CN111742052A

CN111742052A - 包含神经元活力因子的构建体及其用途

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Publication number: CN111742052A
Application number: CN201880089629.4A
Authority: CN
Inventors: T·勒维拉德; N·艾特-艾里·马里; F·布隆; J-A·萨赫尔; G·皮埃尔; E·克勒林
Original assignee: Saving Vision Co; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite
Current assignee: Saving Vision Co; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-10-02
Also published as: SG11202006796RA; JP7231647B2; EP3728610B1; DK3728610T3; BR112020012471A2; EP3728610A1; ES2949484T3; KR20200107990A; US20200318138A1; AU2018387826A1; JP2021508493A; WO2019122403A1; CA3086292A1; IL275529A

Abstract

本发明涉及改进的构建体，所述构建体包含短和长的视杆来源的视锥生存因子，并且涉及用于治疗视网膜退行性疾病的方法。

Description

包含神经元活力因子的构建体及其用途

技术领域

本发明涉及视网膜神经退行性疾病，并且更具体涉及用于治疗和/或预防神经退行性疾病的药物组合物。

背景技术

神经退行性疾病涵盖一系列以神经元变性为特征的严重衰弱性疾病。

视杆-视锥营养不良，诸如色素性视网膜炎(RP)，是一种遗传性异质性视网膜退行性疾病，其特征是杆状光受体的渐进式死亡，随后是视锥的连续损失。RP是遗传性视网膜变性的最常见形式之一，在全世界范围内影响着约1：3,500人(1)。迄今为止，已经在超过63个不同基因中鉴定出引起RP的突变，其中在视杆特异性转录物中有相当比例的这些突变。RP患者最初由于视杆功能障碍而在昏暗的光线下出现视力损失，并相对保留了黄斑视锥介导的视力。但是，随着疾病的进展，初始是视杆损失，随后是视锥变性，以及对应的视锥介导的视力的下降。在现代社会中，大部分环境都是人工照明的，并且许多活动都依赖于高灵敏度色觉，在RP患者中保留视锥介导的视力将大大改善其生活质量。

尽管已经提出了几种不一定互斥的机理，但仍没有完全理解由视杆特异性突变引起的RP亚型中视锥的损失。一些假说提出“邻近效应”，即视锥死亡是由于周围视杆的退化释放出内毒素引起的，或是由于失去与视杆、视网膜色素上皮(RPE)或米勒神经胶质细胞的接触。或者，米勒细胞的活化和毒性分子的释放也可能起作用。另一种假说是，由于视杆的代谢负荷降低，由RPE从脉络膜血液循环输送到感光层的氧气或类视黄醇的数量过多且有毒(2)。Punzo等人证明，在视网膜变性小鼠模型中，视锥部分死亡是由于饥饿和营养失衡所致，这是由雷帕霉素途径的胰岛素/哺乳动物靶标驱动的(3)。另外，已经提出由视杆分泌的且视锥存活所需的生存因子的损失可能导致视锥损失(4,5)。

与最后一种假说相符，已证实在rd1小鼠中，植入的健康视网膜组织可在远离移植组织的区域支持视锥细胞的存活(6,7)。

国际专利申请WO2008/148860A1描述了营养因子家族，称为视杆来源的视锥生存因子(RdCVF)和RdCVF2，它们能够促进神经元存活并且可用于治疗和/或预防诸如RP的神经退行性疾病。

视杆来源的视锥生存因子(RdCVF)最初是通过高通量筛选cDNA文库的方法鉴定出来的，作为负责这种救援作用的候选分子(4)。视杆分泌RdCVF，因此当视杆死亡时，失去了这种旁分泌因子的来源，且RdCVF水平降低。因此，RdCVF和类似的分泌因子的表达缺失，可能会有助于在视杆-视锥营养不良中观察到的第二波视锥变性。已证明，RdCVF可在培养物中(8)并且在隐性和显性色素性视网膜炎的小鼠和大鼠模型中视网膜下注射时介导视锥的存活(4,9)。编码RdCVF的Nxnl1基因的破坏使小鼠光感受器越来越容易受到光感受器功能障碍和视锥细胞丢失的影响(10)。

Nxnl1通过不同剪接方式编码两种蛋白质异构体。介导视锥存活的异构体RdCVF是其较长的对应物RdCVFL的截短型硫氧还蛋白折叠蛋白，其包括赋予酶促巯基氧化还原酶活性的C端延伸(11)。含有RdCVF的全部氨基酸的RdCVFL由Nxnl1基因的外显子1和2编码，并且是硫氧还蛋白家族成员之一(12)。硫氧还蛋白具有多种功能，包括维持细胞中适宜的还原环境以及参与细胞凋亡途径。这些功能是通过硫氧还蛋白折叠内的保守CXXC催化位点介导的巯基氧化还原酶反应实现的(13)。

Byrne等人(32)证明，RdCVF的两种异构体具有互补功能。全身施用编码RdCVF的腺相关病毒(AAV)改进了视锥功能并延缓了视锥损失，同时RdCVFL增加了视紫红质mRNA的表达并降低了氧化应激。RdCVFL预防了视杆的光氧化损伤(36)。

国际专利申请WO2016/185037描述了同时编码RdCVF和RdCVFL的AAV载体，特别是AAV CT35，以及所述载体在治疗诸如色素性视网膜炎的病理中的用途。

已证明RdCVF和RdCVFL之间具有协同作用(34)。一方面，RdCVF由视网膜色素上皮细胞(RPE)产生和分泌，通过非细胞自主机制，经由视锥表面的RdCVF受体刺激有氧糖酵解来保护视锥(37)。另一方面，由于其巯基氧化还原酶功能，RdCVFL以细胞自主方式保护视锥免受氧化损伤。

本发明人现已发现，生产这种AAV载体会预料不到地出现AAV基因组衣壳化的问题。不完全包装这一问题导致生产含全基因组的AAV颗粒存在缺陷。

这限制了生产用于人体治疗的符合GMP的AAV载体。

因此，仍然需要表达RdCVF和RdCVFL因子的改进的构建体，以用于治疗视网膜神经退行性疾病。

发明内容

发明人已经发现，生产包含编码RdCVF的第一核酸和编码RdCVFL的第二核酸的单个AAV载体可能遇到病毒衣壳内AAV单链DNA包装不完全的问题。这种不完全的衣壳化导致产生不完整的AAV基因组，因此DNA的尺寸较小。

发明人意外地发现，这种不完全的衣壳化是由于在AAV基因组内存在同向重复序列，并且限定在第一和第二表达盒之间的相同核苷酸的长度为最多200个连续相同的核苷酸时，AAV可被完全包装。

因此，本发明通过提供AAV载体为该问题提供了解决方案，该AAV载体包含第一表达盒(其包含编码RdCVF的第一核酸)和第二表达盒(其包含编码RdCVFL的第二核酸)，其中优化了AAV颗粒的生产。

根据本发明的AAV包含第一和第二表达盒，其显示最多200个连续相同的核苷酸，优选最多190个，甚至更优选最多180、170、167、165、164、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、55、54、50、40、30、20、15、10、9或8个连续相同的核苷酸。

本发明人针对第一表达盒和第二表达盒之间的同向重复序列的问题，开发了几种替换的和/或累加的方案。

因此，一方面，本发明涉及腺相关载体(AAV)，其包含：

-第一表达盒，其包含编码RdCVF的第一核酸；和

-第二表达盒，其包含编码RdCVFL的第二核酸，

其中所述第一和第二表达盒显示少于200个连续相同的核苷酸。

在另一方面，本发明涉及用于治疗视网膜神经退行性疾病的方法的腺相关载体(AAV)，其包含：

-第一表达盒，其包含编码RdCVF的第一核酸；和

-第二表达盒，其包含编码RdCVFL的第二核酸，

本发明还涉及用于治疗患有视网膜退行性疾病的患者的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效量的腺相关载体(AAV)的步骤，所述腺相关载体包含：

-第一表达盒，其包含编码RdCVF的第一核酸；和

-第二表达盒，其包含编码RdCVFL的第二核酸，

本发明还涉及惰性的人DNA序列在AAV构建体中的用途。

一方面，本发明涉及AAV，其包含具有SEQ ID NO：10所示序列的核酸，其中所述具有SEQ ID NO：10所示序列的核酸不存在于表达盒中。

发明详述

因此，一方面，本发明涉及腺相关载体(AAV)，其包含：

-第一表达盒，其包含编码RdCVF的第一核酸；和

-第二表达盒，其包含编码RdCVFL的第二核酸，

第一和第二表达盒显示少于200个连续相同的核苷酸的事实，是指第一和第二表达盒具有少于200个连续相同的核苷酸。

典型地，第一表达盒和第二表达盒共有最多200个连续相同的核苷酸，优选最多190个，甚至更优选最多180、170、167、165、164、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、55、54、50、40、30、20、15、10、9或8个连续相同的核苷酸。

-第一表达盒，其包含编码RdCVF的第一核酸；和

-第二表达盒，其包含编码RdCVFL的第二核酸，

-第一表达盒，其包含编码RdCVF的第一核酸；和

-第二表达盒，其包含编码RdCVFL的第二核酸，

如本文所用，术语视杆来源的视锥生存因子(RdCVF)是指由类硫氧还蛋白6(TXNL6)或类核糖体毒素1(NXNL1)基因编码的蛋白质。其涵盖任何动物物种的RdCVF蛋白。典型地，根据本发明的RdCVF蛋白可以是哺乳动物的RdCVF蛋白，包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、非人灵长类动物和人。

除非另有说明，否则术语“RdCVF”是指NXNL1基因的短异构体，“RdCVFL”或“RdCVF-L”是指NXNL1基因的长异构体。

典型地，在小鼠中，短异构体(RdCVF)是109个氨基酸长度的蛋白，其Uniprot登录号为Q91W38。小鼠长异构体(RdCVFL)是217个氨基酸长度的蛋白，其编号为Q8VC33。

在本发明的一个实施方案中，RdCVF短异构体是人RdCVF短异构体(hRdCVF)，其具有以下序列：

相应地，编码RdCVF短异构体的第一核酸可包含以下人核酸序列：

ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGACGAGCTGGATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGTGCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGGCTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAGGACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTCCTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGTGA(SEQ ID NO：3)

或者，第一核酸可包含不同于SEQ ID NO：3但编码相同氨基酸序列的核酸。

合适的核酸序列包括但不限于：

-编码人RdCVF的cDNA的多态；

-编码人RdCVF的cDNA多态(罕见单倍型)的组合。罕见单倍型cDNA的示例如SEQ IDNO：11所示；

-“优化”序列，其中某些密码子被编码相同氨基酸的密码子替代。合适的编码RdCVF的密码子优化序列包括但不限于SEQ ID NO：12所示的序列；

-同源序列。例如，本发明人已发现可以使用编码黑猩猩RdCVF短异构体的黑猩猩cDNA序列，因为它编码与人cDNA相同的氨基酸序列。该黑猩猩cDNA具有如SEQ ID NO：4所示的序列。

在本发明的一个实施方案中，NXNL1基因的长异构体是人长异构体RdCVFL(hRdCVFL)，其具有登录号为Q96CM4的序列，如下所示：

相应地，编码RdCVFL的第二核酸可以包含以下人核酸序列：

ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGACGAGCTGGATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGTGCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGGCTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAGGACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTCCTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGGACCTCGGGCGCCAGTTCTCAGTGGAGCGCCTGCCGGCGGTCGTGGTGCTCAAGCCGGACGGGGACGTGCTCACTCGCGACGGCGCCGACGAGATCCAGCGCCTGGGCACCGCCTGCTTCGCCAACTGGCAGGAGGCGGCCGAGGTGCTGGACCGCAACTTCCAGCTGCCAGAGGACCTGGAGGACCAGGAGCCACGGAGCCTCACCGAGTGCCTGCGCCGCCACAAGTACCGCGTGGAAAAGGCGGCGCGAGGCGGGCGCGACCCCGGGGGAGGGGGTGGGGAGGAGGGCGGGGCCGGGGGGCTGTTCTGA(SEQ ID NO:5)

或者，第二核酸可包含不同于SEQ ID NO：5但编码相同氨基酸序列的核酸。

合适的核酸序列包括但不限于：

-编码人RdCVF的cDNA的多态或其组合；

-“优化”序列，其中某些密码子被编码相同氨基酸的密码子替代；合适的密码子优化的编码RdCVF的序列包括但不限于SEQ ID NO：12所示的序列；

-其他物种中的同源序列。

RdCVF和RdCVFL蛋白的序列描述于Chalmel等人2007(39)和国际专利申请WO2008/148860中。

如本文所用，术语“腺相关载体”或“AAV”具有本领域的通用含义。

AAV已在本领域中广泛描述为用于基因递送的合适载体。

实际上，AAV是非致病性的，并且取决于其血清型显示广泛的组织特异性。典型地，根据本发明的AAV是能够靶向视网膜细胞的AAV。

示例包括但不限于AAV2、AAV8、AAV2/8、AAV2/5、AAV2/9和AAV7m8。

在一个实施方案中，根据国际专利申请WO2012/158757中所述的方法，获得本发明的AAV。

典型地，分别编码NXNL1基因的短异构体和长异构体的第一核酸和第二核酸在启动子的控制下，所述启动子允许所述短异构体和长异构体在靶细胞中表达。

合适的启动子可以是泛在启动子(ubiquitous promoters)，诸如CMV/CBA启动子。

合适的启动子可以是能够在视网膜中，优选在视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞中表达的启动子。

在一个实施方案中，所述启动子允许在视网膜色素上皮细胞中基因表达。

在一个实施方案中，所述启动子允许在视锥光感受器中基因表达。非限制性示例是锥体蛋白(cone-opsin)启动子。

典型地，NXNL1基因的短异构体至少由视网膜色素上皮细胞表达，而长异构体至少由视锥光感受器细胞表达。

在本发明的一个实施方案中，使用不同的启动子来驱动短异构体和长异构体的表达。

典型地，可以在CMV/CBA启动子的控制下表达NXNL1基因的短异构体，并在锥体蛋白(cone-opsin)启动子的控制下表达NXNL1基因的长异构体。

在本发明的一个实施方案中，两个表达盒是颠倒的，一个表达盒为5'至3'，另一个表达盒为3'至5'。

本发明人已发现该构建体也适合于避免不完全的包装。

在本发明的一个实施方案中，以上所述腺相关载体(AAV)还包含SEQ ID NO：10的填充序列。

在一个特定实施方案中，本发明涉及腺相关载体(AAV)，其包含：

-第一表达盒，其包含第一核酸(该第一核酸包含密码子优化的编码RdCVF的cDNA)，所述第一核酸在泛在启动子的控制下，优选在CMV/CBA启动子的控制下，和

-第二表达盒，其包含第二核酸(该第二核酸包含密码子优化的编码RdCVFL的cDNA)，所述第二核酸在锥体蛋白启动子(OPN1L/MW)的控制下。

在一个实施方案中，包含密码子优化的编码RdCVF的cDNA的第一核酸具有SEQ IDNO：12所示的序列。

在一个实施方案中，包含密码子优化的编码RdCVFL的cDNA的第二核酸具有SEQ IDNO：13所示的序列。

在一个实施方案中，腺相关载体具有如SEQ ID NO：6所示的序列(对应于下述实施例的构建体3)。

在本发明中，如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指逆转、减轻、抑制发展或预防该术语应用的病症或病状，或该病症或病状的一种或多种症状(例如视网膜退行性疾病)。

术语“视网膜退行性疾病”涵盖与视锥细胞变性相关的所有疾病。视网膜退行性疾病包括但不限于色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性、Bardet-Biedel综合征、Bassen-Kornzweig综合征、贝斯特氏症、脉络膜瘤、环状萎缩、伯氏先天性黑朦、雷夫叙姆病、斯特格氏病或尤塞氏综合症。

在本发明的一个实施方案中，视网膜退行性疾病是色素性视网膜炎。

根据本发明，术语“患者”或“需要其的患者”旨在用于患有或可能患有视网膜退行性疾病的人或非人哺乳动物。

根据本发明，组合物的“治疗有效量”是足以实现所需的在本发明中提高神经元的存活率的生物学作用的量。应当理解，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重、同时进行的治疗类型(如果有的话)、治疗的频率、以及所需效果的性质。但是，如本领域技术人员所理解和确定的，优选剂量可以适合个体受试者，而无需过度实验。

本发明的表达载体可以适合于眼内施用。在一个具体实施方案中，表达载体通过视网膜下注射施用。

一方面，本发明还涉及药物组合物，其包含腺相关载体(AAV)和药学上可接受的载体，其中所述AAV包含：

-第一表达盒，其包含编码RdCVF的第一核酸，

-第二表达盒，其包含编码RdCVFL的第二核酸，

在另一方面，本发明涉及包含具有SEQ ID NO：10所示序列的核酸的AAV，其中所述具有SEQ ID NO：10所示序列的核酸不存在于表达盒中。该序列SEQ ID NO：10在AAV中具有填充DNA的作用。填充序列的作用是增加载体的大小，以避免衣原病毒质粒而非目标基因被衣壳化。

通常，在AAV中使用对应于λ噬菌体DNA的填充物。但是，最常用作填充物的λ噬菌体序列包含开放阅读框，即nin区。尽管由于与人类的遗传距离而被认为是惰性的，Cheng等人(38)证明这种填充物的惰性不同于预期，因为nin区可能具有很强的转录活性。因此，当将具有这种填充物的AAV施用于人类患者时，存在λ噬菌体DNA转录的风险。

因此，开发新的惰性填充物很重要。本发明人出乎意料地发现具有SEQ ID NO：10所示序列的核酸可用作“填充物”DNA，以便增加AAV构建体的大小，以取代λ噬菌体填充物。所述具有SEQ ID NO：10所示序列的核酸具有惰性的巨大优点，因为该序列是非翻译序列，不是miRNA靶标，是非端粒序列，它不含有任何DNA复制起点，不含有重复的核苷酸。该序列具有任何功能活性，在AAV中用作填充序列时没有转录的风险。

通过如图3中所述的全过程选择SEQ ID NO：10所示的序列。这是一种生物信息学途径，包括在不含任何元件(如着丝粒、基因、伪基因、复制起点、micro RNA靶向序列、或重复序列)的人类基因组区域中识别。从这些基因座中选择NO:10序列。

通过以下实施例和附图进一步说明本发明。

附图说明

图1：根据本发明的优选构建体的示意图

图1A表示构建体CT35，WO2016/185037中公开的比较例(因此不是根据本发明的构建体)。图1B、1C和1D分别代表根据本发明的构建体3(C03)、构建体6(C06)和构建体11(C11)。

图2：变性凝胶电泳分析AAV基因组大小的单链DNA

在变性条件下，通过凝胶电泳分析不同构建体的AAV基因组单链DNA的大小：

-同时表达RdCVF和RdCVFL的构建体3(C03)(7^v7.AAV2-CMV/CBA^orig-RdCVF-5’_1.7.OPN1L/MW-RdCVFL)

-同时表达RdCVF和RdCVFL的CT35(AAV2-CMV/CBA-RdCVF-CMV/CBA-RdCVFL)(SEQID NO：15)

-仅表达RdCVF的CT37(AAV2-CMV/CBA-RdCVF+填充物)(SEQ ID NO：16)。

图3：惰性“填充物”DNA筛选过程的示意图

图4：包装比较

图4A：AAV CT35的其他形式。在这种同时表达RdCVF和RdCVFL的AAV中，由于启动子的同向重复，第一和第二表达盒具有390个连续相同的核苷酸[CMV/CBAδ390]。

图4B：两个拷贝[CMV/CBAδ390]之间的重组情况的图形模拟，将产生表达盒[CMV/CBAδ390-RdCVF]消除或与表达盒[CMV/CBAδ390-RdCVFL]重组。

图4C：CT35(AAV-CMV/CBA-RdCVF_CMV/CBA-RdCVFL)在猪色素上皮的原代细胞中的转导。使用兔抗RdCVF多克隆抗体进行RdCVF和RdCVFL蛋白质印迹分析(4)。

图4D：AAV C06的其他形式及重组情况的图形模拟。该AAV中，第一和第二表达盒共有167个连续相同核苷酸的同向重复序列。

图4E：AAV C03的其他形式。

图4F：衣壳化AAV C06、C03、CT35和CT37(衣壳蛋白加DNA)的基因组完整性分析。

图4G和4H：代表对于C03和C06，包含完全衣壳化AAV的衣壳的百分比(完全)、包含不完全衣壳化AAV的衣壳的百分比(中)和不包含AAV的衣壳的百分比(无；无DNA)的表。表4G显示了针对衣壳蛋白和DNA(AAV基因组)的检测结果。表4H显示仅针对DNA的检测结果。

实施例

实施例1

下面提供了根据本发明的合适构建体的非限制性实施例。

构建体3

(C03):7^v7.AAV2-CMV/CBA^orig-RdCVF-5’_1.7.OPN1L/MW-RdCVFL

如图1B所示，在此构建体中，人RdCVF cDNA序列经过密码子优化(使用第一优化方法v1)，并置于泛在启动子CMV/CBA下。还对人RdCVFL cDNA进行了密码子优化(使用不同的优化方法v2)，并将其置于锥体蛋白启动子的控制之下。在第一和第二表达盒之间共有的同向重复序列为9个核苷酸长度。

所述AAV载体具有SEQ ID NO：6所示的序列。

构建体6(C06)：

AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL

如图1C和4D所示，在该构建体中，黑猩猩RdCVF cDNA序列用于第一个表达盒中，并置于泛在启动子CMV/CBA下。将人RdCVFL cDNA置于锥体蛋白启动子的控制之下。在第一和第二表达盒之间共有的同向重复序列为167个核苷酸长度。

所述AAV载体具有SEQ ID NO：7所示的序列。

构建体7(C07)：

AAV2_rev_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL

该构建体与构建体6相似，除了第一表达盒以相反的方向放置。

所述AAV载体具有SEQ ID NO：8所示的序列。

构建体8(C08)：

AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_rev_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL-hGH

该构建体与构建体6相似，除了第二表达盒以相反的方向放置。

所述AAV载体具有SEQ ID NO：9所示的序列。

构建体11(C11)：

AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_rare_haplotype_human_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL

如图1D所示，在该构建体中，第一表达盒包含编码人RdCVF cDNA的多态(罕见单倍型)的组合，在泛在启动子CMV/CBA控制下表达。第二表达盒包含人RdCVFL cDNA，在锥体蛋白启动子的控制下。在第一和第二表达盒之间共有的同向重复序列为54个核苷酸长度。

所述AAV载体具有SEQ ID NO：14所示的序列。

实施例2：显示长串的相同核苷酸的AAV构建体经受不完全包装。

材料与方法

病毒载体的产生

通过质粒共转染方法产生携带编码小鼠RdCVF、RdCVFL或eGFP的cDNA的AAV载体(31)。通过氯化铯或碘克沙醇梯度超速离心纯化重组AAV。将病毒洗脱液进行缓冲液交换，并用Amicon Ultra-15离心过滤器在PBS中浓缩，并通过定量PCR相对于标准曲线进行滴定。。

变性凝胶电泳

提取基因组DNA，进行变性凝胶电泳。将核酸的大小与DNA标尺比较。

结果

图2和图4F示出了WO2016/185037中公开的构建体CT37，而非本发明的构建体。仅表达RdCVF的该比较例需要进行完全包装，因为其生产的DNA预期大小为～5000bp。

如图2和图4F所示，包含390个连续相同核苷酸的重复序列的CT35(图4A)不完全包装，因为其生产导致异常的AAV基因组大小，而不是4804bp的AAV基因组。

因此，充分证明了在AAV中表达编码RdCVF的第一核酸和编码RdCVFL的第二核酸，可导致病毒衣壳内的AAV单链DNA不完全衣壳化。

相反，根据本发明的同时表达RdCVF和RdCVFL并且包含仅仅167个核苷酸长度的同向重复序列的构建体C06在预期大小4926bp下显示条带。该结果证明构建体C06的完全衣壳化。

同样，包含9个连续相同的核苷酸的重复序列的构建体C03在预期大小4926bp下显示条带。

这说明减少两个表达盒之间共有的连续相同的核苷酸的数目，允许增加包含同时编码RdCVF的核酸和编码RdCVFL的核酸的AAV的完全衣壳化的比例。

因此，本发明人证明，当第一表达盒和第二表达盒不包含超过200个连续核酸时，可以获得完全包装。

为了进一步探究这一现象，根据Burnham等人的分析超速离心技术(35)比较不同的构建体(图4G和4H)。C03和C06的结果表明，在变性凝胶中观察到的额外条带与高百分比的具有中等沉降系数的AAV颗粒的条带相匹配，代表介于“完全”与“无”之间的颗粒，因此对应于包含不完全包装AAV的颗粒。与变性凝胶电泳中获得的结果一致，在分析超速离心方法中，构建体C06表现出18％的完全衣壳化，而构建体C03产生了合适的结果，表现出高比例的完全AAV颗粒(58％)(图4H)。

这证实了当两个表达盒之间共有的连续相同核苷酸的数量不超过200时，具有完整基因组的颗粒的百分比会增加。

实施例3：RdCVF和RdCVFL的组合产生协同效应

生产以下构建体并将其引入AAV2载体。

前病毒质粒p618及其元件描述于国际专利申请WO2012158757A1以及公开文献(33)中。

2xRdCVF：质粒p857与AAV CT39

相比CT37(RdCVF-填充物)，P857/CT39设计用于提高RdCVF的表达水平，从而为患有色素性视网膜炎(RP)的患者提供足够的视锥保护。

RdCVF-RdCVFL：质粒p853与AAV CT35

该载体能够同时表达RdCVF短异构体和长异构体。

但是，其生产会遭受异常的不完全包装事件，这限制了其作为治疗剂的用途。

实施例4：选择惰性DNA替代λ噬菌体填充物

本发明人已开发了用于鉴定核酸序列的筛选方法，该核酸序列可以用作传统上用于获得具有足够大小的AAV构建体的λ噬菌体填充序列的更安全的替代物。

为了消除不需要的序列(诸如着丝粒、已知基因、伪基因、重复序列、miRNA靶标、复制起点)，筛选整个人类基因组。本发明的筛选方法最终选择了SEQ ID NO：10，这是来自人类15号染色体的惰性序列。

实施例5：重组情况分析

图4C显示了使用兔抗RdCVF多克隆抗体，蛋白质印迹分析RdCVF和RdCVFL的表达情况。针对构建体CT35检测了两种蛋白质，其证明了CT35不受同源重组的影响。

参考资料

本申请中，多篇参考文献描述了本发明所属领域的现有技术状况。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开文本中。

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