WO2005014038A1 - 粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン - Google Patents

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virus
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double
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Hideki Hasegawa
Takeshi Kurata
Tetsutarou Sata
Masami Moriyama
Shin-Ichi Tamura
Takefumi Tanimoto
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The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University
Japan As Represented By The Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases
Toray Industries, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel vaccine configuration. More specifically, the present invention relates to a novel vaccine using double-stranded RNA as adjuno.
  • influenza viruses particularly influenza A virus
  • influenza A virus have significant antigenic mutations, which produce viruses that are not neutralized by antibodies produced by previous vaccines (ie, previously acquired infections).
  • the efficacy of the vaccine often ends in only one season.
  • novel strains that differ immunologically due to point mutations (continuous antigenic mutations) in genes encoding surface glycoproteins (hemagglutinin [hemagglutinin; HA] and neuraminidase [NA]) and discontinuous mutations in antigens Often occurs.
  • the internal protein is relatively highly conserved in the continuous mutant and the discontinuous mutant.
  • Current vaccine immunization only elicits allogeneic humoral immunity, not common immunity based on cell-mediated immunity, and the effect is diminished if the strain is different from the prevalent strain. become.
  • the predominant strain of influenza virus even if the strain is not discontinuous or continuous over the next year, the immunization must be performed every year because the antibody titer decreases. There is also. Hemagglutination-inhibiting (HI) and neutralizing antibodies have been reported to persist for months to years and then decline gradually. However, even if no such reduction is seen, annual vaccination is recommended. This is because antibody titers may decrease within the year following vaccination.
  • HI Hemagglutination-inhibiting
  • neutralizing antibodies have been reported to persist for months to years and then decline gradually. However, even if no such reduction is seen, annual vaccination is recommended. This is because antibody titers may decrease within the year following vaccination.
  • mucosal for example, nasal
  • conventional vaccines for example, nasal
  • inactivated subcutaneously inoculated vaccines and component vaccines which are the mainstream for influenza virus and the like.
  • mucosal immunity cannot be induced, and a vaccine composition capable of inducing such mucosal immunity has been desired.
  • Influenza vaccines in which a mixture of two strains of A and one strain of B are predominant, also need to be developed, especially those that make prediction unnecessary or at least reduced.
  • Non-Patent Document 1 I. Clinical Investigation, 110 (8), 1175-1184, (2002)) discloses a UV-inactivated whole (whole) influenza virus using Poly (I: C) as an adjuvant via the respiratory tract. It is disclosed that it was administered. However, it is shown in FIG. 2 of Non-Patent Document 1 that the rise of IgG antibody is not different from the case where Poly (I: C) is not added. Therefore, it is suggested that Pol y (I: C) is not very effective as an adjuvant. In addition, it describes that a short-chain phospholipid is used in combination to elevate the antibody.
  • Non-Patent Document 2 Invest. Ophthalmol., 10 (10), 750-759 (1971)
  • Non-Patent Document 3 Invest. Ophthalmol., 10 (10), 760-769, (1971)
  • Non-Patent Document 2 describes that the production of IgA antibody in tears increases, but mentions the effect of preventing infection.
  • Patent document 1 Japanese Patent Publication No. 50-2009 (US3906092) Merck & Co discloses that the addition of a polynucleotide (including Poly (I: C)) to an adsorbent adjuvant enhances the antibody reaction of influenza vaccine. Is disclosed. However, Patent Document 1 does not mention the effect of preventing infection.
  • a polynucleotide including Poly (I: C)
  • Non-patent document 4 discloses that after intraperitoneal inoculation of an inactivated vaccine using Poly (I: C) as an adjuvant, IgG and IgM Although a significant increase was reported, no effect was shown by mucosal administration to the nasal cavity, etc., and the effect of preventing infection was mentioned.
  • Non-Patent Document 5 Pro So Exp. Biol. & Med., 133, 334—338 (1970)
  • sheep erythrocytes When sheep erythrocytes are immunized intravenously with Poly (I: C) as an adjuvant, they report an increase in blood antibodies. .
  • Non-Patent Document 6 (The Journal of Immunology, 149, 981-988 (1992)) does not disclose any force double-stranded RNA that describes the possibility of cholera toxin as an adjuvant.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 50-2009
  • Non-patent document 1 J. Clinical Investigation, 110 (8), 1175-1184, (2002) Non-patent document 2: Invest, Ophthalmol., 10 (10), 750-759 (1971))
  • Non-Patent Document 3 Invest.Ophthalmol., 10 (10), 760-769, (1971)
  • Non-patent document 4 Veterinary Microbiology, 88 (4), 325 '338, (2002) Non-patent document 5: Pro So Exp. Biol. & Med., 133, 334-338 (1970) Non-patent document 6: The Journal of Immunology, 149, 981-988 (1992)
  • the present invention provides an adjuvant which has adjuvant ability more than conventional adjuvants and can provide a protective response across strains when administered mucosally. Make it an issue.
  • the current inactivated influenza HA vaccine improves potency, which is an effective vaccine, and the induction of IgA antibodies in the respiratory mucosal epithelium, which is a gateway for influenza virus, is improved. It is thought that the effect can be further enhanced.
  • Ts Toll-like receptors
  • the present invention provides the following.
  • the pathogens include varicella virus, measles virus, mumps virus, and poliowill Virus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, rubella virus, severe acute respiratory syndrome virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus), human immunodeficiency virus (SARS virus),
  • the vaccine according to item 1 which is selected from the group consisting of HIV), B. pertussis, meningococci, influenza b, pneumonia and cholera.
  • Item 3 The vaccine according to item 1, comprising at least one subunit selected from the group consisting of Bl, PB2, PA and NS2.
  • the double-stranded RNA is present at a concentration sufficient to produce secretory IgA.
  • the vaccine according to 1.
  • a mucosal administration of the vaccine at least once.
  • RNA double-stranded RNA
  • pathogen subunit antigen or inactivated antigen a) double-stranded RNA
  • a vaccine form which can be easily vaccinated by mucosal administration and can obtain cross immunity.
  • an effective vaccine can be produced for an influenza virus without predicting an epidemic strain, and efficient preventive measures can be taken.
  • FIG. 1 is data showing the adjuvant effect of Poly (I: C), exemplified in the examples.
  • the left column shows the dosage form
  • the middle column shows the amount of IgA in the nasal wash
  • the right column shows the amount of IgA in the serum.
  • FIG. 2 is data showing the adjuvant effect of Poly (I: C), exemplified in the examples.
  • the left column shows the administration mode, and the right column shows the survival status of the virus.
  • FIG. 3 is a diagram showing the IgA-inducing effect of vaccination of the present invention on various virus strains.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of the vaccination of the present invention on various virus strains to suppress the growth of viruses.
  • FIG. 5 is a diagram showing the toxicity of the vaccination of the present invention in the brain. Above Poly (I: C) of the present invention is shown, and the lower part shows CTB * of a positive control.
  • FIG. 6 shows the immunological effect when inactivated virus particles were used as nasal influenza vaccine in combination with Poly (I: C): anti-HA and anti-NA antibody titers in nasal washes and serum
  • Fig. 7 shows the immunological effect of inactivated virus particles when used as a nasal influenza vaccine in combination with various sizes (L, M, H) of Poly (I: C): nasal washings and serum HA And the anti-NA antibody titer.
  • FIG. 8 shows the immunological effect when used as a nasal influenza vaccine using double-stranded RNA or single-stranded RNA in combination with subunit HA: anti-HA antibody titers in nasal washes and serum.
  • Fig. 9 shows the results showing the efficacy of a poly (I: C) combined nasal vaccine at two or more doses at one week or more intervals.
  • FIG. 10 shows the results showing that Poly (l: C) also enhances protective immunity against a pertussis vaccine and is also effective in enhancing protective immunity against a vaccine against infectious diseases other than enza.
  • a "vaccine” refers to an antigenic suspension or solution containing an infectious agent or a portion of an infectious agent that is administered into the body to produce active immunity.
  • the antigenic portion of a vaccine is a microorganism (eg, a virus or bacterium) or a natural, synthetic or engineered protein, peptide, polysaccharide or similar product purified from a microorganism. obtain.
  • Live vaccines include, but are not limited to, BCG, vaccinia, polio, chickenpox, rubella, mumps, rinderpest, NDV, Marek's disease, and the like.
  • Inactivated vaccines include pertussis, diphtheria ( Xinoid), tetanus (toxoid), influenza, Japanese encephalitis, etc., but are not limited thereto.
  • the term “inactivated antigen” refers to an antigen that has been used as an antigen for a vaccine and has lost infectivity, and is a virion that is a complete virus particle, an incomplete virus particle, a virion component particle, Examples include, but are not limited to, non-structural viral proteins, protective antigens, epitopes of neutralization reactions, and the like.
  • the term “inactivated antigen” refers to an antigen that loses infectivity but retains immunogenicity.
  • an antigen When such an antigen is used as a vaccine, it is referred to as an "inactivated vaccine.”
  • inactivated antigens include those that have been inactivated by physical (eg, X-ray irradiation, heat, ultrasonic) or chemical (formalin, mercury, alcohol, chlorine) operations. Is not limited to them.
  • the subunit antigen itself also falls within the definition of an inactivated antigen, since the infectivity is usually lost. Alternatively, a dead virus may be used.
  • the "subunit antigen" of a virus is also referred to as a "component,” and such a subunit antigen is obtained by a synthetic or recombinant technique that can be purified from a pathogen such as a natural virus. It may be produced. Such methods are well known and commonly used in the art, and can be carried out using commercially available instruments, reagents, vectors, and the like.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • Ml, M2 matrix
  • NS non-structure
  • PA polymerase
  • NP nuclear protein
  • an "adjuvant” is a substance that, when admixed with an administered immunogen, increases or otherwise alters the immune response.
  • CT is an exotoxin produced by Vibrio cholerae, and refers to a substance causing diarrhea caused by Vibrio cholerae infection. Cholera toxin has been used as an effective adjuvant and has not been used in clinical applications due to its toxicity. Therefore, CT is usually used as a positive control when searching for an effective adjuvant for the vaccine.
  • double-stranded RNA refers to any double-stranded RNA. The size can be measured, for example, by gel electrophoresis. Conventionally, attempts have been made to use double-stranded RNA as an adjuvant for vaccines. There have been few reports that power vaccines were effective in protecting against infection. Such double-stranded RNA includes, but is not limited to, Poly (I: C), Poly (A: U), Poly (G: C), and the like.
  • Poly (I: C) is a double-stranded RNA containing polyinosinic acid (pi) and polycytidic acid (pC). Get in range.
  • an inactivated antigen or a subunit antigen can be used as the antigen.
  • mucosal administration refers to an administration form via mucosa.
  • mucosa refers to the inner wall of a visceral, respiratory, or genitourinary tract, particularly an extrinsic luminal organ, in a vertebrate.
  • mucosal administration includes, but is not limited to, nasal administration (nasal administration), buccal administration, vaginal administration, upper respiratory tract administration, alveolar administration, and the like.
  • nasal administration is advantageous.
  • the nasal cavity is also a transmission route for respiratory infections such as influenza virus, so that mucosal administration can cause an IgA response.
  • nasal administration refers to an administration method via the nasal mucosa.
  • pathogen refers to an organism that can cause a disease or disorder in a host. Pathogens for humans include, but are not limited to, for example, viruses, bacteria, protozoa, rickettsia, chlamydia, fungi, and the like. A vaccine is typically effective, but is not limited to, viruses, bacteria, and the like.
  • the virus targeted in the present specification includes, but is not limited to, DNA-inoles and RNA viruses, which can be of any type.
  • Viruses that are pathogens for humans include, for example, varicella virus, measles virus, mumps virus, polio virus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, rubella virus, SARS virus (coronavirus) ), HIV, but not limited to them.
  • a virus is preferably an influenza virus.
  • the bacteria targeted by the present invention include, but are not limited to, Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, which can be any bacteria.
  • Bacteria that are pathogens for humans include, but are not limited to, B. pertussis, meningococcus, influenza b, pneumonia and cholera.
  • the term "influenza virus” refers to a -chain RNA virus belonging to the family Orthomyxoviridae. It has an envelope of lipid bilayer membrane, backed by Ml (membrane protein), and its membrane is filled with characteristic membrane proteins such as M2, HA (hemagglutinin), NA (neuraminidase) and M2 glycoprotein .
  • M2 membrane protein
  • HA hemagglutinin
  • NA neuroaminidase
  • M2 glycoprotein glycoprotein
  • HA and NA are formed in a manner in which they are embedded in the endoplasmic reticulum membrane, and exit the cell surface via the Golgi apparatus. Therefore, HA and / or NA are good immunogens and have been used as the main source of vaccines.
  • concentration sufficient to produce secretory IgA refers to the ability of an adjuvant or vaccine itself to produce secretory IgA when an immune response occurs after administration. Refers to the concentration of the adjuvant or vaccine itself. Such concentrations can be performed in vitro or in vivo using methods known in the art.
  • secretory IgA refers to secretory IgA.
  • IgA is the major immunoglobulin in the exocrine fluid and helps prevent infection on mucosal surfaces. It is often found in secretions such as saliva, nasal secretions, intestines and trachea, or in colostrum, but is also present in serum. Examples of such a method for measuring secretory IgA include, but are not limited to, an immunodiffusion method, and an exemplary preferred method is that described in the Examples. .
  • the subunit antigen or inactivated antigen contained in the vaccine herein can be produced from a natural material by inactivation, purification, or the like from the vaccine.
  • the polypeptide can be prepared by genetic engineering or artificially produced by synthesis.
  • the vaccine of the present invention can be produced by multiplying a virus or the like using embryonated chicken eggs or the like, inactivating the multiplied virus or the like, or separating and purifying a neutral component thereof.
  • the vaccine of the present invention can be provided in a liquid or dried form in a sealed vial, a syringe, an atomizer or the like, or a sealed ampoule.
  • the target influenza virus strain includes, for example, A / Beijing / 352/89 (H3N2); A / Texas / 36/91 (H1N1); B / Panama / 45/90; A / Georgia / 03 / 93; A / New Caledonia / 20/99 (H1N1), A / Panama / 2007/99 (H3N2); B / Shangdong / 7/97; B / johannesburg / 5/99, but are not limited thereto. .
  • viruses are propagated, for example, by passage in 9-11 day-old embryonated hen eggs and, if necessary, in cultured cells (eg, MDCK cells).
  • the virus can be purified by the method described by Massicot et al. (Virology 101, 242-249 (1980)) or a modification thereof. Briefly, the virus suspension is clarified by centrifugation at 8000 rpm (eg, Sorvall RC5C centrifuge; GS-3 rotor), and then centrifuged in a Beckman 19 rotor at 18, OOO rpm for 2 hours. Into pellets.
  • the pelleted virus was resuspended in STE (0.1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7.4, ImM EDTA) and centrifuged at 4, OOO rpm for 10 minutes (Hermle
  • the banded virus is collected at the interface, diluted 10-fold with STE, and 30, OOOrpm for 2 hours
  • Virus subunit antigens can be produced by culture (eg, CHO-K1 cells) using recombinant DNA technology.
  • culture eg, CHO-K1 cells
  • pCXN As an expression vector, pCXN (Matsunami K., et al., (Clinical & Experimental I
  • the transformed cells are dissolved in a solubilization buffer (8% Triton X-100, 2M KC1, 10mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)), etc., suspended in an equal volume of PBS, and suspended.
  • the soluble fraction is recovered, for example, by centrifugation at 360, OOO rpm (eg, Beckman XL-70 centrifuge Type 55. ITi rotor).
  • the recovered soluble fraction is bound to a carrier to which a protein or peptide, such as a monoclonal or polyclonal antibody, having specific affinity for the antigen of interest or a peptide sequence added thereto is bound to a carrier.
  • Solvent extraction salting out by ammonium sulfate precipitation, desalting by organic solvent, precipitation by organic solvent, anion exchange using resin such as getylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical) Methods such as chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, chromatofocusing, and isoelectric focusing can also be used. it can.
  • the purified antigen can be dialyzed against a buffer such as PBS and frozen, for example, at _70 ° C.
  • a vaccine can be produced in such a manner.
  • Adjuvants are a generic term for substances that, when combined with an antigen, cause an increase in antibody production and an enhanced immune response; in a more preferred embodiment, a non-toxic, modulating or potent adjuvant is used. Adjuvants are required for use with conventional vaccine antigens to elicit a faster, more potent, or prolonged response. Such adjuvants are also useful in cases where antigen supply is limited or production is costly.
  • Adjuvants may be used, for example, in mineral, bacterial, plant, synthetic or host products. Classified according to.
  • the first class is a mineral adjuvant, for example, an aluminum compound.
  • the first use of aluminum compounds as adjuvants was described in 1926. Since that time, antigens precipitated with aluminum compounds or mixed with or adsorbed to preformed aluminum compounds have been used to enhance immune responses in animals and humans.
  • Aluminum compounds and similar adjuvants appear to work through the following mechanisms. Aluminum physically binds to the antigen to form particles that slow the rate of absorption of the antigen by the tissue after injection, thus allowing the interaction between the antigen and the cell presenting the antigen, such as macrophages or follicular-dendritic cells. Prolong the time of action. Alternatively, adjuvants further activate such interactions.
  • Aluminum particles are demonstrated 7 days after immunization in the local lymph nodes of the egret, and other significant functions may direct antigens to T cell-containing regions in the nodes themselves.
  • Adjuvant efficacy has been shown to correlate with regional lymph node activation. Although a number of studies have demonstrated that antigen administered with aluminum activates humoral immunity, cellular immunity appears to be only marginally increased. Aluminum has also been described as activating the complement pathway. This mechanism may play a role in the local inflammatory response as well as in immunoglobulin memory.
  • Aluminum compounds are almost the only safe adjuvants currently used in humans. However, vaccines containing aluminum sometimes cause local reactions. Although the development of allergy is usually not a major clinical problem, aluminum compounds also induce eosinophils into the injection area via a T-cell dependent mechanism, elicit an IgE response after antigen priming, and According to this response, it is said that it activates a population of specific cells with helper functions.
  • Bacterial adjuvants have recently been purified and synthesized (eg, muranyl dipeptide, lipid A). The host-derived immunoreactive protein is clawed (interleukin 1 and interleukin 2). Recently, Bordetella pertussis, lipopolysaccharide and Freund's complete adjuvant (FCA) are being used at the laboratory level.
  • Other substances have also been used variously as adjuvants. They include plant products such as saponins, animal products such as chitin and a number of synthetic chemicals.
  • double-stranded RNA is used as an adjuvant.
  • the method for preparing this double-stranded RNA can conform to the method for preparing a nucleic acid molecule described above, and a method known in the art can be used.
  • a kit available from Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd., Yamasa Shoyu, Fluka, or the like can be used.
  • Poly (I: C) can also be produced using a method well known in the art.
  • Non-patent Documents 13 to 13 Such a method is described in Non-patent Documents 13 to 13.
  • two selected homopolymers are prepared at pH 7.0 (0.006 sodium monophosphate, 0.15 sodium chloride).
  • Sodium phosphate in an equimolar concentration, but not limited thereto.
  • the complex can be formed immediately after mixing.
  • the agents of the invention eg, antigens or inactivated antigens, antibodies
  • polypeptides or nucleic acid molecules can be used.
  • the screening may use a library generated using an in silico 'screening (computer-based system) or a system using a real substance such as in vitro or in vivo.
  • in silico 'screening computer-based system
  • compounds obtained by screening having a desired activity are also included in the scope of the present invention.
  • the present invention also contemplates providing a drug by computer modeling based on the disclosure of the present invention. Therefore, a drug obtained by such screening can also be used as a component of the vaccine of the present invention.
  • the diseases targeted by the present invention include any diseases that can be prevented by vaccine administration.
  • diseases include, but are not limited to, bacterial diseases, viral diseases, allergy diseases, and the like, for example, chickenpox, measles, mumbus, polio, rota, influenza, rubella, severe acute respiratory disease. Syndrome (SARS), pertussis, marrow Meningitis and cholera, RS (respiratory syncytium) virus infection, influenza b type bacteria, pneumococcal infection, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and the like.
  • SARS severe acute respiratory disease. Syndrome
  • RS respiratory syncytium virus infection
  • influenza b type bacteria pneumococcal infection
  • acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) acquired immunodeficiency syndrome
  • the compounds or pharmaceutical compositions of the invention are preferably tested in vitro prior to use in humans and then in vivo and at the animal level for the desired therapeutic or prophylactic activity. .
  • the effect of a compound or composition on a cell line and / or tissue sample can be determined using techniques known to those of skill in the art.
  • In vitro assays that can be used to determine whether administration of a particular compound is indicated, in accordance with the present invention, include observing antigen-antibody binding, and the like.
  • the vaccine can be administered in the same manner as in humans, and the determination can be made by confirming an increase in antibody titer (for example, by ELISA) or activation of cytotoxic T itoda cyst.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the compositions, vaccines, etc. of the present invention include antioxidants, preservatives, coloring agents, flavorings, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, Such as, but not limited to, bulking agents, buffers, delivery vehicles, diluents, excipients, and / or pharmaceutical adjuvants.
  • the medicament of the present invention will be administered in the form of a composition comprising the actin, or a variant or derivative thereof, together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • a suitable vehicle may be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which may be supplemented with other materials common in compositions for parenteral delivery. It is.
  • an acceptable carrier, excipient, or stabilizer is non-toxic to the recipient, and is preferably inert at the dosages and concentrations employed.
  • Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin.
  • the product is formulated as a lyophilizate using suitable excipients (eg, sucrose).
  • suitable excipients eg, sucrose
  • Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired.
  • Other exemplary compositions include Tris buffer at pH 7.0-8.5 or acetate buffer at pH 4.0-5.5, which further includes sonorebitol or a suitable alternative thereof. obtain.
  • the vaccine and the like of the present invention can be administered parenterally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the medicament of the present invention may contain a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizing agent (Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR u ⁇ ennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) and a glycan composition having the desired degree of purity to prepare a lyophilized cake or aqueous solution. And can be saved.
  • a physiologically acceptable carrier Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR u ⁇ ennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.
  • a glycan composition having the desired degree of purity to prepare a lyophilized cake or aqueous solution. And can be saved.
  • Various delivery systems are known, and the present invention contemplates mucosal administration.
  • Techniques that can be used to administer the compounds of the invention include, for example, ribosomes, microparticles, microcapsules, and the like.
  • Methods of introduction include, but are not limited to, intranasal, vaginal, sub-airway, buccal, rectal and intestinal mucosal routes. In this case, it can be administered together with other biologically active agents. Administration can be systemic or local.
  • pulmonary administration may also be used, for example, by use of an inhaler or nebulizer, and by formulation with an aerosolizer.
  • the compound or composition of the present invention is applied not only to the mucosal surface of the administration site but also to the mucosal surface of other tissues so that IgA secretion can be enhanced. It may be desirable to administer locally.
  • the amount of the composition used in the prophylactic method of the present invention can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the target disease (type, etc.), the patient's age, weight, medical history, and the like. Can be done.
  • the frequency of applying the treatment method of the present invention to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the age, weight, medical history, and course of the patient. Thus, a person skilled in the art can easily determine.
  • the frequency may include, for example, daily-once-monthly administration (eg, once a week, once a month), or once a year before the epidemic. It is preferable to administer once a week and once a month while monitoring the progress, and it is advantageous to boost the animals at intervals of at least about one week. More preferably, the interval between boosts can be at least about 3 weeks.
  • the dose of the vaccine or the like of the present invention varies depending on the age, body weight, symptom, administration method, etc. of the subject, and is not particularly limited. obtain.
  • mucosal (e.g., nasal) administration it may be between 0.1 mg and 100 mg, and preferably between 0.1 mg and 1 mg.
  • administering refers to giving the vaccine or the like of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same, alone or in combination with other therapeutic agents, to a host to be treated. means.
  • the combinations may be administered, for example, either simultaneously as a mixture, separately but simultaneously or concurrently; or sequentially. This includes presentations where the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and also procedures where the combined agents are administered separately but simultaneously (e.g., through separate mucous membranes to the same individual). Including.
  • “Combination" administration further includes separately administering one of the compounds or agents given first, followed by the second.
  • the "instruction” refers to a method of administering or diagnosing the medicament or the like of the present invention for a physician, a patient or the like who administers or diagnoses (possibly a patient). It is described.
  • This instruction describes a word indicating a procedure for administering the diagnostic agent, the prophylactic agent, the medicine, and the like of the present invention.
  • This instruction is governed by the country in which the invention is implemented. It shall be prepared in accordance with the format prescribed by the competent authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States) and shall indicate that it has been approved by its competent authority. Instructions are so-called package inserts, which are usually provided in a paper medium, but are not limited thereto, for example, a film attached to a bottle, an electronic medium (for example, provided on the Internet). Website (web site), e-mail).
  • Judgment of termination of the prophylactic treatment by the method of the present invention can be performed by confirming antibodies induced by use of a commercially available assay or equipment.
  • the present invention also provides a pharmaceutical package or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a notice in the form of a government agency that regulates the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products may optionally accompany such containers, and may provide such notice for manufacture, use, or use for human administration. Represents government approval for sale.
  • the present invention provides vaccines for mucosal administration.
  • the vaccine comprises: A) double-stranded RNA; and B) a viral subunit antigen or inactivated antigen.
  • the double-stranded RNA, the viral subunit antigen and the inactivated antigen can be prepared by a well-known method in the relevant field.
  • Suitable forms for mucosal administration are well known in the art and include, but are not limited to, for example, being in liquid form or in spray form.
  • the titer of secretory IgA in the respiratory tract mucosa was increased by the combination of double-stranded RNA and the virulence subunit antigen or inactivated antigen, and the infection-protective effect was actually demonstrated.
  • double-stranded RNA has the ability to produce antibodies as adjuvants even to antibodies, and that it does not exert an actual infection-protecting effect, unexpected effects are unexpectedly significant.
  • the vaccine of the present invention achieves its remarkable effect by mucosal administration, it can be administered via any mucosal route (eg, nasal administration, buccal administration, etc.). Alternatively, in a preferred embodiment, a nasal route can be taken.
  • any mucosal route eg, nasal administration, buccal administration, etc.
  • a nasal route can be taken.
  • the pathogens to which the vaccine of the present invention is applied include, for example, varicella inenoles, hemp pain inoles, mumps innores, polio innoles, oral tawinores, innoleenza virus, adenovirus, herpes virus , Rubella virus, SARS virus, HIV, B. pertussis, meningococcus, influenza b, pneumonia and cholera.
  • the pathogen is an influenza virus.
  • the present invention has the excellent effect of presenting, for the first time in history, a vaccine that demonstrates cross-reactivity between subtypes within strains (eg, H1N1) within influenza virus types (types A and B). Is shown.
  • the present invention exhibits effects not achieved in the prior art, because in some cases it exhibits cross-reactivity across the mold walls.
  • the influenza virus epidemic changes every year, and the virus itself changes. Therefore, it has been conventionally predicted to prepare an influenza virus vaccine every year.
  • cross-reactivity is achieved across strains and subspecies, it is possible to provide an effective influenza vaccine in advance without predicting an epidemic. Is shown. Also, since it is no longer necessary to make predictions, long-term stored vaccines can be used.
  • the subunit of the pathogen used in the present invention is a subunit selected from the group consisting of HA, NA, Ml, M2, NP, PB1, PB2, PA and NS2 of influenza virus. including. More preferably, subunits presented on the surface (eg, HA, NA) are used. More preferably, it is advantageous to use a plurality (eg, HA and NA) of this surface display subunit. By using the subunit presented on the surface, a more effective antigen-antibody reaction can be elicited, and the ability to elicit a neutralizing antibody is acceptable.
  • the double-stranded RNA is present at a concentration sufficient to produce secretory IgA.
  • concentration of such double-stranded RNA is, for example, 0.1 to 10 mg / ml, more preferably 0.5 to 2 mg / ml, even more preferably about lmgZml (for example, 0.8 —1.2 mg / ml ).
  • the double-stranded RNA is provided in a size sufficient to produce secretory IgA.
  • Such size for example, 10 is a 2 bp or more, 0- 3 X 10 6 bp, more preferably such so limited but preferably at least the size of 300bp les.
  • the upper limit of the size of the double-stranded RNA of the present invention is not limited, for example, the upper limit of the size, but Ru include 10 8 bp but not limited to.
  • the subunit used in the vaccine of the present invention advantageously contains at least NA or HA. This is because by including one of these, more preferably both, neutralizing antibodies can be effectively raised, and an antiviral effect is achieved.
  • the double-stranded RNA is preferably a double-stranded RNA containing Poly (I: C), such as Poly (A: U), Poly (G: C), or a mixture thereof.
  • Poly (I: C) may be used regardless of whether the nucleotide is modified or not.
  • the present invention provides a method for preventing an infectious disease.
  • the method comprises the steps of: A) a vaccine for mucosal administration, comprising: a) double-stranded RNA (preferably Pol y (l: C)); and b) a subunit antigen of a virus. At least once mucosal administration.
  • Mucosal administration of the vaccine can be carried out in any suitable form depending on the site to be administered. For nasal administration, various methods can be used, such as spraying, painting or directly applying the vaccine solution.
  • Vaccine administration is preferably performed at least twice. Such immunity is sometimes referred to as a booster. By performing booster immunization, a more effective infection control effect can be achieved.
  • the interval be at least one week or more, more preferably three weeks or more.
  • Embodiments such as double-stranded RNA, Poly (I: C), and antigen can be performed as described above in this specification.
  • the present invention provides a vaccine kit for preventing an infectious disease.
  • the kit comprises: A) a vaccine for mucosal administration comprising: a) double-stranded RNA; and b) A vaccine comprising the virus subunit antigen; and B) instructions for administering the vaccine at least once.
  • This kit can be sold in packages as pharmaceuticals.
  • the instructions include a statement indicating the approval of authorities such as the Ministry of Health, Labor and Welfare, and a statement indicating the method of use.
  • the method for preparing and administering the vaccine is as described above in this specification.
  • the invention provides a composition for the prevention, treatment or prognosis of a disease, disorder or condition of an infectious disease, comprising a prophylactically, therapeutically or prognostically effective amount of an influenza vaccine subunit antigen, Or a fragment or variant thereof, and a double-stranded RNA.
  • the amount effective for prevention, treatment or prognosis can be determined by those skilled in the art using well-known techniques in the relevant field while considering various parameters. For example, it can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, medical history, etc.
  • Influenza virus H1N1 A / PR8 strain (obtained from the National Institute of Infectious Diseases, 23-1 1-1, Toyama, Shinjuku-ku, Tokyo)
  • Vaccine Influenza virus H1N1 (A / PR8) strain H1N1 (AZBeijing) strain (National Institute of Infectious Diseases); H1N1 (A / Yamagata) strain (National Institute of Infectious Diseases); H3N2 (AZ Guizhou) strain (National Infectious Diseases) Research Institute); Inactivated Ether Vaccine HA Vaccine (Osaka University Microbial Disease Research Society, Kanonji, Kagawa Prefecture 2-9-9-41)
  • CTB * contains CTB (cholera toxin B subunit), 0.1% CT (cholera toxin)) and Poly (I: C) as positive controls.
  • PR8HA vaccine National Institute of Infectious Diseases, Osaka University Research Institute for Microbial Diseases
  • 1 ⁇ g of each nasal cavity with Pol y (I: C) 0 ⁇ lg, lg, 3 g, 10 / ig as each adjuvant 5 ⁇ l of the PR8 influenza virus, and 3 weeks later nasal inoculation of the same amount of vaccine without adjuvant or adjuvant, and 2 weeks later, inoculation of lOOpfu PR8 influenza virus in one nose 1.2 ⁇ 1 each.
  • Poly (I: C) was used as an adjuvant, and influenza viruses of different subtypes were used to confirm cross-protection of nasal influenza vaccine H1N1 (A / PR8) strain H1N1 (Beijing) strain, H1N1 (A / Yamagata) and H3N2 (A / Guizhou) vaccines were intranasally inoculated with 3 ⁇ g of Poly (I: C), and the vaccine was administered only 3 weeks later, followed by lOOpfu PR8 influenza virus one week later. Infections were performed by inoculating 1.2 ⁇ l each. Nasal washing 3 days after infection The solution and serum were collected, and IgA in the nasal wash and IgG in the serum were measured by ELISA, and the virus titer in the nasal wash was measured by plaque assay using MDCK cells.
  • the mucosal adjuvant ability of Poly (l: C) was evaluated. Six weeks ago, 1 ⁇ g of PR8 vaccine was intranasally inoculated with Poly (I: C), which was changed to 0: 1 ⁇ g_10 ⁇ g, and two weeks before, the same amount of vaccine was administered with vaccine alone or with adjuvant. Nasal inoculation was performed. Figure 1 shows the IgA antibody response and blood IgG response on the nasal mucosa. To see the dose-dependent adjuvant effect of Poly (I: C), the amount of Poly (I: C) was increased stepwise from 0 to 10 zg and its adjuvant effect was observed.
  • a response of at least 0.1 l xg of Poly (I: C) at the time of the first immunization is observed for the nasal mucosa for IgA response.
  • the amount of IgA induced in the nasal mucosa was dependent on the amount of Pol y (I: C), and the higher the amount, the more its adjuvant effect was observed.
  • Poly (I: C) was used for both immunizations, IgA secretion of 100 ng / ml or more was observed in the nasal wash at a volume of 1 ⁇ g. Specific IgA induction of 100 ng / ml or more was observed by adding (I: C).
  • Serum IgG was also examined simultaneously, which correlated with IgA secretion.Immunization of 1 ⁇ g of PR8 vaccine with Poly (I: C) twice at 4 week intervals gave 1.5 / ig / ml. Blood IgG was obtained.
  • poly (I: C) denatures no longer show virus growth inhibitory effects
  • mice are 5/5 to within one week was Metabotch of more than virus titers also 10 6 pfu of the lung after three days died. All mice survived in the vaccine group with lxg or more of Poly (I: C). The results are shown below.
  • Poly (I: C) can elicit a mucosal IgA antibody response sufficient for protection against Ajuno infection.
  • Example 2 Cross protection by nasal vaccine combined with Poly (I: C)
  • Influenza virus strains with different subtypes from PR8 H1N1 (A / Beijing) strain H1N1 (Yamagata) strain H3N2 (A / Guizhou) vaccine was initially immunized with 3 ⁇ g of Poly (I: C) and the same after 4 weeks Inoculated with the vaccine alone, and two weeks later, lOOpfu H1N1 (A / PR8) was infected with lOOpfu, and three days later, IgA cross-reacting with PR8 in nasal washings and IgG in serum were measured, and PR8 virus was also measured.
  • H1N1 A / Beijing
  • H1N1 A / Yamagata
  • H3N2 A / Guizhou
  • cross-reacting IgA and IgG were found in small amounts, and partial protection against virus infection was observed.
  • mice in the group inoculated with Poly (I: C) in the brain were all alive for more than 2 weeks, and only 5% weight loss was observed in the 25 ⁇ g inoculated group.
  • CTB * CTB with 0.1% CT
  • IgA antibodies in the mucosa are more effective in protecting against influenza virus infection than IgG antibodies induced by current vaccines.
  • Nasal vaccines are effective for mucosal IgA induction.
  • Adjuvants that can be used in humans have not been established.
  • Poly (I: C) a synthetic double-stranded RNA, has been used intravenously in humans and is effective for inducing IgA, and is considered to be useful as a nasal vaccine adjuvant for human application.
  • Poly (I: C) is highly useful as a nasal vaccine adjuvant effective for protection against influenza virus infection in mucous membranes. Further application to mucosal vaccines of other pathogens is also conceivable.
  • IgA antibodies secreted from mucous membranes are very effective for protection against respiratory infections such as influenza.
  • Cross-protection of different types of viruses is mainly mediated by IgA antibodies secreted into the mucous membrane, and those who recover after influenza spontaneous infection are induced by these IgA antibodies and are infected against the epidemic of the same subtype mutant virus You can defend.
  • Vaccination is a method of preventing infection of uninfected individuals, but the vaccine currently used by subcutaneous vaccination does not provide a mucosal immune response and requires more effective vaccine development that has cross-protective ability. Have been.
  • Induction of secretory IgA in the mucosa can be performed by nasal antigen inoculation, but sufficient antigen response is not seen with antigen inoculation alone, and a more effective immune response requires an adjuvant to be administered at the same time as the vaccine. It becomes.
  • the present inventors used the synthetic double-stranded RNA Poly (I: C) as an adjuvant effective for mucosal immunity induction, and secreted IgA from the nasal mucosa and IgG response in serum to lethality. Demonstration of protection against influenza virus doses.
  • mice that died on day 4 were found in cholera toxin (CTB) in which 0.1% of total toxin was added to cholera toxin B subunit as a control (1, 5, 5 in the 10 zg group).
  • CTB cholera toxin
  • body weight was also reduced by 15% or more
  • poloy (I: C) group all mice survived for 8 days, and body weight loss was also transient in the 25 ⁇ g group. Only about 5% in sex Safety was also confirmed.
  • the current inactivated influenza HA vaccine has a low ability to induce IgA antibodies in the respiratory mucosal epithelium, which is an effective vaccine for entry of the influenza virus, so improving this effect will further increase its effect. Can be enhanced.
  • virus (I: C) was adjuvanted to the current inactivated influenza HA vaccine and administered intranasally, virus-specific IgA was efficiently induced on the mucosal surface. Rukoto has been shown.
  • experiments in mice have suggested that it is effective in protecting against lethal infection due to virus challenge and in challenge with different strains of virus.
  • pathogens that are transmitted through the respiratory tract or other mucosal routes (varicella virus, measles virus, mumps virus, poliovirus, oral tawinores, coronadinores, adenowinores, henoreles). It can also be used as an adjuvant for inactivated antigen vaccines such as Suinoinores, wind pain innores, SARS virus, HIV, B. pertussis, meningococcus, influenza b, pneumonia and cholera.
  • inactivated antigen vaccines such as Suinoinores, wind pain innores, SARS virus, HIV, B. pertussis, meningococcus, influenza b, pneumonia and cholera.
  • Vaccines Ether-treated HA vaccine (manufactured by Osaka University Microbial Society), formalin inactivated whole particle vaccine
  • H1N1 New Caledonia / 20/99 (H1N1) virus) (manufactured by Osaka University Microbiology Research Institute)
  • mice BALB / c mice (6 weeks old, female).
  • Virus A / New Caledonia / 20/99 (H1N1) virus
  • mice BALB / c mice (6 weeks old, female).
  • Poly (I: C) as an adjuvant for nasal influenza vaccine was compared with other double-stranded RNAs, Poly (A: U) and single-stranded Poly (A, U).
  • Adjuvants Poly (I: C), Poly (A: U), Poly (A, U).
  • Adjuvant activity was also observed for Poly (A: U) and single-chain Poly (A, U). What is the adjuvant activity of Poly (I: C) compared to? 0 (8:11), single chain (8, U) was smaller (Fig. 8)
  • Example 7 Induction of protective immunity by subunits of several influenza viruses under intranasal administration conditions in combination with Poly (I: C))
  • Adjunct Poly (I: C) (100-1000bp, Sigma)
  • mice BALB / c mice (6 weeks old, female).
  • HA, NA, Ml, and NP administered nasally with Poly (I: C) were compared. That is, HA, NA, Ml and NP molecules were purified from A / NewCaledonia Z20 / 99 (H1N1) virus using a specific anti-monoclonal antibody binding column, and the lxg was converted to Poly (I: C) (100-1000 bp, Sigma) ⁇ g together with BALB / c mice (6-week-old, female) were administered intranasally, and 3 weeks later, each molecule was administered a second time; one week later, mice were exposed to each molecule in nasal washes and serum. Antibody response was measured as an indicator of mucosal and systemic protective immunity.
  • Poly (I: C) has been shown to enhance mucosal and systemic immune responses to any subunit.
  • the prophylactic effect was enhanced by humoral immunity enhancement against HA and NA, but not by humoral immunity enhancement against NP. Therefore, it was found that HA and NA are strong protective antigens, and the ability to induce a prophylactic effect varies depending on the subunit.
  • Adjuvant Poly (I: C) [100_1000bp, Sigma]
  • mice BALB / c mice (6 weeks old, female).
  • Vaccine Current trivalent vaccine for influenza [A / NewCaledonia (HlNl), A / Panama (H3N2), B / Shangdong split-product vaccine derived from three virus strains] (Osaka University Microbial Disease Research Association)
  • Adjuvant Poly (I: C) (100-1000 bp, Sigma).
  • a healthy adult is sprayed with a solution containing 400 ⁇ g / ml of the trivalent vaccine and 700 ⁇ g Zml of Polyl: C at 300 zL (150 zL each in the left and right nose), and re-administered 4 weeks later.
  • a solution containing 400 ⁇ g / ml of the trivalent vaccine and 700 ⁇ g Zml of Polyl: C at 300 zL (150 zL each in the left and right nose) Two weeks after re-administration, saliva and serum materials are collected and antibody responses to HA and NA are measured.
  • the ability of this nasal vaccine to induce an antibody response is evaluated by the ratio of the antibody titers before and after the administration twice.
  • Subjects show increased salivary IgA antibodies to the three strains in the vaccine. [0164] In some subjects, an increase in serum anti-NA-IgG antibody or HI antibody is observed.
  • Enhancement of immunity was confirmed when nasal administration of a vaccine for pertussis other than influenza was administered together with Poly (I: C).
  • Vaccine Pertussis vaccine (manufactured by Osaka University Microbial Society)
  • Adjuvant Poly (I: C) (100_1000bp, Sigma)
  • mice BALB / c mice (6 weeks old, female).
  • Pertussis vaccine manufactured by Osaka University Research Institute for Microbial Diseases (11-3 zg) together with Poly (I: C) (100-1000 bp, Sigma), 0.1 / ig—10 ⁇ g BALB / c Mice (6 weeks old, ⁇ ) were nasally administered, and 3 weeks later, the same vaccine was administered a second time. Twice
  • Poly (l: C) also increased protective immunity to the pertussis vaccine, suggesting that it is also effective in enhancing protective immunity to the vaccine against infections other than influenza (Fig. 10).
  • Pertussis vaccine manufactured by Osaka University Microbial Society (13 zg) was combined with 0.1-10 ⁇ g of Poly (I: C) (100-1000 bp, Sigma) in BALB / c mice (6 (Week old, female), and the same vaccine was administered a second time three weeks later.
  • the antibody response to the pertussis vaccine in the nasal washings and serum of the mice was measured by ELISA and used as an index of mucosal and systemic protective immunity.
  • the virulent strain of B. pertussis was inoculated into the brain or nasal cavity (spray) of the immunized mice and observed for 14 days. The effect was estimated from the survival rate.
  • the nasal mucosal inoculation method was used to evaluate the safety and efficacy of the live Poly (I: C) combined nasal varicella vaccine in adults. Compare with the performed group.
  • Vaccine Chickenpox Vaccine (Osaka University Microbial Society)
  • Adjunct Poly (I: C) (100-1000bp, Sigma)
  • Healthy people 2—several people in each group.
  • Liver varicella vaccine is added to saline for injection to 2 vials / person, and this is nasally inoculated to healthy adults with a nebulizer. Also, a vaccine solution containing the current vaccine and Poly (I: C) (100-lOOOObp, Sigma) is sprayed at a dose of 300 ⁇ l (150 / l into the left and right nasal cavities). The preventive effect is confirmed by measuring humoral and cellular immunity.
  • Poly (l: C) also enhances protective immunity against live varicella vaccine, suggesting that it is effective in enhancing protective immunity to vaccines against infections other than influenza.
  • a vaccine form which can be easily vaccinated by mucosal administration and can obtain cross immunity.
  • an effective vaccine can be produced in the control of influenza virus, and there is a possibility that the vaccine will be widely used in the pharmaceutical and other industries for taking effective preventive measures.

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Abstract

　従来のアジュバント以上にアジュバント能を有し、株を越えた防御反応を提供し得るアジュバントを提供すること。 　サブユニット抗原とともに用いた場合、二本鎖ＲＮＡ（例えば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））が予想外に上記能力を有していることを見いだしたことによって解決された。従って、本発明は、粘膜投与のためのワクチンであって、Ａ）二本鎖ＲＮＡ；およびＢ）病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、を含む、ワクチンを提供する。

Description

明 細 書
粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン
技術分野
[0001] 本発明は、新規ワクチン構成に関する。より詳細には、二本鎖 RNAをアジュノ として用いた新規ワクチンに関する。
背景技術
[0002] 現行の認可ワクチンには、以下のような限界がある。例えば、インフルエンザウィル ス（特に A型インフルエンザウイルス）では抗原変異が顕著に生じ、それまでのヮクチ ン (すなわち、それまでに獲得された感染）により生じている抗体では中和されないゥ ィルスが発生することが頻繁であり、ワクチンの効力が一シーズンのみに終わることが 多レ、。また、表面糖タンパク質 (へマグルチニン [赤血球凝集素； HA]およびノイラミ ニダーゼ [NA] )をコードする遺伝子の点突然変異 (抗原連続変異）、抗原の不連続 変異により免疫学的に異なる新規の株が生じることが頻繁にある。なお、この場合、 内部タンパク質は連続変異株および不連続変異株内でも比較的高度に保存される 。現行のワクチンによる免疫は、細胞性免疫を基礎にした異種株間共通免疫ではな ぐ同種株液性免疫を引き出すに過ぎないことから、流行する株とワクチンの株とが異 なると効果は減弱することになる。
[0003] あるいは、インフルエンザウイルスの優勢流行株力 ある年力、らその翌年にかけて 有意に不連続変異または連続変異しない場合でも、抗体力価が低減するため、免疫 は毎年実施しなければならないという欠点もある。血球凝集阻止（HI)および中和の 抗体は数か月から数年存続し、その後次第に低減することが報告されている。しかし 、そのような低減が見られない場合でも、年に 1度の接種が推奨されている。なぜなら 、ワクチン接種後その年内に抗体力価が低減する可能性があるからである。
[0004] ワクチンの有効性には改良の余地が有る。なぜなら、次シーズンのワクチンの開発 は、次の流行株を予測することに依存する。従って、このような予測には不正確性が 伴レ、、ワクチン用に用いる株と実際に野外で流行するものとが適合しないということが 起こり得る。また、新型株が生じる場合は、例えば、 1992— 1993年のインフルェン ザシーズン中に起きたように、新規の H3N2株（A/Beijing/92)の出現に対して、 予測されたワクチンは無効であることが多レ、。新型ウィルスは、インフルエンザシーズ ンの後期になつてから臨床的に明らかになることが多ぐ現状では、認可ワクチンの 製造および調剤に時間を要するために、既存のワクチンによる防御が不十分である 場合が多い。仮にワクチンの株と流行株とがよく適合した場合でも、認可ワクチンは 小児および青年の約 70%、高齢者の 30 40%の疾患を予防するに過ぎないとレ、 われている。
[0005] 従来のワクチンでは特に、粘膜 (例えば鼻腔)免疫を行うことはほとんど不可能であ り、特に、インフルエンザウイルスなどで主流である皮下接種型の現行の不活化ワク チン、成分ワクチンなどでは、粘膜免疫を惹起できないことがわかっており、そのよう な粘膜免疫を惹起し得るワクチン組成物が渴望されている。
[0006] また、従来のワクチンでは株間でさえ交叉免疫を惹起し得ないことから、少なくとも 株間あるいはサブタイプ間でも交叉免疫を惹起し得るワクチンの開発もまた渴望され ている。 A株 2種および B株 1種の混合物が主流であるインフルエンザワクチンでは、 特に、予測が不要になるか少なくとも低減されるようなワクチンの開発も渴望されてい る。
[0007] さらに、ワクチンとして簡便な接種法である粘膜接種で有効なワクチンもまた渴望さ れている。これは、特にインフルエンザウイルスなどでは、現在行われていないことか ら、集団免疫を容易にする意味からもその解決策の登場が待ち望まれている。あるい は、抗体持続期間が増大するようなものもまた渴望されている。
[0008] 非特許文献 1 ϋ. Clinical Investigation, 110 (8) , 1175—1184, (2002) )は 、 Poly (I： C)をアジュバンとする UV不活化 whole (全体）インフルエンザウイルスを 気道経路で投与したことが開示されている。しかし、 IgG抗体の上昇は Poly (I : C)を 加えない場合と差が無いことが非特許文献 1の図 2に示されている。したがって、 Pol y (I : C)はアジュバントとしてはそれほど有効ではないことが示唆されている。また、抗 体を上昇させるためには短鎖のリン脂質を併用することが記載されている。
[0009] 非特許文献 2 (Invest. Ophthalmol.， 10 (10) , 750— 759 (1971) )および非特 許文献 3 (Invest. Ophthalmol . , 10 (10) , 760—769, (1971) )は、 Polv (I : C) をアジュバントとする不活化ワクチェアウィルスを経鼻接種することが記載されている
。しかし、非特許文献 2は、涙液中の IgA抗体産生が増加することを記載するが、感 染予防効果には言及してレ、なレ、。
[0010] 特許文献 1(特公昭 50— 2009号（US3906092)Merck&Co)は、吸着型アジュ バントにポリヌクレオチド（Poly (I:C)を含む）を加えることにより、インフルエンザワク チンの抗体反応を増進させることを開示している。しかし、特許文献 1は、感染予防 効果には言及していない。
[0011] 非特許文献 4 (Veterinary Microbiology, 88(4), 325-338, (2002))は、 Po ly (I :C)をアジュバントとする不活化ワクチンを腹腔内接種後、 IgG， IgMの有為な上 昇を報告するが、鼻腔などへの粘膜投与での効果は示されておらず、しかも、感染 予防効果には言及してレ、なレ、。
[0012] 非特許文献 5 (Pro So Exp. Biol. & Med. ， 133, 334— 338 (1970) )は、
Poly (I:C)をアジュバントとして羊赤血球を静注して免疫する時、血中抗体が上昇す ることを報告してレ、るが、感染予防効果には言及してレ、なレ、。
[0013] 非特許文献 6(The Journal of Immunology, 149, 981— 988 (1992) )は、コ レラ毒素のアジュバントとしての可能性を記載する力 二本鎖 RNAについてはなんら 記載していない。
特許文献 1：特公昭 50 - 2009号
非特許文献 1:J. Clinical Investigation, 110(8), 1175—1184, (2002) 非特許文献 2: Invest, Ophthalmol. , 10(10), 750-759(1971))
非特許文献 3: Invest. Ophthalmol. , 10(10), 760—769, (1971)
非特許文献 4: Veterinary Microbiology, 88(4), 325' 338， (2002) 非特許文献 5: Pro So Exp. Biol. & Med. , 133， 334-338(1970) 非特許文献 6:The Journal of Immunology, 149, 981-988(1992) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 上述のような状況の中、本発明は、粘膜投与するとき、従来のアジュバント以上にァ ジュバント能を有し、株を越えた防御反応を提供し得るアジュバントを提供することを 課題とする。
課題を解決するための手段
[0015] 上記課題は、サブユニット抗原とともに用いた場合、二本鎖 RNA (例えば、 Poly (I :
C) )が予想外に上記能力を有していることを見いだしたことによって解決された。
[0016] 上述のように、現行の不活化インフルエンザ HAワクチンは、有効なワクチンである 力、インフルエンザウイルスの進入門戸である呼吸器粘膜上皮での IgA抗体の誘導 は低いことから、これを改善することにより、さらに効果が増強できると考えられる。
[0017] そこで、マウスのインフルエンザモデルにおいてアジュバント併用経鼻ワクチンを用 レ、て気道粘膜に交叉反応性の高い分泌型 IgA抗体を産生させることを試みた。アジ ュバントとしてコレラ毒素 Bサブユニット（CTB * )を用い良好な結果が得られた。しか し、ヒトでの経鼻投与を考えた場合、コレラ毒素は顔面神経麻痺などの副作用が報告 されていることから、コレラ毒素を用いたアジュバントを使用せずに、 IgG抗体を誘導 できたならば、より安全なワクチンになると考えられる。 IgAは、補体系の第 2経路を活 性化し、粘膜感染における局所免疫反応に重要な働きを持つが、その IgAの血漿中 半減期は 5— 6日であり、新たに置き換えられていることから、例えば涙液中の IgAが 増加したと
しても感染予防効果まで予測できないと考えられる。
[0018] そこで、生態の微生物成分を認識し、自然免疫系を刺激する Toll様レセプター (T
LR)のあるリガンドが安全性に優れていて、粘膜ワクチンの強力なアジュバントになり 得る可能性があるかを検討したところ、予想外の感染防御効果を示す粘膜投与ワク チンを得ることができた。
[0019] 従って、本発明は、以下を提供する。
[0020] (1) 粘膜投与のためのワクチンであって、
A)二本鎖 RNA;および
B)病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチン。
[0021] (2) 上記粘膜は、鼻の粘膜を含む、項目 1に記載のワクチン。
[0022] (3) 上記病原体は、水痘ウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、ポリオウィル ス、ロタウィルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス、風疹ゥ ィルス、重症急性呼吸器症候群ウィルス（SARSウィルス）、ヒト免疫不全症ウィルス（
HIV)、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザ b型菌、肺炎菌およびコレラ菌からなる 群より選択される、項目 1に記載のワクチン。
[0023] (4) 上記病原体は、インフルエンザウイルスである、項目 1に記載のワクチン。
[0024] (5) 上記サブユニットは、インフルエンザウイルスの HA、 NA、 Ml、 M2、 NP、 P
Bl、 PB2、 PAおよび NS2からなる群より選択される少なくとも 1つのサブユニットを含 む、項目 1に記載のワクチン。
[0025] (6) 上記二本鎖 RNAは、分泌型 IgAを産生するに十分な濃度で存在する、項目
1に記載のワクチン。
[0026] (7) 上記二本鎖 RNAは、 0. 1 10mg/mlの濃度で存在する、項目 1に記載の ワクチン。
[0027] (8) 上記二本鎖 RNAのサイズは、 102— 108bpである、項目 1に記載のワクチン。
[0028] (9) 上記サブユニットは、少なくとも NAまたは HAを含む、項目 1に記載のヮクチ ン。
[0029] (10) 上記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、項目 1に記載のワクチン。
[0030] (11) 感染疾患を予防するための方法であって、
A)粘膜投与のためのワクチンであって、
a)二本鎖 RNA;および
b)病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチンを、少なくとも 1回粘膜投与する工程を包含する、方法。
[0031] (12) 上記ワクチンの投与は、少なくとも 2回行われる、項目 11に記載の方法。
[0032] (13) 上記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも 1週間以上である、より好ましくは 3 週間以上である、項目 11に記載の方法。
[0033] (14) 上記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、項目 11に記載の方法。
[0034] (15) 感染疾患を予防するためのワクチンキットであって、
A)粘膜投与のためのワクチンであって
a)二本鎖 RNA;および b)病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチン;ならびに
B)上記ワクチンを、少なくとも 1回粘膜投与することを指示する指示書、 を備える、キット。
[0035] (16) 上記ワクチンの投与は、少なくとも 2回行われる、項目 15に記載のキット。
[0036] (17) 上記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも 1週間以上である、より好ましくは 3 週間以上である、項目 15に記載のキット。
[0037] (18) 上記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、項目 15に記載のキット。
[0038] (19) 二本鎖 RNAの、ワクチンの粘膜投与のための使用。
[0039] (20) 上記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、項目 19に記載の使用。
[0040] (21) 二本鎖 RNAの、粘膜投与のためのワクチンの製造のための使用。
[0041] (22) 上記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、項目 21に記載の使用。
発明の効果
[0042] 本発明により、粘膜投与により簡単にワクチン接種し、かつ、交叉免疫性を得ること ができるワクチン形態が提供される。これにより、例えば、インフルエンザウイルスでは 、流行株を予測しなくても、有効なワクチンを製造することができ、効率よい予防対策 を講じることが可能となる。
図面の簡単な説明
[0043] [図 1]図 1は、実施例において例示される、 Poly (I : C)のアジュバント効果を示すデー タである。左の欄は、投与形態を示し、中の欄は、鼻洗浄液中の IgA量を示し、右の 欄は、血清中の IgA量を示す。
[図 2]図 2は、実施例において例示される、 Poly (I : C)のアジュバント効果を示すデー タである。左の欄は、投与形態を示し、右の欄は、ウィルスの生存状況を示す。
[図 3]図 3は、種々のウィルス株に対する本発明のワクチン接種の IgA惹起効果を示 す図である。
[図 4]図 4は、種々のウィルス株に対する本発明のワクチン接種のウィルス増殖抑制 効果を示す図である。
[図 5]図 5は、本発明のワクチン接種の脳内投与における毒性を示す図である。上は 本発明の Poly (I : C)を示し、下はポジティブコントロールの CTB *を示す。
[図 6]図 6は、不活化ウィルス粒子を Poly (I : C)と併用する経鼻インフルエンザヮクチ ンとして用いたときの免疫効果：鼻洗浄液と血清中抗 HAおよび抗 NA抗体価を示す
[図 7]図 7は、不活化ウィルス粒子を種々サイズ (L、 M、 H)の Poly (I : C)と併用する 経鼻インフルエンザワクチンとして用いたときの免疫効果：鼻洗浄液および血清中流 HAと抗 NA抗体価を示す。
[図 8]図 8は、 2本鎖 RNAあるいは単鎖 RNAとサブユニット HAを併用する経鼻インフ ルェンザワクチンとして用いたときの免疫効果：鼻洗浄液および血清中抗 HA抗体価 を示す。
[図 9]図 9は、一週間以上の間隔で 2回以上の投与が Poly (I : C)併用経鼻 ンザワクチンの有効性を示す結果である。
[図 10]図 10は、 Poly (l : C)は百日咳ワクチンに対する防御免疫をも高め、 ェンザ以外の感染症に対するワクチンに対する防御免疫増強にも有効であることを 示す結果である。
発明を実施するための最良の形態
[0044] 以下に本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書 において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味 で用いられることが理解されるべきである。
[0045] (定義）
本明細書において「ワクチン」とは、身体中に投与されて、活性な免疫を生成する、 通常感染性因子または感染因子のある部分を含む抗原性懸濁液または溶液をいう 。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物（例えば、ウィルスまたは細菌など）また は微生物から精製された天然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク 質、ペプチド、多糖または同様な産生物であり得る。生ワクチンとしては、例えば、 BC G、種痘、ポリオ、水痘、はしカ 風疹、おたふくかぜ、牛疫、 NDV、マレック病などが 挙げられるがそれらに限定されない。不活化ワクチンとしては、百日咳、ジフテリア（ト キソイド）、破傷風（トキソイド）、インフルエンザ、 日本脳炎などが挙げられるがそれら に限定されない。
[0046] 本明細書において「不活化抗原」とは、ワクチン用抗原として使用される、感染能を 失わせた抗原をいい、完全ウィルス粒子であるビリオン、不完全ウィルス粒子、ビリオ ン構成粒子、ウィルス非構造タンパク質、感染防御抗原、中和反応のェピトープなど が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「不活化抗原」とは、感染 力を失わせるが免疫原性を保持させた抗原をいい、そのような抗原がワクチンとして 使用されるときは、「不活化ワクチン」という。そのような不活化抗原としては、例えば、 物理的（例えば、 X線照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩 素）などの操作により不活化されたものが挙げられるがそれらに限定されなレ、。サブ ユニット抗原自体も、通常感染力が喪失されていることから、不活化抗原の定義内に 入る。あるいは、死滅したウィルスを使用してもよい。
[0047] 本明細書においてウィルスの「サブユニット抗原」とは、「成分」ともいい、そのような サブユニット抗原は、天然のウィルスなどの病原体から精製してもよぐ合成または組 換え技術により作製してもよい。そのような方法は当該分野において周知であり、慣 用されるものであり、市販される機器、試薬、ベクターなどを用いて実施することがで きる。例えば、インフルエンザウイルスでは、へマグルチニン（HA)、ノイラミニダーゼ (NA)、マトリクス（Ml、 M2)、非構造（NS)、ポリメラーゼ（PB1、 PB2 :塩基性ポリメ ラーゼ 1および 2、酸性ポリメラーゼ（PA) )、核タンパク質 (NP)などの、粒子の表面 にでている分子であることが好ましレ、。現在 HAは 15種類、 NAは 9種類が知られて おり、これが変わると新しい株が生まれ得る。
[0048] 本明細書にぉレ、て「アジュバント」とは、投与された免疫原と混合するとき、免疫応 答を増加するか、あるいはそうでなければ変更する物質である。
[0049] 本明細書にぉレ、て「CT」または「コレラ毒素」とは、コレラ菌（Vibrio cholerae)の 産生する外毒素で、コレラ菌感染による下痢症状の原因物質をいう。コレラ毒素は、 有効なアジュバントとして使用されている力 その毒性のために臨床応用はされてい なレ、。従って、通常 CTは、ワクチンの有効なアジュバントを探索する際のポジティブ コントロールとして使用される。 [0050] 本明細書において「二本鎖 RNA」とは、任意の二本鎖の RNAをいう。そのサイズ は、たとえば、ゲル電気泳動などで測定され得る。従来二本鎖 RNAをワクチンのアジ ュバントとして用レ、る試みはなされている力 ワクチンが感染防御に有効であつたとレヽ う報告はほとんどなされていなレ、。そのような二本鎖 RNAとしては、 Poly (I : C)、 Pol y (A : U)、 Poly (G : C)などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0051] 本明細書にぉレ、て「Poly (I： C)」とは、ポリイノシン酸 (pi)とポリシチジン酸 (pC)と を含む二本鎖 RNAであり、上述の二本鎖 RNAの範囲内に入る。
[0052] 本明細書では、不活化抗原またはサブユニット抗原のいずれもがその抗原として用 いられ得る。
[0053] 本明細書において「粘膜投与」とは、粘膜を経由する投与形態をいう。本明細書に おいて「粘膜」とは、脊椎動物において、消化器、呼吸器、泌尿生殖器など特に外通 性の中腔器官の内壁をいう。従って、そのような粘膜投与としては、例えば、鼻腔投 与 (経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与などが挙げられるがそ れらに限定されない。好ましくは、鼻腔投与が有利である。鼻腔は特に、インフルェン ザウィルスなどの呼吸器系感染疾患の感染経路でもあることから、粘膜投与により Ig A反応を引き起こすことも可能であるからである。
[0054] 本明細書において「経鼻投与」とは、鼻粘膜を経由した投与方法をいう。
[0055] 本明細書にぉレ、て「病原体」とは、宿主に対して疾患または障害を発生し得る生物 をいう。ヒトに対する病原体としては、例えば、ウィルス、細菌、原虫、リケッチア、クラミ ジァ、真菌などが挙げられるがそれらに限定されない。ワクチンが有効とされるのは、 通常、ウィルス、細菌などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0056] 本明細書において対象とされるウィルスは、どのような種類のものでもよぐ DNAゥ イノレス、 RNAウィルスなどが挙げられるがそれらに限定されない。
[0057] ヒトにとつて病原体であるウィルスとしては、例えば、水痘ウィルス、麻疹ウィルス、ム ンプスウィルス、ポリオウイルス、ロタウィルス、インフルエンザウイルス、アデノウィル ス、ヘルぺスウィルス、風疹ウィルス、 SARSウィルス（コロナウィルスの一種）、 HIV が挙げられるがそれらに限定されなレ、。このようなウィルスは、好ましくはインフルェン ザウィルスである。 [0058] 本発明が対象とする細菌は、どのような細菌であってもよぐグラム陽性細菌、グラム 陰性細菌が挙げられるがそれらに限定されない。
[0059] ヒトにとつて病原体である細菌としては、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザ b型 菌、肺炎菌およびコレラ菌などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0060] 本明細書にぉレ、て「インフルエンザウイルス」とは、オルソミクソウィルス科に属する —鎖 RN Aウィルスである。脂質二重膜のエンベロープを持ち、 Ml (膜タンパク質）に 裏打ちされ、その膜に M2、 HA (血球凝集素）、 NA (ノイラミニダーゼ）および M2の 糖タンパク質といった特徴的な膜タンパク質がはまり込んでいる。 RNAは 8つに分節 しており、これらは核タンパク質とともに複合体 RNP (リボヌクレオシドカブシド）を形成 し、エンベロープ裏打ちタンパク質 Mlに弱く結合している。
[0061] インフルエンザウイルスのタンパク質のうち HAおよび NAは、小胞体膜にはまり込 んだ形で作られ、ゴルジ装置を経て細胞表面に出る。従って、 HAまたは NAあるい はその両方は、良好な免疫原であり、ワクチンの主原料として使用されている。
[0062] 本明細書において「分泌型 IgAを産生するに十分な濃度」とは、アジュバントまたは ワクチン自体の能力をいい、投与された後、免疫反応が起こるときに、分泌型 IgAを 産生することができる、アジュバントまたはワクチン自体の濃度をいう。そのような濃度 は、インビトロまたはインビボで当該分野において公知の方法を用いて実施すること ができる。
[0063] 本明細書にぉレ、て「分泌型 IgA」とは、分泌性である IgAをレ、う。 IgAは、外分泌液 中の主要な免疫グロブリンで、粘膜表面の感染防御に役立っている。唾液、鼻汁、腸 、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多く見られるが血清中にも存在する。この ような分泌型 IgAの測定方法としては、例えば、免疫拡散法が挙げられるがそれらに 限定されず、例示的な好ましい方法としては、実施例に記載されるようなものを用いる こと力 Sできる。
[0064] (本発明において使用され得る一般生化学手法の説明）
(ワクチンの作製法）
本明細書においてワクチン中に含まれるサブユニット抗原または不活化抗原は、上 述のように、ワクチンから不活化、精製などにより天然の材料から作製することができ るし、あるいは遺伝子工学的にポリペプチドを調製することまたは合成により人工的 に作製することができる。通常、本発明のワクチンは、ウィルスなどを発育鶏卵などを 用いて増殖し、増殖したウィルスなどを不活化またはその中力 成分を分離精製する ことによって製造することができる。
[0065] 本明細書において本発明のワクチンは、液状または乾燥した形態で、密栓したバイ アル瓶、シリンジ、アトマイザ一またはそれに類するもの、あるいは熔封したアンプノレ に入れて提供され得る。
[0066] インフルエンザウイルスワクチンを製造する場合は、以下のような手順を用いること ができるがそれに限定されなレ、。
[0067] 目的のインフルエンザウイルス株としては、例えば、 A/Beijing/352/89 (H3N 2)； A/Texas/36/91 (H1N1)； B/Panama/45/90 ;A/Georgia/03/ 93 ; A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、 A/Panama/2007/99 (H3N2 )； B/Shangdong/7/97； B/johannesburg/5/99などが挙げられるがそれ らに限定されない。
[0068] これらのウィルスは、例えば、 9一 11日齢発育鶏卵胚中で継代により増殖させ、必 要に応じて、培養細胞（例えば、 MDCK細胞）中で増殖させる。ウィルスは、 Massic ot et al. (Virology 101, 242—249 (1980) )が記載した方法またはその変法 により精製すること力 Sできる。手短に言えば、ウィルス懸濁液を 8000rpmで遠心分離 (例えば、 Sorvall RC5C遠心分離器。 GS—3ローター）して明澄化し、次いで Beck man 19型ローターで 18, OOOrpmで 2時間遠心分離してペレットとする。
[0069] ペレット化ウィルスを STE (0. 1M NaCl、 20mM Tris、 pH7. 4、 ImM EDTA )中に再懸濁し、 4， OOOrpmで 10分遠心分離（Hermle
Z360K遠心分離器）して、凝集物を除去する。上清 2mlを、 60%ショ糖 2mlと ST Eで緩衝した上層の 30%ショ糖 7mlから成る不連続ショ糖勾配上に層とし、 36, 00 Orpm (SW—40ローター、 Beckman)で 90分遠心分離する。
[0070] バンド化ウィルスを界面で収集し、 STEで 10倍に希釈して、 30, OOOrpmで 2時間
(Beckman Ti45ローター）ペレット化する。次にペレット化ウィルスを _70°Cで凍結 する。 [0071] ウィルスのサブユニット抗原は、組換え DNA技術を用いて培養（例えば、 CHO-K 1細胞）により生産することができる。発現ベクターとしては、 pCXN (Matsunami K . , et al. , (Clinical & Experimental I
mmunology 126 (1) , 165—172 (2001) )等を利用することができるがそれらに限 定されなレ、。形質転換した細胞は、可溶化緩衝液（8% Triton X— 100、 2M KC 1、 10mM リン酸ナトリウム緩衝剤（pH7. 0) )等に溶解し、等量の PBSをカ卩えて懸濁 し、例えば、 360, OOOrpmで遠心分離（例えば、 Beckman XL—70遠心分離機 Ty pe 55. ITiローター）することにより可溶性画分を回収する。回収された可溶性画 分は、 目的とする抗原またはそれに付加されたペプチド配列に特異的に親和性を持 つモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体をはじめとするタンパク質またはぺプ チドなどを担体に結合させたァフィ二ティーカラムに吸着させ、 0. 1M グリシン一 HC 1、 0. 1 % Tween 80 (pH2. 7)等、 pHその他の変化により結合力を減弱せしめる 溶液を用いて溶出し、精製することができる。また、溶媒抽出法、硫安沈澱等による 塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル（DEAE) - Sepharos e、 DIAION HPA— 75 (三菱化学)等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー 法、ブチルセファロース、フエ二ルセファロースなどの樹脂を用いた疎水性クロマトグ ラフィ一法、分子篩を用いたゲル濾過法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳 動法等の手法を用いることもできる。精製された抗原は、 PBSなどの緩衝液で透析し 、例えば、 _70°Cで凍結することができる。
[0072] このような形でワクチンを生成することができる。
[0073] (アジュバント）
アジュバントは、抗原と組み合わせることで抗体産生の増大、免疫応答の増強を起 こす物質の総称であり、より好ましい実施形態では、変調させるか、または効力のある 無毒のアジュバントが使用される。アジュバントは通常のワクチン抗原とともに使用し て、より早レ、、より効力のある、あるいはより延長した応答を誘発するために要求され る。このようなアジュバントは、また、抗原の供給が限定されるか、あるいは産生にコス トがかかる場合において有用である。
[0074] アジュバントは、例えば、鉱物、バクテリア、植物、合成または宿主の産生物に場合 に応じて分類される。
[0075] 第一のクラスは、鉱物のアジュバント、例えば、アルミニウム化合物である。アジュバ ントとしてのアルミニウム化合物の最初の使用は 1926年に記載された。その時以来 、アルミニウム化合物とともに沈澱させた抗原あるいは予め形成されたアルミニウム化 合物と混合されまたはそれに吸着された抗原が、動物およびヒトにおける免疫応答の 増強するために使用されている。アルミニウム化合物および同様なアジュバントは次 のメカニズムを通して働くようである。アルミニウムは、抗原に物理的に結合して粒子 を形成し、注射後組織の抗原の吸収速度を遅くさせ、こうして抗原と抗原を提示する 細胞、例えば、マクロファージまたは濾胞一樹状細胞との間の相互作用の時間を延長 する。あるいは、アジュバントは、さらに、そのような相互作用を活性化する。アルミ二 ゥム粒子はゥサギの局所リンパ節において免疫後 7日に実証され、そして他の有意の 機能が節それら自体における T細胞含有領域に抗原を向けることがあり得る。アジュ バントの効力は、所属リンパ節の活性化と相関関係を有することが示されている。多 数の研究はアルミニウムとともに投与された抗原が液性免疫を活性化することを証明 したが、細胞性免疫性は、わずかに増加するだけあるように思われる。アルミニウムは 、また、補体の経路を活性化するとして記載された。このメカニズムは局所炎症反応 ならびに免疫グロブリンのメモリーにおいてある役割を演じ得る。
[0076] アルミニウム化合物は現在ヒトにおいて使用されているほぼ唯一の安全なアジュバ ントである。しかし、アルミニウムを含有するワクチンは時々局所的反応を引き起こす 。アレルギーの発現は通常臨床的に大きな問題でないが、アルミニウム化合物は、ま た、好酸球を T細胞依存性メカニズムを経て注射領域に誘導し、抗原のプライミング 後 IgEの応答を誘発し、そして IgEの応答にっレ、てヘルパー機能をもつ特異的細胞 の集団を活性化するといわれている。
[0077] バクテリア由来のアジュバントは最近精製されそして合成されている（例えば、ムラ ニルジペプチド、リピド A)。また、宿主由来免疫活性タンパク質は、クローユングされ ている（インターロイキン 1およびインターロイキン 2)。最近、ボルデテラ'ペルツシス（ Bordetella pertussis)、リポ多糖およびフロインド完全アジュバント（FCA)が実験 室レベルで使用されつつある。 [0078] 他の物質もまた、アジュバントとして種々使用されてきている。それらは植物産生物 、例えば、サポニン、動物産生物、例えば、キチンおよび多数の合成化学物質を包 含する。
[0079] 本明細書では、二本鎖 RNAがアジュバントとして使用される。この二本鎖 RNAの 調製方法は、上述の核酸分子の調製方法に準ずることができ、当該分野において周 知の方法を用いることができる。そのようなものの例示としては、シグマ'アルドリッチ ジャパン (株）、ャマサ醤油、 Flukaなどからが入手可能であるキットを用いることがで きる。
[0080] Poly (I : C)もまた、当該分野において周知の方法を用いて製造することができる。
そのような方法は、非特許文献 1一 3などに記載されており、例えば、好ましくは、 2つ の選択したホモポリマーを pH7. 0 (0. 006モノレリン酸ナトリウム、 0. 15モノレ塩ィ匕ナト リウム）のリン酸緩衝液に等モルの濃度で混ぜることなどが挙げられるがそれらに限 定されない。複合体は、混合後直ちに形成され得る。
[0081] (コンピュータスクリーニング）
タンパク質立体構造データスクリーニングのために、本発明の因子 (例えば、抗原ま たは不活化抗原、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スク リーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよぐインシリ コ 'スクリーニング (コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用 いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合 物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明 の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。従 つて、このようなスクリーニングによって得られた薬物もまた、本発明のワクチンの成分 として用いることができる。
[0082] (疾患）
本明細書において本発明が対象とし得る疾患は、ワクチン投与によって予防し得る 任意の疾患を包含する。そのような疾患としては、細菌性疾患、ウィルス性疾患、ァレ ルギー疾患などが挙げられるがそれらに限定されず、例えば、水痘、麻疹、ムンブス 、ポリオ、ロタ、インフルエンザ、風疹、重症急性呼吸器症候群（SARS)、百日咳、髄 膜炎およびコレラ、 RS (呼吸器性シンシチウム）ウィルス感染症、インフルエンザ b型 菌、肺炎球菌感染症、後天性免疫不全症候群 (AIDS)などが挙げられるがそれらに 限定されない。
[0083] (治療活性または予防活性の証明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロ で、そして次いでインビボで、および動物レベルで、所望の治療活性または予防活 性にっレ、て試験される。細胞株および/または組織サンプノレに対する化合物または 組成物の効果は、当業者に公知である技術を利用して決定され得る。本発明に従つ て、特定の化合物の投与が示されるか否力、を決定するために用いられ得るインビトロ アツセィとしては、抗原と抗体との結合を観察することなどが挙げられる。動物レベル の試験では、ヒトと同様にワクチンを投与し、抗体力価の上昇 (例えば、 ELISAによる )、あるいは細胞障害性 T糸田胞の活性化などを確認することによって判定することがで きる。
[0084] (予防のための投与および組成物）
本発明の組成物、ワクチンなどで用いられ得る薬学的に受容可能なキャリアとして は、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、 フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的ァ ジュバントが挙げられるがそれらに限定されなレ、。代表的には、本発明の医薬は、ヮ クチン、またはその改変体もしくは誘導体を、 1つ以上の生理的に受容可能なキヤリ ァ、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビ ヒクノレは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経 口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
[0085] 本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエン トに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不 活性であり、例えば、リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、 ひ— トコフエロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニノレピロリドン）；アミノ酸（例 えば、グリシン、グノレタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジ サッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）； キレート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトー ノレ）；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに/あるいは非イオン性表面活性 化剤（例えば、 Tween、プル口ニック（pluronic)またはポリエチレングリコール（PEG ) )などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。
[0086] 例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと 混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例 えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希 釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH7. 0-8 . 5の Tris緩衝剤または pH4. 0-5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソノレ ビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
[0087] 以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医 薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調 製法により製造することができる。
[0088] 本発明のワクチンなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合して非経口的に投与 すること力 Sできる。
[0089] 本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安 定化剤（日本薬局方第 14版またはその最新版、 Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. u^ennaro, ed. , Mack Publishing Compan y, 1990などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することに よって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
[0090] 様々な送達系が公知であり、本発明では粘膜投与が企図される。本発明の化合物 を投与するために用いられ得る技術としては、例えば、リボソーム、微粒子、マイクロ カプセルなどが挙げられる。導入方法としては、鼻腔内、膣内、気道下、 口腔内、直 腸粘膜および腸粘膜などの粘膜経路が挙げられるがそれらに限定されない。この場 合、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所 的であり得る。粘膜投与する場合には、例えば、吸入器または噴霧器の使用、および エアロゾルィ匕剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。 [0091] 特定の実施形態において、本発明の化合物または組成物を、投与部位の粘膜面 のみならず、その他の組織の粘膜面にぉレ、ても IgA分泌亢進可能であるような粘膜 面に局所的に投与することが望まれ得る。
[0092] 本発明の予防方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類 など）、患者の年齢、体重、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することが できる。本発明の処置方法を被験体 (または患者）に対して施す頻度もまた、使用目 的、対象疾患 (種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、既往歴、および経過などを 考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日ー数ケ 月に 1回（例えば、 1週間に 1回一 1ヶ月に 1回）の投与、あるいは毎年流行前に 1回の 頻度などが挙げられる。 1週間一 1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好 ましぐ少なくとも約 1週間の間隔をあけて追加免疫をすることが有利である。より好ま しくは、追加免疫の間隔は少なくとも約 3週間であり得る。
[0093] 本発明のワクチンなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法な どにより異なり、特に限定されないが、通常成人 1日あたり、経口投与の場合、 lOmg 一 lgであり得る。粘膜 (例えば経鼻）投与の場合、 0· OOlmg— lOmgであり、好まし くは、 0. lmg— lmgであり得る。
[0094] 本明細書中、「投与する」とは、本発明のワクチンなどまたはそれを含む医薬組成 物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて処置が意図される宿主に与えること を意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもし くは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされ た薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤 が、別々であるが同時に (例えば、同じ個体へ別々の粘膜を通じての場合)投与され る手順もまた含む。 「組み合わせ」投与は、第 1に与えられ、続いて第 2に与えられる 化合物または薬剤のうちの 1つを別々に投与することをさらに含む。
[0095] 本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する 方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人 (患者本人であり得る）に対して 記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、予防薬、医薬などを投与する 手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監 督官庁 (例えば、 日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局 (FDA)な ど)が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記さ れる。指示書は、いわゆる添付文書（package insert)であり、通常は紙媒体で提 供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体 (例 えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような 形態でも提供され得る。
[0096] 本発明の方法による予防処置の終了の判断は、市販のアツセィもしくは機器使用 によって惹起される抗体を確認することによって行うことができる。
[0097] 本発明はまた、本発明の医薬組成物の 1つ以上の成分を満たした 1つ以上の容器 を備える薬学的パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製 造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に 任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する 政府機関による承認を表す。
[0098] (好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本 発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に 限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参 酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
[0099] 1つの局面において、本発明は、粘膜投与のためのワクチンを提供する。このワク チンは、 A)二本鎖 RNA;および B)ウィルスのサブユニット抗原または不活化抗原、 を含む。ここで、二本鎖 RNA、ウィルスサブユニット抗原および不活化抗原は当該分 野において周知の方法により調製することができる。粘膜投与のために適切な形態 は、当該分野において周知であり、例えば、液状にすること、あるいは、噴霧形態に することなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明は、二本鎖 RNAとウイノレ スサブユニット抗原または不活化抗原との組み合わせにより、気道粘膜の分泌型 IgA の力価が上昇し、実際に感染防御効果が実証された。このような効果は、従来、二本 鎖 RNAはアジュバントとして抗体まで産生する力 実際の感染防御効果を発揮しな レ、ことが多数報告されている現状にかんがみると、予想外の顕著な効果であるといえ る。
[0100] 本発明のワクチンは、粘膜投与によりその顕著な効果を達成することから、粘膜を 経由する投与（例えば、経鼻投与、 口腔内投与など）であればどのような経路を経由 してもよいが、好ましい実施形態では、経鼻経路をとることができる。
[0101] 好ましい実施形態では、本発明のワクチンの対象となる病原体は、例えば、水痘ゥ イノレス、麻疼ゥイノレス、ムンプスゥイノレス、ポリオゥイノレス、口タウイノレス、インフノレエン ザウィルス、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス、風疹ウィルス、 SARSウィルス、 HIV 、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザ b菌、肺炎菌およびコレラ菌からなる群より選 択されるものであり得る。好ましくは、病原体は、インフルエンザウイルスである。本発 明は、インフルエンザウイルスの型（A型、 B型）内の株（例えば、 H1N1など）内の亜 型同士の交叉反応性を実質的に史上初めて示すワクチンを提示したという優れた効 果を示す。場合によっては、型の壁を超えた交叉反応性を示すことから、本発明は、 従来技術では達成されなかった効果を示す。インフルエンザウイルスは、毎年流行が 変わり、ウィルス自体が変化することから、従来毎年予測してインフルエンザウイルス のワクチンを調製していた。しかし、本発明により、株、亜種を超えた交叉反応性が達 成されることから、流行を予測しなくても予め有効なインフルエンザワクチンを提供す ることができるようになったという効果が示される。また、予測する必要がなくなつたこと から、長期保存したワクチンを利用可能とすることができる。
[0102] 好ましい実施形態では、本発明で使用される病原体のサブユニットは、インフルェ ンザウィルスの HA、 NA、 Ml、 M2、 NP、 PB1、 PB2、 PAおよび NS2からなる群よ り選択されるサブユニットを含む。より好ましくは、表面に提示されているサブユニット (例えば、 HA、 NA)を用いる。より好ましくは、この表面提示サブユニットを複数 (例 えば、 HAおよび NA)使用することが有利である。表面に提示されているサブュニッ トを使用することによって、より有効な抗原抗体反応を惹起し得、中和抗体を惹起す ること力 S可肯 となるカゝらである。
[0103] 好ましくは、二本鎖 RNAは、分泌型 IgAを産生するに十分な濃度で存在する。そ のような二本鎖 RNAの濃度は、例えば、 0. 1一 10mg/mlであり、より好ましくは、 0 . 5— 2mg/mlであり、さらに好ましくは、約 lmgZml (例えば、 0. 8—1. 2mg/ml )である。
[0104] 好ましくは、二本鎖 RNAは、分泌型 IgAを産生するに十分なサイズで提供される。
そのようなサイズとしては、例えば、 102bp以上であり、 0— 3 X 106bp、より好ましくは 300bp以上の大きさが好ましいがそれらに限定されなレ、。本発明の二本鎖 RNAの サイズの上限は限定されないが、例えば、サイズの上限としては、 108bpが挙げられ るがそれらに限定されない。
[0105] 好ましい実施形態において、本発明のワクチンにおいて使用されるサブユニットは 、少なくとも NAまたは HAを含むことが有利である。これらの一方、より好ましくは両 方を含むことによって、有効に中和抗体を惹起し得、抗ウィルス効果が達成されるか らである。
[0106] 二本鎖 RNAは、好ましくは、 Poly (I : C)を含む力 他の二本鎖 RNA (例えば、 Pol y (A : U)、 Poly (G : C)、それらの混合物などを用いることができる。 Poly (I : C)は、 どのようなものを用いてもよぐヌクレオチドが改変されていても改変されていなくても よい。
[0107] 別の局面において、本発明は、感染性疾患を予防するための方法を提供する。こ の方法は、 A)粘膜投与のためのワクチンであって、 a)二本鎖 RNA (好ましくは、 Pol y (l : C) )；および b)ウィルスのサブユニット抗原、を含む、ワクチンを、少なくとも 1回 粘膜投与する工程を包含する。ワクチンの粘膜投与は、投与される部位に応じて適 切な形態で行うことができる。経鼻投与の場合、噴霧、塗布、あるいは直接ワクチン 液をたらすなどの種々の方法を用いることができる。
[0108] ワクチン投与は、好ましくは、少なくとも 2回行うことが有効である。このような免疫を 、場合によって追加免疫という。追加免疫を行うことによって、より効果の高い感染防 御効果を奏することができる。
[0109] 複数回ワクチン投与を行う場合、間隔は少なくとも 1週間以上、より好ましくは 3週間 以上あけることがこのましい。二本鎖 RNA、 Poly (I : C)、抗原などの態様は本明細 書中上述のとおり行うことができる。
[0110] 別の局面において、本発明は、感染疾患を予防するためのワクチンキットを提供す る。このキットは、 A)粘膜投与のためのワクチンであって a)二本鎖 RNA;および b)ゥ ィルスのサブユニット抗原、を含む、ワクチン；ならびに B)該ワクチンを、少なくとも 1 回投与することを指示する指示書、を備える。このキットは、医薬品としてパッケージ で販売され得る。指示書は、厚生労働省などの当局の認可を示す文言と、使用方法 を示す文言が記載されている。ワクチンの調製、投与方法は、本明細書中上述のと おりである。
[0111] (インフルエンザワクチンサブユニット抗原のポリペプチド形態）
1つの局面において、本発明は、感染症の疾患、障害または状態の予防、処置ま たは予後のための組成物であって、予防、処置または予後上有効な量のインフルェ ンザワクチンサブユニット抗原、またはそのフラグメントもしくは改変体と、二本鎖 RN Aを含む、組成物を提供する。ここで、予防、処置または予後上有効な量は、当該分 野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定する ことができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、 重篤度など）、患者の年齢、体重、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定する ことができる（例えば、「ワクチンハンドブック」、国立予防衛生研究所学友会編（199 4)；「予防接種の手引き 第 8版」、木村三生夫、平山宗宏、堺春美編、近代出版 (2 000)；「生物学的製剤基準」、細菌製剤協会編（1993)など)を参照のこと)。
[0112] 以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的の みに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなぐ 特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0113] 以下の実施例では、対象となる患者からはすべて事前に告知しコンセントもらった 上で実験を行った。動物の取り扱いは、国立感染症研究所および大阪大学におい て規定される基準を遵守した。以下の実施例で使用した試薬は、シグマアルドリッチ ジャパン、ャマサ醤油、 Flukaのいずれかから入手した。
[0114] (実施例 1 ·合成二本鎖 RNAである Poly (I : C)のアジュバント作用）
本実施例では、合成二本鎖 RNAとして Poly (I： C)をアジュバントとして用いて不活 化ウィルスまたはサブユニット抗原の中和抗体惹起能、ひいては感染防御効果を確
5、し/ [0115] (材料）
マウス： BALB/cマウス（6週齢、雌）
ウィルス：インフルエンザウイルス H1N1 (A/PR8)株（国立感染症研究所（東京都 新宿区戸山 1一 23— 1)から入手した）
ワクチン：インフルエンザウイルス H1N1 (A/PR8)株 H1N1 (AZBeijing)株（国 立感染症研究所）； H1N1(A/Yamagata)株（国立感染症研究所）； H3N2(AZ Guizhou)株（国立感染症研究所）；エーテル処理不活化 HAワクチン (財団法人 阪大微生物病研究会、香川県観音寺巿八幡町 2 - 9 - 41)
アジュバント：ポジティブコントロールとして CTB* (CTB (コレラ毒素 Bサブユニット） 、 0. 1%CT (コレラ毒素）を含む）、 Poly(I:C)。
[0116] (方法）
6週齢の BALB/cマウス（日本 SLC (株）、東京）各群 5匹ずつを用いた。 PR8HA ワクチン（国立感染症研究所、財団法人 阪大微生物病研究会） 1 μ gをそれぞれの アジュバントとして Poly(I:C)、 0· l g、 l g、 3 g、 10 /igと共にそれぞれの鼻腔 内に 5 μ 1を接種し 3週後同量のワクチンをアジュバントなしもしくはアジュバント有り を経鼻接種し、さらに 2週後に、 lOOpfuの PR8インフルエンザウイルスを片鼻 1. 2β 1ずつ接種し感染を行った。コントロールとして Poly (I:C) 10 および 1/igのみ、 P R8HAワクチンのみ、処置なしの群をおいた。感染 3日後に鼻腔洗浄液、血清を回 収し、鼻腔洗浄液中の IgA、血清中の IgGを ELISA法を用い、鼻腔洗浄液中のウイ ルス価を MDCK細胞を用いたプラークアツセィで測定した。
[0117] 同様に経鼻免疫したマウスに 40LD の致死量（lCT 'EID (50%の発育鶏卵に
50 50
おいて感染性を示すウィルス量の約 50000倍量）のウィルスを 20 μ 1感染しその生 存を観察した。
[0118] Poly (I： C)をアジュバントに用レ、た経鼻インフルエンザワクチンの交叉防御をみる 為に亜型の違うインフルエンザウイルス H1N1 (A/PR8)株 H1N1 (Beijing)株、 H 1N1 (A/Yamagata)株、 H3N2 (A/Guizhou)株のワクチンを 3 μ gの Poly (I： C )とともに経鼻接種し 3週後ワクチンのみを接種、さらに 2週後に lOOpfuの PR8インフ ルェンザウィルスを片鼻 1. 2 μ 1ずつ接種し感染を行った。感染 3日後に鼻腔洗浄 液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中の IgA、血清中の IgGを ELISA法を用い、鼻腔洗 浄液中のウィルス価を MDCK細胞を用いたプラークアツセィで測定した。
[0119] (結果）
Poly (I:C)をアジュバントに用レ、た経鼻インフルエンザワクチンによる抗体誘導と感 染防御
Poly(l:C)の粘膜アジュバント能を評価した。 6週間前に 1 μ gの PR8ワクチンを 0. ： 1 μ g_10 μ gに変量した Poly (I:C)と共に経鼻接種し更に 2週間前に同量のヮクチ ンをワクチンのみまたはアジュバントと共に経鼻接種した。鼻腔粘膜での IgA抗体応 答と血中 IgG応答を図 1にし示した。 Poly (I： C)の用量依存性のアジュバント効果を 見るために Poly (I:C)の量は 0. から 10 zgまで段階的に増やしそのアジュバ ント作用をみた。その結果鼻腔粘膜に IgAの応答のためには最低で 0. l xgの Poly (I:C)を初回免疫時に使うと応答が見られる。鼻腔粘膜に誘導される IgAの量は Pol y(I:C)の量依存的であり量を増やせば増やすほどそのアジュバント効果がみられた 。 2回の免疫ともに Poly (I： C)を用レ、ると 1 μ gの量で鼻腔洗浄液中に 100ng/ml以 上の IgA分泌がみられ、初回のみの利用の場合 3/igの Poly(I:C)添加で 100ng/ ml以上の特異的 IgA誘導がみられている。血清中の IgGも同時にしらべたがそれら は IgAの分泌に相関するものであり 1 μ gの PR8ワクチンを Poly (I:C)と共に 4週間隔 で 2回免疫すると 1· 5/ig/mlの血中 IgGが得られた。
[0120] また、同様の免疫条件で 2回目の免疫の 2週間後に lOOpfuの PR8ウィルスを片鼻
1.2 /i 1ずつ感染を行った。ワクチン接種をしないコントロール群では鼻腔洗浄液中 に 103pfu/ml以上のウィルス価にウィルス増殖が見られた（図 2)。し力し、 Poly(I: C)併用で経鼻ワクチン接種を 2回行った群、では完全にウィルス増殖が抑制され、ま た、ワクチン単独で l xg以上ずつ 2回免疫した群、 3 §以上の？0 （1: を初回免 疫時のみに使用した群ではまったくウィルス抑制効果は見られなかった（図 2)。
[0121] また、 l zg、 0.： gの Poly(I:C)を初回のみ併用した群でも 10°'8pfu/ml、 101 • 6pfu/mlと著明なウィルスの増殖抑制が見られた。ワクチンのみの 2回投与群では ウィルスの増殖抑制はまったく見られなかった。
[0122] Poly(I:C)のアジュバント作用に二本鎖 RNAである構造が重要であることを示す ため、？0^(1:0を100でで5分間加熱し、ただちに氷上で冷却し 1 μ gをワクチンと 共に経鼻接種した。その結果、変性無しのとき 121 μ g/ml見られていた IgA応答は 21/ig/mlに激減し血中の IgG応答も 1· 5/ig/ml力ら 0.7μ g/mlに減少した。
[0123] また、 Poly (I:C)の denatureによってウィルスの増殖抑制効果も見られなくなった
[0124] 次に Poly (I： C)併用経鼻ワクチン接種による致死量のインフルエンザウイルス感染 による肺炎の防御効果について検討した。 6週間前に 1 μ gの PR8ワクチンと Poly (I: C)を 10 μ g、 3 μ g、 1 μ g併用し経鼻接種、 2週間前にワクチンのみで追加免疫し、 4 OLD の PR8ウィルス 20μ 1感染後、肺炎の防御能を調べた。ワクチンを施さない群
50
ではマウスは 1週間以内に 5/5が死亡し 3日後の肺のウィルス価も 106pfu以上にの ぼった。し力、しワクチン群では l xg以上の Poly (I:C)併用で全マウスが生存した。こ の結果を以下に示す。
[0125] [表 1]
Figure imgf000026_0001
このように、 Poly (I : C)はアジュノ 感染防御に十分な粘膜 IgA抗体応答を 弓 1き出すことができることがわかった。
(実施例 2： Poly (I： C)併用経鼻ワクチンによる交叉防御) Poly (I： C)併用経鼻インフルエンザワクチンにより誘導されるインフルエンザ感染 防御についてその交叉防御能について検討を行った。 PR8と亜型の違うインフルェ ンザウィルス株 H1N1 (A/Beijing)株 H1N1 (Yamagata)株 H3N2 (A/Guizho u)株のワクチンを 3 μ gの Poly (I： C)と初回免疫し 4週後に同じ株のワクチンのみを 接種、さらに 2週間後に lOOpfuの H1N1 (A/PR8)株を lOOpfu感染させその 3日 後に鼻腔洗浄液中の PR8と交叉反応する IgA、血清中の IgGを測定、また PR8ウイ ルスの交叉防御による感染防御について調べた。
[0127] 図 3、 4に示すごとく同じ亜型の H1N1 (A/Beijing)株 H1N1 (A/Yamagata) 株に対しては IgA、 IgG応答ともに見られウィルスの感染も完全に抑えた。亜型の違う H3N2 (A/Guizhou)株に対しては交叉反応する IgA、 IgGが少量みられウィルス 感染の部分防御がみられた。
[0128] このように Poly (I : C)併用経鼻インフルエンザワクチンによる交叉防御が確認され た。
[0129] (実施例 3： Poly (I： C)の中枢神経への安全性にっレ、て）
Poly (I : C)をヒトの経鼻ワクチンとして用いる場合、鼻腔が脳と近接している為、中 枢神経への安全性が重要である。そこで Poly (I： C)の安全性を確認する目的で BA LB/cマウスへの脳内接種を試みた。 0. 25 μ §、 2. 5 μ §、 25 /i gの Poly (I : C)を 2 5 / 1の PBSに溶解し二段針を用いて脳内接種を行った。接種後の体重変化を測定 しまた生存を観察した。対照、として 25 μ g、 10 μ g、 25 μ gの CTB * (CTB、 0. 1 % CTを含む）を同様に 25 μ 1の PBSに溶解し脳内接種を行った。
[0130] 図 5に示すごとく Poly (I : C)脳内接種群のマウスは全群とも 2週間以上生存し体重 変化も 25 μ g接種群で 5%の体重減少がみられるのみであった。一方対照に用いた CTB * (CTB with 0. 1 %CT)を脳内接種した群においては 10 x g投与で 1Z5 匹 25 μ g投与で 2/5匹それぞれ 4日目で死亡し体重減少も 15%に及んだ。
[0131] (考察）
インフルエンザウイルスの感染防御に粘膜での分泌型 IgA抗体が現行ワクチンで 誘導される IgG抗体よりも有効である事は数多くの研究結果よりあきらかである。粘膜 での IgA誘導には経鼻ワクチンが有効であるが多くの試みにもかかわらず現在のとこ ろヒトで使用できるアジュバントが確立されていない。合成二本鎖 RNAである Poly (I ： C)はヒトへ静注された実績もあり IgA誘導に有効であり経鼻ワクチンのアジュバント としてヒトへの応用に有用であると考えられる。
[0132] 本実施例の実験結果を踏まえると、 Poly (I : C)は粘膜でのインフルエンザウイルス 感染防御に有効な経鼻ワクチンのアジュバントとして有用性が高い。さらに他の病原 体の粘膜ワクチンへの応用も考えられる。
[0133] インフルエンザ等の呼吸器感染の防御には粘膜より分泌される特異的 IgA抗体が 非常に有効である。型の違うウィルスの交叉防御は粘膜に分泌される IgA抗体が主 に担っておりインフルエンザに自然罹患後回復したヒトにはこの IgA抗体が誘導され 同亜型の変異ウィルスの流行に対しても感染防御ができる。未感染の個体の感染防 御の方法にはワクチン接種があるが現在用いられている皮下接種によるワクチンで は粘膜免疫応答が得られず交叉防御能を持つ、より効果的なワクチン開発が求めら れている。粘膜での分泌型 IgAの誘導には経鼻で抗原接種する方法が有るが抗原 の接種のみでは十分な抗体応答はみられずより効果的な免疫応答の為ワクチンと同 時に投与するアジュバントが必要となる。
[0134] 本実施例では、本発明者らは粘膜免疫誘導に有効なアジュバントとして合成二本 鎖 RNAである Poly (I： C)を用い鼻腔粘膜での IgA分泌と血清中の IgG応答と致死 量のインフルエンザウイルスに対する感染防御を実証した。
[0135] その免疫応答はワクチン株と亜型の違うウィルスに対する抗体誘導もみられまたヮ クチン株と亜型の異なるウィルスに対する感染防御もみられ、交叉防御能が確認され た。また、経鼻ワクチンの人への応用を考える場合アジュバントの安全性が問題にな る。今回用いた経鼻接種では投与部位が中枢神経に非常に近接した部位であるた めその神経系へ与える影響と安全性を確認する為に 0. 25 μ g 25 μ gZmouseの 量の Poly (I : C)を脳内接種を行った。その結果対照としたコレラ毒素 Bサブユニット に 0. 1%の全毒素を添カ卩したコレラ毒素（CTB)では 4日目で死亡するマウスが見ら れ（10 z g投与群で 1、 5、 25 x g投与群で 2Z5)体重も 15%以上の減少が見られた のに対し、 poloy (I : C)投与群では全てのマウスが 8日間生存し体重減少も 25 μ g接 種群で一過性に 5%ほどみられたに留まり、過剰量の脳内接種でも死亡がみられず 安全性も確認された。
[0136] 現行の不活化インフルエンザ HAワクチンは、有効なワクチンである力 インフルェ ンザウィルスの侵入門戸である呼吸器粘膜上皮での IgA抗体の誘導能は低いため、 これを改善することにより、さらにその効果が増強可能であると考えられる。本実施例 における実験では、現行不活化インフルエンザ HAワクチンに Poly (I : C)をアジュバ ントとしてカ卩え、これを経鼻投与することにより、ウィルス特異的 IgAが粘膜表面に効 率よく誘導されることが示された。また、マウスにおける実験で、ウィルスのチャレンジ による致死的感染を防御し、かつ、異なる株のウィルスのチャレンジにおいても有効 であることが示唆された。
[0137] また、利用の可能性としてインフルエンザウイルス以外に、呼吸器その他の粘膜経 路で感染する病原体（水痘ウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、ポリオウイルス 、 口タウイノレス、コロナゥイノレス、アデノウイノレス、へノレぺスゥイノレス、風疼ゥイノレス、 SA RSウィルス、 HIV、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザ b菌、肺炎菌およびコレラ 菌等の不活化抗原ワクチンのアジュバントとしても利用が考えられる。
[0138] (実施例 4 :不活化ウィルス粒子を Poly (I : C)と併用する経鼻インフルエンザヮクチ ンとして用いたときの予防効果）
現行のエーテル処理 HA (Split— product vaccine)のみではなぐ他の形態のヮ クチンを使用した場合の Poly (I： C)併用経鼻ワクチンの有用性を確認した。
[0139] (材料）
ワクチン：エーテル処理 HAワクチン (財団法人阪大微生物研究会製）、ホルマリン 不活化全ウィルス粒子ワクチン（Inactivated whole particle
vaccine)、 A/New Caledonia/20/99 (H1N1)ウィルス）（財団法人阪大微 生物研究会製）
マウス： BALB/cマウス（6週齢、雌）。
[0140] (方法）
A/New Caledonia/20/99 (H1N1)ウィルスのホルマリン不活化全ウィルス 粒子ワクチン (Inactivated whole particle caccine) (0. 1 μ g)を Poly (I： C) (1 00_1000bp、 Sigma) (0. 1 μ g)併用経鼻インフルエンザワクチンのワクチン成分と して BALB/cマウス（6週齢、雌）に投与し、 3週間後に同じワクチンを 2回目投与し た。
[0141] その 1週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中の HAと NAとに対する抗体応答をそれ ぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
[0142] (結果）
不活化全ウィルス粒子を Poly (I： C)併用経鼻インフルエンザワクチンのワクチン成 分として用いたときにも、粘膜の防御免疫および全身の防御免疫が高められた。
[0143] し力、も、ワクチンと Poly (I:C)とをそれぞれ 0. 1 μ gで用レヽたときでも、 split—produ ct vaccineを CTB*と併用して完全なウィルス感染阻止が予測されるアジュバント 活性の陽性対照群と同等の応答を示した。さらに、これらの応答は、 split— product vaccineを Poly (I:C)とともに用いた場合よりも高かった。したがって、 split-produ ct vaccineのみではなぐ他の形態のワクチンを使用した場合にも Poly (I: C)併用 経鼻ワクチンの有用性が明らかであった（図 6)。
[0144] (実施例 5：経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしての Poly (I： C)の分子の 大きさ）
経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとして有用な Poly (I： C)の分子の大きさ を検討した。
[0145] (材料）
ウィルス： A/New Caledonia/20/99 (H1N1)ウィルス
Poly(I:C)サイズ：（L)10_300bp(Fluka)、（M) 100— lOOObp (Sigma)、（H) >3. 3X106bp(Fluka)
マウス： BALB/cマウス（6週齢、雌）。
[0146] (方法）
A/ J ew し aledonia 20 99 (HlNl)ヮ ノレスの： 5plit_product vaccine (0 .4 ^)を様々な大きさの？0 （1: (10—30(^ ^1111¾)、 (M)lOO-lOOObp(Si gma)、（H)>3. 3 X 10¾ρ (Fluka) )の 0. 1 μ gといつしょに BALB/cマウス（6週 齢、雌）に経鼻投与し、 3週間後に同じワクチンを 2回目投与した。 その 1週間後に マウスの鼻洗浄液および血清中の HAおよび NAに対する抗体応答をそれぞれ粘膜 および全身の防御免疫の指標として測定した。
[0147] (結果）
Poly(I:C)の分子の大きさが 10_300bpを用いた実験群において他の 2群よりも 低い粘膜免疫応答が認められた。従って、経鼻インフルエンザワクチンのアジュバン トとして有用な Poly (I： C)の分子の大きさは約 300bp以上と考えられる（図 7)。
[0148] (実施例 6: Poly (I:C)以外の 2本鎖 RNAのアジュバント作用）
Poly (I:C)の経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしての作用を、他の 2本 鎖 RNAである Poly (A:U)および単鎖の Poly (A， U)と比較した。
[0149] (材料）
サブユニット：精製 HA
アジュバント： Poly(I:C)、 Poly(A:U)、 Poly(A, U)。
[0150] (方法）
A/New Caledonia/20/99 (H1N1)ウィルスから特異的抗 HAモノクローナ ル抗体結合カラムを用いて HA分子を精製し、その 1 μ gを Poly (A: U) (Sigma)お よび単鎖の Poly(A, U) (Sigma)の l gといつしょに BALB/cマウス（6週齢、雌） に経鼻投与し、 3週後に HAのみを 2回目投与した。その 1週間後にマウスの鼻洗浄 液および血清中の HAに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の 指標として測定した。
[0151] (結果）
Poly (A:U)および単鎖 Poly (A, U)にもアジュバント活性が認められた。 Poly(I: C)のアジュバント活性と比べると、？0 (八:11)、単鎖（八， U)の順に小さかった（図 8 )
従って、 Poly (I:C)以外の二本鎖 RNAにも経鼻インフルエンザワクチンと併用する とアジュバント活性が見られることが確認された。
[0152] (実施例 7： Poly (I： C)併用経鼻投与条件でレ、くつかのインフルエンザウイルスのサ ブユニットによる防御免疫誘導）
Poly (I： C)併用経鼻投与条件でレ、くつかのインフルエンザウイルスのサブユニット は防御免疫を誘導することを確認した。 [0153] (材料）
サブユニット： HA、 NA、 Mlおよび NP
アジュノくント： Poly (I : C) ( 100— 1000bp、 Sigma)
マウス： BALB/cマウス（6週齢、雌）。
[0154] (方法）
Poly (I : C)と一緒に経鼻投与されたインフルエンザウイルスのサブユニット、 HA、 NA、 Mlおよび NPの防御効果誘導能を比較した。即ち、 A/NewCaledoniaZ20 /99 (H1N1 )ウィルスから特異的抗モノクローナル抗体結合カラムを用いて HA、 N A、 Mlおよび NP分子を精製し、その l x gを Poly (I : C) ( 100_1000bp、 Sigma) の 1 μ gと一緒に BALB/cマウス（6週齢、雌）に経鼻投与し、 3週間後にそれぞれの 分子を 2回目投与した.その一週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中のそれぞれ の分子に対する抗体応答を粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
[0155] (結果）
Poly (I： C)はどのサブユニットに対する粘膜および全身の免疫応答をも増強するこ と力 S示された。し力 ながら、 HAおよび NAに対する液性免疫増強によっては予防 効果が高められたが、 NPに対する液性免疫増強によっては予防効果を高められな かった。従って、 HAおよび NAが強い防御抗原であり、サブユニットによって予防効 果誘導能に違レ、もあることが分かった。
[0156] (実施例 8： Poly (I： C)併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を高める投与回 数と投与間隔）
Poly (I： C)併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を高める投与回数と投与間 隔を検討する。
[0157] (材料） accme ( 1 μ g)
アジュバント： Poly (I : C) [ 100_1000bp、 Sigma]
マウス： BALB/cマウス（6週齢、雌）。
[0158] (方法） Poly (I : C)併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を高める投与回数と投与間 隔を検討するために、 A/New Caledonia/20/99 (H1N1)ウィルスの Split_p roduct vaccine (l g)を Poly (I : C) (100— 1000bp、 Sigma)の 1 μ gと一緒に B ALBZcマウス（6週齢、雌）に経鼻投与し、 1、 3、 4、 6週間後に同じワクチンを 2回 目投与した。その 1あるいは 2週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中の HAおよび NAに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標にして測定し た。また、この時一回投与のみで 1および 8週後の実験群もおかれた。
[0159] (結果）
一週間以上の間隔で 2回以上の投与が Poly (I： C)併用経鼻インフルエンザヮクチ ンの有効性を高めるのに有効であった（図 9 )。
[0160] (実施例 9： Poly (I : C)併用経鼻インフルエンザワクチンのヒトでの予防効果）
Poly (I： C)併用経鼻インフルエンザワクチンのヒトでの有効性にっレ、て抗インフノレ ェンザ抗体応答から確認する。
[0161] (材料）
ワクチン：現行のインフルエンザの三価ワクチン [A/NewCaledonia (HlNl)、 A /Panama (H3N2)、 B/Shangdongの 3ウィルス株由来の split—product vacci ne] (財団法人阪大微生物病研究会）
アジュノくント： Poly (I : C) (100— 1000bp、 Sigma)。
[0162] (被験者）
健常人 2—数名。
[0163] (方法）
健康成人に、 400 μ g/mlの三価ワクチンと 700 μ gZmlの Polyl： Cを含む液を、 300 z L (150 z Lずつ左右鼻腔に）噴霧投与し、さらに 4週間後再投与する。再投 与後二週間目に唾液及び血清材料を採取し、 HAおよび NAに対する抗体応答を測 定する。投与前、 2回投与後の抗体価の比によって、この経鼻ワクチンの抗体応答誘 導能を評価する。
(結果）
被験者にワクチン中の 3株に対する唾液中の IgA抗体の増加が認められる。 [0164] また、一部の被験者において、血清中の抗 NA— IgG抗体や HI抗体の上昇が認め られる。
[0165] (実施例 10 :百日咳のワクチンを Poly (I : C)と共に経鼻投与した場合の免疫能の 増強）
インフルエンザ以外感染症である百日咳のワクチンを Poly (I： C)と共に経鼻投与し た場合の免疫能の増強を確認した。
[0166] (材料）
ワクチン：百日咳ワクチン (財団法人阪大微生物研究会製）
アジュバント： Poly (I : C) (100_1000bp、 Sigma)
マウス： BALB/cマウス（6週齢、雌）。
[0167] (方法 1)
百日咳ワクチン (財団法人阪大微生物病研究会製）（1一 3 z g)を Poly (I : C) (100 一 1000bp、 Sigma)、の 0. 1 /i g— 10 μ gと一緒に BALB/cマウス（6週齢、 ίϋ)に 経鼻投与し、 3週間後に同じワクチンを 2回目投与した。 2回
目投与後 1週間目のマウスの鼻洗浄液と血清中の百日咳ワクチンに対する抗体応答 を EL
ISA法により測定し、粘膜および全身の防御免疫の指標とした。
[0168] (結果）
Poly (l : C)は百日咳ワクチンに対する防御免疫をも高め、インフルエンザ以外の感 染症に対するワクチンに対する防御免疫増強にも有効であることが示唆された（図 1 0)。
[0169] (方法 2)
百日咳ワクチン (財団法人阪大微生物研究会製）（1一 3 z g)を Poly (I : C) (100- 1000bp、 Sigma)、の 0. 1-10 μ gと一緒に BALB/cマウス（6週齢、雌）に経鼻投 与し、 3週後に同じワクチンを 2回目投与した。 2回目投与後一週間目にマウスの鼻 洗浄液と血清中の百日咳ワクチンに対する抗体応答を ELISA法により測定し、粘膜 と全身の防御免疫の指標とした。また、 2回目投与後 2— 3週間後に、百日咳菌強毒 株を免疫マウスの脳内あるいは鼻腔内（噴霧）に接種 14日間観察し、免疫マウスの 生存率から効果を推定した。
[0170] (結果）
マウス生存率から、 Poly (l : C)は百日咳ワクチンに対する防御免疫をも高め、イン フルェンザ以外の感染症に対するワクチンに対する防御免疫増強に有効であること が確認された。
[0171] (実施例 11 :水痘ワクチンを Poly (I : C)とともに経鼻投与した場合のヒトでの予防効 果）
追加接種として Poly (I： C)併用経鼻水痘生ワクチンの成人での安全性および有効 性について、経鼻粘膜接種法により行い、液性免疫および細胞性免疫を水痘ワクチ ン単独経鼻接種を行った群と比較する。
[0172] (材料）
ワクチン：水痘生ワクチン (財団法人阪大微生物研究会製）
アジュノくント： Poly (I : C) (100— 1000bp、 Sigma)
健常人:各群 2—数名。
[0173] (方法）
水痘生ワクチン 2バイアル/人に注射用生理食塩水中を加え、これを健康成人に ネブライザ一で経鼻接種する。また、現行のワクチンと Poly (I : C) (100-lOOObp, S igma)を含むワクチン液を、 300 μ 1 (150 / lずつ左右鼻腔に）噴霧投与する。液性 免疫および細胞性免疫を測定することにより、予防効果を確認する。
[0174] (結果）
Poly (l : C)は水痘生ワクチンに対する防御免疫をも高め、インフルエンザ以外の感 染症に対するワクチンに対する防御免疫増強に有効であることが示唆される。
[0175] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発 明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解され る。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体 的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として 援用されるべきであることが理角军される。
産業上の利用可能性 本発明により、粘膜投与により簡単にワクチン接種し、かつ、交叉免疫性を得ること ができるワクチン形態が提供される。これにより、例えば、インフルエンザウイルス対策 において、有効なワクチンを製造することができ、効率よい予防対策を講じるための 医薬などの産業において大いに利用される可能性がある。

Claims

請求の範囲
[1] 粘膜投与のためのワクチンであって、
A)二本鎖 RNA;および
B)病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチン。
[2] 前記粘膜は、鼻の粘膜を含む、請求項 1に記載のワクチン。
[3] 前記病原体は、水痘ウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、ポリオウイルス、ロタ ウィルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス、風疹ウィルス、 重症急性呼吸器症候群ウィルス（SARSウィルス）、ヒト免疫不全症ウィルス (HIV)、 百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザ b型菌、肺炎菌およびコレラ菌からなる群より選 択される、請求項 1に記載のワクチン。
[4] 前記病原体は、インフルエンザウイルスである、請求項 1に記載のワクチン。
[5] 前記サブユニットは、インフルエンザウイルスの HA、 NA、 Ml、 M2、 NP、 PB1、 PB 2、 PAおよび NS2からなる群より選択される少なくとも 1つのサブユニットを含む、請 求項 1に記載のワクチン。
[6] 前記二本鎖 RNAは、分泌型 IgAを産生するに十分な濃度で存在する、請求項 1に
[7] 前記二本鎖 RNAは、 0. 1一 10mg/mlの濃度で存在する、請求項 1に記載のワク チン。
[8] 前記二本鎖 RNAのサイズは、 102— 108bpである、請求項 1に記載のワクチン。
[9] 前記サブユニットは、少なくとも NAまたは HAを含む、請求項 1に記載のワクチン。
[10] 前記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、請求項 1に記載のワクチン。
[11] 感染疾患を予防するための方法であって、
A)粘膜投与のためのワクチンであって、
a)二本鎖 RNA;および
b)病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチンを、少なくとも 1回粘膜投与する工程を包含する、方法。
[12] 前記ワクチンの投与は、少なくとも 2回行われる、請求項 11に記載の方法。
[13] 前記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも 1週間以上である、請求項 11に記載の方法
[14] 前記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、請求項 11に記載の方法。
[15] 感染疾患を予防するためのワクチンキットであって、
A)粘膜投与のためのワクチンであって
a)二本鎖 RNA;および
b)病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチン；ならびに
B)該ワクチンを、少なくとも 1回粘膜投与することを指示する指示書、
を備える、キット。
[16] 前記ワクチンの投与は、少なくとも 2回行われる、請求項 15に記載のキット。
[17] 前記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも 1週間以上である、請求項 15に記載のキッ 卜。
[18] 前記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、請求項 15に記載のキット。
[19] 二本鎖 RNAの、ワクチンの粘膜投与のための使用。
[20] 前記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、請求項 19に記載の使用。
[21] 二本鎖 RNAの、粘膜投与のためのワクチンの製造のための使用。
[22] 前記二本鎖 RNAは、 Poly (I : C)を含む、請求項 21に記載の使用。
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