ES2949484T3

ES2949484T3 - Construcciones que comprenden factores de viabilidad neuronal y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2949484T3
Application number: ES18826078T
Authority: ES
Inventors: Thierry Leveillard; Maamri Najate A�?T-Ali; Frédéric Blond; José-Alain Sahel; Géraldine Puel; Emmanuelle Clerin
Original assignee: Sparingvision; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite
Current assignee: Sparingvision; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sorbonne Universite
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2023-09-28
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: CN111742052A; KR20200107990A; IL275529A; BR112020012471A2; EP3728610B1; JP2021508493A; SG11202006796RA; AU2018387826A1; JP7231647B2; EP3728610A1; DK3728610T3; CA3086292A1; US20200318138A1; WO2019122403A1

Abstract

La presente invención se refiere a construcciones mejoradas que comprenden los factores de viabilidad de los conos derivados de bastones cortos y largos y a métodos para tratar enfermedades degenerativas de la retina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones que comprenden factores de viabilidad neuronal y usos de las mismas

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a trastornos neurodegenerativos de la retina, y más particularmente a una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir trastornos neurodegenerativos.

Estado de la técnica

El trastorno neurodegenerativo abarca un intervalo de afecciones seriamente debilitantes que se caracterizan por la degeneración neuronal.

Las distrofias de conos y bastones, tales como la retinitis pigmentaria (RP), son enfermedades degenerativas de la retina genéticamente heterogéneas caracterizadas por la muerte progresiva de fotorreceptores de bastones seguida de la pérdida consecutiva de conos. La RP es una de las formas más comunes de degeneración retiniana hereditaria, que afecta a alrededor de 1:3.500 personas en todo el mundo (1). Hasta la fecha se han identificado mutaciones que causan RP en más de 63 genes distintos, con una proporción significativa de estas mutaciones en transcritos específicos de bastones. Los pacientes de RP presentan inicialmente pérdida de visión en condiciones de poca luz como resultado de la disfunción de los bastones, con una conservación relativa de la visión mediada por conos de la mácula. A medida que la enfermedad progresa, sin embargo, a la pérdida primaria de bastones le sigue la degeneración de conos y un déficit en la visión correspondiente mediada por conos. En la sociedad moderna, en la que muchos ambientes se iluminan artificialmente y muchas actividades dependen de la visión de colores con elevada precisión, la conservación de la vista mediada por conos en pacientes de RP conllevaría una mejora significativa en la calidad de vida.

La pérdida de conos en subgrupos de RP causada por mutaciones específicas de bastones no se conoce a la perfección, aunque varios mecanismos, que no son necesariamente mutuamente excluyentes, han sido propuestos. Algunos mecanismos hipotéticos implican un 'efecto de vecindad' por el que la muerte de conos es una consecuencia de la liberación de endotoxinas a partir de la degeneración de bastones circundantes o como resultado de la pérdida de contacto con bastones, el epitelio pigmentario de la retina (EPR; en inglés, RPE) o la glía de Müller. Como alternativa, podrían desempeñar un papel la activación de las células de Müller y la liberación de moléculas tóxicas. Otra hipótesis consiste en que las cantidades de oxígeno o de retinoides liberados a la capa fotorreceptora por el EPR a partir de la circulación de sangre coroidea son excesivas y tóxicas a medida que la carga metabólica de los bastones se pierde (2). Punzo et al. evidenciaron en modelos murinos de degeneración de la retina que los conos mueren, en parte, como resultado de inanición y desequilibrio nutricional, motivado por la ruta insulina/diana de rapamicina de mamífero (3). Adicionalmente, se ha sugerido que la pérdida de un factor de supervivencia secretado por bastones y requerido para la supervivencia de los conos puede contribuir a la pérdida de conos (4, 5). De acuerdo con la última hipótesis, se ha comprobado que el tejido retiniano sano trasplantado apoya la supervivencia de conos en áreas distantes del tejido trasplantado en el ratón rdl (6, 7).

La Solicitud de Patente Internacional N°. WO2008/148860A1 describe una familia de factores tróficos, denominados factor de viabilidad de conos derivados de bastones (RdCVF) y RdCVF2, que son capaces de incrementar la supervivencia neuronal y son útiles para tratar y/o prevenir trastornos neurodegenerativos tales como la RP.

El factor de viabilidad de conos derivados de bastones (RdCVF) se identificó originalmente a partir de un método de alto rendimiento de cribado de librerías de ADNc como una molécula candidata responsable para este efecto de rescate (4). Los bastones secretan RdCVF y por tanto, según mueren los conos, la fuente de este factor paracrino se pierde y descienden los niveles de RdCVF. La pérdida de expresión de RdCVF y de factores secretados parecidos, puede contribuir por tanto a la segunda ola de degeneración de conos observada en las distrofias de conos y bastones. Se ha observado que el RdCVF media en la supervivencia de conos tanto en cultivo (8) como cuando se inyecta de forma subretiniana en modelos de ratones y ratas de formas recesivas y dominantes de retinitis pigmentaria (4, 9). La alteración de Nxnll, el gen que codifica RdCVF, vuelve a los fotorreceptores de ratón cada vez más susceptibles a la disfunción de los fotorreceptores y a la pérdida de conos a lo largo del tiempo (10).

Nxnll codifica dos isoformas de proteínas a través de corte y empalme diferencial. La isoforma que media en la supervivencia de conos, RdCVF es una proteína de pliegue de tiorredoxina truncada de su contrapartida más larga, RdCVFL, que incluye una extensión del extremo C terminal que confiere actividad tioloxidorreductasa enzimática (11). RdCVFL, que contiene todos los aminoácidos del RdCVF, está codificado por los exones 1 y 2 del gen Nxnll y es un miembro de la familia tiorredoxina (12). Las tiorredoxinas tienen diferentes funciones, incluyendo el mantenimiento del entorno reductor adecuado en las células y la participación en rutas de apoptosis. Estas funciones se consiguen a través de reacciones de tioloxidorreductasas mediadas por un sitio catalítico CXXC dentro de un pliegue de tiorredoxina (13).

Byrne et al. (32) han demostrado que las dos isoformas de RdCVF tienen funciones complementarias. La administración sistémica de un virus adenoasociado (AAV) que codifica RdCVF mejoró la función de conos y retrasó la pérdida de conos, mientras que RdCVFL aumentó el ARNm de rodopsina y redujo el estrés oxidativo. RdCVFL previene el daño fotooxidativo de los bastones (36).

La Solicitud de Patente Internacional N°. WO 2016/185037 describe vectores AAV que codifican tanto RdCVF como RdCVFL, en particular el AAV CT35, y el uso de dichos vectores para el tratamiento de patologías tales como la retinitis pigmentaria.

Se ha demostrado un efecto sinérgico entre RdCVF y RdCVFL (34). Por un lado, RdCVF es producido y secretado por el epitelio pigmentado de la retina (EPR), que protege los conos estimulando la glucólisis aerobia a través del receptor de RdCVF en la superficie celular de los conos mediante un mecanismo autónomo no de la célula (37). Por otro lado, RdCVFL, protege los conos contra el deterioro oxidativo de una manera autónoma de la célula, debido a su función de tioloxidorreductasa.

Los inventores han observado ahora que la producción de dichos vectores AAV presenta inesperadamente un problema de encapsidación del genoma de AAV. Este problema de empaquetado incompleto conduce a un defecto en la producción de partículas de AAV con genoma completo.

Esto presenta una limitación para la producción de vectores AAV compatibles con GMP para uso en terapia humana. Por tanto, todavía existe la necesidad de construcciones mejoradas para la expresión de los factores RdCVF y RdCVFL para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina.

Objeto de la invención

Los inventores han descubierto que la producción de un solo vector AAV que comprende un primer ácido nucleico que codifica RdCVF y un segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL podría estar sujeta a problemas de empaquetado incompleto del ADN monocatenario de AAV dentro de la cápside vírica. Esta encapsidación incompleta conduce a la producción de un genoma de AAV incompleto, por lo que un ADN de un tamaño más pequeño.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que esta encapsidación incompleta se debía a la presencia de secuencias repetidas directas dentro del genoma de AAV y que limitando la longitud de los nucleótidos que son idénticos entre los primer y segundo casetes de expresión, el a Av se puede empaquetar completamente.

Por tanto, la presente invención proporciona una solución a este problema, proporcionando vectores AAV que comprenden un primer casete de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica RdCVF y un segundo casete de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL, en los que se optimiza la producción de partículas de AAV.

El AAV de acuerdo con la presente solicitud comprende un primer y un segundo casetes de expresión que muestran como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos, en particular como máximo 60, 55, 54, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9 u 8 nucleótidos idénticos contiguos.

Los inventores han desarrollado varias soluciones alternativas y/o acumulativas al problema de las secuencias repetidas directas entre los primer y segundo casetes de expresión.

Por tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere a un vector adenoasociado (AAV) que comprende:

- un primer casete de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica RdCVF

y

- un segundo casete de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL,

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos. En otro aspecto, la divulgación se refiere a un vector adenoasociado (AAV) que comprende:

y

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo de la retina,

La divulgación también se refiere a un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad degenerativa de la retina, no formando parte dicho método de la invención reivindicada, que comprende la etapa que consiste en administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector adenoasociado (AAV) que comprende: - un primer casete de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica RdCVF

y

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran menos de 200 nucleótidos idénticos contiguos. La divulgación también se refiere al uso de una secuencia de ADN humano inerte en una construcción de AAV que no forma parte de la invención reivindicada.

Por tanto, la presente divulgación describe un AAV, que no forma parte de la invención reivindicada, que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10, en donde dicho ácido nucleico que tiene la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 10 no está presente en un casete de expresión.

Descripción detallada de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones 1 -15.

La presente invención se refiere a un vector adenoasociado (AAV) que comprende:

y

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos. El hecho de que los primer y segundo casetes de expresión muestren como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos significa que los primer y segundo casetes de expresión tienen como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos en común.

Típicamente, los primer y segundo casetes de expresión comparten como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos, preferentemente como máximo 60, 55, 54, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9 u 8 nucleótidos idénticos contiguos.

En una realización particular, la presente invención se refiere a un vector adenoasociado (AAV) en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 54 nucleótidos idénticos contiguos.

En una realización particular, la presente invención se refiere a un vector adenoasociado (AAV) en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 9 nucleótidos idénticos contiguos.

La presente divulgación también describe un AAV, que no forma parte de la invención reivindicada, que comprende: - un primer casete de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica RdCVF

y

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 200 nucleótidos idénticos contiguos, preferentemente como máximo 190, incluso más preferentemente como máximo 180, 170, 167, 165, 164, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80.

La presente divulgación también describe y además se refiere a un vector adenoasociado (AAV) que comprende: - un primer casete de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica RdCVF

y

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo de la retina.

La presente divulgación también describe un vector adenoasociado (AAV), que no forma parte de la invención reivindicada, que comprende:

y

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 200 nucleótidos idénticos contiguos, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo de la retina.

La divulgación también se refiere a un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad degenerativa de la retina, que no forma parte de la invención reivindicada, que comprende una etapa que consiste en administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector adenoasociado (Aa V) que comprende:

y

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran menos de 200 nucleótidos idénticos contiguos. Como se usa en el presente documento, la expresión factor de viabilidad de conos derivados de bastones (RdCVF) se refiere a la proteína codificada por el gen similar a tiorredoxina 6 (TXNL6) o similar a nucleorredoxina 1 (NXNL1). Abarca las proteínas RdCVF de cualquier especie animal. Típicamente, de acuerdo con la presente invención, las proteínas RdCVF pueden ser proteínas RdCVF de mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a ratones, ratas, gatos, perros, primates no humanos y seres humanos.

A menos que se indique lo contrario, el término "RdCVF" se refiere a la isoforma corta del gen NXNL1 y "RdCVFL" o 'RdCVF-L" a la isoforma larga del gen NXNL1.

Típicamente, en ratones, la isoforma corta (RdCVF) es una proteína de 109 aminoácidos de longitud a la que hace se referencia en virtud del número de registro de Uniprot Q91W38. La isoforma murino larga (RdCVFL) es una proteína de 217 aminoácidos de longitud a la que se hace referencia como Q8VC33.

En particular, la isoforma corta del RdCVF es la isoforma corta humana del RdCVF (hRdCVF), que tiene la siguiente secuencia:

Por consiguiente, el primer ácido nucleico, que codifica la isoforma corta de RdCVF puede comprender la siguiente secuencia de ácido nucleico humano:

Como alternativa, el primer ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico que difiere de la SEQ ID NO: 3 pero codifica la misma secuencia de aminoácidos.

Las secuencias de ácido nucleico adecuadas incluyen, pero sin limitación:

- polimorfismos del ADNc que codifica RdCVF humano;

- combinaciones de polimorfismos (haplotipos raros) del ADNc que codifica RdCVF humano. Un ejemplo de ADNc de haplotipo raro se expone como s Eq ID NO: 11;

- secuencias "optimizadas" en las que determinados codones se sustituyen por codones que codifican el mismo aminoácido. Las secuencias optimizadas por codones adecuadas que codifican RdCVF incluyen, pero sin limitación, la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 12;

- secuencias homólogas. Por ejemplo, los inventores han descubierto que se puede usar la secuencia de ADNc de chimpancé que codifica la isoforma corta de RdCVF de chimpancé, ya que codifica la misma secuencia de aminoácidos que el ADNc humano. El ADNc de chimpancé tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4.

En particular, la isoforma larga del gen NXNL1 es la isoforma larga humana del RdCVFL (hRdCVFL), que tiene la secuencia a la que se hace referencia en virtud del número de registro Q96CM4 y que se expone a continuación:

Por consiguiente, el segundo ácido nucleico, que codifica RdCVFL puede comprender la siguiente secuencia de ácido nucleico humano:

Como alternativa, el segundo ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico que difiere de la SEQ ID NO: 5 pero codifica la misma secuencia de aminoácidos.

Las secuencias de ácido nucleico adecuadas incluyen, pero sin limitación:

- polimorfismos del ADNc que codifica RdCVF humano o combinaciones de los mismos;

- secuencias "optimizadas" en las que determinados codones se sustituyen por codones que codifican el mismo aminoácido; Las secuencias optimizadas por codones adecuadas que codifican RdCVF incluyen, pero sin limitación, la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 12;

- secuencias homólogas en otras especies.

Las secuencias de las proteínas RdCVF y RdCVFL se describen en Chalmel et al. 2007 (39) y en la Solicitud de Patente Internacional N°. WO2008/148860.

Como se usa en el presente documento, el término "vector adenoasociado" o "AAV" tiene su significado general en la técnica.

Se han descrito AAV ampliamente en la técnica como vectores adecuados para la administración de genes. De hecho, los AAV no son patógenos y muestran una gama amplia de especificidad tisular, dependiendo de su serotipo. Típicamente, los AAV de acuerdo con la presente invención son AAV que pueden dirigirse a células retinianas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AAV2, AAV8, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/9 y AAV7m8.

En una realización particular de la invención, el AAV es un serotipo AAV2/8.

En una realización, el AAV de acuerdo con la presente invención se obtiene de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de Patente Internacional N°. WO2012/158757.

Típicamente, los ácidos nucleicos primero y segundo, que codifican las isoformas corta y larga del gen NXNL1 respectivamente, están bajo el control de un promotor que permite la expresión dicha isoforma corta y larga en las células diana.

Los promotores adecuados pueden ser promotores ubicuos, tales como el promotor CMV/CBA. Los promotores adecuados pueden ser promotores que permitan la expresión en la retina, preferentemente en células epiteliales pigmentadas de la retina y en células fotorreceptoras.

En particular, el promotor permite la expresión génica en células epiteliales pigmentadas de retina.

En particular, el promotor permite la expresión génica en fotorreceptores de conos. Un ejemplo no limitativo es el promotor de cono-opsina.

Típicamente, la isoforma corta del gen NXNL1 se expresa al menos por las células epiteliales pigmentadas de la retina y la isoforma larga se expresa al menos por las células fotorreceptoras de conos.

Más particularmente, se usan diferentes promotores para impulsar la expresión de la isoforma corta y de la isoforma larga.

Típicamente, la isoforma corta del gen NXNL1 se puede expresar bajo el control del promotor CMV/CBA y la isoforma larga del gen NXNL1 se puede expresar bajo el control del promotor de cono-opsina.

De acuerdo con una realización, el primer ácido nucleico que codifica RdCVF, en el AAV de la presente invención, está bajo el control de un promotor ubicuo, preferentemente el promotor CMV/CBA.

De acuerdo con una realización, el segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL, en el AAV de la presente invención, está bajo el control del promotor de cono-opsina.

En particular, los dos casetes de expresión están invertidos, con un casete de expresión siendo de 5' a 3' y el otro casete de expresión siendo de 3' a 5'.

Los inventores han descubierto que esta configuración también era adecuada para evitar un empaquetado incompleto. En una realización de la invención, dicho vector adenoasociado (AAV) descrito anteriormente comprende además una secuencia de relleno de SEQ ID NO: 10.

En una realización específica, la presente invención se refiere a un vector adenoasociado (AAV) que comprende: - un primer casete de expresión que comprende un primer ácido nucleico que comprende un ADNc optimizado por codones que codifica RdCVF, bajo el control de un promotor ubicuo, preferentemente el promotor CMV/CBA, y

- un segundo casete de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que comprende un ADNc optimizado por codones que codifica RdCVFL bajo el control del promotor de cono-opsina (OPN1L/MW).

En una realización, el primer ácido nucleico que comprende un ADNc optimizado por codones que codifica RdCVF tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 12.

En una realización, el segundo ácido nucleico que comprende un ADNc optimizado por codones que codifica RdCVFL tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13.

En una realización, el vector adenoasociado tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 6 (correspondiente a la construcción C03 de los ejemplos a continuación).

En el contexto de la invención, el término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de o prevenir el trastorno o afección al que se aplica dicho término o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección (por ejemplo, enfermedades degenerativas de la retina).

La expresión "enfermedades degenerativas de la retina" abarca todas las enfermedades asociadas con la degeneración de conos, enfermedades degenerativas de la retina incluyen, pero sin limitación, retinitis pigmentaria, degeneración macular asociada a la edad, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-Kornzweig, enfermedad de Best, coroidema, atrofia girada, amaurosis congénita de Leber, enfermedad de Refsum, enfermedad de Stargardt o síndrome de Usher.

En una realización de la invención, la enfermedad degenerativa de la retina es la retinitis pigmentaria.

De acuerdo con la invención, la expresión "paciente" o "paciente que lo necesita" tiene por objeto un ser humano o un mamífero no humano afectado o con probabilidad de verse afectado por enfermedades degenerativas de la retina.

De acuerdo con la presente divulgación, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado, en este caso incrementando la viabilidad neuronal. Se entiende que la posología eficaz dependerá de la edad, el sexo, el estado de salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Sin embargo, la posología preferida se puede adaptar al sujeto individual, tal como se entiende y se puede determinar por un experto en la técnica, sin excesiva experimentación.

El vector de expresión de la invención puede ser adecuado para administración intraocular. En una realización particular de la invención, el vector de expresión se administra mediante inyección subretiniana.

En un aspecto, la invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vector adenoasociado (AAV) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho AAV comprende:

- un segundo casete de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL, en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos.

La presente divulgación también describe una composición farmacéutica, que no forma parte de la invención reivindicada, que comprende un vector adenoasociado (AAV) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho AAV comprende:

- un segundo casete de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL, en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 200 nucleótidos idénticos contiguos.

La presente divulgación también describe un AAV, que no forma parte de la invención reivindicada, que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10, en donde dicho ácido nucleico que tiene la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 10 no está presente en un casete de expresión. Esta secuencia SEQ ID NO: 10 tiene el papel de ADN de relleno en el AAV. El papel de una secuencia de relleno es aumentar el tamaño del vector para evitar que el plásmido proviral se encapside en lugar del gen de interés.

Habitualmente, en AAV se usan rellenos correspondientes al ADN del bacteriófago lambda. Sin embargo, las secuencias del bacteriófago lambda usadas más comúnmente como relleno contienen marcos de lectura abiertos, las regiones nin. Aunque se los considera inertes debido a la distancia filogenética con el ser humano, Cheng et al. (38) han demostrado que dichos rellenos no eran tan inerte como se esperaba debido a que las regiones nin pueden tener una fuerte actividad de transcripción. Por tanto, cuando se administran AAV con dicho relleno a un paciente humano, existe el riesgo de transcripción del ADN del bacteriófago lambda.

Por tanto, era importante desarrollar un nuevo relleno inerte. Los inventores han descubierto que el ácido nucleico que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10 podría usarse inesperadamente como un ADN de "relleno", para aumentar el tamaño de las construcciones de AAV, en sustitución del relleno del bacteriófago lambda. Dicho ácido nucleico que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10 tiene la gran ventaja de ser inerte porque esta secuencia es una secuencia no traducida, no es una diana de miARN, es una secuencia no telomérica, no contiene ningún origen de replicación de ADN y no contiene repetición de nucleótidos. Al no tener esta secuencia actividad funcional alguna, no hay riesgo de transcripción cuando se utiliza como relleno en un AAV.

La secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10 se seleccionó a través de un proceso completo como se describe en la figura 3. Es un enfoque bioinformático que consiste en identificar en el genoma humano una región que no contiene ningún elemento como centrómeros, genes, pseudogenes, orígenes de replicación, secuencias o repeticiones dirigidas a micro ARN. La secuencia NO: 10 se seleccionó entre estos loci.

La invención reivindicada se ilustrará adicionalmente a través de los siguientes ejemplos y figuras.

Descripción de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de construcciones preferidas de acuerdo con la invención:

La figura 1A representa la construcción CT35, un ejemplo comparativo (por tanto, no es una construcción de acuerdo con la presente invención) divulgado en el documento WO2016/185037. Las figuras 1B, 1C y 1D representan respectivamente las construcciones 3 (C03), 6 (C06) y 11 (C11) de acuerdo con la invención.

Figura 2: Tamaño del ADN monocatenario del genoma de a Av analizado mediante electroforesis en gel desnaturalizante

El tamaño del ADN monocatenario del genoma de AAV de diferentes construcciones se analizó mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes:

- Construcción 3 (C03) que expresa tanto RdCVF como RdCVFL (7^v7. AAV2-CMV/CBA^{° rig}-RdCVF-5'_1.7.OPN1L/MW-RdCVFL)

- CT35 que expresa tanto RdCVF como RdCVFL (AAV2-CMV/CBA-RdCVF-CMV/CBA-RdCVFL) (SEQ ID NO:

15)

- CT37 que solo expresa RdCVF (AAV2-CMV/CBA-RdCVF relleno) (SEQ ID NO: 16).

Figura 3: Representación esquemática del proceso de selección de un ADN "de relleno" inerte Figura 4: Comparación de empaquetado

Figura 4A: Otra representación del AAV CT35.

Figura 4B: Simulación gráfica de una recombinación entre las dos copias [CMV / CBA delta 390] que produciría una eliminación del casete [CMV / CBA delta 390-RdCVF] o una recombinación con el casete [CMV / CBA delta 390-RdCVFL].

Figura 4C: Transducción de CT35 (AAV-CMV / CBA-RdCVF_CMV / CBA-RdCVFL) en células primarias de epitelio pigmentado porcino. Análisis por transferencia Western de RdCVF y RdCVFL usando anticuerpos anti-RdCVF policlonales de conejo (4).

Figura 4D: Otra representación del AAV C06 y simulación gráfica de una recombinación. En este AAV, los primer y segundo casetes de expresión comparten una repetición directa de 167 nucleótidos idénticos contiguos.

Figura 4E: Otra representación del a Av C03.

Figura 4F: Análisis de integridad del genoma de AAV C06, C03, CT35 y CT37 encapsidados (proteínas de la cápside más ADN).

Figuras 4G y 4H: Tablas que representan para C03 y C06 el porcentaje de cápsides que comprenden un AAV encapsidado completo (lleno), el porcentaje de cápsides que comprenden un AAV incompletamente encapsidado (intermedio) y el porcentaje de cápsides que no comprenden a Av (vacío; sin ADN). La tabla 4G muestra los resultados de detección obtenidos tanto para la proteína de la cápside como para el ADN (genoma de AAV). La tabla 4H muestra los resultados de detección obtenidos solo para el ADN.

Ejemplos

Ejemplo 1

La siguiente sección proporciona ejemplos no limitantes de construcciones adecuadas de acuerdo con la invención.

Construcción 3 (C03): 7^v7. AAV2-CMV/CBA^orig -RdCVF-5'_1.7.OPN1L/MW-RdCVFL Como se muestra en la figura 1B, en esta construcción, la secuencia de ADNc de RdCVF humana se optimizó por codones (usando un primer proceso de optimización v1) y se colocó bajo el promotor ubicuo CMV/CBA. El ADNc de RdCVFL humano también se optimizó por codones (usando un proceso de optimización diferente v2) y se colocó bajo el control del promotor de cono-opsina. La repetición directa compartida entre el primer y el segundo casete de expresión tiene una longitud de 9 nucleótidos.

El vector AAV tiene la secuencia que como se expone en la SEQ ID NO: 6.

Construcción 6 (C06):

AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL

Como se muestra en las figuras 1C y 4D, en esta construcción, la secuencia de ADNc de RdCVF de chimpancé se usó en el primer casete expresado y se colocó bajo el promotor ubicuo CMV/CBA. El ADNc de RdCVFL humano se colocó bajo el control del promotor de cono-opsina. La repetición directa compartida entre el primer y el segundo casete de expresión tiene una longitud de 167 nucleótidos.

El vector AAV tiene la secuencia que como se expone en la SEQ ID NO: 7.

Construcción 7 (C07):

AA V2_rev_CMV/CBA_orig_RdCVF _chimp_5p_1.7 _OPNILMW_RdCVFL

Esta construcción es similar a la construcción 6, excepto que el primer casete de expresión se coloca en orientación inversa.

El vector AAV tiene la secuencia que como se expone en la SEQ ID NO: 8.

Construcción 8 (C08):

AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_chimp_rev_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVFL-hGH

Esta construcción es similar a la construcción 6, excepto que el segundo casete de expresión se coloca en orientación inversa.

El vector AAV tiene la secuencia que como se expone en la SEQ ID NO: 9.

Construcción 11 (C11):

AAV2_CMV/CBA_orig_RdCVF_rare_haplotype_human_5p_1.7_OPN1LMW_RdCVF L

Como se muestra en la figura 1D, en esta construcción, el primer casete de expresión comprende un ADNc que codifica RdCVF humano que es una combinación de polimorfismos (haplotipo raro), bajo el promotor ubicuo ^cM^v/CBA. El segundo casete de expresión comprende el ADNc de RdCVFL humano, bajo el control del promotor de cono-opsina. La repetición directa compartida entre el primer y el segundo casete de expresión tiene una longitud de 54 nucleótidos. El vector AAV tiene la secuencia que como se expone en la SEQ ID NO: 14.

Ejemplo 2: Las construcciones de AAV que muestran tramos largos de nucleótidos idénticos están sujetas a un empaquetado incompleto.

Material y métodos

Producción de vectores víricos

Los vectores de AAV portadores de ADNc que codifican RdCVF de ratón, RdCVFL o eGFP de produjeron mediante el método de cotransfección (31). El AAV recombinante se purificó mediante ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio o yodixanol. El eluyente vírico se intercambió de tampón y se concentró con Ultra-15 Centrifugal Filter Units de Amicon en PBS y se tituló mediante PCR cuantitativa en referencia a una curva patrón.

Electroforesis en gel desnaturalizante

El ADN genómico se extrajo y se sometió a electroforesis en gel desnaturalizante. El tamaño de los ácidos nucleicos se comparó con una escalera de ADN.

Resultados

Las figuras 2 y 4F muestran que la construcción CT37, divulgada en el documento WO2016/185037 y, por tanto, no es una construcción de acuerdo con la invención. Este ejemplo comparativo que solo expresa RdCVF está sujeto a un empaquetado completo ya que su producción da como resultado ADN en los tamaños esperados de -5000 pb. Como se muestra en las figuras 2 y 4F, CT35 está sujeto a empaquetado incompleto ya que su producción da como resultado tamaños anormales del genoma de AAV en lugar de un genoma de AAV de 4804 pb. Por tanto, está bien demostrado que la expresión de un primer ácido nucleico que codifica RdCVF y un segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL en un AAV puede conducir a una encapsidación incompleta del ^aDⁿmonocatenario de AAV dentro de la cápside vírica.

Por el contrario, la construcción C06 de acuerdo con la invención, que expresa tanto RdCVF como RdCVFL y comprende una repetición directa de solo 167 nucleótidos de largo, muestra una banda en el tamaño esperado de 4942 pb. Este resultado demuestra una encapsidación completa con la construcción C06.

De la misma manera, la construcción C03, que comprende una repetición de 9 nucleótidos idénticos contiguos, muestra una sola banda en el tamaño esperado de 4926 pb.

Se muestra que disminuir el número de nucleótidos idénticos contiguos compartidos entre los dos casetes de expresión, permite aumentar la proporción de encapsidación completa de un AAV que comprende tanto un ácido nucleico que codifica RdCVF como un ácido nucleico que codifica RdCVFL.

Por tanto, los inventores han demostrado que se obtiene un empaquetado completo cuando el primer y segundo casete de expresión no contienen más de 200 ácidos nucleicos contiguos.

Para explorar con más profundidad el fenómeno, se usó ultracentrifugación analítica de acuerdo con Burnham et al. (35) para comparar las diferentes construcciones (figuras 4G y 4H). Los resultados para C03 y C06 muestran que la banda adicional observada en el gel desnaturalizante coincide con el alto porcentaje de partículas de AAV con coeficientes de sedimentación intermedios, representan partículas que están entre llenas y vacías y, por tanto, corresponden a partículas que comprenden un AAV empaquetado de forma incompleta. De acuerdo con los resultados obtenidos en la electroforesis en gel desnaturalizante, la construcción C06 muestra una encapsidación completa del 18 % y la construcción C03 produjo resultados apropiados en el método de ultracentrifugación analítica, lo que indica un alto porcentaje de partículas de AAV llenas (58 %) (figura 4H).

Esto confirma que existe un aumento del porcentaje de partículas con genoma integral cuando el número de nucleótidos idénticos contiguos compartidos entre los dos casetes de expresión no es superior a 200.

Ejemplo 3: la combinación de RdCVF y RdCVFL da como resultado un efecto sinérgico

Las siguientes construcciones se han producido e introducido en un vector AAV2.

El plásmido proviral p618 y sus elementos se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada como el documento WO2012158757A1 y en la publicación (33).

2xRdCVF: plásmido p857 y AAV CT39

El P857/CT39 se diseñó para incrementar el nivel de expresión de RdCVF en comparación con CT37 (RdCVF-stuffer (de relleno)) para conseguir suficiente protección de conos en pacientes que padecen retinitis pigmentaria (RP). RdCVF-RdCVFL: plásmido p853 y AAV CT35

Este vector es capaz de coexpresar las isoformas corta y larga de RdCVF.

Sin embargo, su producción está sujeta a eventos anormales de empaquetado incompleto que limitan su uso como agente terapéutico.

Ejemplo 4: Selección de un ADN inerte para sustituir rellenos de fago lambda

Los inventores han desarrollado un proceso de selección para identificar una secuencia de ácido nucleico que podría usarse como una alternativa más segura a las secuencias de relleno del fago lambda usadas tradicionalmente para obtener construcciones de AAV que tengan un tamaño suficiente.

Se realizó un cribado de todo el genoma humano para eliminar secuencias indeseables tales como centrómeros, genes conocidos, pseudogenes, repeticiones, dianas de miARN, orígenes de replicación. Este proceso de cribado inventivo dio como resultado la selección de la SEQ ID NO: 10, que es una secuencia inerte del cromosoma humano 15.

Ejemplo 5: Análisis de recombinación

El análisis por transferencia Western en la figura 4C muestra la expresión de RdCVF y RdCVFL usando anticuerpos anti-RdCVF policlonales de conejo. Ambas proteínas se detectan para la construcción CT35, lo que demuestra que CT35 no está sujeta a recombinación homóloga.

REFERENCIAS

A lo largo de la presente solicitud, describen el estado de la técnica diversas referencias a la que pertenece esta invención.

1. Buch, H. et al. Prevalence and causes of visual impairment and blindness among 9980 Scandinavian adults: the Copenhagen City Eye Study. Ophthalmology. 2004;111(1):53-61.

2. Bramall, A.N., Wright, A.F., Jacobson, S.G., McInnes, R.R. The genomic, biochemical, and cellular responses of the retina in inherited photoreceptor degenerations and prospects for the treatment of these disorders. Annu Rev Neurosci. 2010;33(1):441-472.

3. Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C.L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nat Neurosci. 2009;12(1):44-52.

4. Léveillard T et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet.

2004;36(7):755-759.

5. Mohand-Said S et al. Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(14):8357-8362.

6. Mohand-Said S et al. Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse. Ophthalmic Res. 1997;29(5):290-297.

7. Mohand-Said S, Hicks D, Dreyfus, H., Sahel, J.-A. Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model. Arch Ophthalmol. 2000;118(6):807-811.

8. Wang, X.W., Tan, B.Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J.L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radic Biol Med. 2008;45(3):336-344.

9. Yang, Y. et al. Functional Cone Rescue by RdCVF Protein in a Dominant Model of Retinitis Pigmentosa. Mol Ther. 2009; 17(5): 787-795.

10. Cronin, T. et al. The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress. Cell Death Differ. 2010;17(7):1199-1210.

11. Brennan, L.A., Lee, W., Kantorow, M. TXNL6 is a novel oxidative stress-induced reducing system for methionine sulfoxide reductase a repair of a-crystallin and cytochrome C in the eye lens. PLoS ONE. [publicado en línea antes de impreso: 2010]; doi:10.1371/journal.pone.0015421.g008

12. Funato, Y., Miki, H. Nucleoredoxin, a Novel Thioredoxin Family Member Involved in Cell Growth and Differentiation. Antioxid Redox Signal. 2007;9(8):1035-1058.

13. Lillig, C.H., Holmgren, A. Thioredoxin and Related Molecules-From Biology to Health and Disease. Antioxid Redox Signal. 2007;9(1):25-47.

14. Barhoum, R. et al. Functional and structural modifications during retinal degeneration in the rdl0 mouse. Neuroscience. 2008;155(3):698-713.

15. Phillips MJ, Otteson, D.C., Sherry, D.M. Progression of neuronal and synaptic remodeling in the rd10mouse model of retinitis pigmentosa. J Comp Neurol. 2010;518(11):2071-2089.

16. Gargini, C. et al. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: A morphological and ERG study. J Comp Neurol. 2006;500(2):222-238.

17. Pang, J.J. et al. AAV-mediated gene therapy for retinal degeneration in the rd10 mouse containing a recessive PDEbeta mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2008;49(10):4278-4283.

18. Pang, J.J. et al. Long-term retinal function and structure rescue using capsid mutant AAV8 vector in the rd10 mouse, a model of recessive retinitis pigmentosa. Mol Ther. 2011; 19(2): 234-242.

19. Komeima, K., Rogers, B.S., Campochiaro, P.A. Antioxidants slow photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. J Cell Physiol. 2007;213(3):809-815.

20. Dalkara, D. et al. In v/'vo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 2013;5(189):189ra76.

21. Dalkara, D. et al. Enhanced gene delivery to the neonatal retina through systemic administration of tyrosine mutated AAV9. Gene Ther. 2012;19(2): 176-181.

22. Cao, W., Wen, R., Li, F., Lavail MM, Steinberg, R.H. Mechanical injury increases bFGF and CNTF mRNA expression in the mouse retina. Experimental Eye Research. 1997;65(2):241-248.

23. Hollander den AI, Black, A., Bennett, J., Cremers, F.P.M. Lighting a candle in the dark: advances in genetics and gene therapy of recessive retinal dystrophies. J Clin Invest. 2010;120(9):3042-3053.

24. Maguire, A.M. et al. Safety and Efficacy of Gene Transfer for Leber's Congenital Amaurosis. N Engl J Med.

2008;358(21):2240-2248.

25. Cideciyan, A.V. et al. Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008; 105(39):15112-15117.

26. Bainbridge, J.W.B. et al. Effect of Gene Therapy on Visual Function in Leber's Congenital Amaurosis. N Engl J Med. 2008;358(21):2231-2239.

27. Fridlich, R. et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 2009;8(6):1206-1218.

28. Mingozzi, F. et al. CD8(+) T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med.

2007;13(4):419-422.

29. Manno, C.S. et al. Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med. 2006;12(3):342-347.

30. Jacobson, S.G. et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 2012;130(1):9-24.

31. Grieger, J.C., Choi, V.W., Samulski, R.J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 2006;1(3):1412-1428.

32. Byrne, L.C., Dalkara, D., Luna, G., Fisher, S.K., Clerin, E., Sahel JA, Léveillard, T., Flannery, J.G. Viral-mediated RdCVF and RdCVFL expression protects cone and rod photoreceptors in retinal degeneration. J Clin Invest. 2015 125(1): 105-16.

33. Vasireddy, V., Mills, J.A., Gaddameedi, R., Basner-Tschakarjan, E., Kolinke, M., Black, A.H., Alexandrov, K., Maguire, A.M., Chung, D.C., Mac, H., Sullivan, L., Gadue, P., Bennicelli, J.L., French, D.L. y Bennett, J. AAV-mediated gene therapy for choroideremia: Preclinical studies in personalized models. PLoS ONE 01/2013; 8(5):e61396.

34. Mei X., Chaffiol, A., Kole, C., Yang Y., Millet-Puel G., Clérin E., Ait-Ali N., Bennett, J., Dalkara D., Sahel JA, Duebel, J., Léveillard T., The thioredoxin encoded by the Rod-derived Cone Viability Factor gene protects cone photoreceptors against oxidative stress. Antioxid Redox Signal. 12 de mayo de 2016. [Publicación electrónica previa a la impresión].

35. Burnham B, Nass S, Kong E, Mattingly M, Woodcock D, Song A, Wadsworth S, Cheng SH, Scaria A, O'Riordan CR: Analytical Ultracentrifugation as an Approach to Characterize Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors. Human gene therapy methods 2015, 26(6):228-242.

36. Elachouri G, Lee-Rivera I, Clerin, E., Argentini M, Fridlich R, Blond F, Ferracane V, Yang Y, Raffelsberger W, Wan J, Bennett, J., Sahel JA, Zack DJ, Leveillard T: Thioredoxin rod-derived cone viability factor protects against photooxidative retinal damage. Free radical biology & medicine 2015, 81:22-29.

37. Ait-Ali N, Fridlich R, Millet-Puel G, Clerin, E., Delalande F, Jaillard C, Blond F, Perrocheau L, Reichman S, Byrne, L.C., Ofivier-Bandini A, Bellalou J, Moyse E, Bouillaud F, Nicol X, Dalkara, D., van Dorsselaer A, Sahel JA, Leveillard T: Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell 2015, 161(4):817-832.

38. Cheng SW, Court DL, Friedman DI: Transcription termination signals in the nin region of bacteriophage lambda: identification of Rho-dependent termination regions. Genetics 1995, 140(3):875-887.

39. Chalmel, F., Leveillard, T., Jaillard, C., Lardenois, A., Berdugo, N., Morel, E., Koehl, P., Lambrou, G., Holmgren, A., Sahel, J.A., y Poch, O. (2007). Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC molecular biology 8, 74.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector adenoasociado (AAV) que comprende:

- un primer casete de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica la isoforma corta del factor de viabilidad de conos derivados de bastones (RdCVF) y

- un segundo casete de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica la isoforma larga del factor de viabilidad de conos derivados de bastones (RdCVFL),

en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 70 nucleótidos idénticos contiguos.

2. Un AAV de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 54 nucleótidos idénticos contiguos.

3. Un AAV de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos primer y segundo casetes de expresión muestran como máximo 9 nucleótidos idénticos contiguos.

4. Un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el AAV es un serotipo AAV2/8.

5. Un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el primer ácido nucleico que codifica RdCVF está bajo el control de un promotor ubicuo, preferentemente el promotor CMV/CBA.

6. Un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el segundo ácido nucleico que codifica RdCVFL está bajo el control del promotor de cono-opsina.

7. Un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el AAV tiene una secuencia de ácido nucleico como se establece en el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 14.

8. Un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el AAV tiene una secuencia de ácido nucleico como se establece en la SEQ ID NO: 6.

9. Un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el AAV comprende además una ^{secuencia de relleno de la SEQ ID n}O: ^10.

10. Un AAV de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer ácido nucleico comprende un ADNc optimizado por codones que codifica RdCVF como se establece en la SED IQ NO: 12, o en donde el segundo ácido nucleico comprende un ADNc optimizado por codones que codifica RdCVFL como se establece en la SED IQ NO: 13.

11. Una composición farmacéutica que comprende un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Un AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho AAV es para su uso en un método de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo de la retina.

13. Un AAV para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho trastorno neurodegenerativo de la retina se elige del grupo que consiste en: retinitis pigmentaria, degeneración macular asociada a la edad, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-Kornzweig, enfermedad de Best, coroidema, atrofia girada, amaurosis congénita de Leber, enfermedad de Refsum, enfermedad de Stargardt y síndrome de Usher.

14. Un AAV para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho trastorno neurodegenerativo de la retina es retinitis pigmentaria.

15. Un AAV para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde dicho AAV se administra mediante inyección subretiniana.