KR20200107990A - 신경 생존 인자를 포함하는 컨스트럭트 및 이의 용도 - Google Patents

신경 생존 인자를 포함하는 컨스트럭트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 짧거나 및 긴 추체-유도된 간체 생존 인자를 포함하는 개선된 컨스트럭트 및 망막 퇴행성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신경 생존 인자를 포함하는 컨스트럭트 및 이의 용도
본 발명은 망막 신경퇴행성 장애, 보다 구체적으로는 신경퇴행성 장애의 치료 및/예방을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경 퇴행성 장애는 신경 퇴행을 특징으로 하는 심각하게 쇠약해진 상태의 범위를 포함한다.
망막 색소변성증(retinitis pigmentosa, RP)과 같은 추체-간체 이영양증 (Rod-cone dystrophy)은 추체(rod) 광수용체의 점진적인 소멸에 이어 간체(cone)의 연속적인 손실을 특징으로 하는 유전적으로 이질적인 망막 퇴행성 질환이다. RP는 세계적으로 약 1:3,500명의 사람들에게 영향을 미치는 유전성 망막 퇴행의 가장 흔한 형태 중 하나이다(참고문헌 1). 63개 이상의 상이한 유전자에서 RP를 유발하는 돌연변이는 지금까지 추체-특이적 전사체에서 상당한 비율로 확인되었다. RP 환자는 황반성 간체-매개 시력(macular cone-mediated vision)의 상대적 보존과 함께, 처음에는 추체 기능 이상의 결과로 흐릿한 광 조건에서 시력 상실을 나타낸다. 그러나 질병이 진행됨에 따라, 추체의 1차 손실은 간체 퇴행, 및 이에 상응하는 간체-매개 시력의 결손이 뒤따른다. 환경의 대부분이 인위적으로 조명되고, 많은 활동이 높은 색채 시력에 의존하는 현대 사회에서 RP 환자의 간체-매개 시력 유지는 삶의 질을 크게 향상시킬 것이다.
추체-특이적 돌연변이에 의해 야기된 RP 서브셋에서의 간체 손실은 완전하게 이해되지는 않지만 반드시 상호 배타적이지 않은 일부 메카니즘이 제안되었다. 일부 가설화된 메커니즘은 간체의 사멸이 주변 추체의 퇴행으로 인한 내독소의 방출의 결과, 또는 추체, 망막 색소 상피 (retinal pigment epithelium, RPE) 또는 뮐러 신경교세포(Muller glia)와의 접촉 상실의 결과로 인한 '이웃 효과(neighbor effect)'임을 시사한다. 대안적으로, 뮐러 세포의 활성화 및 독성 분자의 방출이 역할을 할 수 있다. 다른 가설은 추체의 대사 부하가 상실됨에 따라 맥락막 혈액 순환에서 RPE에 의해 광수용체 층으로 전달되는 산소 또는 레티노이드의 양이 과도하고 유독하다는 것이다 (참고문헌 2). Punzo 등은 망막 퇴행의 마우스 모델에서 라파마이신 경로의 인슐린/포유류 표적에 의해 간체가 기아와 영양 불균형의 결과로 부분적으로 죽는다는 증거를 보여 주었다(참고문헌 3). 또한, 추체에 의해 분비되고 간체 생존에 필요한 생존 인자의 결핍이 간체 손실에 기여할 수 있다고 제안되었다 (참고문헌 4, 5).
마지막 가설과 동일하게, rd1 마우스에서 이식된 건강한 망막 조직은 이식된 조직으로부터 떨어진 부위에서 간체 생존을 지지하는 것으로 나타났다 (참고문헌 6, 7).
국제 특허 출원 WO2008/148860A1은 신경 생존을 증가시킬 수 있고 RP와 같은 신경퇴행성 장애의 치료 및/또는 예방에 유용한 추체-유래 간체 생존 인자 (RdCVF) 및 RdCVF2로 불리는 영양 인자(trophic factor)의 패밀리를 기술한다.
추체-유래 간체 생존 인자 (RdCVF)는 이러한 회복 효과(rescue effect)를 담당하는 후보 분자로서 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 고처리량 방법에서 확인되었다 (참고문헌 4). 추체는 RdCVF를 분비하므로 추체가 사멸하면, 이 주변분비 인자(paracrine factor)의 원천이 사라지고 RdCVF 수준이 감소한다. 따라서, RdCVF의 발현 및 분비된 인자의 손실은 추체-간체 이영양증에서 관찰되는 추체 변성의 2차 급증(wave)에 기여할 수 있다. RdCVF는 배양 (참고문헌 8) 및 망막 색소변성증의 열성 및 우성 형태의 마우스 및 랫트 모델에서 망막하(subretinally)에 주사했을 때 간체 생존을 매개하는 것으로 나타났다 (참고문헌 4, 9). RdCVF를 코딩하는 유전자인 Nxnl1의 파괴는 시간이 지남에 따라 마우스 광수용체가 광수용체 기능 이상 및 간체 손실에 점점 더 민감해지게 한다 (참고문헌 10).
Nxnl1은 상이한 스플라이싱을 통해 2개의 단백질 이소형(isoform)을 코딩한다. 간체 생존을 매개하는 이소형인, RdCVF는 더 긴 카운터파트인 RdCVFL의 변형된 티오레독신-접힘 단백질(truncated thioredoxin-fold protein)이며, RdCVFL은 효소적 티올-산화환원효소(thiol-oxidoreductase) 활성을 부여하는 C-말단 연장을 포함한다 (참고문헌 11). RdCVF의 모든 아미노산을 함유하는 RdCVFL은 Nxnl1 유전자의 엑손 1 및 2에 의해 코딩되며 티오레독신 패밀리의 구성원이다 (참고문헌 12). 티오레독신은 세포에서 적절한 환원 환경을 유지하고, 세포사멸 경로에 참여하는 것을 포함하여 다양한 기능을 갖는다. 이들 기능들은 티오레독신 접힘 내의 보존된 CXXC 촉매 부위에 의해 매개되는 티올산화환원효소 반응을 통해 수행된다 (참고문헌 13).
Byrne 등(참고문헌 32)은 RdCVF의 2개 이소형이 상보적인 기능을 가지고 있음을 보여 주었다. RdCVF를 코딩하는 아데노-관련 바이러스(AAV)의 전신 투여는 간체 기능을 개선하고 간체 손실을 지연시키는 한편, RdCVFL은 로돕신 mRNA를 증가시키고 산화 스트레스를 감소시켰다. RdCVFL은 추체의 광-산화적 손상(photo-oxidative damage)을 방지한다(참고문헌 36).
국제 특허 출원 WO 2016/185037은 RdCVF 및 RdCVFL 모두를 코딩하는 AAV 벡터, 구체적으로 AAV CT35, 및 망막 색소변성증과 같은 질병을 치료하기 위한 상기 벡터의 용도를 기술한다.
RdCVF와 RdCVFL 사이의 시너지 효과가 입증되었다(참고문헌 34). 한편, RdCVF는 망막 색소 상피(RPE)에 의해 생성되고 분비되며, 비-세포 자율 기작(non-cell autonomous mechanism)에 의해 간체의 세포 표면에서 RdCVF 수용체를 통해 호기성 당분해를 자극함으로써 간체를 보호한다(참고문헌 37). 반면 RdCVFL은 티올산화환원효소 기능으로 인해 세포 자율 방식으로 산화적 손상으로부터 간체를 보호한다.
본 발명자들은 그러한 AAV 벡터의 생성이 예기치 않게 AAV 게놈의 캡슐화(encapsidation) 문제를 나타내는 것을 관찰하였다. 불완전한 패키징의 문제는 완전한 게놈을 갖는 AAV 입자의 생산에 결함을 초래한다.
이는 인간 치료에 사용하기 위한 GMP-준수 AAV 벡터의 생산에 대한 제한을 보여준다.
따라서, 망막 신경퇴행성 장애를 치료하기 위해 RdCVF 및 RdCVFL 인자의 발현을 위한 개선된 컨스트럭트가 여전히 필요하다.
본 발명자들은 RdCVF를 코딩하는 제1 핵산 및 RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 단일 AAV 벡터의 생산이 바이러스 캡시드 내에서 AAV 단일 가닥 DNA의 불완전 패키징 문제를 겪을 수 있음을 발견하였다. 이러한 불완전한 캡슐화는 불완전한 AAV 게놈, 즉 더 작은 크기의 DNA의 생산을 초래한다.
본 발명자들은 놀랍게도 이러한 불완전한 캡슐화가 AAV 게놈 내의 직접 반복 서열(direct repeated sequences)의 존재에 기인하고, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에서 동일한 뉴클레오티드의 길이를 최대 200개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드(contiguous identical nucleotides)로 제한하면 AAV가 완전히 패키징될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 AAV 입자의 생성에 최적화된, RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및 RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터를 제공함으로써 이 문제에 대한 해결책을 제공한다.
본 발명에 따른 AAV는 최대 200개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드, 바람직하게는 최대 190개, 더욱 바람직하게는 최대 180개, 170개, 167개, 165개, 164개, 160개, 150개, 140개, 130개, 120개, 110개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 55개, 54개, 50개, 40개, 30개, 20개, 15개, 10개, 9개 또는 8개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 보여주는 제1 및 제2 발현 카세트를 포함한다.
본 발명자들은 제1 및 제2 발현 카세트 사이의 직접 반복 서열의 문제점에 대한 몇 가지 대안적인 및/또는 누적적인 해결법을 개발하였다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은
- RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
- RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터(AAV)에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은
- RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
- RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
망막 신경퇴행성 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 것이며,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터(AAV)에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
- RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
- RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터(AAV)의 치료적 유효량을 망막 퇴행성 질환 환자에게 투여하는 것으로 이루어진 단계를 포함하는, 망막 퇴행성 질환 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 AAV 컨스트럭트에서 비활성 인간 DNA 서열의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 AAV에 관한 것이며, 상기 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 핵산은 발현 카세트에는 존재하지 않는다.
본 발명은 짧거나 및 긴 추체-유도 간체 생존 인자를 포함하는 개선된 컨스트럭트 및 망막 퇴행성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 바람직한 컨스트럭트의 개략도를 나타낸다: 도 1A는 WO2016/185037에 개시된 비교예인 컨스트럭트 CT35(따라서, 본 발명에 따른 컨스트럭트가 아님)을 나타내고, 도 1B, 1C 및 1D는 각각 본 발명에 따른 컨스트럭트 3 (C03), 6 (C06) 및 11 (C11)을 나타낸다.
도 2는 변성 젤 전기영동으로 분석한 AAV 게놈의 단일 가닥 DNA의 크기를 나타낸다. 상이한 컨스트럭트에서 AAV 게놈의 단일 가닥 DNA의 크기는 변성 조건 하에서 겔 전기 영동에 의해 분석되었다:
-RdCVF 및 RdCVFL을 모두 발현하는 컨스트럭트 3 (C03) (7v7. AAV2-CMV/CBAorig-RdCVF-5'_1.7.OPN1L/MW-RdCVFL);
-RdCVF 및 RdCVFL을 모두 표현하는 CT35 (AAV2-CMV/CBA-RdCVF-CMV/CBA-RdCVFL)(서열번호 15); 및
-RdCVF만 발현하는 CT37(AAV2-CMV/CBA-RdCVF+스터퍼) (서열번호 16).
도 3은 비활성 "스터퍼" DNA에 대한 선택 과정의 개략도를 나타낸다.
도 4는 패키징 비교를 나타낸다.
도 4A는 AAV CT35의 다른 개략도를 나타내며, RdCVF 및 RdCVFL을 모두 발현하는 이러한 AAV에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 프로모터[CMV/CBA delta 390]의 직접 반복으로 인해 390개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 갖는다.
도 4B는 카세트 [CMV/CBA delta 390-RdCVF]의 제거 또는 카세트 [CMV/CBA delta 390-RdCVFL]와의 재조합을 생성하는 두 카피 [CMV/CBA delta 390] 사이의 재조합에 대한 그래픽 시뮬레이션을 나타낸다.
도 4C는 돼지 색소 상피의 1차 세포에서 CT35 (AAV-CMV/CBA-RdCVF_CMV/CBA-RdCVFL)의 형질 도입(transduction) 및 토끼 다클론성 항-RdCVF 항체(4)를 사용한 RdCVF 및 RdCVFL의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 4D는 AAV C06의 다른 개략도 및 재조합의 그래픽 시뮬레이션을 나타낸다. 이 AAV에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 167개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드의 직접 반복을 공유한다.
도 4E는 AAV C03의 다른 개략도이다.
도 4F는 캡슐화된 AAV C06, C03, CT35 및 CT37 (캡시드 단백질+DNA)의 게놈 완전성(integrity) 분석을 나타낸다.
도 4G 및 4H는 C03 및 C06에 대해 완전한 캡슐화된 AAV(full)를 포함하는 캡시드의 백분율, 불완전하게 캡슐화된 AAV를 포함하는 캡시드의 백분율 (intermediate) 및 AAV를 포함하지 않는 캡시드의 백분율 (empty; DNA 없음)을 나타내는 표이다. 표 4G는 캡시드 단백질 및 DNA (AAV 게놈) 모두에 대해 수득된 검출 결과를 보여주고, 표 4H는 DNA에 대해서만 수득한 검출 결과를 보여준다.
그러므로, 일 측면에서, 본 발명은
- RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
- RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터(AAV)에 관한 것이다.
상기 제1 및 제2 발현 카세트가 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이한다는 사실은 제1 및 제2 발현 카세트가 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 공통으로 갖는 것을 의미한다.
일반적으로, 상기 제1 및 제2 발현 카세트는 최대 200개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드, 바람직하게는 최대 190개, 더욱 바람직하게는 최대 180개, 170개, 167개, 165개, 164개, 160개, 150개, 140개, 130개, 120개, 110개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 55개, 54개, 50개, 40개, 30개, 20개, 15개, 10개, 9개 또는 8개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 공유한다.
다른 측면에서, 본 발명은
- RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
- RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
망막 신경퇴행성 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 것이며,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터(AAV)에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
- RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
- RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터(AAV)의 치료적 유효량을 망막 퇴행성 질환 환자에게 투여하는 것으로 이루어진 단계를 포함하는, 망막 퇴행성 질환 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된, 용어 "추체-유래 간체 생존 인자(rod-derived cone viability factor, RdCVF)는 티오레독신-유사 6 (thioredoxin-like 6, TXNL6) 또는 뉴클레오레독신-유사 1 (Nucleoredoxin-like 1, NXNL1) 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 상기 인자는 모든 동물 종의 RdCVF 단백질을 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 RdCVF 단백질은 마우스, 랫트, 고양이, 개, 비인간 영장류 및 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 RdCVF 단백질일 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "RdCVF"는 NXNL1 유전자의 짧은 이소형을 지칭하고, "RdCVFL" 또는 "RdCVF-L"은 NXNL1 유전자의 긴 이소형을 지칭한다.
일반적으로, 마우스에서, 짧은 이소형(RdCVF)은 Uniprot 식별 번호 Q91W38인 109개 아미노산 길이의 참조 단백질이다. 마우스의 긴 이소형 (RdCVFL)은 Q8VC33에 참조된 217개 아미노산 길이의 단백질이다.
본 발명의 한 실시 양태에서, RdCVF의 짧은 이소형은 다음 서열을 갖는 RdCVF의 인간 짧은 이소형(hRdCVF)이다:
10 20 30 40 50
MASLFSGRIL IRNNSDQDEL DTEAEVSRRL ENRLVLLFFG AGACPQCQAF
60 70 80 90 100
VPILKDFFVR LTDEFYVLRA AQLALVYVSQ DSTEEQQDLF LKDMPKKWLF
109
LPFEDDLRR (서열번호 1)
따라서, RdCVF의 짧은 이소형을 코딩하는 제1 핵산은 하기 인간 핵산 서열을 포함할 수 있다:
ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGACGAGCTG
GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGT
GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGG
CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAG
GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTC
CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGTGA (서열번호 3)
대안적으로, 상기 제1 핵산은 서열번호 3과는 다르지만 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
적절한 핵산 서열은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다:
- 인간 RdCVF를 코딩하는 cDNA의 다형성(polymorphisms);
- 인간 RdCVF를 코딩하는 cDNA의 다형성의 조합(희귀 일배체형). 희귀 일배체형(rare haplotypes) cDNA의 예는 서열번호 11로 표시됨;
- 특정 코돈이 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체되는 "최적화 된" 서열. RdCVF를 코딩하는 적절한 코돈-최적화된 서열은 서열번호 12로 표시되는 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않음; 및
- 상동 서열(homologous sequences). 예를 들어, 본 발명자들은 침팬지 RdCVF의 짧은 이소형을 코딩하는 침팬지 cDNA 서열이 사용될 수 있음을 발견하였으며, 이는 인간 cDNA와 동일한 아미노산 서열을 코딩하기 때문이다. 침팬지 cDNA는 서열번호 4로 표시되는 서열을 갖는다.
본 발명의 한 실시 양태에서, NXNL1 유전자의 긴 이소형은 식별 번호 Q96CM4로 참조되고 하기에 제시된 서열을 갖는 인간의 긴 이소형 RdCVFL (hRdCVFL)이다:
10 20 30 40 50
MASLFSGRIL IRNNSDQDEL DTEAEVSRRL ENRLVLLFFG AGACPQCQAF
60 70 80 90 100
VPILKDFFVR LTDEFYVLRA AQLALVYVSQ DSTEEQQDLF LKDMPKKWLF
110 120 130 140 150
LPFEDDLRRD LGRQFSVERL PAVVVLKPDG DVLTRDGADE IQRLGTACFA
160 170 180 190 200
NWQEAAEVLD RNFQLPEDLE DQEPRSLTEC LRRHKYRVEK AARGGRDPGG
210
GGGEEGGAGG LF (서열번호 2)
따라서, RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산은 하기 인간 핵산 서열을 포함할 수 있다:
ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGACGAGCTG
GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGT
GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGG
CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAG
GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTC
CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGGACCTCGGGCGCCAGTTCTCAGTGGAGCGCCTG
CCGGCGGTCGTGGTGCTCAAGCCGGACGGGGACGTGCTCACTCGCGACGGCGCCGACGAG
ATCCAGCGCCTGGGCACCGCCTGCTTCGCCAACTGGCAGGAGGCGGCCGAGGTGCTGGAC
CGCAACTTCCAGCTGCCAGAGGACCTGGAGGACCAGGAGCCACGGAGCCTCACCGAGTGC
CTGCGCCGCCACAAGTACCGCGTGGAAAAGGCGGCGCGAGGCGGGCGCGACCCCGGGGGA
GGGGGTGGGGAGGAGGGCGGGGCCGGGGGGCTGTTCTGA (서열번호 5)
대안적으로, 상기 제2 핵산은 서열번호 5와는 다르지만 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
적절한 핵산 서열은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다:
-인간 RdCVF를 코딩하는 cDNA의 다형성 또는 이들의 조합;
-특정 코돈이 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체된 "최적화된" 서열; RdCVF 코딩에 적절한 코돈-최적화된 서열은 서열번호 12로 표시되는 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않음;
-다른 종에서의 상동 서열.
RdCVF 및 RdCVFL 단백질의 서열은 Chalmel et al. 2007(39) 및 국제 특허 출원 WO2008/148860에 제시되어 있다.
본원에 사용된 용어 "아데노-관련 벡터" 또는 "AAV"는 당업계의 일반적인 의미를 갖는다.
AAV는 당업계에서 유전자 전달에 적합한 벡터로 광범위하게 기술되어 있다.
실제로, AAV는 비병원성이며, 혈청형에 따라 광범위한 조직 특이성을 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에 따른 AAV는 망막 세포를 표적할 수 있는 AAV이다.
예시는 AAV2, AAV8, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/9 및 AAV7m8을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시 양태에서, 본 발명에 따른 AAV는 국제 특허 출원 WO2012/158757에 기재된 방법에 따라 수득된다.
일반적으로, NXNL1 유전자의 짧은 이소형 및 긴 이소형을 각각 암호화하는 제1 및 제2 핵산은 표적 세포에서 상기 짧은 이소형 및 긴 이소형의 발현을 허용하는 프로모터의 조절 하에 있다.
적합한 프로모터는 CMV/CBA 프로모터와 같은 편재성 프로모터(ubiquitous romoter)일 수 있다.
적합한 프로모터는 망막, 바람직하게는 망막 색소 상피 세포 및 광수용체 세포에서 발현될 수 있는 프로모터일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 프로모터는 망막 색소 상피 세포에서 유전자 발현을 허용한다.
일 실시양태에서, 상기 프로모터는 간체 광수용체에서 유전자 발현을 허용한다. 비제한적 예시는 간체-옵신 프로모터이다.
일반적으로, NXNL1 유전자의 짧은 이소형은 적어도 망막 색소 상피 세포에 의해 발현되고, 긴 이소형은 적어도 간체 광수용체 세포에 의해 발현된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 짧은 이소형 및 긴 이소형의 발현을 유도하기 위해 상이한 프로모터가 사용된다.
일반적으로, NXNL1 유전자의 짧은 이소형은 CMV/CBA 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있고 NXNL1 유전자의 긴 이소형은 간체-옵신 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 두 발현 카세트는 반전되며(inverted), 하나의 발현 카세트는 5' 내지 3'이고 다른 하나의 발현 카세트는 3' 내지 5'이다.
본 발명자들은 이러한 배열(configuration)이 불완전한 패키징을 피하는데 적합하다는 것을 발견했다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 기술한 아데노-관련 벡터(AAV)는 서열번호 10의 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 추가로 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 아데노-관련 벡터 (AAV)에 관한 것이다:
- 편재성 프로모터, 바람직하게는 CMV/CBA 프로모터의 조절 하에서 RdCVF를 코딩하는 코돈-최적화된 cDNA를 포함하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트; 및
- 간체-옵신 프로포모터(OPN1L/MW)의 조절 하에서 RdCVFL을 코딩하는 코돈-최적화된 cDNA를 포함하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트.
일 실시양태에서, RdCVF를 코딩하는 코돈-최적화된 cDNA를 포함하는 제1 핵산은 서열번호 12로 표시되는 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, RdCVFL을 코딩하는 코돈-최적화된 cDNA를 포함하는 제2 핵산은 서열번호 13으로 표시되는 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 상기 아데노-관련 벡터는 서열번호 6으로 표시되는 서열(하기 실시예의 컨스트럭트 3에 상응)을 갖는다.
본 발명의 내용에서, 본원에 사용된, 용어 "치료(treating 또는 treatment)"는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 상태(예를 들어, 망막 퇴행성 질환), 또는 이러한 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 진행의 억제 또는 예방하는 것을 의미한다.
용어 "망막 퇴행성 질환"은 간체 퇴행과 관련된 모든 질환을 포함한다. 망막 퇴행성 질환에는 망막 색소변성증 (Retinitis Pigmentosa), 노화-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration), 바르뎃-바이델 증후군 (Bardet-Biedel syndrome), 바센-코르츠바이크 증후군 (Bassen-Kornzweig syndrome), 베스트 질환 (Best disease), 맥락막 결여(choroidema), 망막 위축 (gyrate atrophy), 레베르 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 레프섬 질환 (Refsum disease), 스타카르트 질환 (Stargardt disease) 또는 어셔 증후군 (Usher syndrome)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 실시 양태에서, 상기 망막 퇴행성 질환은 망막 색소변성증이다.
본 발명에 따르면, 용어 "환자" 또는 "필요한 환자"는 망막 퇴행성 질환의 영향을 받거나 영향을 받을 수 있는 인간 또는 비인간 포유 동물을 위한 것이다.
본 발명에 따르면, 조성물의 "치료적 유효량"은 원하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이며, 이 경우 신경 생존을 증가시킨다. 효과적인 투여량(dosage)은 수여자(recipient)의 연령, 성별, 건강 및 체중, 만약 있다면 동시 치료의 종류, 치료 빈도 및 원하는 효과의 성질에 따라 달라질 것으로 이해된다. 그러나 바람직한 투여량은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이 개별 대상에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 안내(intraocular) 투여에 적합할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 발현 벡터는 망막하 주사(sub-retinal injection)에 의해 투여된다.
일 측면에서, 본 발명은 또한 아데노-관련 벡터 (AAV) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 AAV는
- RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
- RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트을 포함하고,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 AAV에 관한 것이며, 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 상기 핵산은 발현 카세트에 존재하지 않는다. 이러한 서열번호 10 서열은 AAV에서 스터퍼 DNA의 역할을 한다. 스터퍼 서열의 역할은 목적 유전자 대신 전바이러스성(proviral) 플라스미드가 캡슐화되는 것을 막기 위해 벡터의 크기를 증가시키는 것이다.
일반적으로 박테리오파지 람다 DNA에 해당하는 스터퍼가 AAV에 사용된다. 그러나 스터퍼로서 가장 일반적으로 사용되는 박테리오파지 람다의 서열은 nin 영역(nin region)이라는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 인간과의 계통 발생 거리 때문에 비활성(inert)으로 간주되지만, Cheng 등(참고문헌 38)은 nin 영역이 강한 전사 활성을 가질 수 있기 때문에 그러한 스터퍼가 예상만큼 비활성이 아님을 입증 하였다. 따라서, 그러한 스터퍼를 갖는 AAV가 인간 환자에게 투여될 때, 박테리오파지 람다 DNA의 전사 위험이 있다.
따라서 새로운 비활성 스터퍼를 개발하는 것이 중요했다. 본 발명자들은 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 핵산이 박테리오파지 람다 스터퍼를 대신하여 AAV 컨스트럭트의 크기를 증가시키기 위해 "스터퍼" DNA로 사용될 수 있음을 예기치 않게 발견하였다. 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 상기 핵산은 이 서열이 번역되지 않는 서열이고, miRNA 표적이 아니며, 비텔로머성(non-telomeric) 서열이기 때문에 비활성이라는 큰 이점을 가지며, DNA 복제 기점을 포함하지 않고, 뉴클레오티드 반복도 포함하지 않는다. 임의의 기능적 활성을 갖는 이 서열은 AAV에서 스터퍼로서 사용될 때 전사의 위험이 없다.
서열번호 10으로 표시되는 서열은 도 3에 제시된 바와 같은 철저한 과정을 통해 선택되었다. 이는 중심체, 유전자, 유사 유전자(pseudo genes), 복제 원점, 마이크로 RNA 표적화된 서열 또는 반복과 같은 요소와 같은 임의의 요소를 포함하지 않는 인간 게놈 영역을 식별하는 생물정보학적 접근법이다. 이들 유전자좌(loci) 중에서 서열번호 10이 선택되었다.
본 발명은 하기 실시예 및 도면을 통해 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1
다음 섹션은 본 발명에 따른 적합한 컨스트럭트의 비제한적 예시를 제공한다.
컨스트럭트 3 (C03):
7v7. AAV2-CMV/CBAorig-RdCVF-5'_1.7.OPN1L/MW-RdCVFL
도 1B에 도시된 바와 같이, 이 컨스트럭트에서, 인간 RdCVF cDNA 서열은 코돈 최적화되고(일차 최적화 과정 v1 사용), 편재성 프로모터인 CMV/CBA 아래에 배치된다. 인간 RdCVFL cDNA 또한 코돈 최적화되고(다른 최적화 과정 v2 사용) 간체-옵신 프로모터의 제어 하에 배치된다. 제1 및 제2 발현 카세트 사이에 공유되는 직접 반복은 9개 뉴클레오티드 길이이다.
상기 AAV 벡터는 서열번호 6으로 표시되는 서열을 갖는다.
컨스트럭트 6 (C06):
AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL
도 1C 및 4D에 도시된 바와 같이, 이 컨스트럭트에서, 침팬지 RdCVF cDNA 서열은 제1 발현 카세트에 사용되었고 편재성 프로모터인 CMV/CBA 아래에 배치된다. 인간 RdCVFL cDNA는 간체-옵신 프로모터의 제어 하에 배치된다. 제1 및 제2 발현 카세트 사이에 공유되는 직접 반복은 167개 뉴클레오티드 길이이다.
상기 AAV 벡터는 서열번호 7로 표시되는 서열을 갖는다.
컨스트럭트 7 (C07):
AAV2_rev_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL
이 컨스트럭트는 제1 발현 카세트가 역 배향(reverse orientation)으로 배치되는 것을 제외하고 컨스트럭트 6과 유사하다.
상기 AAV 벡터는 서열번호 8로 표시되는 서열을 갖는다.
컨스트럭트 8 (C08):
AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_rev_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL-hGH
이 컨스트럭트는 제2 발현 카세트가 역 배향으로 배치되는 것을 제외하고 컨스트럭트 6과 유사하다.
상기 AAV 벡터는 서열번호 9로 표시되는 서열을 갖는다.
컨스트럭트 11 (C11):
AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_rare_haplotype_human_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL
도 1D에 도시된 바와 같이, 이 컨스트럭트에서, 제1 발현 카세트는 편재성 프로모터인 CMV/CBA 하에서 다형성의 조합(희귀 일배체형)인 인간 RdCVF를 코딩하는 cDNA를 포함한다. 제2 발현 카세트는 간체-옵신 프로모터의 제어 하에 인간 RdCVFL cDNA를 포함한다. 제1 및 제2 발현 카세트 사이에 공유되는 직접 반복은 54개 뉴클레오티드 길이이다.
상기 AAV 벡터는 서열번호 14로 표시되는 서열을 갖는다.
실시예 2: 동일한 뉴클레오타이드의 긴 스트레치를 보여주는 AAV 구축물은 불완전한 패키징을 받는다.
물질 및 방법
바이러스성 벡터의 생성
마우스-RdCVF, RdCVFL 또는 eGFP를 코딩하는 cDNA를 보유하는 AAV 벡터는 플라스미드 공동-형질감염 방법(참고문헌 31)으로 생성하였다. 재조합 AAV는 염화 세슘 또는 이오딕사놀(iodixanol) 구배 초원심분리로 정제하였다. 바이러스성 용리액을 완충액 교환하고 PBS에서 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit으로 농축하였으며 표준 곡선에 대한 정량적 PCR로 적정하였다.
변성 젤 전기영동
게놈 DNA를 추출하고 변성 젤 전기영동에 적용하였다. 핵산의 크기는 DNA 사다리와 비교하였다.
결과
도 2 및 4F는 WO2016/185037에 개시된 컨스트럭트 CT37이고 따라서 본 발명에 따른 컨스트럭트는 아님을 보여준다. RdCVF만 발현하는 이 비교 예시는 이의 생산이 ~ 5000 bp 예상 크기의 DNA를 초래하기 때문에 완전한 패키징이 될 수 있다.
도 2 및 4F에 도시된 바와 같이, 390개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드의 반복을 포함하는 CT35(도 4A)는 이의 생산이 4804 bp의 AAV 게놈 대신에 비정상적인 AAV 게놈 크기를 초래하기 때문에 불완전한 패키징이 될 수 있다.
따라서, AAV에서 RdCVF를 코딩하는 제1 핵산 및 RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 발현시키는 것은 바이러스성 캡시드에서 AAV 단일 가닥 DNA의 불완전한 캡슐화를 야기할 수 있다는 것을 잘 알 수 있다.
대조적으로, RdCVF 및 RdCVFL 모두를 발현하고 단지 167개 뉴클레오티드 길이의 직접 반복을 포함하는 본 발명에 따른 컨스트럭트 C06은 4942 bp의 예상 크기에서 밴드를 나타낸다. 이 결과는 컨스트럭트 C06의 완전한 캡슐화를 입증한다.
동일한 방식으로, 9개의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드의 반복을 포함하는 컨스트럭트 C03은 4926 bp의 예상 크기에서 단일 밴드를 나타낸다.
2개의 발현 카세트 사이에 공유되는 연속적으로 동일한 뉴클레오티드의 수를 감소시키면, RdCVF를 코딩하는 핵산 및 RdCVFL을 코딩하는 핵산 모두를 포함하는 AAV의 완전한 캡슐화의 비율을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명자들은 제1 및 제2 발현 카세트가 200개를 초과하는 연속적인 핵산을 함유하지 않을 때 완전한 패키징이 얻어진다는 것을 입증하였다.
이러한 현상을 추가로 탐구하기 위해, 상이한 컨스트럭트의 비교에 Burnham 등(참고문헌 35)에 따른 분석적 초원심분리를 사용하였다 (도 4G 및 4H). C03 및 C06에 대한 결과는 변성 겔에서 관찰된 여분 밴드(extra band)가 가득 찬 것과 비어있는 것 사이의 입자를 나타내는 중간 침강 계수를 갖는 AAV 입자의 높은 비율과 일치하고, 따라서 불완전하게 패키지된 AAV를 포함하는 입자에 해당함을 보여준다. 변성 겔 전기영동에서 얻은 결과에 따라, 컨스트럭트 C06은 18%의 완전한 캡슐화를 나타내고, 컨스트럭트 C03은 분석적 초원심분리 방법에서 적절한 결과를 산출하였으며, 완전한 AAV 입자의 높은 퍼센트(58%)를 나타냈다 (도 4H).
이는 두 발현 카세트 사이에 공유되는 연속적으로 동일한 뉴클레오티드의 수가 200개를 초과하지 않을 때, 온전한 게놈(integral genome)을 갖는 입자의 백분율이 증가함을 확인시켜 준다.
실시예 3: RdCVF 및 RdCVFL의 조합은 시너지 효과를 초래한다
다음 컨스트를 생성하여 AAV2 벡터에 도입하였다.
전바이러스성 플라스미드 p618 및 이의 요소는 WO2012158757A1로 공개된 국제 특허 출원 및 공개문헌(참고문헌 33)에 기재되어 있다.
2xRdCVF: 플라스미드 p857 및 AAV CT39
P857/CT39는 망막 색소변성증 (RP)을 앓고 있는 환자에서 충분한 간체 보호를 달성하기 위해 CT37 (RdCVF-스터퍼)에 비해 RdCVF의 발현 수준이 증가하도록 설계되었다.
RdCVF-RdCVFL: 플라스미드 p853 및 AAV CT35
이 벡터는 RdCVF의 짧은 이소형 및 긴 이소형을 공동 발현할 수 있다.
그러나 그 생산은 치료제로서의 사용을 제한하는 비정상적인 불완전한 패키징을 받을 수 있다.
실시예 4: 파지 람다 스터퍼를 대체하기 위한 비활성 DNA의 선별
본 발명자들은 충분한 크기를 갖는 AAV 컨스트럭트를 수득하기 위해 전통적으로 사용된 파지 람다 스터퍼 서열에 대해 보다 안전한 대안으로 사용될 수 있는 핵산 서열을 동정하는 스크리닝 공정을 개발하였다.
중심체, 공지된 유전자, 유사 유전자, 반복, miRNA 표적, 복제 원점과 같은 원하지 않는 서열을 제거하기 위해 전체 인간 게놈의 스크리닝을 수행하였다. 본 발명의 스크리닝 공정은 인간 염색체 15로부터 불활성 서열인 서열번호 10의 선택을 초래하였다.
실시예 5: 재조합 분석
도 4C에서의 웨스턴 블롯 분석은 토끼 다클론성 항-RdCVF 항체를 사용하여 RdCVF 및 RdCVFL의 발현을 보여준다. CT35가 상동 재조합에 적용되지 않음을 입증하는 컨스트럭트 CT35에서 두 단백질이 검출된다.
[참고문헌]
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 참고문헌이 본 발명이 속하는 기술 분야를 기술한다. 이들 참고문헌의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
1. Buch H et al. Prevalence and causes of visual impairment and blindness among 9980 Scandinavian adults: the Copenhagen City Eye Study. Ophthalmology. 2004;111(1):53-61.
2. Bramall AN, Wright AF, Jacobson SG, McInnes RR. The genomic, biochemical, and cellular responses of the retina in inherited photoreceptor degenerations and prospects for the treatment of these disorders. Annu Rev Neurosci. 2010;33(1):441-472.
3. Punzo C, Kornacker K, Cepko CL. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nat Neurosci. 2009;12(1):44-52.
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cgccatgcta cttatctacg tagcaagcta gctagttatt 1440 aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 1500 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 1560 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 1620 agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 1680 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 1740 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt aacatggtcg 1800 aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt 1860 tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc 1920 gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg 1980 cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc 2040 ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgcgc tgccttcgcc 2100 ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac 2160 tcccacaggt gagcgggcgg gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 2220 gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 2280 cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 2340 gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 2400 cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 2460 ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 2520 agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 2580 cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 2640 tgaccggcgg ctctagacaa ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggttgg 2700 tgtacactag cggccgccac catggcctcc ctgttctctg gccgcatcct gatccgcaac 2760 aatagcgacc aggacgagct ggatacggag gctgaggtca gtcgcaggct ggagaaccgg 2820 ctggtgctgc tgttctttgg tgctggggct tgtccacagt gccaggcctt cgtgcccatc 2880 ctcaaggact tcttcgtgcg gctcacagat gagttctatg tactgcgggc ggctcagctg 2940 gccctggtgt acgtgtccca ggactccacg gaggagcagc aggacctgtt cctcaaggac 3000 atgccaaaga aatggctttt cctgcccttt gaggatgatc tgaggaggtg atcatctcat 3060 ggatccaaga gatctgcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 3120 tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 3180 gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 3240 caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga ctcgaaagga 3300 aaatgaagtg aagttcctat actttctaga gaataggaac ttctatagtg agtcgaataa 3360 gggcgacaca aaatttattc taaatgcata ataaatactg ataacatctt atagtttgta 3420 ttatattttg tattatcgtt gacatgtata attttgatat caaaaactga ttttcccttt 3480 attattttcg agatttattt tcttaattct ctttaacaaa ctagaaatat tgtatataca 3540 aaaaatcata aataatagat gaatagttta attataggtg ttcatcaatc gaaaaagcaa 3600 cgtatcttat ttaaagtgcg ttgctttttt ctcatttata aggttaaata attctcatat 3660 atcaagcaaa gtgacaggcg cccttaaata ttctgacaaa tgctctttcc ctaaactccc 3720 cccataaaaa aacccgccga agcgggtttt tacgttattt gcggattaac gattactcgt 3780 tatcagaacc gcccaggggg cccgagctta ctagctagtt attaatagta atcaattacg 3840 gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 3900 ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 3960 atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 4020 gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 4080 gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 4140 tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaacatgg tcgaggtgag ccccacgttc 4200 tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt 4260 taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg 4320 gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 4380 ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 4440 cgaagcgcgc ggcgggcggg gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc 4500 cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg 4560 gcgggatgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct 4620 cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg 4680 ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg 4740 cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc 4800 tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg 4860 gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc 4920 gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg 4980 ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc 5040 tagacaattg tactaacctt cttctctttc ctctcctgac aggttggtgt acactagcgg 5100 ccgccaccat ggcctccctg ttctctggcc gcatcctgat ccgcaacaat agcgaccagg 5160 acgagctgga tacggaggct gaggtcagtc gcaggctgga gaaccggctg gtgctgctgt 5220 tctttggtgc tggggcttgt ccacagtgcc aggccttcgt gcccatcctc aaggacttct 5280 tcgtgcggct cacagatgag ttctatgtac tgcgggcggc tcagctggcc ctggtgtacg 5340 tgtcccagga ctccacggag gagcagcagg acctgttcct caaggacatg ccaaagaaat 5400 ggcttttcct gccctttgag gatgatctga ggaggtgatc atctcatgga tccaagagat 5460 ctgcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 5520 ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 5580 cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 5640 gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggactc gagttctacg tagataagta 5700 gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 5760 tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 5820 tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagcctt aattaaccta aggaaaatga 5880 agtgaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttctat agtgagtcga ataagggcga 5940 cacaaaattt attctaaatg cataataaat actgataaca tcttatagtt tgtattatat 6000 tttgtattat cgttgacatg tataattttg atatcaaaaa ctgattttcc ctttattatt 6060 ttcgagattt attttcttaa ttctctttaa caaactagaa atattgtata tacaaaaaat 6120 cataaataat agatgaatag tttaattata ggtgttcatc aatcgaaaaa gcaacgtatc 6180 ttatttaaag tgcgttgctt ttttctcatt tataaggtta aataattctc atatatcaag 6240 caaagtgaca ggcgccctta aatattctga caaatgctct ttccctaaac tccccccata 6300 aaaaaacccg ccgaagcggg tttttacgtt atttgcggat taacgattac tcgttatcag 6360 aaccgcccag ggggcccgag cttaaccttt ttatttgggg gagagggaag tcatgaaaaa 6420 actaaccttt gaaattcgat ctccagcaca tcagcaaaac gctattcacg cagtacagca 6480 aatccttcca gacccaacca aaccaatcgt agtaaccatt caggaacgca accgcagctt 6540 agaccaaaac aggaagctat gggcctgctt aggtgacgtc tctcgtcagg ttgaatggca 6600 tggtcgctgg ctggatgcag aaagctggaa gtgtgtgttt accgcagcat taaagcagca 6660 ggatgttgtt cctaaccttg ccgggaatgg ctttgtggta ataggccagt caaccagcag 6720 gatgcgtgta ggcgaatttg cggagctatt agagcttata caggcattcg gtacagagcg 6780 tggcgttaag tggtcagacg aagcgagact ggctctggag tggaaagcga gatggggaga 6840 cagggctgca tgataaatgt cgttagtttc tccggtggca ggacgtcagc atatttgctc 6900 tggctaatgg agcaaaagcg acgggcaggt aaagacgtgc attacgtttt catggataca 6960 ggttgtgaac atccaatgac atatcggttt gtcagggaag ttgtgaagtt ctgggatata 7020 ccgctcaccg tattgcaggt tgatatcaac ccggagcttg gacagccaaa tggttatacg 7080 gtatgggaac caaaggatat tcagacgcga atgcctgttc tgaagccatt tatcgatatg 7140 gtaaagaaat atggcactcc atacgtcggc ggcgcgttct gcactgacag attaaaactc 7200 gttcccttca ccaaatactg tgatgaccat ttcgggcgag ggaattacac cacgtggatt 7260 ggcatcagag ctgatgaacc gaagcggcta aagccaaagc ctggaatcag atatcttgct 7320 gaactgtcag actttgagaa ggaagatatc ctcgcatggt ggaagcaaca accattcgat 7380 ttgcaaatac cggaacatct cggtaactgc atattctgca ttaaaaaatc aacgcaaaaa 7440 atcggacttg cctgcaaaga tgaggaggga ttgcagcgtg tttttaatga ggtcatcacg 7500 ggatcccatg tgcgtgacgg acatcgggaa acgccaaagg agattatgta ccgaggaaga 7560 atgtcgctgg acggtatcgc gaaaatgtat tcagaaaatg attatcaagc cctgtatcag 7620 gacatggtac gagctaaaag attcgatacc ggctcttgtt ctgagtcatg cgaaatattt 7680 ggagggcagc ttgatttcga cttcgggagg gaagctgcat gatgcgatgt tatcggtgcg 7740 gtgaatgcaa agaagataac cgcttccgac caaatcaacc ttactggaat cgatggtgtc 7800 tccggtgtga aagaacacca acaggggtgt taccactacc gcaggaaaag gaggacgtgt 7860 ggcgagacag cgacgaagta tcaccgacat aatctgcgaa aactgcaaat accttccaac 7920 gaaacgcacc agaaataaac ccaagccaat cccaaaagaa tctgacgtaa aaaccttcaa 7980 ctacacggct cacctgtggg atatccggtg gctaagacgt cgtgcgagga aaacaaggtg 8040 attgaccaaa atcgaagtta cgaacaagaa agcgtcgagc gagctttaac gtgcgctaac 8100 tgcggtcaga agctgcatgt gctggaagtt cacgtgtgtg agcactgctg cgcagaactg 8160 atgagcgatc cgaatagctc gatgcacgag gaagaagatg atggctaaac cagcgcgaag 8220 acgatgtaaa aacgatgaat gccgggaatg gtttcaccct gcattcgcta atcagtggtg 8280 gtgctctcca gagtgtggaa ccaagatagc actcgaacga cgaagtaaag aacgcgaaaa 8340 agcggaaaaa gcagcagaga agaaacgacg acgagaggag cagaaacaga aagataaact 8400 taagattcga aaactcgcct taaagccccg cagttactgg attaaacaag cccaacaagc 8460 cgtaaacgcc ttcatcagag aaagagaccg cgacttacca tgtatctcgt gcggaacgct 8520 cacgtctgct cagtgggatg ccggacatta ccggacaact gctgcggcac ctcaactccg 8580 atttaatgaa cgcaatattc acaagcaatg cgtggtgtgc aaccagcaca aaagcggaaa 8640 tctcgttccg tatcgcgtcg aactgattag ccgcatcggg caggaagcag tagacgaaat 8700 cgaatcaaac cataaccgcc atcgctggac tatcgaagag tgcaaggcga tcaaggcaga 8760 gtaccaacag aaactcaaag acctgcgaaa tagcagaagt gaggccgcat gacgttctca 8820 gtaaaaacca ttccagacat gctcgttgaa acatacggaa atcagacaga agtagcacgc 8880 agactgaaat gtagtcgcgg tacggtcaga aaatacgttg atgataaaga cgggaaaatg 8940 cacgccatcg tcaacgacgt tctcatggtt catcgcggat ggagtgaaag agatgcgcta 9000 ttacgaaaaa attgatggca gcaaataccg aaatatttgg gtagttggcg atctgcacgg 9060 atgctacacg aacctgatga acaaactgga tacgattgga ttcgacaaca aaaaagacct 9120 gcttatctcg gtgggcgatt tggttgatcg tggtgcagag aacgttgaat gcctggaatt 9180 aatcacattc ccctggttca gagctgtacg tggaaaccat gagcaaatga tgattgatgg 9240 cttatcagag cgtggaaacg ttaatcactg gctgcttaat ggcggtggct ggttctttaa 9300 tctcgattac gacaaagaaa ttctggctaa agctcttgcc cataaagcag atgaacttcc 9360 gttaatcatc gaactggtga gcaaagataa aaaatatgtt atctgccacg ccgattatcc 9420 ctttgacgaa tacgagtttg gaaagccagt tgatcatcag caggtaatct ggaaccgcga 9480 acgaatcagc aactcacaaa acgggatcgt gaaagaaatc aaaggcgcgg acacgttcat 9540 ctttggtcat acgccagcag tgaaaccact caagtttgcc aaccaaatgt atatcgatac 9600 cggcgcagtg ttctgcggaa acctaacatt gattcaggta cagggagaag gcgcatgaga 9660 ctcgaaagcg tagctaaatt tcattcgcca aaaagcccga tgatgagcga ctcaccacgg 9720 gccacggctt ctgactctct ttccggtact gatgtgatgg ctgctatggg gatggcgcaa 9780 tcacaagccg gattcggtat ggctgcattc tgcggtaagc acgaactcag ccagaacgac 9840 aaacaaaagg ctatcaacta tctgatgcaa tttgcacaca aggtatcggg gaaataccgt 9900 ggtgtggcaa agcttgaagg aaatactaag gcaaaggtac tgcaagtgct cgcaacattc 9960 gcttatgcgg attattgccg tagtgccgcg acgccggggg caagatgcag agattgccat 10020 ggtacaggcc gtgcggttga tattgccaaa acagagctgt gggggagagt tgtcgagaaa 10080 gagtgcggaa gatgcaaagg cgtcggctat tcaaggatgc cagcaagcgc agcatatcgc 10140 gctgtgacga tgctaatccc aaaccttacc caacccacct ggtcacgcac tgttaagccg 10200 ctgtatgacg ctctggtggt gcaatgccac aaagaagagt caatcgcaga caacattttg 10260 aatgcggtca cacgttagca gcatgattgc cacggatggc aacatattaa cggcatgata 10320 ttgacttatt gaataaaatt gggtaaattt gactcaacga tgggttaatt cgctcgttgt 10380 ggtagtgaga tgaaaagagg cggcgcttac taccgattcc gcctagttgg tcacttcgac 10440 gtatcgtctg gaactccaac catcgcaggc agagaggtct gcaaaatgca atcccgaaac 10500 agttcgcagg taatagttag agcctgcata acggtttcgg gattttttat atctgcacaa 10560 caggtaagag cattgagtcg ataatcgtga agagtcggcg agcctggtta gccagtgctc 10620 tttccgttgt gctgaattaa gcgaataccg gaagcagaac cggatcacca aatgcgtaca 10680 ggcgtcatcg ccgcccagca acagcacaac ccaaactgag ccgtagccac tgtctgtcct 10740 gaattcatta gtaatagtta cgctgcggcc ttttacacat gaccttcgtg aaagcgggtg 10800 gcaggaggtc gcgctaacaa cctcctgccg ttttgcccgt gcatatcggt cacgaacaaa 10860 tctgattact aaacacagta gcctggattt gttctatcag taatcgacct tattcctaat 10920 taaatagagc aaatcccctt attgggggta agacatgaag atgccagaaa aacatgacct 10980 gttggccgcc attctcgcgg caaaggaaca aggcatcggg gcaatccttg cgtttgcaat 11040 ggcgtacctt cgcggcagat ataatggcgg tgcgtttaca aaaacagtaa tcgacgcaac 11100 gatgtgcgcc attatcgcct agttcattcg tgaccttctc gacttcgccg gactaagtag 11160 caatctcgct tatataacga gcgtgtttat cggctacatc ggtactgact cgattggttc 11220 gcttatcaaa cgcttcgctg ctaaaaaagc cggagtagaa gatggtagaa atcaataatc 11280 aacgtaaggc gttcctcgat atgctggcgt ggtcggaggg aactgataac ggacgtcaga 11340 aaaccagaaa tcatggttat gacgtcattg taggcggaga gctatttact gattactccg 11400 atcaccctcg caaacttgtc acgctaaacc caaaactcaa atcaacaggc taagactggc 11460 cgtcgtttta caacacagaa agagtttgta gaaacgcaaa aaggccatcc gtcaggggcc 11520 ttctgcttag tttgatgcct ggcagttccc tactctcgcc ttccgcttcc tcgctcactg 11580 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 11640 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 11700 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 11760 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 11820 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 11880 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 11940 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 12000 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 12060 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 12120 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtgggc taactacggc tacactagaa 12180 gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 12240 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 12300 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 12360 acgctcagtg gaacgacgcg cgcgtaactc acgttaaggg attttggtca tgagcttgcg 12420 ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc t 12451

Claims (9)

  1. - RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
    - RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드(contiguous identical nucleotides)를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터(adeno-associated vector, AAV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 아데노-관련 벡터(AAV)는 혈청형 AAV2/8인, 아데노-관련 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RdCVF를 코딩하는 제1 핵산은 편재성 프로모터, 바람직하게는 CMV/CBA 프로모터의 조절 하에 있는, 아데노-관련 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산은 간체-옵신 프로모터의 조절 하에 있는, 아데노-관련 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노-관련 벡터는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 그룹, 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 핵산 서열을 갖는, 아데노-관련 벡터.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노-관련 벡터는 서열번호 10의 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 추가로 포함하는, 아데노-관련 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노-관련 벡터는 망막 신경퇴행성 장애의 치료 방법에 사용되는, 아데노-관련 벡터.
  8. - RdCVF를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트 및
    - RdCVFL을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 발현 카세트는 200개 미만의 연속적으로 동일한 뉴클레오티드를 디스플레이하는 아데노-관련 벡터의 치료적 유효량을 망막 퇴행성 질환 환자에게 투여하는 것으로 이루어진 단계를 포함하는, 망막 퇴행성 질환 환자의 치료 방법.
  9. 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 핵산을 포함하되, 상기 서열번호 10으로 표시되는 서열을 갖는 핵산은 발현 카세트에는 존재하지 않는 아데노-관련 벡터.
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