alterados a la configuración de la línea germinal (es decir, cambian las secuencias de aminoácidos del entramado de manera que sean las mismas que las secuencias de aminoácidos del entramado de la línea germinal). Tal "retromutación" (o "mutación de la línea germinal") de residuos de región de entramado puede lograrse mediante métodos de biología molecular convencionales para introducir mutaciones específicas (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio; mutagénesis mediada por PCR, y similares).

Enlaces disulfuro

Como se usa en el presente documento, la expresión "enlace disulfuro" se refiere a un enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína incluye un grupo tiol que puede formar un puente disulfuro o un puente con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL están unidas mediante un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en la región flexible de la cadena pesada conocida como región bisagra (típicamente en posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat).

En una divulgación, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos dentro de una región marco, por ejemplo, para mejorar la unión del anticuerpo a su antígeno. En una divulgación, la secuencia de aminoácidos de una región de entramado puede modificarse para realizar una sustitución o deleción de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína que participan en un enlace disulfuro intracatenario, por ejemplo, para generar una molécula de unión que carece de uno o más enlaces disulfuros intracatenarios; para generar una molécula de unión que tiene uno o más enlaces disulfuro intracatenarios adicionales; o para cambiar la ubicación de uno o más enlaces disulfuro intracatenarios.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv. En una divulgación, el scFv incluye un VH y un VL, en los que el extremo C de un primer dominio de región variable está conectado al extremo N de un segundo dominio de región variable por medio de un enlazador de péptido flexible. En una divulgación, el extremo C de un dominio variable pesado (VH) está conectado al extremo N de un dominio de luz variable (VL). Esto se puede denominar una orientación "VH-VL" o "HL". En otras divulgaciones, el extremo C de un dominio variable ligero (VL) está conectado al extremo N de un dominio variable pesado (VH). Esto se puede denominar una orientación "VL-VH" o "LH". La longitud del enlazador (LS) que une el VH y el VL del scFv puede variarse. En una divulgación, el enlazador (LS) tiene una secuencia de aminoácidos de [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5 (SEQ ID NO: 93). En otra divulgación, el enlazador (LS) tiene una secuencia de aminoácidos de [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, (SEQ ID NO: 106). En otras divulgaciones, el enlazador incluye una combinación de las dos secuencias. En una divulgación más particular, el enlazador incluye una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92).

En otras divulgaciones, la posición del enlace disulfuro entre el VH y el VL del scFv se puede variar añadiendo, eliminando o cambiando la ubicación de uno o más residuos de cisteína en el scFv. En una divulgación, el VH del scFv incluye un residuo de cisteína en la posición 43, 44, 100, 101, 105, y combinaciones de los mismos (según lo numerado por Kabat). En una divulgación, el VL del scFv incluye un residuo de cisteína en la posición 43, 44, 46, 49, 50, 100, y combinaciones de los mismos (según lo numerado por Kabat). En una divulgación, el scFv tiene una orientación VL-VH en la que el VL y el VH se unen por un enlace disfulfuro en VL100-VH44, VL43-VH105, VL46-VH101, VL49-VH100, VL50-VH100, o combinaciones de los mismos. En otra divulgación, el scFv tiene una orientación VH-VL en la que el VH y el VL se unen por un enlace disfulfuro en VH44-VL100, VH100-VL49, VH100-VL50, VH101-VL46, VH105-VL43, o combinaciones de los mismos.

Anticuerpos biespecíficos

En una divulgación, la molécula de unión incluye un "anticuerpo biespecífico". Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene dos o más dominios de unión que pueden unirse específicamente a dos moléculas diana o antígenos diferentes. En general, los anticuerpos biespecíficos incorporan las especificidades y propiedades de uno o más, a menudo al menos dos, y típicamente dos anticuerpos monoclonales distintos, denominados "anticuerpos parentales", en una única molécula. Algunos anticuerpos biespecíficos demuestran actividades sinérgicas. En una divulgación, el anticuerpo biespecífico demuestra una actividad de neutralización mejorada contra una o más cepas de influenza A y/o B en comparación con un anticuerpo parental.

En una divulgación, los anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento tienen una amplitud de cobertura extendida en comparación con un mAb individual, y también pueden mostrar una neutralización potenciada de una o más cepas de virus de influenza A. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con una actividad de neutralización mejorada contra una o más cepas de influenza A del grupo 1 o del grupo 2. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con actividad de neutralización mejorada contra una cepa del grupo 1 del virus de la influenza A seleccionada de los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, h 17 y H18. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con actividad de neutralización mejorada contra una cepa del grupo 2 del virus de la influenza A seleccionada de los subtipos H3, H4, H7, H10, H14, y H15. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico con actividad de neutralización mejorada contra el subtipo H9 del virus de influenza A.

En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo biespecífico que tiene más de dos valencias. Por ejemplo, en una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo triespecífico. Los anticuerpos triespecíficos son conocidos y pueden prepararse usando métodos conocidos por los expertos en la técnica (Tutt y col., (1991) J. Immunol., 147: 60).

Los anticuerpos biespecíficos pueden expresarse mediante líneas celulares tales como triomas e hibridomas híbridos o pueden construirse por medios recombinantes. (Strohlein y Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry y Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)).

En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo biespecífico que incluye al menos dos pares de cadenas pesadas y ligeras, o fragmentos de unión de las mismas, en las que un primer par se deriva de un primer anticuerpo "parental" y tiene una primera especificidad de unión y el segundo el par se deriva de un segundo anticuerpo "parental" y tiene una segunda especificidad de unión. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer par de cadena pesada y ligera, o fragmentos del mismo, que se unen específicamente al virus de influenza A y un segundo par de cadena pesada y ligera, o fragmentos del mismo, que se unen específicamente al virus de influenza B. En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo biespecífico que incluye dos o más regiones Fab unidas químicamente que están dirigidas contra dos moléculas diana o antígenos diferentes. En una divulgación, la molécula de unión incluye una o más regiones Fab que se unen específicamente al virus de la influenza A. En otra divulgación, la molécula de unión incluye una o más regiones Fab que se unen específicamente al virus de la influenza B. En otra divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo biespecífico que incluye uno o más fragmentos variables de cadena simple (scFvs). En una divulgación, la molécula de unión incluye al menos un scFv que se une específicamente al virus de la influenza A. En otra divulgación, la molécula de unión incluye al menos un scFv que se une específicamente al virus de la influenza B.

En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico formado por fusión de un anticuerpo IgG y uno o más dominios de unión monocatenarios. En una divulgación, la molécula de unión conserva una estructura de núcleo de anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM). En otras divulgaciones, la estructura del núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) no se conserva, por ejemplo, en dia, tria o tetracuerpos, minicuerpos y formatos monocatenarios (scFv, Bis-scFv). En otra divulgación, el anticuerpo biespecífico puede incluir una fusión F(ab)2 en la que dos o más fragmentos Fab están fusionados con un reticulador químico. Muchos formatos de anticuerpos biespecíficos usan uno o más enlazadores, por ejemplo, para fusionar un núcleo de anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) con un dominio de unión (por ejemplo, scFv) o para fusionar dos o más fragmentos Fab o scFv. En algunas divulgaciones, el dominio Fc, y por lo tanto las funciones efectoras Fc, se conservan. En otras divulgaciones, el dominio Fc no se conserva.

En una divulgación, la molécula de unión incluye una estructura similar a IgG asimétrica con dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que forman una molécula en forma de "Y", en la que un primer "brazo" del anticuerpo se une específicamente a un primer antígeno y el segundo "brazo" del anticuerpo se une a un segundo antígeno.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos monocatenarios, que incluyen una o más regiones variables de cadena pesada (VH) en solitario o en combinación con ninguna, algunas o todas las siguientes: región bisagra (H), dominios CH1, CH2 y CH3 y/o una o más regiones variables de cadena ligera (VL) en solitario o en combinación con un dominio CL.

En una divulgación, el anticuerpo biespecífico incluye uno o más Fv monocatenarios (scFv). En una divulgación, el anticuerpo biespecífico incluye dos o más scFv. En otra divulgación, el anticuerpo biespecífico incluye parte o la totalidad de una estructura de "base" de inmunoglobulina, por ejemplo, una estructura IgA, IgD, IgE, IgG o IgM que incluye uno o más dominios Fv, por ejemplo, una o más cadenas pesadas y una o más cadenas ligeras, en las que uno o más scFv están fusionados a la estructura de "base" de inmunoglobulina. En una divulgación, la molécula de unión incluye una estructura de IgG que incluye dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en las que uno o más scFv están fusionados a la misma.

En una divulgación, el formato del anticuerpo puede ser cualquier formato descrito en el presente documento. En otra divulgación, el formato es cualquiera de Bis1, Bis2, Bis3, Bis4 o Bis5. En una divulgación, el dominio Fv del primer dominio de unión incluye una cadena pesada (HC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi y una cadena ligera (LC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo carboxi de la HC del primer dominio de unión usando uno o dos enlazadores. En una divulgación, el dominio Fv del primer dominio de unión incluye una cadena pesada (HC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi y una cadena ligera (LC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo carboxi de la HC del primer dominio de unión usando un enlazador. En una divulgación, el dominio Fv del primer dominio de unión incluye una cadena pesada (HC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi y una cadena ligera (LC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo carboxi de la HC del primer dominio de unión usando dos enlazadores. En una divulgación, el dominio Fv del primer dominio de unión incluye una cadena pesada (HC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi y una cadena ligera (LC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo amino de la HC del primer dominio de unión. En una divulgación, el dominio Fv del primer dominio de unión incluye una cadena pesada (HC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi y una cadena ligera (LC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y el segundo dominio de unión está unido covalentemente al extremo amino de la LC del primer dominio de unión. En otra divulgación, el dominio Fv del primer dominio de unión incluye una cadena pesada (HC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi y una cadena ligera (LC) que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y el segundo dominio de unión está intercalado covalentemente a lo largo de la cadena polipeptídica de la HC del primer dominio de unión.

En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo biespecífico que incluye una cadena pesada de anticuerpo que tiene la fórmula VH-CH1-H-CH2-CH3, en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio de región constante de cadena pesada 1, H es una región bisagra, CH2 es un dominio de región constante de cadena pesada 2, y CH3 es un dominio de región constante de cadena pesada 3. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que incluye una cadena ligera de anticuerpo que tiene la fórmula VL-CL, en la que VL es un dominio de cadena ligera variable y CL es un dominio constante de cadena ligera.

En una divulgación, la molécula de unión incluye una cadena pesada de anticuerpo con un dominio N-terminal, en la que la cadena pesada de anticuerpo tiene la fórmula VH-CH1-H-CH2-CH3, en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, c H1 es un dominio de región constante de cadena pesada 1, H es una región bisagra, CH2 es un dominio 2 de región constante de cadena pesada y CH3 es un dominio 3 de región constante de cadena pesada y una cadena ligera de anticuerpo con un dominio N-terminal, en el que el anticuerpo de cadena ligera tiene la fórmula VL-CL, en la que VL es un dominio de cadena ligera variable y CL es un dominio constante de cadena ligera, y en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente a uno o más dominios N-terminales de la cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo (figura 1).

En una divulgación, el dominio N-terminal del anticuerpo o fragmento del mismo incluye uno o más dominios Fv y una o más moléculas scFv están unidas covalentemente a uno o más dominios Fv del anticuerpo o fragmento del mismo (figura 1). En una divulgación, una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio N-terminal de uno o más dominios variables de cadena ligera (VL) del anticuerpo o fragmento del mismo. (figura 1). En una divulgación, la molécula de unión incluye una cadena ligera de anticuerpo que tiene una fórmula scFv-L1-VL-CL, en la que scFv es una molécula scFv, L1 es un enlazador, VL es un dominio variable de cadena ligera, VL es un dominio variable de cadena ligera y CL es un dominio constante de cadena ligera (figura 1).

En una divulgación, una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio N-terminal de uno o más dominios variables de cadena pesada (VH) del anticuerpo o fragmento del mismo (figura 1). En una divulgación, la cadena pesada tiene una fórmula scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3, en la que scFv es una molécula scFv, L1 es un enlazador, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio constante de cadena pesada dominio-3 (figura 1).

En otra divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene un dominio C-terminal, en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio C-terminal del anticuerpo o fragmento del mismo (figura 1). En una divulgación, la molécula de unión incluye a primera y segunda cadena pesada con primer y segundo dominios C-terminal, respectivamente, en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio C-terminal de la primera cadena pesada, la segunda cadena pesada, o combinaciones de las mismas (figura 1). En una divulgación, una o más cadenas pesadas tienen una fórmula VH-CH1-CH2-CH3, en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio constante de cadena pesada dominio-3 (figura 1). En una divulgación, una o más cadenas pesadas tienen una fórmula VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv, en al que L1 es un enlazador y scFv es una molécula scFv (figura 1).

En otra divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene un dominio C-terminal, en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio C-terminal del anticuerpo o fragmento del mismo (figura 1). En una divulgación, la molécula de unión incluye a primera y segunda cadena pesada con primer y segundo dominios C-terminal, respectivamente, en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio C-terminal de la primera cadena pesada, la segunda cadena pesada, o combinaciones de las mismas (figura 1). En una divulgación, una o más cadenas pesadas tienen una fórmula VH-CH1-CH2-CH3, en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio constante de cadena pesada dominio-3 (figura 1). En una divulgación, una o más cadenas pesadas tienen una fórmula VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFvL2, en la que L1 y L2 son independientemente enlazadores y scFv es una molécula scFv (figura 1).

En una divulgación, la molécula de unión incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene uno o más dominios constantes de cadena pesada, en los que una o más moléculas scFv se insertan entre uno o más dominios constantes de cadena pesada de una o más cadenas pesadas (figura 1). En una divulgación, una o más cadenas pesadas tienen una fórmula VH-CH1-CH2-CH3, en la que Vh es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio constante de cadena pesada dominio-3 (figura 1). En una divulgación, una o más cadenas pesadas tienen una fórmula VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3, en la que L1 y L2 son independientemente un enlazador y un scFv es una molécula scFv (figura 1). En una divulgación, una o más cadenas pesadas tienen una fórmula VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3, en la que L1 y L2 son independientemente enlazadores y scFv es una molécula scFv.

En una divulgación, la molécula de unión incluye una estructura de inmunoglobulina, por ejemplo, una estructura IgG que tiene uno o más dominios Fv. En una divulgación, el dominio Fv incluye una secuencia VH y Vl que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 1. En otra divulgación, el dominio Fv incluye una secuencia VH y VL que tiene al menos, un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 1. En una divulgación, el dominio Fv incluye una secuencia VH y VL que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 2. En otra divulgación, el dominio Fv incluye una secuencia VH y VL que tiene al menos, un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 2.

En una divulgación, la molécula de unión incluye una estructura de inmunoglobulina que tiene uno o más dominios de unión que incluyen uno o más, incluyendo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR seleccionadas de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3. En una divulgación, la molécula de unión incluye una estructura de inmunoglobulina que tiene uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que CDR se seleccionan de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye una estructura de inmunoglobulina que tiene uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye una estructura de inmunoglobulina que tiene uno o más dominios de unión que incluyen un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv que tiene la fórmula VH-LS-VL o como alternativa, VL-LS-VH, donde LS es una secuencia enlazadora. En una divulgación, el scFv incluye una secuencia VH y VL que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 1. En otra divulgación, el scFv incluye una secuencia VH y VL que tiene al menos, un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 1. En una divulgación, el scFv incluye una secuencia VH y VL que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 2. En otra divulgación, el scFv incluye una secuencia VH y VL que tiene al menos, un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 2.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv con una o más, incluyendo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis CDR seleccionadas de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv con un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que CDR se seleccionan de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv con un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv con un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, en las que las CDR incluyen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR y las LCDR mostradas en las Tablas 4 a 6.

En una divulgación, el enlazador LS tiene una secuencia de aminoácidos de: (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1,2, 3, 4, o 5, (SEQ ID ^{n O :}106) o una combinación de (a) y (b). Por ejemplo, un enlazador descrito en el presente documento incluye: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92). En una divulgación, el scFv está condensado a una estructura de inmunoglobulina, por ejemplo, una estructura IgG a través de un enlazador (L1 o L2) que tiene una secuencia de aminoácidos de: (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, (SEQ ID NO: 106) o una combinación de (a) y (b), incluyendo, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92).

En una divulgación, la molécula de unión incluye una estructura de inmunoglobulina, por ejemplo, una estructura IgG que tiene uno o más dominios Fv que incluyen una secuencia VH y VL que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o ^{v L}mostrada en la Tabla 1 o una secuencia VH y VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 1. En una divulgación, uno o más scFv que tienen la fórmula VH-LS-VL o, como alternativa, VL-LS-VH, donde LS es una secuencia enlazadora se condensan a la estructura de inmunoglobulina y el scFv incluye una secuencia VH y VL que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 2. En otra divulgación, el scFv incluye una secuencia VH y VL que tiene al menos, un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% de identidad con respecto a una secuencia VH o VL mostrada en la Tabla 2. En una divulgación, el enlazador LS tiene una secuencia de aminoácidos de: (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, (SEQ ID NO: 106) o una combinación de (a) y (b). Por ejemplo, un enlazador descrito en el presente documento incluye: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92). En una divulgación, el scFv está condensado a una estructura de inmunoglobulina, por ejemplo, una estructura IgG a través de un enlazador (L1 o L2) que tiene una secuencia de aminoácidos de: (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5 (SEQ ID NO: 93), (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, (SEQ ID NO: 106) o una combinación de (a) y (b), incluyendo, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:92).

En una divulgación, el primer dominio de unión de la molécula de unión incluye un anticuerpo del virus anti-influenza A o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una divulgación, el segundo dominio de unión de la molécula de unión incluye un anticuerpo del virus anti-influenza B o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una divulgación, el primer dominio de unión incluye un dominio Fv del virus anti-influenza A. En una divulgación, la molécula de unión incluye un dominio de fragmento variable (Fv) que tiene un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo, en la que el Fv se une específicamente al virus anti-influenza A. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen una molécula scFv del virus anti-influenza B. En una divulgación, la molécula de unión incluye un primer dominio de unión que incluye un dominio Fv del virus anti-influenza A y un segundo dominio de unión que incluye una molécula scFv del virus anti-influenza B.

En una divulgación, la molécula de unión incluye una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68. En una divulgación, la molécula de unión incluye una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68.

En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, que tiene una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de ^{S e Q}ID NO:67 o SEQ ID NO:69. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, que tiene una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69.

En una divulgación, la molécula de unión incluye una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68. En una divulgación, la molécula de unión incluye una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, que incluye una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68 y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69.

En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, que incluye una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68 y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que tiene una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67. En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo biespecífico que tiene una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68 y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69

En una divulgación, la molécula scFv incluye un dominio VH que tiene un conjunto de tres CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, en las que el conjunto de tres CDR incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR mostradas en las Tablas 5 y 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye un dominio VH que tiene un conjunto de tres CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, en las que el conjunto de tres CDR incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las HCDR mostradas en las Tablas 5 y 6.

En una divulgación, la molécula scFv incluye un dominio VL que tiene un conjunto de tres CDR: LCDR1, LCDR2, LCDR3, en la que el conjunto de tres CDR incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las LCDR mostradas en las Tablas 5 y 6. En otra divulgación, la molécula de unión incluye un dominio VL que tiene un conjunto de tres CDR: LCDR1, LCDR2, LCDR3, en la que el conjunto de tres CDR incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de las LCDR mostradas en las Tablas 5 y 6.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o un 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, y SEQ ID NO:63. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más scFv que tienen una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, y SEQ ID NO:63.

Dominio de unión a influenza A

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen inmunoespecíficamente al menos a un epítopo especificado del virus de influenza A. Como se usan en el presente documento, las expresiones "dominio de unión" o "dominio de unión a antígeno" incluyen un sitio que se une específicamente a un epítopo en un antígeno. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo incluye típicamente al menos una porción de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y al menos una porción de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, en la que el sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen inmunoespecíficamente al menos a un epítopo especificado de la proteína HA del virus de influenza A. El término "epítopo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un determinante proteico capaz de unirse a un anticuerpo. Los epítopos incluyen habitualmente agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen habitualmente características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se diferencian en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

En una divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo que se conserva entre al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todos los subtipos de influenza A. En otra divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo que se conserva entre uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 subtipos del grupo 1 del virus de influenza A seleccionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, y H18 y uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, o 6 subtipos del grupo 2 seleccionados de H3, H4, H7, H10, H14 y H15.

En una divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o 17 o todos los subtipos de influenza A con un CE50 de entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.1 ug/ml, o menos de aproximadamente 5 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.1 ug/ml, o 0.05 ug/ml. En otra divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 subtipos del grupo 1 del virus de influenza A seleccionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, y H18 y uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, o 6 subtipos del grupo 2 seleccionados de H3, H4, H7, H10, H14 y H15 con una CE50 de entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.1 ug/ml, o menos de aproximadamente 5 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.1 ug/ml, o 0.05 ug/ml.

En una divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce un epítopo que es o bien un epítopo lineal o bien un epítopo continuo. En otra divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce un epítopo no lineal o conformacional. En una divulgación, el epítopo está localizado en la región del tallo altamente conservada de HA2. En una divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo conformacional en la región de tallo altamente conservada de HA2. (Wilson et al. (1981) Nature. 289:366-373). En una divulgación, el epítopo incluye uno o más aminoácidos seleccionados de: 18, 19, 42, 45, 156 y 196 en la región del tallo de HA2 como residuos de contacto. En una divulgación, el epítopo incluye uno o más aminoácidos seleccionados entre 18, 19, 42 y 45 en la región del tallo de HA2 como residuos de contacto. En una divulgación adicional, el epítopo incluye los aminoácidos 18, 19, 42 y 45 en la región del tallo de HA2 como residuos de contacto. En otra divulgación más, el epítopo incluye los aminoácidos 18, 19 y 42 en la región del tallo de HA2 como residuos de contacto.

Dominio de unión a influenza B

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen inmunoespecíficamente al menos a un epítopo especificado del virus de influenza B. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen inmunoespecíficamente al menos a un epítopo especificado de la proteína HA del virus de influenza B. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen específicamente a un epítopo presente en al menos dos linajes de influenza B filogenéticamente distintos. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen a un epítopo presente en al menos una cepa de influenza B Yamagata y al menos una cepa de influenza B Victoria. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen a un epítopo que está presente en el virus de la influenza B tanto del linaje Yamagata como del linaje Victoria. En una divulgación, el miembro de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen a un epítopo que se conserva entre la influenza B del linaje Yamagata y del linaje Victoria.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen al menos a una cepa de influenza B Yamagata y al menos una cepa de influenza B Victoria con una concentración eficaz máxima media (CE50) de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 250 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o menos de aproximadamente 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml, 20 ng/ml, o 15 |jg/ml. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen al virus de influenza B del linaje Yamagata y Victoria con una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 250 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o menos de aproximadamente 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml, 20 ng/ml, o 15 jg/ml. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen a un epítopo presente en el virus de influenza B tanto del linaje Yamagata como del linaje Victoria con una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 250 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o menos de aproximadamente 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml, 20 ng/ml, o 15 jg/ml.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen a: un epítopo presente en el linaje Yamagata de influenza B a una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 100 ng/ml, 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 25 ng/ml, o menos de aproximadamente 50 ng/ml o 25 ng/ml; y un epítopo presente en el linaje Victoria de influenza B a una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 250 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o menos de aproximadamente 500 ng/ml, 250 ng/ml, 100 ng/ml o 50 ng/ml.

En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen a: un epítopo presente en el linaje Yamamoto de influenza B a una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 100 ng/ml, 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 25 ng/ml, o menos de aproximadamente 50 ng/ml o 25 ng/ml; un epítopo presente en el linaje Victoria de influenza B a una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 250 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o menos de aproximadamente 500 ng/ml, 250 ng/ml o 100 ng/ml; y un epítopo en HA de influenza A con una CE50 de entre aproximadamente 1 jg/m l y aproximadamente 50 jg/ml, o menos de aproximadamente 50 jg/ml, 25 jg/ml, 15 jg/m l o 10 jg/ml. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que se unen a: un epítopo presente en el linaje Yamagata de influenza B a una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 100 ng/ml, 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 25 ng/ml, o menos de aproximadamente 50 ng/ml o 25 ng/ml; un epítopo presente en el linaje Victoria de influenza B a una CE50 de entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 500 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 250 ng/ml, o entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml, o menos de aproximadamente 500 ng/ml, 250 ng/ml o 100 ng/ml; y un epítopo en H9 HA de influenza A con una CE50 de entre aproximadamente 1 |jg/ml y aproximadamente 50 |jg/ml, o menos de aproximadamente 50 |jg/ml, 25 |jg/ml, 15 jig/ml o 10 jig/ml.

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que reconocen un epítopo que es un epítopo lineal o epítopo continuo. En otra divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que reconocen un epítopo no lineal o conformacional. En una divulgación, el epítopo se localiza en la glicoproteína hemaglutinina (HA) de influenza B. En una divulgación, el epítopo se localiza en la región de la cabeza de la glicoproteína HA de influenza B. En una divulgación, el epítopo incluye uno o más aminoácidos en las posiciones 128, 141, 150 o 235 en la región de cabeza de HA de influenza B como residuos de contacto, que están numerados de acuerdo con el sistema de numeración H3 como se describe en Wang et al. (2008) J. Virol. 82(6):3011-20. En una divulgación, el epítopo incluye el aminoácido 128 de la secuencia de la región de cabeza de HA de influenza B como un residuo de contacto. En otra divulgación, el epítopo incluye los aminoácidos 141, 150 y 235 de la secuencia de la región de cabeza de HA de influenza B como residuos de contacto.

Reactividad cruzada

En una divulgación, la molécula de unión puede describirse o especificarse en términos de uno o más epítopos o porciones de un antígeno que la molécula de unión reconoce o se une específicamente. La porción de una molécula diana que interactúa específicamente con el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo se denomina "epítopo" o "determinante antigénico". Un antígeno diana puede incluir cualquier número de epítopos, dependiendo del tamaño, la conformación y el tipo de antígeno. En una divulgación, la molécula de unión se une específicamente al mismo epítopo que uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento, y/o inhibirá competitivamente un anticuerpo descrito en el presente documento a partir de la unión al epítopo.

En una divulgación, uno o más dominios de unión de la molécula de unión muestran reactividad cruzada con virus de influenza A y virus de influenza B. Como se usa en el presente documento, la expresión "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un dominio de unión de una molécula de unión que es específico para un antígeno, para reaccionar con un segundo antígeno. Por lo tanto, una molécula de unión reacciona de forma cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación.

Región Fc

En una divulgación, la molécula de unión es un anticuerpo que está modificado en la región Fc para proporcionar las funciones efectoras deseadas o la semivida en suero. En una divulgación, la región Fc puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o reclutando complemento en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), o reclutando células citotóxicas inespecíficas que expresan uno o más ligandos efectores que reconocen un anticuerpo unido en el virus de la influenza A y/o virus de la influenza B y posteriormente causan la fagocitosis de la célula en la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), o algún otro mecanismo. En otras divulgaciones, puede ser deseable eliminar o reducir la función efectora, a fin de minimizar los efectos secundarios o las complicaciones terapéuticas. Se conocen métodos para potenciar, así como reducir o eliminar la función Fc-efector. En otras divulgaciones, la región Fc puede modificarse para aumentar la afinidad de unión por FcRn y así aumentar la semivida en suero. En otras divulgaciones más, la región Fc puede conjugarse con PEG o albúmina para aumentar la semivida en suero. Las variantes Fc se describen más completamente en las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N.° 61/885,808, presentada el 2 de octubre de 2013, 62/002,414, presentada el 23 de mayo de 2014, y 62/024,804, presentada el 15 de julio de 2014.

Características de unión

Como se ha descrito anteriormente, las moléculas de unión descritas en el presente documento se unen inmunoespecíficamente al menos a un epítopo específico o determinante antigénico de la proteína del virus de influenza A y/o del virus de influenza B, péptido, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de los mismos exclusiva o preferiblemente con respecto a otros polipéptidos. El término "epítopo" o "determinante antigénico" tal como se usa en la presente se refiere a un determinante proteico que puede unirse a un anticuerpo. En una divulgación, el término "unión" en la presente se refiere a una unión específica. Estos determinantes proteicos o epítopos generalmente incluyen agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se diferencian en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El término "epítopo discontinuo" tal como se usa en la presente, se refiere a un epítopo conformacional en un antígeno proteico que se forma a partir de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína.

Las interacciones entre antígenos y anticuerpos son las mismas que para otras interacciones proteína-proteína no covalentes. En general, existen cuatro tipos de interacciones de unión entre antígenos y anticuerpos: (i) enlaces de hidrógeno, (ii) fuerzas de dispersión, (iii) fuerzas electrostáticas entre ácidos de Lewis y bases de Lewis y (iv) interacciones hidrófobas. Las interacciones hidrófobas son una fuerza motriz principal para la interacción anticuerpo-antígeno, y se basan en la repulsión de agua por grupos no polares en vez de la atracción de moléculas (Tanford, (1978) Science.

200:1012-8). Sin embargo, determinadas fuerzas físicas también contribuyen a la unión antígeno-anticuerpo, por ejemplo, el ajuste o complementariedad de conformaciones de epítopos con sitios de unión al anticuerpo diferentes. Además, otros materiales y antígenos pueden reaccionar de manera cruzada con un anticuerpo, compitiendo de ese modo por el anticuerpo libre disponible.

La medición de la constante de afinidad y la especificidad de unión entre el antígeno y el anticuerpo pueden ayudar a determinar la eficacia de los métodos profilácticos, terapéuticos, de diagnóstico y de investigación que usan moléculas de unión descritas en este documento. "Afinidad de unión" generalmente se refiere a la resistencia de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique otra cosa, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y generalmente puede representarse mediante la constante de disociación de equilibrio (Kd), que se calcula como la relación koff/kon. Véase, p. ej., Chen et al. (1999) J. Mol Biol. 293:865-881. Los anticuerpos con una baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos con una alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. En la técnica se conocen una diversidad de métodos para medir la afinidad de unión.

En una divulgación, una molécula de unión incluye una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones, deleción y/o adiciones, que se introducen en una o más de las regiones variables del anticuerpo. En otra divulgación, las alteraciones de aminoácidos se introducen en las regiones de entramado. Una o más alteraciones de los residuos de la región estructural pueden dar como resultado una mejora en la afinidad de unión de la molécula de unión para el antígeno. En una divulgación, pueden alterarse desde aproximadamente uno hasta aproximadamente cinco residuos de región de entramado.

Un método para determinar la afinidad de unión incluye medir la constante de disociación "Kd" mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por Chen et al. (1999) J. Mol Biol. 293: 865-881. De manera alterna, el valor Kd puede medirse usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un dispositivo BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). Si la velocidad de asociación excede los 106 M-1 S-1 en el caso del ensayo de resonancia de plasmón superficial, entonces la velocidad de asociación puede determinarse usando a técnicas de extinción fluorescente que mide el aumento o descenso en la intensidad de emisión de fluorescencia en presencia de concentraciones crecientes de antígeno. También se puede determinar una "tasa de activación" o "tasa de asociación" o "tasa de asociación" o o "kon" con la misma técnica de resonancia de plasmón superficial descrita anteriormente.

Los métodos y reactivos adecuados para la determinación de las características de unión de una molécula de unión se conocen en la técnica y/o están disponibles comercialmente (Patentes de Estados Unidos N.° 6,849,425; 6,632,926; 6,294,391; 6,143,574). Además, el equipo y el software diseñados para tales análisis cinéticos están disponibles comercialmente (por ejemplo, Biacore® A100 y Biacore® 2000 instruments, Biacore International AB, Uppsala, Suecia).

En una divulgación, las moléculas de unión, incluyendo fragmentos de unión a antígeno o variantes de los mismos, pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión por el virus de influenza A; virus de la influenza B; o una combinación de los mismos Típicamente, los anticuerpos con alta afinidad tienen Kd de menos de 10'7 M. En una divulgación, la molécula de unión o los fragmentos de unión a antígeno de la misma se unen al virus de la influenza A; virus de la influenza B; fragmentos o variantes de los mismos; o una combinación de los mismos, con una constante de disociación o Kd menor o igual a 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M o 10-15 M. En una divulgación, la molécula de unión o los fragmentos de unión a antígeno de la misma se unen al virus de la influenza A; virus de la influenza B, fragmentos o variantes de los mismos; o combinaciones de los mismos, con una constante de disociación o Kd menor o igual a 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M o 10-12 M. La divulgación incluye moléculas de unión o fragmentos de unión a antígeno de las mismas que se unen al virus de influenza A; virus de la influenza B; o una combinación de los mismos, con una constante de disociación o Kd que está dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores indicados individuales.

En otra divulgación, la molécula de unión o fragmentos de unión a antígeno de la misma se unen al virus de la influenza A; virus de influenza B; fragmentos o variantes de los mismos; o combinaciones de los mismos, con una tasa de inactivación (koff) de menos de o igual a 5 x 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 x 10-3 s-1 o 10-3 s-1, 5 x 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 x 10-5 s-1, o 10-5 s-1, 5 x 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 x 10-7 s-1 o 10-7 s-1. En una divulgación, la molécula de unión o fragmentos de unión a antígeno de la misma se unen a polipéptidos de influenza A o fragmentos o variantes de los mismos con una tasa de desactivación (koff) menor de o igual a 5 x 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 x 10-5 s-1, o 10-5 s-1, 5 x 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 x 10-7 s-1 o 10-7 s-1. La divulgación también incluye moléculas de unión o fragmentos de unión a antígeno de la misma que se unen al virus de influenza A; virus de influenza B; o combinaciones de los mismos, con una tasa de inactivación (koff) que está dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores mencionados individuales.

En otra divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma se unen al virus de influenza A; virus de influenza B; fragmentos o variantes de los mismos; o combinaciones de los mismos, con una tasa de activación (kon) de más de o igual a 103 M-1 s-1, 5 x 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1, 5 x 104 M-1 s-1, 105 M-1 s-1, 5 x 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5 x 106 M-1 s-1, 107 M-1 s-1, o 5 x 107 M-1 s-1. En una divulgación, la molécula de unión o fragmentos de unión a antígeno de la misma se unen al virus de influenza A; virus de influenza B; fragmentos o variantes de los mismos; o combinaciones de los mismos, con una tasa de activación (kon) de más de o igual a 105 M-1 s-1, 5 x 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5 x 106 M-1 s-1, 107 M-1 s-1 o 5 x 107 M-1 s-1. La divulgación incluye anticuerpos que se unen al virus de influenza A; virus de influenza B; o combinaciones de los mismos, con una tasa de activación (kon) que está dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores mencionados individuales.

En una divulgación, puede realizarse un ensayo de unión o bien como un ensayo de unión directo o bien como un ensayo de unión-competición. La unión puede detectarse usando ensayos ELISA convencionales o ensayos de citometría de flujo convencionales. En un ensayo de unión directa, una molécula o anticuerpo de unión candidato se ensaya para determinar la unión a su antígeno relacionado. Un ensayo de unión competitiva, por otra parte, evalúa la capacidad de una molécula o anticuerpo candidatos para competir con un anticuerpo conocido u otro compuesto que se une a un antígeno particular, por ejemplo, HA de virus de influenza A o HA de virus de influenza B. En general, cualquier método que permita la unión de la molécula de unión con HA de virus de influenza A y/o HA de virus de influenza B que puede detectarse puede usarse para detectar y medir las características de unión de las moléculas de unión descritas en el presente documento.

En una divulgación, la molécula de unión es capaz de unirse inmunoespecíficamente a HA de virus de influenza A y/o HA de virus de influenza B y es capaz de neutralizar una infección por virus de influenza A y/o infección por virus de influenza B.

En una divulgación, al menos un dominio de unión de la molécula de unión es capaz de unirse inmunoespecíficamente al HA del virus de la influenza A y es capaz de neutralizar la infección por el virus de la influenza A. Los subtipos de hemaglutinina de los virus de influenza A se dividen en dos grupos filogenéticos principales, identificados como grupo 1, que incluye los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 y H18, y el grupo 2, que incluye los subtipos H3, H4, H7, H10, H14 y H15. En una divulgación, al menos un dominio de unión de la molécula de unión o fragmento de unión del mismo es capaz de unirse y/o neutralizar uno o más subtipos del grupo 1 de virus de influenza A seleccionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 y H18 y sus variantes. En otra divulgación, al menos un dominio de unión de la molécula de unión o fragmento de unión del mismo es capaz de unirse y/o neutralizar uno o más subtipos del grupo 2 de virus de influenza A seleccionados de H3, H4, H7, H10, H14 y H15 y sus variantes. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que son capaces de unirse inmunoespecíficamente al subtipo H9 del grupo 1 del virus de la influenza A. En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que son capaces de unirse inmunoespecíficamente a y neutralizar el subtipo H9 del grupo 1 del virus de la influenza A.

En una divulgación, al menos un dominio de unión de la molécula de unión es capaz de unirse inmunoespecíficamente a y neutralizar al menos un virus de influenza B de linaje Yamagata y al menos un virus de influenza B de linaje Victoria. En otra divulgación, al menos un dominio de unión de la molécula de unión se une inmunoespecíficamente y neutraliza el virus de la influenza B tanto del linaje Yamagata como del linaje Victoria.

En una divulgación, al menos un dominio de unión de la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse inmunoespecíficamente tanto a HA del virus de influenza A como a HA del virus de influenza B y neutralizar tanto una infección por virus de influenza A como una infección por virus de influenza B. Los ensayos de neutralización pueden realizarse usando métodos conocidos en la técnica. La expresión "concentración inhibitoria al 50 %" (abreviada como "CI50") representa la concentración de un inhibidor (por ejemplo, una molécula de unión descrita en el presente documento) que se requiere para una neutralización del 50 % del virus influenza A y/o del virus influenza B. Un experto en la técnica entenderá que un valor de CI50 inferior corresponde a un inhibidor más potente.

En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma tiene una CI50 para neutralizar el virus de influenza A y/o el virus de influenza B en el intervalo de aproximadamente 0.001 |jg/ml a aproximadamente 5 |jg/ml, o en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 1 jg/m l del anticuerpo, o menos de 5 jg/ml, menos de 2 jg/ml, menos de 1 jg/ml, menos de 0.5 jg/ml, menos de 0.1 jg/ml, menos de 0.05 jg/m l o menos de 0.01 jg/m l en un ensayo de microneutralización.

En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma tiene un primer dominio de unión con una CI50 para neutralizar el virus de la influenza A en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 5 jg/ml, o en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 1 jg/ml del anticuerpo, o menos de 5 jg/ml, menos de 2 jg/ml, menos de 1 jg/ml, menos de 0.5 jg/ml, menos de 0.1 jg/ml, menos de 0.05 jg/m l o menos de 0.01 jg/m l en un ensayo de microneutralización. En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma tiene un segundo dominio de unión con una CI50 para neutralizar el virus de influenza B en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 50 jg/ml, o en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 5 jg/ml de anticuerpo, o en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 1 jg/m l de anticuerpo, o menos de 10 jg/ml, menos de 5 jg/ml, menos de 1 jg/ml, menos de 0.5 jg/ml, menos de 0.1 jg/ml, menos de 0.05 jg/m l o menos de 0.01 |jg/ml en un ensayo de microneutralización.

En una divulgación, la molécula de unión tiene un dominio de unión o un fragmento de unión de la misma con una CI50 para neutralizar el virus de influenza B en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 5 jg/ml, o en el intervalo de aproximadamente 0.001 jg/m l a aproximadamente 1 jg/m l de anticuerpo, o menos de 5 jg/ml, menos de 2 jg/ml, menos de 1 jg/ml, menos de 0.5 jg/ml, menos de 0.1 jg/ml, menos de 0.05 jg/m l o menos de 0.01 jg/m l en un ensayo de microneutralización; y una CI50 para neutralizar el virus de influenza A en el intervalo de aproximadamente 0.1 jg/m l a aproximadamente 5 jg/ml, o en el intervalo de aproximadamente 0.1 jg/m l a aproximadamente 2 jg/m l de anticuerpo, o menos de 5 jg/ml, menos de 2 jg/ml, menos de 1 jg/ml, o menos de 0.5 jg/m l para la neutralización del virus de influenza A en un ensayo de microneutralización.

En algunas divulgaciones, las moléculas de unión descritas en el presente documento pueden inducir la muerte celular. Un anticuerpo que "induce la muerte celular" es aquel que causa que una célula viable se vuelva inviable. La muerte celular in vitro puede determinarse en ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por tanto, el ensayo para detectar muerte celular puede realizarse usando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia del complemento) y en ausencia de células efectoras inmunitarias. Para determinar si el anticuerpo puede inducir muerte celular, pérdida de membrana integridad según se evalúa mediante la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano (véase, Moore et al. (1995) Cytotechnology 17:1-11), 7AAD o pueden evaluarse otros métodos bien conocidos en la técnica en relación con células sin tratar.

En una divulgación, la molécula de unión puede inducir la muerte celular por apoptosis. Una molécula de unión que "induce apoptosis" es aquella que induce la muerte celular programada según lo determina la unión de anexina V, fragmentación del ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos). Están disponibles diversos métodos para evaluar los acontecimientos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidilserina (PS) puede medirse mediante la unión de anexina; la fragmentación del ADN puede evaluarse a través de marcadores de tamaño molecular del ADN; y la condensación nuclear/de cromatina junto con la fragmentación del ADN pueden evaluarse mediante cualquier aumento en células hipodiploides. En una divulgación, el anticuerpo que induce apoptosis es uno que resulta en una inducción de unión de anexina de aproximadamente 2 a 50 veces, en una realización de aproximadamente 5 a 50 veces, y en una divulgación de aproximadamente 10 a 50 veces, en relación con células sin tratar en un ensayo de unión de anexina.

En otra divulgación, las moléculas de unión descritas en el presente documento pueden inducir la muerte celular mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad mediada por células dependiente de complemento (CDC) y/o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP). La expresión de la actividad de ADCC y la actividad de CDC de los anticuerpos de la subclase de IgG1 humana generalmente implica la unión de la región Fc del anticuerpo a un receptor para un anticuerpo (en lo sucesivo denominado "FcyR") que existe en la superficie de células efectoras tales como células asesinas, células asesinas naturales o macrófagos activados. Se pueden unir varios componentes del complemento. Con respecto a la unión, se ha sugerido que varios residuos de aminoácidos en la región bisagra y el segundo dominio de la región C (en lo sucesivo en el presente documento denominado "dominio Cy2") del anticuerpo son importantes (Greenwood et al. (1993) Eur. J Immunol., 23(5):1098-104; Morgan et al. (1995) Immunology. 86(2):319-324; Clark, M. (1997) Chemical Immunology. 65:88-110) y que una cadena de azúcar en el dominio Cy2 (Clark, M. (1997) Chemical Immunology. 65:88-110) también es importante.

Para evaluar la actividad de ADCC, se puede usar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de Estados Unidos N.° 5,500,362. El ensayo puede realizarse también usando un kit disponible comercialmente, por ejemplo CytoTox 96 ® (Promega). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen, pero sin carácter limitante células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células citotóxicas naturales (NK) y líneas de células NK. Las líneas celulares NK que expresan un receptor Fc transgénico (por ejemplo, CD16) y un polipéptido de señalización asociado (por ejemplo, FCeRI-y) también pueden servir como células efectoras (documento WO 2006/023148). En una divulgación, la línea celular NK incluye CD16 y tiene luciferasa debajo del promotor NFAT y puede usarse para medir la activación de células NK, en vez de lisis celular o muerte celular. Una tecnología similar se vende por Promega, que usa células Jurkat en vez de células NK (bioensayo reportero de ADCC n.° G7010 de Promega). Por ejemplo, puede someterse a ensayo la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar en la lisis mediante activación del complemente y/o ADCC. Las células de interés se cultivan y etiquetan in vitro; la molécula de unión se añade al cultivo celular en combinación con células inmunes que pueden ser activadas por los complejos de antígeno y anticuerpo; es decir, células efectoras implicadas en la respuesta de ADCC. La molécula de unión también se puede ensayar para determinar la activación del complemento. En cualquier caso, se detecta citólisis mediante la liberación del marcador de las células lisadas. El graso de lisis celular también puede determinarse detectando la liberación de proteínas citoplasmáticas (por ejemplo LDH) en el sobrenadante. De hecho, los anticuerpos pueden cribarse usando el propio suero del paciente como fuente de células inmunes y/o complemento. Las moléculas de unión que son capaces de mediar la ADCC humana en el ensayo in vitro se pueden usar terapéuticamente en ese paciente particular. La actividad ADCC de la molécula de unión también puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 652-656. Además, las técnicas para modular (es decir, aumentar o disminuir) el nivel de ADCC, y opcionalmente la actividad de CDC, de un anticuerpo se conocen bien en la técnica (por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5,624,821; 6,194,551; 7,317,091). Las moléculas de unión descritas en el presente documento pueden ser capaces de, o pueden haber sido modificadas para tener la capacidad de inducir ADCC y/o CDC. Pueden ponerse en práctica ensayos para determinar la función de ADCC usando células efectoras humanas para evaluar la función de ADCC humana. Tales ensayos también pueden incluir los destinados a someter a cribado para detectar anticuerpos que inducen, median en, potencian, bloquean la muerte celular mediante mecanismos necróticos y/o apoptóticos. Dichos métodos que incluyen ensayos que utilizan tintes viables, métodos de detección y análisis de caspasas, y ensayos que miden roturas de ADN pueden usarse para evaluar la actividad apoptótica de células cultivadas in vitro con un anticuerpo de interés.

Polinucleótidos

También se proporcionan en el presente documento secuencias de nucleótidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos y que codifican las moléculas de unión descritas en el presente documento. En una divulgación, la invención proporciona polinucleótidos que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de unión descrita en el presente documento o fragmentos de la misma, incluyendo, por ejemplo, secuencias de polinucleótidos que codifican regiones VH y VL que incluyen CDR y FR, así como vectores de expresión para la expresión eficiente en células (por ejemplo, células de mamíferos). Los métodos para preparar las moléculas de unión usando polinucleótidos se conocen y se describen brevemente a continuación.

También se incluyen polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación de astringencia o de restricción inferiores, por ejemplo, como se define en el presente documento, a polinucleótidos que codifican una molécula de unión descrita en el presente documento o un fragmento de la misma. El término "astringencia" como se usa en el presente documento se refiere a condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura y concentración de sal) de un experimento de hibridación para indicar el grado de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro; cuanto mayor es la astringencia, mayor es el porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro.

Las condiciones de hibridación astringentes incluyen, pero sin limitación, hibridación a ADN unido al filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C seguido de uno o más lavados en SSC 0.2X/SDS al 0.1% a aproximadamente 50-65 °C, condiciones altamente astringentes tal como hibridación a ADN unido al filtro en SSC 6X a aproximadamente 45 °C seguido de uno o más lavados en SSC 0.1X/SDS al 0.2% a aproximadamente 65 °C o cualquier otra condición de hibridación astringente conocida por expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley y Sons, Inc., NY en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3).

Las secuencias sustancialmente idénticas incluyen secuencias polimórficas, es decir, secuencias alternativas o alelos en una población. Una diferencia alélica puede ser tan pequeña como un par de bases. Las secuencias sustancialmente idénticas también pueden incluir secuencias mutagenizadas, incluyendo secuencias que tienen mutaciones silenciosas. Una mutación puede incluir uno o más cambios de residuos, una eliminación de uno o más residuos o una inserción de uno o más residuos adicionales.

Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos de la molécula de unión, se puede ensamblar un polinucleótido que codifica la molécula de unión a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al. (1994) BioTechniques. 17: 242), que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica la molécula de unión, la hibridación y la ligadura de estos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.

Un polinucleótido que codifica una molécula de unión también se puede generar a partir de ácido nucleico a partir de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica una molécula de unión particular no está disponible, pero se conoce la secuencia de la molécula de unión, un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, en una realización poliA ARN, aislado de, cualquier tejido o células que expresan el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) por amplificación por PCR usando cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia génica particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Entonces los ácidos nucleicos amplificados generados mediante PCR pueden clonarse en vectores de clonación que pueden replicarse usando cualquier método conocido en la técnica.

Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la molécula de unión, la secuencia de nucleótidos de la molécula de unión puede manipularse usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al. eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar moléculas de unión que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.

Producción de moléculas de unión

Los métodos de ADN recombinante para producir y seleccionar polipéptidos, tales como las moléculas de unión descritas en el presente documento, son rutinarios y bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 4,816,567). El ADN que codifica las moléculas de unión o fragmentos de las mismas, por ejemplo, ADN que codifica un dominio VH, un dominio VL, un scFv o combinaciones de los mismos, puede insertarse en un vector de expresión adecuado, que luego se transfecta en una célula huésped adecuada, como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de anticuerpo para obtener la molécula de unión.

En una divulgación, un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica una molécula de unión, una cadena pesada o ligera de la molécula de unión o un dominio de unión de la misma, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un dominio de unión, o una CDR de cadena pesada o ligera, operativamente unida a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,981,216; 5,591,639; 5,658,759 y 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en un vector del mismo tipo para la expresión de toda la cadena pesada, toda la cadena ligera, o tanto toda la cadena pesada como toda la cadena ligera.

El vector de expresión se puede transferir a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se pueden cultivar mediante técnicas convencionales para producir la molécula de unión. En una divulgación, se proporcionan células huésped que contienen un polinucleótido que codifica la molécula de unión o fragmentos de la misma, o una cadena pesada o ligera de la misma, o una porción de la misma, o un anticuerpo monocatenario, unido operativamente a un promotor heterólogo.

Las líneas celulares de mamíferos adecuadas como huéspedes para la expresión de anticuerpos recombinantes se conocen bien en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células 293 de riñón epitelial humano y varias otras líneas celulares. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo o porción del mismo expresado. Para este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen pero sin carácter limitante a células c Ho , VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce de manera endógena ninguna cadena de inmunoglobulina funcional), SP20, CRL7O3O y HsS78Bst. Pueden utilizarse líneas celulares humanas desarrolladas mediante la inmortalización de linfocitos humanos para producir de manera recombinante anticuerpos monoclonales. La línea celular humana PER.C6®. (Crucell, Países Bajos) para producir de manera recombinante anticuerpos monoclonales.

Las líneas celulares adicionales que pueden utilizarse como huéspedes para la expresión de anticuerpos recombinantes incluyen, pero sin carácter limitante, células de insecto (por ejemplo Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o células de levadura (por ejemplo S. cerevisiae, Pichia, documento US7326681; etc.), células vegetales (documento US20080066200); y células de pollo (documento WO2008142124).

En una divulgación, la molécula de unión se expresa establemente en una línea celular. Puede utilizarse la expresión estable para la producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes. Para la expresión estable, las células huésped se pueden transformar con un vector diseñado apropiadamente que incluye elementos de control de la expresión (por ejemplo, promotor, potenciador, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, las células se dejan crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células que han integrado de forma estable el plásmido en sus cromosomas crezcan y formen focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Se conocen bien en la técnica métodos para producir líneas celulares estables con un alto rendimiento y los reactivos generalmente están disponibles comercialmente.

En otras divulgaciones, las moléculas de unión se expresan transitoriamente en una línea celular. La transfección transitoria es un proceso en el que el ácido nucleico introducido en una célula no se integra en el genoma o el ADN cromosómico de esa célula y se mantiene como un elemento extracromosómico, por ejemplo, como un episoma, en la célula.

La línea celular, ya sea estable o transfectada transitoriamente, se mantiene en medio de cultivo celular y en condiciones bien conocidas en la técnica que dan como resultado la expresión y producción de la molécula de unión. En ciertas divulgaciones, el medio de cultivo de células de mamífero se basa en formulaciones de medios disponibles comercialmente, incluyendo, por ejemplo, DMEM o F12 de Ham. En otras divulgaciones, el medio de cultivo se modifica para soportar aumentos tanto en el crecimiento celular como en la expresión de proteínas biológicas. Tal como se utiliza en la presente, los términos "medio de cultivo celular", "medio de cultivo" y "formulación del medio" se refieren a una solución nutritiva para el mantenimiento, el crecimiento, la propagación o la expansión de células en un entorno in vitro artificial fuera de un tejido u organismo multicelular. El medio de cultivo puede optimizarse para un uso de cultivo celular específico, por ejemplo, medio de crecimiento de cultivo celular que se formula para promover el crecimiento celular, o medio de producción de cultivo celular que se formula para promover la producción de proteína recombinante. Los términos nutriente, ingrediente y componente se usan indistintamente en la presente para referirse a los constituyentes que constituyen un medio de cultivo celular.

En una divulgación, las líneas celulares se mantienen utilizando un método alimentación discontinua. Como se usa en el presente documento, "método de alimentación discontinua" se refiere a un método mediante el cual un cultivo celular se suministra con nutrientes adicionales después de incubarlo primero con un medio inicial. Por ejemplo, un método semicontinuo puede incluir añadir medios complementarios según un plan de alimentación determinado dentro de un periodo de tiempo dado. Por lo tanto, un "cultivo de células de alimentación discontinua" se refiere a un cultivo celular en el que las células, típicamente de mamífero, y el medio de cultivo se suministran inicialmente al recipiente de cultivo y se suministran nutrientes de cultivo adicionales, continuamente o en aumentos discretos, al cultivo durante el cultivo. con o sin recogida periódica de células y/o productos antes de la finalización del cultivo.

Los medios de cultivo celular y los nutrientes contenidos en los mismos son conocidos por los expertos en la técnica. En una divulgación, el medio de cultivo celular incluye un medio basal y al menos un hidrolizado, p. ej., hidrolizado a base de soja, un hidrolizado a base de levadura o una combinación de los dos tipos de hidrolizados dando como resultado un medio basal modificado. En otra divulgación, los nutrientes adicionales pueden incluir sólo un medio basal, tal como un medio basal concentrado, o pueden incluir sólo hidrolizados, o hidrolizados concentrados. Los medios basales adecuados incluyen, pero sin carácter limitante medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), DME/F12, medio esencial mínimo (MEM), medio basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, medio esencial mínimo a (a-MEM), medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM), PF CHO (véase, por ejemplo, medio libre de proteína CHO (Sigma) o medio libre de suero EX-CELL™ 325 PF CHO para células CHO libre de proteína (SAFC Bioscience), y medio de Dulbecco modificado por Iscove. Otros ejemplos de medios basales que pueden usarse en la invención incluyen medio basal BME (Gibco-Invitrogen; véase también Eagle, H (1965) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 89, 36); medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, polvo) (Gibco-Invitrogen (n.° 31600); véase también Dulbecco y Freeman (1959) Virology. 8:396; Smith et al. (1960) Virology.

12:185. Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6:2, 93); medio CMRL 1066 (Gibco-Invitrogen (n.° 11530); véase también Parker et al. (1957) Special Publications, N.Y. Academy of Sciences, 5:303).

El medio basal puede estar libre de suero, lo que significa que el medio no contiene suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), suero de caballo, suero de cabra o cualquier otro suero derivado de animal conocido por el experto en la técnica) o medios libres de proteínas animales o medios definidos químicamente.

El medio basal puede modificarse con el fin de eliminar determinados componentes no nutricionales que se encuentran en medio basal convencional, tales como diversos tampones orgánicos e inorgánicos, tensioactivo(s) y cloruro de sodio. La eliminación de tales componentes del medio celular basal permite un aumento de la concentración de los componentes nutricionales restantes, y puede mejorar el crecimiento celular y la expresión de proteínas globales. Además, pueden añadirse componentes omitidos de nuevo al medio de cultivo celular que contiene el medio celular basal modificado según los requisitos de las condiciones de cultivo celular. En ciertas divulgaciones, el medio de cultivo celular contiene un medio celular basal modificado, y al menos uno de los siguientes nutrientes, una fuente de hierro, un factor de crecimiento recombinante; un tampón; un tensioactivo; un regulador de la osmolaridad; una fuente de energía; e hidrolizados no animales. Además, el medio celular basal modificado puede contener opcionalmente aminoácidos, vitaminas o una combinación de tanto aminoácidos como vitaminas. En otra divulgación, el medio basal modificado contiene además glutamina, por ejemplo L-glutamina y/o metotrexato.

Purificación y aislamiento

Una vez que se ha producido una molécula de unión, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para los antígenos específicos Proteína A o Proteína G, y cromatografía en columna de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias polipeptídicas heterólogas (denominadas en el presente documento "etiquetas") para facilitar la purificación.

En una divulgación, se proporciona una molécula de unión sustancialmente purificada/aislada. En una divulgación, estas moléculas de unión expresadas recombinantemente aisladas/purificadas pueden administrarse a un paciente para mediar un efecto profiláctico o terapéutico. Un producto profiláctico es un medicamento o un tratamiento diseñado y utilizado para prevenir que se produzca una enfermedad, trastorno o infección. Un producto terapéutico se refiere específicamente al tratamiento de una enfermedad, trastorno o infección particular. Una dosis terapéutica es la cantidad necesaria para tratar una enfermedad, trastorno o infección particular. En otra divulgación, estos anticuerpos aislados/purificados pueden usarse para diagnosticar una infección por virus de la influenza, por ejemplo, infección por virus de influenza A, infección por virus de influenza B, o combinaciones de los mismos.

Glucosilación

Además de la capacidad de la glucosilación para alterar la función efectora de los anticuerpos, la glucosilación modificada en la región variable puede alterar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. En una divulgación, se modifica el patrón de glucosilación en la región variable de los presentes anticuerpos. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glucosilación se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de los carbohidratos se pueden conseguir, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que provoquen la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de las regiones estructurales de la región variable para suprimir del mismo modo la glucosilación en dicho sitio. Una aglucosilación del mismo tipo puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Un enfoque del mismo tipo se describe en detalle adicional en las patentes estadounidenses n.os 5,714,350 y 6,350,861. También pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácido que den como resultado la eliminación de un sitio de glucosilación presente en la región Fc (por ejemplo, asparagina 297 de IgG). Además, pueden producirse anticuerpos aglucosilados en células bacterianas que carecen de la maquinaria de glucosilación necesaria.

Variantes y conjugados

En una divulgación, la molécula de unión incluye uno o más dominios de unión que incluyen uno o más residuos de aminoácidos y/o sustituciones de polipéptidos, adiciones y/o deleciones en el dominio ligero variable (VL) y/o el dominio pesado variable (VH) y/o la región Fc y modificaciones postraduccionales. En una divulgación, la molécula de unión incluye una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos conservativas basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Además, glicina y prolina son residuos que pueden influir en la orientación de la cadena. Las sustituciones no conservativas supondrán el intercambio de un miembro de una de las mismas clases por un miembro de otra clase. Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no clásicos o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en la secuencia de anticuerpo. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin carácter limitante, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido a -aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, Y-Abu, £-Ahx, ácido 6-aminohexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como p-metilaminoácidos, Ca-metilaminoácidos, Na-metilaminoácidos análogos de aminoácidos en general.

En una divulgación, uno o más residuos de cisteína pueden estar sustituidos, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. A la inversa, puede añadirse enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

En una divulgación, se introducen una o más mutaciones en una o más regiones de entramado de una molécula de anticuerpo. En otra divulgación, se introducen una o más mutaciones en una o más regiones CDR de una molécula de anticuerpo.

En una divulgación, la molécula de unión está conjugada o unida covalentemente a una secuencia de aminoácidos heteróloga u otro resto o sustancia usando métodos conocidos en la técnica. En una divulgación, la sustancia adherida es un agente terapéutico, un marcador detectable (denominado también en la presente una molécula indicadora) o un soporte sólido. Las sustancias adecuadas para la unión a anticuerpos incluyen, pero sin limitación, un aminoácido, un péptido, una proteína, un polisacárido, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un hapteno, un fármaco, una hormona, un lípido, un conjunto de lípidos, un polímero sintético, una micropartícula polimérica, una célula biológica, un virus, un fluoróforo, un cromóforo, un colorante, una toxina, una enzima, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un radioisótopo, matrices sólidas, matrices semi-sólidas y combinaciones de los mismos. Se conocen métodos para la conjugación o la unión covalente de otra sustancia a un anticuerpo.

En una divulgación, la molécula de unión se conjuga con un soporte sólido. Las moléculas de unión se pueden conjugar a un soporte sólido como parte del proceso de selección y/o purificación y/o fabricación. Como alternativa, las moléculas de unión se pueden conjugar a un soporte sólido como parte de un método o composición de diagnóstico. Un soporte sólido es típicamente sustancialmente insoluble en fases líquidas. Se dispone de un gran número de soportes y el experto habitual en la técnica los conoce.

En una divulgación, la molécula de unión se conjuga con un marcador para fines de diagnóstico y otros ensayos en los que pueden detectarse las moléculas de unión y/o su ligando asociado. Una etiqueta incluye cualquier resto químico, orgánico o inorgánico, que muestre un máximo de absorción a longitudes de onda mayores de 280 nm, y retenga sus propiedades espectrales al unirse covalentemente a la molécula de unión. Los marcadores incluyen, sin limitación, un cromóforo, un fluoróforo, una proteína fluorescente, un colorante fosforescente, un colorante en tándem, una partícula, un hapteno, una enzima y un radioisótopo.

En ciertas divulgaciones, la etiqueta es una enzima. Las enzimas pueden ser deseables como etiquetas porque se puede obtener la amplificación de la señal detectable dando como resultado una sensibilidad aumentada del ensayo. La propia enzima no produce una respuesta detectable, sino que funciona para descomponer un sustrato cuando se pone en contacto mediante un sustrato apropiado de manera que el sustrato convertido produce una señal fluorescente, colorimétrica o luminiscente. Las enzimas amplifican la señal detectable porque una enzima en un reactivo de marcaje puede dar como resultado que múltiples sustratos se conviertan en una señal detectable. El sustrato enzimático se selecciona para producir el producto medible preferido, por ejemplo, colorimétrico, fluorescente o quimioluminiscente. Tales sustratos se usan ampliamente en la técnica y el experto en la técnica los conoce bien.

En otra divulgación, la etiqueta es un hapteno tal como biotina. La biotina es útil porque pueden funcionar en un sistema enzimático para amplificar adicionalmente la señal detectable, y puede funcionar como etiqueta que va a usarse en cromatografía de afinidad para fines de aislamiento. Para fines de detección, se usa un conjugado enzimático que tiene afinidad por biotina, tal como avidina-HRP. Posteriormente, se añade un sustrato de peroxidasa para producir una señal detectable. Los haptenos también incluyen hormonas, fármacos de origen natural y sintéticos, contaminantes, alérgenos, moléculas afectoras, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, linfocinas, aminoácidos, péptidos, productos intermedios químicos, nucleótidos y similares.

En ciertas divulgaciones, las proteínas fluorescentes se pueden usar como una etiqueta. Ejemplos de proteína fluorescentes incluyen la proteína verde fluorescente (GFP) y las ficobiliproteínas y los derivados de las mismas.

En ciertas divulgaciones, el marcador es un isótopo radiactivo. Los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen, pero sin limitación, yodo (121I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (135Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, y 97Ru.

Tratamientos y usos médicos

Las moléculas de unión y los fragmentos de unión a antígeno de las mismas que se describen en el presente documento pueden ser para su uso en el tratamiento de infección por virus de influenza A y/o infección por virus de influenza B, para su uso en la prevención de infección por virus de influenza A y/o infección por virus de influenza B; para la detección, diagnóstico y/o pronóstico de infección por virus de influenza A y/o infección por virus de influenza B; o combinaciones de los mismos.

Los métodos de diagnóstico pueden incluir poner en contacto moléculas de unión o fragmentos de las mismas con una muestra. Tales muestras pueden ser muestras de tejido tomadas de, por ejemplo, las fosas nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oído, ojo, placenta, tubo digestivo, corazón, ovarios, hipófisis, glándulas suprarrenales, tiroides, cerebro o piel. Los métodos de detección, diagnóstico y/o pronóstico también pueden incluir la detección de un complejo antígeno/anticuerpo.

En una divulgación, se proporciona una molécula de unión aislada de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende la misma para su uso en el tratamiento de un sujeto.

En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma, está sustancialmente purificada (es decir, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios indeseados). En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma, se administra después de la exposición, o después de que el sujeto ha sido expuesto al virus de influenza A y/o al virus de influenza B, o está infectado con el virus de influenza A y/o el virus de influenza B. En otra divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma, se administra antes de la exposición, o a un sujeto que aún no ha sido expuesto al virus de influenza A y/o al virus de influenza B, o que aún no está infectado con el virus de influenza A y/o el virus de influenza B.

En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma se administra a un sujeto que es seronegativo para uno o más subtipos de virus de influenza A y/o cepas de virus de influenza B. En otra divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma se administra a un sujeto que es seropositivo para uno o más subtipos de virus de influenza A y/o cepas de virus de influenza B. En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma se administra a un sujeto en 1, 2, 3, 4, 5 días de infección o inicio de los síntomas. En otra divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma se administra a un sujeto después de 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, y 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. o 10 días después de la infección o el inicio de los síntomas.

En una divulgación, el método reduce la infección por el virus de influenza A y/o el virus de influenza B en un sujeto. En otra divulgación, el método previene, reduce el riesgo o retrasa la infección del virus de influenza A y/o el virus de influenza B en un sujeto. En una divulgación, el sujeto es un animal. En una divulgación, el sujeto es un miembro del subfilo de los cordados, incluyendo, por ejemplo, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos. En otra divulgación, el sujeto es un animal de granja tal como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; un animal doméstico, como perros y gatos; un animal de laboratorio, incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas; un ave, incluyendo aves domésticas, silvestres y de caza, tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos. En una divulgación, el sujeto incluye, pero sin limitación, uno que está particularmente en riesgo o es susceptible de infección por el virus de influenza A y/o el virus de influenza B, que incluye, por ejemplo, un sujeto inmunocomprometido.

El tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples y la molécula de unión o fragmento de unión de la misma se puede usar en la inmunización pasiva o la vacunación activa.

En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma se administra a un sujeto en combinación con uno o más medicamentos antivirales. En una divulgación, la molécula de unión o fragmento de unión de la misma se administra a un sujeto en combinación con uno o más medicamentos antivirales de molécula pequeña, incluyendo, pero sin limitación, inhibidores de neuraminidasa tales como oseltamivir (TAMIFLU®), zanamivir (RELENZA®) y adamantanos tales como amantadina y rimantadina.

En otra divulgación, se proporciona una composición que comprende una molécula de unión aislada de las reivindicaciones para su uso como un medicamento para la prevención o el tratamiento de la infección por el virus de influenza A y/o el virus de influenza B. En otra divulgación, una molécula de unión o fragmento de unión de la misma y/o una proteína que tiene un epítopo al que se une la molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma se usa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto y/o el diagnóstico en un sujeto.

Las moléculas de unión y fragmentos de las mismas como se describen en el presente documento también pueden usarse en un kit para el diagnóstico de infección por virus de influenza A; infección por el virus de la influenza B; o combinaciones de los mismos. Las moléculas de unión, fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos, como se describe en el presente documento, también pueden usarse en un kit para monitorizar la inmunogenicidad de la vacuna.

En una divulgación, se proporciona un método para preparar una composición farmacéutica, que incluye la etapa de mezclar una molécula de unión descrita en el presente documento con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar la molécula de unión o fragmento de unión descrito en este documento, incluyendo, pero sin limitación, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar la molécula o fragmento de unión, endocitosis mediada por receptor, electroporación, construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. En una divulgación, la molécula de unión se puede administrar como un plásmido con ADN o ARN que codifica la molécula de unión, por ejemplo, mediante electroporación. Las composiciones se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos, incluyendo, pero sin limitación, composiciones antivirales de molécula pequeña. La administración puede ser sistémica o local. También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente para formar un aerosol. En aún otra divulgación adicional, la composición puede administrarse en un sistema de liberación controlada.

También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión de las reivindicaciones, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéuticamente aceptable” usada en la presente significa que está aprobado por la agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o que está enumerada en la farmacopea de los EE. UU. o en otra farmacopea reconocida de manera general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético tales como aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones de glicerol y dextrosa acuosa como portadores líquidos, particularmente para las soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En una divulgación, la composición farmacéutica contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de una administración adecuada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración. Normalmente, para terapéutica con anticuerpos, la dosificación administrada a un paciente de entre aproximadamente 0.1 mg/kg y 100 mg/kg del peso corporal del paciente.

Kits

En una divulgación, se proporcionan artículos de fabricación que incluyen al menos una molécula de unión tal como se describe en el presente documento, tales como formas de dosificación estériles y kits. Se pueden proporcionar kits que contienen las moléculas de unión para la detección y cuantificación del virus de influenza in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia de Western. Las moléculas de unión útiles para la detección pueden proporcionarse con una etiqueta tal como un fluorescente o radiomarcador.

Divulgaciones ejemplares

1. En el presente documento se describe una molécula de unión aislada que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, que comprende:

(a) un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de influenza A; y

(b) un segundo dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza B y neutralizar el virus de la influenza B en al menos dos linajes filogenéticamente distintos.

2. La molécula de unión aislada de acuerdo con la divulgación 1, en la que el primer dominio de unión es capaz de neutralizar uno o más subtipos del grupo 1 del virus de influenza A seleccionados de: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, H18 y variantes de los mismos; y uno o más subtipos del grupo 2 del virus de la influenza A seleccionados de entre: H3, H4, H7, H10, H14 y H15 y variantes de los mismos.

3. La molécula de unión aislada de acuerdo con la divulgación 1, en la que el segundo dominio de unión es capaz de neutralizar el virus de influenza B tanto los linajes Yamagata y Victoria.

4. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende un anticuerpo del virus anti-influenza A o fragmento de unión a antígeno del mismo.

5. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el segundo dominio de unión comprende un anticuerpo del virus anti-influenza B o fragmento de unión a antígeno del mismo.

6. La molécula de unión de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores, que comprende al menos un VH de una cadena pesada de anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera de anticuerpo.

7. La molécula de unión de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende al menos un VH de una cadena pesada de anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera de anticuerpo.

8. La molécula de unión de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el segundo dominio de unión comprende al menos un VH de una cadena pesada de anticuerpo y al menos un VL de una cadena ligera de anticuerpo.

9. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, Hc DR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en el que el conjunto de seis CDR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

10. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el primer dominio de unión comprende un VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un VH seleccionado de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 7; y

(b) un VH de SEQ ID NO.: 17.

11. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el primer dominio de unión comprende un VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un VL seleccionado de:

(a) un VL de SEQ ID NO.: 2; y

(b) un VL de SEQ ID NO.: 12.

12. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el primer dominio de unión comprende un VH y un VL que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un VH y un VL, respectivamente, seleccionado de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 7 y un VL de SEQ ID NO.: 2; y

(b) un VH de SEQ ID NO.: 17 y un VL de SEQ ID NO.: 12.

13. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el primer dominio de unión comprende un VH y un VL seleccionado de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 7 y un VL de SEQ ID NO.: 2; y

(b) un VH de SEQ ID NO.: 17 y un VL de SEQ ID NO.: 12.

14. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el segundo dominio de unión incluye un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 en el que el conjunto de seis CDR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

15. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el segundo dominio de unión comprende un VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un VH seleccionado de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 27;

(b) un VH de SEQ ID NO.: 33;

(c) un VH de SEQ ID NO.: 36;

(d) un VH de SEQ ID NO.: 43;

(e) un VH de SEQ ID NO.: 49;

(f) un VH de SEQ ID NO.: 52;

(g) un VH de SEQ ID NO.: 59; y

(h) un VH de SEQ ID NO.: 65.

16. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el segundo dominio de unión comprende un VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un VL seleccionado de:

(a) un VL de SEQ ID NO.: 22;

(b) un VL de SEQ ID NO.: 32;

(c) un VL de SEQ ID NO.: 35;

(d) un VL de SEQ ID NO.: 38;

(e) un VL de SEQ ID NO.: 48;

(f) un VL de SEQ ID NO.: 51;

(g) un VL de SEQ ID NO.: 54; y

(h) un VL de SEQ ID NO.: 64.

17. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el segundo dominio de unión comprende un VH y un VL que es al menos un 75% idéntico a la secuencia de aminoácidos de un VH y un VL, respectivamente, seleccionada de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 27 y un VL de SEQ ID NO.: 22;

y

18. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores en la que el segundo dominio de unión comprende un VH y un VL seleccionados de:

(a) un VH de SEQ ID NO.: 27 y un VL de SEQ ID NO.: 22;

(b) un VH de SEQ ID NO.: 33 y un VL de SEQ ID NO.: 32;

(c) un VH de SEQ ID NO.: 36 y un VL de SEQ ID NO.: 35;

(d) un VH de SEQ ID NO.: 43 y un VL de SEQ ID NO.: 38;

(e) un VH de SEQ ID NO.: 49 y un VL de SEQ ID NO.: 48;

(f) un VH de SEQ ID NO.: 52 y un VL de SEQ ID NO.: 51;

(g) un VH de SEQ ID NO.: 59 y un VL de SEQ ID NO.: 54; y

(h) un VH de SEQ ID NO.: 65 y un VL de SEQ ID NO.: 64.

19. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, que comprende un anticuerpo biespecífico.

20. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que uno o más dominios de unión comprenden un dominio de fragmento variable (Fv).

21. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que uno o más dominios de unión comprenden una molécula scFv.

22. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que uno o más dominios de unión comprenden un dominio Fv y uno o más dominios de unión comprenden una molécula scFv.

23. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv del virus anti-influenza A.

24. La molécula de unión de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores, que comprende dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo.

25. La molécula de unión de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores, que comprende un dominio Fv que comprende un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo, en la que el Fv se une específicamente a un virus anti-influenza A.

26. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el segundo dominio de unión comprende una molécula scFv del virus anti-influenza B.

27. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv del virus anti-influenza A y el segundo dominio de unión comprende una molécula scFv del virus anti-influenza B.

28. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 27, en la que el dominio Fv del primer dominio de unión comprende una cadena pesada (HC) que comprende una cadena polipeptídica que tiene un extremo amino y un extremo carboxi y una cadena ligera (LC) que comprende una cadena polipeptídica que tiene un extremo amino y un extremo carboxi, y

29. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 28, en la que la molécula de unión comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una cadena ligera de anticuerpo que tiene una fórmula scFv-L1-VL-CL, en la que scFv es una molécula scFv, L1 es un enlazador, VL es un dominio variable de cadena ligera, CL es un dominio constante de cadena ligera y VL es un dominio variable de cadena ligera.

30. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 28, en la que la cadena pesada comprende una fórmula scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3, en la que scFv es una molécula scFv, L1 es un enlazador, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio constante de cadena pesada dominio-3.

31. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 28-30, que comprende un dominio de cadena pesada variable (VH) con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de dominio VH de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 17.

32. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 28-31, que comprende un dominio de cadena ligera variable (VL) con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de dominio VL de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y Se Q ID NO: 12.

33. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 28, en la que la molécula de unión comprende una primera y segunda cadena pesada con primer y segundo dominios C-terminal, respectivamente, en la que una o más moléculas scFv están unidas covalentemente al dominio C-terminal de la primera cadena pesada, la segunda cadena pesada, o combinaciones de las mismas.

34. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 28, en la que una o más cadenas pesadas comprenden una fórmula VH-CH1-CH2-CH3, en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un dominio constante de cadena pesada dominio-1, CH2 es un dominio constante de cadena pesada dominio-2, y CH3 es un dominio de constante de cadena pesada 3.

35. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 34, en la que una o más cadenas pesadas comprenden una fórmula VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3, en la que L1 y L2 independientemente son un enlazador y un scFv es una molécula scFv.

36. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 34, en la que una o más cadenas pesadas comprenden una fórmula VH-CH1-CH2-L1-scFV-L2-CH3, en la que L1 y L2 independientemente son un enlazador y un scFv es una molécula scFv.

37. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 34, en la que una o más cadenas pesadas comprenden una fórmula VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFV-L2-CH3, en la que L1 y L2 independientemente son un enlazador y un scFv es una molécula scFv.

38. La molécula de unión de acuerdo con las divulgaciones 35, 36, o 37, en la que L1 y L2 comprenden independientemente (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, o una combinación de (a) y (b).

39. La molécula de unión de acuerdo con las divulgaciones 21-38, en la que el scFv comprende una fórmula: VH-LS-VL, y en la que VH es un dominio variable de cadena pesada, LS es un enlazador, y VL es un dominio variable de cadena ligera.

40. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 39, en la que LS comprende (a) [GGGGS]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, (b) [GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5, o una combinación de (a) y (b).

41. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 28, en la que la cadena pesada y la cadena ligera del segundo dominio de unión se unen por uno o más enlaces disulfuro.

42. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 41, en la que el scFv del segundo dominio de unión comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) y el VH del scFv incluye un residuo de cisteína en una posición seleccionada de la posición 43, 44, 100, 101, 105, y combinaciones de las mismas y el VL del scFv incluye una residuo de cisteína en una posición seleccionada de la posición 43, 44, 46, 49, 50, 100, y combinaciones de las mismas.

43. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 42, en la que el VL y VH del scFv se unen por un enlace disfulfuro seleccionado de: VL100-VH44, VL43-VH105, VL46-VH101, VL49-VH100, VL50-VH100, y combinaciones de los mismos.

44. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 42, en la que el VH y el VL del scFv se unen por un enlace disfulfuro seleccionado de: VH44-VL100, VH100-VL49, VH100-VL50, VH101-VL46, VH105-VL43, y combinaciones de los mismos.

45. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 39, en la que VH comprende un conjunto de tres CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, en las que el conjunto de tres CDR se selecciona de:

(f) una secuencia de aminoácidos de: HCDR1 de SEQ ID NO.: 60, HCDR2 de SEQ ID NO.: 61, HCDR3 de SEQ ID NO.: 62.

46. La molécula de unión de acuerdo con la divulgación 39, en la que VL comprende un conjunto de tres CDR: LCDR1, LCDR2, LCDR3 en las que el conjunto de tres CDR se selecciona de:

47. La molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 21-46, en la que el scFv tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:63.

48. En el presente documento se describe un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de influenza A y el virus de influenza B, que comprende al menos una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68.

49. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la divulgación 48, que comprende al menos una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68.

50. En el presente documento se describe un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de influenza A y el virus de influenza B, que comprende al menos una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69.

51. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la divulgación 50, que comprende al menos una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69.

52. En el presente documento se describe un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al virus de influenza A y al virus de influenza B, que comprende al menos una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:68 y al menos una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:69.

53. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la divulgación 52, que comprende:

(a) al menos una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:66 y al menos una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:67; o

(b) al menos una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:68 y al menos una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:69.

54. En el presente documento se describe una célula que comprende o produce la molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47, el anticuerpo biespecífico o fragmento de la misma de las divulgaciones 48 53, o cualquier combinación de los mismos.

55. En el presente documento se describe un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica la molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53.

56. Un vector que comprende el polinucleótido de la divulgación 55.

57. En el presente documento se describe una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la divulgación 55 o el vector de la divulgación 56.

58. En el presente documento se describe una composición que comprende la molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47, el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

59. En el presente documento se describe un kit que comprende la composición de la divulgación 58.

60. En el presente documento se describe una composición de la divulgación 58 para su uso en un método para prevenir o tratar una infección por virus de influenza A o virus de la influenza B en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la composición de la divulgación 58.

61. En el presente documento se describe un método para fabricar una molécula de unión según una cualquiera de las divulgaciones 1-47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53, que comprende cultivar una célula huésped según la divulgación 57 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión o biespecífica anticuerpo o fragmento del mismo.

62. Un método de acuerdo con la divulgación 61, que comprende además aislar la molécula de unión del cultivo de la célula huésped.

63. En el presente documento se describe una molécula de unión de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones 1 47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento de la misma de las divulgaciones 48-53 para su uso en la profilaxis o tratamiento de infección por influenza A, infección por influenza B, o una combinación de los mismos en un sujeto.

64. En el presente documento se describe un uso de una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53 en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de infección por influenza A, infección por influenza B, o combinación de los mismos en un sujeto.

65. En el presente documento se describe un uso de una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53 en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la infección por influenza A e influenza B en un sujeto.

66. En el presente documento se describe una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53 para su uso en un método para profilaxis o el tratamiento de la infección por influenza A, infección por influenza B, o una combinación de los mismos en un sujeto.

67. En el presente documento se describe una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53 para su uso en un método para la profilaxis o el tratamiento de la infección por influenza A e influenza B en un sujeto.

68. En el presente documento se describe un uso de una molécula de unión de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 1-47 o el anticuerpo biespecífico o fragmento del mismo de las divulgaciones 48-53 para el diagnóstico in vitro de infección por influenza A, infección por influenza B, o una combinación de las mismas en un sujeto.

Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de construcciones de anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos IgG anti-HA que se unen específicamente al virus de la influenza A se describen en las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N.° 61/885,808, presentada el 2 de octubre de 2013 y 62/002,414, presentada el 23 de mayo de 2014, y los anticuerpos IgG anti-HA que se unen específicamente al virus de influenza B se describen en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/024,804, presentada el 15 de julio de 2014. En resumen, estos anticuerpos son ampliamente reactivos cruzados que reconocen virus de influenza A (FY1 y GL20) y el virus de influenza B (FBD94, FBC39, y FBC39 FTL). Se construyó una serie de anticuerpos biespecíficos (BiS) usando las secuencias del gen IgG VH y VL de estos anticuerpos. Los anticuerpos biespecíficos resultantes combinan las actividades complementarias de los diferentes mAb anti-influenza A o B HA para crear moléculas de tipo anticuerpo único capaces de neutralizar todas las cepas de influenza A y B.

La figura 1 muestra un esquema de la orientación de cinco diferentes cadenas troncales BiS. En, por ejemplo, los anticuerpos Bis-Flu A B generados, el anticuerpo anti-Flu A (FY1 o su forma optimizada GL20) se usó como una IgG, y el anticuerpo anti-Flu B (FBD94, FBC39 o su forma optimizada FBC39FTL) se uso como un scFv, en el que el scFv se insertó en diferentes posiciones a lo largo de la estructura de IgG en los diferentes formatos Bis. Las construcciones de BiS se nombraron usando una abreviatura de las dos IgG de las que se derivó el anticuerpo Bis, seguido del formato BiS utilizado, y seguido entonces de la posición de aminoácido de dos restos de cisteína usados para formar un enlace disulfuro estabilizante en el scFv.

A. FY1/39 BiS2 100/44

El siguiente método se usó para generar la construcción FY1/39 BiS2 100/44, que incluye FY1/39 Bis2 100/44 de cadena ligera (SEQ ID NO:107) y FY1/39 Bis2 100/44 de cadena pesada (SEQ ID NO:108). En resumen, un vector que contiene las secuencias VH y v L de FY1 (vector pOE-FY1) se digirió con BssHII/BsiWI para obtener ADN FY1 VL (SEQ ID NO:1). Después, el ADN fY 1 VL (SEQ ID NO:1) se purificó en gel y se clonó en un vector que contenía las secuencias de cadena ligera, scFv y de cadena pesada (vector BiS2), que se han digerido con BssHIl/BsiWI, para formar un vector FY1 LC-BÍS2. Se sintetizó ADN FBC39 scFv-FY1 VH (SEQ ID NO:111) por Geneart y se amplificó por PCR usando los siguientes cebadores, que contienen secuencias de reconocimiento para BsrGI/Sall en los extremos 5' y 3'.

Cebador directo: TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 70) Cebador inverso: GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC (SEQ ID NO: 71)

Se verificó la amplificación del ADN FBC39 scFv-FY1 VH (SEQ ID NO:111) y el ADN se purificó en gel.

Después, el vector FY1-LC-BiS2 se digirió con BsrGI/SalI y la banda de vector se purificó en gel. El vector FY1-LC-BiS2 purificado se infundió con producto de PCR FBC39 scFv-FY1 VH (SEQ ID NO:111) usando el sistema In-Fusion (Clontech®) para generar una construcción FY1/39 BiS2 100/44. Las células estelares competentes se transformaron con la construcción FY1/39 BiS2 100/44 y las colonias se secuenciaron para secuencias de scFv de FY1 VL, VH y FBC39 correctas.

B. FY1/39 BiS4 100/44

Se usó un método similar para generar la construcción FY1/39 BiS4 100/44, que incluye FY1/39 Bis4 100/44 de cadena ligera (SEQ ID NO: 109) y FY1/39 Bis4 100/44 de cadena pesada (SEQ ID NO: 110). En resumen, el vector pOE-FY1-VL se digirió con BssHII/BsiWI para obtener ADN FY1 VL (SEQ ID NO:1) Después, el ADN FY1 VL (SEQ ID NO:1) se purificó en gel y se clonó en un vector que contenía secuencias de cadena ligera, VH, CH1, scFv, CH2 y CH3 (vector BiS4), que se había digerido con BssHII/BsiWI para generar un vector FY1-LC BiS4.

Se amplificó el ADN FBC39 scFv (SEQ ID NO:112) de ADN FBC39 scFv-FY1 VH (SEQ ID NO:111), que se sintetizó por Geneart, usando los siguientes cebadores:

Cebador directo:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 72)

Cebador inverso:

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO: 73) Después, el vector FY1-LC-BiS4 se digirió con BsrGI/SalI y la banda de vector se purificó en gel. Un vector que contenía las secuencias FY1 VL y VH (pOE-FY1) se digirió con BsrGI/SalI para obtener Fy 1 VH (SEQ ID NO:6).

Después, se ligó el vector FY1-LC-Bis4 (digerido con BsrGI/SalI, descrito en la línea 5 y 6) con FY1 VH (SEQ ID NO:6) para obtener el vector BiS4-FY1, que se digirió con BamHI y se purificó por gel. Después, el vector BiS4-FY1 purificado se infundió con el producto PCR FBC39 scFv obtenido anteriormente usando el sistema In-Fusion (Clontech®) para obtener la construcción FY1/39 BiS4 100/44. Las células estelares competentes se transformaron con la construcción FY1/39 BiS4 100/44 y las colonias se secuenciaron para secuencias de scFv de FY1 VL, VH y FBC39 correctas.

C. FY1/39 BiS1 100/44

Se usó un método similar para crear la construcción FY1/39 BiS1 100/44, que incluye FY1/39 Bis1 100/44 de cadena ligera (SEQ ID NO:113) y FY1/39 Bis1 100/44 de cadena pesada (SEQ ID NO:114).

Se amplificó FY1 VL a partir de FY1/FBC39 BiS4 100/44 (SEQ ID NO:109), descrito anteriormente, usando los siguientes cebadores:

Cebador directo BiS1 FY1-VL:

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGATATTCAGATGACCCAGAGCCC (SEQ ID NO: 76)

Cebador inverso BiS1 FY1-VL:

TGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCACCTTAGTGCCC (SEQ ID NO: 77)

Se amplificó FBC39 scFv a partir de ADN FBC39 scFv-FY1 VH (SEQ ID NO:111) que se sintetizó por Geneart, usando los siguientes cebadores:

Cebador directo BiS1 FBC39:

CTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCC

(SEQ ID NO: 74)

Cebador inverso BiS1 FBC39:

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC

(SEQ ID NO: 75)

Las bandas de PCR FBC39 scFv y FY1-VL se purificaron por gel.

FY1/FBC39 BiS4 100/44 se digirió con BsrGI/SalI para obtener la FY1 VH, la banda FY1 VH se purificó por gel. Se ligó FY1 VH (SEQ ID NO:6) con un vector que contenía secuencias scFv, LC y HC (vector BiS1), que también se habían digerido con BsrGI/SalI.

Después, el vector resultante FY1 HC BiS1 se digirió con BssHII/BsiWI, la banda de vector se purificó por gel, y se infundió con productos de PCR FBC39 scFv y FY1 VL usando el sistema In-Fusion (Clontech®) para formar la construcción FY1/39 BiS1 100/44. Las células competentes estelares se transformaron con la construcción FY1/39 BiS1 100/44 y las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias correctas FY1 VL, VH y FBC39 scFv.

D. FY1/39 BiS3 100/44

La construcción FY1/39 BiS3 100/44, que contenía FY1/39 Bis3 100/44 de cadena ligera (SEQ ID NO:115) y FY1/39 Bis3 100/44 de cadena pesada (SEQ ID NO:116) se construyó de una manera similar.

Se usaron los siguientes cebadores para amplificar FBC39 scFv (SEQ ID NO:112) de ADN FBC39 scFv-FY1 VH (SEQ ID NO: 111) que se sintetizó por Geneart.

Cebador directo:

AAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 78) Cebador inverso:

TCAATGAATTCGCGGCCGCTCATGAGGAGACGGTGACCGTGGTC (SEQ ID NO: 79)

La amplificación del ADN FBC scFv se verificó y se purificó por gel.

FY1/FBC39 BiS4 100/44 se digirió con BssHII/SalI para obtener FY1 LC/VH. La banda FY1 LC/VH se purificó por gel y se ligó con un vector que contenía secuencias LC, HC y scFv (vector BiS3), que también se había digerido con BssHII/SalI, para formar el vector FY1 BiS3.

El vector FY1 BiS3 se digirió entonces con BamHI y se purificó por gel. El vector FY1 BiS3 purificado se infundió con productos de PCR FBC39 scFv (SEQ ID NO:112) usando el sistema In-Fusion (Clontech®) para formar la construcción FY1/39 BiS3 100/44. Las células competentes estelares se transformaron con la construcción FY1/39 BiS3 100/44 y las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias correctas FY1 VL, VH y FBC39 scFv.

E. FY1/94 BiS2 100/44

FY1/94 BiS2 100/44, que contiene FY1/94 Bis2 100/44 de cadena ligera (SEQ ID NO: 117) y FY1/94 Bis2 100/44 de cadena pesada (SEQ ID NO: 118) se construyó como se indica a continuación.

El ADN FBD94 scFv (SEQ ID NO: 119) se sintetizó por Eurofin y se amplificó para su inserción en el vector BiS2 usando los siguientes cebadores:

Cebador directo:

TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC (SEQ ID NO: 80)

Cebador inverso:

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC

(SEQ ID NO: 81)

FY1 VH (SEQ ID NO:6) se amplificó por PCR a partir de FY1/39 BiS4 100/44 (SEQ ID NO:110) usando los siguientes cebadores:

Cebador directo:

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTCAGGTCCAGCTGCAGGAGAGC

(SEQ ID NO: 82)

Cebador inverso:

GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC (SEQ ID NO: 83)

La amplificación de los productos de PCR, ADN FBD94 scFv (SEQ ID NO:119) y FY1 VH (SEQ ID NO:6), se verificó y los productos de PCR se purificaron por gel. El vector BiS2-FY1-LC se linealizó por digestión con BsrGI/SalI y se infundió con ADN FBD94 scFv (s Eq ID NO:119) y FY1 VH (SEQ ID NO:6) usando el sistema In-Fusion (Clontech®). La orientación de los productos de PCR dentro del vector se controló usando cebadores que contenían secuencias de superposición con el vector. Las células competentes estelares se transformaron con la construcción FY1/94 BiS2 100/44 y las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias correctas FY1 VL, VH y FBD94 scFv.

F. FY1/94 BiS4 100/44

FY1/94 BiS4 100/44 se construyó como se indica a continuación:

Se sintetizó FBD94 scFv (SEQ ID NO:119) por Eurofin y se amplificó en un vector que contenía secuencias de cadena ligera, VH, CH1, scFv, CH2 y CH3 (vector BiS4) usando los siguientes cebadores:

Cebador directo:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC

(SEQ ID NO: 84)

Cebador inverso:

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO: 85) La amplificación del producto de PCR se verificó y FBD94 se purificó por gel.

El vector BiS4-FY1 (descrito anteriormente) se linealizó usando BamHI y se infundió con FBD94 usando el sistema In-Fusion (Clontech®). Las células estelares competentes se transformaron con la construcción FY1/94 BiS4 100/44 y las colonias se secuenciaron para secuencias de scFv de FY1 VL, VH y FBD94 correctas.

G. FY1/39 BiS443/105

FY1/39 BiS4 43/105, que contiene FY1/39 Bis4 43/105 de cadena ligera (SEQ ID NO:120) y FY1/39 Bis4 43/105 de cadena pesada (SEQ ID NO: 121) se construyó como se indica a continuación:

El ADN FBC39-43/105 scFv se sintetizó por Eurofin y se amplificó para su inserción en el vector BiS4 usando los siguientes cebadores:

Cebador directo:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 86)

Cebador inverso:

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO: 87) La amplificación del producto de PCR se verificó y se purificó por gel.

El vector BiS4-FY1 se linealizó con BamHI y se infundió con ADN FBC39-43/105 scFv (SEQ ID NO:124) obtenido anteriormente usando el sistema In-Fusion (Clontech®). Las células competentes estelares se transformaron con la construcción FY1/39 BiS443/105 y las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias correctas FY1 VL, VH y FBC39-43/105 scFv.

H. GL20/39 BiS4 100/44

GL20/39 BiS4 100/44, que incluye GL20/39 BiS4 100/44 de cadena pesada (SEQ ID NO: 66) y GL20/39 BiS4 100/44 de cadena ligera (SEQ ID NO:67) se construyó de una manera similar.

Un vector que contenía FY-GL20 LC y HC (pOE-FY1-GL20) se digirió con BssHII/SalI para obtener GL20 LC(VL-CL) y VH (SEQ iD NO:123), que se purificó por gel. El vector FY1/39 BiS4 100/44 se digirió con BssHII/SalI y se ligó con GL20 LC/VH (SEQ ID NO:123). Las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias GL20 VL, VH y FBC39 scFv correctas.

I. GL20/39 BiS443/105

GL20/39 BiS443/105, que incluye GL20/39 BiS4 43/105 de cadena pesada (SEQ ID NO:68) y GL20/39 BiS443/105 de cadena ligera (SEQ ID NO:69) se construyó de una manera similar. Se digirió pOE-FY1-GL20 con BssHII/SalI para obtener GL20 LC/VH (SEQ ID NO: 123), que se purificó por gel. Se digirió FY1/39 BiS443/105 de cadena ligera (SEQ ID NO:120) con BssHII/SalI y se ligó con GL20 LC/VH (SEQ ID NO:123). Las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias GL20 VL, VH y FBC39-43/105 scFv correctas.

J. GL20/39FTL BiS4 100/44

Se construyó GL20/39FTL BiS4 100/44 de una manera similar.

Se sintetizó ADN FBC39FTL scFv (SEQ ID NO:124) por Eurofin y se amplificó para su inserción en el vector BiS4 usando los siguientes cebadores:

Cebador directo:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 88)

Cebador inverso:

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO: 89)

La amplificación del producto PCR se verificó y se purificó ADN FBC39FTL scFv (SEQ ID NO:124). El vector GL20/39 BiS4 43/105 se linealizó con BamHI y se infundió con ADN FBC39FTL scFv (SEQ ID NO:124) usando el sistema In-Fusion (Clontech®). Las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias GL20 VL, VH y FBC39FTL scFv correctas.

K. GL20/39FTL BiS443/105

GL20/39FTL BiS443/105, que incluye GL20/39FTL BiS443/105 de cadena ligera (SEQ ID NO:125) y GL20/39FTL BiS4 43/105 de cadena pesada (SEQ ID NO: 126) se construyó de una manera similar.

Se sintetizó ADN FBC39FTL43/105 scFv (SEQ ID NO:127) por Eurofin y se amplificó para su inserción en el vector BiS4 usando los siguientes cebadores:

Cebador directo:

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGTCTC (SEQ ID NO: 90)

Cebador inverso:

GTGAGTTTTGTCGGATCCCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NO: 91)

El producto de PCR amplificado se purificó y se infundió con el vector GL20/39 BiS443/105 linealizó (digerido con BamHI) y las colonias se secuenciaron para determinar las secuencias GL20 VL, VH y FBC39FTL-43/105 scFv correctas.

L. BiS5 GL20-FBC39

FY1GL20VL-Ckappa

DIQMTQSPSSLSASVGDRVmCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLUYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFA TYYCQQSRTFGQGTKVE/KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:128)

FY1GL20VH - Fc (CH3-) - Enlazador - FBC39 scFv - Enlazador - Fc (-CH3)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCA/SGDSVSSYNAVWNW/RQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSR/T/NPDTSK NQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSC AASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCAT DGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:129)

M. BiS5 GL20-FBC39-43-105

FY1 GL20VL-Ckappa

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:130)

FY1GL20VH - Fc (CH3-) - Enlazador - FBC39 (43-105) scFv - Enlazador - Fc (-CH3)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCA/SGDSVSSYNAVWNW/RQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSR/T/NPDTSK NQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSC AASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCAT DGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:131)

Ejemplo 2: Expresión de la construcción BiS

Los anticuerpos recombinantes se produjeron mediante transfección transitoria de líneas celulares de mamífero derivadas de células 293F o CHO. Los sobrenadantes de las células transfectadas se recogieron después de 7-10 días de cultivo. La purificación se realizó usando una columna de proteína A (HiTrap Proteína A HP de GE Healthcare). El contenido de monómero se determinó por análisis de HPLC-SEC y los agregados se eliminaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Ejemplo 3: Optimización de la construcción BiS4

La construcción de FY1/39 BiS4 se usó como una cadena principal para optimizar el scFv para crear una construcción de alta expresión de monómero que todavía estaba activa. Para estos estudios, la orientación del scFv se cambió de VL/VH a VH/VL, la longitud del enlazador scFv se cambió de 20 aminoácidos a 10, 15 o 25 aminoácidos, se eliminaron o se cambiaron los enlaces disulfuro estabilizadores en la ubicación de 100/44 a cuatro ubicaciones diferentes, y las regiones de entramado de FBC39 se germinaron completamente. La Tabla 7 proporciona información específica para las construcciones.

Tabla 7.

La expresión y la actividad de estas construcciones optimizadas de BiS4 no se vieron muy afectadas por la longitud del enlazador. Sin embargo, la posición del enlace disulfuro fue importante tanto para la expresión como para la actividad. El mejor perfil de expresión se observó en construcciones que no contienen enlaces disulfuro, la posición del enlace disulfuro cambió a 43/105, 46/101 o 49/100, o la construcción FBC39 de línea germinada con enlace disulfuro 100/44. Sin embargo, aunque se mejoró la expresión, muchos de estos clones perdieron actividad antiviral medida por la unión a HA y la neutralización como se describe en los Ejemplos 4 y 5, a continuación. Una construcción (FY1/39 BiS443/105) mostró un mejor perfil de expresión que FY1/39 BiS4 100/44 y mantuvo la actividad antiviral funcional. Dado que estas dos construcciones (FY1/FBC39 BiS4 100/44 y BiS 43/105) mostraron buena expresión y buena actividad funcional, se construyeron clones BiS optimizados (GL20/FBC39 Bis) con orientaciones BiS4 100/44 y BiS 43/105, respectivamente.

Ejemplo 4. Las construcciones de gripe A B de BiS se unen a las proteínas HA de los virus de influenza A y B

Las construcciones BiS de gripe A B se ensayaron para determinar si conservaban la especificidad de las construcciones parentales de IgG usando un ensayo de unión ELISA de reactividad cruzada de HA. Se recubrieron las placas ELISA Maxisorb de 384 pocillos (Nunc) durante una noche a 4 °C con 1 ug/ml de HA recombinante derivado de cepas de influenza A, A/California/07/2009 H1N1 (A/CA/09) y A/Perth/2009 H3N2 (A/PTH/09), y cepas de influenza B B/Florida/4/2006 del linaje Yamagata (B/FLA/06) y B/Brisbane/60/2008 del linaje Victoria (B/BNe /08) en PBS. La placa se lavó con PBS que contenía Tween-20 al 0.1% v/v para eliminar la proteína sin recubrir y se añadió una solución de bloqueo que contenía caseína al 1 % (p/v) (Thermo Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente. La solución de bloqueo se descartó y se añadió una dilución en serie 3 veces de cada una de las IgG anti-HA y anticuerpos BiS en PBS y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces y se detectaron los anticuerpos IgG y BiS unidos usando un anticuerpo IgG (H+L) de cabra anti-humana conjugado con peroxidasa (KPL). La actividad de unión se calculó midiendo el cambio de color a 450 nm después de la incubación con un sustrato de componente (KPL) de tetrametilbenzidina (TMB) seguido de la adición de ácido sulfúrico 2 N para detener la reacción.

La Tabla 8 muestra los valores de CE50 calculados a partir de las curvas de unión. Como se esperaba, los mAb de IgG de gripe A (FY1 y GL20) se unieron a las proteínas HA de gripe A y los tres mAb de IgG de gripe B (FBD94, FBC39 y FBC39FTL) se unieron a las proteínas HA de influenza B. Todas las construcciones de BiS se unieron a las cuatro proteínas HA de influenza que pertenecían al tipo A y tipo B. Las construcciones de BiS4 para FBC39 y FBD94 mostraron la mejor unión global. Cuando las IgG optimizadas se colocaron en las construcciones de BiS4 con enlaces disulfuro a 100/44 o 43/105, GL20/39 BiS4 43/105 mostró la mejor unión global con valores de CE50 de <1 nM para A/CA/09, A/PTH/09, y B/FL/06, y menos de 10 nM para el B/BNE/08 más difícil de unir.

Tabla 8.

Para caracterizar adicionalmente la cinética de la interacción de unión, las mediciones de afinidad se realizaron usando un Analizador Cinético ForteBio Octet QK 384 (Menlo Park, CA) utilizando placas de 384 pocillos inclinados. Se diluyeron todos los reactivos en tampón Octet Kinetics (ForteBio). HA marcado con His diferentes virus de influenza: subtipo de influenza A H1 (A/California/7/04 (H1N1)), subtipo de influenza A H3 (A/Perth/16/09 (H3N2)), linaje de influenza B Victoria (B/Brisbane/60/2008 (Victoria)), y linaje de influenza B Yamagata (B/Florida/4/2006 (Yamagata)) se inmovilizaron sobre sensores Ni-NTA anti-His a 8 |jg/ml. Entonces se monitorizaron la asociación/disociación de AcM anti-HA en diluciones de 2 veces a partir de 100 nM, más un control con AcM cero. Se corrigieron los datos sin procesar de asociación y disociación por cualquier desviación en los controles de AcM cero, y luego se exportaron a GraphPad Prism (San Diego, CA) para ajustes de la curva de afinidad. Los datos se ajustaron usando una ecuación de asociación/disociación global con un límite impuesto de > 5 x 10-6 s-1. Como se muestra en la Tabla 9, ambas construcciones de BiS mostraron una unión de alta afinidad a las cuatro proteínas HA que pertenecen a las cepas de influenza A y B.

Tabla 9.

Ejemplo 5. Actividad de neutralización in vitro de construcciones de gripo A B de BiS

Un ensayo de microneutralización modificado se basó en un ensayo de inhibición vírica acelerado descrito previamente usando actividad de neuraminidasa (NA) como una lectura (Hassantoufighi, A. et al. 2010, Vaccine 28:790). En resumen, se realizaron ensayos en células MDCK que se cultivaron en medio MEM (Invitrogen) complementado con antibióticos, glutamina (medio MEM completo) y suero bovino fetal al 10% (v/v). Se añadieron 60 TCID50 (dosis infecciosas de cultivo tisular al 50%) de virus a diluciones triples de anticuerpo en una placa de 384 pocillos en medio MEM que contenía 0.75 ug/ml de tripsina TPCK (Worthington) en pocillos duplicados. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron a la placa 2 x 104 células/pocillo. Después de la incubación a 33 oC en una incubadora de CO2 al 5% durante aproximadamente 40 h, la actividad de NA se midió añadiendo un sustrato marcado por fluorescencia, ácido metilumbeliferil-N-acetil neuramínico (MU-NANA) (Sigma) a cada pocillo y se incubó a 37 oC durante 1 h. Se cuantificó la replicación de virus representada por la actividad de NA leyendo la fluorescencia usando un fluorómetro Envision (PerkinElmer) usando los siguientes parámetros: excitación 355 nm, emisión 460 nm; 10 destellos por pocillo. El título de neutralización (50% de concentración inhibidora [CI50]) se expresó como la concentración de anticuerpo final que redujo la señal de fluorescencia en un 50 % en comparación con los pocillos de control de las células.

Las cepas del virus de influenza A y B utilizadas en las Tablas 10 y 11 son como se enumeran a continuación.

En la Tabla 10: A/WSN/33 (A/Wilson Smith N/33 (H1N1)); A/BJ/95 (A/Beijing/262/95 (H1N1)); A/SI/06 (A/Solomon Island/3/2006 (H1N1)); A/CA/09 (A/California/07/2009 (H1N1)); A/HK/68 (A/Hong Kong/8/68 (H3N2)); A/VIC/75 (A/Victoria/3/75 (H3N2)); A/SD/93 (A/Shangdong/9/93 (H3N3)); A/Pan/99 (cold-adapted (ca) A/Panama//2007/99 (H3N2)); B/BJ/97 (ca B/ Beijing/243/97 (Vic)); B/HK/01 (B/Hong Kong/330/2001 (Vic)); B/MY/04 (B/Malaysia/2506/2004 (Vic)); B/OH/05 (B/Ohio/1/2005 (Vic)); B/YI/98 (B/Yamanashi/166/98 (Yam)); B/SIC/99 (B/Sichuan/379/99 (Yam)); y B/FLA/06 (B/Florida/4/2006 (Yam)).

En la Tabla 11: A/WSN/33 H1 (A/Wilson Smith N/33 (H1N1)); A/PR/34 H1 (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)); A/FM/47 H1 (A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)); A/BJ/95 H1 (ca A/Beijing/262/95 (H1N1)); A/SZ/95 H1 (A/Shenzhen/227/95 (H1N1)); A/NC/99 H1 (ca A/New Caledonia/20/99 (H1N1)); A/SI/06 H1 (A/Solomon Island/3/2006 (H1N1)); A/SD/07 H1 (ca A/South Dakota/6/2007 (H1N1)); A/CA/09 H1 (ca A/California/7/2009 (H1N1)); A/BS/10 H1 (A/Brisbane/10/2010 (H1N1)); A/HK/10 H1 (A/Hong Kong/2212/2010 (H1N1)); A/NH/10 H1 (A/New Hampshire/04/2010 (H1N1)); A/WS/12 H1 (A/Washington/24/2012 (H1N1)); A/NY/12 H1 (A/New York/36/2012 (H1N1)); A/BO/13 H1 (A/Bolivia/559/2013 (H1N1)); A/Jap/57 H2 (ca A/Japan/57 (H2N2)); A/VN/04 H5 (ca A/Vietnam/1203/04 (H5N1)); A/Alb/85 H6 (ca A/mallard/Alberta/89/85 (H6N2)); A/HK/97 H9 (ca A/chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2)); A/HK/68 H3 (A/Hong Kong/8/68 (H3N2)); A/Vic/75 H3 (A/Victoria/3/75 (H3N2)); A/SD/93 H3 (A/Shan dong/9/93 (H3N2)); A/WH/95 H3 (ca A/Wuhan/359/95 (H3N2)); A/SY/97 H3 (ca A/Sydney/5/97 (H3N2)); APA/99 H3 (ca A/Panama/2007/99 (H3N2)); A/CA/04 H3 (A/California/7/2004 (H3N2)); A/WS/05 H3 (A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)); A/Perth/09 H3 (ca A/Perth/16/2009 (H3N2)), A/VC/11 H3 (A/Victoria/361/2011 (H3N2)); A/BR/11 H3 (A/Berlin/93/2011 (H3N2)); A/NY/12 H3 A/New York/39/2012 (H3N2)); A/X/12 H3 (A/Texas/50/2012 (H3N2)); A/AS/13 H3 (A/AmericanSomoa/4786/2013 (H3N2)); A/SW/13 H3 (A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2)); A/PU/14 H3 (A/Palau/6759/2014 (H3N2)); A/NC/14 H3 (A/New Caledonia/71/2014 (H3N2)); A/IN/11 H3v (A/Indiana/10/2011 (H3N2v)); A/MN/10 H3v (A/Minnesota/11/2010 (H3N2v)); A/BC/04 H7 (ca A/Brit. Columbia/CN-6/04 (H7N3-LP); B/Lee/40 (B/Lee/40); B/AA/66 (ca B/Ann Arbor/1/66); B/HK/72 (B/Hong Kong/5/72); B/BJ/97 (ca B/Beijing/243/97 (victoria)), B/HK/01 (B/Hong Kong/330/2001 (victoria)); B/MY/04 (B/Malaysia/2506/2004 (victoria)); B/OH/05 (B/Ohio/1/2005 (victoria)); B/BNE/08 (ca B/Brisbane/60/2008 (victoria)); B/NV/11 (B/Nevada/3/2011 (victoria)); B/NJ/12 (B/New Jersey/01/2012 (victoria)); B/TX/13 (B/Texas/2/2013 (victoria)); B/Wis/13 (B/Wisconsin/5/2013 (victoria)); B/Yam/88 (B/Yamagata/16/88 (yamagata)); B/a A/94 (ca B/Ann Arbor/2/94 (yamagata)); B/geo/98 (ca B/Georgia/02/98 (yamagata)); B/YSI/98 (ca B/Yamanashi/166/98 (yamagata)); B/Joh/99 (ca B/Johannesburg/5/99 (yamagata)); B/Sic/99 (B/Sichuan/379/99 (yamagata)); B/Vic/00 (ca B/Victoria/504/2000 (yamagata)); B/Shg/02 (B/Shanghai/361/02 (yamagata)); y B/FL/06 (B/Florida/4/2006 (yamagata)); B/WS/10 (B/Wisconsin/1/2010 (yamagata)); B/Mass/12 (B/Massachusetts/2/2012 (yamagata)); B/AZ/13 (B/Arizona/8/2013 (yamagata)); B/PH/13 (B/Phuket/3073/2013 (yamagata)).

Tabla 10.

La Tabla 10 muestra el valor de CI50 promedio de dos experimentos independientes. Las IgG parentales FY1 y GL20 neutralizaron todas las cepas de influenza A y no mostraron reactividad cruzada con las cepas de influenza B ensayadas. Como era de esperar, las IgG LTL FBD94, FBC39 y FBC39 neutralizaron todas las cepas de influenza B sin actividad contra las cepas de influenza A ensayadas. Sin embargo, de forma similar a los experimentos de unión, las construcciones de BiS4 mostraron el mejor perfil de neutralización total con actividad neutralizante contra todas las cepas de influenza A y todas las cepas de influenza B ensayadas. La construcción de BiS4 generada con los clones de anticuerpo optimizados, GL20/39 BiS4 100/44 y GL20/39 BiS4 43/105, mostró una neutralización global mejorada contra todas las cepas ensayadas sobre el BiS4 parental. GL20/39 BiS443/105 dio como resultado valores de CI50 <50 nM para los 15 virus de la gripe A y B ensayados.

Para confirmar que la amplitud de la cobertura se mantuvo para las construcciones de BiS4 optimizados, se ensayó la neutralización de un panel más grande de 39 virus de influenza A y 25 de influenza B. La Tabla 11 muestra los valores de CI50 promedio de dos experimentos independientes. GL20/39 Bís4 100/44 y GL20/39 BiS443/105 demostraron actividad neutralizante contra todos los virus ensayados. La CI50 media (nM) para los virus de influenza A fue de 8.2, 8.0 y 7.5 para GL20 IgG, GL20/39 BiS4100/44 y GL20/39 BiS4 43/105, respectivamente, lo que demuestra que las construcciones de BiS mantuvieron la actividad de neutralización global de la IgG parental. La CI50 media para los virus de influenza B fue de 0.4, 13.9 y 9.0 para la IgG FBC39, GL20/39 BiS4100/44 y GL20/39 BiS443/105, respectivamente. Las construcciones de BiS mostraron una actividad >10 veces reducida frente a los virus B en comparación con el mAb de IgG parental, sin embargo, la actividad de neutralización global se mantuvo a niveles similares a los de contra los virus de influenza A. Aunque ambas construcciones de BiS, GL20/39 BiS4100/44 y GL20/39 BiS443/105, mostraron perfiles similares, GL20/39 BiS4 43/105 mostró un mejor perfil de neutralización global con valores de CI50 <50 nM para todos los virus. Como se describió previamente, como mAb GL20 de influenza A, el mAb FBC39 fue capaz de neutralizar la cepa H9/HK/97 de influenza además de las cepas de infleunza B. Cuando se construyó en formato BiS4, los anticuerpos BiS4 mostraron una actividad de neutralización mejorada contra A/HK/97 H9 en comparación con cualquiera de los mAb parentales, con valores de CI50 (nM) de 1.6 y 1.1 para GL20/39 BiS4 100/44 y GL/20/39 BiS4 43/105 y 3.0 y 13.3 para GL20 y FBC39, respectivamente.

Tabla 11.

Ejemplo 6. Actividad de inhibición de hemaglutinación

La porción del mAb de influenza B de las construcciones de BiS se une a la cabeza globular de la proteína HA e inhibe la entrada del virus a la célula huésped. Para determinar si este mismo mecanismo de acción es importante para la funcionalidad de la influenza B de la construcción de BiS, se realizaron ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) usando un grupo diverso de cepas del virus de la influenza B. El ensayo de HAI detecta anticuerpos que bloquean el acoplamiento de receptor viral del ácido siálico expresado en la superficie celular midiendo la inhibición de la aglutinación de eritrocitos mediada por virus. Los virus de la influenza B (abreviaturas como se describe en el Ejemplo 5) se ajustaron a 4 unidades de HA determinadas por incubación con glóbulos rojos de pavo al 0.05% (Lampire Biological Laboratories) en ausencia de anticuerpo. En una placa con fondo en U de 96 pocillos, GL20/39 BiS4 100/44, GL20/39 BiS4 43/105 y FBC39 IgG se diluyeron en serie en aumentos de dos veces y se añadió virus diluido a los pocillos. Después de 30 a 60 min de incubación, se añadieron 50 ul de glóbulos rojos de pavo al 0.05%. Las placas se incubaron de 30 a 60 minutos adicionales y se observaron para determinar la aglutinación. Se determinó que el título de HAI era la concentración mínima eficaz (nM) de anticuerpo que inhibía por completo la aglutinación. La Tabla 12 muestra que ambas construcciones BiS4 de GL20/39 tenían actividad HAI contra todas las cepas de influenza B analizadas, proporcionando evidencia de que las construcciones de BiS se unen a la cabeza globular de HA de influenza B. La potencia global de la actividad HAI varió entre las dos construcciones, dando como resultado GL20/39 BiS443/105 una inhibición más potente que GL20/39 BiS4 100/44, con actividad similar a la del mAb FBC39 parental en muchos de los virus ensayados.

Tabla 12.

Ejemplo 7. Función in vitro de Fc-efector de construcciones de BiS de gripe A B

Los anticuerpos monoclonales HA de influenza tienen el potencial de eliminar las células infectadas por virus a través de la función Fc-efector, tal como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y la muerte dependiente del complemento (CDC). Para confirmar que las construcciones de BiS mostraron niveles similares de estas funciones efectoras a sus mAb IgG parentales, se ensayaron en tres ensayos in vitro diferentes para determinar la actividad de ADCC, ADCP y CDC. El ensayo ADCC mide la capacidad de las células NK humanas primarias para matar las células infectadas por la influenza cuando se activan por un anticuerpo. Se infectaron células a 549 con A/California/07/2009 H1N1 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10, A/Hong Kong/8/68 H3N2 a una MOI de 10, B/Malaysia/2506/2004 linaje victoria a una MOI de 20 y B/Sichuan/379/99 linaje yamagata a una MOI de 10 y se incubaron a 37 °C durante 15 horas. Las células infectadas se incubaron con una serie de dilución de GL20, FBC39 o GL20/39 BiS443/105, y luego se incubaron con células NK purificadas seleccionadas positivamente de células mononucleadas de sangre periférica humana (CMSP) (Miltenyi), a una relación efector con respecto a diana de 6:1. Las células infectadas, el anticuerpo y las células NK se incubaron durante 4 horas, y la destrucción celular se midió mediante liberación de LDH (Roche). La Figura 2 muestra que GL20/39 BiS443/105 exhibió una muerte dependiente de la dosis reducida de aproximadamente 3 veces de células A549 infectadas con influenza A en comparación con GL20 con valores de CI50 (nM) de 0.024 y 0.086 para el A/California/07/2009 H1N1 y 0.018 y 0.052 para A/Hong Kong/8/68 H3N2 para GL20 y GL20/39 BiS443/105 respectivamente (A y B). GL20/39 BiS443/105 mostró la misma respuesta dependiente de la dosis que la IgG FBC39 con un valor de CI50 calculado (nM) de 1.45 y 1.50 para la B/Malaysia/2506/2004 victoria y 0.85 y 0.42 para la B/Sichuan/379/99 yamagata para FBC39 y GL20/39 BiS4 43/105, respectivamente (C y D).

Para medir la capacidad de los anticuerpos BiS anti-HA para mediar la fagocitosis en un ensayo de ADCP, se usó la estabilidad de las células MDCK transfectadas con las proteínas HA derivadas de A/South Dakota/6/2007 H1N1 y A/Hong Kong/8/68 H3N2, respectivamente como células diana. Se aislaron monocitos humanos a partir de PBMC y se cultivaron durante 7 días en presencia de M-CSF para que se diferenciaran para dar macrófagos. Se marcaron de manera fluorescente los macrófagos humanos y las células diana que expresaban HA de color violeta y verde, respectivamente (CellTrace Violet o CSFE, Invitrogen). Las células efectoras y diana marcadas se incubaron a una relación de 6:1 en presencia de una serie de dilución de anticuerpos IgG o BiS durante 2 horas, y después se analizaron mediante citometría de flujo. Se midió la fagocitosis en porcentaje como el porcentaje de macrófagos teñidos de violeta que también eran positivos para las células diana verdes (doble positivo). La Figura 3 muestra que el GL20/39 BiS4 43/105 tenía una actividad de ADCP similar a la de IgG GL20 contra las células que expresan H1 y las células que expresan H3, como se esperaba, la IgG FBC39 no mostró fagocitosis de las células que expresan influenza A.

Para medir la muerte celular dependiente del complemento mediada por anticuerpos anti-HA BiS, se usaron células MDCK infectadas con influenza como dianas. En este ensayo de CDC, las células MDCK se infectaron con A/Puerto Rico/8/34 a una MOI de 2, se incubaron con una serie de dilución de IgG GL20, GL20/39 BiS443/105, o mAb de control irrelevante, en presencia de complemento derivado de un conejo (Cedarlane) en una relación efector-diana de 1:18. Se midió la destrucción celular mediante liberación de LDH (Roche). La figura 3C muestra que GL20/39 BiS 43/105 exhibió un nivel similar de capacidades de destrucción celular que IgG GL20.

Ejemplo 8. Protección profiláctica in vivo de construcciones de BiS de gripe A B en modelos murinos letales de infección por influenza A e influenza B

Para evaluar la eficacia profiláctica, a ratones BALB/c de seis u ocho semanas de edad (Harlan Laboratories) se les administró una inyección intraperitoneal única (IP) de IgG GL20 a 3, 0.3 o 0.03 mg/kg o el equivalente molar equivalente de GL20/39 BiS4 43/105 en 100 |jl de volumen. Cuatro horas después de la dosificación, los ratones se inocularon por vía intranasal con 2.5 veces la dosis letal de ratón del cincuenta por ciento (2.5 MLD50) de A/Wilson Smith N/33 H1N1 (A/WSN/33) o 7 MLD50 del 7:1 de A/Puerto Rico/8/34:A/Hong Kong/8/68 HA reasignado (rA/HK/68) en un volumen de 50 j l para el estudio en el modelo de infección por influenza A; o 7 MLD50 del linaje yamagata B/Florida/4/2006 (B/FLA/06) o 10 MLD50 del linaje victoria B/Malasia//2506/2004 (B/MAL/04) en un volumen de 50 j l en el estudio usando modelo de infección por influenza B. Se pesaron grupos de 8-10 ratones el día de la estimulación del virus y se monitorizaron diariamente para determinar la pérdida de peso y la supervivencia durante 14 días (se sacrificó a los ratones con una pérdida de peso corporal >25%). Además, se extirparon los pulmones de 4 animales adicionales el Día 5 después de la infección para la titulación viral. Los pulmones se homogeneizaron usando Teen Lysing Matrix A en una solución al 10% p/v y un homogeneizador Fastprep24. La cuantificación de TCID50 se realizó en el homogeneizado de pulmón diluido en serie en una placa de cultivo tisular de pared negra de 384 pocillos por cuadruplicado. Después, se añadieron células MDCK tripsinizadas al homogeneizado a 2.0 x 104 células/pocillo y las placas se incubaron a 33 °C con CO2 al 5% durante aproximadamente 40 horas. La replicación viral se midió mediante la adición de 40 jM de MU-NANA como se ha descrito anteriormente. Los títulos de virus infecciosos se calcularon usando el método de Karber (Karber et al., 1931 Arch. Exp. Pathol. Pharmak. 162: 480-3) y las muestras positivas se definieron como aquellas que mostraban más de 10 desviaciones estándar por encima del valor medio de las células en solitario.

Actividad profiláctica contra infección por influenza A

Tanto GL20/39 BiS443/105 como IgG GL20 parental proporcionaron protección a los ratones de la estimulación letal con influenza A de una manera dependiente de la dosis similar. Al igual que GL20, la inyección IP de 3 mg/kg equivalente de la molécula BiS protegió al 100% de los animales estimulados con el virus A/WSN/33 H1 y la inyección IP de 3 y 0.3 mg/kg evitó la letalidad equivalente en el 100% de los animales estimulados con el virus rA/HK/68 H3 (figura 4 A y C). Cuando se evaluó el título viral en los pulmones recogidos en el Día 5 después de la infección, ambas moléculas de anticuerpo redujeron los títulos de pulmón viral con una reducción más pronunciada a la dosis equivalente de 3 mg/kg. Comparando el BiS con la IgG, se observan reducciones similares del título viral en los dos grupos con los animales tratados con GL20 que tienen títulos virales ligeramente inferiores en el modelo H1, mientras que el BiS mostró títulos virales más bajos en el modelo H3 (figura 4 B y D). En general, estos datos muestran que GL20/39 BiS443/105 puede prevenir la mortalidad y reducir la replicación viral pulmonar en una medida similar a la IgG GL20.

Actividad profiláctica contra infección por influenza B

Tanto GL20/39 BiS4 43/105 como la IgG parental FBC39 confieren protección contra la infección letal de la influenza B de una manera dependiente de la dosis. La inyección IP de 3 mg/kg equivalente de la molécula de BiS protegió al 100% de los animales estimulados con el linaje yamagata B/FLA/06 y los virus del linaje victoria B/MAL/04 (figura 5 A y C, líneas continuas). Aunque la dosis de BiS y FBC39 a 3 mg/kg proporcionó una protección completa con una tasa de supervivencia del 100%, FBC39 mostró una mejor protección que FBC39 en el nivel de dosis de 0.3 mg/kg en ambos modelos de infección por influenza B. Cuando se evaluó el título viral en los pulmones el Día 5 después de la infección, ambas moléculas de anticuerpo redujeron los títulos de pulmón viral, que fue más evidente a la dosis equivalente de 3 mg/kg. Comparando BiS con IgG, se observan reducciones de títulos virales similares en el modelo de infección B/FLA/06 yamagata, sin embargo, BiS fue menos eficaz que FBC39 en la reducción del título pulmonar viral en ratones infectados con la cepa B/Mal/04 victoria (figura 5 B y D). Tomados en conjunto, estos datos en la figura 4 y 5 muestran que GL20/39 BiS4 43/105 puede prevenir eficazmente la mortalidad y reducir la replicación viral pulmonar en ambos modelos de infección letal por influenza A y B.

Ejemplo 9. Protección terapéutica in vivo de construcciones de BiS de gripe A B en comparación con oseltamivir en un modelo murino letal de infección por influenza A e influenza B

Para comparar directamente la eficacia terapéutica de la molécula de BiS con el inhibidor de la molécula pequeña de NA, oseltamivir, se usó el modelo murino de influenza de la influenza A y B.

Comparación terapéutica de GL20/39 BiS443/105 y oseltamivir (figura 5)

Se inocularon ratones con 2.5 MLD50 del virus A/WSN/33 H1 o 7 MLD50 del virus del linaje yamagata B/FLA/06, y luego se trataron con una sola dosis IV a 10 mg/kg equivalente (14.1 mg/kg) de GL20/39 BiS443/105 o 25 mg/kg dos veces al día, por vía oral durante 5 días de oseltamivir iniciado el día 1, el día 2, el día 3 o el día 4 después de la infección. Se controlaron 10 animales por grupo para la pérdida de peso corporal y la supervivencia, y se sacrificaron 4 animales para medir el título de virus de pulmón como se ha descrito anteriormente. Además, como una lectura no invasiva de la función pulmonar, se midió el nivel de saturación de oxígeno en la sangre usando oximetría de pulso (buey de ratón) el día 6 después de la infección para 4 animales por grupo.

El tratamiento con la molécula de BiS protegió al 100% de los ratones de la infección letal con A/WSN/33 o B/FLA/06 cuando se administró el día 2 después de la infección (figura 6 A y B). Incluso cuando el tratamiento se retrasó hasta el día 3 después de la infección, la molécula de BiS todavía prevenía la mortalidad en el 50% de los animales infectados con el virus de influenza A o B. En el modelo de infección por influenza A, oseltamivir no mostró protección cuando se administró el tratamiento el Día 1 o posterior, sin embargo, proporcionó una buena protección con tasas de supervivencia del 90-100% cuando se inició la administración el Día 1 o Día 2 después de la infección por influenza B. Aunque oseltamivir protegió bien en el modelo de influenza B, BiS mostró una tendencia a una mejor protección con mayores tasas de supervivencia que oseltamivir cuando se administró el Día 2, el Día 3 y el Día 4 después de la infección (figura 6 A y B).

La figura 6 (C y D) mostró el título viral pulmonar en los ratones tratados con BiS u oseltamivir 5 días después de la infección. El tratamiento con la molécula de BiS en diferentes momentos después de la infección con el virus A/WSN/33 H1N1 inhibió la replicación viral pulmonar de una manera dependiente del tiempo de más de 3 log de reducción viral cuando el tratamiento se inició el día 1 después de la infección, a 1 log de reducción viral del título cuando se inició el tratamiento el Día 4 después de la infección (figura 6 C). En comparación con oseltamivir, la molécula de BiS mostró una reducción mayor de 1-2 logs cuando se inició el tratamiento el Día 2, el Día 3 o el Día 4 después de la infección.

Para evaluar el efecto de diferentes tratamientos sobre la función pulmonar, el nivel de saturación de oxígeno se midió mediante oximetría de pulso (figura 6 E y F). Los animales infectados tratados solamente con mAb de control irrelevante mostraron una reducción en el porcentaje de saturación de oxígeno al 80% para A/WSN/33 y el 78% el Día 6 después de la infección en comparación con el 98% para los animales sin tratar. El tratamiento con GL20/39 BiS4 43/105 evitó que los niveles de saturación de oxígeno cayeran por debajo del 90% incluso cuando el tratamiento se retrasó hasta el Día 4 después de la infección, mientras que los animales tratados con oseltamivir mostraron una saturación de oxígeno reducida a niveles similares a los tratados con un mAb de control irrelevante (figura 6 E). Cuando los ratones se infectaron con B/FLA/06 y luego se trataron con BiS u oseltamivir, ambos agentes protegieron la función pulmonar con animales tratados con BiS que tenían un nivel de saturación de oxígeno ligeramente mayor cuando se inició el tratamiento el Día 1 después de la infección (figura 6 F). Cuando se inició el tratamiento el Día 2 después de la infección, los animales tratados con BiS mostraron una función pulmonar significativamente mejorada en 3 de 4 animales tratados que los animales tratados con oseltamivir (promedio de 92% frente a 86%). En general, estos dos estudios muestran que GL20/39 BiS443/105 puede prevenir la mortalidad, reducir los títulos virales y proteger la función pulmonar en animales infectados con dosis letales de influenza A y B cuando el tratamiento se inicia hasta el Día 3 después de la infección.

Secuencias

SEQ ID NO: 1 (secuencia de ácido nucleico VL de FY1)

G ACAT CCAG AT G ACCCAGT CGCCAT CCT CCCT GT CTGCAT CT GT AGG AGACAG AG T AACCAT CACTTGCCGG ACAAGT CAG AGCCTT AGT AGCT ATTT ACATTGGT AT CAG CAG AAACCAGGGAAAGCCCCT AAGCT CCT G AT CT ATGCTGCAT CCAGTTTGCAAAG TGGGGT CCCAT CAAGGTT CAGTGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGT AGT CTGCAACCT G AAG ATTTTGCAACTT ACT ACT GT CAACAG AGT CGG AC GTT CGGCCAAGGG ACCAAGGTGG AAAT CAAA SEQ ID NO: 2 (secuencia de aminoácidos VL de FY1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 3 LCDR1 RTSQSLSSYLH

SEQ ID NO: 4 LCDR2 AASSLQS

SEQ ID NO: 5 LCDR3 QQSRT

SEQ ID NO: 6(secuencia de ácido nucleico VH de FY1)

CAGGT ACAGCTGCAGG AGT CGGGT CCAGG ACTGGT G AAGCCCT CGCAG ACCCT C T CACT CACCT GTGCCAT CT CCGGGG ACAGT GT CT CT AGCAACAATGCT GTTTGG AA CTGG AT CAGGCAGT CCCCAT CG AG AGGCCTT G AGT GGCTGGGAAGG ACAT ACT AC AGGT CCAAGTGGT AT AAT G ATT ATGCAG AAT CT GT G AAAAGT CG AAT AACCGT CAA T CCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCACCTGAAGTCTGTGACTCCCG AG G ACACGGCT GT GTTTT ACT GT GT ACG AT CTGGCCACATT ACGGTTTTTGG AGT G AA T GTT G ACGCTTTT G AT AT GT GGGGCCAAGGG ACAATGGT CACCGT CT CTT CAG SEQ ID NO: 7 (secuencia de aminoácidos VH de FY1) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSÑNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRS KWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 8 HCDR1 SNNAVWN

SEQ ID NO: 9 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS

SEQ ID NO: 10 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM

SEQ ID NO: 11 (secuencia de ácido nucleico VL de GL20)

G AT ATT CAG AT GACCCAG AGCCCTT CCAGCCT GT CCGCTT CAGTGGGGG AT CGAG T G ACCATT ACCTGCCG AACCAGCCAG AGCCT G AGCT CCT ACACGCACTGGT AT CA GCAG AAGCCCGGCAAAGCCCCT AAGCTGCT G AT CT ACGCCGCTT CT AGT CGGGG GT CCGG AGTGCCAAGCCGGTT CT CCGG AT CTGGG AGTGGAACCGACTTT ACCCT G ACAATTTCAAGCCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACATACTACTGTCAGCAGAGCAG AACTTT CGGGCAGGGCACT AAGGTGGAGAT CAAA SEQ ID NO: 12(secuencia de aminoácidos VL de GL20) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 13 LCDR1 RTSQSLSSYTH

SEQ ID NO: 14 LCDR2 AASSRGS

SEQ ID NO: 15 LCDR3 QQSRT

SEQ ID NO: 16 (secuencia de ácido nucleico VH de GL20)

CAGGT CCAGCT GCAGCAGAGCGGCCCCGG ACTGGT CAAGCCTT CACAG ACACT G AGCCTG ACATGCGCCATT AGCGG AG AT AGCGT G AGCT CCT ACAATGCCGT GTGG A ACTGG AT CAGGCAGT CT CCAAGT CG AGG ACTGG AGTGGCTGGG ACG AACAT ACT A T AG AT CCGGGTGGT ACAAT G ACT ATGCT G AAT CAGT G AAAAGCCG AATT ACT AT CA ACCCCG AT ACCT CCAAG AAT CAGTT CT CT CTGCAGCT G AACAGT GT G ACCCCT G AG G ACACAGCCGT GT ACT ACTGCGCCAG AAGCGGCCAT AT CACCGT CTTTGGCGT CA AT GTGGATGCTTT CG AT AT GTGGGGGCAGGGG ACT ATGGT CACCGT GT CAAGC SEQ ID NO: 17 (secuencia de aminoácidos VH de GL20) QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRS GWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 18 HCDR1 SYNAVWN

SEQ ID NO: 19 HCDR2 RTYYRSGWYN DYAESVKS

SEQ ID NO: 20 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM

SEQ ID NO:21 (ADN VL de FBC39)

G ACAT CCAG AT G ACCCAGT CT CCAT CTT CCGT GT CTGCAT CT GT GGG AG ACAG AGT CACCAT CACTT GT CGGGCG AGT CAGG AT ATT AGCACCT GGTT AGCCTGGT AT CAG CAGAAACCAGGG AAAGCCCCT AAGCT CCT G AT CT ATGCTGCATCCAGTTT GCAAAG TGGGGT CCCAT CAAG ATT CAGCGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT G AAG ATTTTGCAACTT ACTTTT GT CAGCAGGCT AACAG TTT CCCT CCG ACTTTTGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AG AT CAAAC SEQ ID NO:22 (proteína VL de FBC39) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:23 (FBC39 LCDR-1 - Kabat): RASQDISTWLA

SEQ ID NO:24 (FBC39 LCDR-2 - Kabat): AASSLQS

SEQ ID NO:25 (FBC39 LCDR-3 - Kabat): QQANSFPPT

SEQ ID NO:26 (ADN VH de FBC39) GAGGTGCAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTT AG ACT CT CCT GTGCAGCCT CTGG ACT CAGTTT CCTT AACGCCTGGAT G AGCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGG AAGGGGCTGG AGTGGGTTGGCCGT ATT AAAAGT AAT ACT GATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCAGCATCTCAA GAGACGATTCAAAGAACATGCTGTTTCTGCATATGAGCAGCCTGAGAACCGAGGA CACAGCCGT CT ATT ACTGCGCCACAGAT GGACCTT ACT CT G ACG ATTTT AG AAGT G GTT ATGCCGCACGCT ACCGTT ATTT CGG AATGGACGT CTGGGGCCAAGGG ACCAC GGT CACCGT CT CCT CAG SEQ ID NO:27 (proteína VH de FBC39) EVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTD GGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYA ARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:28 (FBC39 HCDR-1 - Kabat): NAWMS

SEQ ID NO:29 (FBC39 HCDR-2 - Kabat): RIKSNTDGGTTDYAAPVKG

SEQ ID NO:30 (FBC39 HCDR-3 - Kabat): DGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDV

SEQ ID NO: 31 (secuencia de aminoácidos scFv de FBC39):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGK CLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATD GPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:32 (proteína VL de FBC39 - scFv)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIK

SEQ ID NO:33 (proteína VH de FBC39 - scFv)

EVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTD GGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYA ARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 34 (secuencia de aminoácidos FBC39-43/105 scFv):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGK GLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATD GPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:35 (proteína VL de FBC39 - scFv 43/105)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:36 (proteína VH de FBC39 - scFv 43/105)

EVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTD GGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYA ARYRYFGMDVWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:37 (ADN FBC39 FTL VL)

G ACAT CCAGAT G ACCCAGT CT CCAT CTT CCGT GT CTGCAT CT GT GGG AG ACAG AGT CACCAT CACTT GT CGGGCG AGT CAGG AT ATT AGCACCT GGTT AGCCTGGT AT CAG CAG AAACCAGGG AAAGCCCCT AAGCT CCT G AT CT ATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG TGGGGT CCCAT CAAG ATT CAGCGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT G AAG ATTTTGCAACTT ACT ATT GT CAGCAGGCT AACAG TTT CCCT CCG ACTTTTGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AG AT CAAAC

SEQ ID NO:38 (Proteína FBC39 FTL VL)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:39 (FBC39 FTL LCDR-1 - Kabat): RASQDISTWLA

SEQ ID NO:40 (FBC39 FTL LCDR-2 - Kabat): AASSLQS

SEQ ID NO:41 (FBC39 FTL LCDR-3 - Kabat): QQANSFPPT

SEQ ID NO:42 (ADN FBC39 FTL VH) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTT AGACT CT CCT GTGCAGCCT CTGG ATT CACTTT CCTT AACGCCTGG AT G AGCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGG AAGGGCCT GG AGTGGGTTGGCCGT ATT AAAAGT AAT ACT GATGGTGGGACAACAGACTACGCCGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAA G AGACG ATT CAAAG AACACGCT GT AT CTGCAAAT G AGCAGCCT G AAAACCG AGG A CACAGCCGT CT ATT ACTGCACCACAG ATGG ACCTT ACT CT G ACG ATTTT AG AAGT G GTT ATGCCGCACGCT ACCGTT ATTT CGG AATGGACGT CTGGGGCCAAGGG ACCAC GGT CACCGT CT CCT CA SEQ ID NO:43 (Proteína FBC39 FTL VH)

e v q lv e s g g g Lv k p g g s lr ls c a a s g ftfln a w m s w v r q a p g k g le w v g r ik s n td GGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAA RYRYFGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:44 (FBC39 FTL HCDR-1 - Kabat): NAWMS

SEQ ID NO:45 (FBC39 FTL HCDR-2 - Kabat): RIKSNTDGGTTDYAAPVKG

SEQ ID NO:46 (FBC39 FTL HCDR-3 - Kabat): DGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDV

SEQ ID NO: 47 (Secuencia de aminoácidos FBC39FTL scFv):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGK CLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTD GPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:48 (Proteína FBC39 FTL VL - scFv) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGCGTKLEIK SEQ ID NO:49 (Proteína FBC39 FTL VH - scFv) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTD GGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAA RYRYFGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 50: (Secuencia de aminoácidos FBC39FTL-43/105 scFv):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGK GLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTD GPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSS SEQ ID NO:51 (Proteína FBC39 FTL VL - scFv 43/105) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:52 (Proteína FBC39 FTL VH - scFv 43/105)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTD GGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSLKTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAA RYRYFGMDVWGCGTTVTVSS

SEQ ID NO:53 (ADN VL de FBD94)

G AAATT GT GTT GACACAGT CT CCAGCCACT CT GT CTTT GT CT CCAGGGG AAAGAGC CACCCT CT CCTGCAGGGCCAGT CGG AGT ATT ACCACCTT CTT AGCCTGGT ACCAAC AAAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCT CCT CAT CT ACG ATGCAT CCAACAGGGCCAC TGGCGT CCCAGCCAGGTT CAGTGGCAGTGGGT CT GGG ACAG ACTT CACT CT CACC AT CAACAGCCT AG AGCCT G ACG ATTTTGCAATTT ATT ACT GT CAGCAGCGT G ACCA CTGGCCT CCG AT CTT CGGCCAAGGG ACACG ACTGG AG ATT AAAC

SEQ ID NO:54 (Proteína FBD94 VL)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLUYDASNRATGVP ARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGQGTRLEIK

SEQ ID NO:55 (FBD94 LCDR-1 - Kabat): RASRSITTFLA

SEQ ID NO:56 (FBD94 LCDR-2 - Kabat): DASNRAT

SEQ ID NO:57 (FBD94 LCDR-3 - Kabat): QQRDHWPPI

SEQ ID NO:58 (ADN VH de FBD94)

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGCAGGTCCCTG AG ACT CT CCT GTGCAGTTT CTGGATT CAT CTTT G AAG ATT ATGCCAT AAACTGGGT C CGGCAAGCT CCAGGG AAGGGCCTGGAGTGGGT CT CAATT ATT AGTTGGG ACAGT G

GT AGG AT AGGCT ACGCGGACT CT GT GAGGGGCCG ATT CACCAT CT CCAG AG ACAA CGCCAAG AACT CCT CGTTT CTGCAAAT G AACAGT CT G AG ACCCG AAG ACACGGCC GT GT ATT ATT GT GT AAAAG AT AT GTTGGCGT ATTATT AT G ATGGT AGCGGCAT CAGG T ACAACCT CT ACGGT ATGG ACGT CTGGGGCCAAGGG ACCACGGT CACCGT CT CCT CAG

SEQ ID NO:59 (Proteína FBD94 VH)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKGLEWVSIISWDSGRI GYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYYYDGSGIRYNLY GMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:60 (FBD94 HCDR-1 - Kabat): DYAIN

SEQ ID NO:61 (FBD94 HCDR-2 - Kabat): IISWDSGRIGYADSVRG

SEQ ID NO:62 (FBD94 HCDR-3 - Kabat): DMLAYYYDGSGIRYNLYGMDV

SEQ ID NO: 63 (Secuencia de aminoácidos FBD94 scFv):

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGVP ARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGCGTRLEIKGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKCLE WVSIISWDSGRIGYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYY YDGSGIRYN LYG MD VWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:64 (Proteína FBD94 VL -scFv)

ElVLTQSPATLSLSPGERAtLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLLlYDASNRATGVP ARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGCGTRLEIK

SEQ ID NO:65 (Proteína FBD94 VH - scFv)

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKCLEWVSIISWDSGRI GYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYYYDGSGIRYNLY GMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 66 (GL20/39 BiS4 100/44 de cadena ligera):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 67 (GL20/39 BiS4 100/44 de cadena pesada):

QVQLQQSG PG LVKPSQTLSLTCAISG DSVSSYN AVWNWIRQSPS RGLEWLG RTYYRS GWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTK LEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNA WMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSL

RTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 68 (GL20/39 BiS443/105 de cadena ligera):

SEQ ID NO:69 (GL20/39 BiS443/105 de cadena pesada):

QVQLQQSG PG LVKPSQTLSLTCAISG DSVSSYN AVWNW I RQSPS RG LEWLG RTYYRS GWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTK LEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNA WMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSL RTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 70 (ADN FBC39 scFv-FY1 VH para cebador directo FY1/39 BiS2 100/44)

TT CT CT CCACAGGT GT ACACT CCGACAT CCAGAT GACCCAGT CT C

SEQ ID NO: 71 (ADN FBC39 scFv-FY1 VH para cebador inverso FY1/39 BiS2100/44) GGAT GGGCCCTTGGT CGACGCGCTT GACACGGT GACCATAGT C

SEQ ID NO: 72 (Cebador directo FBC39 scFv FY1/39 BiS4 100/44)

CT CT GGCGGAGGGggatccGACAT CCAGAT GACCCAGT CT C

SEQ ID NO: 73 (Cebador inverso FBC39 scFv FY1/39 BiS4 100/44)

GT GAGTTTT GT CggatccCCCT CCGCCAG AGCCACCT CCGCCT GAGG AG ACGGT G A CCGTGG SEQ ID NO: 74 (Cebador directo BiS1 FBC39):

CTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCC SEQ ID NO: 75 (Cebador inverso BiS1 FBC39):

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC SEQ ID NO: 76 (Cebador directo BiD1 FY1-VL):

AGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGATATTCAGATGACCCAGAGCCC SEQ ID NO: 77 (Cebador inverso BiS1 FY1-VL):

TGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCACCTTAGTGCCC SEQ ID NO: 78 (Cebador directo FY1/39 BiS3 100/44 - FBC39 scFv):

AAAGGCGGAGGGGGAT CCGGCGG AGGGGGCT CT GACAT CCAGÁT GACCCAGT CT C SEQ ID NO: 79 (Cebador inverso FY1/39 BiS3 100/44 - FBC39 scFv):

TCAATGAATTCGCGGCCGCTCATGAGGAGACGGTGACCGTGGTC SEQ ID NO: 80 (Cebador directo FY1/94 BiS2 100/44 - FBD94 scFv):

TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC SEQ ID NO: 81 (Cebador inverso FY1/94 BiS2 100/44 - FBD94 scFv):

CCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC SEQ ID NO: 82 (Cebador directo FY1/94 BiS2 100/44 - FY1 VH):

AGGGGGAT CCGGCGGAGGGGGCT CT CAGGT CCAGCTGCAGGAGAGC SEQ ID NO: 83 (Cebador inverso FY1/94 BiS2 100/44 - FY1 VH):

GGATGGGCCCTTGGTCGACGCGCTTGACACGGTGACCATAGTC SEQ ID NO: 84 (Cebador directo FY1/94 BiS4 100/44 - FBD94 scFv):

CTCTGGCGGAGGGGGATCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC SEQ ID NO: 85 (Cebador inverso FY1/94 BiS4 100/44 - FBD94 scFv):

GT GAGTTTT GT CGG AT CCCCCT CCGCCAG AGCCACCT CCGCCT G AGG AGACGGT G ACCGTGG SEQ ID NO: 86 (Cebador directo FY1/39 BiS443/105 - FBC39-43/105 scFv):

CTCTGGCGGAGGGggatccGACATCCAGATGACCCAGTCTC

SEQ ID NO: 87 (Cebador inverso FY1/39 BiS443/105 - FBC39-43/105 scFv):

GT GAGTTTT GT CggatccCCCT CCGCCAG AGCCACCT CCGCCT GAGGAGACGGT G A CCGTGG SEQ ID NO: 88 (Cebador directo GL20/39FTL BiS4 100/44 - FBC39FTL scFv):

CT CT GGCGGAGGGGGAT CCGACAT CCAGAT GACCCAGT CT C SEQ ID NO: 89 (Cebador inverso GL20/39FTL BiS4 100/44 - FBC39FTL scFv):

GT GAGTTTT GTCGG AT CCCCCT CCGCCAG AGCCACCT CCGCCT GAGGAGACGGT G ACCGTGG SEQ ID NO: 90 (Cebador directo GL20/39FTL BiS443/105 - FBC39FTL43/105 scFv):

CT CT GGCGGAGGGggatccGACAT CCAGAT GACCCAGT CT C

SEQ ID NO: 91 (Cebador inverso GL20/39FTL BiS443/105 - FBC39FTL43/105 scFv):

GT GAGTTTT GTCggatccCCCT CCGCCAG AGCCACCT CCGCCT GAGG AGACGGT GÁ CCGTGG SEQ ID NO: 92 (Enlazador Gly/ser)

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 93 (Enlazador Gly/ser)

[GGGGS]n, en la que n es 0, 1,2, 3, 4, o 5

SEQ ID NO:94 (FBC-39 LCDR-1 - IMGT): QDISTW

SEQ ID NO:95 (FBC-39 LCDR-2 - IMGT): AAS

SEQ ID NO:96 (FBC-39 LCDR-3 - IMGT): QQANSFPPT

SEQ ID NO:97 (FBC-39 HCDR-1 - IMGT): GLSFLNAW

SEQ ID NO:98 (FBC-39 HCDR-2 - IMGT): IKSNTDGGTT

SEQ ID NO:99 (FBC-39 HCDR-3 - IMGT): TDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVW

SEQ ID NO:100 (FBC-39 FTL LCDR-1 - IMGT): QDISTW

SEQ ID NO:101(FBC-39 FTL LCDR-2 - IMGT): AAS

SEQ ID NO:102 (FBC-39 FTL LCDR-3 - IMGT): QQANSFPPT

SEQ ID NO:103 (FBC-39 FTL HCDR-1 - IMGT): GFTFLNAW

SEQ ID NO:104 (FBC-39 FTL HCDR-2 - IMGT): IKSNTDGGTT

SEQ ID NO:105 (FBC-39 FTL HCDR-3 - IMGT): TTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDV

SEQ ID NO: 106 (Enlazador Gly/ser)

[GGGG]n, en la que n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5

SEQ ID NO: 107 (FY1/39 Bis2 100/44 de cadena ligera)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 108 (FY1/39 Bis2 100/44 de cadena pesada)

d iq m tq s p s s v s a s v g d r v titc r a s q d is tw la w Yq q k p g k a p k lliy a a s s lq s g v PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGK CLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATD GPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGL VKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVK SRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 109 (FY1/39 Bis4 100/44 de cadena ligera)

SEQ ID NO: 110 (FY1/39 Bis4 100/44 de cadena pesada)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYRS KWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTK LEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNA WMSWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSL RTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:111 (ADN FBC39 scFv-FY1 VH):

G ACAT CCAG AT G ACCCAGT CT CCAT CTT CCGT GT CTGCAT CT GT GGG AG ACAG AGT CACCAT CACTT GT CGGGCG AGT CAGG AT ATT AGCACCT GGTT AGCCTGGT AT CAG CAG AAACCAGGG AAAGCCCCT AAGCT CCT G AT CT ATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG TGGGGT CCCAT CAAG ATT CAGCGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT G AAG ATTTTGCAACTT ACTTTT GT CAGCAGGCT AACAG TTT CCCT CCG ACTTTTGGCTGCGGG ACCAAGCTGG AG AT CAAAGGCGG AGGGGG CTCTGGGGGAGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAG GTGCAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGA CT CT CCT GTGCAGCCT CTGG ACT CAGTTT CCTT AACGCCTGG AT GAGCTGGGT CC GCCAGGCT CCAGGG AAGTGCCTGG AGT GGGTT GGCCGT ATT AAAAGT AAT ACT G A TGGTGGG ACAACAG ACT ACGCCGCACCCGT G AAAGGCAG ATT CAGCAT CT CAAG A G ACG ATT CAAAG AACATGCT GTTT CTGCAT AT G AGCAGCCT G AG AACCG AGGACA CAGCCGT CT ATT ACTGCGCCACAG ATGG ACCTTACT CT G ACG ATTTT AG AAGTGGT T AT GCCGCACGCT ACCGTT ATTT CGG AATGG ACGT CTGGGGCCAAGGG ACCACGG T CACCGT CT CCT CAGGCGG AGGGGG AT CCGGCGG AGGGGGCT CT CAGGT CCAGC TGCAGG AG AGCGGCCCCGGACT GGT CAAGCCTT CACAG ACACT G AGCCT G ACAT GCGCCATT AGCGG AG AT AGCGT G AGCT CCAACAATGCCGT GTGGAACTGG AT CAG GCAGT CT CCAAGT CG AGG ACTGG AGTGGCTGGG ACG AACAT ACT AT AGAT CCAAG TGGT ACAAT G ACT ATGCT G AAT CAGT G AAAAGCCG AATT ACT GT CAACCCCG AT AC CT CCAAG AAT CAGTT CT CT CTGCACCT G AAAAGT GT GACCCCT G AGG ACACAGCC GT GTT CT ACTGCGT CAG AAGCGGCCAT AT CACCGT CTTT GGCGT CAAT GTGG ATGC TTT CG AT AT GTGGGGGCAGGGGACT ATGGT CACCGT GT CAAGC

SEQ ID NO:112 (ADN FBC39 scFv):

G ACAT CCAG ATG ACCCAGT CT CCAT CTT CCGT GT CTGCAT CT GT GGG AG ACAG AGT CACCAT CACTT GT CGGGCG AGT CAGG AT ATT AGCACCT GGTT AGCCTGGT AT CAG CAG AAACCAGGG AAAGCCCCT AAGCT CCT G AT CT ATGCTGCATCCAGTTTGCAAAG TGGGGT CCCAT CAAG ATT CAGCGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT G AAG ATTTTGCAACTT ACTTTT GT CAGCAGGCT AACAG TTT CCCT CCG ACTTTTGGCTGCGGG ACCAAGCTGG AG AT CAAAGGCGG AGGGGG CTCTGGGGGAGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAG GTGCAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGA CT CT CCT GTGCAGCCT CTGG ACT CAGTTT CCTT AACGCCTGG AT GAGCTGGGT CC GCCAGGCT CCAGGG AAGTGCCTGG AGT GGGTT GGCCGT ATT AAAAGT AAT ACT G A TGGTGGG ACAACAG ACTACGCCGCACCCGTG AAAGGCAG ATTCAGCATCTCAAG A G ACG ATT CAAAG AACATGCT GTTT CTGCAT AT G AGCAGCCT GAG AACCG AGGACA CAGCCGT CT ATT ACTGCGCCACAG ATGG ACCTTACT CT GACG ATTTT AG AAGTGGT T ATGCCGCACGCT ACCGTT ATTT CGGAATGG ACGT CTGGGGCCAAGGG ACCACGG T CACCGT CT CCT CA

SEQ ID NO: 113 (FY1/39 Bis1 100/44 de cadena ligera)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQAPGK CLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYYCATD GPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 114 (FY1/39 Bis1 100/44 de cadena pesada)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRS KWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAF

DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 115 (FY1/39 Bis3 100/44 de cadena ligera)

SEQ ID NO: 116 (FY1/39 Bis3 100/44 de cadena pesada)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYRS KWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLI YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWM SWVRQAPGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTE DTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 117 (FY1/94 Bis2 100/44 de cadena ligera)

SEQ ID NO: 118 (FY1/94 Bis2 100/44 de cadena pesada)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASRSITTFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGVP ARFSGSGSGTDFTLTINSLEPDDFAIYYCQQRDHWPPIFGCGTRLEIKGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFIFEDYAINWVRQAPGKCLE WVSIISWDSGRIGYADSVRGRFTISRDNAKNSSFLQMNSLRPEDTAVYYCVKDMLAYY YDGSGIRYNLYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLS LTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPD TSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:119 (ADN FBD94 scFv):

G AAATT GT GTT GACACAGT CT CCAGCCACT CT GT CTTT GT CT CCAGGGG AAAG AGC CACCCT CT CCTGCAGGGCCAGT CGG AGT ATT ACCACCTT CTT AGCCTGGT ACCAAC AAAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCT CCT CAT CT ACG ATGCAT CCAACAGGGCCAC TGGCGT CCCAGCCAGGTT CAGTGGCAGTGGGT CT GGG ACAG ACTT CACT CT CACC AT CAACAGCCT AG AGCCT G ACG ATTTTGCAATTT ATT ACT GT CAGCAGCGT G ACCA CTGGCCT CCG AT CTT CGGCT GTGGG ACACG ACT GG AG ATT AAAGG AGGCGG AGG ATCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAAGT GCAGCTGGTGG AGT CTGGGGG AGGCTT GGTGCAACCT GGCAGGT CCCT G AG ACT CT CCT GTGCAGTTT CTGG ATT CAT CTTT G AAG ATT ATGCCAT AAACTGGGT CCGGC AAGCT CCAGGG AAGTGCCTGGAGTGGGT CT CAATT ATT AGTTGGG ACAGTGGT AG G AT AGGCT ACGCGG ACT CT GT G AGGGGCCG ATT CACCAT CT CCAG AG ACAACGCC AAG AACT CCT CGTTT CTGCAAAT G AACAGT CT G AGACCCG AAG ACACCGCCGT GT A TT ATT GTGT AAAAG AT AT GTT GGCGT ATT ATT AT GATGGT AG CGG CAT CAGGT ACAA CCT CT ACGGT ATGG ACGT CT GGGGCCAAGGG ACCACGGT CACCGT CT CCT CA

SEQ ID NO: 120 (FY1/39 Bis4 43/105 de cadena ligera)

SEQ ID NO: 121 (FY1/39 Bis4 43/105 de cadena pesada)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYRS KWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTK LEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNA WMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSL RTEDTAVYYCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:122 (ADN FBC39-43/105 scFv):

G ACAT CCAG AT G ACCCAGT CT CCAT CTT CCGT GT CTGCAT CT GT GGG AG ACAG AGT CACCAT CACTT GT CGGGCG AGT CAGG AT ATT AGCACCT GGTT AGCCTGGT AT CAG CAG AAACCAGGG AAATGCCCT AAGCT CCT GAT CT ATGCTGCAT CCAGTTTGCAAAG TGGGGT CCCAT CAAG ATT CAGCGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT G AAG ATTTTGCAACTT ACTTTT GT CAGCAGGCT AACAG

TTT CCCT CCG ACTTTTGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AG AT CAAAGG AGGCGG AGG A TCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAGGTG CAGCTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGACTCAGTTTCCTTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCC AGGCT CCAGGG AAGGGGCTGG AGT GGGTTGGCCGT ATT AAAAGT AAT ACT G ATGG TGGG ACAACAG ACT ACGCCGCACCCGT GAAAGGCAG ATT CAGCAT CT CAAG AG AC G ATT CAAAG AACATGCT GTTT CTGCAT AT G AGCAGCCT G AG AACCG AGG ACACAG CCGT CT ATT ACTGCGCCACAGATGG ACCTT ACT CT GACG ATTTT AG AAGTGGTT AT GCCGCACGCT ACCGTT ATTT CGG AATGG ACGT CTGGGGCTGCGGGACCACGGT C ACCGT CT CCT CA

SEQ ID NO:123 (GL20 LC/VH):

G AT ATT CAG AT GACCCAG AGCCCTT CCAGCCT GT CCGCTT CAGTGGGGG AT CGAG T G ACCATT ACCTGCCG AACCAGCCAG AGCCT G AGCT CCT ACACGCACTGGT AT CA GCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCTAGTCGGGG GT CCGG AGTGCCAAGCCGGTT CT CCGG AT CTGGG AGTGG AACCG ACTTT ACCCT G ACAATTTCAAGCCTGCAGCCCGAGGATTTCGCTACATACTACTGTCAGCAGAGCAG AACTTT CGGGCAGGGCACT AAGGTGGAGAT CAAACGT ACGGTGGCTGCACCAT CT GT CTT CAT CTT CCCGCCAT CT G AT G AGCAGTT G AAAT CTGG AACTGCCT CT GTT GT GTGCCTGCT G AAT AACTT CT AT CCCAG AG AGGCCAAAGT ACAGT GG AAGGTGG AT AACGCCCT CCAAT CGGGT AACT CCCAGG AG AGT GT CACAGAGCAGG ACAGCAAG G ACAGCACCT ACAGCCT CAGCAGCACCCT G ACGCT GAGCAAAGCAG ACT ACG AG A AACACAAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCCAT CAGGGCCT G AGCT CGCCCGT CAC AAAG AGCTT CAACAGGGG AGAGT GTT AGT G AGCT AGCG AT G AT AAT CAGCCAT AC CACATTT GT AG AGGTTTT ACTT GCTTT AAAAAACCT CCCACACCT CCCCCT G AACCT G AAACAT AAAAT G AAT GCAATT GTT GTT GTT AACTT GTTT ATTGCAGCTT AT AATGGT T ACAA AT AAAG C AAT AG CAT CAC AA ATTT CAC AAAT AAAG C ATTTTTTT C ACT G C ATT CT AGTT GT GGTTT GT CCAAACT CAT CAAT GT AT CTT AT CAT GT CTGG ATGGGCCCGT TT AAACCCGCT G AT CAGCCT CG ACT GT GCCTT CT AGTTGCCAGCCAT CT GTT GTTT GCCCCT CCCCCGTGCCTT CCTT G ACCCTGG AAGGTGCCACT CCCACT GT CCTTT C CT AAT AAAAT G AGG AAATTGCAT CGCATT GT CT G AGT AGGT GT CATT CT ATT CTGGG GGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGC ATGCT GGGG ATGCGGT GGGCT CT ATGGCTT CT G AGGCGG AAAG AACCAGCT GGG GCT CT AGCT AGTT ATT AAT AGT AAT CAATT ACGGGGT CATT AGTT CAT AGCCCAT AT ATGG AGTT CCGCGTT ACAT AACTT ACGGT AAATGGCCCGCCT GGCT G ACCGCCCA ACG ACCCCCGCCCATT G ACGT CAAT AAT G ACGT AT GTT CCCAT AGT AACGCCAAT A GGG ACTTT CCATT GACGT CAATGGGTGG AGT ATTT ACGGT AAACTGCCCACTTGGC AGT ACAT CAAGT GT AT CAT ATGCCAAGT ACGCCCCCT ATT GACGT CAAT GACGGT A AATGGCCCGCCTGGCATT ATGCCCAGT ACAT G ACCTT ATGGG ACTTT CCT ACTT GG CAGT ACAT CT ACGT ATT AGT CAT CGCT ATT ACCATGGT G ATGCGGTTTTGGCAGT A CAT CAAT GGGCGT GG AT AGCGGTTT G ACT CACGGGG ATTT CCAAGT CT CCACCCC ATT GACGT CAATGGG AGTTT GTTTTGGCACCAAAAT CAACGGGACTTT CCAAAAT G T CGT AACAACT CCGCCCCATT GACGCAAAT GGGCGGT AGGCGT GT ACGGTGGG A GGT CT AT AT AAGCAG AGCT CGTTT AGT G AACCGT CAG AT CGCCT GG AG ACGCCAT CCACGCT GTTTT G ACCT CCAT AG AAG ACACCGGG ACCG AT CCAGCCT CCGCGGCC GGG AACGGTGCATTGG AACGCGG ATT CCCCGTGCCAAG AGT GACGT AAGT ACCG

CCT AT AG ACT CT AT AGGCACACCCCTTT GGCT CTT AT GCAT G AATT AAT ACG ACT CA CT AT AGGG AG ACAGACT GTT CCTTT CCTGGGT CTTTT CTGCAGGCACCGT CGCCG CCACCATGGGATGG AGCT GT AT CAT CCT CTT CTTGGT AGCAACAGCT ACAGGT AAG GGGCT CACAGT AGCAGGCTT G AGGT CT AG ACAT AT AT ATGGGT G ACAAT G ACAT C CACTTTGCCTTT CT CT CCACAGGT GT ACACT CCCAGGT CCAGCT GCAGCAG AGCG GCCCCGG ACTGGT CAAGCCTT CACAG ACACT G AGCCT GACAT GCGCCATT AGCGG AG AT AGCGT G AGCT CCT ACAATGCCGT GTGG AACTGGAT CAGGCAGT CT CCAAGT CG AGG ACTGG AGT GGCTGGG ACG AACAT ACT AT AG AT CCGGGTGGT ACAAT G ACT ATGCT GAAT CAGT GAAAAGCCG AATT ACT AT CAACCCCG AT ACCT CCAAG AAT CAG TT CT CT CTGCAGCT G AACAGT GT G ACCCCT G AGG ACACAGCCGT GT ACT ACTGCG CCAG AAGCGGCCAT AT CACCGT CTTTGGCGT CAAT GTGG AT GCTTT CG AT ATGTGG GGGCAGGGG ACT ATGGT CACCGT GT CAAGC

SEQ ID NO:124 (ADN FBC39FTL scFv):

G ACAT CCAG AT G ACCCAGT CT CCAT CTT CCGT GT CTGCAT CT GT GGG AG ACAG AGT CACCAT CACTT GT CGGGCG AGT CAGG ATATT AGCACCT GGTT AGCCTGGT AT CAG CAG AAACCAGGG AAAGCCCCT AAGCT CCT G AT CT ATGCT GCAT CCAGTTTGCAAAG TGGGGT CCCAT CAAG ATT CAGCGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT G AAG ATTTTGCAACTT ACT ATT GT CAGCAGGCT AACAG TTT CCCT CCG ACTTTTGGCT GCGGG ACCAAGCTGG AG AT CAAAGG AGGCGG AGG A TCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAGGTG CAGCTGGTGG AGT CTGGGGG AGGCTT GGT AAAGCCTGGGGGGT CCCTT AG ACT C T CCT GTGCAGCCT CTGGATT CACTTT CCTT AACGCCTGGAT G AGCTGGGT CCGCCA GGCT CCAGGG AAGT GCCTGG AGTGGGTTGGCCGT ATT AAAAGT AAT ACT G ATGGT GGG ACAACAG ACT ACGCCGCACCCGT G AAAGGCAG ATT CACCAT CT CAAGAG ACG ATT CAAAG AACACGCT GT AT CTGCAAAT GAGCAGCCT G AAAACCGAGG ACACAGC CGT CT ATT ACTGCACCACAG ATGG ACCTT ACT CT G ACG ATTTT AGAAGTGGTT AT G CCGCACGCT ACCGTT ATTT CGG AAT GG ACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGT CAC CGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 125 (GL20/39FTL Bis4 43/105 de cadena ligera)

DIQMTQSPSSLSÁSVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 126 (GL20/39FTL Bis4 43/105 de cadena pesada)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNÁVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRS GWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPTFGQGTK LEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFLNA WMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMSSL KTEDTAVYYCTTDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGG

SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:127 (ADN FBC39FTL43/105 scFv):

G ACAT CCAG AT G ACCCAGT CT CCAT CTT CCGT GT CTGCAT CT GT GGG AG ACAG AGT CACCAT CACTT GT CGGGCG AGT CAGG ATATT AGCACCT GGTT AGCCTGGT AT CAG CAG AAACCAGGG AAATGCCCT AAGCT CCTG AT CT ATGCTGCAT CCAGTTTGCAAAG TGGGGT CCCAT CAAG ATT CAGCGGCAGTGG AT CTGGG ACAG ATTT CACT CT CACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT G AAG ATTTTGCAACTT ACT ATT GT CAGCAGGCT AACAG TTT CCCT CCG ACTTTTGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AGAT CAAAGG AGGCGG AGG A TCTGGTGGTGGTGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAGGTG CAGCTGGTGG AGT CTGGGGG AGGCTT GGT AAAGCCTGGGGGGT CCCTT AG ACT C T CCT GTGCAGCCT CTGGATT CACTTT CCTT AACGCCTGGAT G AGCTGGGT CCGCCA GGCT CCAGGG AAGGGGCT GGAGTGGGTTGGCCGT ATT AAAAGT AAT ACT G ATGGT GGG ACAACAG ACT ACGCCGCACCCGT G AAAGGCAG ATT CACCAT CT CAAGAG ACG ATT CAAAG AACACGCT GT AT CTGCAAAT GAGCAGCCT G AAAACCGAGG ACACAGC CGT CT ATT ACTGCACCACAG ATGG ACCTT ACT CT G ACG ATTTT AGAAGTGGTT AT G CCGCACGCT ACCGTT ATTT CGG AAT GG ACGTCTGGGGCTGCGGG ACCACGGT CAC CGTCTCCTCA

SEQ ID NO:128_(GL20/39FTL Bis5 43/105 de cadena ligera)

SEQ ID NO:129 (GL20-FBC39 BiS5 - GL20VH - Fc (CH3-) - Enlazador - FBC39 scFv - Enlazador - Fc (-CH3))

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRS GWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGGGSG GGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGCGTKLEIKGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQ APGKCLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVYY CATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 130 (GL20/39FTL Bis5 43/105 de cadena ligera)

SEQ ID NO: 131 (GL20VH BiS5 - Fc (CH3-) - Enlazador - FBC39 (43-105) scFv - Enlazador - Fc (-CH3))

QVQLQQSG PG LVKPSQTLSLTCAISG DSVSSYN AVWNWIRQSPS RGLEWLG RTYYRS GWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAF DMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGGGSG GGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISTWLAWYQQKPGKCPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPPTFGQGTKLEIKGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVVSGGGLVKPGGSLRLSCAASGLSFLNAWMSWVRQ APGKGLEWVGRIKSNTDGGTTDYAAPVKGRFSISRDDSKNMLFLHMSSLRTEDTAVY YCATDGPYSDDFRSGYAARYRYFGMDVWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión aislada que se une específicamente al virus de la influenza A y al virus de la influenza B, en la que la molécula de unión aislada se selecciona de:

(a) una molécula de unión aislada que comprende un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de influenza A, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv y en la que el primer dominio de unión comprende:

(i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:7 y un VL de una cadena ligera de un anticuerpo de SEQ ID NO:2; o

(ii) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO:17 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:12; y

un segundo dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de influenza B y neutralizar el virus de la influenza B en al menos dos linajes filogenéticamente distintos, en la que el segundo dominio de unión comprende un scFv y en la que el segundo dominio de unión comprende:

(i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de s Eq ID NO:59 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:54; o

(b) una molécula de unión aislada que comprende un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de la influenza A, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv y en la que el primer dominio de unión comprende:

(i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de s Eq ID NO:27 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:22; o

(c) una molécula de unión aislada que comprende un primer dominio de unión que es capaz de unirse a la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos 1 subtipo del grupo 2 del virus de la influenza A, en la que el primer dominio de unión comprende un dominio Fv y en la que el primer dominio de unión comprende:

(i) un VH de una cadena pesada del anticuerpo de s Eq ID NO:43 y un VL de una cadena ligera del anticuerpo de SEQ ID NO:38;

en la que el primer dominio de unión comprende una fórmula VH-CH1-CH2-L1-scFv-L2-CH3, en la que L1 y L2 son independientemente un enlazador y scFv es el segundo dominio de unión; y en la que el VL del scFv, el segundo dominio de unión, comprende un residuo de cisteína en una posición selecionada de 43, 44, 46, 49, 50 o 100 y el VH del scFv del segundo dominio de unión comprende un residuo de cisteía en una posición seleccionada entre 43, 44, 100, 101 o 105 (numeración de acuerdo con Kabatt).

2. La molécula de unión aislada de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionada de una molécula de unión aislada que comprende:

(a) una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO:109 y una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO:110; (b) una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO:120 y una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO:121; (c) una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO:68 y una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO:69; y (d) una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO:125 y una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO:126.

3. La molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el primer dominio de unión es capaz de neutralizar uno o más subtipos del grupo 1 del virus de influenza A seleccionados de: H1, H2, H5, H6, H8, H9, h 11, H12, H13, H16, H17, H18 y variantes de los mismos; y uno o más subtipos del grupo 2 del virus de la influenza A seleccionados de entre: H3, H4, h7, H10, H14 y H15 y variantes de los mismos; opcionalmente en la que el segundo dominio de unión es capaz de neutralizar el virus de influenza B tanto en el linaje Yamagata como Victoria.

4. Un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica la molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.

6. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.

7. Una composición que comprende la molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Un método para fabricar una molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6 en las condiciones adecuadas para la expresión de dicha molécula de unión.

9. Una molécula de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en la profilaxis o el tratamiento de infección por influenza A, infección por influenza B, o una combinación de los mismos.