KR101273836B1 - 키메라 아데노바이러스 벡터 - Google Patents

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박사르트, 인크.
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Abstract

본 발명은 키메라 아데노바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 사용하여 관심의 대상이 되는 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

Description

키메라 아데노바이러스 벡터{CHIMERIC ADENOVIRAL VECTORS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2006년 2월 28일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/778,026호, 2006년 5월 19일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/801,645호, 2006년 5월 22일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/802,992호, 2006년 8월 4일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/821,492호, 2006년 9월 22일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/846,658호, 및 2006년 9월 28일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/848,195호 (상기의 개시 내용 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다)에 대한 우선권을 주장한다.
연방 정부 후원 연구 또는 개발하에 이루어진 본 발명에 대한 권리에 관한 진술
해당 사항 없음.
백신은 다수의 질병 및 질환 (예컨대, 바이러스 감염, 세균 감염, 및 암)을 예방 및/또는 치료하기 위한 중요한 수단이다. 핵산-기초 백신이 단백질 또는 약독화된-생백신 보다 우수한 장점을 갖고 있다. 항원을 발현하는 핵산을 표적 세포 내로 도입시킴으로써 관심의 대상이 되는 항원에 대한 면역 반응을 생성시키는 백신을 신속하게 개발할 수 있다. 단백질 백신의 경우, 매번 새로운 백신이 생성될 때마다 효과적이고 효율적인 단백질 정제 방법이 개발되어야 한다. 생백신의 경우, 병원체의 성장을 완전하게 중단시키지는 않되, 인간에서는 완전히 안전한 것으로서 입증된, 약독화 방법이 확인되어야 한다. 단백질 정제와 약독화 방법에 대한 개발은 극도로 많은 시간이 소비되는 공정이다. 반대로, 대부분의 핵산-기초 백신은 단지 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 핵산을 신속하게 변형시킴으로써 매번 동일한 제조 기법을 사용하여 매우 신속하게 제조될 수 있다. 복제 무능한 아데노바이러스는 예상대로 저렴하고 신속하게 고역가로 제조되는 하나의 핵산-기초 백신 시스템이다 (문헌 [Polo, J. M. and Dubensky, T. W., Jr., Drug Discov Today, 7(13), 719-727 (2002)]). 그러나, 당업계에 공지된 아데노바이러스 벡터를 투여한 이후의 항원-특이 반응의 효능은 낮다. 따라서, 당업계에서는 관심의 대상이 되는 항원에 대한 면역 반응을 효과적으로 유도하는데 사용될 수 있는 새로운 아데노바이러스 벡터를 필요로 하고 있다. 본 발명이 이러한 요구 및 기타 요구들을 충족시켜 준다.
본 발명은 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터, 및 이종 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 (a) 톨-유사 수용체(TLR)-3 효현제를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 (b) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, TLR-3 효현제는 dsRNA이다. 몇몇 실시태양에서, TLR 효현제를 코딩하는 핵산은 서열 번호: 3, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로부터 선택되는 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 이종 폴리펩티드는 HIV 외피 폴리펩티드 (예컨대, gp41, gp120 또는 gp160) 및 인플루엔자 HA 폴리펩티드로부터 선택된다. 몇몇 실시태양에서, 제1 및 제2 프로모터는 동일하다. 몇몇 실시태양에서, 제1 및 제2 프로모터는 상이하다. 몇몇 실시태양에서, 프로모터는 베타 액틴 프로모터 및 CMV 프로모터로부터 선택된다. 본 발명은 또한 발현 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 실시태양은 포유동물 대상자 (예컨대, 설치류, 예로서, 마우스, 래트, 또는 기니어 피그 또는 영장류, 예로서, 침팬지, 붉은털 원숭이, 또는 인간)에게 조성물을 면역학적 유효량으로 투여하여 이종 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 벡터는 임의의 비-비경구적인 경로 (예컨대, 경구적으로, 비내로, 또는 점막으로)를 통해 투여된다. 몇몇 실시태양에서, 이종 폴리펩티드는 가지 세포, 미세주름 세포, 및 장 상피 세포로부터 선택되는 세포에서 발현된다.
본 발명의 추가의 실시태양은 (a) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터; 및 (b) TLR-3 효현제 (예컨대, dsRNA)를 포함하는, 면역원성 조성물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, TLR-3 효현제는 핵산에 의해 코딩된다. 본 발명은 또한 임의의 비-비경구적인 경로 (예컨대, 경구, 비내, 또는 점막)를 통해 포유동물 대상자 (예컨대, 설치류, 예로서, 마우스, 래트, 또는 기니어 피그 또는 영장류, 예로서, 침팬지, 붉은털 원숭이, 또는 인간)에게 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 서열 번호: 1, 2, 6, 7, 13, 14, 15, 16, 또는 17에 기재된 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 당업계에서는 관심의 대상이 되는 항원에 대한 면역 반응을 효과적으로 유도하는데 사용될 수 있는 새로운 아데노바이러스 벡터에 대한 요구 및 기타 요구들을 충족시켜 준다.
도 1 및 2는 벡터를 경구로 전달한 이후 항원 특이적인 면역 반응을 유도함에 있어 TLR-3 효현제와 조합된 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터 (즉, DS1)가 표준 아데노바이러스 벡터 (즉, rAd5)보다 더욱 효과적이라는 것을 입증하는 데이타를 도시한다. 도 1은 아데노바이러스 벡터를 경구로 전달한 후 3주째의 HIV 외피 단백질 (즉, gp120)에 대한 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다. 도 2는 아데노바이러스 벡터를 경구로 전달한 후 6주째의 HIV 외피 단백질 (즉, gp120)에 대한 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다.
도 3 내지 5는 항원 특이적인 면역 반응을 유도함에 있어 TLR-3 효현제와 조합된 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터 (즉, DS1b 또는 DS1c)가 표준 아데노바이러스 벡터 (즉, rAd5)보다 더욱 효과적이라는 것을 입증하는 데이타를 도시한다. 도 3은 벡터를 경구로 투여한 후 3주째의 항-GFP IgG 역가를 나타낸 데이타를 도시한다. 도 4는 0주, 4주, 및 8주째 벡터를 경구로 투여한 후 10주째에 GFP에 대한 CD8+ T 세포 반응을 나타낸 데이타를 도시한다. 도 5는 벡터를 경구로 투여한 후 3주째의 항-HA 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다.
도 6 및 7은 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터가 면역 반응을 유도함에 있어 비-비경구적으로 투여될 때 우수하다는 것을 입증하는 데이타를 도시한다. 도 6는 DS1을 근육내로 투여한 후 3주째의 항-gp120 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다. 도 7은 DS1c를 비내로 투여한 후 3주째의 항-HA 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다.
도 8 및 9는 발현된 TLR-3 리간드 효현제가 항원 전달 세포의 활성화를 유도시킬 수 있다는 것을 입증하는 데이타를 도시한다. 도 8은 발현된 dsRNA TLR-3 효현제 luc1에 의한 가지 세포 활성화를 나타낸 데이타를 도시한다. 도 9는 발현된 dsRNA TLR-3 효현제 luc1 및 m1에 의한 가지 세포 활성화를 나타낸 데이타를 도시한다.
도 10은 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터, 즉, 발현되는 dsRNA TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터의 그래프 도해이다.
도 11은 경구로 전달된 이후 항원 특이적인 면역 반응을 유도함에 있어 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터가 효과적이라는 것을 입증하는 데이타를 도시한다. 도 11은 dsRNA TLR-3 효현제 luc1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 키메라 아데노바이러스를 경구로 전달한 후 3주째의 항-gp120 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다.
도 12는 TLR-7/8 효현제가 항원 특이적인 면역 반응을 유도함에 있어 효능이 부족하다는 것을 입증하는 데이타를 도시한다.
도 13 내지 15는 경구로 전달된 이후 항원 특이적인 면역 반응을 유도함에 있어 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터가 효과적이라는 것을 입증하는 데이타를 도시한다. 도 13은 dsRNA TLR-3 효현제 luc1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 키메라 아데노바이러스를 경구로 투여한 후 4주째의 항-HA 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다. 도 14는 dsRNA TLR-3 효현제 luc1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 키메라 아데노바이러스를 투여한 후 4주째 또는 7주째의 항-HA 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다. 도 15는 dsRNA TLR-3 효현제 luc1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 키메라 아데노바이러스를 경구 또는 비내로 투여한 후 3주째의 항-HA 항체 역가를 나타낸 데이타를 도시한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호: 1은 키메라 아데노바이러스 벡터 DS1에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 2는 키메라 아데노바이러스 벡터 DS2에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 3은 TLR-3 효현제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 4는 TLR-3 효현제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 5는 TLR-3 효현제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 6은 인플루엔자 HA를 코딩하는 핵산 및 TLR-3 효현제 (luc)를 코딩하는 핵산을 포함하되, 여기서, 인플루엔자 HA 및 TLR-3 효현제는 동일한 배향으로 존재하는 것인, 키메라 아데노바이러스 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 7은 인플루엔자 HA를 코딩하는 핵산 및 TLR-3 효현제 (luc)를 코딩하는 핵산을 포함하되, 여기서, 인플루엔자 HA 및 TLR-3 효현제는 반대 배향으로 존재하는 것인, 키메라 아데노바이러스 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 8은 짧은 헤어핀 RNA TLR-3 효현제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 상기 서열의 상보적인 부분은 대문자로 나타내고, 링커 서열을 소문자로 나타낸다.
서열 번호: 9는 짧은 헤어핀 RNA TLR-3 효현제 (g1)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 상기 서열의 상보적인 부분은 대문자로 나타내고, 링커 서열을 소문자로 나타낸다.
서열 번호: 10은 짧은 헤어핀 RNA TLR-3 효현제 (luc)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 상기 서열의 상보적인 부분은 대문자로 나타내고, 링커 서열을 소문자로 나타낸다.
서열 번호: 11은 짧은 헤어핀 RNA TLR-3 효현제 (m1)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 상기 서열의 상보적인 부분은 대문자로 나타내고, 링커 서열을 소문자로 나타낸다.
서열 번호: 12는 짧은 헤어핀 RNA TLR-3 효현제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 상기 서열의 상보적인 부분은 대문자로 나타내고, 링커 서열을 소문자로 나타낸다.
서열 번호: 13은 키메라 아데노바이러스 벡터 DS1c에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 상기 서열은 HA (PR8/34)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.
서열 번호: 14는 키메라 아데노바이러스 벡터 DS2베타-luc에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 상기 벡터는 베타 액틴 프로모터의 제어하에 TLR-3 효현제를 코딩하는 서열을 포함한다. 벡터는 또한 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 핵산 서열(들)의 삽입을 위한 오픈 클로닝 부위도 포함한다.
서열 번호: 15는 키메라 아데노바이러스 벡터 DS2C-luc 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 벡터는 CMV 프로모터의 제어하에 TLR-3 효현제 luc를 코딩하는 서열을 포함한다. 벡터는 또한 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 핵산 서열(들)의 삽입을 위한 오픈 클로닝 부위도 포함한다.
서열 번호: 16은 CMV 프로모터의 제어하에 TLR-3 효현제 luc를 코딩하는 핵산 서열 및 별개의 CMV 프로모터의 제어하에 HA (조류 독감)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 pShuttle 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
서열 번호: 17은 키메라 아데노바이러스 벡터 ND 1.1 214에 대한 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 이종 항원을 코딩하는 핵산은 굵게 표시하고, 이는 5' 말단 상의 Cla I 인식 부위 및 3' 말단 상의 Not 1 인식 부위 측면에 위치한다. TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 서열은 이탤릭체로 나타내고, 링커 서열은 굵게 표시한다.
I. 도입
본 발명은 관심의 대상이 되는 항원에 대하여 면역 반응을 유도하기 위해 비-비경구적으로 투여될 수 있는, 신규한 키메라 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 키메라 아데노바이러스 벡터는 특히 비-비경구적인 경로 (예컨대, 경구적으로, 비내로, 또는 점막으로)를 통해 투여되었을 때, 이종 폴리펩티드에 대하여 특이적이며, 강력하고, 효과적인 면역 반응을 유도하다.
본 발명은, dsRNA TLR-3 효현제의 투여는 바이러스 벡터와 함께 투여될 때 효과적인 애주번트가 된다는 놀라운 발견에 기초한다. 사실상, 바이러스 벡터에 대한 애주번트로서 dsRNA를 사용하는 것은, dsRNA 모사체 폴리 I:C가 주로 항바이러스제로서 사용될 수 있다고 제안된 것을 고려하면 반직관적일 것이다 (문헌 ([Nemes, et al, Proc Soc Exp Biol Med. (1969) 132:776]; [Schafer, et al, Nature. (1970) 226:449]; [Fenje, et al, Nature (1970) 226:171.])).
II . 정의
예컨대, 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 본원에서 사용되는 "키메라" 또는 "재조합"이라는 용어는 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었다는 것을 지시한다. 따라서, 예를 들면, 키메라 및 재조합 벡터는 천연 (비-키메라 또는 비-재조합) 형태의 벡터 내에서는 발견되지 않는 핵산 서열을 포함한다. 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 지칭한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정 핵산을 전사시킬 수 있는 일련의 명시된 핵산 요소를 통해 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 작제물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 핵산 단편의 일부분일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 전사시키고자 하는 핵산을 포함한다.
본원에서 "프로모터" 및 "발현 제어 서열"이라는 용어는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열 어레이를 지칭하는 것으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바, 프로모터는 예로서, 폴리머라제 II형 프로모터의 경우, TATA 요소와 같이, 전사 개시 부위에 근접한 위치에 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 만큼의 거리에 위치할 수 있는, 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다. 프로모터는 구성적 및 유도 가능한 프로모터를 포함한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경적 조건과 발달 조건에서 활성인 프로모터이다. "유도 가능한" 프로모터는 환경 조건 또는 발달 조절하에 활성인 프로모터이다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 제어 서열 (예로서, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하되, 여기서, 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에서 사용되는 바, "TLR 효현제" 또는 "톨-유사 수용체 효현제"라는 용어는 예컨대, TLR-2, TLR-3, TLR-6, TLR-7, 또는 TLR-8을 비롯한 톨-유사 수용체에 결합하고, 이를 자극시키는 화합물을 지칭한다. TLR 효현제에 관해서는 문헌 ([MacKichan, IAVI Report. 9:1-5 (2005)] 및 [Abreu et al, J Immunol, 174(8), 4453-4460 (2005)])에 리뷰되어 있다. 효현제는 그의 수용체에 결합한 후, 신호 형질도입을 유도한다.
본원에서 사용되는 바, "TLR-3 효현제" 또는 "톨-유사 수용체 3 효현제"라는 용어는 TLR-3에 결합하고, 이를 자극시키는 화합물을 지칭한다. 더블-스트랜드 RNA, 바이러스로부터 유래된 dsRNA, 폴리이노신산-폴리시티딜산 (폴리 LC) - 폴리아세닐산-폴리우리딜산 (폴리 A:U) 및 폴리 I:폴리 C를 비롯한, 수개의 화학적으로 합성된 더블-스트랜드 RNA에 대한 유사체, 및 IFN-베타를 생산하는 TLR-3에 대한 항체 (또는 그에 대한 항체와 가교결합하는 항체)를 포함하는, TLR-3 효현제가 동정되었다 (문헌 [Matsumoto, M, et al, Biochem Biophys Res Commun 24:1364 (2002)], [de Bouteiller, et al, J Biol Chem 18:38133-45 (2005)]). TLR-3 효현제는 또한 발현된 dsRNA (예컨대, 서열 번호: 3, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12에 기재된 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 dsRNA)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "TLR-7/8 효현제" 또는 "톨-유사 수용체 7/8 효현제"라는 용어는 TLR-7 또는 TLR-8 수용체에 결합하고, 그를 자극시키는 화합물을 지칭하는데; 이들 수용체는 수개의 동일 리간드를 인식한다. 예로서, 바이러스 싱글-스트랜드 RNA, 이미퀴모드, 록소리빈, 폴리우리딜산, 또는 레시퀴모드와 같은 수개의 TLR-7/8 효현제가 동정되었다.
핵산의 부분과 관련하여 사용되는 "이종"이라는 용어는 핵산이 천연 상태로는 서로에 대하여 동일한 유연 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 하위 서열을 포함하는 것을 지시하다. 예를 들어, 전형적으로, 새로운 기능적 핵산을 제조하기 위해 배열된, 관련이 없는 유전자들로부터의 2개 이상의 서열을 갖는, 예컨대, 하나의 공급원으로부터 유래된 프로모터와 또다른 공급원으로부터 유래된 코딩 영역을 갖는 핵산이 재조합적으로 생산된다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 천연 상태로는 서로에 대하여 동일한 유연 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 하위 서열을 포함하는 것을 지시하다 (예컨대, 융합 단백질).
"핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 싱글- 또는 더블-스트랜드 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 함유하며, 합성인 것, 천연적으로 발생된 것, 및 비천연적으로 발생된 것이고, 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 가지며, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사가 이루어지는 핵산을 포함한다. 그러한 유사체의 일례로는 제한없이 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNAs)을 포함한다.
달리 지시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 그의 변이체 (예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열 뿐만 아니라, 명확하게 명시된 서열을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치의 것이 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환을 달성할 수 있다 (문헌 [Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]). 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환적으로 사용된다.
항원- T 세포 수용체 및/또는 항체에 의해 인식될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드 부분을 지칭한다. 전형적으로, 항원은 세균, 바이러스, 또는 진균 단백질로부터 유래된다.
본 발명의 조성물의 "면역학적 유효 투여량 또는 면역학적 유효량"은 이종 폴리펩티드에 대하여 특이적인 면역 반응을 유도하거나 조정하는 양이다. 면역원성 조성물은 임의 단계의 질병을 치료학적으로 예방학적으로 치료하거나 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
"체액성 면역 반응"은 혈액의 무세포 성분들, 즉, 혈장 또는 혈청에 의해 매개되는데; 하나의 개체로부터 또다른 개체로 혈청 또는 혈장을 전달하는 것이 면역성을 전달한다.
"세포 매개 면역 반응"은 항원 특이 림프구에 의해 매개되는데; 하나의 개체로부터 또다른 개체로 항원 특이 림프구를 전달하는 것이 면역성을 전달한다.
키메라 아데노바이러스 벡터, 또는 키메라 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 "치료학적 투여량" 또는 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 이종 폴리펩티드의 공급원 (예컨대, 바이러스, 세균, 기생충, 또는 암)과 관련된 질병 및 질환 증상을 예방, 경감, 완화, 또는 저하시키는 벡터의 양 또는 벡터를 포함하는 조성물의 양이다.
항체- 특이적으로 항원에 결합하고 그를 인식하는, 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. 인식되는 면역글로불린 유전자로는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실런, 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 입실런으로 분류되는데, 결국 이는 각각 면역글로불린 부류인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.
T 세포- 한 유전자 계열에 의해 코딩되는 특정 수용체 (T 세포 수용체)를 발현하는 특정 부류의 림프구를 지칭한다. 인식되는 T 세포 수용체 유전자는 알파, 베타, 델타, 및 감마 좌위를 포함하고, T 세포 수용체는 전형적으로 (단, 보편적이지는 않음) MHC와 짧은 펩티드의 조합물을 인식한다.
적응 면역 반응- 항원에 대한 T 세포 및/또는 항체 인식을 지칭한다.
항원 전달 세포(APCs)- 본원에서 사용되는 바, 이는 면역원성 펩티드 또는 그의 단편을 T 세포로 전달하여 면역 반응을 활성화시키거나 증진시키는 세포를 지칭한다. APCs로는 가지 세포, 대식세포, B 세포, 단핵구 및 효과적인 APCs가 되도록 조작될 수 있는 기타 세포를 포함한다. 그러한 세포는 항원을 전달하는 능력을 증가시키기 위해, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 개선시키기 위해, 그 자체로 항종양 효과를 갖도록 하기 위해 및/또는 수용기 (즉, 매치되는 HLA 반수체)와 면역학적으로 적합성이 되도록 하기 위해 유전적으로 변형될 수는 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. APCs는 골수, 말초 혈액, 종양 및 종양주변 조직을 비롯한, 임의의 다양한 생물학적 유체 및 기관으로부터 단리될 수 있고, 자가, 동종이형, 동계 또는 이종 세포일 수 있다. APCs는 전형적으로 주조직적합성(MHC) 좌위로부터의 수용체를 이용하여 짧은 폴리펩티드를 T 세포에 전달한다.
애주번트- 비특이 면역 반응 증진제이다. 적합한 애주번트로는 예를 들면, 콜레라 독소, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 프로인트 완전 애주번트, 프로인트 불완전 애주번트, 퀼 A(Quil A), 및 Al(OH)을 포함한다. 애주번트는 또한 톨-유사 수용체와 같이, 2차 신호 전달 분자를 통해 APC를 활성화시키고, T 세포의 전달을 증진시키는 물질일 수 있다. 톨-유사 수용체의 예로는 더블-스트랜드 RNA, 세균 편모, LPS, CpG DNA, 및 세균 지질펩티드를 인식하는 수용체를 포함한다 (최근에 문헌 [Abreu et al, J Immunol , 174(8), 4453-4460 (2005)]에 리뷰됨).
"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 발생된 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산 중합체 및 비천연적으로 발생된 아미노산 중합체에도 적용된다.
"아미노산"이라는 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 발생된 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것 뿐만 아니라, 이후에 변형된 아미노산, 예컨대, 하이드록시프롤린, y-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카복실기, 아미노기, R 기, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합하는 y 탄소를 갖는 화합물을 지칭한다. 그러한 유사체는 변형된 R 기 (예컨대, 노르류신), 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 학명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상적으로 공지된 3-문자 기호 또는 1-문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 1-문자 코드로 지칭될 수 있다.
"보존적 변형 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열, 둘 모두에 적용된다. 특정한 핵산 서열에 대해, 보존적 변형 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 전술한 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적 변형 변이의 한 종류인 "침묵 변이"이다. 본원의 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 기재된 각각의 서열에 내포되어 있다.
아미노산 서열의 경우, 단일 아미노산 또는 코딩된 서열 내의 적은 퍼센트의 아미노산을 변경시키거나, 부가하거나 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가는 상기와 같은 변경을 통해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된 "보존적 변형 변이체"라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 보존적 변형 변이체는 본 발명의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자 이외의 것이나, 이들을 배제하지 않는다.
하기 8개의 군 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파라긴산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라진(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌 I, 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M).
(예컨대, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).
어구 "~에 선별적으로 (또는 특이적으로) 혼성화한다"는 것은 서열이 복합 혼합물 (예컨대, 전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 중에 존재하는 경우, 분자가 엄격한 혼성화 조건하에 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합하거나, 그와 이중 가닥을 형성하거나, 그와 혼성화하는 것을 지칭한다.
어구 "엄격한 혼성화 조건"이란 그 조건하에서는 프로브가 전형적으로는 핵산의 복합 혼합물 중의 그의 표적 하위 서열에는 혼성화하지만, 다른 서열에는 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 수 있다. 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 지정된 이온 강도, pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점 I보다 약 5 내지 10℃ 더 낮은 것으로 선택된다. Tm은, 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형시에 (표적 서열이 과량으로 존재할 때 Tm에서는 평형시 프로브의 50%가 점유된다) 표적 서열에 혼성화하는 (지정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하의) 온도이다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 pH 7.0 내지 약 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로, 약 0.01 내지 약 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 짧은 프로브 (예컨대, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)의 경우, 온도가 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브 (예컨대, 50개 초과의 뉴클레오티드)의 경우, 온도가 약 60℃ 이상인 조건이다. 엄격한 조건은 또한 예로서, 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가를 통해 달성할 수 있다. 선별적 또는 특이적 혼성화의 경우, 양성 신호는 배경의 2배 이상인 것, 임의로 배경의 10배인 혼성화이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5 X SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5 X SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션과, 65℃에서 0.2 X SSC 및 0.1% SDS를 사용한 세척.
엄격한 조건하에서 서로에게 혼성화하지 않는 핵산은 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면, 이 역시 실질적으로 동일한 것이다. 이는 예를 들면, 핵산 카피가 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 형성될 때에 발생한다. 그러한 경우, 핵산은 전형적으로 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화한다. 예시적인 "중간 정도의 엄격한 혼성환 조건"은 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS 완충액중 37℃에서 혼성화, 및 45℃하의 1X SSC중에서 세척. 양성 혼성화는 배경의 2배 이상이다. 숙련인은 대체 혼성화 및 세척 조건을 사용함으로써 유사한 엄격도 조건을 제공할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
"항체"는 면역글로불린 유전자로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드, 또는 항원에 결합하고 그를 인식하는 그의 단편을 지칭한다. 인식되는 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실런, 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 입실런으로 분류되는데, 결국 이는 각각 면역글로불린 부류인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 사합체를 포함한다. 각 사합체는 2개의 동일한 쌍으로 된 폴리펩티드 쇄로 구성되는데, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa)과 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하고 있는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 정의한다. 상기의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)가 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다.
단백질 또는 펩티드와 관련하여 언급될 때, 항체"에 특이적으로 (또는 선별적으로) 결합" 또는 "~와 특이적으로 (또는 선별적으로) 면역반응성인"이라는 어구는 단백질과 다른 생물의 이질성 군집내 상기 단백질의 존재를 결정하는 것인 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 면역분석법 조건하에서 특정 항체는 배경의 2배 이상으로 특정 단백질에 결합하고, 실질적으로 샘플내 존재하는 기타 단백질에는 유의적인 양으로 결합하지 못한다. 그러한 조건하의 항체의 특이적인 결합은 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 관하여 선별된 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질에 대한 폴리클로날 항체는, 융합 단백질에는 특이적으로 면역반응성이지만, 융합 단백질의 각개 성분들과는 면역반응성이 아닌 그러한 폴리클로날 항체만을 수득하기 위해서 선별될 수 있다. 개개의 항원과 교차 반응하는 항체를 감함으로써 상기와 같은 선별을 달성할 수 있다. 다양한 면역분석 포맷을 사용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선별할 수 있다. 예를 들면, 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선별하는데 통상적으로 고체상 ELISA 면역분석법이 사용된다 (예컨대, 특이적인 면역반응성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 면역분석법 포맷 및 조건에 관하여 기술하고 있는 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)]을 참조한다). 전형적으로 특이적인 또는 선별적 반응은 배경 신호 또는 소음의 2배 이상이 될 것이며, 더욱 전형적으로는 배경의 10 내지 100배 이상이 될 것이다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 서열 또는 dsRNA 또는 그의 부분)을 포함할 수 있거나, 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항원을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여, 코딩된 폴리펩티드의 생물학적 활성은 감소되지 않도록 하는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유하지 않는 dsRNA와 비교하여, 코딩된 dsRNA의 효현제 활성은 감소되지 않도록 하는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 변이체는 바람직하게 천연 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분, 또는 TLR-3 효현제 활성을 갖는 것으로서 dsRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 나타낸다.
2개 이상의 핵산 (예컨대, TLR-3 효현제인 dsRNA) 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여, "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"이라는 용어는 하기의 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하거나, 수동적 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정되는 지정된 영역 또는 비교 윈도우에 대하여 비교하고 최대로 상응하도록 정렬하였을 때, 아미노산 잔기가 동일하거나 특정 비율의 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열, 또는 동일한 (즉, 특정 영역에 대하여 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성) 뉴클레오티드를 지칭한다. 이어서, 그러한 서열은 "실질적으로 동일한" 것으로 언급된다. 이러한 정의는 또한 시험 서열의 컴플리먼트를 지칭하기도 한다. 임의로, 동일성은 적어도 약 10개 내지 약 100개, 약 20개 내지 약 75개, 약 30개 내지 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이를 가진 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교시, 전형적으로 한 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이 기준 서열과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 하위 서열 배위가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수를 사용하거나, 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 기준 서열에 대한 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"는, 2개의 서열들이 최적으로 정렬된 이후, 서열이 인접하는 위치와 동일한 수의 위치로 이루어진 기준 서열과 비교될 수 있는 인접 위치 중 약 10개 내지 약 500개, 약 25개 내지 약 200개, 50개 내지 약 150개의 인접 위치들의 수 중 임의의 하나로 이루어진 세그먼트에 대한 기준을 포함한다. 비교를 위하여 서열을 정렬하는 방법에 관하여는 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예컨대, 국소 상동성 알고리즘(문헌 [Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482 (1981)]), 상동성 정렬 알고리즘(문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)]), 유사성 검색 방법(문헌 [Pearson & Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444, (1988)]), 이들 알고리즘의 컴퓨터 처리 실행(위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지(Wisconsin Genetics Software Package) 중 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동식 정렬법 및 육안 조사 (예컨대, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
유용한 다른 알고리즘의 예로는 PILEUP가 있다. PILEUP는 점진적인 짝맞춤 방식의 정렬을 이용하여 일군의 관련 서열로부터 다수의 서열을 정렬함으로써 서열들의 관련성 및 퍼센트 서열 동일성을 나타낸다. 이 알고리즘은 또한 정렬하는 데 사용되는 클러스터링 관계를 보여주는 계통수 또는 수상도를 구성한다. PILEUP는 문헌 [Feng & Doolittle, J. Mol . Evol. 35:351-360 (1987)]에 기재된 점진적 정렬 방법을 간소화시켜 이용한다. 이용된 방법은 문헌 [Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)]에 기재된 방법과 유사하다. 이 프로그램은 300개까지의 서열을 정렬할 수 있으며, 각 서열의 최대 길이는 뉴클레오티드 또는 아미노산 5,000개이다. 다수의 정렬 방법은 2개의 가장 유사한 서열들을 짝맞춤 방식으로 정렬하여 시작함으로써, 2개의 정렬된 서열의 클러스터를 생성한다. 이어서, 이 클러스터는 그 다음으로 가장 관련성이 높은 서열, 또는 정렬된 서열들의 클러스터와 정렬된다. 서열들의 클러스터 2개는 각 서열 2개의 짝맞춤 방식의 정렬을 간단히 확장시켜 정렬한다. 최종 정렬은 일련의 점진적인 짝맞춤 방식의 정렬에 의해 달성된다. 이 프로그램은 특정 서열 및 서열 비교 영역에 대한 상기 서열의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고, 프로그램의 매개변수를 지정함으로써 구동된다. PILEUP를 이용하는 경우, 디폴트 갭 가중치 (3.00), 디폴트 갭 길이 가중치 (0.10) 및 가중된 말단 갭의 매개변수를 이용하여 기준 서열을 다른 시험 서열과 비교함으로써 퍼센트 서열 동일성 관계를 결정한다. PILEUP는 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예컨대, 버전 7.0 (문헌 [Devereaux et al., Nuc . Acids Res. 12:387-395 (1984)])로부터 얻을 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 또다른 예로는 문헌 ([Altschul et al., Nuc . Acids Res . 25:3389-3402 (1977)] 및 [Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990)])에 각각 기재된 BLSAT 및 BLSAT 2.0 알고리즘이 있다. BLSAT 및 BLSAT 2.0을 본원에 기재된 매개변수로 이용하여, 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 퍼센트 서열 동일성를 결정한다. BLSAT 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공개적으로 입수 가능하다. 이 알고리즘은 먼저 검색을 의문 서열에서 짧은 길이의 워드 W를 확인하여 스코어가 높은 서열 쌍(HSP)을 찾아내는데, 이는 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드와 정렬하는 경우에 매치되거나 일부 (+) 값의 역치 스코어 T를 충족한다. T는 인접 워드 스코어 역치로 지칭된다 (문헌 [Altschul et al., 상기 문헌]). 이들 최초의 인접 워드 히트는 이들을 포함하는 보다 긴 길이의 HSP 검색을 개시하기 위한 입력값(seed)으로 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한도까지 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 확장된다. 누적 스코어는, 뉴클레오티드 서열의 경우, 매개변수 M (매치되는 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 0 초과임) 및 N (매치되지 않은 잔기에 대한 패널티 스코어; 항상 0 미만임)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 스코어 산정 매트릭스를 이용하여 누적 스코어를 계산한다. 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값에서 X의 양으로 감소되는 경우, 누적 스코어가 (-) 스코어를 갖는 하나 이상의 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 내려간 경우, 또는 서열의 한쪽 말단에 도달한 경우에 각 방향에서 워드 히트의 확장이 중단된다. BLAST 알고리즘의 매개변수인 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열의 경우) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3 및 기대값 (E) 10을 이용하고, BLOSUM62 스코어 산정 매트릭스 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 (1989)] 참조)는 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 이용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예컨대, 문헌 [Karlin & Altschul, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성 측정값은, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 가능성을 나타내는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
III . 본 발명의 조성물
본 발명은 키메라 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터 및 TLR3 효현제를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 제1 및 제2 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 제1 및 제2 프로모터는 독립적으로 베타 액틴 프로모터 및 CMV 프로모터로부터 선택된다.
몇몇 실시태양에서, 키메라 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈 (마이너스 E1 및 E3 유전자), 및 IRF-3 및 TLR-3 하류의 기타 신호 전달 분자를 활성화시키는 유전자를 코딩하는 핵산을 포함한다. 재조합 아데노바이러스(rAd)가 Ad의 E1 유전자를 발현하는 세포에서 생산될 수 있도록 키메라 벡터는 상기 세포로 투여될 수 있다. 상기 rAd가 수거될 수 있고, 이는 1회의 감염을 통해 트랜스제닉 조성물을 포유동물의 또다른 세포로 전달함으로써 이종 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
A. 적합한 아데노바이러스 벡터
몇몇 실시태양에서, 아데노바이러스 벡터는 예를 들면, E1/E3 영역이 결실된 Ad5 및 E4 영역이 결실된 Ad5를 비롯한 아데노바이러스 5이다. 다른 적합한 아데노바이러스 벡터로는 균주 2, 경구적으로 시험된 균주 4 및 7, 장내 아데노바이러스 40 및 41, 및 항원을 전달하고 트랜스진 항원에 대한 트랜스진 항원을 유도하는데 충분한 기타 균주 (예컨대, Ad34)를 포함한다 (문헌 ([Lubeck et al, Proc Natl Acad Sci USA, 86(17), 6763-6767 (1989)]; [Shen et al, J Virol , 75(9), 4297-4307 (2001)]; [Bailey et al, Virology, 202(2), 695-706 (1994)])). 몇몇 실시태양에서, 아데노바이러스 벡터는 생, 복제 무능한 아데노바이러스 벡터 (예로서, E1 및 E3 결실된 rAd5), 생 및 약독화된 아데노바이러스 벡터 (예로서, E1B55K 결실 바이러스), 또는 야생형 복제를 하는 생 아데노바이러스 벡터이다.
생체내에서 척추 동물 세포를 형질전환시키는데 사용하고자 하는, 발현 벡터내 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 통상 사용되는 프로모터 및 인핸서는 예컨대, 베타 액틴, 아데노바이러스, 시미안 바이러스(SV40), 및 인간 거대세포바이러스(CMV)로부터 유래된다. 예를 들면, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 트랜스듀서 프로모터, 또는 포유동물 세포에서의 발현에 효과적인 제시된 기타 프로모터의 지시하에 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터가 적합하다. 추가의 바이러스 게놈 프로모터, 제어 및/또는 신호 서열이 사용될 수 있는데, 단, 상기 제어 서열은 선택된 숙주 세포와 적합성이다.
B. 이종 폴리펩티드
적합한 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 예를 들면, 바이러스 항원, 세균 항원, 암 항원, 진균 항원, 또는 기생충 항원으로부터 유래될 수 있다.
바이러스 항원은 예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스 (예컨대, gag (p55 및 p160), pol, env (gp120 및 gp41) (문헌 [Shiver et al. Nature 415(6869):331 (2002)]에 기재); 진뱅크 수탁 번호: EF363127; EF363126; EF363125; EF363124; EF363123; EF363122; EF192592; 및 EF192591에 기재된 HTV 게놈 서열; 진뱅크 수탁 번호: EF396891; EF396890; EF396889; EF396888; EF396887; EF396886; EF396885; EF396884; EF396883; EF396882; EF396881; EF396880; EF396879; EF396878; EF396877; EF396876; EF39687; EF396874; EF396873; 및 EF396872에 기재된 HIV gag 서열; 진뱅크 수탁 번호: EF396810; EF396809; EF396808; EF396807; EF396806; EF396805; EF396804; EF396803; EF396802; EF396801; EF396800; EF396799; EF396798; EF396797; EF396796; EF396795; EF396794; EF396793; EF396792; 및 EF396791에 기재된 HIV pol 서열; 및 진뱅크 수탁 번호: 9: EF367234; EF367233; EF367232; EF367231; EF367230; EF367229; EF367228; EF367227; EF367226; EF367225; EF367224; 및 EF367223에 기재된 HIV env 서열), 인간 유두종 바이러스 (예컨대, 캡시드 단백질 L1 (문헌 [Donnelly et al. J Infect Dis. 173:314 (1996)]에 기재) 및 진뱅크 수탁 번호: EF362755; EF362754; NC_001694; NC_001693; NC_001691; NC_001690; NC_005134; NC_001458; NC_001457; NC_001354; NC_001352; NC_001526; 및 X94164에 기재된 서열), 엡스타인 바 바이러스, 단순 포진바이러스, 인간 포진 바이러스, 리노바이러스, 콕사키바이러스, 엔테로바이러스, A형, B형, C형, 및 E형 간염 바이러스 (예컨대, B형 간염 표면 항원 (문헌 [Lubeck et al, PNAS USA 86:6763 (1989)]에 기재) 및 진뱅크 수탁 번호: AB236481; AB236471; AB206501; AB206489; AB206487; AB221788; AB221777; AB221773; AR933671; AR933670; AB236514; AB236513; AB236512; AB236511; AB236510; AB236509; AB236508; AB236507에 기재된 서열); C형 간염 NS 5 (예컨대, 진뱅크 수탁 번호: X59609; DQ911563; S71627; S70787; S70786; S70341; S62220; S70790; S70789; S70788; 및 AB204642 참조)), 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오바이러스, 천연두 바이러스, 광견병 바이러스, 및 수두-대상포진 바이러스로부터 유래될 수 있다. 인플루엔자 항원으로는 예컨대, 적혈구 응집소(HA), 기질 단백질 1(M1), 및 뉴클레오단백질(NP) (예컨대, 문헌 [Donnelly, et al, Vaccine 15:865 (1997)] 참조), 및 진뱅크 수탁 번호: AB294219; AB294217; AB294215; AB294213; EF102944; EF102943; EF102942; EF102941; EF102940; EF102939; EF102938; EF102937; EF102936; EF102935; EF102934; EF102933; DQ643982; DQ464354; CY019432; CY019424; CY019416; CY019408; CY019400; CY019392; CY019384; CY019376; CY019368; CY019360; CY019352; EF124794; EF110519; EF110518; EF165066; EF165065; EF165064; 및 EF165063에 기재된 인플루엔자 HA 서열; 진뱅크 수탁 번호: AB292791; CY019980; CY019972; CY019964; CY019956; CY019948; CY019940; CY019628; CY019652; CY019644; CY019932; CY019924; CY019916; CY019908; CY019900; CY019892; CY019884; CYO19876; CY019868; CY019860에 기재된 인플루엔자 M1 서열; 및 진뱅크 수탁 번호: AB292790; CY019461; CY019974; CY019966; CY019958; CY019950; CY019942; CY019630; CY019654; CY019646; CY019934; CY019926; CY019918; CY019910; CY019902; CY019894; CY019886; CY019878; CY019870; 및 CY019862에 기재된 인플루엔자 NP 서열을 포함한다.
적합한 바이러스 항원으로는 또한 예컨대, 바이러스 비구조 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 "바이러스 비구조 단백질"이라는 용어는 구조 폴리펩티드를 코딩하지 않는 것으로 바이러스 핵산에 의해 코딩된 단백질, 예로서, 캡시드를 만드는 것 또는 바이러스를 감싸는 단백질을 지칭한다. 비구조 단백질로는 바이러스 핵산 복제 및 바이러스 유전자 발현을 촉진시키는 단백질, 예로서, 베네수엘라 말 뇌염(VEE), EEE, 또는 셈리키 삼림 바이러스로부터의 비구조 단백질 1, 2, 3, 및 4 (각각 NS1, NS2, NS3, 및 NS4)를 포함한다 (문헌 ([Dubensky et al., J Virol, 70(1), 508-519 (1996)]; [Petrakova et al., J Virol 2005 79(12): 7597-608]; 미국 특허 번호 제5,185,440호; 제5,739,026호; 제6,566,093호; 및 제5,814,482호). 적합한 알파바이러스의 여러 대표적인 일례로는 아우라(Aura) (ATCC VR-368), 베바루(Bebaru) 바이러스 (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), 카바소우(Cabassou) (진뱅크 수탁 번호: AF398387, ATCC VR-922), 치쿤구니아(Chikungunya) 바이러스 (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), 동부 말 뇌염 바이러스 (진뱅크 수탁 번호: AY705241, AY705240, ATCC VR-65, ATCC VR-1242), 포트 모건(Fort Morgan) (ATCC VR-924), 게타(Getah) 바이러스 (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), 키질라가크(Kyzylagach) (ATCC VR-927), 미야로(Mayaro) (ATCC VR-66), 미야로 바이러스 (ATCC VR-1277), 미들버그(Middleburg) (ATCC VR-370), 무캄보(Mucambo) 바이러스 (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), 두무(Ndumu) (ATCC VR-371), 픽수나(Pixuna) 바이러스 (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), 로스 리버(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), 셈리키 삼림 (진뱅크 수탁 번호: AJ251359, ATCC VR-67, ATCC VR-1247), 신드비스 바이러스 (진뱅크 수탁 번호: J02363, ATCC VR-68, ATCC VR-1248), 토네이트(Tonate) (ATCC VR-925), 트리니티(Triniti) (ATCC VR-469), 우나(Una) (ATCC VR-374), 베네주엘라 말 뇌염 (ATCC VR-69), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 (진뱅크 수탁 번호: AY986475, AY973944, NC 001449, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), 서부 말 뇌염 (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), 와타로와(Whataroa) (ATCC VR-926), 및 Y-62-33 (ATCC VR-375)을 포함한다.
세균 항원은 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 스트랩토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium diphtheriae), 보렐리아 복도페리(Borrelia burgdorferi), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 보르데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 나이제리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플라즘 종(Mycoplasm sp .), 나이세리아 랜스듀세르스(Neisseria ransducers), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리케치아 티피(Rickettsia typhi), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 및 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) (예컨대, 진뱅크 수탁 번호: U25679; A09803; EF158842; X76391; AF390572에 기재된 콜레라 독소 하위유니트 B; 문헌 [Wu et al, Infection and Immunity Vol . 69(12):7695 (2001)]에 기술되어 있고, 진뱅크 수탁 번호: NC_002505 및 AE004169에 기재된 콜레라 독소-공조절 모상 구조물 (TCP)); 헬리코박터 필로리(진뱅크 수탁 번호: AY848858; AF042737; AF042736; AF042735; AF042734; NC_000921에 기재된 VacA; 진뱅크 수탁 번호: AF043490; AF043489; AF043488; AF043487에 기재된 CagA; 진뱅크 수탁 번호: AF284121; AF284120; AF284119; AF284118; AF284117; AF284116; AB045143; AB045142; AF227081; AF227080; AF227079; AF227078; AF227077; AF227076; AF227075; AF227074에 기재된 NAP; 진뱅크 수탁 번호 NC_000921에 기재된 Hsp 또는 카탈라제; 진뱅크 수탁 번호: AM417610; AM417609; AM417608; AM417607; AM417606; AM417605; AM417604; AM417603; AM417602; AM417601; 및 AM417600에 기재된 우레아제; 진뱅크 수탁 번호: AB214865; AB214864; AB214863; AB214862에 기재된 E. 콜라이(E. coli) 섬모 항원; 진뱅크 수탁 번호: X83966; V00275; X83966; JO1646; V00275; M35581; M17873; M17874; K01995; M61015; M17894; M17101; K00433에 기재된 E. 콜라이 열-민감성 장독소를 비롯한, 진뱅크 수탁 번호: NC_000913; U00096; NC_002655; BA000007; AEO14075에 기재된 E. 콜라이 항원으로부터 유래될 수 있다.
기생충 항원은 예를 들면, 기아디아 람블리아(Giardia lamblia), 레쉬마니아 종(Leishmania sp .), 트리파노조마 종(Trypanosoma sp .), 트리코모나스 종(Trichomonas sp .), 플라스모디움 종(Plasmodium sp .) (예컨대, P. 팔시파럼(P. faciparum) 표면 단백질 항원, 예로서, 진뱅크 수탁 번호: XM_001347551; X07802; AF193769; AF179423; AF154117; 및 AF030628에 기재된 pfs25 서열, 진뱅크 수탁 번호: L25843에 기재된 pfs28 서열, 진뱅크 수탁 번호: EF158081; EF158079; EF158078; EF158076; EF158075; 및 EF158085에 기재된 pfs45 서열, pfs84, 진뱅크 수탁 번호: AF356146; AF356145; AF356144; AF356143; AF356142; AF356141; AF356140; AF356139; AF356138; AF356137; AF356136; AF356135; AF356134; AF356133; AF356132; AF356131; AF35613O; AF356129; AF356128; AF356127에 기재된 pfs 48/45 서열, 진뱅크 수탁 번호: NC_000910; XM_001349564; AE001393; L22219; L08135; 및 AF269242에 기재된 pfs 230 서열, P. 비박스(P. vivax) 항원, 예로서, 진뱅크 수탁 번호: DQ641509; DQ641508; DQ641507; AY639972; AY639971; AY639970; AY639969; AY639968; AY639967; AY639966; 및 AY639965에 기재된 Pvs25 서열; 및 진뱅크 수탁 번호: AB033364; AB033363; AB033362; AB033361; AB033360; AB033359; AB033358; AB033357; AB033356; B033355; AB033354; AB033353; AB033352; AB033351; AB033350; AB033349; AB033348; AB033347; AB033346; 및 AB033345에 기재된 Pvs28 서열), 시스토소마 종(Schistosoma sp .), 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (예컨대, 진뱅크 수탁 번호: AX253506; AX253504; AX253502; 및 AX211309에 기재된 Ag85 서열; MPT64, ESAT-6, CFP1O, R8307, MTB-32 MTB-39, CSP, LSA-1, LSA-3, EXP1, SSP-2, SALSA, STARP, GLURP, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, MSP-8, MSP-9, AMA-1, 1형 통합 막 단백질, RESA, EBA-175, 및 진뱅크 수탁 번호: BX842572; BX842573; BX842574; BX842575; BX842576; BX842577; BX842578; BX842579; BX842580; BX842581; BX842582;BX842583; BX842584 및 NC_000962에 기재된 DBA 서열, 진뱅크 수탁 번호: AY299175; AY299174; AY299144; AF547886; 및 AF547885에 기재된 HSP65 서열)로부터 유래될 수 있다.
암 항원으로는 예를 들면, 결장암, 위암, 췌장암, 폐암, 난소암, 전립선암, 유방암, 피부암 (예컨대, 흑색종), 백혈병, 림프종, 또는 골수종에서 발현된 항원을 포함하고, 대표적인 암 항원으로는 예를 들면, HPV L1, HPV L2, HPV E1, HPV E2, 태반 알칼리성 인산효소, AFP, BRCA1, Her2/neu, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CEA, Hcg, 유로키나제형 플라스미노겐 활성제(Upa), 플라스미노겐 활성제 저해제를 포함한다.
진균 항원은 예를 들면, 티네아 페디스(Tinea pedis), 티네아 코르포루스(Tinea corporus), 티네아 크루리스(Tinea cruris), 티네아 운구이움(Tinea unguium), 클라도스포리움 카리오니이(Cladosporium carionii), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 칸디다 종(Candida sp .), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 및 뉴모사이스티스 카리니이(Pneumocystis carinii)로부터 유래될 수 있다.
면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 전형적으로 재조합 DNA 방법에 의해 생산된다 (예컨대, 문헌 [Ausubel, et al. ed. (2001) Current Protocols in Molecular Biology] 참조). 예를 들면, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 cDNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오티드 링커로부터, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있거나, 적절한 프라이머를 사용하여 cDNA로부터 증폭되어 재조합 발현 벡터 (즉, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터)에 삽입될 수 있고 재조합 전사 단위로 발현할 수 있는 합성 유전자를 제공할 수 있다. 일단 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생산되면, 이는 생체내 또는 생체외 발현에 적합한 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
재조합 발현-벡터는 포유동물 또는 바이러스 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. 그러한 조절 요소로는 전사 프로모터, 전사를 제어하는 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 복제 기점 및 형질전환체의 인식을 촉진시키는 선별가능한 마커가 추가로 혼입될 수 있다. 재조합 발현 벡터에 사용되는 유전자는 1 초과의 바이러스로 분할되어 상기 유전자 산물이 2개의 상이한 벡터 상에 존재할 수 있도록 할 수 있고, 공-형질도입을 위해 벡터를 사용함으로써 트랜스로 모든 유전자 산물을 제공한다. 유전자 산물을 분할하는 이유로서, 예를 들면, 삽입을 위한 크기 제한, 또는 바이러스 생산 세포주에 대한 조합된 유전자 산물의 독성과 같은 이유가 존재할 수 있다.
C. TLR 효현제
본 발명의 방법에 따라, TLR 효현제는 이종 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해서 사용된다. 몇몇 실시태양에서, TLR-3 효현제가 사용된다. 다른 실시태양에서, TLR 7/8 효현제가 사용된다. 본원에 기술된 TLR 효현제는 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 발현 벡터와 함께 동시에 전달될 수 있거나, 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 발현 벡터와는 별개로 (즉, 시간상 또는 공간상) 전달될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 비-비경구적인 경로 (예컨대, 경구적으로, 비내로, 또는 점막으로)를 통해 투여될 수 있는 반면, TLR-효현제는 비경구적인 경로 (예컨대, 점막내, 복강내, 또는 피하)에 의해 전달된다.
1. TLR -3 효현제
본 발명의 바람직한 실시태양에서, TLR-3 효현제는 관심의 대상이 되는 항원의 면역적 인식을 자극시키는데 사용된다. TLR-3 효현제는 예를 들면, 짧은 헤어핀 RNA, 바이러스로부터 유래된 RNA, 더블-스트랜드 또는 짧은 헤어핀 RNA를 형성할 수 있는 짧은 RNA 세그먼트, 및 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, TLR-3 효현제는 바이러스로부터 유래된 dsRNA, 예를 들면, 신드비스 바이러스로부터 유래된 dsRNA 또는 dsRNA 바이러스 중간체이다 (문헌 [Alexopoulou et al, Nature 413:732-8 (2001)]). 몇몇 실시태양에서, TLR-3 효현제는 짧은 헤어핀 RNA이다. 짧은 헤어핀 RNA 서열은 전형적으로 링커 서열에 의해 연결된 2개의 상보성인 서열을 포함한다. 특정의 링커 서열이 본 발명의 중요한 측면은 아니다. dsRNA를 형성하는 2개의 상보성인 서열의 결합을 간섭하지 않는 한, 임의의 적절한 링커 서열이 사용될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 짧은 헤어핀 RNA는 서열 번호: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 또는 12에 기재된 서열, 서열 번호: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 또는 12에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 서열, 또는 서열 번호: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 또는 12에 기재된 서열의 변이체를 포함한다. 특정 실시태양에서, TLR-3 효현제인 dsRNA가 특정 폴리펩티드를 코딩하는 것은 아니지만, 시험관내 또는 생체내에서 반응자 세포 (예컨대, 가지 세포, 말초 혈액 단핵구 세포, 또는 대식세포)와 접촉할 경우, 전-염증성 사이토카인 (예컨대 IL-6, IL-8, TNF-알파, IFN-알파, IFN-베타)을 생산한다. 몇몇의 경우, TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 (예컨대, 발현되는 dsRNA) 및 이종 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터는 동일한 제제로 투여된다. 다른 경우에서는, TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 및 이종 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터는 상이한 제제로 투여된다. TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 및 이종 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터가 상이한 제제로 투여되는 경우, 그의 투여는 동시에 이루어질 수 있거나, 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산을 먼저 투여한 후, 이어서, 키메라 아데노바이러스 벡터를 투여할 수 있다 (예컨대,1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 또는 24시간 후에, 2, 4, 6, 8, 또는 10일 후에). 별법으로, 아데노바이러스 벡터를 먼저 투여한 후, 이어서, TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산을 투여할 수 있다 (예컨대, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 또는 24시간 후에, 2, 4, 6, 8, 또는 10일 후에). 몇몇 실시태양에서, TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 및 이종 항원을 코딩하는 핵산은 동일한 프로모터의 제어하에 있다. 다른 실시태양에서, TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 및 이종 항원을 코딩하는 핵산은 상이한 프로모터의 제어하에 있다.
수개의 화학적으로 합성된 더블-스트랜드 RNA에 대한 유사체가 상업적으로 이용가능하다. 이는 폴리이노신산-폴리시티딜산 (폴리 I:C), 폴리아세닐산:폴리우리딜산 (폴리 A:U), 및 폴리 I:폴리 C를 포함한다. TLR-3에 대한 항체 (또는 그에 대한 항체와 가교결합하는 항체) 또한 IFN-베타 또는 전-염증성 사이토카인을 생산할 수 있다 (문헌 [Matsumoto et al, Biochem . Biophys . Res . Commun. 24:1364 (2002)], [de Bouteiller et al, J Biol . Chem. 18:38133-45 (2005)]). 상업적으로 이용가능한, 임의 서열의 siRNA 세그먼트 또한 공급처, 예로서, 인비트로겐(Invitrogen)을 통해 구입할 수 있다.
2. TLR7 /8 효현제
몇몇 실시태양에서, TLR 효현제는 TLR7/8 효현제이다. TLR7/8 리간드는 전형적으로 싱글-스트랜드의, 바이러스로부터 유래된 RNA이다. 수용체는 세포내 구획, 예로서, 엔도좀에서 발현되기 때문에, RNA의 짧은 세그먼트는 정확한 구획에 도달하여야 하는 바, 그들 모두가 TLR7/8 신호 전달 캐스캐이드를 일으키는 것은 아닐 것이다. 외부에서 첨가되어 상기 신호 전달 캐스캐이드를 일으킨다고 제시된 몇몇 리간드는 폴리우리딜산, 레시퀴모드, 및 이미퀴모드이다 (문헌 [Westwood, et al, Vaccine 24:1736-1745(2006)].
IV . 약제학적 조성물
본원에 기술된 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 생물학적으로 활성이거나 불활성인 기타 화합물들을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,372,945호 및 제4,474,757호에 기재되어 있는 바와 같이 다른 거대분자에 접합될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 약제학적 조성물은 일반적으로 예방용 및 치료용의 목적으로 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 투여된 키메라 아데노바이러스 벡터가 원하는 위치에 도달할 수 있도록 위 분해에 대해 보호하는 방법으로 구성될 수 있다. 경구 환경을 위해서는 상기들 중, 유드라짓(Eudragit) 및 타임클락(TimeClock) 방출 시스템 뿐만 아니라, 아데노바이러스용으로 특별히 디자인된 기타 방법을 비롯한 수개의 방법이 이용될 수 있다 (문헌 ([Lubeck et al., Proc Natl Acad Sci . USA, 86(17), 6763-6767 (1989)]; [Chourasia and Jain, J Pharm Pharm Sci, 6(1), 33-66 (2003)])). 경구 전달을 위한 DNA 및 약물의 미세캡슐화에 대해서는 앞서 수개의 방법이 기술된 바 있다 (예컨대, 미국 특허 공개 번호 제2004043952호 참조). 몇몇 실시태양에서, 키메라 아데노바이러스 벡터를 보다 아래쪽에 있는 소장으로 전달하는데 유드라짓 시스템이 사용될 것이다. 그러나, 소장의 다른 위치로 전달하는 것 또한 수행하여야 한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터는 당업계의 통상의 기술을 갖는 숙련인에게 공지되어 있는 임의 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 예로서, 문헌 [Rolland (1998) Crit . Rev . Therap . Drug Carrier Systems 15:143-198]과 그 안에서 인용된 참고 문헌에 기재되어 있는 것과 같은 다수의 유전자 전달 기법이 당업계에 잘 알려져 있다.
면역원성 조성물이 이종 폴리펩티드 (예컨대, 면역원성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 그러한 염은 유기 염기 (예컨대, 1차, 2차, 및 3차 아민 및 염기성 아미노산의 염), 및 무기 염기 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 티륨, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)를 비롯한, 약제학적으로 허용가능한 비-독성 염기로부터 제조될 수 있다. 염에 관한 몇몇의 특정 일례로는 인산염 완충처리된 염수 및 주사용 염수를 포함한다.
당업계의 통상의 기술을 갖는 숙련인에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 적합한 담체로 예를 들면, 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스, 완충액, 고체 담체, 예로서, 만닛톨, 락토스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 탤컴, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 및 탄산마그네슘, 또는 생분해성 미립구 (예컨대, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 포함한다. 적합한 생분해성 미립구는 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,897,268호; 제5,075,109호; 제5,928,647호; 제5,811,128호; 제5,820,883호에 개시되어 있다. 면역원성 폴리펩티드 및/또는 담체 바이러스가 생분해성 미립구 내로 캡슐화될 수 있거나, 미립구 표면과 결합될 수 있다.
그러한 조성물은 또한 완충액 (예컨대, 중성 완충처리된 염수 또는 인산염 완충처리된 염수), 당질 (예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스, 또는 덱스트란), 만닛톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예로서, 글리신, 항산화제, 정균제, 킬레이트제, 예로서, EDTA 또는 글루타티온, 애주번트 (예컨대, 수산화알루미늄), 제제가 수혜자의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약하게 고장성이 되도록 하는 용질, 현탁화제, 농후제, 및/또는 방부제를 포함할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화될 수 있다. 화합물은 또한 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 리포좀 내로 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 조성물은 추가로 애주번트를 포함한다. 적합한 애주번트로는 예컨대, WO 04/020592, 문헌 ([Anderson and Crowle, Infect . Immun. 31(1):413-418 (1981)], [Roterman et al, J. Physiol . Pharmacol , 44(3):213-32 (1993)], [Arora and Crowle, J. Reticuloendothel. 24(3):271-86 (1978)], 및 [Crowle and May, Infect . Immun. 38(3):932-7 (1982)])에 기재되어 있는 바와 같이 예를 들면, 지질 및 비-지질 화합물, 콜레라 독소(CT), CT 하위유니트 B, CT 유도체 CTK63, E. 콜라이 열-민감성 장독소(LT), LT 유도체 LTK63, Al(OH)3, 및 다이온성 유기산을 포함한다. 적합한 다이온성 유기산으로는 예를 들면, 6,6'-[3,3'-데미틸[1,1'-비페닐]-4,4'-디일]비스(아조)비스[4-아미노-5-하이드록시-1,3-나프탈렌-디설폰산] (에반스 블루(Evans Blue)) 및 3,3'-[1,1'비페닐]-4,4'-디일비스(아조)비스[4-아미노-1-나프탈렌설폰산] (콩고 레드(Congo Red))을 포함한다. 임의의 유전자 백신접종 방법에 대하여 다이온성 유기산이 임의 유형의 투여법과 함께 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
기타 적합한 애주번트로는 국소용 면역조절제, 예로서, 이미다조퀴놀린 계열의 구성원, 예로서, 이미퀴모드 및 레시퀴모드 (예컨대, 문헌 [Hengge et al, Lancet Infect . Dis. 1(3):189-98 (2001)]을 참조)를 포함한다. 발현된 TLR-3 효현제 (예컨대, dsRNA) 및 TLR-7 효현제 (예컨대, ssRNA) 또한 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
추가의 적합한 애주번트, 예를 들면, 추가의 백반-기재 애주번트 (예컨대, 알하이드로겔(Alhydrogel), 리하이드로겔(Rehydragel), 인산알루미늄, 알감물린(Algammulin)); 오일 기재 애주번트 (프로인트 불완전 애주번트 및 완전 애주번트 (미시간주 디트로이트에 소재하는 디프코 라보라토리즈(Difco Laboratories)), 스페콜(Specol), RIBI, 티터맥스(TiterMax), 몬타니드(Montanide) ISA50 또는 세픽 몬타나이드 ISA(Seppic MONTANIDE ISA) 720); 비이온성 블럭 공중합체-기재 애주번트, 사이토카인 (예컨대, GM-CSF 또는 Flat3-리간드); 머크(애주번트) 65 (뉴저지주 로웨이 머크 앤드 컴퍼니 인크.(Merck and Company, Inc.)); AS-2 (펜실베이니아주 필라델피아 스미스클라인 비참(SmithKline Beecham)); 칼슘염, 철염 또는 아연염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온 또는 음이온으로 유도화된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 미립구; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A가 상업적으로 이용가능하다. 사이토카인, 예로서, GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7, 또는-12 또한 적합한 애주번트이다. 헤모시아닌 (예컨대, 키홀 림펫 헤모시아닌) 및 헤모에리트린 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 다당류 애주번트, 예로서, 키틴, 키토산, 및 탈아세틸화된 키틴 또한 애주번트로서 적합하다. 기타 적합한 애주번트로는 무라밀 디펩티드 (MDP, N 아세틸무라밀 L 알라닐 D 이소글루타민) 세균 펩티도글리칸 및 그의 유도체 (예컨대, 트레오닐-MDP, 및 MTPPE)를 포함한다. 트레할로스 디미콜레이트를 포함하거나 포함하지 않는 BCG 및 BCG 세포벽 골격(CWS) 또한 본 발명에서 애주번트로서 사용될 수 있다. 트레할로스 디미콜레이트 그 자체가 사용될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 제4,579,945호 참조). 해독된 내독소 또한 단독으로 또는 기타 애주번트와 함께 애주번트로서 유용하다 (예컨대, 미국 특허 번호 제4,866,034호; 제4,435,386호; 제4,505,899호; 제4,436,727호; 제4,436,728호; 제4,505,900호; 및 제4,520,019호 참조). 사포닌 QS21, QS17, QS7 또한 애주번트로서 유용하다 (예컨대, 미국 특허 번호 제5,057,540호; EP 0362 279; WO 96/33739; 및 WO 96/11711 참조). 기타 적합한 애주번트는 몬타나이드 ISA 720(프랑스에 소재하는 세픽), SAF (미국 캘리포니아주에 소재하는 키론(Chiron)), ISCOMS (CSL), MF-59 (키론), SBAS 시리즈의 애주번트 (예컨대, SBAS-2, SBAS-4 또는 SBAS-6 또는 그의 변이체, 벨기에 릭센사르트에 소재하는 스미스클라인 비참으로부터 이용가능), 데톡스(Detox) (몬태나주 해밀톤에 소재하는 코릭사(Corixa)), 및 RC-529 (몬태나주 해밀톤에 소재하는 코릭사)를 포함한다.
또한, 슈퍼항원이 본 발명에서 애주번트로서 사용되는 것에 관해 주시된다. 슈퍼항원은 스타필로코커스 엑도단백질, S. 아우레우스(S. aureus) 및 S. 에피더미스(S. epidermis)로부터의 α, β, γ 및 Δ 장독소, 및 α, β, γ 및 Δ E. 콜라이 외독소를 포함한다. 보편적인 스타필로코커스 장독소는 스타필로코커스 장독소 A(SEA) 및 스타필로코커스 장독소 B(SEB)로서 공지되어 있고, 장독소 E(SEE)까지 (문헌 [Rott et al., 1992])에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스 B(SEB), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 장독소 (문헌 [Bowness et al., 1992]), S. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 세포질막-결합 단백질(CAP) (문헌 [Sato et al, 1994]) 및 S. 아우레우스로부터의 독 쇼크 증후군 유발독소 1(TSST 1) (문헌 [Schwab et al., 1993])이 추가로 유용한 슈퍼항원이다.
본원에서 제공하는 약제학적 조성물 내에서 애주번트 조성물은 예컨대, 두드러지게 Th1형 또는 Th2형의 면역 반응을 유도하도록 디자인될 수 있다. 고수준의 Th1형 사이토카인 (예컨대, IFN-감마, TNF-알파, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응의 유도를 촉진시키는 경향이 있다. 대조적으로, 고수준의 Th2형 사이토카인 (예컨대, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 촉진시키는 경향이 있다. 본원에서 제공된 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 경구를 통한 전달 이후에, Th1형 및 Th2형 반응을 유도하는 면역 반응이 전형적으로 유도될 것이다.
본원에 기술된 조성물은 지효성 방출 제제 (즉, 예로서, 투여 이후에 서서히 방출되도록 하는 캡슐 또는 스폰지와 같은 제제)의 부분으로 투여될 수 있다. 그러한 제제는 일반적으로 잘 알려져 있는 기술 (예컨대, 문헌 [Coombes et al., (1996) Vaccine 14:1429-1438])을 사용하여 제조될 수 있다. 지효성 방출 제제는 담체 매트릭스에 분산되어 있고/거나, 속도 조절 막에 의해 둘러싸진 저장소 내에 함유되어 있는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 함유할 수 있다.
그러한 제제 내에서 사용될 수 있는 담체는 생체적합성이고, 또한 생체분해성일 수 있으며; 바람직하게 제제는 상대적으로 일정한 수준으로 활성 성분을 방출한다. 그러한 담체로는 폴리(락티드-공-글리콜리드) 미세입자 뿐만 아니라, 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스 및 덱스트란을 포함한다. 기타 지연-방출형 담체로는 비-지질 친수성 코어 (예컨대, 가교결합된 다당류 또는 올리고당)를 포함하는 초분자 생체 벡터, 및 임의로 양쪽 친매성 화합물을 포함하는 외층을 포함한다 (예컨대, WO 94/20078; WO 94/23701; 및 WO 96/06638 참조). 지효성 방출 제제 내에 함유되어 있는 활성 화합물의 양은 주입 위치, 방출 속도 및 예상되는 방출 지속 기간, 및 치료하거나 예방하고자 하는 증상의 성질에 따라 달라진다.
약제학적 조성물은 1회분-투여량 또는 다회분-투여량 용기, 예로서, 실링된 앰플 또는 바이알로 제공될 수 있다. 그러한 용기는 사용시까지 제제의 무균성을 보존하기 위해 밀폐되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 제제는 오일성 또는 수성 비히클내 현탁제, 액제 또는 유제로서 저장될 수 있다. 별법으로, 약제학적 조성물은 동결-건조 조건에서 저장될 수 있는데, 이는 사용하기 직전에 멸균 액상 담체가 첨가되어야 하는 것만을 필요로 한다.
V. 본 발명의 치료학적 용도
본 발명의 하나의 측면은 질병, 예로서, 바이러스 감염, 세균 감염, 기생충 감염, 진균 감염, 또는 암을 앓는 대상자 또는 환자로부터 항원 특이성 면역 반응 유도하기 위해 본원에 기술된 면역원성 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "대상자" 또는 "환자"는 임의의 온혈동물, 예를 들면, 설치류, 고양이, 개, 또는 영장류, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 면역원성 조성물은 질병의 임의 단계에서, 즉, 전-암, 암, 또는 전이성 단계에서 치료하기 위해 사용될 수 있거나, 질병을 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 조성물은 바이러스 질병, 예로서, HIV 또는 간염 치료를 위해서 사용될 수 있거나, 암 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 그러한 방법에서 약제학적 조성물은 전형적으로 환자에게 투여된다. 환자는 질병 또는 질환 (예컨대, 바이러스 감염, 세균 감염, 또는 암)에 걸렸거나, 걸리지 않은 상태일 수 있다. 따라서, 상기의 약제학적 조성물은 질병 또는 질환 (예컨대, 바이러스 감염, 세균 감염, 또는 암)의 발병을 예방하기 위해 또는 질병 또는 질환 (예컨대, 바이러스 감염, 세균 감염, 또는 암)에 걸린 환자를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 질병 또는 질환은 당업계에서 일반적으로 승인받은 기준을 사용함으로써 진단할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 감염은 환자로부터 유래된 샘플내 바이러스 역가의 측정을 통해 진단할 수 있고, 세균 감염은 환자로부터 유래된 샘플내 세균을 검출함으로써 진단할 수 있고, 암은 악성 종양의 존재를 검출함으로써 진단할 수 있다. 약제학적 조성물은 원발성 종양 절제 및/또는 치료, 예로서, 방사선요법 또는 통상의 화학요법용 약물의 투여 이전 또는 이전에 투여될 수 있다.
면역요법은 전형적으로, 치료법이 예컨대, 종양, 또는 세균이나 바이러스에 감염된 세포에 대하여 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극과, 면역 반응-변형제 (본원에서 제공된 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물)의 투여에 의존하는 것인 활성 면역요법이다.
본원에 기술된 예방학적 또는 치료학적 조성물의 투여 빈도 뿐만 아니라, 투여량은 개체별로 다를 것이며, 표준 기법을 사용하여 용이하게 확립될 수 있다. 대개는, 1회 내지 10회분의 투여량이 52주간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 전형적으로, 3회분의 투여량이 1개월 간격으로 투여되고, 더욱 전형적으로는, 2-3회분의 투여량이 매 2-3개월마다 투여된다. 특정 요법의 경우 상기 간격은 1년에 1회인 것에 더 가까울 수 있다. 그 이후 추가 백신접종이 주기적으로 이루어질 수 있다. 개별 환자 및 특정 질병 및 질환에 대하여 대체 프로토콜이 적절할 수 있다. 적합한 투여량은 상기 기술된 바와 같이 투여되었을 때, 예컨대, 항-종양, 항-바이러스, 또는 항세균 면역 반응을 촉진시킬 수 있고, 기준 (즉, 미처리) 수준보다 10-50% 이상 높은 화합물의 양이다. 그러한 반응은 환자에서 항-종양 항체를 측정함으로써 모니터할 수 있거나, 예컨대, 환자의 종양 세포, 환자의 바이러스에 감염된 세포, 또는 환자의 세균에 감염된 세포를 시험관내에서 사멸시킬 수 있는 세포용해 T 세포의 백신에 의존하는 생성에 의해 모니터할 수 있다. 그러한 백신은 또한 백신접종받지 않은 환자와 비교하여 백신접종 받은 환자에서 임상 결과를 개선시키는 (예컨대, 보다 잦은 경감, 완전하거나 부분적인, 또는 장기간의 무병 생존) 면역 반응을 일으킬 수 있어야 한다. 전형적으로, 바이러스 역가량은 동물 1마리당 1.0x104 pfu 내지 1마리당 1.0x1015 pfu일 것이다. 적합한 투여량의 크기는 환자의 크기에 따라 달라질 것이지만, 전형적으로 약 0.01 ml 내지 약 10 ml, 더욱 전형적으로 약 0.025 내지 약 7.5 ml, 가장 전형적으로 약 0.05 내지 약 5 ml 범위가 될 것이다. 투여량 크기는 특정 환자, 또는 치료하고자 하는 특정 질병 또는 질환에 기초하여 조정될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 경구 투여의 경우, 키메라 아데노바이러스 벡터는 편의상 환제로 제형화될 수 있다.
일반적으로, 적절한 투약 및 치료 요법이 치료학적 및/또는 예방학적 이익을 제공하는데 충분한 양으로 활성 화합물(들)을 제공한다. 그러한 반응은 치료받지 않은 환자와 비교하여 치료받은 환자에서 개선된 임상 결과 (예컨대, 보다 잦은 경감, 완전하거나 부분적인, 또는 장기간의 무병 생존)를 확립시킴으로써 모니터될 수 있다. 그러한 면역 반응은 일반적으로 치료 이전 및 이후에 환자로부터 수득한 샘플을 사용하여 실시될 수 있는 것으로, 상기 기술된 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 분석법을 사용함으로써 평가될 수 있다.
예를 들면, 면역원성 폴리펩티드와, 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 체액내 항체 사이에 형성된 면역복합체 검출을 사용하여 특정 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 요법의 면역원성 폴리펩티드가 관련된 질병 또는 질환에 대한 효능을 모니터할 수 있다. 요법 개시 이전 및 그 이후에 개체로부터 채취한 체액 샘플을 상기 기술된 방법론에 의해 면역복합체에 대하여 분석할 수 있다. 간략하면, 두개의 샘플 모두에서 검출된 면역복합체의 갯수를 비교한다. 제1 샘플 (요법 이전)과 비교하여 제2 샘플 (요법 개시 이후)내 면역복합체의 갯수의 실질적인 변화가 요법이 성공적이라는 것을 반영한다.
A. 본 발명의 조성물의 투여
본 발명의 방법에 따라, 키메라 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 임의의 비-비경구적 경로 (예컨대, 경구적으로, 비내로, 또는 예를 들면, 질, 폐, 타액선, 비강, 소장, 결장, 직장, 편도, 또는 페이어반을 통한 점막으로)에 의해 투여된다. 조성물은 단독으로 투여되거나, 상기 기술된 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 애주번트는 핵산 서열 (예컨대, IL-2, GM-CSF, IL-12, 또는 세균 편모를 코딩하는 핵산)에 의해 코딩된다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 애주번트는 조성물과 동시에 투여된다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 애주번트는 조성물 이후에, 예컨대, 조성물 투여 후, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60, 또는 72시간이 경과한 이후에 투여된다.
B. 관심의 대상이 되는 항원에 대한 면역 반응의 검출
당업계에 공지된 임의의 수단을 사용함여, 예를 들면, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적인 활성화를 검출하거나, 특이적으로 폴리펩티드에 결합하는 항체의 존재를 검출함으로써 이종 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 검출할 수 있다.
점막, 체액성, 또는 세포-매개성 면역 반응과 관련된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적인 활성화는 다양한 방법으로 검출될 수 있다. 특이적인 T 세포 활성화를 검출하는 방법으로는 T 세포 증식, 사이토카인 (예컨대, 림포카인) 생산, 또는 세포용해 활성의 생성 (즉, 면역원성 폴리펩티드에 대한 특이적인 세포용해 T세포의 생성)을 검출하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적인 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 T 세포 증식을 검출하는 것이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적인 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 51Cr 방출 분석법을 사용하여 세포용해 활성의 생성을 검출하는 것이다 (예컨대, 문헌 ([Brossart and Bevan, Blood 90(4): 1594-1599 (1997)] 및 [Lenz et al, J. Exp. Med . 192(8):1135-1142 (2000)]) 참조).
T 세포 증식을 검출하는 것은 다양한 공지 기법에 의해 달성할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성 속도를 측정함으로써 검출될 수 있다. 자극을 받아 증식하는 T 세포는 증가된 DNA 합성 속도를 나타낸다. DNA 합성 속도를 측정하는 전형적인 방법은 예를 들면, 새로 합성되는 DNA 내로 혼입되는 뉴클레오시드 전구체인, 삼중수소로 표지된 티미딘과 T 세포의 배양물을 펄스-표지함에 의한 것이다. 혼입된 삼중수소로 표지된 티미딘의 양은 액체 섬광 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다. T 세포 증식을 검출하는 기타 방법으로는 인터루킨-2 (IL-2) 생산, Ca2 + 유입량, 또는 염료 흡수량, 예로서, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움의 증가를 측정하는 것을 포함한다. 별법으로, 림포카인 (예컨대, 인터페론-감마)의 합성을 측정할 수 있거나, 면역원성 폴리펩티드에 반응할 수 있는 T 세포의 상대적인 갯수를 측량할 수 있다.
점막 항체 반응을 비롯한, 항체 면역 반응 (체액성 면역 반응 또는 B 세포 반응으로도 공지되어 있음)은 당업계에 공지된 면역분석법을 사용함으로써 검출될 수 있다 (문헌 ([Tucker et al, Mol Therapy , 8, 392-399 (2003)]; [Tucker et al, Vaccine, 22, 2500-2504 (2004)])). 적합한 면역분석법은 데이빗(David) 등 (미국 특허 번호 제4,376,110호)의 이중 모노클로날 항체 샌드위치 면역분석법 기법; 모노클로날-폴리클로날 항체 샌드위치 분석법 (문헌 [Wide et al, in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)]); 고든(Gordon) 등 (미국 특허 번호 제4,452,901호)의 "웨스턴 블롯"; 표시된 리간드의 면역침전법 (문헌 [Brown et al. (1980) J. Biol . Chem. 255:4980-4983]); 예를 들면, 문헌 [Raines et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:5154-5160]에 기재된 효소-결합 면역흡착법 (ELISA); 플루오로크롬 사용을 포함하는 면역세포화학적 기법 (문헌 [Brooks et al. (1980) Clin . Exp . Immunol. 39:477]); 및 활성 중화 (문헌 [Bowen-Pope et al. (1984) Proc . Natl . Acad . Sd . USA 81 :2396-2400])를 포함한다. 상기 기술된 면역분석법 이외에도, 미국 특허 번호 제3,817,827호; 제3,850,752호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 및 제4,098,876호에 기재된 것을 비롯한, 다수의 기타 면역분석법이 이용가능하다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 키메라 아데노바이러스 벡터( DS1 )의 작제
TLR-3 효현제가 관심의 대상이 되는 발현된 항원에 대한 적응 면역 반응을 개선시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해서 관심의 대상이 되는 수개의 상이한 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 수개의 상이한 키메라 아데노바이러스 벡터를 작제하였다. 본 실시예에서, gp120을 코딩하는 핵산 (NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program))을 CMV 프로모터의 제어하에 셔틀 벡터 (pShuttle, 큐바이오겐(Qbiogene))중 개시 코돈 바로 앞쪽 상류에 작은 인트론과 함께 배치하였다. bGH로부터의 폴리 A 테일은 gp120을 코딩하는 핵산의 하류에 배치하였다. 벡터 서열을 서열 번호: 1로 기재한다. 벡터 pAd (큐바이오겐)와의 상동성 재조합을 실시하여 gp120을 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 Ad (E1/E3 결실)를 생산할 수 있는 벡터를 생성하였다. 신규한 pAd CMV-gp120 발현 작제물을 293 세포내로 형질감염시켜 DS1을 생성하였다. 역가는 표준 방법에 의해 측정하였다.
실시예 2: DS1 (벡터 + TLR -3 효현제 )이 항원 특이적인 면역 반응을 유도함에 있어 표준 rAd5보다 우수하다
TLR-3 효현제를 첨가하는 것이 적응 면역 반응을 개선시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위하여 10x107 PFU의 rAd-CMV-gp120 + 5 ug/ml 폴리 I:C (DS1), 또는 rAd-CMV-gp120 단독 (rAd5)을 0주째 및 3주째에 경구 위관 영양법에 의해 동물에게 투여하였다. 두 벡터 모두 CMV 프로모터의 제어하에 HIV gp120을 발현하고, 재조합 E1/E3 결실된 5형 아데노바이러스를 사용한다. gp120에 대한 항체 역가는 문헌 [Tucker, et al., Mol Ther 8:392 (2004)]에 기재되어 있는 바와 같이 항-gp120 IgG ELISA에 의해서 최초 투여 후 3주 및 6주째에 혈장에서 측정하였다. 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, DS1은 최초 투여 후 3주 및 6주째, 둘 모두에서 단백질 gp120에 대한 항체 반응을 유도함에 있어 rAd5보다 현저히 우수하게 실시하였다. 특히, 6주째에 gp120에 대한 평균 항체 역가는 rAd5 군보다 DS1 군의 경우 100배 우수하였다. 또한, DS1 군의 경우, 평균 역가가 3주째 내지 6주째 사이에 20배 초과로 증가한 반면, rAd5 군은 평균 항체 역가가 단지 약간 증가하였다는 점에서 DS1 군은 4주째의 재투여에 의해 증폭된 것으로 보인다. 본 결과가, TLR-3 효현제를 첨가하는 것이 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터의 경구 투여 이후 관심의 대상이 되는 항원에 대한 Ad5 매개 항체 반응을 현저하게 개선시킬 수 있다는 것을 입증한다. 본 분석법의 양성 대조군인, gp120 + 프로인트 완전 애주번트를 피하 주사 맞은 동물로부터 유래된 혈청도 3주째에 항-gp120 ELISA로 측정하였다. 미처리 동물과 dsRNA 유사체를 단독으로 (dsRNA) 투여받은 동물은 각각 ELISA에 대한 음성 대조군과 배경 대조군으로서 사용되었다. 각 군당 6마리의 동물이 포함되었다.
실시예 3: 제2 키메라 아데노바이러스 벡터( DS1b ) 및 제3 키메라 아데노바이러스 벡터(DS1c) 작제
표준 제한 효소 분해를 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 핵산을 pShuttle-CMV (큐바이오겐) 내로 삽입하였다. GFP를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 Ad (E1/E3 결실)를 생산할 수 있는 벡터를 생성하기 위하여 앞서 기술된 바와 같이 벡터 pAd (큐바이오겐)와의 상동성 재조합에 의해 플라스미드 pShuttleCMV-GFP를 조합하였다. 인플루엔자 A/PR/8/34로부터 유래된 적혈구 응집소(HA)를 코딩하는 핵산을 클로닝하고 pShuttle-CMV 벡터 (큐바이오겐) (서열 번호: 13)에 배치하였다. HA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 Ad (E1/E3 결실)를 생산할 수 있는 벡터를 생성하기 위하여 앞서 기술된 바와 같이 벡터를 조합하였다. 새로운 pAd-CMV-GFP 및 pAd-CMV-HA 발현 작제물을 293 세포 내로 형질감염시켜 재조합 Ad를 생성하였다. 역가는 표준 방법에 의해 측정하였다.
실시예 4: DS1b ( Ad - CMV - GFP + TLR -3 효현제 ) 및 DS1c ( Ad - CMV - HA + TLR -3 효현제)가 항원 특이적인 면역 반응을 유도함에 있어 표준 rAd5보다 우수하다
1.0x107 PFU의 Ad-CMV-GFP + 5 ug/ml 폴리 I:C (DS1b) 또는 Ad-CMV-GFP (rAd5)를 0주째에 경구 위관 영양법에 의해 동물에게 투여하였다. 두 바이러스 모두 CMV 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하고, 재조합 E1/E3 결실된 5형 아데노바이러스를 사용한다. GFP에 대한 항체 역가는 항-GFP IgG ELISA에 의해서 최초 바이러스 투여 후 3주째에 혈장에서 측정하였다. 도 3 내지 5에 나타낸 바와 같이, DS1b 군은 최초 경구 투여 후 3주째에 단백질 GFP에 대한 항체 반응을 유도함에 있어 rAd5보다 현저히 우수하게 실시하였다.
GFP에 대한 CD8+ T 세포 반응은 비세포의 사합체 염색에 의해 측정하였다. 0주, 4주, 8주째 동물에 백신접종하고, 10주째 비장을 수거하였다. 비세포를 Balb/c 마우스에서 GFP에 대한 면역원성 에피토프를 인식하는 사합체 및 CD8-FITC로 염색하였다. 본 결과는, DS1b 벡터를 경구 투여하는 것이 사합체 양성 CD8 세포를 유도함에 있어 단독의 rAd보다 통계학적으로 보다 우수하였다는 것을 나타낸다 (도 4).
1.0x107 PFU의 Ad-CMV-HA + 5 ug/ml 폴리 I:C (DS1c) 또는 Ad-CMV-HA (rAd5)를 0주째에 경구 위관 영양법에 의해 동물에게 투여하였다. 두 바이러스 모두 CMV 프로모터의 제어하에 HA를 발현하고, 재조합 E1/E3 결실된 5형 아데노바이러스를 사용한다. HA에 대한 항체 역가는 항-PR8/34 IgG ELISA에 의해서 최초 바이러스 투여 후 3주째에 혈장에서 측정하였다. 항체 반응을 측정하는 방법은 앞서 기술된 것과 유사하되, 단, ELISA 플레이트가 5 ug/ml의 전체 A/PR8/34 용해물 (메릴랜드주 게이터스버그에 소재하는 어드밴스드 바이오테크놀러지 인코포레이티드(Advanced Biotechnology Incorporated))로 코팅되는 것을 예외로 하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, DS1c 군은 최초 경구 투여 후 3주째에 인플루엔자에 대한 항체 반응을 유도함에 있어 rAd5보다 현저히 우수하게 (대략 100배 우수) 실시하였다. 이러한 연구 결과는 또한, 키메라 재조합 아데노바이러스 벡터와 함께 TLR-3 효현제를 사용하는 접근법이 일반적으로는 다수의 상이한 이종 항원에 적용될 수 있고, 항체 역가는 100배 개선된다는 것을 입증한다.
실시예 5: 비- 비경구적인 경로로 전달하는 것이 비경구적인 경로보다 우수하다
동물의 사두근 내로 1.0x107 pfu의 pAd-CMV-gp120 (DS1O +/- 5 ug/ml 폴리 I:C)을 직접 주사하여 근육내 전달을 시험하였다. GFP에 대한 혈장 혈청 IgG역가는 앞서 기술된 바와 같이 측정하였다. 각 군당 6마리의 동물을 포함하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 군에 TLR-3 효현제를 투여한 후 3주째에 gp120에 대한 유의적인 항체 역가가 관찰되었다 (i.m. rAd+PI). (도 6).
마우스 비강 내로 20 ul의 1.0x106 pfu DS1c +/- 5 ug/ml의 폴리 I:C를 투여하여 비내 투여를 시험하였다. 멸균 염수 중 제형화된 바이러스를 투여하기 이전에 이소플루란으로 마우스를 가볍에 마취시켰다. 본 결과는 rAd-CMV-HA + 폴리 I:C (DS1c)가 표준 rAd-CMV-HA를 제공하는 동물과 비교하여 약간 더 높은 항체 역가를 가졌다는 것을 나타낸다. 결과를 DS1c (N=6) 및 rAd (N=5) 군에 대하여 개별 동물로서 플로팅한다. 미처리 동물 (N=4)은 음성 대조군으로 사용한다.
실시예 6: 발현된 TLR3 효현제 작제
함께 어닐링될 때 더블-스트랜드 RNA (GAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC) (서열 번호: 10)의 헤어핀을 만들도록 디자인된 45 bp 세그먼트를 형성하는 DNA 올리고를 정돈하여 45 bp의 짧은 DNA 세그먼트를 합성하였다. 이러한 짧은 세그먼트 (luc1로 명명)는, 인간 베타 액틴 프로모터 및 BGH 폴리 A 테일을 함유하는 플라스미드 pSK 내로 클로닝하였다. 이러한 플라스미드를 pSk-luc1로 명명한다.
실시예 7: pSK - luc1 은 폴리 I:C와 같이 가지 세포 배양물에서 작용하고, 폴리 I:C 및 rAd의 효과는 상가적이다.
상기 실시예 6의 발현된 TLR-3 효현제가 TLR-3 리간드 폴리 I:C와 같이 전-염증성 사이토카인 및 가지 세포 성숙의 유도제로서 작용할 수 있는지 여부를 측정하기 위하여 발현된 dsRNA TLR-3 효현제를 가지 세포 배양물에서 시험하였다. 1차 가지 세포 배양물을 제조하기 위하여 Balb/c 마우스의 대퇴골로부터 얻은 골수를 DMEM 배지중 flt-3 리간드 (200 ng/ml), 5% 혈청과 함께 배양하였다. 1차 골수 배양물을 셋업한 후 5일째 293 세포를 pSk-luc1, pSK-베타2 (200 bp 헤어핀을 형성하는 베타 갈락토시다제의 긴 세그먼트), 또는 pcDNA3 (빈 발현 벡터)로 형질감염시켰다. 6일째, 형질감염된 세포를 UV 조사 (40 kJ/cm2로 20초)하여 아포프토시스를 유발하고, 이들 세포를 가지 세포에 제공하였다. 폴리 I:C (1 ug/ml), rAd (1 pfu/세포), rAd + 폴리 I:C, pSK-luc1 형질감염된 세포, pSK-베타2 형질감염된 세포, 또는 pcDNA3 형질감염된 세포를 가지 세포에 제공하고 밤새도록 배양하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, pSK-luc1 형질감염된 세포는 마우스 IL-6 ELISA에 의해 측정된 것처럼 가지 세포 활성화를 유의적으로 개선시킬 수 있다. 본 실험 결과 또한, rAd + TLR3 리간드 (폴리 I:C)를 함께 조합하는 것이 가지 세포 활성을 현저히 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
추가의 리간드 또한 시험하였다. 서열 번호: 11에 기재된 TLR-3 효현제 (m1) 또한 luc1과 크기가 대략적으로 동일한 dsRNA 헤어핀을 형성한다. 인간 베타 액틴 프로모터의 제어하에 pSK-벡터 내로 클로닝하기 전에, 올리고뉴클레오티드를 중복시키고, 그를 함께 어닐링함으로써 제조하였다. 벡터를 293 세포 내로 형질감염시키고, 상기 기술된 바와 같이, 1차 가지 세포에 제공하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 이들 추가의 리간드는 리간드 luc1의 것과 유사한 가지 세포를 활성화시킬 수 있다 (도 9).
실시예 8: 제4 키메라 아데노바이러스 벡터 ( DS2 )의 작제 및 벡터들 ( DS2 베타-luc 및 DS2C-luc)의 신속한 클로닝
gp120을 코딩하는 핵산 (NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램)을 CMV 프로모터의 제어하에 셔틀 벡터중 개시 코돈 바로 앞쪽 상류에 작은 인트론과 함께 배치하였다. bGH로부터의 폴리 A 테일은 gp120을 코딩하는 핵산의 하류에 배치하였다. 인간 베타 액틴 프로모터 및 폴리 A (상기 실시예 5에 기술됨) 제어하의 dsRNA TLR-3 효현제를 gp120 pShuttle 벡터 내로 삽입하여 gp120을 코딩하는 핵산 및 TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산, 둘 모두가 2개의 별개의 프로모터 제어하에 단일 벡터에 함유되도록 하였다. 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 핵산의 발현 및 TLR-3 효현제의 발현의 배향은 도 10에 도시한다.
DS2베타-luc (서열 번호: 14) 및 DS2C-luc (서열 번호: 15)로 명명되는 2개의 일반 셔틀 벡터 또한 작제하여 관심의 대상이 되는 임의의 항원을 코딩하는 핵산이 CMV 프로모터의 제어하에 삽입될 수 있고, 인간 베타 액틴 프로모터 또는 CMV 프로모터가 dsRNA TLR-3 효현제의 발현을 유도하는데 사용될 수 있도록 하였다. 특히, 벡터 DS2C-luc는, 관심의 대상이 되는 항원을 코딩하는 핵산이 용이하게 클로닝될 수 있는 독특한 Kpn 1 부위를 갖는다. 관심의 대상이 되는 임의의 항원을 코딩하는 핵산이 클로닝 부위 내로 삽입되어 관심의 대상이 되는 항원에 대한 항체 및 T 세포 반응을 유도할 수 있는 벡터를 신속하게 제조할 수 있는 바, 이들 벡터의 목적은 추후의 작제를 보다 용이하게 만드는 것이다. GFP를 코딩하는 핵산 및 dsRNA TLR-3 효현제 luc1을 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 Ad (E1/E3 결실)를 생산할 수 있는 벡터를 생성하기 위하여 상기와 같이 벡터 pAd (큐바이오겐)와 DS2의 상동성 재조합을 실시하였다. 새로운 pAd-베타액틴-luc1-CMV-gp120 발현 작제물을 293 세포 내로 형질감염시켜 재조합 Ad를 생성하였다. 역가는 표준 방법에 의해 측정하였다.
실시예 9: DS2 를 경구로 전달한 이후의 항원 특이적인 면역 반응의 도입
1.0x107 PFU의 rAd-CMV-gp120 + TLR-3 효현제 luc1 (DS2) 또는 pAd-CMV-gp120 (rAd5)를 0주째에 경구 위관 영양법에 의해 동물에게 투여하였다. 두 바이러스 모두 CMV 프로모터의 제어하에 HIV gp120을 발현하고, 재조합 E1/E3 결실된 5형 아데노바이러스를 사용한다. gp120에 대한 항체 역가는 항-gp120 IgG ELISA에 의해서 바이러스 투여 후 3주째에 혈장에서 측정하였다. ELISA 프로토콜은 앞서 기술되어 있다 (문헌 [Tucker, et al, Mol Therapy 8:392 (2004)]). 본 결과는, DS2가 본원에서 사용된 이종 항원인 gp120에 대한 항체 역가를 대략 2 로그만큼 개선시킬 수 있다는 것을 입증한다. DS2 벡터는 gp120을 코딩/발현하는 핵산 서열 및 dsRNA TLR-3 효현제를 발현하는 핵산 서열을 포함한다. 본 분석법에 대한 양성 대조군으로서, 10 ㎍의 gp120 단백질 + 프로인트 완전 애주번트를 피하 주사 맞은 동물로부터 유래된 혈청 또한 3주째 항-gp120 ELISA로 측정하였다. 미처리 동물을 ELISA에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 각 군당 6마리의 동물을 포함하였다. 결과는 도 11에 도시한다.
실시예 10: DS3 을 경구로 전달한 이후의 항원 특이적인 면역 반응의 도입
1.0x107 PFU의 pAd-CMV-인플루엔자 HA (A/PR/8/34로부터) + TLR7/8 리간드 폴리우리딜산 (DS3) 또는 pAd-CMV-HA (rAd5)를 0주째에 경구 위관 영양법에 의해 동물에게 투여하였다. 두 바이러스 모두 CMV 프로모터의 제어하에 인플루엔자 HA를 발현하고, 재조합 E1/E3 결실된 5형 아데노바이러스를 사용한다. HA에 대한 항체 역가는 항-인플루엔자 HA IgG ELISA에 의해서 바이러스 투여 후 3주째에 혈장에서 측정하였다. 각 군당 6마리의 동물을 포함하였다. 결과는 도 12에 도시한다.
실시예 11: 제5, 제6, 및 제7 키메라 아데노바이러스 벡터 ( DS2b , DS2b - for , 및 ND1.1 214)의 작제
셀텍크 (테네시주 낸슈빌 소재)에 의해 유전자 인플루엔자 HA (A/Indo/5/2005)를 합성시키고, 이를 셔틀 벡터중 개시 코돈 바로 앞쪽 상류에 작은 인트론과 함께 CMV 프로모터를 포함하는 벡터 pShuttleCMV (큐바이오겐) 내로 배치하였다. 인간 베타 액틴 프로모터 및 폴리 A (실시예 5에 기술됨)와 함께 luc1 DNA를 DS2b에 대해 도 10에 나타낸 배향으로 항원의 하류에 벡터 내로 배치하였다. luc1의 서열은 (GAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC) (서열 번호: 10)이고, 전체 pShuttle 벡터는 서열 번호: 6에 기재되어 있다. 셔틀 벡터내 프로모터와 luc1의 대체 배향은 서열 번호: 7로서 기재하고, DS2b-for로 지정하였다. 본 발명자들은 또한 상기 기술된 TLR-3 효현제 luc1 및 인플루엔자 HA의 발현을 유도하는 2개의 별개의 CMV 프로모터를 포함하는 또다른 pShuttle 벡터 (DS2bC-HA로 명명됨) (서열 번호: 16)를 작제하였다. 별개의 프로모터하에 HA 및 TLR-3 효현제 luc1을 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 Ad (E1/E3 결실)를 생산할 수 있는 벡터를 생성하기 위하여 앞서 기술된 바와 같이 벡터 pAd (큐바이오겐)와의 상동성 재조합을 실시하였다. 새로운 pAd-작제물을 293 세포 내로 형질감염시켜 재조합 Ad를 생성하였다. 역가는 표준 방법에 의해 측정하였다. DS2C-luc를 함유하는, 완성된 pAd 벡터를 ND1.1 214로 명명하고, 2007년 2월 22일 ATCC 특허 기탁 기관 (버지니아주 마나싸스)에 기탁하였다. 본 키메라 아데노바이러스 벡터의 핵산 서열은 서열 번호: 17에 기재되어 있다. 이종 항원을 코딩하는 핵산은 굵게 표기하고, 이는 5' 말단 상의 Cla I 인식 부위 및 3' 말단 상의 Not 1 인식 부위 측면에 위치한다. TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 서열은 이탤릭체로 나타내고, 링커 서열은 굵게 표시한다. 관심의 대상이 되는 임의의 항원을 코딩하는 핵산 서열 및 임의의 적합한 발현된 TLR-3 효현제를 코딩하는 핵산 서열을 키메라 아데노바이러스 벡터 내로 삽입시킬 수 있다.
실시예 12: DS2b 를 경구로 전달한 이후의 항원 특이적인 면역 반응의 도입
1.0x107 PFU의, 역배향의 Ad-CMV-HA + TLR-3 효현제 (DS2b) 또는 정배향의 Ad-CMV-HA + TLR-3 효현제 (DS2b-for), 또는 pAd-CMV-HA (rAd5)를 0주째에 경구 위관 영양법에 의해 동물에게 투여하였다. 두 바이러스 모두 CMV 프로모터의 제어하에 인플루엔자 HA를 발현하고, 재조합 E1/E3 결실된 5형 아데노바이러스를 사용한다. HA에 대한 항체 역가는 항-HA IgG ELISA에 의해서 바이러스 투여 후 3주째에 혈장에서 측정하였다. 본 결과는 DS2b 벡터가 표준 rAd 벡터 (rAd5)보다도 더 잘 단백질 HA에 대한 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 입증한다. DS2b 벡터는 HA를 발현하는 rAd5를 함유할 뿐만 아니라, 더블-스트랜드 RNA의 헤어핀인 톨-유사 수용체 3 (TLR3) 효현제를 발현하는데, 이는 코딩된 dsRNA - 리간드를 사용함으로써 관심의 대상이 되는 항원에 대한 적응 면역 반응을 개선시킬 수 있다는 것을 입증한다. 도 13 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 발현된 dsRNA는 다수의 상이한 이종 항원에 대한 적응 면역 반응을 개선시킬 수 있다. 미처리 동물을 ELISA에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 각 군당 6마리의 동물을 포함하였다.
경구 또는 근육내로 동물 1마리당 1.0x107 pfu 바이러스를 투여한 후 0 및 5주째에 반대 배향의 벡터 (DS2for)를 항체 반응에 대하여 조사하였다. HA에 대한 항체 역가는 최초 투여 후 4주 및 7주째 측정하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이,반대 배향의 벡터 또한 이종 항원에 대한 상당한 항체 반응을 유도할 수 있다. DS1b 및 DS1bfor 벡터는 시점 4주째에 HA에 대하여 유사한 반응을 유도하였다. 유의적으로, 항체 반응을 증폭시키는 효과는 DS1bfor 벡터를 사용하여 입증하였고, 상기 효과는 다수의 투여량을 사용하여 이종 항원에 대한 항체 반응을 증가시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
키메라 아데노바이러스 벡터 접근법의 효능에 관한 또다른 일례도 입증되었다. 경구 (1.0x107 PFU) 또는 비내 투여 (3x106 pfu)에 의해 벡터 ND1.1 214를 동물에게 투여하고, 3주째에 이종 항원에 대한 항체 반응을 측정하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, HA에 대한 상당한 항체 반응은 경구 투여 이후에 측정하였고, 이는 rAd 벡터의 단일 경구 투여로부터의 전형적인 값보다 훨씬 컸다.
본 명세서에서 인용된 모든 공보, 특허 공보, 특허, 및 진뱅크 수탁 번호는 마치 각 개별 공보, 특허 공보, 특허가 참고로 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 같이 모든 목적을 위해 본원에서 전체적으로 참고로 인용된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Tucker, Sean N. West Coast Biologicals <120> Chimeric Adenoviral Vectors <130> 026163-000110PC <140> WO PCT/US07/05386 <141> 2007-02-28 <150> US 60/778,026 <151> 2006-02-28 <150> US 60/801,645 <151> 2006-05-19 <150> US 60/802,992 <151> 2006-05-22 <150> US 60/821,492 <151> 2006-08-04 <150> US 60/846,658 <151> 2006-09-22 <150> US 60/848,195 <151> 2006-09-28 <160> 17 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11025 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric adenoviral vector DS1 <400> 1 taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60 agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120 tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180 ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240 tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300 ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactggt accgcggccg 360 cctcgagtct agagatctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac 420 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattgt aatacgactc 480 actatagggc gaattgggta ctggccacag agcttggccc attgcatacg ttgtatccat 540 atcataatat gtacatttat attggctcat gtccaacatt accgccatgt tgacattgat 600 tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 660 agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 720 gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 780 gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 840 atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 900 cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 960 ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 1020 cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 1080 atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 1140 ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct 1200 ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctga 1260 ctctagccta gctctgaagt tggtggtgag gccctgggca ggttggtatc aaggttacaa 1320 gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcatgtggag acagagaaga ctcttgggtt 1380 tctgataggc actgactctc tctgcctatt ggtctatttt cccaccctta ggctgctggt 1440 ctgagcctag gagatctctc gaggtcgacg gtatagcttc tagagatccc tcgacctcga 1500 gatccattgt gctctaaagg agatacccgg ccagacaccc tcacctgcgg tgcccagctg 1560 cccaggctga ggcaagagaa ggccagaaac catgcccatg gggtctctgc aaccgctggc 1620 caccttgtac ctgctgggga tgctggtcgc ttccgtgcta gctgtggaga agctgtgggt 1680 gactgtatac tatggggtgc ctgtgtggaa ggaggccacc accaccctgt tctgtgcctc 1740 tgatgccaag gcctatgaca ctgaggtcca caatgtctgg gccacccatg cctgtgtgcc 1800 cactgacccc aaccctcagg aggtggtgct ggagaatgtg actgagcact tcaacatgtg 1860 gaagaacaac atggtggagc agatgcagga ggacatcatc agcctgtggg accagagcct 1920 gaagccctgt gtgaagctga cccccctgtg tgtgaccctg aactgcaagg atgtgaatgc 1980 caccaacacc accaatgact ctgagggcac tatggagagg ggtgagatca agaactgcag 2040 cttcaacatc accaccagca tcagggatga ggtgcagaag gagtatgccc tgttctacaa 2100 gctggatgtg gtgcccattg acaacaacaa caccagctac aggctgatca gctgtgacac 2160 ctctgtgatc acccaggcct gccccaagat cagctttgag cccatcccca tccactactg 2220 tgcccctgct ggctttgcca tcctgaagtg caatgacaag accttcaatg gcaaaggccc 2280 ttgcaagaat gtgagcactg tgcagtgcac tcatggcatc aggcctgtgg tgagcaccca 2340 gctgctgctg aatggcagcc tggctgagga ggaggtggtg atcaggtctg acaacttcac 2400 caacaatgcc aagaccatca ttgtgcagct gaaggagtct gtggagatca actgcaccag 2460 gcccaacaac aacaccagga agagcattca cattggccct ggcagggcct tctacaccac 2520 tggggagatc attggggaca tcaggcaggc ccactgcaac atcagcaggg ccaagtggaa 2580 tgacaccctg aagcagattg tgatcaagct gagggagcag tttgagaaca agaccattgt 2640 gttcaatcac agctctggtg gtgatcctga gattgtgatg cacagcttca actgtggtgg 2700 tgagttcttc tactgcaaca gcacccagct gttcaacagc acctggaaca acaacactga 2760 gggcagcaac aacactgagg gcaacaccat caccctgcct tgcaggatca agcagatcat 2820 caacatgtgg caggaggtgg gcaaggccat gtatgctcct cccatcaggg gccagatcag 2880 gtgcagcagc aacatcactg gcctgctgct gaccagggat ggtggcatca atgagaatgg 2940 cactgagatt ttcaggcctg gtggtgggga catgagggac aactggaggt ctgagctgta 3000 caagtacaag gtggtgaaga ttgagcccct tggtgtggct cccaccaagg ctaagcgcag 3060 ggtggtgcag agggagaagc gcgctgtggg ctgaggatcc cgagggtgag tgctcctgcc 3120 tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 3180 ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 3240 ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 3300 aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag 3360 cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat 3420 tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg 3480 cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg 3540 ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca 3600 tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 3660 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 3720 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 3780 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc agcgtcctca 3840 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 3900 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc 3960 gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta 4020 ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc 4080 gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca 4140 gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc 4200 ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 4260 gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc 4320 actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg agtgcgacgg ccgcaggtaa 4380 gccagcccag gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat 4440 ccagggacag gccccagccg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcaggtctgc 4500 ccgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 4560 cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 4620 ccttctataa tattatgggg 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tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 900 gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 960 ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 1020 caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 1080 tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 1140 tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt 1200 tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctga ctctagccta gctctgaagt 1260 tggtggtgag gccctgggca ggttggtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa 1320 tagaaactgg gcatgtggag acagagaaga ctcttgggtt tctgataggc actgactctc 1380 tctgcctatt ggtctatttt cccaccctta ggctgctggt ctgagcctag gagatctctc 1440 gaggtcgacg gtatcgatgc caccatggag aaaatcgtcc tgttgctcgc tattgtgtct 1500 ctagtgaaga gcgatcaaat ttgtatcggc taccatgcca ataactcaac agagcaggtc 1560 gatactatca tggagaaaaa cgtaacagtt actcatgccc aagacatctt ggaaaagacc 1620 cacaacggca aactttgcga cctggatgga gtgaagcccc tgatcctccg ggactgttca 1680 gtcgctggtt ggctgctcgg gaaccctatg 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hairpin <400> 11 cctaataatt atcaaaatgt ggatccacat tttgataatt attagg 46 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> short hairpin RNA TLR-3 agonist <400> 12 cctaataatt atcaaaatgt aattacattt tgataattat tagg 44 <210> 13 <211> 9387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric adenoviral vector DS1c encoding hemagglutinin (HA) from influenza A/PR/8/34 in pShuttle-CMV vector (Ad-CMV-HA plus TLR-3 agonist) <400> 13 taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60 agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120 tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180 ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240 tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300 ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgta atagtaatca 360 attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 420 aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 480 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 540 taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 600 gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 660 cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 720 cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 780 attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 840 aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 900 agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccga gctcggatcc 960 gccaccatgg aggcaaacct actggtcctg ttatgtgcac ttgcagctgc agatgcagac 1020 acaatatgta taggctacca tgcgaacaat tcaaccgaca ctggtgacac agtactcgag 1080 aagaatgtga cagtgacaca ctctgttaac ctgctcgaag acagccacaa cggaaaacta 1140 tgtagattaa aaggaatagc cccactacaa ttggggaaat gtaacatcgc cggatggctc 1200 ttgggaaacc cagaatgcga cccactgctt ccagtgagat catggtccta cattgtagaa 1260 acaccaaact ctgagaatgg aatatgttat ccaggagatt tcatcgacta tgaggagctg 1320 agggagcaat tgagctcagt gtcatcattc gaaagattcg aaatatttcc caaagaaagc 1380 tcatggccca accacaacac aaccaaagga gtaacggcag catgctccca tgcggggaaa 1440 agcagttttt acagaaattt gctatggctg acggagaagg agggctcata cccaaagctg 1500 aaaaattctt atgtgaacaa gaaagggaaa gaagtccttg tactgtgggg tattcatcac 1560 ccgtctaaca gtaaggatca acagaatatc tatcagaatg aaaatgctta tgtctctgta 1620 gtgacttcaa attataacag gagatttacc ccggaaatag cagaaagacc caaagtaaga 1680 gatcaagctg ggaggatgaa ctattactgg accttgctaa aacccggaga cacaataata 1740 tttgaggcaa atggaaatct aatagcacca aggtatgctt tcgcactgag tagaggcttt 1800 gggtccggca tcatcacctc aaacgcatca atgcatgagt gtaacacgaa gtgtcaaaca 1860 cccctgggag ctataaacag cagtctccct ttccagaata tacacccagt cacaatagga 1920 gagtgcccaa aatacgtcag gagtgccaaa ttgaggatgg ttacaggact aaggaacatt 1980 ccgtccattc aatccagagg tctatttgga gccattgccg gttttattga agggggatgg 2040 actggaatga tagatggatg gtacggttat catcatcaga atgaacaggg atcaggctat 2100 gcagcggatc aaaaaagcac acaaaatgcc attaacggga ttacaaacaa ggtgaactct 2160 gttatcgaga aaatgaacat tcaattcaca gctgtgggta aagaattcaa caaattagaa 2220 aaaaggatgg aaaatttaaa taaaaaagtt gatgatggat ttctggacat ttggacatat 2280 aatgcagaat tgttagttct actggaaaat gaaaggactc tggatttcca tgactcaaat 2340 gtgaagaatc tgtatgagaa agtaaaaagc caattaaaga ataatgccaa agaaatcgga 2400 aatggatgtt ttgagttcta ccacaagtgt gacaatgaat gcatggaaag tgtaagaaat 2460 gggacttatg attatcccaa atattcagaa gagtcaaagt tgaacaggga aaaggtagat 2520 ggagtgaaat tggaatcaat ggggatctat cagattctgg cgatctactc aactgtcgcc 2580 agttcactgg tgcttttggt ctccctgggg gcaatcagtt tctggatgtg ttctaatgga 2640 tctttgcagt gcagaatatg catctgagat tagaatttca gagatatgag gaaaaacacc 2700 cttgtttcta ctcccaagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt 2760 caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac cgtcaccctg 2820 gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatgggcgg 2880 ccgctcgagc ctaagcttct agataagata tccgatccac cggatctaga taactgatca 2940 taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc 3000 ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 3060 ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 3120 tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaacgcgga tctgggcgtg 3180 gttaagggtg ggaaagaata tataaggtgg gggtcttatg tagttttgta tctgttttgc 3240 agcagccgcc gccgccatga gcaccaactc gtttgatgga agcattgtga gctcatattt 3300 gacaacgcgc atgcccccat gggccggggt gcgtcagaat gtgatgggct ccagcattga 3360 tggtcgcccc gtcctgcccg caaactctac taccttgacc tacgagaccg tgtctggaac 3420 gccgttggag actgcagcct ccgccgccgc ttcagccgct gcagccaccg cccgcgggat 3480 tgtgactgac tttgctttcc tgagcccgct tgcaagcagt gcagcttccc gttcatccgc 3540 ccgcgatgac aagttgacgg ctcttttggc acaattggat tctttgaccc gggaacttaa 3600 tgtcgtttct cagcagctgt tggatctgcg ccagcaggtt tctgccctga aggcttcctc 3660 ccctcccaat gcggtttaaa acataaataa aaaaccagac tctgtttgga tttggatcaa 3720 gcaagtgtct tgctgtcttt atttaggggt tttgcgcgcg cggtaggccc gggaccagcg 3780 gtctcggtcg ttgagggtcc tgtgtatttt ttccaggacg tggtaaaggt gactctggat 3840 gttcagatac atgggcataa gcccgtctct ggggtggagg tagcaccact gcagagcttc 3900 atgctgcggg gtggtgttgt agatgatcca gtcgtagcag gagcgctggg cgtggtgcct 3960 aaaaatgtct ttcagtagca agctgattgc caggggcagg cccttggtgt aagtgtttac 4020 aaagcggtta agctgggatg ggtgcatacg tggggatatg agatgcatct tggactgtat 4080 ttttaggttg gctatgttcc cagccatatc cctccgggga ttcatgttgt gcagaaccac 4140 cagcacagtg tatccggtgc acttgggaaa tttgtcatgt agcttagaag gaaatgcgtg 4200 gaagaacttg gagacgccct tgtgacctcc aagattttcc atgcattcgt ccataatgat 4260 ggcaatgggc ccacgggcgg cggcctgggc gaagatattt ctgggatcac taacgtcata 4320 gttgtgttcc aggatgagat cgtcataggc catttttaca aagcgcgggc ggagggtgcc 4380 agactgcggt ataatggttc catccggccc aggggcgtag ttaccctcac agatttgcat 4440 ttcccacgct ttgagttcag atggggggat catgtctacc tgcggggcga tgaagaaaac 4500 ggtttccggg gtaggggaga tcagctggga agaaagcagg ttcctgagca gctgcgactt 4560 accgcagccg gtgggcccgt aaatcacacc tattaccggg tgcaactggt agttaagaga 4620 gctgcagctg ccgtcatccc tgagcagggg ggccacttcg ttaagcatgt ccctgactcg 4680 catgttttcc ctgaccaaat ccgccagaag gcgctcgccg cccagcgata gcagttcttg 4740 caaggaagca aagtttttca acggtttgag accgtccgcc gtaggcatgc ttttgagcgt 4800 ttgaccaagc agttccaggc ggtcccacag ctcggtcacc tgctctacgg catctcgatc 4860 cagcatatct cctcgtttcg cgggttgggg cggctttcgc tgtacggcag tagtcggtgc 4920 tcgtccagac gggccagggt catgtctttc cacgggcgca gggtcctcgt cagcgtagtc 4980 tgggtcacgg tgaaggggtg cgctccgggc tgcgcgctgg ccagggtgcg cttgaggctg 5040 gtcctgctgg tgctgaagcg ctgccggtct tcgccctgcg cgtcggccag gtagcatttg 5100 accatggtgt catagtccag cccctccgcg gcgtggccct tggcgcgcag cttgcccttg 5160 gaggaggcgc cgcacgaggg gcagtgcaga cttttgaggg cgtagagctt gggcgcgaga 5220 aataccgatt ccggggagta ggcatccgcg ccgcaggccc cgcagacggt ctcgcattcc 5280 acgagccagg tgagctctgg ccgttcgggg tcaaaaacca ggtttccccc atgctttttg 5340 atgcgtttct tacctctggt ttccatgagc cggtgtccac gctcggtgac gaaaaggctg 5400 tccgtgtccc cgtatacaga cttgagaggg agtttaaacg aattcaatag cttgttgcat 5460 gggcggcgat ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa 5520 agaaagcaca tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac 5580 agaaaaagac accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata 5640 aaataacaaa aaaacattta aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt 5700 ataagcataa gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga 5760 ttaaaaagca ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta 5820 aacacatcag gttgattcat cggtcagtgc taaaaagcga ccgaaatagc ccgggggaat 5880 acatacccgc aggcgtagag acaacattac agcccccata ggaggtataa caaaattaat 5940 aggagagaaa aacacataaa cacctgaaaa accctcctgc ctaggcaaaa tagcaccctc 6000 ccgctccaga acaacataca gcgcttcaca gcggcagcct aacagtcagc cttaccagta 6060 aaaaagaaaa cctattaaaa aaacaccact cgacacggca ccagctcaat cagtcacagt 6120 gtaaaaaagg gccaagtgca gagcgagtat atataggact aaaaaatgac gtaacggtta 6180 aagtccacaa aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta cgcccagaaa cgaaagccaa 6240 aaaacccaca acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc acgttacgta acttcccatt 6300 ttaagaaaac tacaattccc aacacataca agttactccg ccctaaaacc tacgtcaccc 6360 gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc ccctcattat catattggct 6420 tcaatccaaa ataaggtata ttattgatga tgttaattaa catgcatgga tccatatgcg 6480 gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc 6540 ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 6600 aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 6660 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 6720 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 6780 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 6840 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 6900 ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 6960 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 7020 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 7080 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 7140 ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 7200 aagagttggt 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tggatggctt tctcgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagctc 8100 tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 8160 ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 8220 ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 8280 gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct 8340 ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 8400 ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 8460 cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 8520 ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 8580 cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 8640 gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 8700 tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 8760 ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 8820 agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 8880 ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaattt tgttaaaatt 8940 tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaacatc ccttataaat 9000 caaaagaata gaccgcgata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat 9060 taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac 9120 tacgtgaacc atcacccaaa tcaagttttt tgcggtcgag gtgccgtaaa gctctaaatc 9180 ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga 9240 gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca 9300 cgctgcgcgt aaccaccaca cccgcgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtccattcg 9360 ccattcagga tcgaattaat tcttaat 9387 <210> 14 <211> 8473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric adenoviral vector DS2beta-luc encoding TLR-3 agonist luc and human beta actin promotor, generic shuttle vector, rapid cloning vector <400> 14 taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60 agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120 tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180 ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240 tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300 ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgct agagatctgg 360 cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 420 gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 480 ctggccacag agcttggccc attgcatacg ttgtatccat atcataatat gtacatttat 540 attggctcat gtccaacatt accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 600 taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 660 acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 720 acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 780 ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 840 attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 900 gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 960 ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 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gccaggctca 8340 aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 8400 atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 8460 cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 8520 aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 8580 ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaattttgtt aaaatttttg ttaaatcagc 8640 tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aacatccctt ataaatcaaa agaatagacc 8700 gcgatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 8760 tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 8820 cccaaatcaa gttttttgcg gtcgaggtgc cgtaaagctc taaatcggaa ccctaaaggg 8880 agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 8940 aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 9000 accacacccg cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc cattcgccat tcaggatcga 9060 attaattctt aat 9073 <210> 16 <211> 50475 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric adenoviral vector DS2bC-HA encoding TLR-3 agonist luc1, influenza hemagglutinin (HA) (A/Indo/5/2005; avian flu) and cytomegalovirus (CMV) promotor, pShuttle vector <221> modified_base <222> (1)...(50475) <223> n = g, a, c or t <400> 16 taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60 agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120 tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180 ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240 tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300 ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgct agagatctgg 360 cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 420 gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 480 ctggccacag agcttggccc attgcatacg ttgtatccat atcataatat gtacatttat 540 attggctcat gtccaacatt accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 600 taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 660 acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 720 acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 780 ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 840 attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 900 gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 960 ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 1020 caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 1080 tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 1140 tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt 1200 tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctga ctctagccta gctctgaagt 1260 tggtggtgag gccctgggca ggttggtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa 1320 tagaaactgg gcatgtggag acagagaaga ctcttgggtt tctgataggc actgactctc 1380 tctgcctatt ggtctatttt cccaccctta ggctgctggt ctgagcctag gagatctctc 1440 gaggtcgacg gtatcgatgc caccatggag aaaatcgtcc tgttgctcgc tattgtgtct 1500 ctagtgaaga gcgatcaaat ttgtatcggc taccatgcca ataactcaac agagcaggtc 1560 gatactatca tggagaaaaa cgtaacagtt actcatgccc aagacatctt ggaaaagacc 1620 cacaacggca aactttgcga cctggatgga gtgaagcccc tgatcctccg ggactgttca 1680 gtcgctggtt ggctgctcgg gaaccctatg tgtgatgagt ttatcaacgt gcctgaatgg 1740 tcttacattg tggagaaggc taaccctacc aatgacctct gctatcctgg gtcatttaac 1800 gattacgagg aactgaaaca cctgttgtct agaattaacc actttgaaaa gatacagatt 1860 atacccaagt ctagttggag tgatcacgaa gcctcctcag gcgttagctc agcgtgtccc 1920 tatctgggct ctccatcctt ctttagaaat gtggtctggt taatcaaaaa gaacagtacc 1980 tacccaacca tcaaaaagtc ttataacaat accaatcagg aggacctgct cgtgttgtgg 2040 ggtatccatc acccgaacga cgccgctgaa cagactaggc tgtatcagaa ccccactaca 2100 tacatcagta ttggcacgag tactctgaac cagcgattag tgccaaagat tgcaacacgg 2160 agcaaagtaa atgggcaatc tggcaggatg gagtttttct ggacaatctt aaaacccaac 2220 gatgcgataa atttcgagtc caatggcaat ttcatcgccc ctgaatacgc ctataagatc 2280 gtgaaaaagg gggactctgc aattatgaag tccgaattag agtatggcaa ttgcaacacg 2340 aagtgccaga caccaatggg agccattaat agctcaatgc ccttccataa tattcatcca 2400 ttgaccattg gggagtgccc aaagtacgtg aagtccaacc gcctggtcct cgcaaccggt 2460 ctaagaaata gcccgcagag agaatcgcgg aggaagaaac gtggcctgtt tggcgcgatt 2520 gccggattca tcgagggagg ctggcagggt atggtcgatg gttggtacgg ataccaccat 2580 agcaacgaac aggggtccgg ctatgcagca gataaggaga gcactcagaa agctattgac 2640 ggagttacaa acaaggttaa tagtattata gataaaatga acacgcaatt cgaggccgtt 2700 gggagggagt ttaacaatct ggaacgccgg atcgaaaatc tgaataagaa aatggaagac 2760 ggcttccttg acgtgtggac ttataatgca gagctgcttg tactcatgga gaacgagagg 2820 accctggatt tccacgatag caacgtgaag aacctttacg acaaggtgag acttcagctc 2880 cgagacaacg ccaaggagct ggggaatgga tgcttcgagt tttaccacaa atgtgacaat 2940 gagtgcatgg aaagtatacg caacgggacc tacaattacc ctcagtatag cgaagaggct 3000 cggctcaaac gcgaagagat aagcggggtg aaattggaat caatcggaac atatcaaatc 3060 ctgtccatct attccaccgt cgcctcttcg ctggccctcg ctatcatgat ggctggtctg 3120 tccctatgga tgtgttccaa tggaagcctt cagtgccgta tttgtatatg agcggccgcc 3180 ctattctata gtgtcaccta aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 3240 gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 3300 ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 3360 attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 3420 gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accaaagctt 3480 aacatcatca ataatatacc ttattttgga ttgaagccaa tatgataatg agggggtgga 3540 gtttgtgacg tggcgcgggg cgtgggaacg gggcgggtga cgtagtagtg tggcggaagt 3600 gtgatgttgc aagtgtggcg gaacacatgt aagcgacgga tgtggcaaaa gtgacgtttt 3660 tggtgtgcgc cggtgtacac aggaagtgac aattttcgcg cggttttagg cggatgttgt 3720 agtaaatttg ggcgtaaccg agtaagattt ggccattttc gcgggaaaac tgaataagag 3780 gaagtgaaat ctgaataatt ttgtgttact catagcgcgt aatactgtaa tagtaatcaa 3840 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 3900 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 3960 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 4020 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 4080 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 4140 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 4200 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 4260 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 4320 acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 4380 gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagagatc tgggaaacga tatgggctga 4440 atacggatcc gtattcagcc catatcgttt ctctagaaat aaaatatctt tattttcatt 4500 acatctgtgt gttggttttt tgtgtggcgg ccgctcgagc ctaagcttct agataagata 4560 tccgatccac cggatctaga taactgatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt 4620 tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa 4680 ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 4740 caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 4800 tcaatgtatc ttaacgcgga tctgggcgtg gttaagggtg ggaaagaata tataaggtgg 4860 gggtcttatg tagttttgta tctgttttgc agcagccgcc gccgccatga gcaccaactc 4920 gtttgatgga agcattgtga gcttgtcgac tcgaagatct gggcgtggtt aagggtggga 4980 aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag ttttgtatct gttttgcagc agccgccgcc 5040 gccatgagca ccaactcgtt tgatggaagc attgtgagct catatttgac aacgcgcatg 5100 cccccatggg ccggggtgcg tcagaatgtg atgggctcca gcattgatgg tcgccccgtc 5160 ctgcccgcaa actctactac cttgacctac gagaccgtgt ctggaacgcc gttggagact 5220 gcagcctccg ccgccgcttc agccgctgca gccaccgccc gcgggattgt gactgacttt 5280 gctttcctga gcccgcttgc aagcagtgca gcttcccgtt catccgcccg cgatgacaag 5340 ttgacggctc ttttggcaca attggattct ttgacccggg aacttaatgt cgtttctcag 5400 cagctgttgg atctgcgcca gcaggtttct gccctgaagg cttcctcccc tcccaatgcg 5460 gtttaaaaca taaataaaaa accagactct gtttggattt ggatcaagca agtgtcttgc 5520 tgtctttatt taggggtttt gcgcgcgcgg taggcccggg accagcggtc tcggtcgttg 5580 agggtcctgt gtattttttc caggacgtgg taaaggtgac tctggatgtt cagatacatg 5640 ggcataagcc cgtctctggg gtggaggtag caccactgca gagcttcatg ctgcggggtg 5700 gtgttgtaga tgatccagtc gtagcaggag cgctgggcgt ggtgcctaaa aatgtctttc 5760 agtagcaagc tgattgccag gggcaggccc ttggtgtaag tgtttacaaa gcggttaagc 5820 tgggatgggt gcatacgtgg ggatatgaga tgcatcttgg actgtatttt taggttggct 5880 atgttcccag ccatatccct ccggggattc atgttgtgca gaaccaccag cacagtgtat 5940 ccggtgcact tgggaaattt gtcatgtagc ttagaaggaa atgcgtggaa gaacttggag 6000 acgcccttgt gacctccaag attttccatg cattcgtcca taatgatggc aatgggccca 6060 cgggcggcgg cctgggcgaa gatatttctg ggatcactaa cgtcatagtt gtgttccagg 6120 atgagatcgt cataggccat ttttacaaag cgcgggcgga gggtgccaga ctgcggtata 6180 atggttccat ccggcccagg ggcgtagtta ccctcacaga tttgcatttc ccacgctttg 6240 agttcagatg gggggatcat gtctacctgc ggggcgatga agaaaacggt ttccggggta 6300 ggggagatca gctgggaaga aagcaggttc ctgagcagct gcgacttacc gcagccggtg 6360 ggcccgtaaa tcacacctat taccgggtgc aactggtagt taagagagct gcagctgccg 6420 tcatccctga gcaggggggc cacttcgtta agcatgtccc tgactcgcat gttttccctg 6480 accaaatccg ccagaaggcg ctcgccgccc agcgatagca gttcttgcaa ggaagcaaag 6540 tttttcaacg gtttgagacc gtccgccgta ggcatgcttt tgagcgtttg accaagcagt 6600 tccaggcggt cccacagctc ggtcacctgc tctacggcat ctcgatccag catatctcct 6660 cgtttcgcgg gttggggcgg ctttcgctgt acggcagtag tcggtgctcg tccagacggg 6720 ccagggtcat gtctttccac gggcgcaggg tcctcgtcag cgtagtctgg gtcacggtga 6780 aggggtgcgc tccgggctgc gcgctggcca gggtgcgctt gaggctggtc ctgctggtgc 6840 tgaagcgctg ccggtcttcg ccctgcgcgt cggccaggta gcatttgacc atggtgtcat 6900 agtccagccc ctccgcggcg tggcccttgg cgcgcagctt gcccttggag gaggcgccgc 6960 acgaggggca gtgcagactt ttgagggcgt agagcttggg cgcgagaaat accgattccg 7020 gggagtaggc atccgcgccg caggccccgc agacggtctc gcattccacg agccaggtga 7080 gctctggccg ttcggggtca aaaaccaggt ttcccccatg ctttttgatg cgtttcttac 7140 ctctggtttc catgagccgg tgtccacgct cggtgacgaa aaggctgtcc gtgtccccgt 7200 atacagactt gagagggagt ttaaacgaat tcaatagctt gttgcatggg cggcgatata 7260 aaatgcaagg tgctgctcaa aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga aagcacatcg 7320 tagtcatgct catgcagata aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga aaaagacacc 7380 atttttctct caaacatgtc tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa taacaaaaaa 7440 acatttaaac attagaagcc tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata agcataagac 7500 ggactacggc catgccggcg tgaccgtaaa aaaactggtc accgtgatta aaaagcacca 7560 ccgacagctc ctcggtcatg tccggagtca taatgtaaga ctcggtaaac acatcaggtt 7620 gattcatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca tacccgcagg 7680 cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg agagaaaaac 7740 acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg ctccagaaca 7800 acatacagcg cttcacagcg gcagcctaac agtcagcctt accagtaaaa aagaaaacct 7860 attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta aaaaagggcc 7920 aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta acggttaaag tccacaaaaa 7980 acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc ccagaaacga aagccaaaaa acccacaact 8040 tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtaact tcccatttta agaaaactac 8100 aattcccaac acatacaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc ccgttcccac 8160 gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca atccaaaata 8220 aggtatatta ttgatgatgt taattaacat gcatggatcc atatgcggtg tgaaataccg 8280 cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 8340 tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 8400 cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 8460 aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 8520 gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 8580 agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 8640 cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 8700 cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 8760 ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 8820 gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 8880 tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 8940 acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 9000 tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 9060 attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 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attcaccacc 48120 tcccggtacc atataaacct ctgattaaac atggcgccat ccaccaccat cctaaaccag 48180 ctggccaaaa cctgcccgcc ggctatacac tgcagggaac cgggactgga acaatgacag 48240 tggagagccc aggactcgta accatggatc atcatgctcg tcatgatatc aatgttggca 48300 caacacaggc acacgtgcat acacttcctc aggattacaa gctcctcccg cgttagaacc 48360 atatcccagg gaacaaccca ttcctgaatc agcgtaaatc ccacactgca gggaagacct 48420 cgcacgtaac tcacgttgtg cattgtcaaa gtgttacatt cgggcagcag cggatgatcc 48480 tccagtatgg tagcgcgggt ttctgtctca aaaggaggta gacgatccct actgtacgga 48540 gtgcgccgag acaaccgaga tcgtgttggt cgtagtgtca tgccaaatgg aacgccggac 48600 gtagtcatat ttcctgaagc aaaaccaggt gcgggcgtga caaacagatc tgcgtctccg 48660 gtctcgccgc ttagatcgct ctgtgtagta gttgtagtat atccactctc tcaaagcatc 48720 caggcgcccc ctggcttcgg gttctatgta aactccttca tgcgccgctg ccctgataac 48780 atccaccacc gcagaataag ccacacccag ccaacctaca cattcgttct gcgagtcaca 48840 cacgggagga gcgggaagag ctggaagaac catgtttttt tttttattcc aaaagattat 48900 ccaaaacctc aaaatgaaga tctattaagt gaacgcgctc ccctccggtg gcgtggtcaa 48960 actctacagc caaagaacag ataatggcat ttgtaagatg ttgcacaatg gcttccaaaa 49020 ggcaaacggc cctcacgtcc aagtggacgt aaaggctaaa cccttcaggg tgaatctcct 49080 ctataaacat tccagcacct tcaaccatgc ccaaataatt ctcatctcgc caccttctca 49140 atatatctct aagcaaatcc cgaatattaa gtccggccat tgtaaaaatc tgctccagag 49200 cgccctccac cttcagcctc aagcagcgaa tcatgattgc aaaaattcag gttcctcaca 49260 gacctgtata agattcaaaa gcggaacatt aacaaaaata ccgcgatccc gtaggtccct 49320 tcgcagggcc agctgaacat aatcgtgcag gtctgcacgg accagcgcgg ccacttcccc 49380 gccaggaacc ttgacaaaag aacccacact gattatgaca cgcatactcg gagctatgct 49440 aaccagcgta gccccgatgt aagctttgtt gcatgggcgg cgatataaaa tgcaaggtgc 49500 tgctcaaaaa atcaggcaaa gcctcgcgca aaaaagaaag cacatcgtag tcatgctcat 49560 gcagataaag gcaggtaagc tccggaacca ccacagaaaa agacaccatt tttctctcaa 49620 acatgtctgc gggtttctgc ataaacacaa aataaaataa caaaaaaaca tttaaacatt 49680 agaagcctgt cttacaacag gaaaaacaac ccttataagc ataagacgga ctacggccat 49740 gccggcgtga ccgtaaaaaa actggtcacc gtgattaaaa agcaccaccg acagctcctc 49800 ggtcatgtcc ggagtcataa tgtaagactc ggtaaacaca tcaggttgat tcatcggtca 49860 gtgctaaaaa gcgaccgaaa tagcccgggg gaatacatac ccgcaggcgt agagacaaca 49920 ttacagcccc cataggaggt ataacaaaat taataggaga gaaaaacaca taaacacctg 49980 aaaaaccctc ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca tacagcgctt 50040 cacagcggca gcctaacagt cagccttacc agtaaaaaag aaaacctatt aaaaaaacac 50100 cactcgacac ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa aagggccaag tgcagagcga 50160 gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaaaca cccagaaaac 50220 cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc tcaaatcgtc 50280 acttccgttt tcccacgtta cgtaacttcc cattttaaga aaactacaat tcccaacaca 50340 tacaagttac tccgccctaa aacctacgtc acccgccccg ttcccacgcc ccgcgccacg 50400 tcacaaactc caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc caaaataagg tatattattg 50460 atgatnnnnn ttaat 50475 <210> 17 <211> 39301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric adenoviral vector ND1.1 214, pAd vector containing DS2C-luc <221> modified_base <222> (1)...(39301) <223> n = g, a, c or t <400> 17 taaggatccn nncctgtcct cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct 60 tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc 120 aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct 180 ggagcgcgac gatgatcggc ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc 240 aagccttcgt cactggtccc gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg 300 gcatggcggc cgacgcgctg ggctacgtct tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg 360 ccttccccat tatgattctt ctcgcttccg gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca 420 tgctgtccag gcaggtagat gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc 480 ttaccagcct aacttcgatc actggaccgc tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg 540 cgagcacatg gaacgggttg gcatggattg taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc 600 ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca 660 cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt 720 gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg 780 cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct 840 gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc 900 gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac 960 atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg 1020 caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac 1080 atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat 1140 ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt 1200 aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa 1260 ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc 1320 cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat 1380 gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc 1440 ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 1500 acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 1560 gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 1620 ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 1680 taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca 1740 ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 1800 taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 1860 agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 1920 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 1980 tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 2040 tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat 2100 gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 2160 acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 2220 acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 2280 cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 2340 gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 2400 gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 2460 agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 2520 ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 2580 ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 2640 atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 2700 tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 2760 gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 2820 ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 2880 caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 2940 cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc agccatgaga ttatcaaaaa 3000 ggatcttcac ctagatcctt ttcacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 3060 ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 3120 aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 3180 gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 3240 actggatggc tttctcgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaagc tctgatcaag 3300 agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 3360 ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 3420 atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 3480 tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 3540 cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 3600 tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 3660 tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 3720 tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 3780 tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 3840 ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 3900 tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 3960 gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 4020 gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 4080 gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat tttgttaaaa tttttgttaa 4140 atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaca tcccttataa atcaaaagaa 4200 tagaccgcga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 4260 gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 4320 ccatcaccca aatcaagttt tttgcggtcg aggtgccgta aagctctaaa tcggaaccct 4380 aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 4440 gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 4500 gtaaccacca cacccgcgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtccatt cgccattcag 4560 gatcgaatta attcttaatt aacatcatca ataatatacc ttattttgga ttgaagccaa 4620 tatgataatg agggggtgga gtttgtgacg tggcgcgggg cgtgggaacg gggcgggtga 4680 cgtagtagtg tggcggaagt gtgatgttgc aagtgtggcg gaacacatgt aagcgacgga 4740 tgtggcaaaa gtgacgtttt tggtgtgcgc cggtgtacac aggaagtgac aattttcgcg 4800 cggttttagg cggatgttgt agtaaatttg ggcgtaaccg agtaagattt ggccattttc 4860 gcgggaaaac tgaataagag gaagtgaaat ctgaataatt ttgtgttact catagcgcgt 4920 aatactgcta gagatctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 4980 ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta atacgactca 5040 ctatagggcg aattgggtac tggccacaga gcttggccca ttgcatacgt tgtatccata 5100 tcataatatg tacatttata ttggctcatg tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt 5160 attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 5220 gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 5280 cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 5340 acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 5400 tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 5460 ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 5520 tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 5580 acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 5640 tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 5700 gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg 5760 gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctgac 5820 tctagcctag ctctgaagtt ggtggtgagg ccctgggcag gttggtatca aggttacaag 5880 acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg catgtggaga cagagaagac tcttgggttt 5940 ctgataggca ctgactctct ctgcctattg gtctattttc ccacccttag gctgctggtc 6000 tgagcctagg agatctctcg aggtcgacgg tatcgatgcc accatggaga aaatcgtcct 6060 gttgctcgct attgtgtctc tagtgaagag cgatcaaatt tgtatcggct accatgccaa 6120 taactcaaca gagcaggtcg atactatcat ggagaaaaac gtaacagtta ctcatgccca 6180 agacatcttg gaaaagaccc acaacggcaa actttgcgac ctggatggag tgaagcccct 6240 gatcctccgg gactgttcag tcgctggttg gctgctcggg aaccctatgt gtgatgagtt 6300 tatcaacgtg cctgaatggt cttacattgt ggagaaggct aaccctacca atgacctctg 6360 ctatcctggg tcatttaacg attacgagga actgaaacac ctgttgtcta gaattaacca 6420 ctttgaaaag atacagatta tacccaagtc tagttggagt gatcacgaag cctcctcagg 6480 cgttagctca gcgtgtccct atctgggctc tccatccttc tttagaaatg tggtctggtt 6540 aatcaaaaag aacagtacct acccaaccat caaaaagtct tataacaata ccaatcagga 6600 ggacctgctc gtgttgtggg gtatccatca cccgaacgac gccgctgaac agactaggct 6660 gtatcagaac cccactacat acatcagtat tggcacgagt actctgaacc agcgattagt 6720 gccaaagatt gcaacacgga gcaaagtaaa tgggcaatct ggcaggatgg agtttttctg 6780 gacaatctta aaacccaacg atgcgataaa tttcgagtcc aatggcaatt tcatcgcccc 6840 tgaatacgcc tataagatcg tgaaaaaggg ggactctgca attatgaagt ccgaattaga 6900 gtatggcaat tgcaacacga agtgccagac accaatggga gccattaata gctcaatgcc 6960 cttccataat attcatccat tgaccattgg ggagtgccca aagtacgtga agtccaaccg 7020 cctggtcctc gcaaccggtc taagaaatag cccgcagaga gaatcgcgga ggaagaaacg 7080 tggcctgttt ggcgcgattg ccggattcat cgagggaggc tggcagggta tggtcgatgg 7140 ttggtacgga taccaccata gcaacgaaca ggggtccggc tatgcagcag ataaggagag 7200 cactcagaaa gctattgacg gagttacaaa caaggttaat agtattatag ataaaatgaa 7260 cacgcaattc gaggccgttg ggagggagtt taacaatctg gaacgccgga tcgaaaatct 7320 gaataagaaa atggaagacg gcttccttga cgtgtggact tataatgcag agctgcttgt 7380 actcatggag aacgagagga ccctggattt ccacgatagc aacgtgaaga acctttacga 7440 caaggtgaga cttcagctcc gagacaacgc caaggagctg gggaatggat gcttcgagtt 7500 ttaccacaaa tgtgacaatg agtgcatgga aagtatacgc aacgggacct acaattaccc 7560 tcagtatagc gaagaggctc ggctcaaacg cgaagagata agcggggtga aattggaatc 7620 aatcggaaca tatcaaatcc tgtccatcta ttccaccgtc gcctcttcgc tggccctcgc 7680 tatcatgatg gctggtctgt ccctatggat gtgttccaat ggaagccttc agtgccgtat 7740 ttgtatatga gcggccgccc tattctatag tgtcacctaa atgctagagc tcgctgatca 7800 gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 7860 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 7920 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 7980 gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 8040 gcggaaagaa ccaaagctta acatcatcaa taatatacct tattttggat tgaagccaat 8100 atgataatga gggggtggag tttgtgacgt ggcgcggggc gtgggaacgg ggcgggtgac 8160 gtagtagtgt ggcggaagtg tgatgttgca agtgtggcgg aacacatgta agcgacggat 8220 gtggcaaaag tgacgttttt ggtgtgcgcc ggtgtacaca ggaagtgaca attttcgcgc 8280 ggttttaggc ggatgttgta gtaaatttgg gcgtaaccga gtaagatttg gccattttcg 8340 cgggaaaact gaataagagg 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aactactgcc actggtagct tgggcattga cttgaaagag 34980 cccatttata cacaaaatgg aaaactagga ctaaagtacg gggctccttt gcatgtaaca 35040 gacgacctaa acactttgac cgtagcaact ggtccaggtg tgactattaa taatacttcc 35100 ttgcaaacta aagttactgg agccttgggt tttgattcac aaggcaatat gcaacttaat 35160 gtagcaggag gactaaggat tgattctcaa aacagacgcc ttatacttga tgttagttat 35220 ccgtttgatg ctcaaaacca actaaatcta agactaggac agggccctct ttttataaac 35280 tcagcccaca acttggatat taactacaac aaaggccttt acttgtttac agcttcaaac 35340 aattccaaaa agcttgaggt taacctaagc actgccaagg ggttgatgtt tgacgctaca 35400 gccatagcca ttaatgcagg agatgggctt gaatttggtt cacctaatgc accaaacaca 35460 aatcccctca aaacaaaaat tggccatggc ctagaatttg attcaaacaa ggctatggtt 35520 cctaaactag gaactggcct tagttttgac agcacaggtg ccattacagt aggaaacaaa 35580 aataatgata agctaacttt gtggaccaca ccagctccat ctcctaactg tagactaaat 35640 gcagagaaag atgctaaact cactttggtc ttaacaaaat gtggcagtca aatacttgct 35700 acagtttcag ttttggctgt taaaggcagt ttggctccaa tatctggaac agttcaaagt 35760 gctcatctta ttataagatt tgacgaaaat ggagtgctac taaacaattc cttcctggac 35820 ccagaatatt ggaactttag aaatggagat cttactgaag gcacagccta tacaaacgct 35880 gttggattta tgcctaacct atcagcttat ccaaaatctc acggtaaaac tgccaaaagt 35940 aacattgtca gtcaagttta cttaaacgga gacaaaacta aacctgtaac actaaccatt 36000 acactaaacg gtacacagga aacaggagac acaactccaa gtgcatactc tatgtcattt 36060 tcatgggact ggtctggcca caactacatt aatgaaatat ttgccacatc ctcttacact 36120 ttttcataca ttgcccaaga ataaagaatc gtttgtgtta tgtttcaacg tgtttatttt 36180 tcaattgcag aaaatttcaa gtcatttttc attcagtagt atagccccac caccacatag 36240 cttatacaga tcaccgtacc ttaatcaaac tcacagaacc ctagtattca acctgccacc 36300 tccctcccaa cacacagagt acacagtcct ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat 36360 atcatgggta acagacatat tcttaggtgt tatattccac acggtttcct gtcgagccaa 36420 acgctcatca gtgatattaa taaactcccc gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc 36480 cagctgctga gccacaggct gctgtccaac ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga 36540 agtccacgcc tacatggggg tagagtcata atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg 36600 cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc 36660 agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc 36720 acagcagcgc accctgatct cacttaaatc agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat 36780 attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga 36840 acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag gtagattaag tggcgacccc tcataaacac 36900 gctggacata aacattacct cttttggcat gttgtaattc accacctccc ggtaccatat 36960 aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg 37020 cccgccggct atacactgca gggaaccggg actggaacaa tgacagtgga gagcccagga 37080 ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac 37140 gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac 37200 aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac actgcaggga agacctcgca cgtaactcac 37260 gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc 37320 gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg atccctactg tacggagtgc gccgagacaa 37380 ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc aaatggaacg ccggacgtag tcatatttcc 37440 tgaagcaaaa ccaggtgcgg gcgtgacaaa cagatctgcg tctccggtct cgccgcttag 37500 atcgctctgt gtagtagttg tagtatatcc actctctcaa agcatccagg cgccccctgg 37560 cttcgggttc tatgtaaact ccttcatgcg ccgctgccct gataacatcc accaccgcag 37620 aataagccac acccagccaa cctacacatt cgttctgcga gtcacacacg ggaggagcgg 37680 gaagagctgg aagaaccatg tttttttttt tattccaaaa gattatccaa aacctcaaaa 37740 tgaagatcta ttaagtgaac gcgctcccct ccggtggcgt ggtcaaactc tacagccaaa 37800 gaacagataa tggcatttgt aagatgttgc acaatggctt ccaaaaggca aacggccctc 37860 acgtccaagt ggacgtaaag gctaaaccct tcagggtgaa tctcctctat aaacattcca 37920 gcaccttcaa ccatgcccaa ataattctca tctcgccacc ttctcaatat atctctaagc 37980 aaatcccgaa tattaagtcc ggccattgta aaaatctgct ccagagcgcc ctccaccttc 38040 agcctcaagc agcgaatcat gattgcaaaa attcaggttc ctcacagacc tgtataagat 38100 tcaaaagcgg aacattaaca aaaataccgc gatcccgtag gtcccttcgc agggccagct 38160 gaacataatc gtgcaggtct gcacggacca gcgcggccac ttccccgcca ggaaccttga 38220 caaaagaacc cacactgatt atgacacgca tactcggagc tatgctaacc agcgtagccc 38280 cgatgtaagc tttgttgcat gggcggcgat ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca 38340 ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag 38400 gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt 38460 ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa aaaacattta aacattagaa gcctgtctta 38520 caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt 38580 aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag 38640 tcataatgta agactcggta aacacatcag gttgattcat cggtcagtgc taaaaagcga 38700 ccgaaatagc ccgggggaat acatacccgc aggcgtagag acaacattac agcccccata 38760 ggaggtataa caaaattaat aggagagaaa aacacataaa cacctgaaaa accctcctgc 38820 ctaggcaaaa tagcaccctc ccgctccaga acaacataca gcgcttcaca gcggcagcct 38880 aacagtcagc cttaccagta aaaaagaaaa cctattaaaa aaacaccact cgacacggca 38940 ccagctcaat cagtcacagt gtaaaaaagg gccaagtgca gagcgagtat atataggact 39000 aaaaaatgac gtaacggtta aagtccacaa aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta 39060 cgcccagaaa cgaaagccaa aaaacccaca acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc 39120 acgttacgta acttcccatt ttaagaaaac tacaattccc aacacataca agttactccg 39180 ccctaaaacc tacgtcaccc gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc 39240 ccctcattat catattggct tcaatccaaa ataaggtata ttattgatga tnnnnnttaa 39300 t 39301

Claims (12)

  1. (a) 이중가닥 RNA(dsRNA)인 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제(agonist)를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및
    (b) HIV 외피 폴리펩티드가 아니고, 인플루엔자 HA 폴리펩티드도 아닌 이종 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터
    를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, TLR-3 작용제를 코딩하는 핵산이 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터가 동일한 것인 키메라 아데 노바이러스 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터가 각각 CMV 프로모터인 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  5. 제1항의 발현 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  6. (a) 이중가닥 RNA(dsRNA)인 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및
    (b) HIV 외피 폴리펩티드가 아니고, 인플루엔자 HA 폴리펩티드도 아닌 이종 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하고,
    투여 경로가 경구, 비내, 및 점막으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포유동물 대상체에서 이종 면역원성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 이종 면역원성 폴리펩티드가 가지 세포, 미세주름 세포, 및 장 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포에서 발현되는 것인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 포유동물이 인간인 조성물.
  9. (a) HIV 외피 폴리펩티드가 아니고, 인플루엔자 HA 폴리펩티드도 아닌 이종 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터;
    (b) 이중가닥 RNA(dsRNA)인 TLR-3 작용제; 및
    (c) 약제학적으로 허용가능한 담체
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 프로모터가 인간 베타 액틴 프로모터인 조성물.
  12. 제9항에 있어서, TLR-3 작용제가 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 핵산인 조성물.
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