EA014757B1 - Химерный аденовирусный вектор, иммуногенная композиция на его основе, способ индукции иммуного ответа с его помощью и выделенная нуклеиновая кислота - Google Patents

Химерный аденовирусный вектор, иммуногенная композиция на его основе, способ индукции иммуного ответа с его помощью и выделенная нуклеиновая кислота Download PDF

Info

Publication number
EA014757B1
EA014757B1 EA200801907A EA200801907A EA014757B1 EA 014757 B1 EA014757 B1 EA 014757B1 EA 200801907 A EA200801907 A EA 200801907A EA 200801907 A EA200801907 A EA 200801907A EA 014757 B1 EA014757 B1 EA 014757B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
vector
zeo
promoter
agonist
Prior art date
Application number
EA200801907A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801907A1 (ru
Inventor
Шон Н. Такер
Original Assignee
Вэксарт, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вэксарт, Инк. filed Critical Вэксарт, Инк.
Publication of EA200801907A1 publication Critical patent/EA200801907A1/ru
Publication of EA014757B1 publication Critical patent/EA014757B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C12N15/8613—Chimaeric vector systems comprising heterologous sequences for production of another viral vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Изобретение относится к химерным аденовирусным векторам и использованию этих векторов для создания иммунного ответа на интересующий антиген.

Description

Настоящее изобретение относится к химерным аденовирусным векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, которые кодируют гетерологичный полипептид, а также к способам индукции иммунного ответа против гетерологичного полипептида.
Сведения о предшествующем уровне техники
Вакцины являются важным средством профилактики и/или лечения различных заболеваний и расстройств (например, вирусных инфекций, бактериальных инфекций и рака). Вакцины, основанные на нуклеиновых кислотах, характеризуются несколькими преимуществами, по сравнению с белковыми или ослабленными живыми вакцинами. Введение нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует антиген, в клетку-мишень позволяет быстро разработать вакцину, генерирующую иммунный ответ против интересующего антигена. В случае белковых вакцин каждый раз, когда требуется создать вакцину, необходимо также разработать эффективный и целесообразный способ очистки белка. В случае живых вакцин необходимо найти способ их ослабления, который не полностью останавливал бы рост патогена, но делал бы его безопасным для людей. На разработку методов очистки белков и методик ослабления уходит чрезвычайно много времени. Напротив, большую часть вакцин, основанных на нуклеиновых кислотах, можно изготовить очень быстро, используя каждый раз одни и те же технологии только с незначительными модификациями нуклеиновых кислот, кодирующих интересующий антиген. Одной из систем вакцин, основанных на нуклеиновых кислотах, является некомпетентный по репликации аденовирус, ее высокий титр удается получить быстро, предсказуемо и недорого. [Ροϊο, 1. М. апб ОпЬспАу. Т. ^., 1г., Эгид Όίκεον Тобау, 7(13), 719-727 (2002)]. Однако эффективность антиген-специфического ответа после введения аденовирусных векторов невелика. Таким образом, в уровне техники существует ярко выраженная потребность в новых аденовирусных векторах, которые можно было бы использовать для эффективной индукции иммунного ответа против интересующего антигена. Настоящее изобретение призвано удовлетворить эти и другие потребности.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к химерным аденовирусным векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, которые кодируют гетерологичный полипептид, а также способам индукции иммунного ответа против гетерологичного полипептида.
Один аспект изобретения относится к химерным аденовирусным векторам экспрессии, содержащим кассету расширения, которая содержит: (а) первый промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей агонист То11-подобного рецептора (То11-11ке гесерЮг (ТЬК)-3); и (Ь) второй промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид. В соответствии с некоторыми аспектами агонист ТЬВ-3 представляет собой дцРНК (двухцепочечная РНК или бкКЫЛ). В соответствии с некоторыми аспектами кодирующая ТЬВ-3 агонист нуклеиновая кислота содержит последовательность, выбранную из следующих: 8ЕО ГО N08: 3, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В соответствии с некоторыми аспектами гетерологичный полипептид выбран из числа оболочечных полипептидов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (например, др41, др120 или др160) и полипептида гриппа НА. В соответствии с некоторыми аспектами первый промотор совпадает со вторым. В соответствии с некоторыми аспектами первый промотор и второй промотор разные. В соответствии с некоторыми аспектами промоторы выбраны из числа бета-актинового промотора и промотора цитомегаловируса (СМУ, или ЦМВ). Изобретение относится также к иммуногенным композициям, содержащим вектор экспрессии.
Еще один аспект изобретения относится к способам индукции иммунного ответа против гетерологичного полипептида, предусматривающий введение иммунологически эффективного количества композиций млекопитающему (например, грызуну, такому как мышь, крыса или морская свинка, или примату, такому как шимпанзе, макака-резус или человек). В соответствии с некоторыми аспектами вектор вводится по непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально). В соответствии с некоторыми аспектами гетерологичный полипептид экспрессируется в клетках, выбранных из числа дендритных клеток, складчатых клеток и клеток эпителия кишечника.
Еще один аспект изобретения относится к иммуногенным композициям, содержащим: (а) химерные аденовирусные векторы экспрессии, содержащие промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид; и (Ь) агонист ТШ-3 (например, дцРНК). В соответствии с некоторыми аспектами, агонист ТЬВ-3 кодируется нуклеиновой кислотой. Изобретение относится также к способам индукции иммунного ответа, заключающимся во введении композиций млекопитающему (например, грызуну, такому как мышь, крыса или морская свинка, или примату, такому как шимпанзе, макака-резус или человек) по любому непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально).
Еще один аспект изобретения относится к выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, описанную в 8Е0 ГО N08: 1, 2, 6, 7, 13, 14, 15, 16 или 17.
Перечень фигур, чертежей и иных материалов
Перечень фигур
На фиг. 1-2 представлены данные, демонстрирующие, что химерный аденовирусный вектор изобретения (например, Ό81) совместно с агонистом ТШ-3 более эффективен в индукции антиген
- 1 014757 специфического иммунного ответа после орального введения, чем стандартный аденовирусный вектор (например, гАб5).
На фиг. 1 представлены данные, отражающие титр антител к оболочечному белку ВИЧ (то есть, др120) через три недели после орального введения аденовирусных векторов.
На фиг. 2 представлены данные, отражающие титр антител к оболочечному белку ВИЧ (то есть, др120) через шесть недель после орального введения аденовирусных векторов.
На фиг. 3-5 представлены данные, демонстрирующие, что химерный аденовирусный вектор изобретения (то есть, Э81Ь или Э81с) совместно с агонистом ТЬВ-3 более эффективен в индукции антигенспецифического иммунного ответа, чем стандартный аденовирусный вектор (например, гАб5).
На фиг. 3 представлены данные, отражающие титр аий-СЕР 1дС через три недели после орального введения векторов.
На фиг. 4 представлены данные, отражающие ответ Т-клеток СВ8+ на СЕР через 10 недель после введения вектора в 0, 4 и 8 недели.
На фиг. 5 представлены данные, отражающие титр антител аий-НА через три недели после орального введения векторов.
На фиг. 6-7 представлены данные, демонстрирующие, что химерные аденовирусные векторы изобретения вызывают иммунный ответ более эффективно, если введены непарентерально.
На фиг. 6 показаны данные, отражающие титр аий-др120 антител через три недели после внутримышечного введения Ό81.
На фиг. 7 показаны данные, отражающие титр аий-НА через три недели после интраназального введения О81с.
На фиг. 8-9 представлены данные, демонстрирующие, что экспрессируемые агонисты ТЬВ-3 могут индуцировать активацию антиген-представляющих клеток.
На фиг. 8 представлены данные, отражающие активацию дендритных клеток экспрессируемым дцРНК ТЬВ-3 агонистом 1ис1.
На фиг. 9 представлены данные, отражающие активацию дендритных клеток экспрессируемыми дцРНК ТЬВ-3 агонистами 1ис1 и т1.
Фиг. 10 представляет собой графическую иллюстрацию химерных аденовирусных векторов изобретения, то есть, химерных аденовирусных векторов, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие экспрессируемые дцРНК ТЬВ-3 агонисты.
На фиг. 11 представлены данные, демонстрирующие, что химерные аденовирусные векторы изобретения эффективно индуцируют антиген-специфический иммунный ответ после введения орально. Данные этой фигуры отражают титр аий-др120 антител через три недели после орального введения химерного аденовируса, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует дцРНК ТЬВ-3 агонист 1ис11.
На фиг. 12 представлены данные, демонстрирующие, что агонисты ТЬВ-7/8 малоэффективны в индукции антиген-специфического иммунного ответа.
На фиг. 13-15 представлены данные, демонстрирующие, что химерные аденовирусные векторы изобретения эффективно индуцируют антиген-специфический иммунный ответ после орального введения.
Данные фиг. 13 демонстрируют титр аий-НА антител четыре недели спустя орального введения химерной аденовирусной композиции, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует дцРНК ТЬВ-3 агонист 1ис 1.
Данные фиг. 14 демонстрируют титр аий-НА антител через четыре или семь недель после введения химерной аденовирусной композиции, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует дцРНК ТЬВ-3 агонист 1ис1.
На фиг. 15 представлены данные, показывающие титр аий-НА антител через три недели после орального или интраназального введения химерной аденовирусной композиции, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирующую дцРНК ТЬВ-3 агонист 1ис1.
Перечень последовательностей
ЕС ГО N0: 1 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора Ό81.
ЕС ГО N0: 2 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора Ό82.
8Е0 ГО N0: 3 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую ТЬВ-3 агонист.
8ЕСУЭ N0:4 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую ТТВ-3 агонист.
8Е0 ГО N0: 5 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую ТЬВ-3 агонист.
8Е0 ГО N0: 6 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую НА гриппа, и нуклеиновую кислоту, кодирующую ТЬВ-3 агонист (1ис), где НА гриппа и ТЬВ-3 агонист находятся в одной и той же ориентации.
8Е0 ГО N0: 7 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую НА гриппа, и нуклеиновую кислоту, кодирующую
- 2 014757
ТЬК-3 агонист (1ис), где НА гриппа и ТЬК-3 агонист находятся в противоположной ориентации.
8ЕО Ш N0: 8 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНК ТЬК-3 агониста. Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.
8Е0 Ш N0: 9 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНК ТЬК-3 агониста (д1). Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.
8Е0 Ш N0: 10 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНК ТЬК-3 агониста (1ис). Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.
8Е0 Ш N0: 11 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНК ТЬК-3 агониста (т1). Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.
8Е0 Ш N0: 12 описывает нуклеотидную последовательность, кодирующую короткую шпильку РНК ТЬК-3 агониста. Комплементарные фрагменты последовательности обозначены заглавными буквами, а последовательности линкера - маленькими буквами.
8Е0 Ш N0: 13 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора Ь81с. Последовательность содержит нуклеотиды, кодирующие НА(РК8/34).
8Е0 Ш N0: 14 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора Ь82Ье1а-1ис. Вектор содержит последовательность, кодирующую ТЬК-3 агонист 1ис под контролем промотора бета-актина. Вектор содержит также открытые сайты клонирования для включения нуклеотидной последовательности (последовательностей), кодирующих интересующий антиген.
8Е0 Ш N0: 15 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора О82С-1ис. Вектор содержит последовательность, кодирующую ТЬК-3 агонист 1ис под контролем промотора ЦМВ. Вектор содержит также открытые сайты клонирования для включения нуклеотидной последовательности (последовательностей), кодирующих интересующий антиген.
8Е0 Ш N0: 16 описывает нуклеотидную последовательность челночного вектора р8йий1е, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую ТЬК-3 агонист 1ис под контролем промотора ЦМВ и нуклеотидную последовательность, кодирующую НА (птичий грипп) под контролем другого промотора ЦМВ.
8Е0 Ш N0: 17 описывает нуклеотидную последовательность химерного аденовирусного вектора N0 1.1 214. Нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный антиген, выделена полужирным шрифтом и ограничена по краям сайтом распознавания С1а I по 5' концу и сайтом распознавания N01 1 по 3' концу. Нуклеотидная последовательность, кодирующая ТЬК-3 агонисты, выделена курсивом, а последовательность линкера полужирным шрифтом.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
I. Введение.
Настоящее изобретение относится к новым химерным аденовирусным векторам, которые можно вводить непарентерально с целью вызвать иммунный ответ против интересующего антигена. Химерные аденовирусные векторы изобретения включают нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный полипептид, и нуклеиновую кислоту, кодирующую ТЬК-3 агонист. Химерные аденовирусные векторы индуцируют сильный и эффективный иммунный ответ, специфичный для гетерологичного полипептида, особенно, если вводятся по непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально).
Изобретение основано на неожиданном открытии, что введение дцРНК ТЬК-3 агонистов является эффективным вспомогательным средством, если осуществляется совместно с вирусными векторами. Фактически, применение дцРНК в качестве адьюванта для вирусных векторов невозможно предположить на основании простой интуиции, особенно если учесть, что основное предполагаемое применение дцРНКмиметических поли 1:С является использование их в качестве противовирусного средства [№те§, е! а1, Ргос 8ос Ехр Βίο1 Меб. (1969) 132:776; 8с11аГег. е! а1, №11иге. (1970) 226:449; Ееи)е, е! а1, №11иге (1970) 226:171].
II. Определения.
Термин химерный или рекомбинантный со ссылкой, например, на нуклеиновую кислоту, белок или вектор означает здесь, что нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка, либо путем изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка. Так, например, химерные или рекомбинантные векторы включают нуклеотидные последовательности, не содержащиеся в нативных (нехимерных или нерекомбинантных) формах вектора. Химерные аденовирусные векторы экспрессии означают аденовирусные векторы экспрессии, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный полипептид. Вектор экспрессии представляет собой нуклеотидный конструкт, сгенерированный рекомбинантно или синтетически, совместно с последовательностью указанных нуклеотидных остатков, который позволяет осуществить транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке хозяина. Вектор экспрессии может входить в
- 3 014757 состав плазмиды, вируса или нуклеотидного фрагмента. Как правило, вектор экспрессии включает транскрибируемую нуклеиновую кислоту, оперативно связанную с промотором.
Термины промотор и последовательность, контролирующая экспрессию, здесь означает массив нуклеотидных контролирующих последовательностей, которые направляют транскрипцию нуклеиновых кислот. Промотор здесь включает необходимую нуклеотидную последовательность, расположенную около стартового сайта транскрипции, такого как, в случае промотора полимеразы II типа, элемент ТАТА. Промотор также может включать дистальные энхансеры или репрессоры, расположенные даже на расстоянии несколько тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промоторы включают конститутивные и индуцибельные промоторы. Конститутивным является промотор, сохраняющий активность при большинстве обстоятельств окружающей среды или развития. Активность индуцибельного промотора контролируется эволюционными условиями или условиями окружающей среды. Термин оперативно (операбельно) связанный означает функциональную связь между контролирующей экспрессию нуклеотидной последовательностью (такой как промотор или массив сайтов связывания факторов транскрипции) и другой нуклеотидной последовательностью, где контролирующая экспрессию последовательность направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты второй последовательности.
Термин ТЬК агонист или агонист То11-подобного рецептора (То11-11ке гееер!ог) означает здесь соединение, которое связывается с То11-подобным рецептором и стимулирует его. Например, это могут быть агонисты рецепторов ТЬК-2, ТЬК-3, ТЬК-6, ТЬК-7 или ТЬК-8. ТЬК агонисты описаны в работах МасКюйап, ΙΑ VI Керой. 9:1-5 (2005) и АЬгеи е! а1, I 1ттипо1, 174(8), 4453-4460 (2005). Агонисты индуцируют трансдукцию сигнала после связывания со своим рецептором.
Термины ТЬК-3 агонист или агонист То11-подобного рецептора третьего типа означает здесь соединение, которое связывается с ТЬК-3 и стимулирует его. ТЬК-3 агонисты, включают двухцепочечные РНК, вирусные дцРНК, некоторые химически синтезированные аналоги двухцепочечной РНК, включая полиинозин-полицитидиловую кислоту (поли 1:С), полиадениловую-полиуридиловую кислоту (поли Α:ϋ), а также поли I: поли С, и антитела (или перекрестно сшитые с антителами) к ТЬК-3, ведущие к генерации ΙΡΝ-бета [Ма!кито!о, М, е! а1, ВюсНет Вюрйук Кек Соттип 24:1364 (2002), бе Вои!еИ1ег, е! а1., I Вю1 СНет 18:38133-45 (2005)]. Агонисты ТЬК-3 включают также экспрессированнуюдцРНК (например, дцРНК, кодируемую нуклеиновой кислотой, последовательность которой описана в 8ЕО Ш N08: 3, 7, 8, 9, 10, 11 или 12).
Термины ТЬК-7/8 агонист или агонист То11-подобного рецептора типа 7/8 означает здесь соединение, которое связывается с рецепторами ТЬК-3 или ТЬК-8 и стимулирует их; некоторые лиганды распознаются теми и другими рецепторами. Было обнаружено несколько агонистов ТЬК-7/8, такие как вирусные одноцепочечные РНК, имихимод, локсорибин, полиуридиловая кислота или резихимод.
Термин гетерологичный здесь с указанием на участок нуклеиновой кислоты означает, что нуклеиновая кислота содержит две или больше последовательности, не находящихся в таком же отношении друг к другу в природе. Например, это может быть нуклеиновая кислота, полученная, как правило, рекомбинантно, содержащая две или более последовательности неродственных генов, связанных так, чтобы образовать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор из одного источника и кодирующий участок из другого источника. Аналогично вышесказанному, термин гетерологичный белок означает, что белок содержит две или более последовательности, не находящиеся в таком же отношении друг к другу в природе (например, химерный белок).
Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид здесь используются в одном смысле и означают дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды и полимеры из них в одно- либо двухцепочечной форме. Термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги, а также модифицированные остатки каркаса или связи, которые могут быть синтетическими, а также встречающимися и не встречающимися в природе, которые характеризуются одинаковыми свойствами связывания с нуклеиновой кислотой сравнения и которые метаболизируются так же, как и нуклеотиды сравнения. Примеры таких аналогов включают, но не ограничиваются, фосфортиоаты, фосфорамидаты, метил фосфонаты, хиральные метил фосфонаты, 2-О-метил рибонуклеотиды, комплексы пептидов и нуклеиновых кислот (ΡΝΑκ - от англ. рерШе-пискю асИк).
Если не указано по-другому, к числу особых нуклеотидных последовательностей относятся также их консервативно модифицированные варианты (например, заместители дегенерированных кодонов) и комплементарные последовательности, а также явным образом указанные последовательности. Конкретно, замену дегенерированных кодонов можно осуществить, сгенерировав последовательности, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов замещено остатками различных оснований и/или деоксиинозиновыми остатками (Ва1хег е! а1, Шс1ею АсИ Кек. 19:5081 (1991); 0Н!кика е! аН, I. Вю1. СНет. 260:2605-2608 (1985); Коккойш е! а1, Мо1. Се11. РгоЬек 8:91-98 (1994)). Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид.
Термин антиген означает белок или часть полипептидной цепочки, которая может быть распознана Т-клеточными рецепторами и/или антителами. Как правило, антигены выделяют из белков бактерий, вирусов или грибков.
- 4 014757
Термин иммуногенно эффективная доза или количество композиций настоящего изобретения означает количество, которое индуцирует или модулирует иммуногенный ответ, специфичный для гетерологичного полипептида. Иммунные ответы включают гуморальные иммунные ответы и опосредованные клетками иммунные ответы. Иммуногенная композиция может применяться терапевтически или профилактически для лечения или профилактики заболевания на любой стадии.
Гуморальные иммунные ответы опосредуются бесклеточными компонентами крови, то есть, плазмой или сывороткой; перенос сыворотки или плазмы от одного индивидуума другому переносит и его иммунитет.
Опосредуемые клетками иммунные ответы опосредуются антиген-специфичными лимфоцитами; перенос антиген-специфичных лимфоцитов от одного индивидуума другому переносит и его иммунитет.
Терапевтическая доза, терапевтически эффективное количество или эффективное количество химерного аденовирусного вектора или композиции, содержащей химерный аденовирусный вектор, представляет собой количество вектора или содержащей вектор композиции, которое предотвращает, ослабляет, уменьшает или снижает интенсивность симптомов заболевания или расстройства, связанного с источником гетерологичного полипептида (например, вирусом, бактерией, паразитом или раком).
Антитело означает полипептид, закодированный геном иммуноглобулина или его фрагментом, который специфически связывается с антигеном и распознает его. Известные гены иммуноглобулина включают гены каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю константных регионов, а также гены вариабельных регионов иммуноглобулина. Легкие цепи бывают либо каппа, либо лямда. Тяжелые цепи могут быть гамма, мю, дельта, альфа или эпсилон, они, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулина ΙβΟ. 1дМ, 1дА, 1дИ и 1дЕ, соответственно.
Т-клетки означают конкретный класс лимфоцитов, которые экспрессируют конкретный рецептор (рецептор Т-клеток), закодированный семейством генов. Известные гены рецепторов Т-клеток включают альфа, бета, дельта и гамма локусы, и, как правило (но не всегда), рецепторы Т -клеток узнают комбинацию МНС и короткого пептида.
Термин адаптивный иммунный ответ означает распознавание антигена Т-клетками и/или антителами.
Термин антиген-представляющие клетки (АРС - от англ. аийдеи ртезеийид се11з) здесь означает клетки, способные представлять иммуногенные пептиды или их фрагменты Т-клеткам, активируя или усиливая иммунный ответ. АРС включают дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, моноциты и другие клетки, которые можно сделать эффективными АРС. Такие клетки можно генетически модифицировать (но необходимости в этом нет), чтобы повысить их способность представлять антиген, чтобы улучшить активацию и/или обслуживание ответа Т-клеток, чтобы обеспечить противоопухолевые эффекты и/или чтобы сделать их иммунологически совместимыми с приемником (то есть, чтобы у них был подходящий гаплотип НЬА). АРС можно выделить из большого количества биологических жидкостей и органов, включая костный мозг, периферическую кровь, опухолевые и периопухолевые ткани, они могут быть автологичными, аллогеничными, сингеничными или ксеногеничными. Как правило, для представления Т клеткам коротких полипептидов в АРС используются локусы рецепторы главного комплекса гистосовместимости (МНС).
Адьювант представляет собой неспецифический усилитель иммунного ответа. Подходящие адьюванты включают, например, токсин холеры, монофосфорил липид А (шопорйо8рйогу1 Ιίρίά А (МРЬ)), полный адьювант Фрейнда, неполный адьювант Фрейнда, Οιιί1 А и А1(ОН)3. Адьюванты могут также вызывать активацию АРС и улучшенную презентацию Т-клеткам посредством вторичных сигнальных молекул, таких как То11-подобные рецепторы. Примеры То11-подобных рецепторов включают рецепторы, распознающие двухцепочечные РНК, жгутики бактерий, ЬР8, СрО ДНК и бактериальные липопептиды (недавно описаны в работе АЬгеи е! а1, 1 1шшипо1, 174(8), 4453-4460 (2005)).
Термины полипептид, пептид и белок используются здесь для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применимы к аминокислотным полимерам, один или более остатков в которых представляют собой искусственные химические миметики соответствующих природных аминокислот, а также полимеры из природных аминокислот и неприродных аминокислот.
Термин аминокислота означает природные и синтетические аминокислоты, а также аналоги и миметики аминокислот, функционирующие наподобие природных аминокислот. Природные аминокислоты кодируются генетическим кодом, некоторые аминокислоты затем подвергаются модификации, например, гидроксипролин, α-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот означают соединения с такой же базовой химической структурой, как и природные аминокислоты, то есть, у которых αуглерод связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и В-группой, например, гомосерин, норлейцин, метионина сульфоксид, метионина метил сульфоний. Такие аналоги содержат модифицированные В-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют такую же базовую химическую структуру, что и природная аминокислота. Миметики аминокислот означают химические соединения, структура которых отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют наподобие природных аминокислот. Аминокислоты здесь могут обо
- 5 014757 значаться либо их распространенным трехбуквенным обозначением, либо однобуквенным символом, рекомендованным комиссией по номенклатуре ГОРЛС-ГОВ В1оейеш1са1 №тспе1а1игс Сотпйккюп. Аналогично этому, нуклеотиды могут обозначаться их повсеместно принятыми однобуквенными кодами.
Термин консервативно модифицированные варианты применим как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. По отношению к нуклеотидным последовательностям термин обозначает нуклеиновые кислоты, кодирующие идентичные или в существенной степени идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, то существенно идентичные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода любой данный белок может кодироваться большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например кодоны ССА, ССС, ССС и ССИ кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, везде, где аланин обозначен кодоном, этот кодон можно заменить на любой из соответствующих указанных кодонов, не меняя закодированный им полипептид. Такие вариации нуклеиновых кислот называются молчащими вариациями, они представляют собой разновидность консервативно модифицированных вариаций. Каждая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, соответствует также всем возможным молчащим вариациям нуклеиновой кислоты. Специалист понимает, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (кроме кодона АИС, который, обычно, является единственным кодоном, кодирующим метионин, и ТСС, который, обычно, является единственным кодоном, кодирующим триптофан) можно модифицировать, получив функционально идентичную молекулу. Соответственно, каждая описанная последовательность неявным образом предполагает все молчащие вариации нуклеиновой кислоты, кодирующие данный полипептид.
Что касается аминокислотных последовательностей, специалист понимает, что индивидуальные замены, делеции или вставки в нуклеиновую кислоту, пептид, полипептид или белковую последовательность, которые изменяют, добавляют или удаляют отдельные аминокислотные остатки или небольшое количество аминокислотных остатков в кодируемой последовательности, представляют собой консервативно модифицированные варианты, если аминокислота замещается на химически подобную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, приводящих к получению функционально похожих аминокислот, хорошо известны в уровне техники. Такие консервативно модифицированные варианты представляют собой, помимо прочего, полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели изобретения.
Следующие далее восемь групп содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга:
1) Аналин (А), Глицин (С);
2) Аспарагиновая кислота (И), Глутаминовая кислота (Е);
3) Аспарагин (Ν), Глутамин (О);
4) Аргинин I, Лизин (К);
5) Изолейцин (I), Лейцин (Ъ), Метионин (М), Валин (V);
6) Фенилаланин (Р), Тирозин (Υ), Триптофан (ЭД);
7) Серии (8), Треонин (Т); и
8) Цистеин (С), Метионин (М) (см., например, С’гещЫоп. Рго1е1П8 (1984)). Фраза селективно (или специфически) гибридизуется с означает связывание, образование дуплексов или гибридизация молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, если последовательность представлена в сложной смеси (например, общая ДНК или РНК клетки или библиотеки).
Фраза жесткие условия гибридизации означает условия, в которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью, как правило, в комплексной смеси нуклеиновых кислот, но не с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различными в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот содержится в работе Туккеп, Тес11шс.|ие5 ίη ВюсйешШгу апб Мо1еси1аг Вю1оду-НуЬпб|/а1юп \νίΐ1ι М1с1е1с РгоЬек, Оуегу|с\у о£ ргтар1ек о£ НуЬг1б1хаИоп апб 111е к1га1еду о£ пис1е1с ас1б аккаук (1993). В общем случае, жесткие условия подбирают так, чтобы температура была, приблизительно, на 5-10°С меньше термальной точки плавления I для конкретной последовательности при определенной ионной силе РН. Тш представляет собой температуру (при определенной ионной силе, Р11 и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зонда, комплементарного мишени, гибридизуется с целевой последовательностью в состоянии равновесия (так как целевая последовательность представлена в избытке, при температуре Тт в состоянии равновесия связано 50% зонда). При жестких условиях концентрация соли бывает меньше, чем, приблизительно, 1,0 М ионов натрия, как правило, приблизительно, от 0,01 до 1,0 М ионов натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, и при температуре не меньше, чем приблизительно, 30°С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и не меньше 60°С для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия можно создать также введением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал должен хотя бы в два раза превышать фоновую гибридизацию, а возможно, в 10 раз. Примеры жестких условий гибридизации могут быть следующие: 50% формамида, 5х 88С и 1% 8Ό8, инкубация при 42°С, или 5х 88С, 1%
- 6 014757
8Ό8, инкубация при 65% с промывкой в 0,2х 88С и 0,1% 8Ό8 при 65°С.
Нуклеиновые условия, которые не гибридизуются друг с другом при жестких условиях, все-таки, являются идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, в существенной степени идентичны. Это бывает, например, если копию нуклеиновой кислоты создают с максимальным вырождением кодона, допустимым генетическим кодом. В таких случаях нуклеиновая кислота, как правило, гибридизуется при умеренно жестких условиях гибридизации. Примеры умеренно жестких условий гибридизации включают гибридизацию в буфере из 40% формамида, 1 М ИаС1, 1% 8Ό8 при 37°С и промывку в 1Х 88С при 45°С. Положительная гибридизация хотя бы в два раза превышает фон. Специалисты понимают, что для создания условий одной жесткости можно применять различные условия гибридизации и промывки.
Антитело означает полипептид, содержащий каркасный регион гена иммуноглобулина или его фрагментов, который специфически связывается с антигеном и распознает его. Известные гены иммуноглобулина включают константные регионы генов каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю константных регионов, а также гены переменных регионов иммуноглобулина. Легкие цепи бывают либо каппа, либо лямда. Тяжелые цепи могут быть гамма, мю, дельта, альфа или эпсилон, они, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулина 1дС. 1дМ, 1дА, 1дЭ и 1дЕ, соответственно.
Пример структурной единицы иммуноглобулина (антитела) содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну легкую (около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа). Ν-конец каждой цепи определяет переменный регион, состоящий, приблизительно, из 100, 110 или больше аминокислотных остатков, в основном, отвечающих за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (УЬ) и вариабельная тяжелая цепь (УН) означают эти легкую и тяжелую цепи, соответственно.
Фраза специфически (или селективно) связывается с антителом или специфически (или селективно) иммунореактивен с в отношении белка или пептида означает реакцию связывания, зависящую от присутствия белка в гетерогенной популяции белков и других биологических веществ. Так, в спроектированных условиях иммуноанализа специфические антитела связываются с конкретным белком, по меньшей мере, в два раза сильнее фона, и, фактически, не связываются в значительных количествах с другими белками образца. Для специфического связывания с антителом в таких условиях может потребоваться наличие антитела, специфически выбранного для конкретного белка. Например, работая с поликлональными антителами, образующимися по отношению к химерному белку, можно выделить только такие поликлональные антитела, которые специфически иммунореактивны с химерным белком, но не с индивидуальными компонентами этих белков. Этого можно добиться, вычитая антитела, перекрестно реагирующие с индивидуальными антигенами. Для выбора антител, специфически реагирующих с конкретным белком, подходят различные способы иммуноанализа. Например, твердофазный иммунохимический анализ (ЕЫ8А) рутинно используется для выбора антител, специфически иммунореактивных с белком (см., например, Наг1оте & Ьаие, АпйЬоФек, А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (1988), в этой работе содержится описание форматов иммунохимического анализа и условий, позволяющих определить специфическую иммунореактивность). Как правило, для специфической или селективной реакции отношение сигнала к шуму будет по меньшей мере два, а более типично, если это отношение составляет от 10 до 100.
Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (то есть, эндогенную последовательность, кодирующую индивидуальный полипептид, дцРНК или его фрагмент), а могут содержать вариант такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен, инсерций, делеций и/или вставок, так чтобы биологическая активность кодируемого полипептида не снижалась, по сравнению с полипептидом, содержащим нативные антигены. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен, инсерций, делеций и/или вставок, так чтобы активность ТЬВ3 агониста закодированной дцРНК не снижалась относительно дцРНК, не содержащего замен, добавлений, делеций и/или вставок. Варианты предпочтительно содержат по меньшей мере приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% от полинуклеотидной последовательности, кодирующей нативный полипептид или его фрагмент, или полинуклеотидной последовательности, кодирующей дцРНК с активностью ТЬВ-3 агониста.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более нуклеотидных (например, дцРНК, являющейся агонистом ТЬВ-3) или полипептидных последовательностей означает две или более последовательности или субпоследовательности, одинаковых или содержащих указанное количество общих аминокислотных остатков или нуклеотидов (то есть, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или еще большая идентичность в указанной области) при сравнении и выравнивании для достижения максимального соответствия в окне сравнения или указанном регионе, причем сравнение осуществляется по одному из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или вручную с визуальным изучением. Такие последовательности затем называют в значительной степени идентичными. Определение относится также к комплементу тестируемой последовательности. Возможно, что идентичность наблюдается в регионе, содержащем по меньшей мере приблизительно от 10 до 100, от 20 до 75, от 30 до 50 аминокислотных остатков или нуклеотидов.
При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность является последовательностью сравнения, и с ней сравнивают тестируемые последовательности. Если используется алго
- 7 014757 ритм сравнения последовательностей, тестируемую последовательность и последовательность сравнения вводят в компьютер, задают координаты последовательности, если необходимо, и параметры алгоритма сравнения. Затем алгоритм рассчитывает процент идентичности последовательностей по отношению к последовательности сравнения, используя при этом параметры программы.
Окно сравнения здесь означает сегмент из любого количества расположенных подряд нуклеотидов (аминокислот), приблизительно, от 10 до 500, от 25 до 200, от 50 до 150, последовательность которого можно сравнивать с таким же количеством расположенных подряд нуклеотидов последовательности сравнения после их оптимального выравнивания. Методы выравнивания последовательностей (кециеисе айдитеи!) для их сравнения хорошо известны в уровне техники. Оптимальное выравнивание последовательностей можно провести, например, по алгоритму локальной гомологии (8ιηί11ι & \Уа1егтап. Λάν. Αρρί. Ма!й. 2:482 (1981)), по алгоритму гомологичного выравнивания (Ыее61етаи & ^ииксй, 1. Μοί. ΒίοΙ. 48:443 (1970)), по методу поиска сходства (Реагкои & Ыртаи, Ргос. Ыа1 'I. Аса6. 86. И8А 85:2444 (1988)), с помощью компьютерной реализации этих алгоритмов (ОАР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, ЕА8ТА и ТЕА8ТА из пакета программ \У15соп5ш Сеиейск 8ой^ате Раскаде, Сеиебск Сотри!ег Огоир, 575 8с1еисе Ότ., Ма61кои, ^1), а также можно выровнять последовательности вручную с последующим визуальным исследованием (см., например, Сштеи! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (АикиЬе1 е! а1., е6к. 1995 кирр1етеи!)).
Одним примером полезного алгоритма является РШЕИР. Он выравнивает несколько последовательностей в группе родственных последовательностей с использованием прогрессивного, попарного выравнивания, позволяющего показать отношения между последовательностями и процент идентичности. Алгоритм позволяет также построить дерево или дендрограмму с иллюстрацией отношений кластеризации, на основании которых создается выравнивание. В РШЕИР используется упрощенный вариант метода прогрессивного выравнивания Фенга и Дулиттла (Ееид & ОооШбе, 1. Мо1. Ενο1. 35:351-360 (1987)). Реализованный метод аналогичен описанному в работе Н1ддшк & 8йагр, САВ1О8 5:151 -153 (1989). Программа может выровнять до 300 последовательностей, максимальная длина каждой 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее похожих последовательностей с получением кластера из двух выровненных последовательностей. Этот кластер затем выравнивается к следующей наиболее похожей последовательности или кластеру выровненных последовательностей.
При выравнивании двух кластеров последовательностей используется простое расширение метода попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Общее выравнивание достигается в результате серии прогрессивных попарных выравниваний. При запуске программы задают конкретную последовательность, а также координаты аминокислотного остатка или нуклеотида ее участка сравнения и параметры программы. С помощью РШЕИР последовательность сравнения сравнивают с другими тестовыми последовательностями и определяют отношение идентичности последовательностей в процентах. Параметры задаются следующие: весовой зазор по умолчанию (3.00), весовой зазор длины по умолчанию (0.10), а также взвешенные зазоры концевых участков. РШЕИР входит в состав программного пакета анализа последовательностей ССС, например, версии 7.0 (Эе^'егеанх е! ай, Ыис. Ас16к Век. 12:387395 (1984).
Другим примером алгоритма, подходящего для определения процентной идентичности и сходства последовательностей являются алгоритмы ВЬА8Т и ВЬА8Т 2.0, описанные в работах А1!ксйи1 е! а1., Ыис. Ас16к Век. 25:3389-3402 (1977) и А1!ксйи1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215:403-410 (1990), соответственно.
Программное обеспечение для проведения анализа ВЬА8Т доступно публично в Национальном центре биотехнологической информации (Ыа11оиа1 Сеи!ег Гог Вю!есйио1оду 1иГогта!юи (1!!р:// те^^.исЫ. п1т.ш11.до\7)). Прежде всего, он связан с идентификацией так называемых пар последовательностей высокого счета (1ид11 ксотшд кециеисе рапк (Н8Р), для чего сначала находятся короткие слова длины в последовательности запроса, которые при выравнивании со словом такой же длины из последовательности базы данных либо соответствуют этому слову, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому значению Т. Параметр Т называют пороговым счетом слова соседства (ие1дйЬотйоо6 \\όγ6 ксоге 111гек1ю16 (А1!ксйи1 е! а1, там же). Исходное слово соседства представляет собой семя для инициации поиска содержащих его более длинных Н8Р. Затем это слово удлиняется в обоих направлениях последовательности до тех пор, пока возрастает общий счет выравнивания. Для определения общего счета в случае нуклеотидных последовательностей используют параметры М (награда для пары соответствующих остатков всегда больше 0) и N (наказание для пары несоответствующих остатков всегда меньше 0). В случае аминокислотных последовательностей кумулятивный счет подсчитывают с помощью матрицы счета. Удлинение слова в каждом направлении останавливается, если: кумулятивный счет выравнивания падает ниже величины X; он падает до 0 или ниже, из-за появления одного или больше выравниваний остатков с отрицательным счетом, а также при достижении конца последовательности. Параметры алгоритма ВЬА8Т ^, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе Β^Α8ΤN (для последовательностей нуклеотидов) используются по умолчанию следующие значения параметров: длина слова = 11, ожидание Е = 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В случае аминокислотных последовательностей используются по умолчанию следующие значения параметров: длина слова 3, ожидание (Е) 10 и матрица счета ВЕО8ИМ62 (см. НешкоГГ & НешкоГГ, Ргос. №!1. Аса6. 8сЬ И8А 89:10915
- 8 014757 (1989)) выравниваний (В) 50, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.
Алгоритм ВЬА8Т выполняет также статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Катйп & А115сйи1, Ргос. ΝηΤΙ. Асаб. 8с1. И8А 90:5873-5787 (1993)). Одной предоставляемой алгоритмом характеристикой сходства является вероятность минимальной суммы (Ρ(Ν)), указывающая вероятность того, что соответствие между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями осуществится случайно.
Например, нуклеиновая кислота считается такой же, что и последовательность сравнения, если вероятность минимальной суммы при сравнении между ними менее чем приблизительно 0,2, более предпочтительно, если менее 0,01, и наиболее предпочтительно, если менее 0,001.
III. Композиции настоящего изобретения.
Изобретение относится к композициям, содержащим химерные аденовирусные векторы. В соответствии с некоторыми аспектами химерные аденовирусные векторы изобретения содержат первый промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, которая кодирует гетерологичный полипептид, и второй промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, которая кодирует ТШ агонист. Первый и второй промоторы могут быть одинаковыми или различными. В соответствии с некоторыми аспектами первый и второй промоторы независимо выбраны из числа промотора бета-актина и промотора ЦМВ.
В соответствии с некоторыми аспектами химерные аденовирусные векторы содержат аденовирусный геном (без генов Е1 и Е3) и нуклеиновую кислоту, кодирующую ген, который активирует ΙΡΡ-3 и другие сигнальные молекулы ниже ТЬВ-3. Химерный вектор можно вводить в клетку, которая экспрессирует ген Аб Е1, так что клетка будет продуцировать рекомбинантный аденовирус (гАб). Этот гАб можно выделить, после чего он будет способен осуществить один раунд инфекции, которая введет трансгенную композицию в другую клетку млекопитающего, чтобы индуцировать иммунный ответ на гетерологичный полипептид.
A. Подходящие аденовирусные векторы.
В соответствии с некоторыми аспектами аденовирусный вектор представляет собой аденовирус 5, включая, например, Аб5 с делецией участков Е1/Е3 и Аб5 с делецией участка Е4. Другие подходящие аденовирусные векторы включают штаммы 2, орально протестированные штаммы 4 и 7, энтерические аденовирусы 40 и 41 и другие штаммы (например, Аб34), которых достаточно для введения антигена и индукции адаптивного иммунного ответа на трансгенный антиген [ЬиЬеск е! а1, Ргос ΝαΙΙ Асаб 8с1 И8А, 86(17), 6763-6767 (1989); 811еп е! а1, I Упо1, 75(9), 4297-4307 (2001); Вабеу е! а1, У1то1оду, 202(2), 695-706 (1994)]. В соответствии с некоторыми аспектами аденовирусный вектор представляет собой живой, некомпетентный по репликации аденовирусный вектор (такой как гАб5 с делецией по Е1 и Е3), живой и ослабленный аденовирусный вектор (такой как вирусы с делецией Е1В55К) или живой аденовирусный вектор с репликацией дикого типа.
Транскрипционная и трансляционная управляющие последовательности векторов экспрессии, используемые для трансформации клеток позвоночных животных ίη у1уо, можно получить из вирусных источников. Например, обычно используемые промоторы и усилители получают, например, из бетаактина, аденовируса, обезьяньего вируса (8У40), а также цитомегаловируса человека (ЦМВ). Например, подходят векторы, делающие возможной экспрессию белков под управлением ЦМВ промотора, раннего промотора 8У40, позднего промотора 8У40, металлотионеинового промотора, промотора мышиного вируса опухолей, промотора вируса саркомы Роуса, промотор трансдукции или других промоторов, эффективных для экспрессии в клетках млекопитающих. Можно использовать и другие вирусные генетические промоторы, управляющие и/или сигнальные последовательности, если только такие сигнальные последовательности совместимы с клеткой-хозяином.
B. Гетерологичные полипептиды.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие подходящие гетерологичные полипептиды, можно выделить из антигенов, таких как, например, вирусные антигены, бактериальные антигены, раковые антигены, грибковые антигены или антигены паразитов.
Вирусные антигены можно получить, например, из следующих источников:
вирус иммунодефицита человека, например, дад (р55 и р160), ро1, епу (др120 и др41), как описано в работе 8Ыует е! а1. №1Ц.1ге 415(6869):331 (2002);
последовательности генома ВИЧ доступны из ОепЬапк с номерами доступа ЕЕ363127, ЕЕ363126, ЕЕ363125, ЕЕ363124, ЕЕ363123, ЕЕ363122, ЕЕ192592 и ЕЕ192591;
ВИЧ дад последовательности имеют номера доступа ЕЕ396891, ЕЕ396890, ЕЕ396889, ЕЕ396888, ЕЕ396887, ЕЕ396886, ЕЕ396885, ЕЕ396884, ЕЕ396883, ЕЕ396882, ЕЕ396881, ЕЕ396880, ЕЕ396879, ЕЕ396878, ЕЕ396877, ЕЕ396876, ЕЕ39687, ЕЕ396874, ЕЕ396873 и ЕЕ396872;
ВИЧ ро1 последовательности имеют номера доступа ОепЬапк ЕЕ396810, ЕЕ396809, ЕЕ396808, ЕЕ396807, ЕЕ396806, ЕЕ396805, ЕЕ396804, ЕЕ396803, ЕЕ396802, ЕЕ396801, ЕЕ396800, ЕЕ396799, ЕЕ396798, ЕЕ396797, ЕЕ396796, ЕЕ396795, ЕЕ396794, ЕЕ396793, ЕЕ396792 и ЕЕ396791;
ВИЧ епу последовательности имеют номера доступа ОепЬапк ЕЕ367234, ЕЕ367233, ЕЕ367232, ЕЕ367231, ЕЕ367230, ЕЕ367229, ЕЕ367228, ЕЕ367227, ЕЕ367226, ЕЕ367225, ЕЕ367224 и ЕЕ367223;
- 9 014757 вирус папилломы человека (например, белка капсида Ь1, описанного, например, в работе Эоппе11у е! а1. 1 1пГсс( Э1к. 173:314 (1996) и последовательностей с номерами доступа СеиЬапк ЕЕ362755, ЕЕ362754, N^001694, N^001693, N^001691, Ж?_001690, N^005134, N^001458, N^001457, N^001354, N^001352, ЫС_001526 и Х94164);
вирус Эпштейна Бара, простой вирус герпеса, вирус герпеса человека, риновирус, коксакивирус, энтеровирус, гепатиты А, В, С и Е (например, поверхностный антиген вируса гепатита В, описанный, например, в работе ЬиЬеск е! а1., ΡΥΛ8 И8А 86:6763 (1989) и последовательностей с номерами доступа СепЬапк АВ236481, АВ236471, АВ206501, АВ206489, АВ206487, АВ221788, АВ221777, АВ221773,.АК933671.АК933670, АВ236514, АВ236513, АВ236512, АВ236511, АВ236510, АВ236509, АВ236508, АВ236507);
гепатита С N8 5 (см., например, номера доступа СеиЬапк Х59609, ΌΟ911563, 871627, 870787, 870786, 870341, 862220, 870790, 870789, 870788, а также АВ204642);
вируса свинки, кори, краснухи, полиомиелита, оспы, бешенства и вируса опоясывающего лишая, и Уапе11а-хок1ег у1гик.
Антигены гриппа включают, например, гемагглютинин (НА), матриксный белок 1 (М1) и нуклеопротеин (ЫР) (см., например, Эоппе11у. е! а1, Уассше 15:865 (1997) и последовательности НА гриппа с номерами доступа СепЬапк АВ294219, АВ294217, АВ294215, АВ294213, ЕЕ102944, ЕЕ102943, ЕЕ102942, ЕЕ102941, ЕЕ102940, ЕЕ102939, ЕЕ102938, ЕЕ102937, ЕЕ102936, ЕЕ102935, ЕЕ102934, ЕЕ102933, ΌΟ643982, ΌΟ464354, СУ019432, СУ019424, СУ019416, СУ019408, СУ019400, СУ019392, СУ019384, СУ019376, СУ019368, СУ019360, СУ019352, ЕЕ124794, ЕЕ110519, ЕЕ110518, ЕЕ165066, ЕЕ165065, ЕЕ165064 и ЕЕ165063;
последовательности гриппа М1 с номерами доступа СепЬапк АВ292791, СУ019980, СУ019972, СУ019964, СУ019956, СУ019948, СУ019940, СУ019628, СУ019652, СУ019644, СУ019932, СУ019924, СУ019916, СУ019908, СУ019900, СУ019892, СУ019884, СУ019876, СУ019868, СУ019860 и последовательности гриппа № с номерами доступа СепЬапк АВ292790, СУ019461, СУ019974, СУ019966, СУ019958, СУ019950, СУ019942, СУ019630,
СУ019654, СУ019646, СУ019934, СУ019926, СУ019918 СУ019910, СУ019902, СУ019894, СУ019886, СУ019878, СУ019870 и СУ019862.
Подходящие вирусные антигены включают, например, вирусные неструктурные белки. Термин вирусный неструктурный белок здесь означает белки, кодируемые вирусной нуклеиновой кислотой, которая не кодирует структурные полипептиды, такие как компоненты капсида или окружающие вирус. Неструктурные белки включают белки, инициирующие репликацию вирусной нуклеиновой кислоты и экспрессию генов вируса, таких как, например, неструктурные белки 1, 2, 3 и 4 (N81, N82, N83 и N84, соответственно) Венесуэльского конского энцефалита (УЕЕ), ЕЕЕ или вируса леса Семлики |ЭпЬепкку е! а1, 1 У1го1, 70(1), 508-519 (1996); РеИакоуа е! а1 1 У1го1 2005 79(12): 7597-608; патент США № 5185440, 5739026, 6566093 и 5814482]. Несколько репрезентативных примеров подходящих альфавирусов включают Аига (АТСС УК-368), вирус ВеЬаги (АТСС УК-600, АТСС УК-1240), СаЬаккои (СепЬапк номера доступа АР398387, АТСС УК-922), вирус чикугуньи (АТСС УК-64, АТСС УК-1241), вирус восточного конского энцефаломиелита (СепЬапк номера доступа АУ705241, АУ705240, АТСС УК-65, АТСС УК1242), Форт Морган (АТСС УК-924), вирус Гетах (АТСС УК-369, АТСС УК-1243), Кизилагах (АТСС УК-927), Майаро (АТСС УК-66), вирус майаро (АТСС УК-1277), Миддлбург (АТСС УК-370), вирус Мукамбо (АТСС УК-580, АТСС УК-1244), Ндуму (АТСС УК-371), вирус Пиксуна (АТСС УК-372, АТСС УК-1245), вирус Росс Ривер (АТСС УК-373, АТСС УК-1246), лес Семлики (СепЬапк номера доступа А1251359, АТСС УК-67, АТСС УК-1247), вирус Синдбиса (СепЬапк номера доступа 102363, АТСС УК68, АТСС УК-1248), Тонат (АТСС УК-925), Тринити (АТСС УК-469), Уна (АТСС УК-374), Венесуэльский конский энцефаломиелит (АТСС УК-69), вирус Венесуэльского конского энцефаломиелита (СепЬапк номера доступа АУ986475, АУ973944, N0 001449, АТСС УК-923, АТСС УК-1250 АТСС УК-1249, АТСС УК-532), Западный конский энцефаломиелит (АТСС УК-70, АТСС УК-1251, АТСС УК-622, АТСС УК-1252), Вхатароа (АТСС УК-926) и Υ-62-33 (АТСС УК-375).
Бактериальные антигены можно выделить, например, из 81арйу1ососсик аигеик, 81арйу1ососсик ер1бегшщ, НейсоЬас1ег ру1оп, 81гер1ососсик Ьоущ, 81гер1ососсик руодепек, 81гер1ососсик рпеитошае, Ык1ег1а топосу^е^^ МусоЬас1егшш 1иЬегси1ок1к, МусоЬас1егшт1ергае, СогупеЬасЮгшт б1рЫйепае, ВоггеЬа ЬигдбогГеп, ВасШик апИасЕ, ВасШик сегеик, С1ок1пбп.пп Ьо1и1шиш, С1ок1пбп.пп бгГйсбе, 8а1топе11а 1ур11к У1Ьгю сШоегае, НаешорЫ1ик хпДиепгае, Вогбе!е11а рейиккЕ, Υе^к^п^а рекйк, №ккепа допоггИоезе, Тгеропета раШбиш, Мусор1акш кр., №|ккепа гапкбисег к, Бедюпе11а рнеин-юрИНа, Кккейыа 1ур11к СЫашуЛа 1гас1ю1паЬк и 8Ыде11а букегИепае, У1Ьгю сИо1ега (например, субъединица В токсина холеры с номерами доступа СепЬапк И25679, А09803, ЕЕ158842, Х76391, АР390572, сорегулируемые с токсином холеры пили (ТСР), описанные в работе Аи е! а1, 1пГесЬоп апб 1шшипйу Уо1. 69(12):7695 (2001) и в СепЬапк номера доступа N^002505 и АЕ004169), НеНсоЬасЮг ру1ош (УасА, в соответствии с СепЬапк номера доступа АΥ848858, АЕ042737, АЕ042736, АЕ042735, АЕ042734 и N^000921; СадА с номерами доступа СепЬапк АР043490, АЕ043489, АР043488, АР043487; NАР в соответствии с СепЬапк номера доступа АЕ284121, АЕ284120, АЕ284119, АЕ284118, АЕ284117, АЕ284116, АВ045143, АВ045142, АЕ227081,
- 10 014757
АР227080. АР227079. АР227078. АР227077. АР227076. АР227075 и АР227074; Икр или каталаза в соответствии с СеиЬаик номера доступа ЫС_000921; уреаза в соответствии с СепЬапк номера доступа АМ417610. АМ417609. АМ417608. АМ417607. АМ417606. АМ417605. АМ417604. АМ417603. АМ417602, АМ417601 и АМ417600; антигены Е. со11 в соответствии с СепЬапк номера доступа ΝΟ_000913. И00096. ЫС_002655, ВА000007, АЕ014075, включая фимбриальные антигены Е. сой. имеющие номера доступа в СепЬапк АВ214865. АВ214864. АВ214863. АВ214862; термолабильный энтеротоксин Е. сой с номерами доступа СепЬапк Х83966. У00275. Х83966. ГО1 646. У00275. М35581. М17873. М17874. К01995. М61015. М17894. М17101 и К00433.
Антигены паразитов можно получить. например. из С1агб1а 1атййа. ЬеЕйтата кр.. Тгурапокота кр.. Тпсйотопак кр.. Р1актобшт кр. (например. антигены белков поверхности Р.Гаарагит. такие как последовательности рГк25. описанные в СепЬапк номера доступа ХМ_001347551. Х07802. АП 93769. АР179423. АИ 54117 и АР030628. последовательности рГк28. имеющие номера доступа в СепЬапк Й25843. последовательности рГк45. описанные в СепЬапк с номерами доступа ЕР158081. ЕР158079. ЕР158078. ЕР158076. ЕР158075 и ЕР158085. последовательности рГк84. рГк 48/45. описанные в СепЬапк с номерами доступа АР356146. АР356145. АР356144. АР356143. АР356142. АР356141. АР356140. АР356139. АР356138. АР356137. АР356136. АР356135. АР356134. АР356133. АР356132. АР356131. АР35613О. АР356129. АР356128. АР356127. последовательности рГк 230. описанные в СепЬапк с номерами доступа N^000910. ХМ_001349564. АЕ001393. Й22219. Й08135 и АР269242. антигены Р. ущах. такие как последовательности Рук25. описанные в СепЬапк с номерами доступа ЭО641509. ЭС641508. ΌΡ641507. АУ639972. АУ639971. АУ639970. АУ639969. АУ639968. АУ639967. АУ639966 и АУ639965. и последовательности Рук28. описанные в СепЬапк с номерами доступа АВ033364. АВ033363. АВ033362. АВ033361. АВ033360. АВ033359. АВ033358. АВ033357. АВ033356. В033355. АВ033354. АВ033353. АВ033352. АВ033351. АВ033350. АВ033349. АВ033348. АВ033347. АВ033346 и АВ033345). 8сй1к1окоша кр.. МусоЬас1етшт 1нйегси1ок1к (например. последовательности Ад85. описанные в СепЬапк с номерами доступа АХ253506. АХ253504. АХ253502 и АХ211309. последовательности МРТ64. Е8АТ-6. СТР 10. К8307. МТВ-32 МТВ-39. С8Р. Ь8А-1. Ь8А-3. ЕХР1. 88Р-2. 8АЬ8А. 8ТАКР. СС.Р'КР. М8Р-1. М8Р-2. М8Р-3. М8Р-4. М8Р-5. М8Р-8. М8Р-9. интегрального мембранного белка АМА-15 Тип 1. КЕ8А. ЕВА175 и ОВА. описанные в СепЬапк с номерами доступа ВХ842572. ВХ842573. ВХ842574. ВХ842575. ВХ842576. ВХ842577. ВХ842578. ВХ842579. ВХ842580. ВХ842581. ВХ842582.ВХ842583. ВХ842584 и ΝΟ_000962. последовательности Н8Р65. описанные в СепЬапк с номерами доступа АУ299175. АУ299174. АУ299144. АР547886 и АР547885).
Раковые антигены включают. например. антигены. экспрессируемые при раке толстой кишки. раке желудка. поджелудочной железы. легкого. яичников. простаты. молочной железы. кожи (например. меланома). при лейкемии. лимфоме или миеломе. примеры раковых антигенов включают. например. НРУ Ь1. НРУ Ь2. НРУ Е1. НРУ Е2. плацентарную щелочную фосфатазу. АРР. ВКСА1. Нег2/пеи. СА 15-3. СА 19-9. СА-125. СЕА. Нсд. активатор плазминогена урокиназного типа (Ира). ингибитор активатора плазминогена. Антигены грибков можно получить. например. из Тшеа реб1к. Тшеа согрогик. Тшеа сгипк. Т1пеа надшит. С1абокротшш сапопн. Сосс1бю1бек иатШк. Сапб1ба кр.. АкрегдШик ГитфаШк и Рпеитосукбк саппн.
Нуклеиновые кислоты. кодирующие иммуногенные полипептиды. как правило. получают методами рекомбинированияДНК(см.. например. АикиЬе1. е1 а1. еб. (2001) СиггеШ Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду). Например. последовательности ДНК. кодирующие иммуногенные полипептиды. можно собрать из фрагментов кДНК и коротких полипептидных линкеров. или из серии нуклеотидов. или амплифицировать из кДНК с использованием соответствующих праймеров с получением синтетического гена. который может быть включен в рекомбинантный вектор экспрессии (то есть. в плазмидный или вирусный вектор) и экспрессирован в рекомбинантную единицу транскрипции. После получения нуклеиновой кислоты. кодирующей иммуногенный полипептид. ее можно включить в рекомбинантный вектор экспрессии. подходящий для экспрессии ш у|уо или ех у|уо.
Рекомбинантные векторы экспрессии содержат последовательность ДНК. кодирующую иммуногенный полипептид и оперативно связанную с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами. выделенными из генов млекопитающих или вирусов. Такие регулирующие элементы включают промотор транскрипции. дополнительную операторную последовательность для контроля транскрипции (необязательно). последовательность. кодирующую подходящие рибосомальные сайты связывания мРНК. а также последовательность. контролирующую остановку транскрипции и трансляции. Можно также включить источник репликации и выбираемый маркер для облегчения распознавания трансформантов. Гены. используемые в рекомбинантных векторах экспрессии. можно разделить между несколькими вирусами. так что образующиеся гены будут кодироваться двумя различными векторами. и эти векторы совместно будут получать генные продукты в трансформантах. Причины разделения генов включают ограничения на вставки по размерам и токсичность комбинированных генетических продуктов для образующихся с помощью вирусов клеточных линий.
С. ТЬК агонисты.
В соответствии со способами изобретения ТЕК. применяются для усиления иммунного ответа на ге
- 11 014757 терологичный полипептид. В соответствии с некоторыми аспектами используются ТЬК-3 агонисты. В соответствии с другими аспектами, используются ТЬК 7/8 агонисты. Описанные здесь ТЬК агонисты можно вводить совместно с вектором экспрессии, кодирующим интересующий антиген, а также отдельно (то есть, пространственно или временно) от этого вектора. Например, вектор экспрессии можно вводить по непарентеральному маршруту (например, орально, интраназально или мукозально), а ТЬКагонист будет вводится по парентеральному маршруту (например, внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно).
1. ТЬК-3 агонисты.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения ТЬК-3 агонист используется для стимулирования иммунного распознавания интересующего антигена. ТЬК-3 агонисты включают, например, короткие шпильки РНК, вирусную РНК, короткие сегменты РНК, которые могут формировать двухцепочечные РНК или короткие шпильки РНК, а также короткую интерферирующую РНК (κίΚΝΑ). В соответствии с одним аспектом изобретения, ТЬК-3 агонист представляет собой вирусную дцРНК, такую, как, например, дцРНК из вируса Синдбис (8шбЫк) или вирусные интермедиаты дцРНК [А1ехорои1ои е1 а1, №1Шге 413:732-8 (2001)]. В соответствии с некоторыми аспектами ТЬК-3 агонисты представляют собой короткие РНК шпильки. Такие последовательности, как правило, содержат две комплементарные последовательности, объединенные линкерной последовательностью. Конкретная линкерная последовательность не является критическим аспектом изобретения. Может использоваться любая подходящая линкерная последовательность, если только она не мешает связыванию двух линкерных последовательностей с образованием дцРНК.
В соответствии с некоторыми аспектами короткие шпильки РНК содержат последовательность, описанную в 8ЕО ΙΌ N08: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 или 12, последовательность, в значительной степени идентичную последовательности из 8Е0 ΙΌ N08: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 или 12, или вариант последовательности с 8Е0 ΙΌ N08: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 или 12. В соответствии с некоторыми аспектами дцРНК, представляющая собой ТЬК-3 агонист, не кодирует конкретный полипептид, но продуцирует провоспалительный цитокин (например, 1Ь-6, 1Ь-8, Т№-альфа, ΙΕΝ-альфа, ΙΕΝ-бета) при взаимодействии с респондерной клеткой (например, дендритной клеткой, моноядерной клеткой периферической крови или макрофагом) ίη νίΐτο или ίη-νίνο. Иногда кодирующая ТЬК-3 агонист нуклеиновая кислота (например, экспрессированная дцРНК) и химерный аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный антиген, вводятся в одном составе. В других случаях кодирующая ТЬК-3 агонист нуклеиновая кислота и химерный аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный антиген, вводятся по отдельности. Если кодирующая ТЬК-3 агонист нуклеиновая кислота и химерный аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный антиген, вводятся по отдельности, то это введение может быть одновременным или последовательным. Например, сначала можно ввести кодирующую ТЬК-3 агонист нуклеиновую кислоту, а затем химерный аденовирусный вектор (например, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 или 24 ч, а также 2, 4, 6, 8 или 10 дней спустя). В соответствии с некоторыми аспектами, кодирующая ТЬК-3 агонист нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, которая кодирует гетерологичный антиген, находятся под контролем одного и того же промотора. В соответствии с другим и аспектами, кодирующая ТЬК-3 агонист нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, которая кодирует гетерологичный антиген, находятся под контролем различных промоторов. Коммерчески доступно несколько химически синтезированных аналогов двухцепочечной РНК. Эти аналоги включают полиинозин-полицитидиловую кислоту (поли 1:С), полиаденилполиуридиловую кислоту (поли Α:ϋ), а также поли 1:поли С. Антитела (или перекрестно сшитые антитела) к ТЬК-3 могут также вести к продукции ΙΕΝ-бета или провоспалительных цитокинов |Ма1кито1о е1 а1, ВюсЬет. ВюрЬук. Век. Соттип. 24:1364 (2002), бе Вои1е111ег е! а1, 1 Вю1. СЬет. 18:38133-45 (2005)]. Коммерчески доступные сегменты κίΚΝΑ любой последовательности могут также быть получены, в частности, от ΙηνίϋΌ^η.
2. ТЬК7/8 агонисты.
В соответствии с некоторыми аспектами ТЬК агонисты представляют собой ТЬК.7/8 агонисты. Как правило, ТЬК7/8 лиганды - это одноцепочечные РНК вирусной природы. Поскольку рецепторы экспрессируются во внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы, то не все короткие сегменты РНКзапускают сигнальный каскад ТЬК7/8; это связано с тем, что им надо достичь корректного компартмента. Примерами лигандов, которые, как показано, запускают этот процесс при добавлении экзогенно, являются полиуридиловая кислота, резихимод и имихимод [УекЩооб, е! а1, Уассше 24:1736-1745(2006)].
ГУ. Фармацевтические композиции.
Фармацевтические композиции, содержащие описанные здесь векторы, могут также содержать другие компоненты, которые могут быть биологически активны или неактивны. Полипептиды могут быть (а могут и не быть) конъюгированы с другими описанными макромолекулами, например, в патентах США №№4372945 и 4474757. Фармацевтические композиции могут, в целом, быть использованы для профилактических и терапевтических целей. Фармацевтические композиции могут составляться способами, защищающими от разложения в желудке, так что введенные химерные аденовирусные векторы могли бы достичь требуемых мест в организме. Для орального введения доступно несколько таких композиций,
- 12 014757 включая системы высвобождения Еибгадй и Т1теС1оск, а также другие способы, специально разработанные для аденовирусов [ЬиЬеск е! ай, Ргос Να11 Асаб 8б И8А, 86(17), 6763-6767 (1989); С’йоигача апб .Таш, 1 Рйагт Рйагт 8с1, 6(1), 33-66 (2003)].
Описано также еще несколько методов для микроинкапсулирования ДНК и лекарств, предназначенных для введения орально (см., например, заявку на патент США № 2004/043952). В соответствии с некоторыми аспектами, система Еибгадй может использоваться для доставки химерных аденовирусных векторов в нижнюю часть тонкого кишечника. Однако лекарства могут доставляться также и в другие участки тонкого кишечника.
Как уже упоминалось, химерные аденовирусные векторы изобретения можно вводить с использованием любой системы доставки, известной специалистам в соответствующей области. Известно много технологий введения генов, некоторые из них описаны в работе Во11апб (1998) Сгй. Вет. Тйегар. Эгид Саглег 8уЧет8 15:143-198 и процитированных там ссылках. Очевидно, что иммуногенные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые соли полинуклеотидов, кодирующих гетерологичные полипептиды (например, иммуногенные полипептиды). Такие соли можно получить из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая органические основания (например, соли первичных, вторичных и третичных аминов и основных аминокислот) и неорганические основания (например, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния). Конкретные примеры солей включают забуференный фосфатом физиологический раствор и физиологический раствор для инъекций.
В составе фармацевтических композиций изобретения может использоваться любой подходящий носитель, известный специалистам. Подходящие носители включают, например, воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск, буфер, твердый носитель, такой как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния, или биодеградируемые микросферы (например, полилактата полигликолят). Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах США №№4897268, 5075109, 5928647, 5811128 и 5820883. Иммуногенный полипептид и/или вирус-носитель можно инкапсулировать в биодеградируемую микросферу или связать с ее поверхностью.
Такие композиции могут также содержать буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатики, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион, адьюванты (например, гидроксид алюминия), растворы, делающие состав изотоническим, гипотоническим или слегка гипертоническим по отношению к крови реципиента, суспендирующие агенты, уплотняющие агенты и/или консерванты. Альтернативно, композиции настоящего изобретения можно получить в виде лиофилизатов. Соединения можно также инкапсулировать в липосомы, используя хорошо известные методы.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, композиции также содержат адьювант. Подходящие адьюванты включают, например, липиды и не-липидные соединения, токсин холеры (СТ), субъединицу В СТ, производное СТ под названием СТК63, лабильные энтеротоксин Е. сой (ЬТ), производное ЬТ под названием ЙТК63, А1(0Н)3 и полиионные органические кислоты, описанные, например, в публикациях \У0 04/020592, Апбегзоп апб СгоМе, 1пГес1. 1ттип. 31(1):413-418(1981), Во1егтап е! а1, 1. Рйу8ю1. Рйагтасо1, 44(3):213-32 (1993), Агога апб Сгоет1е, 1. Вейси1оепбо1йе1. 24(3):271-86 (1978), а также С’го\\'1е и Мау, 1пГес1. 1ттип. 38(3):932-7(1982)). Подходящие полиионные органические кислоты включают, например, 6,6'-[3,3'-диметил[1,1'-бифенил]-4,4'-диил]бис(азо)бис[4-амино-5-гидрокси-1,3-нафталит-дисульфоновая кислота] (Етапх В1ие) апб 3,3'-[1,1'-бифенил]-4,4'-диилбис(азо)бис[4амино-1-нафталинсульфоновая кислота] (Сопдо Веб). Специалист понимает, что полиионные органические кислоты могут использоваться в любом методе генетической вакцинации совместно с любым типом введения.
Другие подходящие адьюванты включают местные иммуномодуляторы, такие как члены семейства имидазохинолинов, например, имихимод и резихимод (см., например, Непдде е! а1, йапсе! 1пГес1. Όίδ. 1(3): 189-98 (2001). В настоящем изобретении могут также использоваться экспрессированные ТЬВ-3 агонисты (например, дцРНК) и ТЬВ-7 агонисты (например, 88Κ.ΝΛ). Другие коммерчески доступные подходящие адьюванты включают, например, дополнительные адьюванты из алюмокалиевых квасцов (например, Альгидрогель, Регидрогель, фосфат алюминия, Альгаммулин); адьванты на масле (полный и неполный адьюванты Фрейнда (Э|Гсо йаЬогаЮпеч Пе1гой, Мюй.), Спекол, ΒΙΒΙ, ТйегМах, Монтанид Μ0ΝТАМЭЕ 18А50 или 8еррю М0ЭТАМПЕ 18А 720); неионные блок-сополимерные адьюванты; цитокины (например, СМ-С8Р или Е1а13-лиганд); Адьювант Мерка Мегск Аб^итат 65 (Мегск апб Сотрапу, 1пс., Вайетау, N. 1.); А8-2 (8тййК1те Веесйат, Рй11абе1рй1а, Ра.); соли кальция, железа или цинка; нерастворимую суспензию ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биодеградируемые микросферы; монофосфорил липид А и цитокины Ош1 А.
Цитокины, такие как СМ-С8Р или интерлейкин-2, -7 или -12, также представляют собой подходящие адьюванты. В изобретении могут также использоваться гемоцианины (например, гемоцианин мор
- 13 014757 ского моллюска фиссуреллии) и гемоэритрины. В качестве адьювантов подходят также полисахаридные адьюванты, такие как, например, хитин, хитозан и деацетилированный хитин. Другие подходящие адьюванты включают мурамил дипептид (ΜΌΡ, N ацетилмурамил Ь аланил Ό изоглутамин), бактериальные пептидоглюканы и их производные (например, треонил-ΜΌΡ и МТРРЕ). Может использоваться также скелетон клеточной стенки ВСС и ВСС (С^8) совместно или без димиколята трегалозы. Последний может использоваться и сам по себе (см., например, патентСША№4579945). В качестве адьювантов полезны также детоксифицированные эндотоксины, самостоятельно или совместно с другими адьювантами (см., например, патенты США №№ 4866034, 4435386, 4505899, 4436727, 4436728, 4505900 и 4520019). Могут использоваться также сапонины ^821. ^817. ^87 (см., например, патент США № 5057540, ЕР 0362279, \νϋ 96/33739 и νθ 96/11711). Другие подходящие адьюванты включают Монтанид ΜοηΙαηίάο Ι8Ά 720 (8ерр1с, Ргапсе), 8ΆΡ (СЫтоп, Са11Г., Ипйеб 81а1с5). 18СОМ8 (С8Ь), ΜΡ-59 (СЫтоп), серию адьювантов 8ΒΆ8 (например, 8ΒΆ8-2, 8ВА8-4 или 8ВА8-6 или их варианты, доступные в компании 8тй11Кйпе Веесйат, В1хеп8ат1, Ве1дшт), Детокс Ие1ох (Сопха, НатШоп, Моп!.), а также ВС-529 (Сопха, Натίΐΐοη, Моп!).
В качестве адьюванта в настоящем изобретении могут использоваться также суперантигены. Суперантигены включают экзопротеины 81арйу1ососси8, такие как α,β, γ и δ энтеротоксины из 8. аигеик и 8. ерИеттШк, а также α, β, γ и δ экзотоксины Е. сой. Обычные энтеротоксины 8!арйу1ососсик называются стафилококкальным энтеротоксином А (8ЕА) и стафилококкальным энтеротоксином В (8ЕВ), но описаны энтеротоксины вплоть до Е (8ЕЕ) (Вой е! а1., 1992). Используются также такие суперантигены, как 81тер!ососси8 пиоген В (8ЕВ), энтеротоксин С1о81пбшт регГтшдепк (Во^пекк е! а1., 1992), цитоплазмический связанный с мембраной белок (САР) из 8. руодепек (8а!о е! а1, 1994) и токсин 1 синдрома токсического шока (!ох1с кйоск купбтоте !охш 1 (Т88Т 1)) из 8. аигеик (8с11\таЬ е! а1., 1993).
В состав описанных здесь фармацевтических композиций можно включать специальные адьювантные композиции для того, чтобы индуцировать, например, иммунный ответ, в основном, типа Т111 или Т112. Высокое содержание цитокинов Т111 (например, ΙΡΝ-гамма, ΤΝΡ-альфа, ΙΌ-2 и ΙΌ-12) благоприятствует индукции опосредованного клетками иммунного ответа на введенный антиген. Напротив, высокое содержание цитокинов Т112 (например, ΙΌ-4, 1Ь-5, ΙΌ-6 и 1Ь-10) благоприятствует индукции гуморальных иммунных ответов. После орального введения содержащей иммуногенный полипептид композиции, описанной здесь, как правило, развивается иммунный ответ, включающий ответы типов Т111 и Т112.
Описанные здесь композиции можно вводить в составе задержанного высвобождения (то есть, таком составе, как капсула или пилюля, которая приводит к медленному выделению соединения после введения). Такие составы могут, в целом, быть приготовлены по хорошо известным технологиям (см., например, СоотЬек е! а1. (1996) Уассше 14:1429-1438). Составы задержанного высвобождения могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, диспергированное в матрице-носителе и/или содержащееся в резервуаре, окруженном мембраной, которая контролирует скорость высвобождения.
Используемые в таких составах носители должны быть биосовместимы и могут также быть биодеградируемыми; предпочтительно, чтобы состав обеспечивал относительно постоянную скорость высвобождения активного компонента. Такие носители включают микрочастицы поли(лактид-ко-гликолида), а также полиакрилат, латекс, крахмал, целлюлозу и декстран. Другие носители замедленного высвобождения включают супрамолекулярные био-векторы, которые содержат нежидкое гидрофильное ядро (например, перекрестно сшитый полисахарид или олигосахарид) и, возможно, внешний слой, состоящий из амфифильного соединения (см., например, νθ 94/20078, νθ 94/23701 и νθ 96/06638). Количество активного соединения, содержащегося в составе задержанного высвобождения, зависит от места введения, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения, а также от природы состояния, которое требуется вылечить или предотвратить.
Фармацевтические композиции могут быть представлены в виде контейнеров для одной или нескольких доз, такие как закупоренные ампулы или сосуды. Подобные контейнеры предпочтительно герметически закупоривают, чтобы сохранить стерильность препарата до его использования. В целом составы можно хранить в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях. Альтернативно фармацевтическую композицию можно хранить в лиофилизированном состоянии, когда непосредственно перед использованием к ней требуется добавить стерильный водный носитель.
V. Терапевтическое применение изобретения.
Один аспект настоящего изобретения предполагает использование описанных здесь иммуногенных композиций для индукции антиген-специфического иммунного ответа у субъекта или пациента с таким заболеванием, как, например, вирусная инфекция, бактериальная инфекция, паразитарная инфекция, грибковая инфекция или рак. Здесь термин субъект или пациент означает любое теплокровное животное, такое как, например, грызун, кошка, собака, примат, предпочтительно, человек. Иммуногенные композиции могут использоваться для лечения на любой стадии заболевания, то есть, на предраковой стадии, во время рака, на этапе метастаз или для предотвращения болезни. Например, описанные здесь композиции могут использоваться для лечения вирусного заболевания, такого как ВИЧ или гепатит, а также для профилактики или лечения рака. В рамках указанных методов фармацевтическую компози
- 14 014757 цию, как правило, вводят пациенту. У пациента может быть, а может и не быть заболевание или расстройство (например, вирусная инфекция, бактериальная инфекция или рак). Соответственно, упомянутые выше фармацевтические композиции могут использоваться для профилактики развития заболевания или расстройства (например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции или рака) или для лечения пациентов, страдающих от заболевания или расстройства (например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции или рака). Заболевание или расстройство может быть диагностировано на основании критериев, общепринятых в уровне техники. Например, вирусную инфекцию можно диагностировать, измеряя титр вирусов в образце, взятом у пациента, бактериальную инфекцию можно диагностировать, обнаружив бактерии в образце, взятом у пациента, а рак можно диагностировать, обнаружив злокачественную опухоль. Фармацевтические композиции можно вводить до или после хирургического удаления первичных опухолей и/или лечения, такого как радиотерапия или назначение традиционных химиотерапевтических лекарств.
Как правило, иммунотерапия является активной иммунотерапией, когда лечение основано на ίη νίνο стимуляции эндогенной иммунной системы хозяина, чтобы заставить ее реагировать против, например, опухолей либо клеток, инфицированных вирусами, либо против бактерий. Эта стимуляция осуществляется путем введения агентов, модифицирующих иммунный ответ (композиций, содержащих нуклеиновые кислоты, которые кодируют иммуногенные полипептиды описанным здесь способом).
Частота введения и дозировка описанных здесь профилактических или терапевтических композиций зависят от индивидуума и могут быть легко установлены стандартными методами. Часто в течение 52-недельного периода вводят от одной до десяти доз. Часто вводят три дозы препарата с интервалом в один месяц, более типично, если каждые 2-3 месяца вводят 2-3 дозы. Для некоторых видов лечения интервалы могут приближаться к году. Периодически после этого могут делать ускоренную (Ьоойег) вакцинацию. Для отдельных пациентов и конкретных заболеваний и расстройств могут быть разработаны альтернативные протоколы лечения. Подходящая доза представляет собой такое количество соединения, которое при введении описанным выше способом может стимулировать, например, противоопухолевый, противовирусный или антибактериальный иммунный ответ, который по меньшей мере на 10-50% выше базового (то есть, в отсутствие лечения) уровня. Такой ответ можно отслеживать, измеряя противоопухолевые антитела у пациента или определяя вакцинозависимую генерацию цитолитических Т-клеток, способных убивать, например, опухолевые клетки пациента, клетки пациента, инфицированные вирусами или бактериями ίη νίίτο. Такие вакцины должны быть способны также вызывать иммунный ответ, ведущий к улучшению клинического результата (например, более частым ремиссиям, полному, частичному или более длительному периоду жизни без заболевания) у вакцинированных пациентов, по сравнению с невакцинированными пациентами. Как правило, вирусные титры составляют от 1,0-104 вирусных частиц в единице объема/животное до 1,0-1015 вирусных частиц в единице объема/животное. Подходящая доза зависит от размера пациента, но, как правило, колеблется приблизительно от 0,01 мл до 10 мл, более типично приблизительно от 0,025 до 7,5 мл, более типично приблизительно от 0,05 до 5 мл. Специалисты понимают, что размер дозы можно определить для конкретного пациента и конкретного заболевания или расстройства, которое предстоит лечить. При оральном введении химерные аденовирусные векторы часто можно сформулировать в виде пилюли.
В целом, соответствующая дозировка и режим лечения позволяют ввести активное соединение (соединения) в количестве, достаточном для достижения терапевтических и/или профилактических целей. Такой ответ можно обнаружить, зарегистрировав улучшение клинических показателей (например, более частые ремиссии, полные или частичные, а также более длительное время жизни без приступов болезни) у принимавших лечение пациентов, по сравнению с нелеченными. Такие иммунные ответы оценивают с помощью стандартных описанных выше анализов пролиферации, цитотоксичности или цитокинов, которые можно провести по отношению к образцам, взятым у пациента до и после лечения.
Например, для отслеживания эффективности терапии можно использовать метод детекции иммунокомплексов, образующихся между иммуногенными полипептидами и антителами жидкостей организма, специфичными для иммуногенных полипептидов. Этот анализ связан с поиском конкретных иммуногенных полипептидов, специфичных для заболевания или расстройства. Образцы жидкостей тела, взятые у индивидуума до и после начала терапии, можно проанализировать на наличие иммунокомплексов описанными выше методами. В целом, при этом необходимо сравнить количество иммунокомплексов в обоих образцах.
Существенное изменение числа иммунокомлексов во втором образце (после начала терапии) по сравнению с первым (до ее начала) показывает эффективность лечения.
А. Введение композиций настоящего изобретения
В соответствии со способами настоящего изобретения содержащую химерный аденовирусный вектор композицию вводят любым непарентеральным маршрутом (например, орально, интраназально или мукозально, например, через влагалище, легкие, слюнные железы, носовые полости, тонкий кишечник, толстый кишечник, прямую кишку, миндалевидные железы или пейеровы бляшки). Композиции можно вводить самостоятельно или совместно с адьювантом, как описано выше. В соответствии с некоторыми
- 15 014757 аспектами, адьюванты кодируются нуклеотидными последовательностями (например, последовательностями, кодирующими ГЬ-2, СМ-С8Р, ГЬ-12 или белок бактериального жгутика). В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения адьювант вводят в то же время, что и композицию. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения адьювант вводят после композиции, например, спустя 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 или 72 после ее введения.
В. Детекция иммунного ответа на интересующие антигены.
Иммунный ответ на гетерологичный полипептид можно зарегистрировать любыми известными способами, включая, например, детекцию специфической активации СО4+ или СР8+Т-клеток или антител, специфически связывающихся с полипептидом.
Специфическая активация СЭ4' или СЭ8' Т-клеток, ассоциированная с мукозальным, гуморальным или клеточным иммунным ответом, может быть обнаружена большим количеством способов. Методы детекции специфической активации Т-клеток включают, но не ограничиваются, регистрацию пролиферации Т-клеток, продукции цитокинов (например, лимфокинов) или генерации цитолитической активности (то есть, генерации цитотоксических Т-клеток, специфических для иммуногенного полипептида).
В случае СО4+ Т-клеток предпочтительным методом детекции специфической активации Т-клеток является регистрация пролиферации Т-клеток. В случае СО8+ Т-клеток предпочтительным методом детекции специфической активации Т-клеток является регистрация цитолитической активности методом высвобождения меченого 51Сг (см., например, Вгоккаг! апб Веуап, В1ооб 90(4): 1594-1599 (1997) апб Ьепх е! а1, I. Ехр. Меб. 192(8):1135-1142 (2000)).
Пролиферацию Т-клеток можно осуществить множеством известных методов. Например, этого можно добиться, измеряя скорость синтеза ДНК. Стимулированные пролиферирующие Т-клетки демонстрируют повышенную скорость синтеза ДНК. Распространенным способом измерения скорости синтеза ДНК является, например, импульсное мечение культур Т-клеток тритированным тимидином, предшественником нуклеотидов, встраивающимся в синтезируемую ДНК. Количество включенного тритированного тимидина можно определить с помощью спектрофотометра с жидкостной сцинцилляцией. Другие способы детекции пролиферации Т-клеток включают измерение скорости усиления продукции интерлейкина^ДЬ^), потока Са2+ или захвата красителя, такого как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолин. Альтернативно, можно измерить синтез лимфокинов (например, интерферонагамма) или относительное количество Т-клеток, реагирующих на иммуногенный полипептид.
Иммунный ответ антител (он же гуморальный иммунный ответ или ответ В-клеток), включая мукозальный иммунный ответ антител, можно определить методами иммунохимического анализа, известными в уровне техники [Тискег е! а1., Мо1 ТРегару, 8, 392-399 (2003); Тискег е! а1., Vасс^ηе, 22, 2500-2504 (2004)]. Подходящие методы включают иммуноферментный сэндвич-анализ с двумя моноклональными антителами, разработанный Оау1б е! а1. (патент США № 4376110); иммуноферментный сэндвич-анализ с моноклональными и поликлональными антителами (Абе е! а1., ш КРкНат апб Нип!ег, ебк., Кабю1ттипоаккау Мебюбк. Е. апб 8. ЬМпдк!опе, ЕбтЬигдН (1970)); метод вестерн блоттинга Согбоп е! а1. (патент США № 4452901); иммунопреципитация меченого лиганда (Вго\\'п е! а1. (1980) I. Вю1. СНет. 255:49804983); твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), описанный, например, в работе Катек е! а1. (1982) I. В1о1. СНет. 257:5154-5160; иммуноцитохимические методы, включая применение флуорохромов (Вгоокк е! а1. (1980) СРп. Ехр. Iттиηо1. 39:477); а также нейтрализация активности (Во\геп-Роре е! а1. (1984) Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А 81:2396-2400). В дополнение к описанным выше методам, в настоящее время доступно множество других технологий иммуноферментного анализа, включая описанные в патентах США №№ 3817827, 3850752, 3901654, 3935074, 3984533, 3996345, 4034074 и 4098876.
Примеры
Следующие далее примеры предназначены для иллюстрации, но не ограничивают область настоящего изобретения.
Пример 1. Конструирование химерного аденовирусного вектора (Ώ81).
Чтобы продемонстрировать, что ТЬК-3 агонисты способны улучшать адаптивные иммунные ответы на интересующие экспрессируемые антигены, было сконструировано несколько различных химерных аденовирусных векторов, содержащих нуклеотидные последовательности, которые кодируют различные антигены. В данном примере нуклеиновую кислоту, кодирующую др 120 (МН АЮ8 Кеадеп! апб Кекегепсе Кеадеп! Ргодгат) расположили под контролем ЦМВ промотора с небольшим интроном сразу за стартовым кодоном челночного вектора (р8Рий1е, ОЫодепе). Номера доступа ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей др120, поместили ро1у-А хвост из ЬСН. Последовательность вектора описана в 8ЕО Ю N0: 1. Чтобы сгенерировать вектор, способный продуцировать рекомбинантный Аб (с делецией Е1/Е3), содержащий кодирующую др120 нуклеиновую кислоту, выполнили гомологичную рекомбинацию с вектором рАб (ОЫодепе). Ό81 сгенерировали, трансфицировав новый рАб-СМ-др120 конструкт экспрессии в 293 клетки. Титры измеряют стандартными методами.
Пример 2. Ό81 (вектор плюс ТЬК-3 агонист) превосходит стандартный гАб5 по способности индуцировать антиген-специфический иммунный ответ.
Чтобы определить, может ли введение ТЬК-3 агониста улучшить адаптивный иммунный ответ, животным ввели 1,0-107 РРИ либо ^Αб-СМV-др120 плюс 5 мкг/мл поли ЬС (081), либо одного только гАб
- 16 014757
СМУ-др120 (гАб5). Введение осуществляли через желудочный зонд в недели 0 и 3 эксперимента. Оба вектора экспрессируют ВИЧ др120 под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е1/ЕЗ. Титр антител к др120 измеряли в плазме через 3 и 6 недель после первоначального введения методом ап!1-др120 фС ЕЫ8А, как описано в работе Тискег, е! а1., Мо1 Тйег 8:392(2004)). Как показано на фиг. 1-2, 081 функционировал значительно эффективнее, чем гАб5, лучше индуцируя ответ антител на белок др120 как на третью, так и на шестую недели после первоначального орального введения. В частности, на шестой неделе средний титр антител к др120 был для группы 081 в 100 раз выше, чем для гАб5. Кроме того, представляется, что повторное введение на неделе 4 значительно усилило ответ, так как средний титр между третьей и шестой неделями возрос более чем в 20 раз, в то время как группа гАб5 продемонстрировала только незначительное увеличение. Результаты показывают, что введение ТЬК-3 агониста может значительно улучшить опосредованный Аб5 ответ антител на интересующие антигены после орального введения химерного аденовирусного вектора, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующий антиген. В качестве положительного контроля в этом анализе использовали сыворотку животных, которым подкожно вводили др120 совместно с полным адьювантом Фрейнда, ее также анализировали на апй-др120 методом ЕЫ8А на неделе 3. Нелеченые животные и животные, которым вводили только один аналог дцРНК(дцРНК), использовались в ЕЫ8А в качестве отрицательного контроля и контроля фона, соответственно. Каждая группа содержала по 6 животных.
Пример 3. Конструирование второго химерного аденовирусного вектора (О81Ь) и третьего химерного аденовирусного вектора (О81с).
Нуклеиновую кислоту, кодирующую зеленый флуоресцирующий белок (СЕР) включили в р8йий1еСМУ стандартными рестриктазами. Плазмиду р8йий1еСМУ-СЕР получили гомологичной рекомбинацией с вектором рАб (СЬюдепе). как описано выше, с целью создания вектора, способного продуцировать рекомбинантный Аб (с делецией Е1/Е3), который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую СЕР. Клонировали нуклеиновую кислоту, кодирующую гемагглютинин из вируса гриппа А/РК/8/34 и поместили ее в вектор р8йий1е-СМУ (ОЬюдепе) (8ЕО Ю N0: 13). Плазмиду р8йий1еСМУНА (РК/8) получили гомологичной рекомбинацией с вектором рАб ЮЬюдепе), как описано выше, с целью создания вектора, способного продуцировать рекомбинантный Аб (с делецией Е1/Е3), который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую НА. Рекомбинантный Аб генерировали, трансфицировав новые конструкты экспрессии рАб-СМУ-СЕР и рАб-СМУ-НА в 293 клетки. Титры измеряли стандартными методами.
Пример 4. 081Ь (Аб-СМУ-СЕР плюс ТЬК-3 агонист) и 081с (Аб-СМУ-НА плюс ТЬК-3 агонист) превосходят стандартный гАб5 по способности индуцировать антиген-специфический иммунный ответ 1,0-107 РЕИ либо Аб-СМУ-СЕР плюс 5 мкг/мл поли ЬС (081), либо Аб-СМУ-СЕР (гАб5) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Оба вируса экспрессируют СЕР под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е1/Е3. Титр антител к СЕР измеряли в плазме через 3 недели после первоначального введения вируса методом апй-СЕР фС ЕЫ8А. Как показано на фиг. 3-4, группа О81Ь значительно более эффективно, чем гАб5, индуцировала ответ антител на белок СЕР через три недели после первоначального орального введения. Ответ СО8+ Т-клеток на СЕР измеряли методом тетрамерного окрашивания спленоцитов. Животных вакцинировали в недели 0, 4 и 8, и в неделю 10 извлекали у них селезенку. Спленоциты окрашивали СЬ8-Е[ТС и добавляли тетрамер, распознающий иммунодоминантный эпитоп к СЕР у мышей Ва1Ь/с. Результаты показывают, что вектор О81Ь статистически лучше, по сравнению с одним гАб, индуцировал тетрамер-положительные СО8 клетки (фиг. 4). 1,0-107 РЕИ либо Аб-СМУ-НА плюс 5 мкг/мл поли ЬС (081), либо Аб-СМУ-НА (гАб5) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Оба вируса экспрессируют НА под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е1/Е3. Титры антител к НА измеряли в плазме через 3 недели после первоначального введения вируса методом апй-РК8/34 фС ЕЫ8А. Процедура определения ответа антител похожа на описанную ранее, за исключением того, что в планшеты ЕЫ8А было добавлено 5 мкг/мл цельного лизата А/РК8/34 (Абуапсеб Вю!есйпо1оду Шсогрогайб, СаййешЬшд, МО). Как показано на фиг. 5, группа О81с значительно более эффективно, чем гАб5, индуцировала ответ антител на белок гриппа через три недели после первоначального орального введения (приблизительно, в 100 раз эффективнее). Результаты этих экспериментов демонстрируют также, что ТЬК-3 агонист совместно с химерным рекомбинантным аденовирусным вектором можно широко применять к множеству различных гетерологичных антигенов, при этом титр антител улучшается в 100 раз.
Пример 5. Непарентеральные маршруты введения лучше парентеральных маршрутов.
Внутримышечное введение препаратов тестировали, выполняя непосредственные инъекции 1,0-107 РЕИ рАб-СМУ-др120 (0810 +/- поли ЬС в концентрации 5 мкг/мл группам животных в четырехглавую мышцу (квадрицепс). Титры фС к СЕР в сыворотке крови измерялись, как описано выше. Каждая группа содержала шесть животных. Как показано на фиг. 6, значительные титры антител к др120 наблюдались через три недели после введения ТЬК-3 агониста (то есть, гАб+РЦ. (фиг. 6).
Интраназальное введение проверяли, вводя 20 мкл 1,1 -106 РЕИ О81с+/-5 мкг/мл поли ЬС в назаль
- 17 014757 ную полость мышам. Мышей слегка анестезировали изофлураном, после чего вводили вирус, сформулированный в стерильном физиологическом растворе. Результаты показывают, что гАб-СМУ-НА плюс поли 1:С (Э81с) демонстрирует слегка более высокие титры антител, по сравнению с животными, которым давали стандартный гАб-СМУ-НА. Результаты для индивидуальных животных были нанесены на графики для групп Э81с (N=6) и гАб (N=5). В качестве отрицательного контроля использовали нелеченых животных (N=4).
Пример 6. Конструирование экспрессируемого ТЕВ3 агониста.
Короткий сегмент из 45 пар оснований синтезировали, исходя из олигонуклеотидов и ДНК, которые при совместном отжиге формировали 45 Ьр сегмент, способный создать шпильку двухцепочечной РНК (6аС6АТАТ666СТ6ААТАС66АТСС6ТАТТСА6СССАТАТС6ТТТС) (8 ЕС) ΙΌ N0:10). Этот короткий сегмент (с названием 1ис1) клонировали в плазмиду р8К, содержащую человеческий бета-актиновый промотор и хвост ВСН ро1у А. Такая плазмида называется р8к-1ис1.
Пример 7. р8К-1ис 1 функционирует в дендритных клеточных культурах наподобие поли 1:С, эффекты поли 1:С и гАб аддитивны.
Чтобы определить, может ли экспрессированный ТЬВ-3 агонист из примера 6 функционировать как индуктор развития про-воспалительных цитокинов и дендритных клеток, наподобие лиганда ТБВ-3 поли 1:С, экспрессированный дцРНК ТБВ-3 агонист протестировали на культуре дендритных клеток. Костный мозг из бедер мышей Ва1Ь/с выращивали совместно с лигандом ί1ΐ-3 (200 нг/мл) и 5% сыворотки в среде ЭМЕМ, получив первичные культуры дендритных клеток. Пять дней спустя 293 клетки из первичных культур костного мозга трансфицировали либо р8к-1ис1, р8К-Ьс1а2 (длинный сегмент бета галактозидазы, формирующий шпильку из 200 пар оснований), либо рсЭХА3 (пустой вектор экспрессии). На шестой день трансфицированные клетки обработали ультрафиолетом (20 с при 40 кДж/см2), чтобы вызвать их апоптоз, после чего добавили к дендритным клеткам. К культуре дендритных клеток добавляли либо поли 1:С (1 мкг/мл), гАб (1 РЕИ/клетку), гАб + поли 1:С, р8К-1ис 1 трансфицированные клетки, и р8КЬс1а2 трансфицированные клетки, либо рсЭХА3 трансфицированные клетки, после чего систему культивировали одну ночь. Как показано на фиг. 8, р8К-1ис 1 трансфицированные клетки могут значительно усиливать активацию дендритных клеток, что измеряли методом 1Ь-6 ЕЫ8А. Результаты этого эксперимента показывают также, что сочетание гАб плюс ТЕВ3 лиганд (поли 1:С) сильно повышает активность дендритных клеток.
Протестировали также и другие лиганды. ТЕВ-3 агонист из 8Е0 ΙΌ N0: 11 (мл) также формирует шпильку дцРНК, приблизительно, такого же размера, что и 1ис1. Ее приготовили, смешивая олигонуклеотиды и совместно отжигая их с последующим клонированием в вектор р8К под контролем человеческого промотора бета-актина. Векторы трансфицировали в 293 клетки и добавили к первичным дендритным клеткам, как описано выше. Как показано на фиг. 9, эти дополнительные лиганды могут активировать дендритные клетки, наподобие лиганда 1ис1 (фиг. 9).
Пример 8. Конструирование четвертого химерного аденовирусного вектора (Ό82) и быстрое клонирование векторов (Э82Ье1а-1ис и Э82С-1ис).
Нуклеиновую кислоту, кодирующую др120 (МН ΛΙΩ8 ВеадеШ апб ВеЕегепсе Веадеп! Ргодгат) расположили под контролем ЦМВ промотора с небольшим интроном сразу выше стартового кодона челночного вектора (р81ш111е. ОЬюдепе). Ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей др120, поместили ро1у-А хвост из ЬСН. Последовательность вектора описана в 8Е0 ΙΌ N0: 1. дцРНК ТЬВ-3 агонист 1ис1 под контролем промотора из бета-актина человека и ро1у А (описанный в примере 5 выше) включили в челночный вектор др120 р8йий1е, так чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая др120, и нуклеиновая кислота, кодирующая ТЬВ-3 агонист, содержались в одном векторе под контролем двух различных промоторов. Направление экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий антиген, и экспрессии ТЬВ3 агониста показаны на фиг. 10.
Были также сконструированы два общих челночных вектора Э82Ье1а-1ис (8Е0 ΙΌ N0: 14) и Э82С1ис (8Е0 ΙΌ N0: 15). Это сделано так, чтобы в них можно было включить нуклеиновую кислоту, кодирующую любой интересующий антиген, под контролем промотора ЦМВ. Для управления экспрессией дцРНК ТЬВ-3 агониста могут использоваться либо промотор бета-актина человека, либо промотор ЦМВ. В частности, вектор Э82С-1ис содержит уникальный сайт Кри 1, в который с легкостью может быть клонирована нуклеиновая кислота, кодирующая интересующий антиген. Целью разработки этих векторов является значительное облегчение последующего конструирования векторов, поскольку кодирующую любой интересующий антиген нуклеиновую кислоту можно просто включить в сайт клонирования, чтобы быстро изготовить вектор, способный индуцировать ответ антител и Т-клеток на интересующий антиген. Гомологичную репликацию Ό82 с вектором рАб (ОЬюдепе) выполнили, как описано выше, с целью получения вектора, который способен продуцировать рекомбинантный Аб (с делецией по Е1/Е3), содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую СЕР, и нуклеиновую кислоту, кодирующую дцРНК ТЬВ-3 агонист 1ис1.
Рекомбинантный Аб сгенерировали, трансфицировав новый конструкт экспрессии рАб-бетаактин1ис1-СМУ-др120 в 293 клетки. Титры измеряли стандартными методами.
Пример 9. Индукция антиген-специфического иммунного ответа после орального введения Ό82.
- 18 014757
1,0-107 РЕИ либо рАб-СМУ-др120 плюс ТЬВ-3 агонист 1ис1 (Ό82), либо рАб-СМУ-др120 (гА65) ввели животным через желудочный зонд. Оба вируса экспрессируют др 120 под контролем ЦМВпромотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е1/Е3. Титр антител к др 120 измеряли в плазме через три недели после введения вируса методом ап0-др120 1дС ЕБ18А. Протокол ЕЫ8А был описан ранее (Тискег, е! а1, Мо1 Ткегару 8:392 (2004)). Результаты демонстрируют, что Ό82 способен индуцировать увеличение титра антител к др120 (используемому в этом изобретении гетерологичному антигену), приблизительно, на две логарифмические единицы. Вектор Ό82 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую экспрессируемый др120, и нуклеотидную последовательность, кодирующую дцРНК ТЬВ-3 агонист. В качестве положительного контроля в анализе использовали сыворотку из двух животных, которым подкожно ввели 10 микрограмм белка др120 плюс Полный адьювант Фрейнда, анализ также проводился методом ап0-др120 ЕЫ8А. Отрицательным контролем для ЕЫ8А служили нелеченые животные. Каждая группа содержала по 6 животных. Результаты представлены на фиг. 11.
Пример 10. Индукция антиген-специфического иммунного ответа после орального введения Ό83.
1,0-107 РЕИ либо А6-СМУ-НА гриппа (из А/РВ/8/34) плюс ТБВ.7/8 лиганд полиуридиловая кислота (Ό83), либо А6-СМУ-НА (гА65) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Оба вируса экспрессируют НА под контролем ЦМВ промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е1/Е3. Титр антител к НА измеряли в плазме через 3 недели после введения вируса методом апйНА гриппа 1дО ЕЫ8А. Каждая группа содержала по 6 животных. Результаты показаны на фиг. 12.
Пример 11. Конструирование пятого, шестого и седьмого химерного аденовирусного вектора (Э82Ь, Э82Ь-Гог и ΝΏ1.1 214).
Ген НА гриппа (А/1и6о/5/2005) был синтезирован компанией Се1Тек (№8ЙуШе, ΊΝ) и помещен в вектор р8йий1еСМУ (ОЫодепе), содержащий ЦМВ промотор с небольшим интроном сразу выше стартового кодона челночного вектора. Ниже антигена в векторе расположили 1ис1 ^NА с промотором человеческого бета-актина и ро1у А (как описано в примере 5), ориентация для Э82Ь показана на фиг. 10. Последовательность 1ис1 следующая: 6аС6АТАТ666СТ6ААТАС66АТСС6ТАТТСА6СССАТАТС6Т ТТС (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10), а готовый вектор р8йий1е описан в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6. Альтернативная ориентация 1ис1 с промотором в челночном векторе описана в 8ЕО ΙΌ N0:7 и названа Э82Ь-Гог. Сконструировали также еще один челночный вектор (под названием Э82ЬС-НА) (8Е0 ΙΌ N0: 16), содержащий два различных ЦМВ промотора, которые управляют экспрессией ТЬВ-3 агониста 1ис1 и НА гриппа, описанных выше. Гомологичную рекомбинацию с вектором рА6 (ОЫодепе) выполняли, как описано выше, с целью генерировать векторы, способные продуцировать рекомбинантный А6 (с делецией по Е1/Е3), который содержал бы нуклеиновые кислоты, кодирующие НА и ТЬВ-3 агонист 1ис1 под контролем различных промоторов. Рекомбинантный А6 генерировали, трансфицировав новые рАб-конструкты в 293 клетки. Титры измеряли стандартными методами. Готовый вектор рАб, содержащий Э82С-1ис, назвали ΝΏ 1.1 214 и опубликовали в патентном депозитарии АТСС 22 февраля 2007 года (Мапа^их, УА). Нуклеотидная последовательность этого химерного аденовирусного вектора описана в 8Е0 ΙΌ N0: 17. Кодирующая гетерологичный антиген нуклеиновая кислота выделена полужирным шрифтом и окружена сайтом распознавания С1а Ι по 5' концу и сайтом распознавания №11 по 3' концу. Кодирующая ТЬВ-3 агонисты нуклеотидная последовательность выделена курсивом, а линкерная последовательность полужирным шрифтом. В химерный аденовирусный вектор можно включить нуклеотидную последовательность, кодирующую любой интересующий антиген, и последовательность, кодирующую любой подходящий экспрессируемый ТЬВ-3 агонист.
Пример 12. Индукция антиген-специфического иммунного ответа после орального введения Э82Ь.
1,0-107 РЕИ либо рАб-СМУ-НА плюс ТЬВ-3 агониста Нгс 1 в обратной (Э82Ь) или прямой (Э82ЬГог) ориентации, либо рАб-СМУ-НА (гАб5) ввели животным через желудочный зонд в неделю 0. Эти вирусы экспрессируют антиген НА гриппа под контролем ЦМВ-промотора и используют рекомбинантный аденовирус типа 5 с делецией Е1/Е3. Титр антител к НА измерили в плазме через три недели после введения вируса методом апй-НА ЕЫ8А. Результаты демонстрируют, что вектор Э82Ь индуцирует ответ антител к белку НА в большей степени, чем стандартный вектор гАб (гАб5). Вектор Э82Ь содержит гАб5, экспрессирующий НА, он также экспрессирует агонист То11-подобного рецептора (ТЬВ3), шпильку двухцепочечной РНК и демонстрирует тем самым, что использование закодированного дцРНКлиганда может улучшить адаптивный иммунный ответ на интересующие антигены. Как показано на фиг. 11 и 13, экспрессированная дцРНК улучшает адаптивный иммунный ответ к различным гетерологичным антигенам. Отрицательным контролем для ЕЫ8А служили нелеченые животные. Каждая группа содержала по 6 животных.
Векторы в противоположной ориентации (Э82Гог) исследовали на ответ антител после либо орального, либо внутримышечного введения 1,0-107 РЕИ вируса на животное в недели 0 и 5. Ответ антител на НА измеряли на четвертую и седьмую недели после первоначального введения. Как показано на фиг. 14, векторы в противоположной ориентации также могут индуцировать существенный ответ антител на гетерологичные антигены. Векторы Э81Ь апб Ό81 ЬГог индуцировали одинаковые ответы на НА на четвер
- 19 014757 той неделе. Важно, что для Э81ЬГог был продемонстрирован эффект резкого усиления иммунного ответа, показавший, что в целях усиления иммунного ответа на гетерологичный антиген можно использовать многократные введения.
Был продемонстрирован также и еще один пример возможностей подхода с использованием химерных аденовирусных векторов. Вектор ΝΏ1.1 214 вводили животным орально (1,0-107 РРИ) или интраназально (3-106 РРИ), а ответы антител на гетерологичный антиген измеряли в неделю 3. Как показано на фиг. 15, после орального введения был получен значимый ответ антител на НА, далеко превосходящий типичные значения, наблюдаемые после однократного орального введения вектора гАб. Все публикации, патентные публикации, патенты и номера доступа СепЬапк, процитированные в настоящей спецификации, включены в нее по ссылке во всей своей полноте для всех целей, как если бы для каждой отдельной публикации, патентной публикации или патента было бы отдельно и конкретно указано, что они включены по ссылке.

Claims (13)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Химерный аденовирусный вектор экспрессии, содержащий кассету экспрессии, включающую первый промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей агонист То11-подобного рецептора-3 (ТЬВ-3), представляющий собой двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК), и второй промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид.
2. Вектор по п.1, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая агонист ТЬЯ-3, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ΙΌ N0: 3, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 11 и ЗЕО ГО N0: 12.
3. Вектор по п.1, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая агонист ТЬЯ-3, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0: 4, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0: 9, ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 11 и ЗЕО ГО N0: 12.
4. Вектор по п.1, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный полипептид, является кодирующей гетерологичный полипептид, представляющий собой полипептид оболочки вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) епу.
5. Вектор по п.4, в котором полипептид ВИЧ епу выбран из группы, состоящей из др41, др 120 и др160.
6. Вектор по п.1, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный полипептид, является кодирующей гетерологичный полипептид, представляющий собой полипептид гемагглютинина (НА) вируса гриппа.
7. Вектор по п.1, в котором первый промотор и второй промотор одинаковы.
8. Вектор по п.7, в котором первый промотор и второй промотор представляют собой промотор цитомегаловируса.
9. Иммуногенная композиция, содержащая вектор экспрессии по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
10. Способ индукции иммунного ответа, направленного против гетерологичного полипептида, включающий оральное, интраназальное или мукозальное введение млекопитающему иммуногенно эффективного количества вектора по п.1.
11. Способ по п.10, в котором при введении упомянутый вектор экспрессируют дендритные клетки, складчатые клетки или эпителиальные клетки тонкого кишечника, с образованием гетерологичного полипептида.
12. Способ по п.10, в котором упомянутый вектор вводят млекопитающему, представляющему со
- 169 014757 бой человека.
13. Выделенная нуклеиновая кислота, включающая последовательность, выбранную из группы, состоящей из 81Т) ГО N0: 1, 81Т) ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 6, 81Т) ГО N0: 7, 81Т) ГО N0: 14, 81Т) ГО N0: 15, 81Т) ГО N0: 16 и 81Т) ГО N0: 17.
Ответ антител на Ηΐν βην в неделю 3 после введения
EA200801907A 2006-02-28 2007-02-28 Химерный аденовирусный вектор, иммуногенная композиция на его основе, способ индукции иммуного ответа с его помощью и выделенная нуклеиновая кислота EA014757B1 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77802606P 2006-02-28 2006-02-28
US80164506P 2006-05-19 2006-05-19
US80299206P 2006-05-22 2006-05-22
US82149206P 2006-08-04 2006-08-04
US84665806P 2006-09-22 2006-09-22
US84819506P 2006-09-28 2006-09-28
PCT/US2007/005386 WO2007100908A2 (en) 2006-02-28 2007-02-28 Chimeric adenoviral vectors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801907A1 EA200801907A1 (ru) 2009-02-27
EA014757B1 true EA014757B1 (ru) 2011-02-28

Family

ID=38459683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801907A EA014757B1 (ru) 2006-02-28 2007-02-28 Химерный аденовирусный вектор, иммуногенная композиция на его основе, способ индукции иммуного ответа с его помощью и выделенная нуклеиновая кислота

Country Status (23)

Country Link
US (3) US7879602B2 (ru)
EP (1) EP1996238B1 (ru)
JP (1) JP5016614B2 (ru)
KR (2) KR101105511B1 (ru)
CN (2) CN101432291B (ru)
AP (1) AP2844A (ru)
AU (1) AU2007220988B2 (ru)
BR (1) BRPI0708344B8 (ru)
CA (1) CA2638757C (ru)
DK (1) DK1996238T3 (ru)
EA (1) EA014757B1 (ru)
ES (1) ES2573456T3 (ru)
HR (1) HRP20160795T1 (ru)
HU (1) HUE030281T2 (ru)
IL (2) IL193684A (ru)
LT (1) LT1996238T (ru)
MY (1) MY154956A (ru)
NZ (1) NZ571010A (ru)
PL (1) PL1996238T3 (ru)
PT (1) PT1996238T (ru)
RS (1) RS54843B1 (ru)
SI (1) SI1996238T1 (ru)
WO (1) WO2007100908A2 (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5016614B2 (ja) * 2006-02-28 2012-09-05 バクサート インコーポレーティッド キメラアデノウイルスベクター
WO2009073133A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-11 Vaxinnate Corporation Compositions of toll-like receptor agonists and papillomavirus antigens and uses thereof
WO2010036293A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 The Johns Hokins University Malaria vaccine
RU2012107702A (ru) * 2009-07-31 2013-09-10 Пэксвэкс, Инк. Векторы на основе аденовирусов
WO2011034950A1 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 Vaxart, Inc. Immunization strategy to prevent h1n1 infection
US9198959B2 (en) * 2011-02-22 2015-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Adenovirus vaccine vector and methods of use
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
EP2931896B1 (en) 2012-12-11 2019-01-16 Osivax SAS Modified coiled coil type proteins having improved properties
EP3041503A4 (en) * 2013-09-06 2017-06-07 Altimmune Inc. Methods and compositions for viral vectored vaccines
KR102396817B1 (ko) 2014-02-20 2022-05-11 박사르트, 인크. 소장 전달을 위한 제형들
MY181175A (en) 2014-11-04 2020-12-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv16 vaccines
EP3283634B1 (en) 2015-04-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
EP3307239B1 (en) * 2015-06-12 2020-09-16 Vaxart, Inc. Formulations for small intestinal delivery of rsv and norovirus antigens
SG10202001501QA (en) 2015-08-20 2020-04-29 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv18 vaccines
GB201603577D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Oxford Genetics Ltd Promoter
AU2017259259B2 (en) 2016-05-02 2020-11-19 Bavarian Nordic A/S Therapeutic HPV vaccine combinations
CN109154000B (zh) 2016-05-12 2022-07-05 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
AU2017283118B2 (en) 2016-06-20 2019-02-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
WO2018106931A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US11205103B2 (en) 2016-12-09 2021-12-21 The Research Foundation for the State University Semisupervised autoencoder for sentiment analysis
CA3046019A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tlr modulator
EP3565591A1 (en) * 2017-01-06 2019-11-13 Stabilitech Biopharma Ltd Virus
AU2018217935B2 (en) 2017-02-09 2020-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
US20230107927A1 (en) 2020-02-28 2023-04-06 First Wave Bio, Inc. Methods of treating iatrogenic autoimmune colitis
WO2021248017A2 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 Vaxart, Inc. Chimeric adenoviral vectors
EP4175640A1 (en) 2020-07-02 2023-05-10 VIIV Healthcare Company Method of achieving hiv viral remission using long-acting antiretroviral agents

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020182223A1 (en) * 2000-06-02 2002-12-05 Lacount Douglas J. Method of rapidly generating double-stranded RNA and methods of use thereof
US6511845B1 (en) * 1992-08-07 2003-01-28 Alan R. Davis Methods for producing an immune response against HIV-1
WO2005014038A1 (ja) * 2003-08-11 2005-02-17 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University 粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン
US20050239728A1 (en) * 2002-07-31 2005-10-27 Pachuk Catherine J Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
US20020155127A1 (en) 2000-06-02 2002-10-24 Danher Wang Genetic vaccine against human immunodeficiency virus
EP1327688A1 (en) * 2002-01-14 2003-07-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Adenoviruses with enhanced lytic potency
GB0321615D0 (en) * 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
EP1586654A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Replication competent viruses capable of silencing virus inhibitory factor expression
KR20100018029A (ko) * 2004-07-18 2010-02-16 씨에스엘 리미티드 면역자극 복합체 및 향상된 인터페론-감마 반응을 유도하기 위한 올리고뉴클레오티드 제제
JP5016614B2 (ja) * 2006-02-28 2012-09-05 バクサート インコーポレーティッド キメラアデノウイルスベクター

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6511845B1 (en) * 1992-08-07 2003-01-28 Alan R. Davis Methods for producing an immune response against HIV-1
US20020182223A1 (en) * 2000-06-02 2002-12-05 Lacount Douglas J. Method of rapidly generating double-stranded RNA and methods of use thereof
US20050239728A1 (en) * 2002-07-31 2005-10-27 Pachuk Catherine J Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
WO2005014038A1 (ja) * 2003-08-11 2005-02-17 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University 粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン
US20070219149A1 (en) * 2003-08-11 2007-09-20 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Novel Vaccine Containing Adjuvant Capable Of Inducing Mucosal Immunity

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXOPOULOU L. et al. Recognition of double stranded RNA and activation of NK-kappa B by Toll-like Receptor 3. Nature. October 2001, Vol. 413, pages 732-738, see entire document. *
ICHINOHE. T. et al. Synthetic double-stranded RNA poly (I:C) combined with mucosal vaccine protects against Influenza virus infection. J. Virol. 2005, Vol. 79, No.5, pages 2910-2919, see entire document. *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ571010A (en) 2010-11-26
IL229523A (en) 2016-08-31
DK1996238T3 (da) 2016-08-01
BRPI0708344A8 (pt) 2016-05-31
CA2638757C (en) 2014-01-21
BRPI0708344A2 (pt) 2011-05-24
EP1996238A4 (en) 2011-08-24
HRP20160795T1 (hr) 2016-08-12
EA200801907A1 (ru) 2009-02-27
CN101432291B (zh) 2013-03-20
ES2573456T3 (es) 2016-06-08
LT1996238T (lt) 2016-09-12
WO2007100908A2 (en) 2007-09-07
PT1996238T (pt) 2016-07-11
JP5016614B2 (ja) 2012-09-05
KR20080105120A (ko) 2008-12-03
US8222224B2 (en) 2012-07-17
AP2008004612A0 (en) 2008-10-31
US20070269410A1 (en) 2007-11-22
BRPI0708344B1 (pt) 2021-05-11
US20110081375A1 (en) 2011-04-07
AU2007220988A1 (en) 2007-09-07
PL1996238T3 (pl) 2016-12-30
RS54843B1 (sr) 2016-10-31
US20130164326A1 (en) 2013-06-27
AP2844A (en) 2014-02-28
CA2638757A1 (en) 2007-09-07
IL229523A0 (en) 2013-12-31
HUE030281T2 (en) 2017-05-29
BRPI0708344B8 (pt) 2021-05-25
AU2007220988B2 (en) 2010-06-03
KR101105511B1 (ko) 2012-01-16
KR20110132637A (ko) 2011-12-08
CN101432291A (zh) 2009-05-13
SI1996238T1 (sl) 2016-10-28
KR101273836B1 (ko) 2013-06-11
IL193684A0 (en) 2011-08-01
MY154956A (en) 2015-08-28
EP1996238B1 (en) 2016-04-06
JP2009533018A (ja) 2009-09-17
IL193684A (en) 2013-12-31
US8999946B2 (en) 2015-04-07
US7879602B2 (en) 2011-02-01
WO2007100908A3 (en) 2008-11-27
CN103122360A (zh) 2013-05-29
EP1996238A2 (en) 2008-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014757B1 (ru) Химерный аденовирусный вектор, иммуногенная композиция на его основе, способ индукции иммуного ответа с его помощью и выделенная нуклеиновая кислота
AU2003297039B2 (en) Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
KR102025488B1 (ko) 신규한 배큘로바이러스 벡터 및 사용 방법
Borah et al. Perspectives on RNA vaccine candidates for COVID-19
JP2019521148A (ja) アルファウイルスワクチン接種のための組成物及び方法
Kabiri et al. Robust mucosal and systemic responses against HTLV-1 by delivery of multi-epitope vaccine in PLGA nanoparticles
Neukirch et al. Adenovirus based virus-like-vaccines targeting endogenous retroviruses can eliminate growing colorectal cancers in mice
US20230405109A1 (en) Nucleic acids, proteins, and vaccines of sars-cov-2
Khan et al. Adenovirus-vectored SARS-CoV-2 vaccine expressing S1-N fusion protein
Rice et al. Heterologous saRNA prime, DNA dual-antigen boost SARS-CoV-2 vaccination elicits robust cellular immunogenicity and cross-variant neutralizing antibodies
Choi et al. Bolstering components of the immune response compromised by prior exposure to adenovirus: guided formulation development for a nasal Ebola vaccine
US20210260176A1 (en) Methods and Compositions for Vaccinating Against Malaria
CN116710129A (zh) 用于预防和/或治疗covid-19的组合物和方法
JP2018521030A (ja) Ｒｓｖおよびノロウイルス抗原の小腸送達のための製剤
JP2023507347A (ja) ネオエピトープをコードするコンストラクトを使用する核酸ワクチン接種
JP2013505022A (ja) Ｈ１ｎ１感染を予防するための免疫戦略の方法
US20230293670A1 (en) Novel coronavirus recombinant spike protein, polynucleotide encoding same, vector comprising polynucleotide, and vaccine for preventing or treating coronavirus infection, comprising vector
Neeli et al. Comparison of DNA vaccines with AS03 as an adjuvant and an mRNA vaccine against SARS-CoV-2
US20240093234A1 (en) Chimeric adenoviral vectors
Schmidt et al. MIDGE vectors and dSLIM immunomodulators: DNA-based molecules for gene therapeutic strategies
Myers et al. Tumor immunity and prolonged survival following combined adenovirus-HSP72 and CEA-plasmid vaccination
KR20170081646A (ko) 단순 포진 바이러스 유형 2(ｈｓｖ-2)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 치료 조성물 및 방법
WO2021222851A1 (en) Combinations of viral proteins, peptide sequences, epitopes, and methods and uses thereof
Han et al. 9 DNA Vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KG MD

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): KG MD

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ