CN103446582A - 包含诱导粘膜免疫的佐剂的新型疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的名称是包含诱导粘膜免疫的佐剂的新型疫苗。本发明提供佐剂，当经粘膜施用时，该佐剂具有优于传统佐剂的能力，且能提供株间的防御反应。本发明是基于双链RNA（例如Poly（I:C））在与抗原亚单位同时使用时具有上述功能，这一出乎意料的发现而完成的。因此，本发明提供经粘膜施用的疫苗，其包括A）双链RNA，及B）病原体的亚单位抗原或灭活抗原。

Description

包含诱导粘膜免疫的佐剂的新型疫苗
本申请是申请日为2004年8月10日，申请号为200480029805.3的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新型疫苗的组成成分。更详细而言，本发明涉及以双链RNA作佐剂新型疫苗。
技术背景
现行被认可的疫苗有以下局限性。例如，流感病毒（特别是A型流感病毒）发生显著的抗原变异，结果导致之前应用的疫苗（即已经获得的感染）所产生的抗体不能中和的病毒频繁发生，疫苗的效果大多仅能维持一个季。另外，因编码表面糖蛋白（红血球凝集素[HA]及神经氨酸酶[NA]）的基因的点突变（抗原连续突变）、抗原不连续突变而引起的免疫学不同的新株频繁产生。该情况下，即使在连续突变株和不连续突变株中内在蛋白质也在相当高的水平上保守。用现行的疫苗进行免疫时，由于在同种株间只诱发体液免疫，而非异种株间基于细胞免疫的共同免疫，所以流行株与疫苗株不同的话，疫苗的效果就会被减弱。
存在的另一个缺点是：即使流感病毒的主流流行株从一年到来年没有发生显著地不连续突变或连续突变，由于抗体效价会降低，所以必须每年进行免疫。据报道，血球凝集抑制（HI）和中和的抗体可存在数月到数年，其后逐渐减少。但是，即使在没有减少的情况下，也推荐1年接种1次。这是因为疫苗接种后的年内，抗体效价有可能降低。
存在着改变疫苗有效性的余地。这是因为开发来季疫苗依赖于预测将来的流行株。因此，这种预测伴随着不准确性，会发生用于疫苗的株与实际野外流行的不匹配的情况。假如产生新型株，预测的疫苗常常无效，例如1992～1993年的流感季节产生的新型H3N2株(A/Beijing/92)。新型病毒往往直到流感季节的后期才在临床上比较明显，用现有的疫苗进行预防常常令人不满意，因为制备和调剂出被认可的疫苗需要时间。即使疫苗株与流行株很好匹配，被认可的疫苗也仅能预防儿童和青年约70％、高龄者30％～40％的疾病。
传统的疫苗几乎不可能进行粘膜（例如鼻腔）免疫；特别是已知代表流感病毒主流的皮下接种型现灭活疫苗、成分疫苗等，不能产生粘膜免疫，因此渴望能产生粘膜免疫的疫苗组合物。
同样，由于传统的疫苗即便在株间也不能诱导交叉免疫，所以渴望开发至少能在株间或亚型间能诱导交叉免疫的疫苗。流感疫苗的主流是2种A株和1种B株的混合物，因此特别渴望开发不需要依赖预测或至少减少依赖预测流行株的疫苗。
此外，还渴望以简便的接种方法接种且粘膜接种有效的疫苗。由于对于流感病毒等还做不到，所以特别期望易于进行群体免疫（massimmunization）的解决策略。此外，也渴望增加抗体持续时间的疫苗。
非专利文献1(J.Clinical Investigation,110(8),1175-1184,(2002))公开了以Poly（I：C）作佐剂，经气道途径施用UV灭活的整个流感病毒。但是，如非专利文献1的图2所示，IgG抗体的上升与不添加Poly（I：C）时无差异。因此，这提示用Poly（I：C）作佐剂几乎无效。此外，该文献中还描述了联合使用短链磷脂以增加抗体。
非专利文献2（Invest.Ophthalmol.,10(10),750-759(1971)）和非专利文献3（Invest.Ophthalmol.,10(10),760-769(1971)）中描述了用Poly（I：C）作佐剂，经鼻接种灭活疫苗病毒。但是，非专利文献2中描述泪液中IgA抗体产生增加，但未言及感染预防效果。
专利文献1（特开昭50－2009号（US3906092）Merck&Co）公开了通过向吸附型佐剂中添加多核苷酸（包括Poly（I：C））促进流感病毒的抗体反应。但是，专利文献1未言及感染预防效果。
非专利文献4（Veterinary Microbiology,88(4),325-338,2002）报道了以Poly（I：C）作佐剂，腹腔内接种灭活疫苗后，IgG、IgM显著性上升，但未显示经鼻腔等粘膜施用的效果，而且也未言及感染预防效果。
非专利文献5（Proc.Soc.Exp.Biol.&Med.,133,334-338(1970)）报道了用Poly（I：C）作佐剂，静脉内注射羊红细胞进行免疫时，血中抗体增加，但未言及感染预防效果。
非专利文献6（The Journal of Immunology.149,981-988(1992)）描述了霍乱毒素作佐剂的可能性，但对双链RNA未进行描述。
专利文献1：特开昭50－2009号
非专利文献1：J.Clinical Investigation,110(8),1175-1184,(2002)
非专利文献2：Invest.Ophthalmol.,10(10),750-759(1971)
非专利文献3：Invest.Ophthalmol.,10(10),760-769(1971)
非专利文献4：Veterinary Microbiology,88(4),325-338,2002）
非专利文献5：Proc.Soc.Exp.Biol.&Med.,133,334-338(1970)
非专利文献6：The Journal of Immunology.149,981-988(1992)
发明公开
发明所要解决的问题
在如上状况中，本发明提供佐剂，当经粘膜施用时，该佐剂具有优于传统佐剂的能力，且能提供跨株防御反应。
解决问题的手段
我们发现当与亚单位抗原一起应用时，双链RNA出乎意料地具有上述能力，由此解决了上述问题。
如上所述，现行的灭活流感HA疫苗是有效的疫苗，但由于在流感病毒的进入门户呼吸道粘膜上皮IgA抗体的诱导很低，所以我们考虑到通过改善诱导可进一步增强效果。
于是，本发明者们尝试在小鼠的流感模型中，用佐剂和经鼻疫苗一起，诱导对气道粘膜交叉反应性高的分泌型IgA抗体。应用霍乱毒素B亚单位（CTB*）作佐剂获得良好效果。但是，由于考虑到在人类经鼻施用时，有霍乱毒素引起颜面神经麻痹等副作用的报道，所以认为倘若不使用应用霍乱毒素的佐剂能诱导IgG抗体，疫苗应该更安全。IgA活化补体系统的第2条途径，在粘膜感染中对局部免疫反应具有重要作用，IgA血浆中的半衰期为5～6日，随后被替换成新的，所以不能预测其感染预防效果，例如即使泪液中IgA增加。
因此，本发明者们探讨了识别体内微生物组分、刺激天然免疫成分的Toll样受体（TLR）的配体是否具有优越的安全性、成为粘膜疫苗强力佐剂的可能性，结果获得具有出乎意料的感染预防效果的经粘膜施用的疫苗。
因此，本发明提供如下：
（1）经粘膜施用的疫苗，包括
A）双链RNA，及
B）病原体的亚单位抗原或灭活抗原。
（2）（1）中所述的疫苗，其中所述粘膜包括鼻粘膜。
（3）（1）中所述的疫苗，其中病原体选自水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、流感病毒、腺病毒、疱疹病毒、风疹病毒、重症急性呼吸道综合症病毒（SARS病毒）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、百日咳杆菌（Borcletella pertussis）、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、流感嗜血菌b型(Haemophilusinfluenzae type b)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。
（4）（1）中所述的疫苗，其中病原体为流感病毒。
（5）（1）中所述的疫苗，其中亚单位包括至少一种选自流感病毒HA、NA、M1、M2、NP、PB1、PB2、PA及NS2的亚单位。
（6）（1）中所述的疫苗，其中双链RNA以足以诱导产生分泌型IgA的浓度存在。
（7）（1）中所述的疫苗，其中双链RNA的浓度为0.1～10mg/ml。
（8）（1）中所述的疫苗，其中双链RNA的大小为102～108bp。
（9）（1）中所述的疫苗，其中亚单位至少包括NA或HA。
（10）（1）中所述的疫苗，其中双链RNA包含Poly（I：C）。
（11）一种预防感染性疾病的方法，包括至少一次经粘膜施用A）用于粘膜施用的疫苗的步骤：所述疫苗包括：a)双链RNA；和b)病原体的亚单位抗原或灭活抗原。
（12）（11）中所述的方法，其中疫苗的施用至少进行两次。
（13）（11）中所述的方法，其中疫苗的施用间隔至少在1周或以上，更优选3周或以上。
（14）（11）中所述的方法，其中双链RNA包含Poly（I：C）。
（15）一种预防感染性疾病的疫苗试剂盒，包括：A）进行粘膜施用的疫苗，所述疫苗包括：a)双链RNA；和b)病原体的亚单位抗原或灭活抗原；B）指示至少一次经粘膜施用疫苗的说明书。
（16）（15）中所述的试剂盒，其中疫苗的施用至少进行两次。
（17）（15）中所述的试剂盒，其中疫苗的施用间隔至少在1周或以上，更优选3周或以上。
（18）（15）中所述的试剂盒，其中双链RNA包含Poly（I：C）。
（19）双链RNA在经粘膜施用疫苗中的应用。
（20）（19）中所述的应用，其中双链RNA包含Poly（I：C）。
（21）双链RNA在制备经粘膜施用的疫苗中的应用。
（22）（21）中所述的应用，其中双链RNA包含Poly（I：C）。
发明效果
本发明提供一种疫苗形式，对于能通过粘膜施用进行简单接种，且能获得交叉免疫。由此，例如流感病毒，无需预测流行株即可制备有效的疫苗，可获得有效预防策略。
附图简述
[图1]图1是表示实施例中例示的Poly（I：C）佐剂效果的数据。左栏表示施用方式，中栏表示鼻洗涤液中IgA的含量，右栏表示血清中的IgA含量。
[图2]图1是表示实施例中例示的Poly（I：C）佐剂效果的数据。左栏表示施用方式，右栏表示病毒的生存状况。
[图3]图3表示针对不同病毒株，本发明的疫苗接种诱导IgA的效果。
[图4]图4表示针对不同病毒株，本发明的疫苗接种病毒增殖抑制效果。
[图5]图5表示本发明的疫苗接种在脑内施用的毒性。上面表示本发明的Poly（I：C），下面表示阳性对照的CTB。
[图6]图6表示灭活病毒颗粒与Poly（I：C）并用作为经鼻流感疫苗使用时的免疫效果：鼻洗涤液和血清中抗HA和抗NA抗体的效价。
[图7]图7表示灭活病毒颗粒与各种大小（L、M、H）的Poly（I：C）并用作为经鼻流感疫苗使用时的免疫效果：鼻洗涤液和血清中抗HA和抗NA抗体的效价。
[图8]图8表示双链RNA或单链RNA与亚单位HA并用作为经鼻流感疫苗使用时的免疫效果：鼻洗涤液和血清中抗HA抗体的效价。
[图9]图9是表明与Poly（I：C）并用的经鼻流感疫苗以一周或以上的间隔施用两次或以上的有效性的结果。
[图10]图10是表明Poly（I：C）也增强针对百日咳疫苗的保护免疫，对增强非流感感染性疾病的疫苗的保护免疫也有效的结果。
实施发明的最佳实施方式
以下说明本发明。整个说明书中任何单数形式的表达，均可理解为包含其复数形式的概念，有特殊说明的情况除外。此外，本说明书中使用的术语，可按该领域内通常使用的意思进行理解，有特殊说明的情况除外。
（定义）
本说明书中“疫苗”是指施用到体内，诱导主动免疫的通常包括感染性因子或其部分的抗原性悬浊液或溶液。构成疫苗的抗原性部分可以是微生物（例如病毒或细菌等）或从微生物纯化出的天然产物、合成物或基因工程的蛋白质、肽、多糖或类似的产物。活疫苗包括，例如BCG、天花疫苗、脊髓灰质炎、水痘、麻疹、风疹、腮腺炎、牛疫、NDV、马立克氏病（Marek’s disease）等，但并不限定于此。灭活疫苗包括百日咳、白喉（类毒素）、破伤风（类毒素）、流感、日本脑炎等，但并不限定于此。
本说明书中“灭活抗原”是指能作为用于疫苗的抗原使用、丧失感染能力的抗原，包括完整病毒颗粒病毒体、不完全病毒颗粒、病毒体组成颗粒、病毒的非结构蛋白质、感染防御抗原、中和反应的表位等，但并不限定于此。本说明书中“灭活抗原”是指丧失感染能力但保持免疫原性的抗原，这样的抗原作为疫苗使用时叫做“灭活疫苗”。这样的灭活抗原包括，例如通过物理的（例如，X线照射、热、超声波）、化学的（福尔马林、水银、酒精、氯）等手段而灭活的物质，但并不限定于此。因为亚单位抗原自身也通常丧失感染力，所以属于灭活抗原的定义内。或者也可使用灭活的病毒。
本说明书中病毒的“亚单位抗原”也叫做“组分”，这样的亚单位抗原既可从天然病毒等病原体纯化而来，也可通过合成或重组技术进行制备。在该领域内，这样的方法是众所周知的经常使用的方法，可应用市售的机器、试剂、载体等进行制备。例如，对于流感病毒，优选红血球凝集素（HA）、神经氨酸酶（NA）、基质（M1、M2）、非结构（NS）、聚合酶（PB1、PB2：碱性聚合酶1、2，酸性聚合酶（PA））、核蛋白质（NP）等存在于颗粒表面的分子。目前已知HA有15种，NA有9种，若它们发生变化就会获得新株。
本说明书中的“佐剂”是指当与所施用的免疫原混合时，可增强或改变免疫应答的物质。
本说明书中的“CT”或“霍乱毒素”是指霍乱弧菌产生的外毒素，它是感染霍乱弧菌产生腹泻症状的物质原。霍乱毒素可作为有效的佐剂使用，但由于其毒性，不能在临床中应用。因此，通常CT作为探索疫苗的有效佐剂时的阳性对照使用。
本说明书中的“双链RNA”是指任意的双链RNA。其大小，例如可通过凝胶电泳进行测定。虽然以往人们尝试用双链RNA作为疫苗的佐剂，但几乎没有疫苗对感染防御有效的报道。这样的双链RNA包括Poly（I：C）、Poly（A：U）、Poly（G：C）等，但并不限定于此。
本说明书中的“Poly（I：C）”是包括聚肌苷酸（pI）和聚胞嘧啶核苷酸（pC）的双链RNA，属于上述双链RNA的范畴之内。
本说明书中的可用灭活抗原或亚单位抗原中的任一种作为其抗原。
本说明书中的“粘膜施用”是指经粘膜施用的模式。本说明书中的“粘膜”是指脊椎动物中尤其与机体外部相通的中空性器官，如消化道器官、呼吸道器官、泌尿生殖道器官等的内壁。因此，粘膜施用包括，例如鼻腔施用（经鼻施用）、口腔施用、阴道施用、上呼吸道施用、肺泡施用等，但并不限定于此。优选鼻腔施用。鼻腔是流感病毒等呼吸道感染性疾病的感染路径，所以通过粘膜施用可诱导IgA反应。
本说明书中的“经鼻施用”是指通过鼻腔粘膜施用的方法。
本说明书中的“病原体”是指能使宿主产生疾病或发生紊乱的生物体。人类的病原体的例子包括，例如病毒、细菌、原生动物、立克次氏体、衣原体、真菌等，但并不限定于此。疫苗有效的病原体通常包括病毒、细菌等，但并不限定于此。
成为本说明书中对象的病毒可以是任何种类的病毒，包括DNA病毒、RNA病毒等，但并不限定于此。
作为人类病原体的病毒包括，例如水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、流感病毒、腺病毒、疱疹病毒、风疹病毒、SARS病毒（冠状病毒的一种）、HIV等，但并不限定于此。这些病毒中优选流感病毒。
成为本发明对象的细菌可以是任何细菌，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等，但并不限定于此。
成为人类病原体的细菌包括，百日咳杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌b型、肺炎链球菌、霍乱弧菌等，但并不限定于此。
本说明书中的“流感病毒”是属于正粘病毒科的单链RNA病毒。有脂质双层膜的外壳，由M1（膜蛋白）支持着，膜上镶嵌着M2、HA（血球凝集素）、NA（神经氨酸酶）、M2糖蛋白等特征性的膜蛋白。RNA分为8段，与核蛋白质一起形成复合体RNP（核糖核苷衣壳），与外壳支持蛋白M1微弱结合。
流感病毒的蛋白质中，HA和NA包裹在内质网膜中形成囊泡，经高尔基体运输到细胞表面。因此，HA或NA是良好的免疫原，可作为疫苗的主要原材料使用。
本说明书中的“足以产生分泌型IgA的浓度”是指佐剂或疫苗自身的能力，即施用后，诱导免疫应答时可产生分泌型IgA的佐剂或疫苗自身的浓度。可应用该领域公知的方法体外或体内达到该浓度。
本说明书中的“分泌型IgA”是指分泌型的IgA。IgA是外分泌液中主要的免疫球蛋白，在粘膜表面的感染防御中发挥作用。多存在于唾液、鼻涕、肠道、气管等分泌液中或初乳中，也存在于血清中。分泌型IgA的测定方法包括，例如免疫扩散法，但并不限定于此；作为示例的优选方法，可应用实施例中描述的方法。
（可在本发明中使用的一般生物化学方法的说明）
（疫苗的制备方法）
本说明书中疫苗中所含亚单位抗原或灭活抗原可如上所述通过灭活、纯化等从天然材料中制备，或通过遗传工程学技术制备多肽，或通过合成进行人工制备。通常，本发明的疫苗可这样制备：应用发育鸡蛋等使病毒增殖，使增殖的病毒灭活或从中分离纯化成分。
本说明书中，本发明的疫苗可以液态或干燥形式装在密封的小瓶、注射器、香水喷瓶等类似容器中，或加热密封的安瓿中。
制备流感病毒疫苗时，可应用以下程序，但并不限定于此。
目的流感病毒株的实例包括，例如A/Beijing/352/89(H3N2);A/Texas/36/91(H1N1);B/Panama/45/90;A/Georgia/03/93;A/NewCaledonia/20/99(H1N1);A//Panama/2007/99(H3N2);B/Shangdong/7/97;B/Johannesburg/5/99等，但不限定于此。
这些病毒，例如在9～11天龄的发育鸡胚中传代增殖，必要时可在培养细胞中（例如MDCK细胞）增殖。可根据Massicot等（Virology101，242－249（1980））记载的方法或其修饰方法纯化病毒。简而言之，将病毒悬浮液8000rpm离心（例如，Sorvall RC5C离心机，GS－3号转头），澄清，然后用Beckman19型转头18000rpm离心2小时，成团。
将成团的病毒再次悬浮到STE（0.1M NaCl，20mM Tris、pH7.4，1mM EDTA），4000rpm离心10分钟（HermleZ360K离心机），去除凝集物。将2ml上清覆盖到由2ml60％蔗糖和7ml STE缓冲的上层30％蔗糖构成的不连续蔗糖梯度上，36000rpm（SW－40转头，Beckman）离心90分钟。
在界面收集病毒带，用STE10倍稀释，30000rpm离心2小时（Beckman Ti45转头），成团。然后将成团的病毒－70℃冻存。
病毒的亚单位抗原可应用重组DNA技术通过培养（例如，CHO－K1细胞）进行生产。可利用pCXN（Matsunami K等，（Clinical&Experimental Immunology126（1），165－172（2001））等作为表达载体，但并不限定于此。将转化的细胞，溶解到可溶化缓冲液（8％Triton X－100、2M KCl、10mM磷酸钠缓冲液（pH7.0））等，加入等量PBS，混悬，通过例如360000rpm离心（例如，Beckman XL－70离心机，55.1Ti转头）回收可溶性级分。将回收的可溶性级分吸附到亲和层析柱上，与目的抗原或结合到其上的肽序列有特异性亲和性的蛋白质或肽，如单克隆抗体或多克隆抗体等结合到载体上，用0.1M甘氨酸－HCl、0.1％Tween80（pH2.7）等通过改变pH或其它改变而降低结合力的溶液进行洗脱，纯化。另外，也可应用溶剂萃取法、硫酸铵沉淀等盐析脱盐法、有机溶剂沉淀法、应用二乙氨乙基（DEAE）－Sepharose DIAION HPA-75(三菱化学)等树脂的阴离子交换色谱法、应用butyl-Sepharose或phenyl-Sepharose等树脂的疏水性色谱法，应用分子筛的凝胶过滤法、层析聚焦、等电聚焦电泳法等手段进行。用PBS等缓冲液透析纯化的抗原，－70℃冻存。
按这样的形式可获得疫苗。
（佐剂）
佐剂是与抗原联合应用能增加抗体产生、增强免疫应答的物质的总称。更优选的实施方案中使用经过调整的、有效的、无毒的佐剂。佐剂与通常的疫苗抗原一起使用，以诱导更快、更有效的免疫应答、或延长免疫应答。此外，这样的佐剂在抗原的供给有限、或抗原的产生昂贵时有用。
佐剂可分类为，例如矿物、细菌、植物、合成或宿主的产物。
第一类矿物佐剂，例如铝化合物。铝化合物作为佐剂的最初使用记载于1926年。此后，与铝化合物一起沉淀的抗原，或者与预先形成的铝化合物混合的或吸附到其上的抗原，用于增强动物和人类中的免疫应答。铝化合物及其类似的佐剂通过下面的机制发挥作用。铝与抗原物理结合形成粒子，可延迟注射后抗原的吸收速度，这样抗原与抗原提呈细胞，例如巨噬细胞或滤泡－树突状细胞间的相互作用时间延长。或者，佐剂还活化它们间的相互作用。已证实铝颗粒在免疫后7天出现在兔的局部淋巴结，其它有意义的功能有指引抗原到淋巴结自身的T细胞含有区域。佐剂的效力与所属淋巴结的活化具有相关性。尽管多数的研究证明与铝一起施用的抗原活化体液免疫，似乎仅轻微的增强细胞免疫。还有记载铝活化补体途径。该机制在局部炎症反应及免疫球蛋白的记忆中发挥作用。
铝化合物几乎是现在人类中使用的唯一安全的佐剂。但是含有铝的疫苗有时引起局部反应。过敏的发作通常不是临床中最大的问题，但铝化合物可通过T细胞依赖性机制将噬酸性细胞诱导到注射部位，抗原加强后诱导IgE的应答，因此可以说活化持有辅助IgE应答功能的特异细胞集团。
最近人们纯化、合成了细菌来源的佐剂（例如胞壁酰二肽，脂质A）。也克隆了宿主来源的免疫活性蛋白质（白细胞介素1和白细胞介素2）。最近，人们开始在实验室水平使用百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、脂多糖和氟氏完全佐剂（FCA）。
也有其它各种各样的物质作为佐剂使用。包括植物产生物，如皂角苷，动物产生物，如壳多糖，以及多种合成的化学物质。
本说明书中使用双链RNA作为佐剂。该双链RNA的制备方法可按照上述核酸分子的制备方法，应用该领域内众所周知的方法。作为示例可应用购自Sigma Aldrich Japan、YAMASA、Fluka的试剂盒。
Poly（I：C）也可应用该领域内众所周知的方法进行制备。这样的方法包括非专利文献1～3中描述的，例如优选将2个选择的均聚合物以等摩尔浓度混合到pH7.0（0.006M磷酸钠，0.15M氯化钠）的磷酸缓冲液中，但并不限定于此。混合后能立即形成复合体。
（计算机筛选）
为了进行蛋白质立体结构的筛选，可使用本发明的因子（例如抗原或灭活抗原、抗体）、多肽或核酸分子。也可使用应用现有物质的体内、体外等体系进行筛选，也可应用用silico－筛选（应用计算机系统）体系生成的文库进行筛选。本发明中可以这样理解，通过筛选获得的具有期望活性的化合物也包含在本发明的范围内。本发明还打算在本发明公开的基础上，提供通过计算机模型设计的药物。因此，通过这样的筛选而获得的药物可作为本发明的疫苗成分应用。
（疾病）
本说明书中能成为本发明目标的疾病包括通过施用疫苗能预防的任何疾病。这样的疾病包括细菌性疾病、病毒性疾病、过敏性疾病等，但并不限定于此，例如水痘、麻疹、腮腺炎脊髓灰质炎、轮状病毒、流感、风疹、重症急性呼吸道综合症（SARS）、百日咳、脑膜炎、霍乱、RS（呼吸道性多核体）病毒感染症、流感嗜血菌b型、肺炎球菌感染症、后天性免疫不全综合症（AIDS）等，但并不限定于此。
（治疗活性或预防活性的证明）
优选在人类使用前，在体外、然后体内、动物水平对本发明的化合物或药物组合物进行所期望的治疗活性或预防活性的试验。利用本领域的技术人员公知的技术即可测定化合物或组成物对细胞株和/或组织样品中的效果。按照本发明，用于确定是否指示施用特定化合物的体外方法包括观察抗原与抗体的结合。动物水平的试验是：与人同样施用疫苗，通过验证抗体效价的上升（例如，通过ELISA）、或细胞毒性T细胞的活化等来进行判断。
（用于预防的施用及组合物）
能在本发明的组合物、疫苗中使用的药学上可接受的载体包括抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味品、和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲剂、输送载体、稀释剂、赋形剂和/或药学上的佐剂，但不限定于此。代表性的，本发明的药物的施用模式是：包括疫苗或其修饰物或衍生物与1种或以上的生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物。例如，适宜的介质可以是注射用水、生理溶液、或人工脑脊液，其中可补充非经口输送的组合物中经常使用的其它物质。
本说明书中使用的可接受的载体、赋形剂或稳定剂对受者无毒性，优选使用的药量及浓度中无活性，例如包括磷酸盐、柠檬酸盐、或其它有机酸；维生素C、α-维生素E、低分子量多肽、蛋白质（例如，血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白）；亲水性聚合物（例如聚乙烯吡咯烷酮）；氨基酸（例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸）；单糖、二糖、和其它碳水化合物（包括葡萄糖、甘露糖、或糊精）螯合剂（例如EDTA）；糖醇（例如甘露醇或山梨醇）；盐形成抗衡离子（例如钠）；和/或非离子表面活性剂（例如吐温（Tween），聚丙二醇（pluronic）或聚乙二醇(PEG)）等，但不限定于此。
作为适宜的示例的载体包括中性缓冲生理盐水、或与血清白蛋白混合的生理盐水。优选应用适当的赋形剂（例如蔗糖）其生成物可形成冷冻干燥剂。也可根据需要包括其它的标准载体、稀释剂和赋形剂。其它示例的组合物包括pH7.0～8.5的Tris缓冲液或pH4.0～5.5的醋酸缓冲液，还可包含山梨醇或其它适当的替代物。
以下描述了本发明的药物组合物的普通制备方法。需要指出的是，可按照公知的制备方法制备动物药品组合物、类似药物、水产药物组合物、食品组合物及化妆品组合物等。
本发明的疫苗等，可配合药学可接受的载体非经口施用。
本发明的药物可以必要时通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂（参照日本药局方第14版或其最新版，Remington’sPharmaceutical Sciences,18thEdition,A.R.Gennaro,ed.,Mack PublishingCompany,1990等)，及具有期望纯度的糖链组合物混合，制备成冷冻干燥的块状或水溶液形式。
已知有各种各样的输送系统，本发明打算经粘膜施用。施用本发明的化合物所能使用的技术包括，例如脂质体、微粒子、微胶囊等。导入方法包括鼻腔内、阴道内、气道下、口腔内、直肠粘膜及肠粘膜等粘膜途径，但不限定于此。此时，可与其它生物学活性药物一起施用。可全身施用也可局部施用。经粘膜施用的时候，也可肺部施用，例如吸入器或喷雾器的使用，及应用喷雾剂的配方。
在特定的实施方案中，期望本发明的化合物或组合物不仅施用在施用部位的粘膜面而且施用在有可能增加IgA分泌的其它组织的粘膜面中。
本发明的预防方法中使用的组合物的量，本领域的技术人员根据使用目的、使用对象的疾病（种类等）、患者的年龄、体重、既往史等，可容易确定。本发明的处置方法对受验者（或患者）施用的频度，也可由本领域的技术人员根据使用目的、使用对象的疾病（种类、严重程度等）、患者的年龄、体重、既往史、及经历等，容易确定。作为频度，例如每日～数月1次（例如，1周1次～1个月1次），或者每年流行前施用1次。优选同时进行监测，1周～1个月施用1次，至少间隔1周进行加强免疫是有利的。更优选加强免疫的间隔至少约3周。
本发明的疫苗等的施用量根据受验者的年龄、体重、症状或施用方法等而异，无特殊限定，但通常成人每日经口施用时10mg~1g。粘膜（例如经鼻）施用时，0.001mg~10mg，优选0.1mg~1mg。
本说明书中“施用”是指本发明的疫苗等或含有它的药物组合物可单独、或与其它治疗剂联合应用于宿主。联合是指，例如作为混合物同时施用，或单个同时或并行或先后施用。其包括联合的药物作为治疗混合物一起施用的提示，还包括联合的药物分别但同时（例如对同一个体通过不同的粘膜）施用的程序。“联合”施用还包括分别施用化合物或药物中的一个，先给第一个然后给第二个。
本说明书中的“指示书（用法说明书）”是指给医师、患者等实施施用的人、诊断的人（可为患者本人）讲述施用本发明的药物等的方法或诊断方法。该用法说明书指出了实施本发明的诊断试剂、预防药物、药物等的程序。该用法说明书是按照实施本发明的国家的监督管理部门（例如日本的厚生劳动省，美国的食品药物监督局（FDA））规定的格式制成的，以获得其监督管理部门的承认为宗旨进行陈述。用法说明书即所谓的附加文书（package insert），通常写在纸上，但也不限定于此，例如以贴到瓶上的薄膜、电子媒体（例如，互联网提供的网页（website），电子邮件）方式提供。
判断按照本发明的方法进行预防处理完成，可通过使用商品化的测定或机器确定诱导出的抗体进行。
本发明还提供有一个或以上包含一种或以上本发明药物组合物的容器的药物包装或试剂盒。容器中附上按控制药品或生物制品制备、使用或销售的政府机关规定形式的布告，布告中指出制造、使用或销售在人类的施用得到了政府机关的批准。
（优选实施方案的说明）
以下说明本发明的优选实施方案。为了更好的理解本发明提供了以下实施方案，但本发明的范围不能限定于以下的描述。因此，很明显，本领域的技术人员参照本说明书中的描述可在本发明的范围内进行适当变动。
一方面，本发明提供经粘膜施用的疫苗。该疫苗包括A）双链RNA；B）病毒的亚单位抗原或灭活抗原。这里，双链RNA、病毒的亚单位抗原或灭活抗原可按照该领域内众所周知的方法进行制备。适于经粘膜施用的形式该领域内众所周知，例如包括液状或喷雾形式，但不限定于此。本发明证实，双链RNA与病毒的亚单位抗原或灭活抗原联合应用可提高气道粘膜的分泌型IgA，实际上有感染防御效果。目前的现实情况是大多数报道说双链RNA作为佐剂可产生抗体，但不发挥实际的感染防御效果，所以这是一个出乎意料的显著效果。
由于本发明的疫苗进行粘膜施用可达到显著效果，所以只要是经粘膜施用（例如经鼻施用、口腔内施用等）任何途径均可，但优选经鼻施用。
优选的实施方案中，成为本发明疫苗靶标的病原体可选自，例如水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、流感病毒、腺病毒、疱疹病毒、风疹病毒、SARS病毒、HIV、百日咳杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌b型、肺炎链球菌和霍乱弧菌。优选病原体为流感病毒。本发明有良好的效果，它提供实质上在历史上初次使用的，在流感病毒型（A型、B型）内株（例如H1N1等）内亚型间存在交叉反应的疫苗。由于有些情况下本发明存在克服型的壁垒的交叉反应，所以提示本发明实现了传统技术未达到的效果。由于流感病毒每年改变流行的模式，病毒自身也发生变化，所以传统上每年制备预测出的流感病毒的疫苗。但是，由于本发明能达到超越株、亚种间的交叉反应，所以即使不预测流行也能提供有效的流感疫苗。此外，由于不必要进行预测，所以利用长期保存的疫苗成为可能。
优选的实施方案中，本发明中使用的病原体的亚单位包含选自流感病毒HA、NA、M1、M2、NP、PB1、PB2、PA及NS2的亚单位。更优选提呈到表面的亚单位（例如HA、NA）。更优选使用多数个提呈到表面的亚单位（例如HA、NA）有利。通过使用提呈到表面的亚单位可更有效的诱导抗原抗体反应，从而诱导中和抗体。
优选双链RNA以足以诱导产生分泌型IgA的浓度存在。双链RNA的浓度为例如，0.1～10mg/ml，更优选0.5~2mg/ml，再更优选1mg/ml（例如0.8～1.2mg/ml）。
优选双链RNA以足以诱导产生分泌型IgA的大小提供。其大小，例如优选在102bp或以上，0～3×106bp，更优选300bp或以上，但不限定于此。本发明的双链RNA大小的上限无限定，例如大小的上限在108bp，但不限定于此。
优选的实施方案中，本发明的疫苗中使用的亚单位至少包括NA或HA更有利。包含其中的一个，更优选包含两个，可有效诱导中和抗体，达到抗病毒的效果。
双链RNA优选包含Poly（I：C），也可应用其它双链RNA（例如，Poly（A：U）、Poly（G：C）、其混合物等）。Poly（I：C）可应用任何形式的，既可进行核苷酸改变也可不改变。
其它方面，本发明提供预防感染性疾病的方法。它包括至少经粘膜施用一次疫苗的步骤，A）进行粘膜施用的疫苗，所述疫苗包括：a)双链RNA（优选Poly（I：C））；b)病原体的亚单位抗原。根据施用的部位，可以适当的形式进行疫苗的粘膜施用。经鼻施用时，可使用喷雾、涂布、或直接滴加疫苗液体等各种各样的方法。
疫苗的施用，优选至少进行两次有效。这样的免疫有时叫做加强免疫。通过进行加强免疫，可起到更高的感染防御效果。
进行多次疫苗施用时，间隔至少在1周或以上，更优选3周或以上。双链RNA、Poly（I：C）、抗原等的实施方案按本说明书中的上述方案进行。
其它方面，本发明提供预防感染性疾病的疫苗试剂盒，它包括：A）进行粘膜施用的疫苗，所述疫苗包括：a)双链RNA；b)病原体的亚单位抗原；B）指示至少一次经粘膜施用疫苗的说明书。该试剂盒可作为药品包装销售。说明书中以厚生劳动省等当局认可的形式描述了使用方法。疫苗的制备、施用方法按本说明书中上述描述进行。
（流感疫苗亚单位抗原的多肽形式）
1方面中，本发明提供用于感染性疾病的疾病、紊乱、或状况的预防、治疗或预后的组合物，它包括预防、治疗或预后上有效量的流感疫苗亚单位抗原、或其片段或其变异体，和双链RNA。这里，预防、治疗或预后上的有效量，可由本领域的技术人员应用该领域内公知的方法，参考各种参数进行确定。本领域的技术人员可容易的确定其有效量，例如根据使用目的、对象疾病（种类、严重程度等）、患者的年龄、体重、既往史等（例如参照《Vaccine Handbook》国立预防卫生研究所学友会编（1994）；《预防接种手册第8版》木寸三生夫、平山宗宏、琾春美编，近代出版（2000）；《生物学的制剂基准》细菌制剂协会编（1993）等）。
以下，以实施例为基础说明本发明，但以下实施例仅起到示例的目的。因此，本发明的范围不由实施例限定，而仅由权利要求的范围进行限定。
实施例
以下的实施例中，均在获得患者知情同意的情况下进行试验。动物的处理遵照国立感染症研究所及大阪大学的规定。以下实施例中使用的试剂均从购自Sigma Aldrich Japan、YAMASA公司、Fluka公司。
（实施例1.合成的双链RNA Poly（I：C）的佐剂作用）
本实施例中证实合成的双链RNA Poly(I:C)作为佐剂，引起对灭活病毒或亚单位抗原中和抗体的能力、及感染防御效果。
（材料）
小鼠：BALB/c小鼠（6周龄，雌性）
病毒：流感病毒H1N1（A/PR8）株（购自国立感染症研究所（东京都新宿区户山1－23－1））
疫苗：流感病毒H1N1（A/PR8）株H1N1（A/Beijing）株（国立感染症研究所）；H1N1（A/Yamagata）株（国立感染症研究所）；H3N2（A/Guizhou）株（国立感染症研究所）；乙醚处理灭活HA疫苗（财团法人阪大微生物病研究会、香川县观音寺市八幡町2－9－41）
佐剂：阳性对照CTB*（CTB（包括霍乱毒素B亚单位）、0.1％CT（霍乱毒素））、Poly（I：C）
（方法）
应用6周龄的BALB/c小鼠（日本SLC、东京），每组5只。将1μg PR8HA疫苗（国立感染症研究所、财团法人阪大微生物病研究会）分别与作为佐剂的0.1μg、1μg、3μg、10μg Poly（I：C）一起，以5μl分别接种到鼻腔内，3周后有佐剂或无佐剂经鼻接种同量的疫苗，再过两周后，每侧鼻腔接种1.2μl100pfu的PR8流感病毒，进行感染。设立仅10μg和1μg Poly（I：C）、仅PR8HA疫苗、无处置的组别作对照。感染3天后回收鼻腔洗涤液、血清，用ELISA法测定鼻腔洗涤液中的IgA、血清中的IgG，用应用MDCK细胞的空斑方法测定鼻腔洗涤液中的病毒滴度。
给同样经鼻免疫的小鼠感染20μl40LD50致死量（104.7EID50（表示50％发育鸡卵中感染性的病毒量的大约50000倍量），观察其生存。
为了观察用Poly（I：C）作佐剂的经鼻流感疫苗的交叉防御效果，将亚型不同的流感病毒H1N1（A/PR8）株H1N1（A/Beijing）株、H1N1（A/Yamagata）株、H3N2（A/Guizhou）株的疫苗与3μg Poly（I：C）一起经鼻接种，3周后仅接种疫苗，再过两周后每侧鼻腔接种1.2μl100pfu的PR8流感病毒，进行感染。感染3天后回收鼻腔洗涤液、血清，用ELISA法测定鼻腔洗涤液中的IgA、血清中的IgG，用应用MDCK细胞的空斑方法测定鼻腔洗涤液中的病毒滴度。
（结果）
用Poly（I：C）作佐剂的经鼻流感疫苗的抗体诱导和感染防御
评价Poly（I：C）的粘膜佐剂能力。6周前1μg PR8HA疫苗与0.1μg－10μg不等的Poly（I：C）一起经鼻接种，再两周前仅经鼻接种疫苗或与佐剂一起经鼻接种。图1中显示了鼻腔粘膜中的IgA抗体应答与血中IgG应答。为了观察Poly（I：C）用量依赖性的佐剂效果，Poly（I：C）的量从0.1μg－10μg阶段性增加，以观察其佐剂作用。使用最低量的0.1μg Poly（I：C）初次免疫时可见到鼻腔粘膜中IgA应答。鼻腔粘膜中诱导的IgA量依赖于Poly（I：C）的量，随其量的增加而增加，可看到其佐剂效果。二次免疫也使用Poly（I：C）时，用量1μg鼻腔洗涤液中IgA的分泌达100ng/ml或以上，仅初次免疫利用相同剂量时，添加3μg Poly（I：C）可特异性诱导100ng/ml或以上的IgA。血清中的IgG也同时进行监测，它与IgA的分泌相关。1μgPR8疫苗与Poly（I：C）一起4周间隔免疫两次时可获得1.5μg/ml的IgG.
另外，在同样的免疫条件下第二次免疫两周后，每侧鼻腔接种1.2μl100pfu的PR8流感病毒，进行感染。未接种疫苗的对照组中鼻腔洗涤液中病毒滴度达103pfu/ml，可见病毒增殖（图2）。但是，与Poly（I：C）并用的经鼻进行两次疫苗接种的组中，病毒增殖完全被抑制。另外，单独疫苗每次1μg或以上免疫两次的组中、仅初次免疫时使用3μg Poly（I：C）的组中完全未见到病毒抑制效果（图2）。
此外，仅初次并用1μg、0.1μg Poly（I：C）的组中也看到100.8pfu/ml、101.6pfu/ml显著的病毒增殖抑制效果。仅疫苗施用两次的组中完全未见到病毒抑制效果。
为了证明双链RNA的结构对Poly（I：C）的佐剂作用非常重要，将Poly（I：C）100℃加热5分钟，立即冰上冷却，取1μg与疫苗一起经鼻接种。结果，IgA应答由未变性时的121μg/ml骤减到21μg/ml，血中的IgG由1.5μg/ml减到0.7μg/ml。
此外，Poly（I：C）变性后也未观察到病毒的增殖抑制效果。
接下来探讨Poly（I：C）并用经鼻疫苗接种时对致死量的流感病毒感染引发的肺炎防御效果。6周前1μg PR8疫苗与10μg、3μg、1μg Poly（I：C）一起经鼻接种，两周前仅加强免疫疫苗，20μl40LD50的PR8病毒感染后，检测肺炎的防御能力。未实施疫苗的组中，小鼠1周内死亡5/5，3日后肺部的病毒滴度达106pfu/ml或以上。但是疫苗组中，并用1μg或以上Poly（I：C）时，所有的小鼠均生存。结果如下所示。
Figure BDA00002830668400191
由此表明，Poly（I：C）作为佐剂在感染预防中可诱导足够的粘膜IgA抗体应答。
（实施例2：与Poly（I：C）并用的经鼻疫苗的交叉防御）
关于与Poly（I：C）并用的经鼻流感疫苗诱导的流感感染防御，探讨其对交叉感染的防御能力。将PR8与亚型不同的流感病毒株H1N1（A/Beijing）株、H1N1（Yamagata）株、H3N2（A/Guizhou）株的疫苗与3μg Poly（I：C）一起，初次免疫4周后仅接种同一株的疫苗，再过两周后感染100pfu的H1N1（A/PR8）株。感染3天后测定鼻腔洗涤液中与PR8交叉反应的IgA、血清中的IgG。另外，通过PR8病毒的交叉防御对感染防御进行检测。
如图3、4所示，同一亚型的H1N1（A/Beijing）株、H1N1（A/Yamagata）株，IgA、IgG应答均可见到，也可完全抑制病毒的感染。见到少量对亚型不同的H3N2（A/Guizhou）株产生交叉反应的IgA、IgG，可部分防御病毒的感染。
由此可以确认与Poly（I：C）并用的经鼻疫苗的交叉防御作用。
（实施例3：Poly（I：C）对中枢神经的安全性）
Poly（I：C）作为人类的经鼻疫苗应用时，由于鼻腔接近脑部，所以对中枢神经的安全性非常重要。于是以确认Poly（I：C）的安全性为目的，进行BALB/c小鼠的脑内接种试验。将0.25μg、2.5μg、25μg的Poly（I：C）溶解到25μlPBS中，用双针注射器进行脑内接种。测定接种后的体重变化或观察生存期。将25μg、10μg、25μg的CTB*（CTB、0.1％CT）同样溶解到25μlPBS中，作为对照进行脑内接种。
如图5所示，Poly（I：C）脑内接种组的小鼠，全组均生存两周或以上，仅25μg接种组中见到5％的体重减少。另一方面，作为脑内接种对照CTB*（CTB、0.1％CT）的组中，10μg施用组1/5只小鼠、25μg施用组2/5只小鼠分别在第4天死亡，体重也减少15％。
（讨论）
许多研究结果表明在流感病毒的感染性防御过程中，粘膜的分泌型IgA抗体比现行疫苗诱导的IgG抗体更为有效。经鼻疫苗对粘膜的IgA有效，尽管人们做了很多尝试，但目前尚未确立在人类中能够使用的佐剂。合成的双链RNA Poly（I：C）能顺利地在人体静脉内使用，对IgA诱导有效，可考虑作为经鼻疫苗的佐剂在人类应用。
从本实施例的实验结果判断，Poly（I：C）作为对粘膜中流感病毒感染防御有效的经鼻疫苗佐剂的有用性高。还可考虑用于其它病原体的粘膜疫苗。
由粘膜分泌的特异性IgA抗体在流感等呼吸道感染的防御中非常有效。型间不同病毒的交叉防御主要由粘膜分泌的IgA抗体承担，自然罹患流感恢复的人中，诱导出的IgA抗体对同亚型变异的病毒的流行有感染防御效果。未感染个体的感染防御方法有疫苗接种，但现在应用的皮下接种的疫苗不能诱导粘膜免疫应答，所以期望开发持有交叉防御能力、有更好效果的疫苗。诱导粘膜中分泌型IgA抗体有经鼻抗原接种的方法，但仅接种抗原不能诱导足够的抗体应答，所以为了更有效的免疫应答，有必要与疫苗同时使用佐剂。
本实施例中，发明者们应用合成的双链RNA Poly（I：C）作为有效诱导粘膜免疫的佐剂，证实了鼻腔粘膜中的IgA分泌、血清中的IgG应答和对致死量的流感病毒感染的防御。
免疫应答包括对与疫苗株亚型不同的病毒诱导抗体，或者对与疫苗株亚型不同的病毒感染有防御作用，能确认有交叉防御能力。考虑到经鼻疫苗对人类应用时，存在佐剂的安全性问题。由于这次应用的经鼻接种的施用部位是非常接近中枢神经的部位，所以脑内接种了0.25μg～25μg/小鼠的Poly（I：C），以确认其对神经系统的影响及安全性。结果，作为对照的霍乱毒素B亚单位中添加0.1％全毒素的霍乱毒素（CTB）组，第4天可见到死亡的小鼠（10μg施用组1/5只小鼠、25μg施用组2/5只小鼠），体重也减少15％。与此相对，Poly（I：C）施用组所有小鼠均均生存8天，仅25μg接种组中见到一过性5％的体重减少，即使过量的脑内接种也未见到死亡，其安全性也可得到确认。
现行的灭活流感HA疫苗是有效的疫苗，但由于在流感病毒的入侵门户呼吸道粘膜上皮诱导IgA抗体的能力低，所以考虑通过改善这种状况，可能进一步增强其效果。本实施例的实验中显示，Poly（I：C）作为佐剂加入到现行的灭活流感HA疫苗，通过经鼻施用，可在粘膜表面高效诱导病毒特异的IgA。另外，在小鼠的实验中提示，防御了病毒攻击造成的致死性感染，且在不同株病毒的攻击中也有效。
另外，作为利用的可能性，除流感病毒以外，还可考虑作为呼吸道其它粘膜途径感染的病原体（水痘病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、冠状病毒、腺病毒、疱疹病毒、风疹病毒、SARS病毒、HIV、百日咳杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌b型、肺炎链球菌和霍乱弧菌等）的灭活抗原疫苗的佐剂利用。
（实施例4：灭活病毒颗粒与Poly（I：C）并用作为经鼻流感疫苗时的防御效果）
不仅验证使用现行的乙醚处理HA（片段疫苗（Split－productvaccine）），而且验证使用其它形式的疫苗时，并用Poly（I：C）的经鼻疫苗的有效性。
（材料）
疫苗：乙醚处理HA疫苗（财团法人阪大微生物病研究会）、福尔马林灭活全病毒颗粒疫苗（Inactivated whole particle vaccine）、A/New Caledonia/20/99（H1N1）病毒）（财团法人阪大微生物病研究会）
小鼠：BALB/c小鼠（6周龄、雌性）
（方法）
将A/New Caledonia/20/99（H1N1）病毒的福尔马林灭活全病毒颗粒疫苗（0.1μg）与Poly（I：C）（100-1000bp，Sigma）（0.1μg）并用，作为经鼻疫苗流感疫苗的疫苗成分，施用给BALB/c小鼠（6周龄、雌性），3周后第二次施用同样的疫苗。
1周后以小鼠鼻腔洗涤液和血清中针对HA和NA的抗体应答分别作为粘膜和全身保护免疫的指标进行测定。
（结果）
灭活全病毒颗粒与Poly（I：C）并用，作为经鼻流感疫苗的疫苗成分应用时，也可提高粘膜的保护免疫和全身的保护免疫。
并且，即使分别应用0.1μg疫苗和Poly（I：C）也显示出与阳性对照组同等的应答，所述阳性对照指片段疫苗和CTB*并用预期的完全阻止病毒感染佐剂活性的。而且，该应答比片段疫苗和Poly（I：C）并用时还高。因此，由此阐明不仅片段疫苗，使用其它形式的疫苗时，并用Poly（I：C）的经鼻疫苗的有效性（图6）。
（实施例5：作为经鼻流感疫苗佐剂的Poly（I：C）分子的大小）
探讨作为经鼻流感疫苗的佐剂有用的Poly（I：C）分子的大小
（材料）
病毒：A/New Caledonia/20/99（H1N1）病毒
Poly（I：C）大小：（L）10-300bp(Fluka)、(M)100-1000bp(Sigma)、(H)＞3.3×106bp(Fluka)
小鼠：BALB/c小鼠（6周龄、雌性）
（方法）
将A/New Caledonia/20/99（H1N1）病毒的片段疫苗（0.4μg）与0.1μg各种大小的Poly(I：C）10-300bp(Fluka)、(M)100-1000bp(Sigma)、(H)＞3.3×106bp(Fluka)一起经鼻施用给BALB/c小鼠（6周龄、雌性），3周后第二次施用同样的疫苗。1周后以小鼠鼻腔洗涤液和血清中针对HA和NA的抗体应答分别作为粘膜和全身保护免疫的指标进行测定。
（结果）
Poly（I：C）分子的大小为10-300bp的实验组比其它两组的粘膜免疫应答低。因此，认为作为经鼻流感疫苗的佐剂有用的Poly（I：C）分子的大小应在300bp或以上（图7）。
（实施例6：Poly（I：C）以外的双链RNA的佐剂作用）
比较Poly（I：C）与其它双链RNA Poly（A：U）及单链RNA Poly（A，U）作为经鼻流感疫苗的佐剂的作用。
（材料）
亚单位：纯化HA
佐剂：Poly（I：C）、Poly（A：U）、Poly（A，U）
（方法）
应用结合了特异抗HA单克隆抗体的柱子从A/NewCaledonia/20/99（H1N1）病毒纯化HA分子，取1μg与1μg Poly（A：U）（Sigma）和单链Poly（A，U）（Sigma）一起经鼻施用给BALB/c小鼠（6周龄、雌性），3周后第二次施用同样的疫苗。1周后以小鼠鼻腔洗涤液和血清中针对HA的抗体应答分别作为粘膜和全身保护免疫的指标进行测定。
（结果）
Poly（A：U）和单链Poly（A，U）也观察到佐剂活性。与Poly（I：C）的佐剂活性相比，Poly（A：U）、单链Poly（A，U）顺次降低（图8）。
因此，验证了Poly（I：C）以外的双链RNA与经鼻流感疫苗并用时也具有佐剂活性。
（实施例7：在Poly（I：C）并用的经鼻施用条件下，几个流感病毒亚单位诱导的保护免疫）
在Poly（I：C）并用的经鼻施用条件下，验证几个流感病毒亚单位诱导的保护免疫。
（材料）
亚单位：HA、NA、M1和NP
佐剂：Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)
小鼠：BALB/c小鼠（6周龄、雌性）
（方法）
比较与Poly（I：C）一起经鼻施用的流感病毒亚单位HA、NA、M1和NP诱导保护免疫的能力。即，应用结合了特异单克隆抗体的柱子从A/New Caledonia/20/99（H1N1）病毒纯化HA、NA、M1和NP分子，取1μg与1μg Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)一起经鼻施用给BALB/c小鼠（6周龄、雌性），3周后第二次施用同样的疫苗。1周后以小鼠鼻腔洗涤液和血清中针对HA和NA的抗体应答分别作为粘膜和全身保护免疫的指标进行测定。
（结果）
提示对无论哪种类型的亚单位，Poly（I：C）均能增强其粘膜和全身免疫应答。对HA和NA，能通过增强体液免疫而提高防御效果，但对于NP未通过增强体液免疫而提高防御效果。因此明确，HA和NA是强保护原，通过亚单位诱导的防御能力不同。
（实施例8：提高Poly（I：C）并用经鼻流感疫苗有效性的施用次数和施用间隔）
验证提高Poly（I：C）并用经鼻流感疫苗有效性的施用次数和施用间隔。
（材料）
疫苗：病毒A/New Caledonia/20/99（H1N1）的片段疫苗（1μg）
佐剂：Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)
小鼠：BALB/c小鼠（6周龄、雌性）
（方法）
为了探讨提高与Poly（I：C）并用的经鼻流感疫苗有效性的施用次数和施用间隔，将A/New Caledonia/20/99（H1N1）病毒的片段疫苗（1μg）与1μg Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)一起经鼻施用给BALB/c小鼠（6周龄、雌性），1、3、4、6周后第二次施用同样的疫苗。1或两周后以小鼠鼻腔洗涤液和血清中针对HA和NA的抗体应答分别作为粘膜和全身保护免疫的指标进行测定。此时设立了仅施用1次的1周及8周后的实验组。
（结果）
1周或以上的间隔施用两次，对提高Poly（I：C）并用经鼻流感疫苗的有效性有效（图9）。
（实施例9：Poly（I：C）并用经鼻流感疫苗在人中的防御效果）
通过抗流感抗体的应答验证Poly（I：C）并用经鼻流感疫苗在人中的防御效果。
（材料）
疫苗：现行流感的三价疫苗[A/New Caledonia/20/99（H1N1）、A/Panama(H3N2)、B/Shangdong3株病毒来源的片段疫苗]（财团法人阪大微生物病研究会）
佐剂：Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)
（受验者）
健康人2～数名。
（方法）
将含有400μg/ml三价疫苗和700μg/ml Poly（I：C）的液体300μl（左右鼻腔各150μl）喷雾施用给健康成年人，4周后再次施用。再次施用后第二周采集唾液和血清材料，测定针对HA和NA的抗体应答。通过比较施用前、二次施用后的抗体效价来评价该经鼻疫苗的抗体应答诱导能力。
（结果）
观察到受验者的唾液中针对疫苗中3株病毒的IgA抗体增加。
另外，在部分受验者中观察到血清中的抗NA－IgG抗体和HI抗体上升。
（实施例10：Poly（I：C）与百日咳疫苗一起经鼻施用时免疫能力的增强）
验证Poly（I：C）与流感以外的感染性疾病百日咳疫苗一起经鼻施用时免疫能力的增强。
（材料）
疫苗：百日咳疫苗（财团法人阪大微生物病研究会）
佐剂：Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)
小鼠：BALB/c小鼠（6周龄、雌性）
（方法1）
将百日咳疫苗（财团法人阪大微生物病研究会）（1～3μg）与0.1～10μg Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)一起经鼻施用给BALB/c小鼠（6周龄、雌性），3周后第二次施用同样的疫苗。用ELISA法测定第二次施用后1周小鼠鼻腔洗涤液和血清中针对百日咳疫苗的抗体应答，作为粘膜和全身保护免疫的指标。
（结果）
Poly（I：C）也能提高针对百日咳疫苗的保护免疫，这提示Poly（I：C）对流感以外的感染性疾病的疫苗也能有效增强其保护免疫能力（图10）。
（方法2）
将百日咳疫苗（财团法人阪大微生物病研究会）（1～3μg）与0.1～10μg Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)一起经鼻施用给BALB/c小鼠（6周龄、雌性），3周后第二次施用同样的疫苗。用ELISA法测定第二次施用后1周小鼠鼻腔洗涤液和血清中针对百日咳疫苗的抗体应答，作为粘膜和全身保护免疫的指标。此外，在第二次施用2～3周后，将百日咳杆菌强毒素接种到免疫小鼠的脑内或鼻腔内（喷雾），观察14天，根据免疫小鼠的生存率推断其效果。
（结果）
从生存率来看，Poly（I：C）也能提高针对百日咳疫苗的保护免疫，这验证了Poly（I：C）对流感以外的感染性疾病的疫苗也能有效增强其保护免疫能力（图10）。
（实施例11：Poly（I：C）与水痘疫苗一起经鼻施用时在人中的防御效果）
关于成人中作为加强接种给予Poly（I：C）并用经鼻水痘活疫苗时的安全性和有效性，通过鼻腔粘膜接种法进行，与单独使用水痘疫苗的经鼻接种组比较体液免疫和细胞免疫。
（材料）
疫苗：水痘活疫苗（财团法人阪大微生物病研究会）
佐剂：Poly（I：C）100-1000bp(Sigma)
健康人2～数名。
（方法）
将注射用生理盐水加到水痘活疫苗2瓶/人中，用喷雾器经鼻接种到健康成年人中。另外，将含有现行疫苗与Poly（I：C）（100-1000bp(Sigma)）的疫苗液体300μl（左右鼻腔各150μl）喷雾施用。通过测定体液免疫和细胞免疫来确认防御效果。
（结果）
Poly（I：C）也能提高针对水痘活疫苗的保护免疫，这提示Poly（I：C）对流感以外的感染性疾病的疫苗也能有效增强其保护免疫能力。
如上，应用本发明的优选实施方案示例了本发明，但应理解为本发明的范围仅在权利要求中阐明。本说明书中引用的专利、专利应用和文献应理解为，其内容在本说明书中有具体描述，同样其内容在本说明书中作为参考引用。
产业上利用的可能性
本发明提供一种能通过粘膜施用简单进行疫苗接种，且能获得交叉免疫的疫苗形式。例如，在制定流感病毒策略中，可制备有效的疫苗，有可能在用于制定有效预防措施的药物等产业中被广泛利用。

Claims (14)

1.一种经粘膜施用的疫苗，其包括：
A）双链RNA，及
B）流感病毒的亚单位抗原或其灭活抗原。
2.权利要求1的疫苗，其中所述粘膜包括鼻腔粘膜。
3.权利要求1的疫苗，其中所述亚单位包括至少一种选自流感病毒的亚单位HA、NA、M1、M2、NP、PB1、PB2、PA及NS2。
4.权利要求1的疫苗，其中所述双链RNA以足以诱导产生分泌型IgA的浓度存在。
5.权利要求1的疫苗，其中所述双链RNA的浓度为0.1～10mg/ml。
6.权利要求1的疫苗，其中所述双链RNA的大小为102～108bp。
7.权利要求1的疫苗，其中所述亚单位至少包括NA或HA。
8.权利要求1的疫苗，其中所述双链RNA包含Poly（I：C）。
9.双链RNA和流感病毒的亚单位抗原或其灭活抗原在制备用于通过粘膜施用时在株间能诱导保护性免疫反应的疫苗中的用途。
10.权利要求9所述的用途，其中所述双链RNA包含Poly（I：C）。
11.一种预防感染性疾病的疫苗试剂盒，包括：A）进行粘膜施用的疫苗，所述疫苗包括：a)双链RNA；和b)流感病毒的亚单位抗原或其灭活抗原；及B）指示至少一次经粘膜施用所述疫苗的说明书。
12.权利要求11所述的试剂盒，其中所述疫苗的施用至少进行两次。
13.权利要求11所述的试剂盒，其中所述疫苗的施用间隔至少在1周或以上。
14.权利要求11所述的试剂盒，其中所述双链RNA包含Poly（I：C）。
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