CN110268061A - 用于表达异源基因的有效的短启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于与质粒载体、病毒载体、病毒以及包含可操作地连接至转基因的AoHV‑1启动子的细胞系一起使用的AoHV‑1启动子。本发明还提供了制备和使用重组质粒载体、病毒载体、病毒以及包含可操作地连接至转基因的AoHV‑1启动子的细胞系的方法。

Description

用于表达异源基因的有效的短启动子
技术领域
本发明涉及生物学研究领域、医学领域和与异源基因表达有关的其他应用领域。更特别地，本发明涉及用于在质粒、病毒载体和细胞系的表达盒中表达异源基因的有效的短启动子，其可以单独使用或与常用的启动子(如hCMV启动子)组合使用。
背景技术
重组表达载体广泛用于多种分子生物学应用中用于表达异源蛋白，包括例如用于生物学研究的哺乳动物基因表达系统，以生产用于生产病毒载体的细胞系，以及用作基因疗法和疫苗接种的病毒载体的细胞系。对于基因疗法和疫苗接种应用，载体(包括病毒载体)被用作待引入细胞中的一种或多种目的基因的运载体。例如，病毒载体可用于表达编码所希望的抗原以引发免疫应答的基因或其部分。
作为表达载体一部分的顺式作用元件可对质粒和病毒载体的成功应用产生很大影响。启动子是主要的顺式作用元件，其被置于表达载体的表达盒中并指示表达的整体强度。启动子启动转录，因此是用于表达目的克隆基因的重要控制点。常用于表达载体的启动子序列衍生自病毒或真核基因调控序列。
表达载体和病毒载体中的一些常用的增强子和启动子序列是，例如，hCMV、CAG、SV40、mCMV、EF-1α和hPGK启动子。由于hCMV启动子的高效力和约0.8kB的中等尺寸，该hCMV启动子是这些启动子中最常用的启动子之一。hPGK启动子的特征在于小尺寸(约0.4kB)，但其效力低于hCMV启动子。另一方面，CAG启动子由巨细胞病毒早期增强子元件、启动子、第一外显子和鸡β-肌动蛋白基因的内含子、以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体组成，可以指导与hCMV启动子相当的非常有效的基因表达，但是该CAG启动子的大尺寸使其不太适合于病毒载体(例如，腺病毒载体(AdV)、腺相关病毒载体(AAV)或慢病毒载体(LV))，其中空间限制可能是一个重要问题。
在某些情况下，希望的是由一种载体表达至少两种抗原。在两个表达盒被置于载体中以表达两种不同基因的情况下，通常表达盒的尺寸限制以及特别是启动子序列是尤其重要的。除了尺寸限制之外，当将两个表达盒置于载体中时，使用相同或甚至非常相似的启动子序列是不利的，因为这可能在生产期间导致载体的遗传不稳定性。因此，当两个表达盒被置于载体中以表达两种不同基因时，希望的是使用相对较小且相对有效的不同异源启动子序列，这些序列彼此之间很少至没有序列同一性。
当制备用于生产病毒载体的细胞系时，还希望的是具有与病毒载体的表达盒中常用的其他启动子不同的序列的有效启动子，如常用的hCMV启动子。细胞系基因组与其中生产的载体之间的序列同一性的显著延伸可导致同源重组，并因此导致所生产的载体批次的遗传不稳定性或异质性(例如，Lochmüller等人,1994)，并且因此是优选避免的(例如，Fallaux等人,1998；Murakami等人,2002)。同样对于此类应用，希望的是使用与常用的hCMV启动子几乎没有或没有序列同一性的有效启动子。
因此，仍然需要鉴定有效的启动子，其优选具有短的尺寸并且与hCMV启动子很少至没有序列同一性，用于例如质粒、病毒载体和细胞系中。
发明内容
本发明提供了重组核酸分子，这些重组核酸分子包含夜猴疱疹病毒1型(AoHV-1启动子)的主要立即早期启动子区域，和载体(包括例如质粒载体、病毒载体)，重组病毒以及重组细胞系，这些重组细胞系包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。本发明还提供了包含AoHV-1启动子的重组核酸分子，该AoHV-1启动子可操作地连接至调控序列，这些调控序列可用于调节自AoHV-1启动子的转录。
本文所附独立权利要求和从属权利要求分别限定了一般和优选的实施例，为了简洁起见，将其通过引用并入本文。从下面结合附图的详细描述中，本发明的不同方面的其他优选的实施例、特征和优点将变得明显。
在一个实施例中，本发明提供了AoHV-1启动子，其中该AoHV-1启动子可操作地连接至转基因，用于表达具有质粒载体、病毒载体或重组病毒的转基因，或在包含该AoHV-1启动子的宿主细胞的基因组中表达转基因。
在某些实施例中，本发明提供了包含AoHV-1启动子的质粒载体，其中该质粒载体包含少于1kb的AoHV-1DNA。
在某些实施例中，本发明提供了表达盒，该表达盒包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子，其中转基因与该AoHV-1启动子是异源的，例如，其中该转基因不可操作地连接至自然界中的AoHV-1启动子和/或该转基因并非源自AoHV-1。该表达盒可以例如整合到质粒、载体、病毒基因组、细胞系等中。本发明还提供了制备此类表达盒的方法，该方法包括通过重组手段或通过核酸合成构建该表达盒。本发明还提供了表达转基因的方法，该方法包括从本发明的表达盒(例如，在重组细胞系中)表达该转基因。
在某些实施例中，本发明提供了包含AoHV-1启动子的重组细胞系，其中该AoHV-1启动子可操作地连接至转基因。在某些实施例中，可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子可以存在于细胞系中，该细胞系体现在例如用于从中表达该转基因的质粒载体、病毒载体或重组病毒中。在某些实施例中，将可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子整合到该重组细胞系的基因组中，以从中表达该转基因。在某些实施例中，该转基因被整合到细胞系的基因组中并编码四环素阻遏(TetR)蛋白。在其某些实施例中，所述细胞系是PER.C6细胞系。
在另一个实施例中，本发明还提供了用于在细胞中表达转基因的方法，该方法包括向细胞提供重组载体，该重组载体包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。
在某些实施例中，本发明还提供了用于生产目的蛋白的方法，其中该AoHV-1启动子可操作地连接至编码目的蛋白的转基因，该方法包括提供包含AoHV-1蛋白的细胞，该AoHV-1蛋白可操作地连接至编码目的蛋白的核酸序列，并且从该细胞表达目的蛋白。在某些实施例中，该方法进一步包括例如，从细胞或从培养基或从细胞和培养基收获目的蛋白。在某些实施例中，该方法进一步包括纯化目的蛋白。优选地，该目的蛋白是不由自然界中的夜猴疱疹病毒1型编码的蛋白质，即它是异源蛋白。
在某些实施例中，本发明提供了可操作地连接至调控序列的AoHV-1启动子，这些调控序列可用于调节自AoHV-1启动子的转录。在其某些实施例中，该AoHV-1启动子可以例如通过阻遏物与阻遏物结合序列(该阻遏物结合序列已经可操作地连接至AoHV-1启动子)的结合来阻遏。在某些实施例中，该AoHV-1启动子可以通过去除阻遏物或通过提供诱导信号或诱导剂来诱导。
在某些实施例中，本发明提供了可操作地连接至一个或多个四环素操纵基因序列(tetO位点)的AoHV-1启动子，使得可以可逆地控制表达。
在另一个实施例中，本发明还提供了生产包含该AoHV-1启动子的重组病毒的方法，该方法包括：制备如下构建体，该构建体包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子，并将所述构建体并入重组病毒的基因组中。
在本发明的某些实施例中，该AoHV-1启动子可操作地连接至编码目的蛋白的转基因，其中该目的蛋白是治疗蛋白或抗原。
在某些实施例中，包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的病毒和病毒载体是重组腺病毒(rAd)和rAd载体。
在某些实施例中，本发明涉及包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的rAd和rAd载体，并且涉及制备和/或使用这些rAd和rAd载体的方法，其中这些rAd和rAd载体包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。
在某些实施例中，本发明的重组腺病毒在E1区域具有缺失，并且在某些实施例中，包含可操作地连接至该E1区域中的转基因的AoHV-1启动子。可替代地，也可以使用重组腺病毒的其他区域。例如，包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的表达盒也可以置于E3区域中，或者置于基因组的右末端，在重组腺病毒的E4区域和右ITR之间。
在某些实施例中，根据本发明的rAd载体在病毒复制必需的腺病毒基因组的E1区域(例如，E1a区域和/或E1b区域)的至少一个必需基因功能上是有缺陷的。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，该载体在E1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述E1缺陷的，或E1-、E3-缺陷的腺病毒载体可以进一步在E4区域的至少一个必需基因和/或E2区域(例如，E2A区域和/或E2B区域)的至少一个必需基因上是有缺陷的。
在另一个实施例中，本发明还提供了包含重组腺病毒的基因组的重组DNA分子，该重组腺病毒包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。
附图说明
图1：在HEK293细胞中用瞬时转染评估的从不同启动子构建体的荧光素酶的表达。通过测量SEAP水平，将荧光素酶表达测量为相对光单位(RLU)并校正转染效率。与在hCMV启动子控制下的荧光素酶的阳性对照和未转染细胞的阴性对照相比，显示了所指示的启动子的结果。
图2：用CLC工作平台(CLC workbench)进行的hCMV和短chCMV或hCMV和短AoHV-1之间的序列比对。灰色阴影指示比对序列之间的核苷酸差异。用完整的启动子序列进行比对。然而，图中仅显示了序列比对的区域，因为这些区域与潜在的同源重组事件相关。点划线指示没有比对的区域(空位)。(A)hCMV与短chCMV的比对区域。(B)hCMV与短AoHV-1的比对区域。
图3：测试“7xTetO-AoHV-1”作为tTA响应启动子用于调控表达的适用性。用质粒瞬时转染Vero细胞，其中Gaussia荧光素酶表达在7xTetO-AoHV-1(7xTetO位于核心AoHV-1启动子的上游)的控制下，其产生最小的启动子活性。为了诱导启动子活性，共转染表达四环素反式激活蛋白(tTA)的质粒。将多西环素添加至用tTA质粒共转染的细胞的培养基中以关闭启动子活性。将劳氏肉瘤病毒启动子(RSV)用作阳性对照。
图4：测试短AoHV-1的TetR阻遏型形式，用于目的基因(GOI)在细胞中的调控表达。(A)比较启动子hCMV、hPGK和短AoHV-1的效力以诱导瞬时质粒转染中的eGFP表达。显示了由Evos荧光显微镜拍摄的eGFP表达的照片。(B)设计和测试短AoHV-1的调控形式。在PER.C6-hCMV.TetR细胞中通过AoHV.2xtetO或标准hCMV启动子(pCDNA)瞬时表达eGFP。(C)在稳定的细胞系中通过AoHV.2xtetO调控表达GOI。显示了在蛋白质印迹测定中GOI的表达。泳道的标记：泳道1：克隆11，泳道2：克隆11+多西环素，泳道3：克隆73，泳道4：克隆73+多西环素，泳道5：阳性表达对照，用在AoHV-1启动子控制下表达GOI的质粒瞬时转染的细胞，泳道6：阴性对照(未转染的PER.C6细胞)。
图5：(A)Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL载体基因组的示意性图示。空心箭头指示两个转基因盒插入：CMV或CMVtetO启动子驱动的Gluc表达盒被插入E1区域缺失的位置，AoHV-1启动子驱动的RFL表达盒被插入E4区域和RITR之间。黑色箭头代表驱动转基因盒的启动子。灰色箭头代表编码序列。GLuc，Gaussia荧光素酶。RFL，红色萤火虫萤光素酶。LITR和RITR，左侧反向末端重复和右侧反向末端重复。CMV，人巨细胞病毒主要立即早期启动子(hCMV MIEp)。CMVtetO，配备有两个四环素操纵基因(TetO)序列(用于TetR阻遏型表达)的hCMV MIEp。AoHV-1P，AoHV-1短启动子。SV40pA，SV40病毒衍生的聚腺苷酸化信号。BGHpA，牛生长激素基因衍生的聚腺苷酸化信号。E4，Ad26的E4区域。(B)通过同一性PCR分析Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL纯化批次的转基因(TG)盒完整性。进行PCR以扩增插入E1中的TG盒(“E1PCR”)和位于E4和RITR之间的TG盒(“E4PCR1”和“E4PCR2”)。插图指示了不同PCR的预期PCR产物尺寸。L，1Kb Plus DNA Ladder(英杰公司(Invitrogen))，P1＝pAdApt26(Abbink等人,2007)，具有“空”表达盒(即，由hCMV启动子和SV40聚腺苷酸化信号组成，但不具有TG编码序列)。P2，pWE.Ad26.dE3.5orf6(Abbink等人,2007)，在E4区域和RITR之间没有转基因盒插入。W，没有DNA模板控制。V1，Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL病毒DNA。V2，Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL病毒DNA。(C和D)通过Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL纯化批次分析转基因表达。接种于96孔板中的A549细胞以指定的病毒颗粒与细胞的比率(VP/细胞)一式三份感染，并且在感染后2天收获的样品中检测到GLuc和RFL活性。RLU，相对光单位。Ad26.CMV(空)，不携带GLuc或RFL编码序列的匹配对照Ad26病毒载体。*，观察到用Ad26.CMVtetO_Gluc.AoHV1_RFL以10VP/细胞感染的为187RLU的一个离群值被去除(这种一式三份感染的另外两个值是14和26RLU)。
图6：(A)pC_AoHV_TetR的质粒图谱。灰色箭头指示四环素阻遏(TetR)蛋白、新霉素磷酸转移酶II和β-内酰胺酶的编码序列；黑色箭头指示其他遗传元件。空心箭头指示被插入pcDNA2004Neo(-)以构建pC_AoHV_TetR的合成序列。AoHV-1P，AoHV-1短启动子。TetR，密码子优化的四环素阻遏物编码序列。BGH pA，牛生长激素基因衍生的聚腺苷酸化信号。SV40P，SV40病毒衍生的启动子。pUC ori，pUC复制原点。bla P，用于驱动β-内酰胺酶表达的启动子。(B)通过在第20、40和60代的流式细胞术细胞内染色延长传代时，通过PER.C6/TetR细胞克隆的TetR表达的稳定性。显示了在每个时间点对每个克隆(具有和不具有选择的情况下的生长)观察到的TetR阳性级分。PER.C6，不具有TetR构建体的对照PER.C6细胞系，仅在不具有抗生素选择的情况下生长。(C)延长传代后的TetR功能性测定(60次群体倍增)。用Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL感染PER.C6/TetR细胞克隆，之后确定GLuc和RFL活性。每次感染复制时，CMV或CMVtetO启动子驱动的GLuc活性通过对于相同样品观察到的AoHV-1启动子驱动的RFL活性进行标准化。所得的标准化Gluc值相对于TetR阴性对照细胞系(PER.C6)发现的那些在该图中表示。+，在具有抗生素选择的情况下生长的细胞。-，在不具有抗生素选择的情况下生长的细胞。Ctrl(+)，先前建立的TetR阳性对照细胞系，其衍生自通过用pCDNA6/TR(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，目录号：V102520)(该质粒包含在人CMV启动子控制下的TetR序列)稳定转染的PER.C6。
图7：(A)AoHV-1启动子的截短形式和拉长形式的设计。描绘了从左至右对应于基因库登录号NC_016447的核苷酸编号157077至154304的夜猴疱疹病毒1型基因组的2774-bp延伸的图示。标记的条指示本文设计和测试的不同AoHV-1启动子变体。序列v00和v06分别代表具有和不具有其天然AvrII位点的AoHV-1短启动子。D和A，分别是预测的剪接供体和受体位点。TATA，假定的TATA盒。Inr，假定的启始序列(含有预测的转录起始位点)。(B)在瞬时转染的PER.C6细胞中不同形式的AoHV-1启动子的效力测试结果。显示了相对于v00AoHV-1短启动子的两个实验的平均结果。
具体实施方式
本文描述了与鉴定、设计和测试衍生自夜猴疱疹病毒1型(AoHV-1启动子)的立即早期增强子/启动子区域的新启动子有关的实验结果。结果显示，基于用不同细胞系中的质粒载体瞬时转染和用包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的病毒的病毒感染，AoHV-1启动子提供了与其可操作地连接的转基因的有效表达。AoHV-1启动子也是一种相对较短的启动子，因此它适用于许多其中需要考虑尺寸限制的应用。因此，本发明的AoHV-1启动子适用于如下应用，其中有效表达是优先重点和/或其中AoHV-1启动子的小尺寸是有用的，例如与其他更长的启动子相比，在载体或病毒基因组的有限尺寸内为转基因留下更多的空间。此外，由于与其他常用启动子(像hCMV)的低序列同源性，AoHV-1启动子也可用于如下应用，其中存在对同时一起使用的两个启动子之间的序列同一性的担忧，例如，当从相同病毒载体表达两种不同的转基因时或当产生具有生产细胞系的病毒(这些病毒也含有hCMV启动子序列)时。AoHV-1启动子也适用于与调控序列一起使用，这些调控序列可用于调节自AoHV-1启动子的转录。
因此，本发明涉及包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的重组核酸分子。在某些实施例中，本发明涉及使用包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的载体和病毒，用于在细胞中表达该转基因。在特定的非限制性实施例中，本发明的载体可包含质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人类人工染色体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体、疱疹病毒载体、EB病毒(Epstein-Barr virus)载体、牛痘病毒载体、或者其组合或嵌合体。本领域普通技术人员将认识到，本发明的AoHV-1启动子也将用于在基因表达和基因转移领域中采用的其他载体，尤其是其中有效表达是重要的并且表达盒的总体尺寸是相关因素的那些。
本发明还涉及使用载体用于使宿主细胞生产异源蛋白或其他目的表达产物。例如，包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的质粒载体可用于在细胞中表达异源蛋白。此类质粒载体可以是DNA序列，该DNA序列含有例如，(1)AoHV-1启动子；(2)用于启动翻译的转基因的科扎克(Kozak)共有序列；(3)转基因的编码区，即编码所希望的多肽的核苷酸的序列；(4)转基因的终止序列(当读取转基因的完整编码时允许翻译终止)；聚腺苷酸化信号、和/或间插序列以及本领域普通技术人员已知的其他元件，以从某些载体表达转基因；和(6)任选地，允许整个载体一旦进入细胞内就被复制的复制原点(如果载体不直接插入基因组中)。可以将载体引入宿主细胞，例如通过转染、电穿孔或感染，并且可以培养宿主细胞以表达转基因。
在某些实施例中，本发明的质粒载体还包括一个或多个多克隆位点(MCS)(也称为多接头)，这些多克隆位点是含有若干个限制性位点的DNA的短片段。MCS内的这些限制性位点通常是独特的，仅在给定质粒内发生一次。MCS通常在涉及分子克隆或亚克隆的程序中使用，并且在生物技术、生物工程和分子遗传学中非常有用，因为它们允许将一个片段的DNA或若干个片段的DNA插入至MCS区域，例如，插入表达盒，该表达盒包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子，该转基因编码目的蛋白用于在细胞中表达。
本发明还提供了通过本文描述的载体转化的细胞和包含AoHV-1启动子的重组细胞系，其中该AoHV-1启动子可操作地连接至转基因。在此上下文中，转化是指将异源核酸材料引入至细胞并在细胞内表达的任何过程。因此，如本文所使用的转化包括“瞬时的”和“稳定的”转染程序，包括但不限于通过如下介导的那些：电穿孔、阳离子脂质/DNA复合物、蛋白质/DNA复合物、磷酸钙介导的胞饮作用、病毒载体等，其中引入至宿主细胞的核酸存在于染色体外或其中转染的核酸已被整合到宿主细胞的基因组中。转染程序还可包括编码选择标记(例如，对抗生素的抗性)的第二核酸，这使得能够对细胞进行阳性选择，从而维持含有AoHV-1启动子的转染的核酸。因此，可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子可以存在于细胞系中，该细胞系体现在例如用于从中表达该转基因的质粒载体、病毒载体和重组病毒中。在某些实施例中，可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子可以被整合到该重组细胞系的基因组中，以从中表达该转基因。
本发明还提供了用于在细胞中表达转基因的方法，该转基因包含，例如，编码目的蛋白的转基因或包含非编码序列(例如，调控RNA，如微小RNA、短干扰RNA(siRNA)或反义RNA等)的转基因，该方法包括向细胞提供载体，该载体包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。特别地，在某些实施例中，本发明提供了用于在细胞中生产目的表达产物的方法，其中该AoHV-1启动子可操作地连接至编码目的表达产物的转基因，该方法包括提供包含AoHV-1启动子的细胞，该AoHV-1启动子可操作地连接至编码目的表达产物的核酸序列，并且在该细胞中表达该目的表达产物。在某些实施例中，该表达产物是蛋白质。在某些实施例中，该表达产物是四环素阻遏(TetR)蛋白。该方法可进一步包括(例如，从细胞、或从培养基、或从细胞和培养基)收获目的表达产物(例如蛋白质)。该方法还可包括用于多种目的(包括例如诊断目的、治疗目的或预防目的，研究等)纯化蛋白质。此外，纯化的目的蛋白可任选地配制到药物组合物中。治疗性蛋白可包括例如，抗凝血剂、凝血因子、生长因子、激素、抗体、Fc融合蛋白、骨形态发生蛋白、工程化的蛋白支架、酶以及细胞因子，例如趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子等。
本发明还提供了生产病毒的方法，该方法包括在表达具有繁殖所述病毒功能的基因的细胞中繁殖该病毒，其中所述基因在AoHV-1启动子的控制下，并且其中所述基因编码核酸(例如，调控RNA)或蛋白质(例如，补充病毒复制周期中的缺陷或病毒其他功能(例如感染)的蛋白质)。病毒可以是野生型病毒，但优选地是重组病毒，例如，具有一种缺陷，这种缺陷使得其是复制缺陷的或感染缺陷的。此外，所述基因可以从染色体外元件或优选地从细胞(然后该细胞可以来自稳定的细胞系)的基因组表达，并且该细胞可在培养基中培养，使得可以收获并任选地纯化病毒，然后用于感染其他细胞，或用于配制在药物组合物中等。
根据本发明的“细胞”或“宿主细胞”可以是其中AoHV-1启动子可以是活性的任何细胞。在某些实施例中，细胞与其正常组织分离，并且例如可以在培养基中培养(体外)。在某些实施例中，根据本发明的细胞或宿主细胞是永生化细胞，例如来自细胞系。在某些实施例中，根据本发明的细胞或宿主细胞是哺乳动物细胞或禽细胞，优选哺乳动物细胞。根据本发明的细胞或宿主细胞的一些非限制性实例是啮齿动物细胞、人细胞、猿猴细胞、狗细胞、鸡细胞等。根据本发明的细胞或宿主细胞的一些非限制性实例是Vero细胞、MDCK细胞、HEK293细胞、PER.C6细胞、CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、杂交瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、A549细胞等。技术人员将认识到，AoHV-1启动子可用于许多不同的细胞中以指导目的表达产物的表达，并且细胞的类型对本发明并不重要。
在某些方面，本发明提供了生产细胞，其中AoHV-1启动子可操作地连接至编码TetR蛋白的核酸序列，优选地其中AoHV-1启动子和编码TetR的序列被整合到生产细胞的基因组中，优选地其中所述细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞，并且在特别优选的实施例中，通过将AoHV-1启动子和编码TetR的序列整合到其基因组中，生产细胞衍生自PER.C6细胞(参见例如，US 5,994,128)。因此，本发明还提供了包含整合到所述细胞基因组中的转基因的PER.C6细胞，其中该转基因包含核酸，该核酸包含可操作地连接至编码TetR的序列的AoHV-1启动子。在其非限制性实施例中，该转基因具有如SEQ ID NO:20所示的序列。此类细胞因此表达TetR，并且可以例如用于生产重组腺病毒，该重组腺病毒在可以被TetR调控的启动子(例如，CMV或可操作地连接至一个或多个tetO位点的其他启动子)的控制下编码目的表达产物，如果由腺病毒编码的目的表达产物当在腺病毒繁殖期间产生时对生产细胞是有毒的或者会降低重组腺病毒的稳定性或产量，这可能是特别有利的。TetR可以在此类系统中在生产细胞生产期间阻遏tetO调控的启动子(例如，tetO调节的hCMV启动子)，使得在重组腺病毒的繁殖和生产期间不生产或仅以非常低的水平生产目的表达产物，这导致在生产期间重组腺病毒的产量和/或稳定性提高。在一方面，本发明还提供了一种组合，包含：(i)生产细胞，其包含可操作地连接至编码TetR的序列的AoHV-1启动子，和(ii)重组腺病毒，其包含可操作地连接至启动子的编码目的表达产物的序列，该启动子可操作地连接至一个或多个tetO位点。
本发明还提供了用载体和病毒治疗遗传性、代谢性或获得性疾病的方法，这些载体和病毒包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。该方法包括使细胞与足量的本发明的载体或病毒接触，这些载体或病毒包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子，其中转化细胞使得该转基因在细胞中表达。可以在体外、离体或体内转化细胞。
如果它是DNA载体(如质粒载体)或病毒载体(如腺病毒载体)，载体的一个重要方面是这些载体适应所希望的转基因序列的能力。这种能力可能受到载体的尺寸限制的约束，如果超过某种尺寸限制，这种能力可能例如变得不稳定或甚至不可能产生。因此，除了此类启动子应该具有的功能能力，启动子占据的空间是在设计新的载体时的重要考虑因素。即时AoHV-1启动子具有其相对较短的优点，这意味着在载体的一定尺寸限制下，为转基因剩余空间更多，例如，与较大尺寸的其他启动子相比，如果转基因是免疫原则允许包括更多表位，或允许更大的蛋白质的表达。本发明的AoHV-1启动子的另一个优点是将它与系统中的hCMV启动子组合的可能性，例如，一个核酸分子(如载体)上的两个启动子，或者细胞系中的一个启动子，以及核酸分子(如存在于细胞系中的载体)上的另一个启动子，由于AoHV-1启动子和hCMV启动子之间的低序列同源性，启动子序列之间具有非常有限的至没有同源重组的风险。
如本文所使用的，如涉及hCMV启动子序列的术语“低序列同源性”和“低序列同一性”是指与hCMV启动子具有小于约50％同一性的启动子序列，并且优选与hCMV启动子具有小于约40％的同一性。另外，具有“低序列同源性”和“低序列同一性”的启动子序列优选地也不具有长于约15个核酸的连续同一比对的延伸，或者更优选地不具有长于约14个核酸的同一比对的延伸。在某些优选的实施例中，该启动子是AoHV-1短启动子(SEQ ID NO:1或SEQID NO:30)，并且与hCMV启动子的同一性是36％，并且不具有长于约14个核酸的连续同一比对的延伸。在其他优选的实施例中，该启动子包含具有启动子活性的SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:30的片段，例如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26。如本文所使用的，比对是指本领域技术人员熟知的方法，例如，使用算法(如BLAST(基本局部比对检索工具))来比对和比较不同的核苷酸或蛋白质序列(Altschul,Gish,Miller,Myers,和Lipman,1990)。
本发明还提供了通过包含hCMV启动子和AoHV-1启动子的载体或病毒转化的细胞或转基因生物体，其中hCMV启动子和AoHV-1启动子可操作地连接至转基因，使得两种转基因在细胞或转基因生物体中表达。hCMV启动子和AoHV-1启动子可以存在于单独的分子上(例如，质粒或病毒中的一个启动子和细胞基因组中的另一个启动子，或不同质粒上的两个启动子，或细胞基因组中的两个启动子)，或者两种启动子可以存在于单个分子中(例如，在基因组的一个染色体中，或在一个质粒中，或在病毒的一个基因组中)。
本发明还提供了生产重组病毒的方法，其中当病毒被引入至靶细胞时有效表达转基因，该方法包括：制备如下构建体，该构建体包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子，并将所述构建体并入重组病毒中，然后将载体引入至细胞，例如，通过用病毒进行感染。这种构建体的制备涵盖使用如技术人员已知的并且在重组载体或重组病毒技术领域中常规进行的熟知的标准分子克隆方法(参见例如(Holterman等人,2004；Lemckert等人,2006；Vogels等人,2003)；Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:ALaboratoryManual[分子克隆：实验室手册],第二版,1989；Current Protocols in MolecularBiology[现行分子生物学方案],Ausubel FM等人编辑,1987；the series Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)[酶学方法系列(学术出版社有限公司)]；PCR2:APractical Approach[PCR2：实践方法],MacPherson MJ,Hams BD,Taylor GR编辑,1995)，并且在本文中举例说明。AoHV-1启动子具有如上所述的特征，并且鉴于本披露，可以通过常规方法(如PCR或核酸从头合成)获得。为方便起见，技术人员可以通过克隆到更小的片段中来操纵病毒基因组，例如，腺病毒的基因组左边部分的第一部分直到E1区域，以便于操纵和引入质粒形式的转基因以及与第一部分重组时可以产生完整的腺病毒基因组的基因组的其余部分的第二、较大的部分(参见例如WO 99/55132)。
“异源核酸”或“异源基因”(在本文中也称为“转基因”或“目的基因”)(例如，在本发明的载体或病毒或细胞中)是非天然存在于载体或病毒或细胞中的核酸，或者是不可操作地连接至自然界中的AoHV-1启动子的核酸。例如，通过标准分子生物学技术将其引入至载体或病毒或细胞中。在某些实施例中，它可以编码目的蛋白或其部分。在这种情况下，目的蛋白可以被称为“异源蛋白”，因为它不是由可操作地连接至自然界中的AoHV-1启动子的序列天然编码。例如，可以将转基因克隆至质粒载体或克隆至腺病毒载体的缺失的E1或E3区域。在本发明的一些实施例中，将具有可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的表达盒置于腺病毒基因组的E1区域中。在本发明的一些实施例中，将具有可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的表达盒置于腺病毒基因组的E3区域中。在本发明的一些实施例中，将具有可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的表达盒置于腺病毒基因组的E4区域和右ITR之间。在其他实施例中，具有可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的表达盒存在于质粒载体中。在其他实施例中，具有可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的表达盒被整合到细胞的基因组中。此类细胞或细胞系可用于重组表达转基因，例如，通过在其中启动子具有活性(如果使用启动子的非调控形式，即如果没有将调控元件添加至该启动子，则该表达将在培养时自动发生)并驱动转基因表达的条件下培养细胞。
如本文所使用的，术语“启动子”或“启动子区域”或“启动子元件”可互换地使用，并且是指控制与其有效地连接的核酸序列的转录的核酸序列片段，典型地但不限于DNA。启动子区域包括足以用于RNA聚合酶识别、结合和转录启动的特异性序列。此外，启动子区域可以任选地包括调节RNA聚合酶的这种识别、结合和转录启动活性的序列。这些序列可以是顺式作用的或可能对反式作用因子有响应。此外，启动子可以是组成型或调控型的，这取决于调控的性质。
技术人员将意识到启动子是由核酸序列延伸构建的，并且通常在核酸序列的那些延伸中包含元件或功能单位，如转录起始位点、RNA聚合酶的结合位点、一般转录因子结合位点(如TATA盒)、特定转录因子结合位点等。还可以存在另外的调控序列，如增强子，并且有时在启动子序列末端存在内含子。此类功能单元可以彼此直接相邻，但也可以通过在启动子功能中不起直接作用的核酸的延伸分开。技术人员可以参考用于测试核酸的延伸中的核苷酸是否与启动子功能相关的本文的实例，以及参考测试通过标准分子生物学方法将核苷酸去除或添加至给定的启动子序列的效果，以例如使其长度最小化的同时保留启动子活性或优化活性。如果这些启动子预期在同一细胞中同时存在或使用，也可将突变引入至该启动子以减少(延伸)与其他启动子(例如hCMV)的同一性。
如本文所使用的，术语“增强子”是指可以被蛋白质(激活蛋白)结合以刺激或增强一种基因或若干种基因的转录的调控DNA序列，例如50-1500bp。这些激活蛋白(又称转录因子)与介体复合物相互作用并募集聚合酶II和一般转录因子，然后开始转录基因。增强子通常是顺式作用的，但可以位于基因或它们调控的基因的起始位点的上游或下游。此外，增强子可以是向前或向后方向，并且不需要位于转录启始位点附近以影响转录，因为已发现一些增强子位于起始位点上游或下游的数十万个碱基对。内含子中也可以发现增强子。
如本领域惯例，本文中的序列以5’至3’方向提供。还应注意，术语‘上游’和‘下游’是关于本领域常用的转录方向。例如，按照惯例，术语上游和下游涉及发生RNA转录的5'至3'方向。上游朝向RNA分子的5'末端，并且下游朝向3'末端。当考虑双链DNA时，上游朝向所讨论的基因的编码链的5'末端，并且下游朝向3'末端。由于DNA的反平行性质，这意味着模板链的3'末端是基因的上游，并且5'末端是下游。
根据本发明的AoHV-1启动子优选地含有TATA盒序列，如位于SEQ ID NO:25中的位置251-258的序列。如本文所定义的，“TATA盒”是可以被TATA结合蛋白(TBP)结合并且具有共有序列TATAWAWR(其中W是A或T，并且R是A或G)的DNA序列。它通常位于转录起始位点上游的约25-35个碱基对。在某些实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含TATA盒序列TATATAAG(SEQ ID NO:25中的位置251-258)。技术人员将理解，AoHV-1启动子的所述TATA盒序列(即TATATAAG)可以被相似的经典TATA盒序列取代，即对应于共有序列TATAWAWR(其中W是A或T，并且R是A或G)的序列，没有预期的启动子活性的显著降低。
根据本发明的AoHV-1启动子还可含有(假定的)启始元件(Inr)，如位于SEQ IDNO:25(序列：CCATTCG)中的位置280-286。在存在Inr的实施例中，通过主要附着于Inr序列YYANWYY(其中Y是C或T；N是A、C、G或T；以及W是A或T)的另一序列取代AoHV-1启动子的所述Inr序列(即CCATTCG)预计不会显著影响所述启动子的活性。
在存在假定的Inr的某些实施例中，AoHV-1启动子包含对应于SEQ ID NO:25中的位置251-258的TATA盒，以及高达约nt 286的序列。不希望被理论所束缚，对于本发明的AoHV-1启动子的某些实施例，包含TATA盒和Inr两者可能是有益的，其中Inr序列位于TATA盒的第一个nt的下游约25-40，例如，约29-36nt。
同样在不存在Inr的实施例中，优选在TATA盒下游和有效连接的目的基因的编码序列的上游包括至少约25-35个碱基对。本申请包括AoHV-1启动子的至少一个实例，该AoHV-1启动子在TATA盒的第一个nt的下游约29-35nt的天然位置处不再包含共有Inr序列，然而此类启动子仍然具有活性，这证明在该位置处的Inr序列对功能启动子不是必需的。
根据本发明的AoHV-1启动子在本文中定义为如下序列，该序列具有启动子活性并且包含与SEQ ID NO:25的至少50、100、150、200、250、300或350个核苷酸的片段具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或是100％同一的序列。优选地，所述片段包括至少50nt的片段，该片段与SEQ ID NO:25的nt 237-286具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或是100％同一的，并且优选地，所述至少50nt包括在对应于SEQ ID NO:25中的约nt251-258的位置处的序列TATAWAWR(TATA盒共有序列)。
因此，在某些优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的nt 237-286具有至少80％同一性的序列。
本发明的AoHV-1启动子的3’截短可能在SEQ ID NO:25的约nt 286的下游进行(即，假定的Inr的下游，其含有预期的转录起始位点，预期在该序列中处于核苷酸282处)，对启动子活性没有强烈影响，而去除假定的Inr/转录起始位点或尤其是去除所述假定的Inr/转录起始位点和所述TATA盒二者的更大的3’截短预期会导致启动子活性的显著降低。事实上，显示在核苷酸399下游(即，仅包括假定的Inr下游的1个AoHV-1核苷酸，参考SEQ IDNO:30，对应于SEQ ID NO:25中的核苷酸287)不包含AoHV-1序列的3’截短形式的AoHV-1短启动子(SEQ ID NO:30)仍然具有作为启动子的活性。
本文证明，在其TATA盒上游仅包含120个核苷酸的相对较短的启动子片段(SEQ IDNO:26)仍然具有显著的启动子活性，其可通过添加一些另外的上游序列(如例如在SEQ IDNO:25中)而进一步增加。相比之下，通过包含某些更下游的序列(如例如在SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29中)在其3'末端(即，假定的Inr/转录起始位点的下游)延伸AoHV-1短启动子(SEQ ID NO:30)似乎没有添加太多活性。
在优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸201至286是至少95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
在更优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸187至286是至少95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
在更优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸137至286是至少95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
在更优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸131至286是至少95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
在更优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸87至286是至少95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
在更优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸37至286是至少95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
在更优选的实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸1至286是至少95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
在某些实施例中，本发明的AoHV-1启动子优选地包含如下序列，该序列与SEQ IDNO:26(再次优选地包含至少Inr和包括TATA盒的其上游的序列，以及更上游的序列，例如，SEQ ID NO:25的至少约nt 87-286)的至少200个核苷酸具有至少98％同一性，更优选地包含如下核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少99％同一性或是100％同一的，仍更优选地包含如下核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:25具有至少99％同一性或是100％同一的。在某些实施例中，AoHV-1启动子包含240与1500个核苷酸之间，优选240与1000个核苷酸之间，更优选240与500个核苷酸之间的片段，该片段与SEQ ID NO:32的片段是至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的，其中所述SEQ ID NO:32的片段包括如下片段，该片段与SEQ ID NO:25的核苷酸201至286(其对应于SEQ ID NO:32的核苷酸1359至1444)是至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的或是100％同一的。
本发明提供了具有相对较小尺寸的有效AoHV-1启动子，该AoHV-1启动子在携带转基因的载体的尺寸限制的情况下是非常有利的(即，可以适应更大的转基因和/或载体可以保持更稳定)。因此，本发明的AoHV-1启动子的长度优选小于2000个核苷酸(2kb)，优选小于1kb，更优选小于0.8kb。在某些优选的实施例中，AoHV-1启动子的长度小于700、小于650、小于600、小于550、小于500个核苷酸。在某些优选的实施例中，AoHV-1启动子的长度为至少200、至少240、至少250、至少300、至少350、至少400个核苷酸。在某些优选的实施例中，AoHV-1启动子的长度为200至500，例如，240至485个核苷酸。如本文所示，尽管具有一个相对较短的序列，这种新颖的AoHV-1启动子令人惊讶地能够指导与其可操作地连接的转基因的有效表达。
本领域技术人员将认识到，突变可以在提供的序列中进行并且所得的启动子可以通过常规方法针对启动子活性进行测试。序列的变体也可以存在于自然界中，例如，在病毒的不同分离物中，因此此类变体可能在核苷酸序列上具有一些差异但保持相同的功能性。典型地，与所指示的启动子序列具有至少90％同一性的序列将仍具有功能活性，并且因此将被认为是AoHV-1启动子。因此，本发明的AoHV-1启动子优选地包含如下序列，该序列与本文提供的优选AoHV-1启动子序列(如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:25或SEQ IDNO:26中的任一个)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性，或是100％同一的。技术人员将意识到，所提供的启动子序列的不同部分的序列长度可以在一定程度上变化，并且可以获得基本相似的结果。测试本文中举例说明的启动子序列的片段或突变序列是否仍具有启动子活性，本领域技术人员可以在没有过度负担的情况下用本文披露的信息进行测试。
本发明的AoHV-1启动子的优选实施例是包含SEQ ID NO:26的AoHV-1启动子。本发明的AoHV-1启动子优选地与SEQ ID NO:26或者与其至少50、100、150或200个核苷酸的片段具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在某些优选的实施例中，AoHV-1启动子与SEQ ID NO:26或者与其至少50、100、150或200个核苷酸的片段是100％同一的。
本发明的另外的优选AoHV-1启动子是包含SEQ ID NO:25的AoHV-1启动子。在某些实施例中，本发明的AoHV-1启动子优选地与SEQ ID NO:25或者与其至少50、100、150、200、250、300、或350个核苷酸的片段具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性，或是100％同一的。在某些优选的实施例中，AoHV-1启动子与SEQ IDNO:25或者与其至少50、100、150、200、250、300、或350个核苷酸的片段是100％同一的。
在另一个实施例中，本发明的优选AoHV-1启动子是包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:30的AoHV-1短启动子。在某些实施例中，本发明的AoHV-1启动子优选地与SEQ ID NO:1或者与其至少50、100、150、200、250、300、350或400个核苷酸的片段具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在某些优选的实施例中，AoHV-1启动子与SEQ ID NO:1是100％同一的，或者与SEQ ID NO:30或与至少50、100、150、200、250、300、350或400个核苷酸的这些中之一的片段是100％同一的。
在其他实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或是100％同一的。
在其他实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或是100％同一的。
在其他实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:27具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或是100％同一的。
在其他实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或是100％同一的。
在其他实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，或是100％同一的。
在某些其他实施例中，本发明的AoHV-1启动子包含核心启动子(SEQ ID NO:31)(其与一个或多个操纵基因序列和/或增强子序列可操作地连接以调节转录)(例如，tetO序列、来自cumate操纵子的操纵基因序列)、来自天然存在的增强子-启动子对(像SV40或hCMV)的增强子(Foecking和Hofstetter,1986)、合成增强子(Schlabach,Hu,Li,和Elledge,2010)、或本领域技术人员熟知的其他调控序列。如本文所使用的，术语“核心启动子”旨在意指启动子的最小功能单元，该启动子自身具有非常低的启动子活性，但当核心启动子与一个或多个调控序列组合以调节自该核心启动子的转录时，该启动子可驱动转基因的有效表达，例如，可以被四环素控制的反式激活蛋白(tTA)结合的tetO序列。参见例如(Smale,2001)，关于核心启动子序列的讨论。
可操作地连接至AoHV-1启动子的转基因可以被有效表达。如本文所使用的，“被有效表达”或“有效表达”意指从AoHV-1启动子的表达(如例如通过不同蛋白质检测技术(如蛋白质印迹法、FACS分析、或使用发光或荧光的其他测定)之一所测量的)是从hCMV启动子(具有SEQ ID NO:4)的表达的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或优选地约100％、或更多。值得注意的是，与其他常用的启动子(如hPGK、UBI C或RSV LTR启动子)相比，hCMV启动子更强(Powell,Rivera-Soto,和Gray,2015)。hCMV启动子衍生自人巨细胞病毒的主要立即早期(mIE)区域，并且经常用于疫苗和基因疗法载体中的有效基因表达。例如，hCMV启动子序列可以衍生自hCMV AD169菌株mIE基因座(X03922)，并且包括NF1结合位点、增强子区域、TATA盒和第一外显子的一部分。已知其他hCMV启动子序列可以更短(例如仅含有增强子和启动子区域并且缺乏NF1结合位点)或更长(例如包括另外的细胞因子结合位点和第一内含子序列)。发现这些长度不同的hCMV启动子都是有效的普遍活性的启动子。截短的hCMV启动子的实例披露于US 7,407,801中，其通过引用并入本文。如本文所使用的，“hCMV启动子”包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:4的nt 578-736，优选地与nt 564-736具有至少80％，优选地至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在我们实验室(未显示)的实验中显示了SEQ ID NO:4的nt 578-736的片段具有启动子活性，并且已经显示与SEQ ID NO:4的nt 564-736具有一些错配的序列由其他人提供了良好表达水平(例如，US 7,407,801B2，其中的SEQ ID NO:1)。在某些实施例中，hCMV启动子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。对于如本文所述的表达水平的比较，hCMV启动子序列是SEQ ID NO:4。例如，从载体中本发明的AoHV-1启动子的表达水平优选地是从载体(其中转基因在SEQ ID NO:4的hCMV启动子的控制下)的表达水平的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或优选地约100％、或更多。此外，从rAd在hCMV启动子的控制下表达抗原可知，该表达足以产生显著的T细胞和B细胞免疫应答。相似地，预期从rAd通过本发明的AoHV-1启动子表达的转基因的表达对该转基因产生显著的T细胞和B细胞免疫应答。例如，如果该转基因在被给予至受试者时编码抗原以引发免疫应答，则预期该转基因的有效表达将产生针对该抗原的可测量的免疫应答。
针对用于本披露中的数值的术语“约”是指±10％的值。
术语“编码序列”、“序列编码”或“编码”在本文中可互换地使用，并且是指核酸序列，该核酸序列当被可操作地连接至适当的调控序列上时，将在体外或体内被转录(DNA)和翻译(mRNA)成多肽。
聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素polyA信号(U.S.5,122,458)或SV40polyA信号可以存在于这些转基因后面。
还可以将另外的调控序列添加至包含本发明的AoHV-1启动子的构建体中。术语“调控序列”与“调控元件”在本文中可互换地使用，并且是指核酸片段，典型地但不限于DNA，该核酸片段调节与其有效地连接的核酸序列的转录，并且因此作为转录调节子。这种表达的调节在蛋白质表达对宿主细胞是有毒的情况下尤其有用，例如，在表达对宿主细胞是致死的或对细胞生长有负面影响和/或减少或消除蛋白质生产的情况下。此外，在表达导致载体不稳定性或表达时间是体外或体内进行实验的考虑因素的情况下，表达的调节也是有用的。调控序列通常包含核酸序列，这些核酸序列被转录蛋白和/或转录因子(这些转录因子激活或阻遏转录)的核酸结合结构域识别。例如，调控序列可以包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个等)四环素操纵基因序列(tetO位点)，使得在四环素阻遏蛋白(tetR)存在下表达被抑制，参见例如，WO1999/000510A1。单个tetO序列的实例是CCCTATCAGTGATAGAG(SEQ ID NO:14)。在不存在四环素的情况下，该tetR蛋白能够结合至tetO位点并且阻遏可操作地连接至tetO位点的基因的转录。然而，在四环素的存在下，tetR蛋白中构象变化阻止其结合至操纵基因序列，允许发生可操作地连接的基因的转录。在某些实施例中，本发明的载体或rAd可以任选地包括与AoHV-1启动子有效地连接的一个或多个tetO位点，使得在表达tetR蛋白的生产细胞系中生产的载体中一种或多种转基因的表达被抑制。随后，如果将载体引入至受试者或不表达tetR蛋白的细胞中，那么将不能抑制表达(参见例如，WO 07/073513)。在某些其他实施例中，本发明的载体可以任选地包括cumate基因开关系统，其中表达的调控是通过将阻遏物(CymR)结合至操纵基因位点(CuO)(可操作地连接，例如，通过将其置于启动子的转录起始位点附近)进行介导的(参见例如(Mullick等人,2006))。在其他实施例中，熟知的lac阻遏物系统与本发明的启动子组合，其中一个或多个lac操纵基因位点可操作地连接至启动子，使得lac阻遏蛋白的结合可用于调控表达。
如本文所使用的，术语“阻遏物”是指具有抑制、干扰、延迟和/或阻遏重组表达载体的异源蛋白产物的生产的能力的实体(例如，蛋白质或其他分子)。例如，通过干扰表达载体中(如在表达盒中)处于适当位置的结合位点。阻遏物的实例包括tetR、CymR、lac阻遏物、trp阻遏物、gal阻遏物、λ阻遏物、以及其他本领域中已知的适当的阻遏物。
术语“可操作地连接(operably linked)”或“有效地连接(operatively linked)”在本文中可互换地使用，并且是指核酸序列与核苷酸的调控序列(如启动子、增强子、阻遏物序列、转录和翻译终止位点以及其他信号序列)的功能关系，并且指示两个或更多个DNA片段结合在一起，使得它们为了预期的目的而一致起作用。例如，核酸序列(典型地为DNA)与调控序列或启动子区域的有效连接是指DNA与调控序列或启动子之间的物理和功能关系，使得通过特异性识别、结合和转录该DNA的RNA聚合酶从调控序列或启动子启动此类DNA的转录。为了优化表达和/或体外转录，有可能修饰其所表达的细胞类型中核酸或DNA表达的调控序列。对此类修饰的期望或需要可以根据经验确定。
本发明还提供了用于在细胞中表达转基因的方法，该方法包括向细胞提供重组病毒(例如，重组腺病毒)，该重组病毒包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。向细胞提供重组腺病毒可以通过向受试者给予腺病毒，或通过体外或离体引入(例如感染)腺病毒至细胞中来进行。在某些实施例中，本发明提供了用于(例如，通过向受试者给予重组腺病毒)在细胞中表达转基因的重组腺病毒载体。
本发明还提供了用于在细胞中表达转基因的方法，该方法包括向细胞提供重组病毒(例如，重组腺病毒)，该重组病毒包含AoHV-1启动子，该AoHV-1启动子可操作地连接至编码目的表达产物(如蛋白质)的转基因，例如其中该目的蛋白是治疗蛋白或抗原。
本发明还提供了诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予载体(例如，包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子的重组腺病毒)。本发明还提供了根据本发明的载体或重组腺病毒，用于诱导针对抗原的免疫应答。
在某些实施例中，本发明的AoHV-1启动子可以例如用于驱动抗原的表达，目的是在疫苗应用中产生对该抗原的免疫应答。该转基因的同一性不适合本发明，其适用于例如包含任何转基因的载体或腺病毒。适合的转基因是技术人员熟知的，并且例如可以包括转基因可读框，例如编码具有疗效的多肽的可读框(例如用于基因疗法目的)，或当载体(例如rAd载体)用于疫苗接种目的时希望对其产生免疫应答的多肽。特别优选的异源核酸是编码期望对其产生免疫应答的抗原决定簇的目的基因。典型地，此类抗原决定簇也被称为抗原。当对受试者给予重组载体时，将针对一种或多种抗原产生免疫应答。任何所希望的抗原都可以由载体编码。在根据本发明的典型实施例中，抗原是来自可能引起疾病或病症的生物体的肽、多肽或蛋白质。因此，在另外的优选的实施例中，所述目的异源核酸编码免疫原性(或抗原性)决定簇。更优选地，所述免疫原性决定簇是来自细菌、病毒、酵母或寄生虫的抗原。此类生物体引起的疾病通常被称为“传染病”(并且因此不限于会“感染”的生物体，而且还包括进入宿主并引起疾病的那些)。所谓的“自体抗原”，例如肿瘤抗原也构成了现有技术的一部分，并且可以由根据本发明的重组载体中的异源核酸编码。可作为抗原决定簇(或抗原)的非限制性实例是引起疟疾的生物体(如恶性疟原虫)、引起结核病的生物体(如结核分枝杆菌)、酵母或病毒。在其他优选的实施例中，可以根据本发明的组合物使用来自如下病毒的抗原：如黄病毒(例如西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒)、埃博拉病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和马尔堡病毒。抗原的示例性非限制性实施例是来自恶性疟原虫(P.falciparum)的CS蛋白或其免疫原性部分，一种抗原的蛋白质，或来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的若干种抗原的融合蛋白，如Ag85A、Ag85B和/或TB10.4蛋白或其一种或多种免疫原性部分，病毒糖蛋白或其免疫原性部分，如来自线状病毒(如埃博拉病毒或马尔堡病毒)的GP，HIV蛋白，如gag、pol、env、nef或其变体，或者来自流感病毒的HA、NA、M或NP蛋白或这些中的任何的免疫原性部分，或者呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，例如RSV F蛋白或RSV G蛋白、或两者、或其他RSV蛋白，人乳头瘤病毒或其他病毒抗原等。重组载体(例如rAd)可以编码一种抗原，但也可以任选地编码来自相同生物体的两种不同的抗原，或任选地编码来自不同生物体的抗原的组合，例如，来自第一生物体的第一抗原和来自第二生物体的第二抗原。也有可能将抗原和例如佐剂编码到相同的载体(如rAd载体)中，例如，抗原和Toll样受体(TLR)激动剂，如TLR3激动剂，如dsRNA或其模拟物等(例如，WO 2007/100908)。在某些实施例中，重组载体(例如重组腺病毒)编码两种不同的抗原，一种在AoHV-1启动子的控制下，另一种在不同启动子(例如hCMV启动子)的控制下。在其他实施例中，载体或重组病毒编码抗原和免疫调节子，其中一种在AoHV-1启动子的控制下，另一种在不同启动子(例如hCMV启动子)的控制下。在某些实施例中，除了在AoHV-1启动子控制下的转基因外，另外的异源序列或转基因可存在于载体或重组病毒中。
本发明还提供了包含本发明的AoHV-1启动子的重组DNA分子，该AoHV-1启动子可操作地连接至转基因。本发明还提供了包含AoHV-1启动子的重组腺病毒的基因组，该AoHV-1启动子可操作地连接至转基因。技术人员将意识到，这也可以是至少两种不同的重组DNA分子的组合，这两种DNA分子可以一起形成本发明的单个重组DNA分子。此类分子可用于操纵基因组并产生新颖的重组腺病毒。基因组编码腺病毒复制和在容许细胞中包装所需的蛋白质。
如本文所使用的，用于重组腺病毒的术语‘重组’意指已被人工修饰的腺病毒，而不是野生型腺病毒，例如重组腺病毒包含一种或多种异源基因或者其部分，以及可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子。
腺病毒载体、其构建方法和其繁殖方法是本领域熟知的，并且被描述于以下文献中：例如，美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、6,113,913和8,932,607，以及Virology[病毒学](Thomas Shenk,“Adenoviridae and their Replication[腺病毒及其复制]”M.S.Horowitz,"Adenoviruses[腺病毒]",分别为第67和68章),B.N.Fields等人(编辑),第3版,雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.),纽约(1996)，以及本文提及的其他参考文献。典型地，腺病毒载体的构建涉及本领域熟知的标准分子生物技术的使用，如描述在以下的那些：例如Sambrook等人,Molecular Cloning,a Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册],第2版,冷泉港实验出版社,冷泉港实验室,纽约(1989),Watson等人,RecombinantDNA[重组DNA],第2版,Scientific American Books[科学美国人书](1992),和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],威利国际科学出版社(Wiley Interscience Publishers),纽约(1995)，以及本文提及的其他参考文献。
根据本发明的腺病毒属于腺病毒科，并且优选地是属于哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属的一种。它可以是人腺病毒，但还可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、猪腺病毒(例如PAdV3或PAdV5)、或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，腺病毒是人腺病毒(HAdV或AdHu；在本发明中，如果提及Ad但是没有指示物种的情况下，即指人腺病毒，例如简短符号“Ad5”表示与HAdV5(人腺病毒血清型5)相同)或猿猴腺病毒(如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV))或猕猴腺病毒(RhAd)。
已使用人腺病毒进行大多数高级研究，并且根据本发明的某些方面，人腺病毒是优选的。在某些优选的实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于人腺病毒。在优选的实施例中，该重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根据本发明的特别优选的实施例，腺病毒是人腺病毒血清型26和35中的一种。这些血清型的优点是在人群中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价。rAd26载体的制备描述于以下文献中：例如WO 2007/104792以及(Abbink等人,2007)。Ad26的示例性基因组序列发现于基因库登录号EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。rAd35载体的制备描述于以下文献中：例如U.S.7,270,811、WO 00/70071、以及(Vogels等人,2003)。Ad35的示例性基因组序列发现于基因库登录号AC_000019中和WO 00/70071的图6中。
上面提到的大多数人和非人腺病毒的序列是已知的，并且对于其他的腺病毒序列，可以使用常规程序获得。
根据本发明的重组腺病毒可以是具有复制能力的或复制缺陷的。
在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它在基因组的E1区域中含有缺失。与野生型腺病毒相比，“E1区域中的缺失”意指在该区域中的缺失，并且意指在E1A、E1B 55K或E1B 21K编码区域中至少之一中的缺失，优选E1A、E1B 55K和E1B21K编码区域的缺失。如技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须由菌株反式提供，优选的是由生产细胞提供，即，当E1、E2和/或E4区域的部分或全部从腺病毒中缺失时，这些必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在E3区域中的缺失，该缺失对于复制是非必要的，并且因此不必补充此种缺失。
可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文还称为‘包装细胞’或‘补充细胞’)可以是任何生产细胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，该生产细胞补充了腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选地在其基因组中至少具有腺病毒E1序列，并且从而能够补充在E1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何E1补充生产细胞，如由E1永生化的人网膜细胞，例如911或PER.C6细胞(参见例如U.S.5,994,128)、E1转化的羊水细胞(参见例如EP 1230354)、E1转化的A549细胞(参见例如WO98/39411，U.S.5,891,690)、GH329:HeLa细胞(Gao,Engdahl,和Wilson,2000)、293细胞等。在某些实施例中，这些生产细胞是，例如，HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞等。
除腺病毒外，本领域技术人员将认识到其他病毒也适于用作使用本发明AoHV-1启动子的病毒载体。例如，腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、副粘病毒(如麻疹病毒)、甲病毒、EBNA病毒、逆转录病毒、痘病毒和慢病毒等也可以被工程化以包括本发明的AoHV-1启动子。参见，例如(Heilbronn和Weger,2010；Robbins和Ghivizzani,1998；Walther和Stein,2000)中讨论的关于不同载体的综述。
针对向人给予，可以采用药物组合物，这些药物组合物例如包含载体、重组病毒、或使用本发明的方法表达的重组蛋白(例如rAd)、或使用本发明的AoHV-1启动子表达的重组蛋白，以及药学上可接受的运载体或赋形剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该运载体或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起不必要或不良的影响。此类药学上可接受的运载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,马克出版公司(Mack Publishing Company)[1990]；Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides and Proteins[肽和蛋白质的制药配方开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[2000]；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients[药用辅料手册],第3版,A.Kibbe编辑,英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。尽管也有可能运用冻干制剂，但纯化的载体(例如rAd)或蛋白质优选地是作为无菌溶液进行配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。然后将这些溶液冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0至9.5，例如pH 5.0至7.5范围内。载体或rAd或蛋白质典型地是在具有适合缓冲液的溶液中，并且该溶液还可以含有盐。任选地，稳定剂(如白蛋白)可以存在。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，载体、rAd或蛋白质可以被配制为可注射制剂。这些配制品含有有效量的药物成分，例如载体、rAd或蛋白质(这些有效量的药物成分是无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干的形式)，并且可任选地含有稳定剂或赋形剂。可以制备药物制剂用于不同的给药途径，例如，肌内注射或皮内注射、吸入、静脉内给予、经口给予等。
腺病毒配制品的实例是腺病毒世界标准(Hoganson等人,2002)：20mM Tris pH 8、25mM NaCl、2.5％甘油；或20mM Tris、2mM MgCl2、25mM NaCl、蔗糖10％w/v、聚山梨酯-800.02％w/v；或10mM-25mM柠檬酸盐缓冲液pH5.9-6.2，4％-6％(w/w)羟丙基-β-环糊精(HBCD)、70mM-100mM NaCl、0.018％-0.035％(w/w)聚山梨酯-80以及任选地0.3％-0.45％(w/w)乙醇。显而易见地，可以使用许多其他缓冲液，并且已知针对存储和针对纯化药物制剂的药用给予的适合的配制品的若干实例。
在某些实施例中，包含本发明的载体或重组病毒(例如rAd)的组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂是本领域已知的，以进一步增加对所用抗原决定簇的免疫应答，并且包含腺病毒和适合佐剂的药物组合物例如在WO2007/110409中披露，其通过引用并入本文。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明腺病毒载体的免疫应答。适合的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如U.S.5,057,540和WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等)。也有可能例如通过使用编码C4结合蛋白(C4bp)的寡聚化结构域与目的抗原的融合的异源核酸(Ogun,Dumon-Seignovert,Marchand,Holder,和Hill,2008)，或编码toll样受体(TLR)激动剂(如TLR3激动剂，如dsRNA(参见例如WO 2007/100908))的异源核酸，或编码免疫刺激细胞因子(例如白细胞介素，例如IL-12(参见例如US5,723,127)等)的异源核酸，使用载体编码的佐剂。
在某些实施例中，根据本发明的药物组合物可以是疫苗。
可以使用标准给药途径给予本发明的载体或重组病毒，例如腺病毒组合物。非限制性实施例包括不经肠给予，如通过注射(例如皮内、肌内等)，或者皮下或经皮、或粘膜给予(例如鼻内、经口等)。技术人员已知给予组合物(例如疫苗)以诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同可能性。
可以将腺病毒组合物给予受试者，例如人受试者。在一次给予期间向受试者提供的腺病毒的总剂量可以如技术从业人员已知的有所改变，并且通常是在1x107病毒颗粒(vp)和1x1012vp之间，优选地是在1x108vp和1x1011vp之间，例如在3x108vp和5x1010vp之间，例如在109vp和3x1010vp之间。
如本文所使用的，受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠或非人灵长类动物或人。优选地，该受试者为人受试者。
也有可能提供一种或多种疫苗的一次或多次加强给予。如果执行加强疫苗接种，那么典型地，此类加强疫苗接种将在该组合物第一次给予至受试者(在此类情况下这被称为“初次疫苗接种”)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时刻给予至相同的受试者。在替代性加强方案中，也有可能向受试者给予不同载体，例如一种或多种不同血清型的腺病毒，或其他载体，如MVA、或DNA、或蛋白质，作为初次或加强疫苗接种。
在括号中的可以包括专利、公开申请、技术文章和学术文章的各种出版物在整个说明书中被引用，并且在说明书结尾处可以发现每个出版物的完整引用。这些引用的出版物中的每一篇通过引用以其全文并入本文。
实施例
实施例1是重组核酸分子，该重组核酸分子包含可操作地连接至异源转基因的夜猴疱疹病毒主要立即早期启动子(AoHV-1启动子)。
实施例2是质粒载体，该质粒载体包含紧跟着多克隆位点的AoHV-1启动子。
实施例3是根据实施例1所述的重组核酸分子或根据实施例2所述的质粒载体，其中该AoHV-1启动子可操作地连接至调控序列，该调控序列调节自AoHV-1启动子的转录。
实施例4是根据实施例1所述的重组核酸分子或根据实施例2所述的质粒载体，其中该AoHV-1启动子可操作地连接至调控序列，该调控序列包含一个或多个四环素操纵基因序列(tetO位点)。
实施例5是重组载体或重组病毒，该重组载体或重组病毒包含根据实施例1、3或4中任一项所述的重组核酸分子。
实施例6是根据实施例5所述的重组载体，其中该载体是质粒载体。
实施例7是根据实施例5所述的重组病毒，其中该病毒是腺病毒。
实施例8是根据实施例7所述的重组腺病毒，其中该腺病毒在其基因组的区域具有缺失。
实施例9是根据实施例8所述的重组腺病毒，其中该缺失位于E1区域、E3区域、或E1区域和E3区域。
实施例10是细胞，该细胞包含根据实施例1、3或4所述的重组核酸分子，根据实施例2、3或4所述的质粒载体，或者根据实施例5-9中任一项所述的重组载体或重组病毒。
实施例11是包含重组核酸分子的细胞，该细胞在其基因组中包含AoHV-1启动子，优选地其中所述启动子可操作地连接至编码目的蛋白的核酸。
实施例12是细胞，该细胞包含：(i)包含可操作地连接至第一转基因的AoHV-1启动子的重组核酸分子，和(ii)包含可操作地连接至第二转基因的hCMV启动子的重组核酸分子。
实施例13是载体，该载体包含：(i)包含可操作地连接至第一转基因的AoHV-1启动子的重组核酸分子，和(ii)包含可操作地连接至第二转基因的hCMV启动子的重组核酸分子。
实施例14是生产重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子，其中当该腺病毒感染靶细胞时该转基因被有效地表达，该方法包括：
a)制备如下构建体，该构建体包含可操作地连接至转基因的AoHV-1启动子；和
b)将所述构建体并入该重组腺病毒的基因组中。
实施例15是生产重组核酸分子的方法，该重组核酸分子包含AoHV-1启动子，该AoHV-1启动子可操作地连接至编码目的蛋白的转基因，该方法包括可操作地连接至AoHV-1启动子的转基因的分子克隆。
实施例16是重组DNA分子，该重组DNA分子包含根据实施例7-9中任一项所述的重组腺病毒的基因组。
实施例17是用于制备根据实施例11所述的细胞的方法，该方法包括将AoHV-1启动子引入至细胞并将该AoHV-1启动子整合到基因组中，优选地其中所述启动子可操作地连接至编码目的蛋白的核酸。
实施例18是用于生产目的表达产物的方法，该方法包括在宿主细胞中表达编码目的表达产物的转基因，其中该转基因可操作地连接至AoHV-1启动子。
实施例19是根据实施例18所述的方法，其中表达产物是蛋白质。
实施例20是用于表达目的转基因的方法，该方法包括在宿主细胞中从根据实施例1、3、4、5或6中任一项所述的重组核酸分子表达该转基因。
实施例21是根据实施例20所述的方法，其中目的转基因编码在宿主细胞中表达的目的蛋白。
实施例22是根据实施例19或21所述的方法，该方法进一步包括从宿主细胞或从其中培养该宿主细胞的培养基，或从该宿主细胞和该培养基二者收获目的蛋白。
实施例24是用于生产病毒的方法，该方法包括在表达具有繁殖所述病毒功能的基因的细胞中繁殖该病毒，其中所述基因在AoHV-1启动子的控制下。
实施例25是根据实施例24所述的方法，其中所述病毒不会从其自身的基因组中生产功能形式的所述基因，并且其中所述基因对于所述病毒的复制是必需的。
实施例26是药物组合物，该药物组合物包含根据实施例5-9中任一项所述的重组载体或重组病毒，以及药学上可接受的运载体或赋形剂。
实施例27是根据实施例11所述的细胞，其中基因组中的AoHV-1启动子可操作地连接至编码四环素阻遏(TetR)蛋白的核酸。
实施例28是根据实施例12所述的细胞，其中第一转基因编码TetR。
实施例29是根据实施例28所述的细胞，该细胞进一步包含重组腺病毒，该重组腺病毒包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含可操作地连接至第二转基因的hCMV启动子。
实施例30是根据实施例29所述的细胞，其中该hCMV启动子可以被TetR调控(例如，被可操作地连接至一个或多个tetO位点)。
实施例31是根据实施例27、28、29或30所述的细胞，其中该细胞是PER.C6细胞。
实施例32是根据实施例20所述的方法，其中该转基因编码TetR。
实施例33是根据实施例32所述的方法，其中该细胞是PER.C6细胞。
实施例34是用于繁殖重组腺病毒的方法，该方法包括在hCMV启动子的控制下繁殖编码转基因的重组腺病毒，该hCMV启动子可操作地连接至根据实施例27、29或31所述的细胞中的一个或多个tetO位点，并优选地分离该重组腺病毒。
实施例35是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸237-286具有至少80％同一性的序列。
实施例36是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:25的核苷酸237-286具有至少86％同一性，优选地至少90％同一性，优选地至少96％同一性，优选地至少98％同一性，更优选地100％同一性。
实施例37是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸131-286具有至少90％同一性的序列。
实施例38是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:31是至少95％同一的序列。
实施例39是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含SEQ ID NO:32的240与1500个之间的核苷酸，优选地240与1000个之间的核苷酸，更优选地240与500个之间的核苷酸。
实施例40是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含SEQ ID NO:26。
实施例41是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的至少300个核苷酸的片段是至少95％同一的序列。
实施例42是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含SEQ ID NO:25。
实施例43是前述实施例中的任一项，其中AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:1的至少400个核苷酸的片段是至少95％同一的序列。
实施例44是实施例43，其中AoHV-1启动子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:30。
实施例45是包含转基因的细胞，该转基因包含SEQ ID NO:20，优选地在该细胞的基因组内。
实施例46是根据实施例45所述的细胞，其中该细胞是PER.C6细胞。
实例
无需进一步描述，据信本领域中的一般技术人员可使用先前描述及以下说明性方法和实例制造且利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实例具体指出了本发明的某些实施例、特征、和优点，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。实例仅仅用以阐明本发明。
方法
细胞培养：
将HEK293细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)中。在补充有5％胎牛血清(FBS)的最小必需培养基(MEM，美国生命技术公司(LifeTechnologies))中培养Vero细胞。在含有补充有10mM MgCl2的10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培养PER.C6细胞(Fallaux等人,1998)。
在如上所述的针对PER.C6细胞的相似培养基中培养PER.C6-hCMV.TetR细胞(本文所述)，但补充有2ug/ml杀稻瘟菌素(博科公司(Gibco)A11139-03)。
使用TrypLE Select Enzyme(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，目录号：12563011)根据标准方案进行上述细胞的继代培养以分离细胞。
pAdApt35质粒：
使用AvrII和HindIII限制性位点，将不同的启动子构建体克隆到pAdApt35(Vogels等人,2007)中。使用HindIII和XbaI限制性位点插入编码萤火虫荧光素酶的基因，得到pAdapt质粒，其中Luc基因在不同的测试启动子(pAdapt35.P.Luc)下表达。这些质粒用于实例1中。
瞬时转染的HEK293细胞中的表达分析。
将HEK293细胞接种在多孔6聚-L-赖氨酸(PLL)包被的板中，并且根据制造商(美国生命技术公司)提供的说明书使用脂质体用1μg pAdapt.P.Luc质粒转染。随后，将这些板在37C，10％CO2中孵育24小时。在LuminoskanTMAscent微孔板发光计中，在0.1％DTT(1M)存在下，在细胞裂解物中转染后24h测量荧光素酶活性。作为转染效率的对照，共转染编码分泌的胚胎碱性磷酸酶的质粒(80ng/孔)。使用Clontech Great EscAPeTMSEAP化学发光试剂盒2.0和Trilux Microbeta工作站测量SEAP水平。实例1中使用瞬时转染的HEK293细胞中的表达分析。
在tTA响应人工启动子“7xTetO-AoHV-1”的控制下瞬时转染的Vero细胞中Gaussia荧光素酶的表达分析
将Vero细胞接种在多孔96板中，接种密度为1.25x104个细胞/孔。在7xtetO-AoHV-1的控制下，用含有Gaussia荧光素酶基因的pDualLuc衍生的质粒在接种后1天转染细胞。除了荧光素酶质粒，用编码四环素控制的反式激活(tTA)蛋白的质粒或用阴性对照质粒(pBluescript)共转染细胞。根据制造商(美国生命技术公司)的方案使用脂质体3000进行细胞转染。在LuminoskanTMAscent微孔板发光计中，使用Pierce Gaussia-萤火虫荧光素酶双测定试剂盒(赛默科技公司(Thermo Scientific))在转染后24小时测量荧光素酶活性。为了控制转染效率，将测量的Gaussia萤光素酶单位标准化为红色萤火虫萤光素酶的水平(因为由短AoHV-1驱动的表达盒位于相同的pDualLuc质粒上)。实例2中进行了瞬时转染的Vero细胞中的表达分析。
在AoHV-1启动子变体的控制下瞬时转染的PER.C6细胞中Gaussia荧光素酶的表达分析
将PER.C6细胞接种在多孔96板中，接种密度为5x104个细胞/孔。如实例6中所述，在不同的AoHV-1启动子变体的控制下，使用含有Gaussia荧光素酶基因的pDualLuc质粒在接种后1天转染细胞。根据制造商(美国生命技术公司)的方案使用脂质体2000CD进行细胞转染。使用Pierce Gaussia-萤火虫荧光素酶双测定试剂盒(赛默科技公司)和LuminoskanTMAscent微孔板发光计，在转染后24小时测量荧光素酶活性。为了控制转染效率，将测量的Gaussia萤光素酶单位标准化为红色萤火虫萤光素酶的水平(因为由短AoHV-1驱动的表达盒位于相同的pDualLuc质粒上)。该方法部分适用于实例6。
PER.C6-hCMV.TetR和PER.C6-AoHV.TetR细胞
本文中产生并使用了两种类型的稳定表达TetR的PER.C6细胞。
首先，根据制造商的方案描述的标准程序，通过用质粒pCDNA6/TR(赛默飞世尔科技公司，目录号：V102520)稳定转染PER.C6细胞，产生在hCMV启动子控制下表达TetR的PER.C6-hCMV.TetR细胞。
其次，根据实例5(以及其中提及的方法部分)中描述的程序，通过用质粒pC_AoHV_TetR稳定转染PER.C6细胞，产生在AoHV-1短启动子控制下表达TetR的PER.C6-AoHV.TetR细胞。
在TetR调控的AoHV-1短启动子控制下表达另外的目的基因的PER.C6-hCMV.TetR细胞的细胞克隆产生
在转染前1天，将PER.C6-hCMV.TetR细胞接种在T80培养瓶中。用于转染的质粒在AoHV.2xtetO启动子(SEQ ID NO:7)的控制下携带目的基因(GOI)。另外，它含有由SV40衍生的启动子控制的新霉素磷酸转移酶II基因表达盒。通过若干克隆步骤，通过包含AoHV.2xtetO的片段随后通过GOI的编码序列替换含有hCMV启动子的pcDNA2004Neo(-)(基因库登录号FB674876)的MfeI-XbaI片段来构建质粒。根据制造商的方案(英杰公司)用脂质体2000进行转染。转染后第二天，将细胞继代培养并以1:2、1:4、1:8和1:16接种在10-cm培养皿中。接种后一天，用补充有0.5mg/ml遗传霉素(博科公司10131-019)的PER.C6-hCMV.TetR培养基替换细胞培养基。培养基每周替换2次。转染后2-3周挑选克隆。该方法部分适用于实例3。
蛋白质印迹用于分析目的基因的表达
将接种的细胞与或不与多西环素(1μg/ml)一起孵育2天，并在RIPA缓冲液(150mMNaCl，1％triton[曲通]X100，0.5％脱氧胆酸盐，0.1％SDS
50mM tris-HCL)中收获。
将样品加载到10％bis-tris凝胶(英杰公司NP0301PK2)上并在MOPS缓冲液(英杰公司NP0001)中运行。将SDS凝胶印迹在iBlot2系统(英杰公司)中，并将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(英杰公司IB23001)上。将膜在4C下在封闭缓冲液(LI-COR 927-40000)中封闭过夜。将蛋白质印迹膜用第一抗体(1:200小鼠多克隆抗Ad35病毒(内部))在封闭缓冲液中孵育2小时，并用TBST洗涤。将蛋白质印迹用第二抗体(1:5000山羊抗小鼠-800CW)在封闭缓冲液中孵育1小时，并用TBST洗涤多次。在LI-COR Odessey成像仪上进行可视化。该方法部分适用于实例3。
双荧光素酶质粒pDualLuc的产生
pDualLuc(SEQ ID NO:21)是携带两个表达盒的质粒：在人巨细胞病毒(hCMV)启动子的控制下表达Gaussia萤光素酶(Gluc)的第一表达盒和在AoHV-1短启动子的控制下表达红色萤火虫萤光素酶(RFL)的第二盒。在pDualLuc内，Gluc和RFL表达盒相对于彼此以尾对尾方向定位。
通过在基因艺术公司(GeneArt)(美国生命技术公司)进行的若干个基因合成和亚克隆步骤产生pDualLuc。首先，产生携带各自表达盒的合成片段“CMV_GLuc_SV”(SEQ IDNO:17)和“AoHV1_RFL_BGH”(SEQ ID NO:19)，并克隆到标准基因艺术公司质粒(pMK-RQ)中。随后，使用MluI和NsiI限制性位点将合成片段AoHV1_RFL_BGH进一步亚克隆到含有CMV_GLuc_SV的构建体中。
驱动Gaussia荧光素酶的pDualLuc的CMV启动子序列的侧翼是独特的限制性位点XhoI和HindIII，允许通过替代性启动子序列替换该启动子，如本文实例2和6中所进行的。
Ad26载体基因组质粒pAd26.dE1.dE3.5orf6的产生
pAd26.dE1.dE3.5orf6是含有全长Ad26载体基因组的质粒，其携带E1缺失、E3缺失、以及通过Ad5进行的Ad26E4orf6的替换，如先前产生的基于Ad26的载体所述(Abbink等人,2007)。pAd26.dE1.dE3.5orf6的质粒骨架包含pMB1复制原点和氨苄青霉素抗性基因，并且衍生自pBR322(基因库登录号J01749.1)。pAd26.dE1.dE3.5orf6进一步含有独特的AsiSI限制性位点(该位点代替载体基因组的E1缺失)和独特的PacI限制性位点(该位点在该载体基因组的E4区域和右侧反向末端重复(RITR)之间)。这些位点可用于在各自位置处插入转基因盒。最后，pAd26.dE1.dE3.5orf6内的腺病毒载体基因组在其每个末端的侧翼是SwaI限制性位点，允许其通过SwaI消化从质粒骨架释放。
涉及若干个合成和克隆步骤的pAd26.dE1.dE3.5orf6的构建。在基因艺术公司/美国生命技术公司合成含有(所希望的)Ad26载体基因组的左端和右端片段的2-kb序列(SEQID NO:16)。该序列的左端载体基因组片段从载体基因组的左侧反向末端重复(LITR)跨越直至并包括对应于(野生型)Ad26病毒基因组(基因库登录号EF153474.1)的在位置3755至3767处的SfiI位点的SfiI位点。右端病毒基因组片段从对应于野生型Ad26病毒基因组的在位置34079至34084处的NheI位点的NheI位点跨越直至并包括右ITR(RITR)。设计合成的序列以携带E1缺失(来自Ad26的位置472至3365，基因库登录号EF153474.1)以及上述限制性位点(即，代替E1缺失的AsiSI位点、E4和RITR之间的PacI位点、和直接位于载体基因组序列侧翼的两个SwaI位点)。基因合成片段进一步含有两个外部限制性位点以促进克隆：左端侧包括MfeI位点，而右端侧包括AseI位点。将合成的片段作为MfeI-AseI限制性片段连接到EcoRI和NdeI消化的pBR322(基因库登录号J01749.1)中(从而替换pBR322的2.3-kb，含有四环素抗性基因的EcoRI-NdeI片段)，这导致消除已经消化的限制性位点以产生各自的连接片段。携带载体基因组的左端和右端的所得质粒最终用于通过两个连续克隆步骤构建pAd26.dE1.dE3.5orf6。首先，将衍生自pWE.Ad26.dE3.5orf6(Abbink等人,2007)的12.7-kbSfiI-NheI Ad26载体基因组限制性片段连接到由SfiI和NheI消化的“左端/右端”质粒中。其次，将衍生自pWE.Ad26.dE3.5orf6的13.7-kb SfiI-SfiI Ad26载体基因组限制性片段插入到所得的部分载体基因组质粒的SfiI位点中。
Ad26载体基因组质粒pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL的产生
pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL是含有pAd26.dE1.dE3.5orf6(见上文)的Ad26载体基因组的质粒，经修饰以携带两个转基因表达盒：(1)在(缺失的)E1区域插入的人巨细胞病毒(hCMV)启动子驱动的Gaussia萤光素酶(Gluc)表达盒，和(2)在E4和RITR之间插入的AoHV-1启动子驱动的红色萤火虫萤光素酶(RFL)表达盒。
pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL与pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL是同一的，除了它另外在GLuc表达盒的hCMV启动子内携带两个四环素操纵基因(tetO)序列。
质粒pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL的构建涉及携带所需表达盒的中间构建体的产生，随后通过Gibson组装(Gibson等人,2009)将这些盒插入到pAd26.dE1.dE3.5orf6的Ad26载体基因组中。携带合成序列“CMV_GLuc_SV”(SEQ IDNO:17)、“CMVtetO_GLuc_SV”(SEQ ID NO:18)和“AoHV1_RFL_BGH”(SEQ ID NO:19)的中间构建体在基因合成服务提供商基因艺术公司(美国生命技术公司)处产生。序列CMV_GLuc_SV含有用于表达GLuc的表达盒。它包含人巨细胞病毒(hCMV)启动子(SEQ ID NO:4)、Gluc编码序列和SV40衍生的聚腺苷酸化信号序列。序列CMVtetO_GLuc_SV与序列CMV_GLuc_SV的不同之处在于它在其hCMV启动子衍生的启动子CMVtetO(SEQ ID NO:15)内携带含有两个四环素操纵基因(tetO)序列的54-bp插入。序列AoHV1_RFL_BGH含有用于表达RFL的表达盒。它包含短AoHV-1(SEQ ID NO:30)、RFL编码序列和牛生长激素基因衍生的聚腺苷酸化信号序列。设计序列CMV_GLuc_SV和CMVtetO_Gluc_SV以另外含有短侧翼序列，这些短侧翼序列对应于直接位于pAd26.dE1.dE3.5orf6侧翼的AsiSI位点的序列。这些侧翼序列允许通过体外装配(IVA)方法(如例如，Gibson等人描述的(Gibson等人,2009))将相关表达盒插入至pAd26.dE1.dE3.5orf6的AsiSI位点(即，在Ad载体基因组的E1缺失位置处)。相似地，序列AoHV1_RFL_BGH含有侧翼序列，这些侧翼序列允许通过IVA将相关表达盒插入至pAd26.dE1.dE3.5orf6的PacI位点(即，在载体基因组的E4区域和RITR之间)。所有三个序列进一步配备有侧翼外部限制性位点，其意图从它们各自的质粒骨架(其中它们由基因合成服务供应商提供)中释放这些序列。通过在质粒pAd26.dE1.dE3.5orf6(由AsiSI和PacI二者消化)和合成序列CMV_GLuc_SV和AoHV1_RFL_BGH(它们从其各自的质粒骨架(分别由PmlI和PshAI消化)中释放)之间进行4片段Gibson组装反应(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs))来构建pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL。以与pAd26.dE1.dE3.5orf6相同的方式产生pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL，但在Gibson组装反应中使用合成的序列CMVtetO_GLuc_SV代替CMV_Gluc_SV。
用于分析转基因盒完整性的引物
“E1PCR”引物对序列：
TGGCGCGAAAACTGAATGAG-正向(SEQ ID NO:8)
GCAGGCGGGTTGTCAAATAAG-反向(SEQ ID NO:9)
“E4PCR1”引物对序列：
GACGGGAGCAATCCCTCCAG-正向(SEQ ID NO:10)
CCCCACAAAGTAAACAAAAG-反向(SEQ ID NO:11)
“E4PCR2”引物对序列：
CGTTCTCACTTCCTCGTATC-正向(SEQ ID NO:12)
CAACGCTGATTGGACGAG-反向(SEQ ID NO:13)
该部分中描述的质粒用于实例4中。
TetR表达质粒pC_AoHV_TetR
为了构建pC_AoHV_TetR，(在基因艺术公司/美国生命技术公司处)合成包含短AoHV-1(SEQ ID NO:30)随后是密码子优化的编码TetR的序列的1.3-Kbp DNA(SEQ ID NO:20)片段，并且随后使用MfeI和XbaI限制性位点将其亚克隆到pcDNA2004Neo(-)(基因库登录号FB674876)中。图6A显示了pC_AoHV_TetR的图谱，其中指示了1.3-Kbp插入的位置。
PER.C6-AoHV.TetR细胞系产生程序
通过标准细胞系产生程序产生PER.C6-AoHV.TetR稳定的细胞系。简言之，使用伯乐公司(BioRad)电穿孔仪通过电穿孔用质粒pC_AoHV_TetR转染在CDM4PerMAb培养基(海克隆公司(HyClone))中生长的无血清生长的、悬浮适应的PER.C6细胞(Fallaux等人,1998)，该培养基补充有4mM L-谷氨酰胺(龙沙公司(Lonza))。在“PerMab选择培养基”(即，补充有4mM L-谷氨酰胺和125ug/mL遗传霉素(博科公司)的CDM4PerMAb培养基)中回收和抗生素选择后，在补充有4mM L-谷氨酰胺和125ug/mL遗传霉素的MAb培养基(SAFC)中，将转染的细胞接种于MW96板(每孔1个活细胞)中进行单细胞克隆。在形成细胞集落后，将分离的克隆在PerMAb选择培养基中的静态培养物中扩增若干次传代。随后使用抗TetR抗体(Tet03，MoBiTec公司)通过流式细胞术细胞内染色程序分析100个克隆表达TetR的能力。在该第一筛选中，发现100个测试克隆中的94个是TetR阳性的。选择这些TetR阳性克隆中的47个，并且在补充有4mM L-谷氨酰胺和125ug/mL遗传霉素的Permexcis培养基(龙沙公司)中适应生长后，通过流式细胞术细胞内染色程序再次测试TetR表达，以及通过TetR功能性测定(在本文的方法部分中描述)测试TetR活性。然后选择24个TetR阳性克隆，这些克隆展示了30小时或更低的群体倍增时间，并且代表广泛范围的TetR活性水平。这些克隆，表示为PER.C6-AoHV.TetR克隆1号至24号，(重新)适应于在摇瓶中生长，之后它们最终在小规模研究细胞库中冷冻保存。该方法部分适用于实例5。
从PER.C6-AoHV.TetR克隆表达TetR的稳定性
分析PER.C6-AoHV.TetR细胞克隆在延长传代时表达TetR的稳定性。PER.C6-AoHV.TetR细胞克隆在摇瓶中生长(具有和不具有抗生素选择)，用于多次传代直至达到大约60次群体倍增(或几代)。在第20、40和60代通过流式细胞术细胞内染色分析TetR表达。在这些时间点的每一个中，对每个克隆的细胞进行流式细胞术细胞内双染色方案以检测TetR和微管蛋白二者。根据标准流式细胞术细胞内程序进行染色，并且该染色包括两个抗体孵育步骤：第一个是抗TetR小鼠单克隆抗体(Tet03，MoBiTec公司)，第二个是抗小鼠IgG-FITC共轭物(554001，BD生物科学公司(BD Biosciences))与抗微管蛋白抗体-亚历克萨荧光染料647共轭物(ab195884，艾博抗公司(Abcam))的组合。每个克隆，在严格的微管蛋白阳性门内确定TetR阳性和阴性细胞的级分。该方法部分适用于实例5。
TetR功能性测定
在PER.C6-AoHV.TetR细胞克隆的延长传代后进行TetR功能性测定。PER.C6-AoHV.TetR细胞克隆在摇瓶中生长(具有和不具有抗生素选择)，用于多次传代直至达到大约60次群体倍增(或几代)。然后，将PER.C6-AoHV.TetR细胞克隆和对照PER.C6细胞接种在补充有4mM L-谷氨酰胺的Permexcis培养基中的聚-L-赖氨酸包被的多孔96板中，并且在孵育2小时后通过载体Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL(在实例4中描述)一式四份进行感染。在感染后一天，在荧光素酶细胞裂解缓冲液(Pierce/赛默科技公司)中收获感染的细胞。使用每个细胞裂解物的单独等分试样，随后分别使用BioLuxGaussia荧光素酶测定试剂盒(NEB)和荧光素酶发光测定试剂盒(Pierce/赛默科技公司)试剂以及Luminoskan Ascent微孔板发光计(赛默科技公司)，根据制造商的说明测量GLuc和RFL活性。每次感染复制，Gluc活性通过RFL活性标准化。该方法部分适用于实例5。
实例1：短AoHV-1作为用于异源基因表达的有效启动子的鉴定
通常，衍生自病毒或动物/人类基因组的启动子用于异源蛋白表达，例如，在质粒载体或病毒载体中的表达盒中用于在细胞或宿主生物体中表达目的基因。通常用于此目的的启动子是衍生自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期区域的启动子(Powell等人,2015)。感染其他宿主的若干种巨细胞病毒(CMV)也是已知的。它们感染例如猕猴(rhCMV)(Barry,Alcendor,Power,Kerr,和Luciw,1996；Chan,Chiou,Huang,和Hayward,1996；Chang等人,1993；Hansen,Strelow,Franchi,Anders,和Wong,2003)和黑猩猩(chCMV)(Chan等人,1996)。
为了鉴定优选地是有效的短启动子并且还与常用的hCMV启动子具有低序列同一性的启动子，鉴定并测试了若干种假定的启动子序列。我们测试的并且衍生自与hCMV更远距离相关的疱疹病毒的若干种假定的启动子显示出非常低或根本没有启动子活性。对于衍生自不同CMV物种并且已知是有效启动子的一些其他启动子，我们证实了启动子活性，但不幸的是此类启动子通常展示以下缺点之一：它们的特征在于更大的尺寸，由于例如包含增强子和内含子序列和/或它们展示出与hCMV启动子序列相当大的同源性。
夜猴疱疹病毒1型(AoHV-1)暂时归类为巨细胞病毒。有趣的是，虽然公布了AoHV-1的完整基因组序列并且在序列中注释了可读框(ORF)，但到目前为止还没有描述主要的立即早期启动子。我们测试了AoHV-1基因组区域的不同长度的两种不同设计，并称为各自假定的启动子序列长AoHV-1和短AoHV-1。基于下面描述的结果，我们证明了这些序列的启动子活性，我们将这些及其衍生物称为AoHV-1主要立即早期启动子，或简称为AoHV-1启动子。
为了测试鉴定的假定的启动子序列的异源基因表达效力，我们在基因艺术公司、美国生命技术公司处合成了假定的启动子序列，并通过萤火虫荧光素酶报告基因上游的AvrII和HindIII限制性位点亚克隆到pAdapt35.Luc质粒中。在转染后24小时测量转染的HEK293细胞中的萤火虫荧光素酶水平，并与由hCMV启动子(SEQ ID NO:4)诱导的萤火虫荧光素酶表达进行比较。
从一组可能的启动子中选择，我们选择了一些有效的启动子(数据未显示)，其中短chCMV和短AoHV-1因其非常小的尺寸和效力而是优选的。针对选择的启动子短AoHV-1(SEQ ID NO:1)、长AoHV-1(SEQ ID NO:2)、短chCMV(SEQ ID NO:3)和hCMV启动子的效力测试结果显示在图1中。短AoHV-1、长AoHV-1、短chCMV和hCMV启动子在该实验中均显示出相当的启动子效力。
然而，如图2A所示，短chCMV与比对区域中的hCMV具有非常高的序列同一性(序列同一性约64％)，尤其是chCMV短启动子的下游部分显示出与hCMV的显著比对和序列同一性的长延伸(具有多达19个核苷酸的若干同一延伸和仅具有很少核苷酸差异的超过100个核苷酸的同源延伸)。相比之下，如图2B所示，新颖的启动子短AoHV-1与比对区域中的hCMV具有低序列同一性(序列同一性约36％)，并且具有与hCMV对照相当的效力。关于同源启动子区域之间的潜在同源重组，两个序列中同一延伸的长度比总体序列同源性更相关。值得注意的是，与共享同一核苷酸的更多和/或更长延伸的启动子(例如(Rubnitz和Subramani,1984))相比，AoHV-1短启动子与hCMV仅共享很少的短同一序列延伸，最大长度为14个核苷酸，这被认为导致hCMV启动子和短AoHV-1之间的同源重组风险非常低。因此，认为hCMV和AoHV-1短启动子之间不希望的同源重组的风险非常低。如果希望的话，这些启动子之间已经非常有限的序列同一性水平甚至可以通过在任一启动子中进行一个或多个靶向突变并通过常规方法进行测试来进一步降低，这并不会消除启动子活性。
总之，AoHV-1短启动子是优选的，因为它在金标准hCMV的范围内显示出非常好的效力，同时具有非常短的序列(484bp)并且与hCMV启动子具有低序列同一性。
实例2：AoHV-1核心启动子在基于小分子控制的反式激活蛋白的系统中的应用，用于在哺乳动物细胞中目的基因的可诱导表达
基因的可诱导表达在生物技术领域具有高适用性，特别是对于毒性基因产物的瞬时表达。用于哺乳动物细胞中异源基因调控的某些公认的系统利用由与hCMV核心启动子连接的Tet操纵基因(TetO)序列的多个拷贝组成的人工启动子(Gossen和Bujard,1992；Gossen等人,1995)。在这些系统中，所述不展示或展示非常低的基础转录活性的人工启动子可以通过特异性结合至它们的某些重组转录因子(称为四环素控制的反式激活蛋白(tTA)或反向四环素控制的反式激活蛋白(rtTA))的TetO序列而被激活。在这里，我们测试了是否可以使用AoHV-1启动子的序列元件代替hCMV核心启动子来产生相似的此类tTA/rtTA响应人工启动子。
为此，构建启动子，其中仅假定的最小(核心)AoHV-1启动子被立即放置在七个Tet操纵基因(7xTetO-AoHV-1，SEQ ID NO:5)的下游。在基因艺术公司、美国生命技术公司处合成启动子序列，并将其通过XhoI和HindIII限制性位点亚克隆到本文方法部分所述的质粒pDualLuc中，从而替换控制该质粒的Gaussia荧光素酶报告基因的CMV启动子。在转染后24h测量转染的Vero细胞中的Gaussia荧光素酶水平，并在反式激活蛋白tTA存在下通过相同的启动子与Gaussia荧光素酶表达进行比较。在AoHV-1短启动子的控制下通过测量红色萤火虫萤光素酶(RFL)将表达数据标准化为转染效率，这是因为表达盒位于相同的pDualLuc质粒上。图3描绘了在7xTetO-AoHV-1启动子的控制下Gaussia萤光素酶基因的表达。在四个独立实验(N＝4)中，7xTetO-AoHV-1启动子的基础表达水平接近背景水平(仅用培养基转染的细胞，阴性对照)，并且平均比用编码反式激活蛋白tTA(7xTetO-AoHV-1+tTA)的质粒共转染时低1400倍。添加多西环素(进行两次，N＝2)后，这将抑制tTA与启动子的tetO序列的结合，再次观察到基础表达水平。还将7xTetO-AoHV-1的诱导表达水平与RSV启动子(衍生自劳氏肉瘤病毒的LTR；这是描述用于生物技术表达系统的另一种启动子)进行比较，指示了诱导的7xTetO-AoHV-1启动子导致Gaussia荧光素酶表达水平比RSV启动子高约1个log。
总之，衍生自AoHV-1启动子的包含假定的核心启动子的序列可用于构建对四环素控制的反式激活蛋白有响应的人工启动子。在此上下文中应用该序列证明允许对目的基因表达的紧密控制的调控。因此，所述序列代表如本文所定义的真正的“核心启动子”，因为该核心启动子本身具有非常低的启动子活性，但当与其他调控序列(如天然或人工转录因子的结合位点)组合时能够驱动有效的基因表达。
实例3：AoHV-1核心启动子在基于小分子控制的细菌阻遏蛋白的系统中的应用，用于在哺乳动物细胞中目的基因的调控表达
如实例2中提及的，例如细胞系中目的毒性基因的调控表达对于蛋白质或病毒载体的重组生产是必需的。在使用已经含有具有hCMV启动子的表达盒的病毒载体的情况下，希望的是使用具有不同序列的强启动子用于在生产细胞系中表达目的基因(GOI)。为了鉴定hCMV启动子的替代物，测试AoHV-1短启动子和人磷酸甘油酸激酶1(hPGK)启动子(描述用于生物技术表达系统的另一种启动子)在PER.C6细胞中eGFP的瞬时表达。与实例1的结果一致，AoHV-1短启动子再次显示出是用于表达异源基因的有效启动子，其驱动eGFP表达水平相似于hCMV(SEQ ID NO:4的)并且远高于hPGK启动子(SEQ ID NO:6)(图4A)。
在下文中，通常是组成型活性的AoHV-1短启动子(参见实例1和该实例的第一部分)被设计为四环素阻遏蛋白(TetR)调控的启动子，通过在TATA盒下游和在AoHV-1短启动子(AoHV.2xtetO，SEQ ID NO:7)的转录起始位点(TSS)上游插入两个Tet操纵基因。该设计先前显示适用于hCMV启动子(例如参见，WO 1999/000510A1)。该启动子在不表达TetR的细胞中具有活性。在该设计中，启动子活性在TetR(例如，在表达TetR的细胞系中)的存在下被阻遏。通过添加对TetR蛋白具有高亲和力的多西环素(Dox)可以减轻该阻遏。图4B显示克隆在AoHV.2xTetO下游的eGFP的表达事实上在PER.C6-hCMV.TetR细胞中被阻遏。添加Dox导致eGFP蛋白表达水平的增加，这与由hCMV驱动的eGFP表达水平相似。
为了建立展示TetR调控的目的基因表达的稳定细胞克隆，用在AoHV.2xtetO控制下表达目的基因的质粒转染在hCMV启动子控制下表达TetR的PER.C6-hCMV.TetR细胞。使用抗生素选择培养基选择八十五个克隆。在该实验中选择两个克隆用于测试目的基因(GOI)的可诱导表达。图4C显示了两个选择的克隆用于GOI的可诱导表达的测试。如从蛋白质印迹可以看出，两个测试的克隆在Dox不存在下显示低背景信号，而在Dox存在下，GOI被有效表达。作为阳性对照，使用在AoHV-1短启动子控制下用表达GOI的质粒瞬时转染的细胞。该阳性对照显示GOI的表达水平高于细胞克隆，这通常在产生稳定的细胞系时被观察到。
还设计并测试了替代性的细菌阻遏物调控的启动子，其中将cumate操纵基因序列(CuO)直接置于AoHV-1短启动子的(假定的)启始元件下游，并且也被证明是有功能的(数据未显示)。在该启动子设计中，CymR阻遏蛋白可以结合CuO序列，从而抑制表达。
另外，类似于所描述的TetR-和CymR-调控的基于AoHV1-启动子的系统，产生含有Lac操纵基因(LacO)的AoHV-1短启动子，并且被证明是由Lac阻遏物(LacR)(数据未显示)强烈阻遏的。
总之，该实例证实了与其他常用的用于异源基因表达的启动子相比，AoHV-1短启动子具有高效力。此外，产生AoHV-1启动子的TetR-、CymR-和LacR-调控的形式，其允许在哺乳动物细胞中GOI的调控表达。这可以例如用于表达对细胞有毒的蛋白质或用于表达导致细胞或载体不稳定性的蛋白质。
实例4：AoHV-1启动子在具有两个表达盒的病毒载体中的应用
AoHV-1短启动子(短AoHV-1)可以应用于病毒载体中以驱动疫苗抗原或其他目的蛋白的表达。这在本文中通过在腺病毒载体Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL的背景下应用短AoHV-1来说明。这些是两个基于Ad26的重组腺病毒载体，二者携带两个表达盒，第一个盒编码在(缺失的)E1区域插入的Gaussia荧光素酶(GLuc)，第二个盒编码位于E4区域和右侧反向末端重复(RITR)之间的红色萤火虫荧光素酶(RFL)。两种病毒的Gluc表达盒分别由hCMV启动子(SEQ ID NO:4)和CMVtetO(SEQ ID NO:15)驱动。CMVtetO与hCMV启动子的不同之处在于它携带含有两个四环素操纵基因(TetO)序列基序的序列的插入，使得该启动子可被四环素阻遏(TetR)蛋白阻遏。在两种病毒中，RFL表达盒在短AoHV-1(SEQ ID NO:30)的控制下。参见图5A对于两种载体的基因组的示意性图示。
通过将本文方法部分中描述的全基因组质粒pAd26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和pAd26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL转染到PER.C6细胞中来产生上述两种载体。根据标准程序，使用脂质体2000转染试剂(英杰公司)和在T25组织培养瓶(将该培养瓶在前一天每瓶用3x106个PER.C6细胞接种)中每次转染的4ug SwaI消化的质粒DNA，进行这些转染。(SwaI消化用于从质粒骨架释放腺病毒载体基因组)。在收获病毒拯救转染后，通过PER.C6细胞上的若干轮连续感染进一步扩增病毒，直到转染后在病毒传代数(VPN)5处进行大规模病毒生产感染。使用如前所述的两步氯化铯(CsCl)密度梯度超速离心程序从粗病毒收获物中纯化病毒(Havenga等人,2006)。在如前所述的两种情况下，通过基于分光光度法的程序定量病毒以确定病毒颗粒(VP)滴度，并通过TCID50测定来确定感染单位(IU)滴度(Maizel,White,和Scharff,1968)。
纯化批次的Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL的VP和IU定量结果显示在表1中。对于两个批次获得的病毒产量以及VP与IU比率与对于标准的含有单个转基因表达盒的基于Ad26的载体所常规获得的那些在相同的范围内。例如，对于批次Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL(即23和14)获得的VP与IU比率均落在VP与IU比率为18、11、24、10、12和26的范围内，先前报道了一组具有不同(单个)转基因表达盒的基于Ad26的载体的VP与IU比率(Zahn等人,2012)。
先前已经报道，使用两个同一的启动子用于从腺病毒的E1区域表达两个转基因可以引起遗传不稳定性，这可能是通过同源重组引起的(参见例如(Belousova等人,2006)和WO 2016166088A1的实例2)。为了检查是否可以通过使用在分别与E1和E4_rITR位置的hCMV启动子相同的系统中的本发明的AoHV-1启动子的组合来解决这个问题，我们测试了该组合的转基因盒完整性。通过基于PCR的扩增，随后对转基因盒插入区域(图5B)进行测序，证实了这两个纯化批次的Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL的转基因(TG)盒完整性。具体地，进行PCR以扩增在E1插入的TG盒(“E1PCR”)，并且进行两次PCR以靶向E4和RITR之间的TG盒(“E4PCR1”和“E4PCR2”)。在这些PCR中使用的所有引物都与Ad26特异性序列互补(即，它们不退火到位于它们各自TG盒内的序列)。所有PCR都给出了预期尺寸的产物，而没有可以辨别出指示缺失的小尺寸产物。PCR产物的测序也未发现任何突变。因此，本发明的AoHV-1启动子和hCMV启动子在单一载体中的组合确实产出了遗传上稳定的载体。
最后，测试了Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL纯化批次表达它们编码的两种萤光素酶的能力。为此，通过两种病毒以不同的多重感染来感染人细胞系A549，并在两天后收获的样品中检测到GLuc和RFL活性。结果显示两种载体都能够表达GLuc和RFL(图5C和D)。这指示了相关的转基因表达盒构型在测试它们的腺病毒基因组结构中是完全有功能的。
总之，短AoHV-1可用作启动子以驱动从插入病毒载体中的转基因表达盒表达目的蛋白。这在上文中举例说明，其中短AoHV-1用于在两个腺病毒载体的背景下表达RFL，每个腺病毒载体包含在腺病毒载体基因组内不同位置处插入的两个单独的转基因表达盒。这些腺病毒载体易于产生并被证明可用于高滴度纯化的载体批次，这些载体批次展示出良好的VP与IU比率并且具有遗传和功能完整的转基因表达盒。
实例5：AoHV-1启动子在质粒中的应用，用于在细胞中稳定表达目的基因
AoHV-1启动子可用于在稳定的细胞系中驱动异源基因的表达。这在本文中通过使用pC_AoHV_TetR(一种质粒，其中TetR基因表达由AoHV-1启动子驱动)产生表达TetR的细胞系来说明。
pC_AoHV_TetR在图6A中描绘并且在本文的方法部分中描述。它包含在AoHV-1启动子控制下的编码TetR的表达盒，和在SV40衍生的启动子控制下的新霉素磷酸转移酶II基因表达盒。后一种盒允许通过使用遗传霉素补充的细胞生长培养基选择稳定转染的细胞。
如本文方法部分“PER.C6-AoHV.TetR细胞系产生程序”中进一步详述的，pC_AoHV_TetR用于稳定转染到人细胞系PER.C6。在单细胞克隆后，这导致多个表达TetR的“PER.C6-AoHV.TetR”细胞克隆的有效产生。基于流式细胞术细胞内染色方案以检测TetR，发现100个测试的遗传霉素抗性克隆中的94个在第一筛选步骤中对于TetR表达是阳性的(数据未显示)。在对这些TetR阳性克隆中的47个进行第二次筛选步骤后(数据未显示)，选择24个克隆在小规模研究细胞库中冷冻保存。
进一步评估十二个冷冻保存的PER.C6-AoHV.TetR克隆在摇瓶中解冻后的生长性能以及它们在延长传代(最多60次群体倍增)时表达(功能的)TetR的能力，两者均在遗传霉素选择的存在和不存在下。发现所有克隆生长为至少与亲本悬浮液PER.C6对照细胞系一样有效且具有相似的活力(数据未显示)。通过流式细胞术细胞内染色分析TetR表达进一步证明在整个延长传代实验中TetR阳性细胞级分保持高水平(即97％或更高)。三个代表性克隆(PER.C6-AoHV.TetR克隆1-3)在图6B中显示。最后，TetR功能性测定证明，十二个克隆在其延长传代后均展示出显著的TetR介导的阻遏活性，如图6C对于PER.C6-AoHV.TetR克隆1-3所示的。具体地，在第60代，所有十二个PER.C6-AoHV.TetR克隆保持阻遏由TetR调控的启动子驱动的腺病毒载体编码的报告基因的表达的能力。对于12个不同克隆观察到的阻遏水平与对于使用先前描述的表达TetR的质粒pCDNA6/TR(一种包含由人CMV启动子控制的TetR表达盒的质粒)产生的阳性对照细胞系(PER.C6-hCMV.TetR)观察到的那些相似(或高于)。
总之，成功产生了稳定的sPER.C6-AoHV.TetR细胞系，其中TetR表达由AoHV1启动子驱动。这是在将转基因(该转基因可操作地连接至根据本发明的AoHV-1启动子)整合到宿主细胞的基因组中之后稳定表达目的蛋白的一个非限制性实例。
实例6：AoHV-1启动子的不同形式的设计
为了绘制AoHV-1主要立即早期调控区域的必需部分用于表达异源基因，制备了一组不同形式的AoHV-1启动子。不同的设计呈现于图7A中。进行了两种设计以截短已经非常短的AoHV-1短序列，以便绘制该短启动子序列的必需部分。其他设计包括另外的假定的结构域和细胞因子结合位点以及预测的内含子序列，以便测试是否可以增加短AoHV-1的效力。
测试的启动子形式命名为形式v00-v09，如下所列出的：
v00：SEQ ID NO:30(具有天然AvrII位点)
v01：SEQ ID NO:22
v02：SEQ ID NO:23
v03：SEQ ID NO:24
v04：SEQ ID NO:25
v05：SEQ ID NO:26
v06：SEQ ID NO:1(在核苷酸位置360处用胞嘧啶(c)的单核苷酸插入消除AvrII位点)
v07：SEQ ID NO:27
v08：SEQ ID NO:28
v09：SEQ ID NO:29
使用质粒瞬时转染到PER.C6细胞中来测试启动子活性。不同的启动子形式驱动Gaussia荧光素酶在本文方法部分中描述的pDualLuc质粒中的表达。图7B显示了相对于短AoHV-1(形式00)活性的启动子效力测试的结果。将该实验进行两次。相对于相同实验中的v00的平均值计算每个单独的值。汇集来自两个实验的值以计算平均值和标准偏差，其相对于AoHV-1短v00展示。v00和v06(分别具有和不具有AvrII位点的短AoHV-1)的活性被认为是在相同的范围内。
有趣的是，截短形式04显示与短AoHV-1(形式00和06)相当的启动子活性。该形式04的长度仅为371个核苷酸。相比之下，具有241个核苷酸长度的进一步截短形式05显示与短AoHV-1相比活性降低，这可以通过缺少若干个预测的细胞因子结合位点来解释。该启动子形式05仍然可以被认为是有效的启动子。预期启动子的活性随着进一步的截短而逐渐降低。
大多数其他启动子形式(与AoHV-1短启动子相比均含有延伸)的效力都在AoHV-1短启动子的范围内。在这些延伸的AoHV-1启动子变体中，仅v03(数据未显示)显示与短AoHV-1相比启动子活性的主要下降，但这可以通过在v03中存在不完整的内含子序列来解释：尽管v03在其延伸范围内携带预测的剪接供体位点，但它缺少位于更下游的任何预测的剪接受体位点。相比之下，延伸的AoHV-1启动子变体v07、v08和v09(其各自在(任何一个)其预测的剪接供体位点下游携带至少一个预测的剪接受体位点)各自显示出在AoHV-1短启动子范围内的表达。序列v09是v07的缺失突变体；与v07相比，v09携带内部缺失，其保留完整的某些预测的剪接供体和受体序列。数据显示v09是具有预测的内含子的短但有效的AoHV-1启动子变体的实例。可以设想，通过对AoHV-1启动子变体v08应用相似的缺失(如对v07应用的所述内部缺失)，可以产生相似的短但有效的含有内含子的启动子。
还设计了两个另外的AoHV-1启动子序列，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，并测试了这两个序列驱动目的基因的表达的能力。与短AoHV-1(即，SEQ ID NO:30)相比，这两个序列各自携带84-bp长3'截短，并且此外在它们的AoHV-1启动子核心区域内分别携带2和7个单核苷酸取代。由于所述3'截短，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34二者均仅包含AoHV-I启动子的假定的启始序列下游的1个AoHV-1核苷酸。
通过将SEQ ID NO:33作为合成基因片段的一部分插入至质粒pC_AoHV_TetR(在本文的方法部分中描述)，SEQ ID NO:33可操作地连接至编码TetR的序列，替换该质粒的AoHV-1短启动子。瞬时转染到PER.C6细胞中，随后使用抗TetR单克隆抗体(TetR03，MoBiTec公司)对细胞裂解物进行免疫印迹，随后证明SEQ ID NO:33的启动子活性与短AoHV-1的启动子活性相似(数据未显示)。
通过使用AvrII和AscI限制性位点将合成的基因片段克隆到pDualLuc(在本文的方法部分中描述)，将SEQ ID NO:34可操作地连接至编码RFL的序列。瞬时转染实验到PER.C6细胞中，随后在细胞裂解物中进行RFL活性测量，随后证明SEQ ID NO:34是功能性启动子序列(数据未显示)。
这些启动子变体的活性证明，对于启动子活性，不需要在假定的Inr的第一个核苷酸3’(即，SEQ ID NO:30中的核苷酸399，对应于SEQ ID NO:25中的核苷酸287)的下游包括AoHV-1序列。
结论
如上所述，从夜猴疱疹病毒1型中鉴定出短且有效的启动子。该AoHV-1启动子具有短序列并且其具有与hCMV启动子相当的效力。这些特征使该AoHV-1启动子成为在使用hCMV启动子的任何情况下用作取代物的理想启动子。此外，该AoHV-1启动子与hCMV启动子具有相对较低的序列同一性，这使得当从相同病毒载体表达两种不同的转基因时或当产生具有生产细胞系的病毒(这些病毒也含有相似的序列)时，它适合与hCMV启动子组合使用。AoHV-1启动子也适用于与调控序列一起使用，这些调控序列可用于调节自AoHV-1启动子的转录。
表1：表格显示了Ad26.CMV_GLuc.AoHV1_RFL和Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL纯化批次的定量结果。
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序列表
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<120> 用于表达异源基因的有效的短启动子
<130> 0284 WO 00 ORD
<160> 37
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 484
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 短AoHV-1（在核苷酸位置360处用胞嘧啶 (c) 的单核苷酸插入消除AvrII位点）
<400> 1
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctac 360
gggtatataa gcagagcccg gttagcagac cgccattcgc cttcaagaca gcgtgaggga 420
cccacgttct ccggaccagc caccgggacc gagcggccta gcctagccgg ggacccttca 480
ctgg 484
<210> 2
<211> 1333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 长AoHV-1
<400> 2
cctaggtcaa tatactggat gtcagccagc taaaaaaata aacaataaaa tcgtcacctg 60
gcattcagcc aatggatcaa tgtattggct gaatgccata ctattgatat atagataatc 120
tattgccaat taattggcca tatagccaat acaatggcac ggggccaatg tattggctat 180
atatcaatat gatggcgggg ttccagtata ttaatatatt gccaatgtat tggctatata 240
tcaatatggt ggcaaggttc cagtatatta atctattggc aatctattgg ccatatatca 300
atatggtggc aaggttccag tatattaatc tattggcaat ctattggcca tatatcaata 360
tggtggcaag gttccagtat attaatctat tggcaatcta ttggccatat atcaatatgg 420
tggcaaggtt ccagtatatt aatctattgg caatctattg gccatatatc aatatggtgg 480
cagtgaccca agttattaat ctattgccaa tataggccaa tagattggag atgagccagt 540
ctatcaatcc ataatcaata tatatctatc agtattggga catatattga ttagtatggg 600
gtcaaatagg gtatttccgt gttcccatca atacttggca caaacaacac tatgactcaa 660
tgggctatgg gccaagaaca taggtcaaat agggtatttc cgtgttccca tctgtacttg 720
gcacaaacaa cactatgact caataggcta tttgccaaga acataaggtc aatcagggta 780
cttccgcgtt cccaccgccc catttggcaa caaaataggg gttatttggg ggtcttcccc 840
ttgaaatcaa tgacttggca agcatataca tccgtcctgg caccagaata ggggttaaat 900
ggggactttc cataagccca ccgcctcatt tggcaccaaa aagggggatt tctattatta 960
gtcaatgtcc ttggccaata gccagtgacg tcaatgggaa cggggccagt tcccctttcc 1020
caccattacc ggcaatggtg ggtggggaaa ttccatatta gtcaatgttc ttggcaccaa 1080
aaccgcgggg actttccatt gacgtcagtg gaaaggggcg taacggggag tgaccatggg 1140
cgttcccggg cggagttatg ggcgttactg ggcggttcgt gggcggacca tgggctgtcc 1200
tacgggtata taagcagagc ccggttagca gaccgccatt cgccttcaag acagcgtgag 1260
ggacccacgt tctccggacc agccaccggg accgagcggc ctagcctagc cggggaccct 1320
tcactggaag ctt 1333
<210> 3
<211> 397
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 短chCMV
<400> 3
cgccaattgc atcatcctat tgtttttcta tgggaatttc cctattggca gtacatcaac 60
gtattactaa tggggatttc caatgactaa tacaacgggc agtacgccca gtacgtatga 120
ctaatgggac tttccataat cccgccccat tgacgtcaat gggcatccgt tctggcacca 180
aaatgaatgg gaatttccaa tatgagtcat aaaccccgcc ccattgacgc acattacacg 240
tcaatgggcg gtaggcgtgc cctatgggcg gtctatataa gcagagcccg tttagtgaac 300
cgtcacttcg cttggagcca ccgtccacgc tgtttggagc tccatagaag gaaccgggac 360
ccagccagcc tccgtagccg ggaacggtgc attggaa 397
<210> 4
<211> 829
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMV
<400> 4
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780
aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattgga 829
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<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7xTetO-AoHV-1
<400> 5
ttactcccta tcagtgatag agaacgtatg tcgagtttac tccctatcag tgatagagaa 60
cgatgtcgag tttactccct atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca 120
gtgatagaga acgtatgtcg agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atgtcgagtt 180
tatccctatc agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc cctatcagtg atagagaacg 240
tatgtcgagg cggaccatgg gctgtcctag ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc 300
gccattcgcc ttcaa 315
<210> 6
<211> 505
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPGK
<400> 6
aattgcgata attccacggg gttggggttg cgccttttcc aaggcagccc tgggtttgcg 60
cagggacgcg gctgctctgg gcgtggttcc gggaaacgca gcggcgccga ccctgggtct 120
cgcacattct tcacgtccgt tcgcagcgtc acccggatct tcgccgctac ccttgtgggc 180
cccccggcga cgcttcctgc tccgccccta agtcgggaag gttccttgcg gttcgcggcg 240
tgccggacgt gacaaacgga agccgcacgt ctcactagta ccctcgcaga cggacagcgc 300
cagggagcaa tggcagcgcg ccgaccgcga tgggctgtgg ccaatagcgg ctgctcagca 360
gggcgcgccg agagcagcgg ccgggaaggg gcggtgcggg aggcggggtg tggggcggta 420
gtgtgggccc tgttcctgcc cgcgcggtgt tccgcattct gcaagcctcc ggagcgcacg 480
tcggcagtcg gctccctcgt tccga 505
<210> 7
<211> 538
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AoHV.2xtetO
<400> 7
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagccctc cctatcagtg atagagatct ccctatcagt gatagagatc 420
gtcgacgagc tcggttagca gaccgccatt cgccttcaag acagcgtgag ggacccacgt 480
tctccggacc agccaccggg accgagcggc ctagcctagc cggggaccct tcactggg 538
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1 PCR - 正向
<400> 8
tggcgcgaaa actgaatgag 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1 PCR - 反向
<400> 9
gcaggcgggt tgtcaaataa g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E4 PCR1 - 正向
<400> 10
gacgggagca atccctccag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E4 PCR1 - 反向
<400> 11
ccccacaaag taaacaaaag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E4 PCR2 - 正向
<400> 12
cgttctcact tcctcgtatc 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E4 PCR2 - 反向
<400> 13
caacgctgat tggacgag 18
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tetO调控序列
<400> 14
ccctatcagt gatagag 17
<210> 15
<211> 883
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在Ad26.CMVtetO_GLuc.AoHV1_RFL中的CMVtetO
<400> 15
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660
cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tctccctatc agtgatagag atctccctat cagtgataga gatcgtcgac gagctcgttt 780
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 840
ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt gga 883
<210> 16
<211> 2026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于pAd26.dE1.dE3.5orf6的构建
<400> 16
caattgattt aaatcatcat caataatata ccccacaaag taaacaaaag ttaatatgca 60
aatgagcttt tgaattttaa cggttttggg gcggagccaa cgctgattgg acgagaaacg 120
gtgatgcaaa tgacgtcacg acgcacggct aacggtcgcc gcggaggcgt ggcctagccc 180
ggaagcaagt cgcggggctg atgacgtata aaaaagcgga ctttagaccc ggaaacggcc 240
gattttcccg cggccacgcc cggatatgag gtaattctgg gcggatgcaa gtgaaattag 300
gtcattttgg cgcgaaaact gaatgaggaa gtgaaaagcg aaaaataccg gtccctccca 360
gggcggaata tttaccgagg gccgagagac tttgaccgat tacgtggggg tttcgattgc 420
ggtgtttttt tcgcgaattt ccgcgtccgt gtcaaagtcc ggtgtttatg tcacagatca 480
gctgagcgat cgcaggtagg tttgagtagt gggcgtggct aaggtgacta taaaggcggg 540
tgtcttacga gggtcttttt gcttttctgc agacatcatg aacgggactg gcggggcctt 600
cgaagggggg ctttttagcc cttatttgac aacccgcctg ccgggatggg ccggagttcg 660
tcagaatgtg atgggatcga cggtggatgg gcgcccagtg cttccagcaa attcctcgac 720
catgacctac gcgaccgtgg ggaactcgtc gctcgacagc accgccgcag ccgcggcagc 780
cgcagccgcc atgacagcga cgagactggc ctcgagctac atgcccagca gcggtagtag 840
cccctctgtg cccagttcca tcatcgccga ggagaaactg ctggccctgc tggccgagct 900
ggaagccctg tgtacatact ttaatgctcc aaagctagca cccaaaaact gcatgctgga 960
ataagctctc tttgtgtcac cggtgatgcc ttccaatagg tgagtgataa agcgaggtag 1020
tttttcttta atcatttgag taatagaaaa gtcctctaaa taagtcacta ggaccccagg 1080
aaccacaatg tggtagctga cagcgtgtcg ctcaagcatg gttagtagag atgagagtct 1140
gaaaaacaga aagcatgcac taaaccagag ttgccagtct cactgaagga aaaatcactc 1200
tctccagcag caaagtgccc actgggtggc cctctcggac atacaaaaat cgatccgtgt 1260
ggttaaagag cagcacagtt agctcctgtc ttctcccagc aaagatcaca tcggactggg 1320
ttagtatgcc cctggaatgg tagtcattca aggccataaa tctgccttgg tagccattag 1380
gaatcagcac gctcactctc aagtgaacca aaaccacccc atgcggagga atgtggaaag 1440
attctgggca aaaaaaggta tatctattgc tagtcccttc ctggacggga gcaatccctc 1500
cagggctatc tatgaaagca tacagagatt cagccatagc tcagcccgct taccagtaga 1560
cagagagcac agcagtacaa gcgccaacag cagcgactga ctacccactg acccagctcc 1620
ctatttaaag gcaccttaca ctgacgtaat gaccaaaggt ctaaaaaccc cgccaaaaaa 1680
acacacacgc cctgggtgtt tttcgcgaaa acacttccgc gttctcactt cctcgtatcg 1740
atttcgtgac tcaacttccg ggttcccacg ttacgtcact tctgccctta catgttaatt 1800
aactcagccg tagggcgcca tcttgcccac gtccaaaatg gcttccatgt ccggccacgc 1860
ctccgcggcg accgttagcc gtgcgtcgtg acgtcatttg catcaccgtt tctcgtccaa 1920
tcagcgttgg ctccgcccca aaaccgttaa aattcaaaag ctcatttgca tattaacttt 1980
tgtttacttt gtggggtata ttattgatga tgatttaaat attaat 2026
<210> 17
<211> 1813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV_GLuc_SV
<400> 17
accggtgacc cgcgtccgtg tcaaagtccg gtgtttatgt cacagatcag ctgagcgatc 60
tcgagtcaat attggccatt agccatatta ttcattggtt atatagcata aatcaatatt 120
ggctattggc cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca 180
tgtccaacat taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 240
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 300
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 360
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 420
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 480
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 540
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 600
tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 660
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 720
aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 780
agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc 840
catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggagcgatc 900
gcaagcttgc caccatgggc gtgaaggtgc tgttcgccct gatctgtatc gccgtggccg 960
aggccaagcc caccgagaac aacgaggact tcaacatcgt ggccgtggcc tccaacttcg 1020
ccaccaccga tctggacgcc gacagaggca agctgcccgg caagaaactg cccctggaag 1080
tgctgaaaga gatggaagcc aacgcccgga aggccggctg taccagaggc tgtctgatct 1140
gcctgagcca cattaagtgc acccccaaga tgaagaagtt catccccggc agatgccaca 1200
cctacgaggg cgacaaagag tctgcccagg gcggaatcgg agaggccatc gtggacatcc 1260
ctgagatccc cggcttcaag gacctggaac ccatggaaca gtttatcgcc caggtggacc 1320
tgtgcgtgga ctgcacaaca ggctgcctga agggcctggc caacgtgcag tgtagcgacc 1380
tgctgaagaa gtggctgccc cagagatgcg ccaccttcgc ctctaagatc cagggacagg 1440
tggacaagat caagggcgct ggcggcgact gagtctagag cgatcgcatc cgaacttgtt 1500
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 1560
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 1620
ctgctagcat cgcaggtagg tttgagtagt gggcgtggct aaggtgacta taaaggcggg 1680
tgtcttacga gggtcttttt gcttttctgc agacatcagt cccaatgcat tgcactacac 1740
ctctagtcgt ctcacgcgtc tgggcctcat gggccttcct ttcactgccc gctttccagt 1800
cgggaaacct gtc 1813
<210> 18
<211> 1813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMVtetO_GLuc_SV
<400> 18
accggtgacc cgcgtccgtg tcaaagtccg gtgtttatgt cacagatcag ctgagcgatc 60
tcgagtcaat attggccatt agccatatta ttcattggtt atatagcata aatcaatatt 120
ggctattggc cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca 180
tgtccaacat taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 240
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 300
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 360
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 420
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 480
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 540
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 600
tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 660
gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 720
aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 780
agagctctcc ctatcagtga tagagatctc cctatcagtg atagagatcg tcgacgagct 840
cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 900
agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggagc gatcgcaagc 960
ttgccaccat gggcgtgaag gtgctgttcg ccctgatctg tatcgccgtg gccgaggcca 1020
agcccaccga gaacaacgag gacttcaaca tcgtggccgt ggcctccaac ttcgccacca 1080
ccgatctgga cgccgacaga ggcaagctgc ccggcaagaa actgcccctg gaagtgctga 1140
aagagatgga agccaacgcc cggaaggccg gctgtaccag aggctgtctg atctgcctga 1200
gccacattaa gtgcaccccc aagatgaaga agttcatccc cggcagatgc cacacctacg 1260
agggcgacaa agagtctgcc cagggcggaa tcggagaggc catcgtggac atccctgaga 1320
tccccggctt caaggacctg gaacccatgg aacagtttat cgcccaggtg gacctgtgcg 1380
tggactgcac aacaggctgc ctgaagggcc tggccaacgt gcagtgtagc gacctgctga 1440
agaagtggct gccccagaga tgcgccacct tcgcctctaa gatccaggga caggtggaca 1500
agatcaaggg cgctggcggc gactgagtct agagcgatcg catccgaact tgtttattgc 1560
agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 1620
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgcta 1680
gcatcgcagg taggtttgag tagtgggcgt ggctaaggtg actataaagg cgggtgtctt 1740
acgagggtct ttttgctttt ctgcagacat cagtcccaat gcattgcact acacctctag 1800
tcgtctcacg cgt 1813
<210> 19
<211> 2548
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AoHV1_RFL_BGH
<400> 19
gacggtctca cgcgtcacgt ggccggacat ggaagccatt ttggacgtgg gcaagatggc 60
gccctacggc tgagttaatg gatccaaatc aatgacttgg caagcatata catccgtcct 120
ggcaccagaa taggggttaa atggggactt tccataagcc caccgcctca tttggcacca 180
aaaaggggga tttctattat tagtcaatgt ccttggccaa tagccagtga cgtcaatggg 240
aacggggcca gttccccttt cccaccatta ccggcaatgg tgggtgggga aattccatat 300
tagtcaatgt tcttggcacc aaaaccgcgg ggactttcca ttgacgtcag tggaaagggg 360
cgtaacgggg agtgaccatg ggcgttcccg ggcggagtta tgggcgttac tgggcggttc 420
gtgggcggac catgggctgt cctagggtat ataagcagag cccggttagc agaccgccat 480
tcgccttcaa gacagcgtga gggacccacg ttctccggac cagccaccgg gaccgagcgg 540
cctagcctag ccggggaccc ttcactggtt aattaaggcg cgccaccatg gagaacatgg 600
aaaacgacga gaacatcgtc gtgggcccca agcccttcta ccccatcgag gaaggctctg 660
ccggcaccca gctgcggaag tacatggaaa gatacgccaa gctgggcgct atcgccttca 720
ccaatgccgt gaccggcgtg gactacagct acgccgagta cctggaaaag agctgctgcc 780
tgggcaaggc cctgcagaac tatggcctgg tggtggacgg cagaatcgcc ctgtgcagcg 840
agaactgcga agagttcttc atccccgtga tcgccggcct gttcatcgga gtgggagtgg 900
cccccaccaa cgagatctac accctgcggg aactggtgca cagcctgggc atcagcaagc 960
ccaccatcgt gttcagcagc aagaaaggcc tggacaaagt gatcaccgtg cagaaaaccg 1020
tgaccaccat caagaccatc gtgatcctgg acagcaaggt ggactaccgg ggctaccagt 1080
gcctggacac cttcatcaag cggaacaccc ccccaggctt ccaggcctcc agcttcaaga 1140
ccgtggaagt ggaccggaaa gaacaggtgg ccctgatcat gaacagcagc ggcagcaccg 1200
gactgcccaa aggcgtgcag ctgacccacg agaacaccgt gacacggttc agccacgccc 1260
gggaccccat ctacggaaac caggtgtccc ctggcaccgc cgtgctgacc gtggtgcctt 1320
ttcaccacgg cttcggcatg ttcaccaccc tgggctacct gatctgcggc ttccgggtcg 1380
tgatgctgac caagttcgac gaggaaacct tcctgaaaac cctgcaggac tacaagtgca 1440
cctatgtgat cctggtgccc accctgttcg ccatcctgaa caagagcgaa ctgctgaaca 1500
aatacgacct gagcaacctg gtggaaatcg ccagcggagg cgcccctctg agcaaagaag 1560
tgggagaggc cgtggccaga cggttcaatc tgcctggcgt gcggcagggc tacggcctga 1620
cagaaacaac cagcgccatc atcatcaccc ccgagggcga cgataagcct ggcgcctctg 1680
gaaaggtggt gcccctgttc aaggccaaag tgattgacct ggataccaag aagtccctgg 1740
gccctaacag acggggcgaa gtgtgcgtga agggccccat gctgatgaag ggctacgtga 1800
acaaccccga ggccaccaaa gagctgatcg acgaagaggg ctggctgcac accggcgaca 1860
tcggctacta cgatgaggaa aagcacttct tcatcgtgga ccggctgaag tctctgatca 1920
agtacaaggg ctatcaggtg ccccctgccg agctggaatc tgtgctgctg cagcatccca 1980
gcatcttcga cgctggcgtg gcaggcgtgc cagatcctgt ggctggcgaa ctgccaggcg 2040
ctgtggtggt gctggaaagc ggcaagaaca tgaccgagaa agaagtgatg gactacgtgg 2100
cctctcaggt gtccaacgcc aagagactga gaggcggcgt cagattcgtg gacgaggtgc 2160
caaagggcct gaccggcaag atcgatggca gagccatcag agagatcctg aagaaacccg 2220
tggccaagat gtgaattcct taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2280
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2340
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2400
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2460
tgggctctat ggtaccatta acatgtaagg gcagaagtga cgtaacgtgg gaacccggaa 2520
gttgagtcac gtgccaatgc attgggtg 2548
<210> 20
<211> 1322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于pC_AoHV_TetR的构建
<400> 20
caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgct aggtggtcaa 60
tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg 120
ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca 180
ttaccgccat gacgcgtaaa tcaatgactt ggcaagcata tacatccgtc ctggcaccag 240
aataggggtt aaatggggac tttccataag cccaccgcct catttggcac caaaaagggg 300
gatttctatt attagtcaat gtccttggcc aatagccagt gacgtcaatg ggaacggggc 360
cagttcccct ttcccaccat taccggcaat ggtgggtggg gaaattccat attagtcaat 420
gttcttggca ccaaaaccgc ggggactttc cattgacgtc agtggaaagg ggcgtaacgg 480
ggagtgacca tgggcgttcc cgggcggagt tatgggcgtt actgggcggt tcgtgggcgg 540
accatgggct gtcctagggt atataagcag agcccggtta gcagaccgcc attcgccttc 600
aagacagcgt gagggaccca cgttctccgg accagccacc gggaccgagc ggcctagcct 660
agccggggac ccttcactgg cgcgccacca tgagccggct ggacaagagc aaagtgatca 720
acagcgccct ggaactgctg aacgaagtgg gcatcgaggg cctgaccacc cggaagctgg 780
cccagaaact gggcgtggaa cagcccaccc tgtactggca cgtgaagaac aagcgggccc 840
tgctggacgc cctggccatc gagatgctgg accggcacca cacccacttt tgccccctgg 900
aaggcgagag ctggcaggac ttcctgcgga acaacgccaa gagcttcaga tgcgccctgc 960
tgagccacag ggacggcgcc aaggtgcacc tgggcaccag acccaccgag aagcagtacg 1020
agacactgga aaaccagctg gccttcctgt gccagcaggg cttcagcctg gaaaacgccc 1080
tgtacgccct gagcgccgtg ggccacttta ccctgggctg cgtgctggaa gatcaggaac 1140
accaggtcgc caaagaggaa agagagacac ccaccaccga cagcatgccc cccctgctga 1200
gacaggccat cgagctattc gatcaccaag gcgccgagcc cgccttcctg ttcggcctgg 1260
aactgatcat ctgcggcctc gagaagcagc tgaagtgcga gagcggctcc tgataatcta 1320
ga 1322
<210> 21
<211> 6535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDualLuc
<400> 21
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360
aggccgcata ccggtgaccc gcgtccgtgt caaagtccgg tgtttatgtc acagatcagc 420
tgagcgatct cgagtcaata ttggccatta gccatattat tcattggtta tatagcataa 480
atcaatattg gctattggcc attgcatacg ttgtatccat atcataatat gtacatttat 540
attggctcat gtccaacatt accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 600
taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 660
acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 720
acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 780
ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 840
attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 900
gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 960
ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 1020
caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 1080
tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 1140
tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt 1200
tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt 1260
ggagcgatcg caagcttgcc accatgggcg tgaaggtgct gttcgccctg atctgtatcg 1320
ccgtggccga ggccaagccc accgagaaca acgaggactt caacatcgtg gccgtggcct 1380
ccaacttcgc caccaccgat ctggacgccg acagaggcaa gctgcccggc aagaaactgc 1440
ccctggaagt gctgaaagag atggaagcca acgcccggaa ggccggctgt accagaggct 1500
gtctgatctg cctgagccac attaagtgca cccccaagat gaagaagttc atccccggca 1560
gatgccacac ctacgagggc gacaaagagt ctgcccaggg cggaatcgga gaggccatcg 1620
tggacatccc tgagatcccc ggcttcaagg acctggaacc catggaacag tttatcgccc 1680
aggtggacct gtgcgtggac tgcacaacag gctgcctgaa gggcctggcc aacgtgcagt 1740
gtagcgacct gctgaagaag tggctgcccc agagatgcgc caccttcgcc tctaagatcc 1800
agggacaggt ggacaagatc aagggcgctg gcggcgactg agtctagagc gatcgcatcc 1860
gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 1920
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 1980
ttatcatgtc tgctagcatc gcaggtaggt ttgagtagtg ggcgtggcta aggtgactat 2040
aaaggcgggt gtcttacgag ggtctttttg cttttctgca gacatcagtc ccaatgcatt 2100
ggcacgtgac tcaacttccg ggttcccacg ttacgtcact tctgccctta catgttaatg 2160
gtaccataga gcccaccgca tccccagcat gcctgctatt gtcttcccaa tcctccccct 2220
tgctgtcctg ccccacccca ccccccagaa tagaatgaca cctactcaga caatgcgatg 2280
caatttcctc attttattag gaaaggacag tgggagtggc accttccagg gtcaaggaag 2340
gcacggggga ggggcaaaca acagatggct ggcaactaga aggcacagtt aattaaggaa 2400
ttcacatctt ggccacgggt ttcttcagga tctctctgat ggctctgcca tcgatcttgc 2460
cggtcaggcc ctttggcacc tcgtccacga atctgacgcc gcctctcagt ctcttggcgt 2520
tggacacctg agaggccacg tagtccatca cttctttctc ggtcatgttc ttgccgcttt 2580
ccagcaccac cacagcgcct ggcagttcgc cagccacagg atctggcacg cctgccacgc 2640
cagcgtcgaa gatgctggga tgctgcagca gcacagattc cagctcggca gggggcacct 2700
gatagccctt gtacttgatc agagacttca gccggtccac gatgaagaag tgcttttcct 2760
catcgtagta gccgatgtcg ccggtgtgca gccagccctc ttcgtcgatc agctctttgg 2820
tggcctcggg gttgttcacg tagcccttca tcagcatggg gcccttcacg cacacttcgc 2880
cccgtctgtt agggcccagg gacttcttgg tatccaggtc aatcactttg gccttgaaca 2940
ggggcaccac ctttccagag gcgccaggct tatcgtcgcc ctcgggggtg atgatgatgg 3000
cgctggttgt ttctgtcagg ccgtagccct gccgcacgcc aggcagattg aaccgtctgg 3060
ccacggcctc tcccacttct ttgctcagag gggcgcctcc gctggcgatt tccaccaggt 3120
tgctcaggtc gtatttgttc agcagttcgc tcttgttcag gatggcgaac agggtgggca 3180
ccaggatcac ataggtgcac ttgtagtcct gcagggtttt caggaaggtt tcctcgtcga 3240
acttggtcag catcacgacc cggaagccgc agatcaggta gcccagggtg gtgaacatgc 3300
cgaagccgtg gtgaaaaggc accacggtca gcacggcggt gccaggggac acctggtttc 3360
cgtagatggg gtcccgggcg tggctgaacc gtgtcacggt gttctcgtgg gtcagctgca 3420
cgcctttggg cagtccggtg ctgccgctgc tgttcatgat cagggccacc tgttctttcc 3480
ggtccacttc cacggtcttg aagctggagg cctggaagcc tgggggggtg ttccgcttga 3540
tgaaggtgtc caggcactgg tagccccggt agtccacctt gctgtccagg atcacgatgg 3600
tcttgatggt ggtcacggtt ttctgcacgg tgatcacttt gtccaggcct ttcttgctgc 3660
tgaacacgat ggtgggcttg ctgatgccca ggctgtgcac cagttcccgc agggtgtaga 3720
tctcgttggt gggggccact cccactccga tgaacaggcc ggcgatcacg gggatgaaga 3780
actcttcgca gttctcgctg cacagggcga ttctgccgtc caccaccagg ccatagttct 3840
gcagggcctt gcccaggcag cagctctttt ccaggtactc ggcgtagctg tagtccacgc 3900
cggtcacggc attggtgaag gcgatagcgc ccagcttggc gtatctttcc atgtacttcc 3960
gcagctgggt gccggcagag ccttcctcga tggggtagaa gggcttgggg cccacgacga 4020
tgttctcgtc gttttccatg ttctccatgg tggcgcgcct taattaacca gtgaagggtc 4080
cccggctagg ctaggccgct cggtcccggt ggctggtccg gagaacgtgg gtccctcacg 4140
ctgtcttgaa ggcgaatggc ggtctgctaa ccgggctctg cttatatacc ctaggacagc 4200
ccatggtccg cccacgaacc gcccagtaac gcccataact ccgcccggga acgcccatgg 4260
tcactccccg ttacgcccct ttccactgac gtcaatggaa agtccccgcg gttttggtgc 4320
caagaacatt gactaatatg gaatttcccc acccaccatt gccggtaatg gtgggaaagg 4380
ggaactggcc ccgttcccat tgacgtcact ggctattggc caaggacatt gactaataat 4440
agaaatcccc ctttttggtg ccaaatgagg cggtgggctt atggaaagtc cccatttaac 4500
ccctattctg gtgccaggac ggatgtatat gcttgccaag tcattgattt ggatccatta 4560
actcagccgt agggcgccat cttgcccacg tccaaaatgg cttccatgtc cggccacgtg 4620
acgcgtctgg gcctcatggg ccttcctttc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 4680
gtgccagctg cattaacatg gtcatagctg tttccttgcg tattgggcgc tctccgcttc 4740
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcgggtaaag cctggggtgc ctaatgagca 4800
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 4860
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 4920
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 4980
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 5040
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 5100
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 5160
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 5220
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5280
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5340
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 5400
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 5460
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 5520
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 5580
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt tattagaaaa attcatccag cagacgataa 5640
aacgcaatac gctggctatc cggtgccgca atgccataca gcaccagaaa acgatccgcc 5700
cattcgccgc ccagttcttc cgcaatatca cgggtggcca gcgcaatatc ctgataacga 5760
tccgccacgc ccagacggcc gcaatcaata aagccgctaa aacggccatt ttccaccata 5820
atgttcggca ggcacgcatc accatgggtc accaccagat cttcgccatc cggcatgctc 5880
gctttcagac gcgcaaacag ctctgccggt gccaggccct gatgttcttc atccagatca 5940
tcctgatcca ccaggcccgc ttccatacgg gtacgcgcac gttcaatacg atgtttcgcc 6000
tgatgatcaa acggacaggt cgccgggtcc agggtatgca gacgacgcat ggcatccgcc 6060
ataatgctca ctttttctgc cggcgccaga tggctagaca gcagatcctg acccggcact 6120
tcgcccagca gcagccaatc acggcccgct tcggtcacca catccagcac cgccgcacac 6180
ggaacaccgg tggtggccag ccagctcaga cgcgccgctt catcctgcag ctcgttcagc 6240
gcaccgctca gatcggtttt cacaaacagc accggacgac cctgcgcgct cagacgaaac 6300
accgccgcat cagagcagcc aatggtctgc tgcgcccaat catagccaaa cagacgttcc 6360
acccacgctg ccgggctacc cgcatgcagg ccatcctgtt caatcatact cttccttttt 6420
caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 6480
atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccac 6535
<210> 22
<211> 1529
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v01
<400> 22
tgtggtgtcg tggccttggc ccggtgccaa gtattgcgac tatctggcac tgtgtcaagt 60
tattgatggg tatcattgat gcctgattga catctgtcaa tgcacatcta taatgatcaa 120
taagtttaaa ttgagtcttt gactatgagc cagacatctg tcaccaatac atcaatctga 180
gtgttcaata aaccatattg gaattcatat caatatactg gatgtcagcc agctaaaaaa 240
ataaacaata aaatcgtcac ctggcattca gccaatggat caatgtattg gctgaatgcc 300
atactattga tatatagata atctattgcc aattaattgg ccatatagcc aatacaatgg 360
cacggggcca atgtattggc tatatatcaa tatgatggcg gggttccagt atattaatat 420
attgccaatg tattggctat atatcaatat ggtggcaagg ttccagtata ttaatctatt 480
ggcaatctat tggccatata tcaatatggt ggcaaggttc cagtatatta atctattggc 540
aatctattgg ccatatatca atatggtggc aaggttccag tatattaatc tattggcaat 600
ctattggcca tatatcaata tggtggcaag gttccagtat attaatctat tggcaatcta 660
ttggccatat atcaatatgg tggcagtgac ccaagttatt aatctattgc caatataggc 720
caatagattg gagatgagcc agtctatcaa tccataatca atatatatct atcagtattg 780
ggacatatat tgattagtat ggggtcaaat agggtatttc cgtgttccca tcaatacttg 840
gcacaaacaa cactatgact caatgggcta tgggccaaga acataggtca aatagggtat 900
ttccgtgttc ccatctgtac ttggcacaaa caacactatg actcaatagg ctatttgcca 960
agaacataag gtcaatcagg gtacttccgc gttcccaccg ccccatttgg caacaaaata 1020
ggggttattt gggggtcttc cccttgaaat caatgacttg gcaagcatat acatccgtcc 1080
tggcaccaga ataggggtta aatggggact ttccataagc ccaccgcctc atttggcacc 1140
aaaaaggggg atttctatta ttagtcaatg tccttggcca atagccagtg acgtcaatgg 1200
gaacggggcc agttcccctt tcccaccatt accggcaatg gtgggtgggg aaattccata 1260
ttagtcaatg ttcttggcac caaaaccgcg gggactttcc attgacgtca gtggaaaggg 1320
gcgtaacggg gagtgaccat gggcgttccc gggcggagtt atgggcgtta ctgggcggtt 1380
cgtgggcgga ccatgggctg tcctagggta tataagcaga gcccggttag cagaccgcca 1440
ttcgccttca agacagcgtg agggacccac gttctccgga ccagccaccg ggaccgagcg 1500
gcctagccta gccggggacc cttcactgg 1529
<210> 23
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v02
<400> 23
atgggccaag aacataggtc aaatagggta tttccgtgtt cccatctgta cttggcacaa 60
acaacactat gactcaatag gctatttgcc aagaacataa ggtcaatcag ggtacttccg 120
cgttcccacc gccccatttg gcaacaaaat aggggttatt tgggggtctt ccccttgaaa 180
tcaatgactt ggcaagcata tacatccgtc ctggcaccag aataggggtt aaatggggac 240
tttccataag cccaccgcct catttggcac caaaaagggg gatttctatt attagtcaat 300
gtccttggcc aatagccagt gacgtcaatg ggaacggggc cagttcccct ttcccaccat 360
taccggcaat ggtgggtggg gaaattccat attagtcaat gttcttggca ccaaaaccgc 420
ggggactttc cattgacgtc agtggaaagg ggcgtaacgg ggagtgacca tgggcgttcc 480
cgggcggagt tatgggcgtt actgggcggt tcgtgggcgg accatgggct gtcctagggt 540
atataagcag agcccggtta gcagaccgcc attcgccttc aagacagcgt gagggaccca 600
cgttctccgg accagccacc gggaccgagc ggcctagcct agccggggac ccttcactgg 660
<210> 24
<211> 1157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v03
<400> 24
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccattcgcc ttcaagacag cgtgagggac 420
ccacgttctc cggaccagcc accgggaccg agcggcctag cctagccggg gacccttcac 480
tggaacgcgg atacagcgtg ccaaattaag gtatggagcg cggatggtat agcttgcatg 540
ctgattggtg gctggtggcg gtatctatag tatataatgt atagcctatt catggtatag 600
gcctccatat tgggggctgt gccgccattt taatgcatgg atgacgtgtg ggcttaatgt 660
atagatattg attattgatt aatcatggca gccatagctt ttatctgcat gttaatgata 720
cagctgccat tactatgtgc ccttatgccc tatatgttac taatttcctt gttggcacag 780
tgcctaacag tgctaatgta tgctttgcta taatgggcgg tgggccaggc ctggcatcgg 840
gccaactttt tgctaattgc tgggggcgct tctccatgtt gttgtggttt attattttgg 900
cacccggcca ttatgcggag cccctgtcag tcgaaacccg ggttttggca ccgtgccaaa 960
ttcacgtcat ccatacatag agctataatg tgatttggtg atggttaaca tatggtgatg 1020
cgtcagtaca ttcatgacaa cacgccacac acactttagg ctgcatgccc tctccacaca 1080
ctcttttctg gacgcttgcc agttttggcc cagtgccaat ttaccgctac agacacagta 1140
aactgagtta gattgtt 1157
<210> 25
<211> 371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v04
<400> 25
tattagtcaa tgtccttggc caatagccag tgacgtcaat gggaacgggg ccagttcccc 60
tttcccacca ttaccggcaa tggtgggtgg ggaaattcca tattagtcaa tgttcttggc 120
accaaaaccg cggggacttt ccattgacgt cagtggaaag gggcgtaacg gggagtgacc 180
atgggcgttc ccgggcggag ttatgggcgt tactgggcgg ttcgtgggcg gaccatgggc 240
tgtcctaggg tatataagca gagcccggtt agcagaccgc cattcgcctt caagacagcg 300
tgagggaccc acgttctccg gaccagccac cgggaccgag cggcctagcc tagccgggga 360
cccttcactg g 371
<210> 26
<211> 241
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v05
<400> 26
cggggacttt ccattgacgt cagtggaaag gggcgtaacg gggagtgacc atgggcgttc 60
ccgggcggag ttatgggcgt tactgggcgg ttcgtgggcg gaccatgggc tgtcctaggg 120
tatataagca gagcccggtt agcagaccgc cattcgcctt caagacagcg tgagggaccc 180
acgttctccg gaccagccac cgggaccgag cggcctagcc tagccgggga cccttcactg 240
g 241
<210> 27
<211> 1728
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v07
<400> 27
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccattcgcc ttcaagacag cgtgagggac 420
ccacgttctc cggaccagcc accgggaccg agcggcctag cctagccggg gacccttcac 480
tggaacgcgg atacagcgtg ccaaattaag gtatggagcg cggatggtat agcttgcatg 540
ctgattggtg gctggtggcg gtatctatag tatataatgt atagcctatt catggtatag 600
gcctccatat tgggggctgt gccgccattt taatgcatgg atgacgtgtg ggcttaatgt 660
atagatattg attattgatt aatcatggca gccatagctt ttatctgcat gttaatgata 720
cagctgccat tactatgtgc ccttatgccc tatatgttac taatttcctt gttggcacag 780
tgcctaacag tgctaatgta tgctttgcta taatgggcgg tgggccaggc ctggcatcgg 840
gccaactttt tgctaattgc tgggggcgct tctccatgtt gttgtggttt attattttgg 900
cacccggcca ttatgcggag cccctgtcag tcgaaacccg ggttttggca ccgtgccaaa 960
ttcacgtcat ccatacatag agctataatg tgatttggtg atggttaaca tatggtgatg 1020
cgtcagtaca ttcatgacaa cacgccacac acactttagg ctgcatgccc tctccacaca 1080
ctcttttctg gacgcttgcc agttttggcc cagtgccaat ttaccgctac agacacagta 1140
aactgagtta gattgtttta ttcacaggga actgttattg acagggctgg tacacagtcc 1200
tctttgccca tctcaggcac atcaatgatg gtgtcctggg ggacccggtt caaggcctct 1260
gcttcctcca tgatctcttg cacagcttcc tccagattct tgtcagtaga gcagaaactg 1320
cacatcatga ctgtgattat aagtccgaac atacacagta tagcgcctat ggagctcacg 1380
gggcgcatcc aggcattatg tgcaaaagat agtacatgcg aacggtcaga gcttctcccg 1440
gtggtagtag gttgacttga ggtaagaatg gtggtgctca cagtagtaga tgagtgatct 1500
agaaatggac attagtctta atatctattt ttagatcaca tgaggggggg taggcttcat 1560
gaatgttgtc tctgtccact tactggtggt ttgagtgaca cttgtggtga cattatcagc 1620
agtggtggcg ttgagcatcc aggcgatggc gcatccacag atgataagtc ccagggggtc 1680
caggtccctg aaggtaacag gtgtttgtgt ttactcacag ctgtaaag 1728
<210> 28
<211> 1224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v08
<400> 28
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccattcgcc ttcaagacag cgtgagggac 420
ccacgttctc cggaccagcc accgggaccg agcggcctag cctagccggg gacccttcac 480
tggaacgcgg atacagcgtg ccaaattaag gtatggagcg cggatggtat agcttgcatg 540
ctgattggtg gctggtggcg gtatctatag tatataatgt atagcctatt catggtatag 600
gcctccatat tgggggctgt gccgccattt taatgcatgg atgacgtgtg ggcttaatgt 660
atagatattg attattgatt aatcatggca gccatagctt ttatctgcat gttaatgata 720
cagctgccat tactatgtgc ccttatgccc tatatgttac taatttcctt gttggcacag 780
tgcctaacag tgctaatgta tgctttgcta taatgggcgg tgggccaggc ctggcatcgg 840
gccaactttt tgctaattgc tgggggcgct tctccatgtt gttgtggttt attattttgg 900
cacccggcca ttatgcggag cccctgtcag tcgaaacccg ggttttggca ccgtgccaaa 960
ttcacgtcat ccatacatag agctataatg tgatttggtg atggttaaca tatggtgatg 1020
cgtcagtaca ttcatgacaa cacgccacac acactttagg ctgcatgccc tctccacaca 1080
ctcttttctg gacgcttgcc agttttggcc cagtgccaat ttaccgctac agacacagta 1140
aactgagtta gattgtttta ttcacaggga actgttattg acagggctgg tacacagtcc 1200
tctttgccca tctcaggcac atca 1224
<210> 29
<211> 658
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v09
<400> 29
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccattcgcc ttcaagacag cgtgagggac 420
ccacgttctc cggaccagcc accgggaccg agcggcctag cctagccggg gacccttcac 480
tggaacgcgg atacagcgtg ccaaattaag gtatggagcg cggatggtat agcttgcatg 540
ctgattggtg gctggtggcg gtatctatcc aggcgatggc gcatccacag atgataagtc 600
ccagggggtc caggtccctg aaggtaacag gtgtttgtgt ttactcacag ctgtaaag 658
<210> 30
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 短AoHV-1（具有天然AvrII位点）
<400> 30
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccattcgcc ttcaagacag cgtgagggac 420
ccacgttctc cggaccagcc accgggaccg agcggcctag cctagccggg gacccttcac 480
tgg 483
<210> 31
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AoHV-1核心启动子
<400> 31
ggcggaccat gggctgtcct agggtatata agcagagccc ggttagcaga ccgccattcg 60
ccttcaa 67
<210> 32
<211> 2774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AoHV-1基因组片段
<400> 32
tgtggtgtcg tggccttggc ccggtgccaa gtattgcgac tatctggcac tgtgtcaagt 60
tattgatggg tatcattgat gcctgattga catctgtcaa tgcacatcta taatgatcaa 120
taagtttaaa ttgagtcttt gactatgagc cagacatctg tcaccaatac atcaatctga 180
gtgttcaata aaccatattg gaattcatat caatatactg gatgtcagcc agctaaaaaa 240
ataaacaata aaatcgtcac ctggcattca gccaatggat caatgtattg gctgaatgcc 300
atactattga tatatagata atctattgcc aattaattgg ccatatagcc aatacaatgg 360
cacggggcca atgtattggc tatatatcaa tatgatggcg gggttccagt atattaatat 420
attgccaatg tattggctat atatcaatat ggtggcaagg ttccagtata ttaatctatt 480
ggcaatctat tggccatata tcaatatggt ggcaaggttc cagtatatta atctattggc 540
aatctattgg ccatatatca atatggtggc aaggttccag tatattaatc tattggcaat 600
ctattggcca tatatcaata tggtggcaag gttccagtat attaatctat tggcaatcta 660
ttggccatat atcaatatgg tggcagtgac ccaagttatt aatctattgc caatataggc 720
caatagattg gagatgagcc agtctatcaa tccataatca atatatatct atcagtattg 780
ggacatatat tgattagtat ggggtcaaat agggtatttc cgtgttccca tcaatacttg 840
gcacaaacaa cactatgact caatgggcta tgggccaaga acataggtca aatagggtat 900
ttccgtgttc ccatctgtac ttggcacaaa caacactatg actcaatagg ctatttgcca 960
agaacataag gtcaatcagg gtacttccgc gttcccaccg ccccatttgg caacaaaata 1020
ggggttattt gggggtcttc cccttgaaat caatgacttg gcaagcatat acatccgtcc 1080
tggcaccaga ataggggtta aatggggact ttccataagc ccaccgcctc atttggcacc 1140
aaaaaggggg atttctatta ttagtcaatg tccttggcca atagccagtg acgtcaatgg 1200
gaacggggcc agttcccctt tcccaccatt accggcaatg gtgggtgggg aaattccata 1260
ttagtcaatg ttcttggcac caaaaccgcg gggactttcc attgacgtca gtggaaaggg 1320
gcgtaacggg gagtgaccat gggcgttccc gggcggagtt atgggcgtta ctgggcggtt 1380
cgtgggcgga ccatgggctg tcctagggta tataagcaga gcccggttag cagaccgcca 1440
ttcgccttca agacagcgtg agggacccac gttctccgga ccagccaccg ggaccgagcg 1500
gcctagccta gccggggacc cttcactgga acgcggatac agcgtgccaa attaaggtat 1560
ggagcgcgga tggtatagct tgcatgctga ttggtggctg gtggcggtat ctatagtata 1620
taatgtatag cctattcatg gtataggcct ccatattggg ggctgtgccg ccattttaat 1680
gcatggatga cgtgtgggct taatgtatag atattgatta ttgattaatc atggcagcca 1740
tagcttttat ctgcatgtta atgatacagc tgccattact atgtgccctt atgccctata 1800
tgttactaat ttccttgttg gcacagtgcc taacagtgct aatgtatgct ttgctataat 1860
gggcggtggg ccaggcctgg catcgggcca actttttgct aattgctggg ggcgcttctc 1920
catgttgttg tggtttatta ttttggcacc cggccattat gcggagcccc tgtcagtcga 1980
aacccgggtt ttggcaccgt gccaaattca cgtcatccat acatagagct ataatgtgat 2040
ttggtgatgg ttaacatatg gtgatgcgtc agtacattca tgacaacacg ccacacacac 2100
tttaggctgc atgccctctc cacacactct tttctggacg cttgccagtt ttggcccagt 2160
gccaatttac cgctacagac acagtaaact gagttagatt gttttattca cagggaactg 2220
ttattgacag ggctggtaca cagtcctctt tgcccatctc aggcacatca atgatggtgt 2280
cctgggggac ccggttcaag gcctctgctt cctccatgat ctcttgcaca gcttcctcca 2340
gattcttgtc agtagagcag aaactgcaca tcatgactgt gattataagt ccgaacatac 2400
acagtatagc gcctatggag ctcacggggc gcatccaggc attatgtgca aaagatagta 2460
catgcgaacg gtcagagctt ctcccggtgg tagtaggttg acttgaggta agaatggtgg 2520
tgctcacagt agtagatgag tgatctagaa atggacatta gtcttaatat ctatttttag 2580
atcacatgag ggggggtagg cttcatgaat gttgtctctg tccacttact ggtggtttga 2640
gtgacacttg tggtgacatt atcagcagtg gtggcgttga gcatccaggc gatggcgcat 2700
ccacagatga taagtcccag ggggtccagg tccctgaagg taacaggtgt ttgtgtttac 2760
tcacagctgt aaag 2774
<210> 33
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有3'截短的第一变体短AoHV-1
<400> 33
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagcccgg ttagcagacc gccactctc 399
<210> 34
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有3'截短的第二变体AoHV-1短启动子
<400> 34
aaatcaatga cttggcaagc atatacatcc gtcctggcac cagaataggg gttaaatggg 60
gactttccat aagcccaccg cctcatttgg caccaaaaag ggggatttct attattagtc 120
aatgtccttg gccaatagcc agtgacgtca atgggaacgg ggccagttcc cctttcccac 180
cattaccggc aatggtgggt ggggaaattc catattagtc aatgttcttg gcaccaaaac 240
cgcggggact ttccattgac gtcagtggaa aggggcgtaa cggggagtga ccatgggcgt 300
tcccgggcgg agttatgggc gttactgggc ggttcgtggg cggaccatgg gctgtcctag 360
ggtatataag cagagctctg ttcgcacacc tccactctc 399
<210> 35
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMV启动子（图2A）
<400> 35
catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 60
gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 120
gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 180
tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 240
ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 300
caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 360
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 420
cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc attgga 456
<210> 36
<211> 398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chCMV短启动子（图2A）
<400> 36
cgccaattgc atcatcctat tgtttttcta tgggaatttc cctattggca gtacatcaac 60
gtattactaa tggggatttc caatgactaa tacaacgggc agtacgccca gtacgtatga 120
ctaatgggac tttccataat cccgccccat tgacgtcaat gggcatccgt tctggcacca 180
aaatgaatgg gaatttccaa tatgagtcat aaaccccgcc ccattgacgc acattacacg 240
tcaatgggcg gtaggcgtgc cctatgggcg gtctatataa gcagagcccg tttagtgaac 300
cgtcacttcg cttggagcca ccgtccacgc tgtttggagc tccatagaag gaaccgggac 360
ccagccagcc tccgtagccg ggaacggtgc attggaac 398
<210> 37
<211> 785
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMV启动子（图2B）
<400> 37
aaatcaatat tggctattgg ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt 60
atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat 120
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 180
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 240
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 360
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 420
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 480
ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 540
tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 600
aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 660
tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 720
gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 780
ttgga 785

Claims (25)

1.一种核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至异源转基因的夜猴疱疹病毒1型主要立即早期启动子(AoHV-1启动子)。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸237-286具有至少80％同一性的序列，优选地其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ IDNO:25的核苷酸201至286具有至少至少95％同一性的序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述AoHV-1启动子可操作地连接至调控序列，所述调控序列调节自所述AoHV-1启动子的转录。
4.根据前述权利要求任一项中所述的核酸分子，其中所述AoHV-1启动子可操作地连接至调控序列，所述调控序列包含一个或多个四环素操纵基因序列(tetO位点)。
5.一种载体或病毒，所述载体或病毒包含根据前述权利要求任一项中所述的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的载体，其中所述载体是质粒载体。
7.根据权利要求5所述的病毒，其中所述病毒是腺病毒。
8.根据权利要求7所述的腺病毒，其中所述腺病毒在其基因组中具有至少一个缺失，优选地至少在其基因组的E1区域中。
9.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，或者根据权利要求5-8中任一项所述的载体或病毒。
10.一种细胞，所述细胞包含核酸分子，所述细胞在其基因组中包含AoHV-1启动子，优选地其中所述启动子可操作地连接至编码目的蛋白的核酸。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸237-286具有至少80％同一性的序列，优选地其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸201至286具有至少至少95％同一性的序列。
12.根据权利要求10或11所述的细胞，其中在所述基因组中的所述AoHV-1启动子可操作地连接至编码四环素阻遏(TetR)蛋白的核酸，优选地其中所述细胞是PER.C6细胞。
13.一种细胞，所述细胞包含：(i)包含可操作地连接至第一转基因的AoHV-1启动子的核酸分子，和(ii)包含可操作地连接至第二转基因的hCMV启动子的核酸分子。
14.根据权利要求13所述的细胞，其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸237-286具有至少80％同一性的序列，优选地其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸201至286具有至少至少95％同一性的序列，并且其中所述hCMV启动子包含与SEQ ID NO:4的核苷酸578-736，优选地与核苷酸564-736具有至少95％同一性的序列。
15.根据权利要求13或14所述的细胞，其中所述第一转基因编码TetR，优选地其中所述细胞是PER.C6细胞。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中包含可操作地连接至第二转基因的hCMV启动子的所述核酸分子是腺病毒的一部分。
17.一种载体，所述载体包含：(i)包含可操作地连接至第一转基因的AoHV-1启动子的核酸分子，和(ii)包含可操作地连接至第二转基因的hCMV启动子的核酸分子。
18.根据权利要求17所述的载体，其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸237-286具有至少80％同一性的序列，优选地其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸201至286具有至少至少95％同一性的序列。
19.一种用于生产目的表达产物的方法，所述方法包括在宿主细胞中从根据权利要求1-8中任一项所述的核酸分子表达所述转基因，其中所述转基因编码所述目的表达产物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述表达产物是蛋白质。
21.根据权利要求19或20所述的方法，所述方法进一步包括从所述宿主细胞或从其中培养所述宿主细胞的培养基，或从所述宿主细胞和所述培养基二者收获所述目的表达产物。
22.一种用于生产病毒的方法，所述方法包括在表达具有繁殖所述病毒功能的异源基因的细胞中繁殖所述病毒，其中所述异源基因在AoHV-1启动子的控制下；以及从所述细胞或从其中培养所述细胞的培养基，或从所述细胞和所述培养基二者收获所述病毒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸237-286具有至少80％同一性的序列，优选地其中所述AoHV-1启动子包含与SEQ ID NO:25的核苷酸201至286具有至少至少95％同一性的序列。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求5-8中任一项所述的载体或病毒，以及药学上可接受的运载体或赋形剂。
25.一种用于制备腺病毒的方法，所述方法包括在hCMV启动子的控制下繁殖编码转基因的腺病毒，所述hCMV启动子可操作地连接至根据权利要求12所述的细胞中的一个或多个tetO位点；以及优选地分离所述腺病毒。
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