BR112014010091B1 - Ácido nucleico, vetor viral, preparação farmacêutica, uso destes, método para produção de uma proteína rdcvf, e método in vitro ou ex vivo de secreção de uma proteína rdcvf a partir de uma célula - Google Patents

Ácido nucleico, vetor viral, preparação farmacêutica, uso destes, método para produção de uma proteína rdcvf, e método in vitro ou ex vivo de secreção de uma proteína rdcvf a partir de uma célula Download PDF

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Abstract

VETORES CODIFICANDO FATOR DE VIABILIDADE DOS CONES DERIVADO DOS BASTONETES. A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos codificando para e capazes de expressar um fator de viabilidade dos cones derivado dos bastonetes (RdCVF) e vetores virais contendo estes ácidos nucleicos. A invenção também se refere a composições e preparações farmacêuticas compreendendo estes ácidos nucleicos ou vetores, métodos de produção ou secreção de uma RdCVF, e métodos de tratamento.

Description

INFORMAÇÕES DE CONCESSÃO
[001] Esta invenção foi produzida com suporte governamental segundo a SBIR Grant No. EY016262 concedida pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos da América, (Department of Health and Human Services, National Institutes of Health). O governo pode ter determinados direitos na invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A RdCVF é uma proteína semelhante à tiorredoxina ex pressada especificamente por bastonetes fotorreceptores na retina (Léveillard et al. (2004) Nature Genetics 36: 755-759 e a informação suplementar). Dois genes de RdCVF diferentes são encontrados em humanos e são designados RdCVF1 e RdCVF2. Ambos os genes de RdCVF codificam dois produtos através de emenda (splicing) alternativa: uma proteína de comprimento total e uma proteína truncada pós- transcripcionalmente de C-terminal, conhecida como RdCVF longa e RdCVF curta, respectivamente.
[003] RdCVF curta é descrita como um fator trófico secretado pa ra promover a sobrevida de cones, e RdCVF longa como uma enzima redox ativa que interage com proteínas intracelulares (Léveillard et al. (2010) Sci Transl Med. 2(26): 26 ps 16). Por exemplo, tau é descrito como um parceiro de ligação para RdCVF-L e tau é exclusivamente intracellular (Fridlich et al. (2009) Molecular & Cellular Proteomics 8(6): 1206-18).
[004] Foi visto que os indivíduos sofrendo de algumas distrofias retinais têm menores níveis de proteína RdCVF em seus olhos do que os indivíduos sem distrofias retinais (Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO02/081513).
[005] Foi demonstrado que diferentes formas de proteína RdCVF podem estimular a sobrevida de células cone fotorreceptoras in vitro e in vivo. Por exemplo, injeções intraoculares da forma curta de proteína RdCVF1 humana (RdCVF1S) não somente resgatou células cone de degeneração mas também preservou sua função em modelos animais de degeneração retinal hereditária (Yang et al. (2009) Mol Therapy 17: 787-795). No entanto, a demonstração do efeito protetor de células cone in vivo desta proteína exigiu o uso de múltiplas injeções intraocu- lares.
[006] A expressão de níveis significativos de RdCVF em larga escala e de vetores de terapia genética tem sido difícil, por exemplo, vide a Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20110034546, parágrafo [0004].
[007] A citação ou discussão de uma referência aqui, neste Pedi do de patente, não deve ser considerada como uma admissão de que semelhante é arte anterior à presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A presente invenção se refere, em parte, a ácidos nucleicos codificando RdCVF, a constructos de expressão de RdCVF, a vetores de RdCVF, a métodos de expressão de RdCVF, a métodos de retardamento, prevenção ou inibição da morte de células de fotorreceptores (por exemplo, células cone e/ou bastonetes), ao tratamento de doenças dos olhos, tais como distrofias retinais, e ao tratamento de doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson ou uma doença olfativa.
[009] A presente invenção proporciona composições, métodos para a expressão de proteínas RdCVF a partir de uma ou mais células e métodos de tratamento.
[0010] Algumas modalidades da invenção proporcionam ácidos nu- cleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência codificante para uma proteína RdCVF, em que a sequência codificante para RdCVF compreende uma sequência de nu- cleotídeos recodificada.
[0011] A invenção também inclui vetores virais compreendendo um ácido nucleico, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência codificante para uma proteína RdCVF, em que a sequência codificante para RdCVF compreende uma sequência de nucleotídeos recodificada.
[0012] Algumas modalidades da invenção se referem a uma célula isolada compreendendo um ácido nucleico da invenção.
[0013] Outras modalidades da invenção se referem a uma proteína RdCVF produzida por uma célula da invenção ou a partir de um ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF não é uma sequência de aminoácidos RdCVF que ocorre naturalmente.
[0014] Também são incluídas na invenção preparações farmacêu ticas compreendendo (i) um veículo farmaceuticamente aceitável e (ii) um ácido nucleico da invenção, um vetor viral da invenção, uma proteína RdCVF da invenção ou uma combinação dos mesmos.
[0015] Também são proporcionados métodos para a produção de uma proteína RdCVF compreendendo cultivar uma célula da invenção sob condições que permitam a expressão e a secreção da proteína RdCVF e isolar a proteína RdCVF da cultura celular.
[0016] Algumas modalidades da invenção se referem a métodos de preservação de bastonetes oculares compreendendo a administração, ao olho de um mamífero, de um ácido nucleico da invenção, de um vetor viral da invenção, de uma proteína RdCVF da invenção ou de uma combinação dos mesmos.
[0017] A invenção também proporciona métodos de tratamento de doenças tais como distrofia retinal, doença de Stargardt, retinite pigmentosa, degeneração macular seca relacionada com a idade (em inglês, dry AMD), atrofia geográfica (estágio avançado de dry AMD), degeneração macular úmida relacionada com a idade (em inglês, wet AMD), glaucoma com ou sem hipertensão ocular, retinopatia diabética, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-Kornzweig, doença de Best, coroidema, atrofia girada, amaurose congênita, síndrome de Refsum, síndrome de Usher, doença dos olhos relacionada com a ti- roide, doença de Grave, uma doença associada com células epiteliais pigmentadas retinais, doença do segmento anterior, doença de lente / catarata, um distúrbio do copo ocular, uveíte, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson ou uma doença olfativa.
[0018] Algumas modalidades da invenção se referem a métodos de preservação de bastonetes oculares compreendendo a administração, ao olho de um mamífero, do ácido nucleico e/ou do vetor viral da invenção, em que o ácido nucleico e/ou o vetor viral é administrado por injeção sub-retiniana e os bastonetes são preservados em um sítio diferente do sítio da injeção sub-retiniana.
[0019] Algumas modalidades da invenção se referem a métodos de preservação de células cone oculares compreendendo a administração, ao olho de um mamífero, do ácido nucleico e/ou do vetor viral da invenção, em que o ácido nucleico e/ou o vetor viral é administrado por injeção sub-retiniana e as células cone são preservadas em um sítio diferente do sítio da injeção sub-retiniana.
[0020] A invenção também proporciona métodos de secreção de uma proteína RdCVF a partir de uma célula compreendendo a admi-nistração, à célula, de um ácido nucleico ou de um vetor viral da invenção.
[0021] Uma proteína RdCVF pode ser uma proteína RdCVF1 ou RdCVF2 ou uma versão longa ou curta.
[0022] É contemplado que qualquer método ou composição des crito aqui, neste Pedido de patente, pode ser implementado com respeito a qualquer outro método ou composição descrito aqui, neste Pedido de patente. A utilização da palavra "um" ou "uma" quando usada em combinação com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou na especificação pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "no mínimo um", e "um ou mais de um". A utilização do termo / da expressão "e/ou" quando usado com uma lista significa que podem ser utilizados um ou mais dos ítens listados, por exemplo, não é limitada a um ou a todos os elementos.
[0023] Este sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características ou características necessárias da invenção. A invenção também pode residir em uma subcombinação das características descritas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0024] Para os fins de ilustrar a invenção, são representadas nos desenhos determinadas modalidades da invenção. No entanto, a invenção não é limitada às precisas disposições e instrumentalidades de modalidades representadas nos desenhos.
[0025] A Figura 1 mostra uma análise SDS-PAGE de partículas de vetores AAV-RdCVF1L e AAV-GFP recombinantes purificados. Proteínas de uma preparação de rAAV-GFP (alameda 1) e duas preparações de rAAV-RdCVF1L (alamedas 2 e 3) foram separadas por SDS- PAGE e visualizadas por análise de corante prata.
[0026] A Figura 2 mostra uma análise Western blot da expressão de RdCVF1L em células ARPE-19 transduzidas por vetor rAAV- RdCVF1L. O lisado celular (Figura 2A) e o sobrenadante (Figura 2B) de células ARPE-19 transduzidas por rAAV foram separados por SDS- PAGE, e uma análise Western Blot foi realizada contra a proteína RdCVF1L. A alameda 1 mostra o lisado de células ARPE-19 não transduzidas (Figura 2A) e o sobrenadante para controle (Figura 2B), a alameda 2 e a alameda 3 mostram lisados celulares (Figura 2A) e so- brenadante (Figura 2B) de célula ARPE-19 transduzida por rAAV-GFP e rAAV-RdCVF1L, respectivamente.
[0027] A Figura 3 mostra a confirmação do aumento da expressão de RdCVF em olhos injetados com rAAV-RdCVF1L versus rAAV-GFP e olhos não tratados de camundongos Balb/C normais por Western blot seis semanas depois da injeção dos vetores. Extratos de proteína de células ARPE-19 transduzidas por rAAV-RdCVF1L foram usados como um controle positivo (Alameda 14 e 17) enquanto o extrato de células não transduzidas foi usado como um controle negativo (Alameda 15). Proteína RdCVF foi detectada em olhos injetados com rA- AV-RdCVF1L (Alameda 6, 8, 10 e 12) ao passo que não foram observadas ou somente foram observadas bandas correspondentes a RdCVF fraca nos olhos contralaterais não tratados nos mesmos animais (Alameda 7, 9, 11 e 13) bem como nos olhos injetados com rA- AV-GFP (Alameda 2 a 5). A alameda 1 é um marcador de proteína de rotina. A alameda 16 é o extrato de proteína do olho de um camundongo normal selvagem.
[0028] A Figura 4 mostra a coloração imunohistoquímica de RdCVF nas células RPE de montagens planas de RPE-coroide- esclera. Foi observada robusta expressão de RdCVF no olho injetado com rAAV-RdCVF1L de camundongos Balb/C normais seis semanas depois da injeção do vetor (Fig. 4A), mas não no olho contralateral não injetado (Fig. 4B). Não foi vista imunorreatividade na amostra processada sem anticorpo primário (Fig. 4C). As montagens planas foram contracoradas com DAPI de modo a mostrar os núcleos celulares em azul.
[0029] A Figura 5 mostra a coloração imunohistoquímica de RdCVF1L de montagens planas neuroretinais. Foi observada robusta expressão de RdCVF1L nas células de fotorreceptores no olho injetado com rAAV-RdCVF1L de camundongos Balb/C normais seis semanas depois da injeção do vetor (Fig. 5A). A maior parte da coloração foi nos segmentos externos das células dos fotorreceptores. Em contraste, somente foi vista coloração de fundo nas células de fotorreceptores no olho contralateral não injetado (Fig. 5B). Não foi vista imunorreativi- dade nas amostras processadas sem anticorpo primário (Fig. 5C).
[0030] A Figura 6 mostra os resultados para estudos que demons traram expressão de RdCVF1L em células RPE e de fotorreceptores 5 semanas depois de injeção sub-retiniana de AAV-RdCVF1L em ca-mundongos rd10. Células RPE expressando RdCVF foram vistas em aproximadamente metade da montagem plana de RPE-coroide- esclera do olho injetado com vetor rAAV-RdCVF1L (A), mas não no olho contralateral não injetado (B). Células de fotorreceptores (C) também foram transduzidas como segmentos expressando RdCVF foram observadas na retina em que foi realizada montagem plana do mesmo olho. Em contraste, não foi vista expressão de RdCVF no olho contralateral não injetado (D). As células de cor verde escuro em (D) provavelmente são macrófagos autofluorescentes aderidos à retina. Visualização em alta ampliação de células RPE transduzidas (E), mantendo morologia hexagonal típica, e segmentos de fotorreceptores expressando RdCVF (F).
[0031] A Figura 7 mostra a recuperação de fotorreceptores por in jeção sub-retiniana de AAV-RdCVF1L em camundongos rd10. Fotomi- crografias óticas de seções retinais representativas de 2 camundongos nos quais os olhos direitos receberam rAAV-RdCVF1L no dia 3 pós- natal (A e C) e os olhos esquerdos (B e D) servem como controles não tratados. Os camundongos rd10 foram sacrificados com 5 semanas de idade. Notar a diferença na espessura da camada nuclear externa (ONL) entre os olhos tratados (setas de cabeça dupla) e os olhos não tratados (setas de cabeça única). Há 2 a 4 linhas nos olhos tratados com AAV-RdCVF (A e C) versus 1 linha nos olhos não tratados (B e D). Segmentos internos e externos de fotorreceptores permaneceram em algumas áreas da retina protegida (E). IS, segmentos internos; OS, segmentos externos; ONL, camada nuclear externa.
[0032] A Figura 8 mostra uma fotomicrografia ótica de um copo ocular de um camundongo rd10 de 5 semanas de idade típico que recebeu uma injeção sub-retiniana de rAAV-RdCVF1L em um olho (Painel A, Figura 8) e nenhum tratamento no olho contralateral (Painel B, Figura 8). Conforme mostrado, mais células de fotorreceptores foram preservadas no olho tratado.
[0033] A Figura 9 mostra a sequência de nucleotídeos anotada de rAAV-RdCVF1L.
[0034] A Figura 10 A: A liberação de rAAV-RdCVF1L melhora a função retinal nos camundongos rd10. Os ERGs foram realizados em aproximadamente 5 semanas depois da injeção de rAAV-RdCVF1L. As medições das respostas do ERG de todos os 8 camundongos que foram testados mostraram que as amplitudes médias das ondas b dos olhos tratados foram cerca de 3 vezes maiores do que as dos olhos de pares não tratados, o que foi estatisticamente significante (p = 0,025).
[0035] Figura 10B: A liberação de rAAV-RdCVF1L melhora a fun ção retinal nos camundongos rd10. Os ERGs foram realizados em aproximadamente 5 semanas depois da injeção de rAAV-RdCVF1L. Painel da direita: Estes são a média de oito formas de onda dos olhos tratados (linha preta, n = 8) e de olhos de pares não tratados (linha vermelha, n = 8) as quais foram registradas na intensidade de 25 cd.s/m2 de flashes luminosos únicos sob o fundo de escuridão. Obviamente, os olhos tratados tiveram uma resposta muito maior do que os olhos de pares. Painel da esquerda: As medições das respostas do ERG de todos os 8 camundongos que foram testados mostraram que as amplitudes médias das ondas b dos olhos tratados foram cerca de 3 vezes maiores do que as dos olhos de pares não tratados, o que foi estatisticamente significante (p = 0,025).
[0036] Figuras 11A e 11B: Preservação de fotorreceptores por in jeção sub-retiniana de rAAV-RdCVF1L em camundongos rd10. Foto- micrografias óticas de seções retinais representativas de um camundongo no qual o olho direito recebeu rAAV-RdCVF1L no dia 3 pós- natal (A) e o olho esquerdo (B) serviu como controles não tratados. Notar a diferença na espessura da camada nuclear externa entre o olho tratado e o não tratado. Há cerca de 4 linhas no olho tratado (A) versus 1 linha nos olhos não tratados (B). Os segmentos externos dos fotorreceptores permaneceram em algumas áreas da retina protegida; onl, camada nuclear externa (outer nuclear layer).
[0037] Figura 12: Comparação da espessura da camada nuclear externa (ONL) em olhos tratados com rAAV-RdCVF1L versus não tratados em camundongos rd10. A espessura média da camada nuclear externa nos olhos tratados (barra vermelha) é significativamente maior (P = 0,006) do que a espessura média da camada nuclear externa nos olhos não tratados (barra preta). Os números representam média + desvio-padrão.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0038] Conforme usado aqui, neste Pedido de patente, o termo transicional "compreendendo" é em aberto. Uma reivindicação utilizando este termo pode conter elementos além daqueles mencionados na reivindicação referida. Deste modo, por exemplo, as reivindicações podem falar sobre métodos que também incluem outras etapas não especificamente mencionadas nas mesmas, à medida que os elementos mencionados ou seu equivalente estejam presentes.
[0039] Os termos "identidade" e "idênticas" quando usados no con- texto de comparação de duas sequências, tais como sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos, se refere à percentagem da sequência que se alinha entre as duas sequências. A percentagem de identidade pode ser determinada por algoritmos comumente empregados por aqueles versados nesta técnica. Por exemplo, a percentagem de identidade pode ser determinada usando ferramentas e programas disponíveis no National Center for Biotechnology Information (NCBI) conforme disponívei em seu website. A percentagem de identidade de duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada, por exemplo, usando um site NCBI/BLAST/blastn. Blastn pode ser usado com os parâmetros ajustados em: expect threshold (limiar esperado) = 10; word size (tamanho de palavra) = 28; max matches in a query range (máx. compatibilidades em uma faixa de query) = 0; match / mismatch scores (pontuações de compatibilidade / incompatibilidade) = 1,-2; gap costs (custos de intervalo) = existência: 5; extensão: 2.
[0040] As publicações dos PedidoPedidos de Patente Internacio nal Nos. WO2002/081513, WO2008/148860, e WO2009/146183 descrevem várias composições e métodos relacionados com RdCVF. Em alguns casos, composições e métodos relacionados com RdCVF descritos nas publicações dos Pedidos de Patente Internacional Nos. WO2002/081513, WO2008/148860, e WO2009/146183 podem ser utilizados, por exemplo, substituindo um ácido nucleico, um vetor ou uma proteína codificando para RdCVF com os da presente invenção, por exemplo, ácidos nucleicos e vetores compreendendo uma sequência selvagem codificante para RdCVF).
[0041] Algumas modalidades da invenção proporcionam sequên cias de aminoácidos de pró-proteínas RdCVF tais como as SEQ ID NOs: 2 e 4. A invenção também proporciona sequências de nucleotí- deos codificando pró-proteínas RdCVF tais como as SEQ ID NOs: 1, 3 e 11.
[0042] A invenção também proporciona métodos de tratamento de uma doença em um indivíduo em que a doença é mediada por ou associada com uma mudança na expressão genética de RdCVF1 ou RdCVF2 (por exemplo, uma diminuição na presença do polipeptídeo RDCVF1 ou RDCVF2 no olho) por meio da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido nucleico ou de vetor codificando uma proteína RDCVF1 ou RDCVF2 ou uma proteína relacionada ou um fragmento ou uma porção da mesma a um indivíduo.
[0043] Em outro aspecto, uma proteína RdCVF, um ácido nucleico, um vetor ou uma composição da invenção pode ser usado na fabricação de um medicamento, por exemplo, para tratar doenças listadas aqui, neste Pedido de patente.
[0044] Produtos, composições, processos e métodos da invenção podem ser usados para, entre outros, fins de pesquisa, biológicos, clínicos ou terapêuticos.
RdCVF
[0045] Foi demonstrado que uma proteína RdCVF pode estimular a sobrevida de células cone fotorreceptoras in vitro e in vivo. Por exemplo, injeções intraoculares da forma curta de proteína RdCVF1 humana (RdCVF1S) não somente recuperaram células cone contra degeneração mas também preservaram sua função em modelos animais de degeneração retinal hereditária. (Yang et al. (Mol Therapy (2009) 17: 787-795 e o material suplementar). RdCVF é expressada por vários tipos de células incluindo bastonetes fotorreceptores na retina (Léveillard et al. (2004) Nature Genetics 36: 755-759).
[0046] Dois genes de RdCVF diferentes são encontrados em hu manos e outros mamíferos e são designados RdCVF1 e RdCVF2. Ambos os genes de RdCVF codificam dois produtos através de emenda (splicing) alternativa: uma proteína de comprimento total e uma proteína truncada de C-terminal, conhecida como RdCVF longa e RdCVF curta, respectivamente.
[0047] Em algumas modalidades, a invenção inclui uma sequência codificante para RdCVF recodificada. Uma sequência codificante para RdCVF recodificada pode codificar para qualquer proteína RdCVF incluindo qualquer uma das reveladas aqui, neste Pedido de patente. Sequências para várias proteínas RdCVF podem ser encontradas na Publicação de Patente Internacional PCT Nos. WO2002081513 e WO2010029130; Chalmelet al. (BMC Molecular Biology (2007) 8:74 pp1-12 e a informação suplementar); Léveillard et al. (Nature Genetics (2004) 36:755-759 e a informação suplementar); Yang et al. (Mol Therapy (2009) 17:787-795 e o material suplementar) e Acesso do GenBank Nos. NP_612463, AAH14127, Q96CM4, EAW84608, CAD67528, Q5VZ03, NP_001155097, NP_660326, CAM24748, CAM14247, AAH22521 e CAD67531. (Para fins de esclarecimento, todas estas sequências do GenBank, bem como todas as outras publicações de patente e não-patente discutidas aqui, neste Pedido de patente, são incorporadas por meio de referência em sua totalidade.)
[0048] Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF é um fra gmento ou um análogo de uma proteína RdCVF que retém um efeito protetor ou uma atividade de sobrevida de células cone e/ou uma atividade de sobrevida de bastonetes. Métodos para a medição destas atividades ou efeitos são conhecidos na arte. Por exemplo, Léveillard et al. (Nature Genetics (2004) 36: 755-759 e a informação suplementar) descreve modelos de camundongo relacionados e métodos in vitro para a detecção da atividade de RdCVF. Uma proteína RdCVF ou uma RdCVF codificada por um ácido nucleico, pode ter uma sequência de aminoácidos diferente de uma sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente. Por exemplo, uma proteína RdCVF que é uma proteína que não ocorre naturalmente pode conter aminoácidos além daqueles encontrados em uma proteína RdCVF que ocorre naturalmente (por exemplo, no térmico amino ou carbo'xi) e/ou pode conter substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas (por exemplo, substituições de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras) em comparação com uma sequência de aminoácidos RdCVF que ocorre naturalmente. Uma substituição de aminoácidos conservadora geralmente não deve modificar substancialmente as características estruturais da sequência de origem (por exemplo, uma substituição de aminoácidos não deve tender a romper uma hélice que ocorre na sequência de origem, ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracterize a sequência de origem). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de po- lipeptídeos reconhecidas na arte são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991). Substituições conservadoras incluem, mas não estão limitadas a, as substituições dos seguintes grupos: Resíduos Acidíferos Asp (D) e Glu (E); Resíduos Básicos Lys (K), Arg (R), e His (H); Resíduos Não Carregados Hidrofílicos Ser (S), Thr (T), Asn (N), e Gln (Q); Resíduos Não Carregados Alifáticos Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), e Ile (I); Resíduos Não Carregados Não- polares Cys (C), Met (M), e Pro (P); Resíduos Aromáticos Phe (F), Tyr (Y), e Trp (W); Resíduos contendo grupamento álcool S e T; Resíduos Alifáticos I, L, V e M; Resíduos associados a Cicloalquenil F, H, W e Y; Resíduos hidrofóbicos A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y; Resíduos Negativamente carregados D e E; Resíduos polares C, D, E, H, K, N, Q, R, S e T; Resíduos Positivamente carregados H, K e R; Resíduos pequenos A, C, D, G, N, P, S, T e V; Resíduos muito pequenos A, G e S; Resíduos envolvidos na formação de volta A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P e T; e Resíduos flexíveis Q, T, K, S, G, P, D, E e R. Em algumas modalidades da invenção, uma proteína RdCVF que não ocorre naturalmente tem aminoácidos adicionais no término amino, por exemplo, aminoácidos adicionais de um peptídeo de sinal heterólogo. Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF da invenção é inicialmente traduzida a partir de uma sequência codificante de nucleotí- deos com um peptídeo de sinal e em alguns casos todos ou parte dos aminoácidos do peptídeo de sinal são retidos sobre uma proteína RdCVF expressada e/ou secretada da invenção.
Sequências Codificantes para RdCVF Recodificadas
[0049] O termo "recodificada" ou "sequência de nucleotídeos reco- dificada" significa que no mínimo um códon nativo é modificado para um códon diferente que codifica para o mesmo aminoácido que o có- don nativo. Em algumas modalidades, uma região codificante para RdCVF recodificada tem no mínimo 2,5%, no mínimo 5%, no mínimo 10%, no mínimo 15%, no mínimo 20%, no mínimo 25%, no mínimo 30%, no mínimo 35%, no mínimo 40%, no mínimo 45%, no mínimo 50%, no mínimo 55%, no mínimo 60%, no mínimo 65%, no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo ou no mínimo 95% dos códons recodificados. Em al- gumas modalidades, cerca de 20 a 50%, 35 a 45%, 38 a 42% ou 39 a 41% dos códons são recodificados. Em algumas modalidades, um có- don recodificado é substituído com um códon que é usado de modo mais prevalente em humanos. Em algumas modalidades, no mínimo 5%, no mínimo 10%, no mínimo 15%, no mínimo 20%, no mínimo 25%, no mínimo 30%, no mínimo 35%, no mínimo 40%, no mínimo 45%, no mínimo 50% ou no mínimo 55% dos códons foram substituídos com um códon que é usado de modo mais prevalente em humanos.
[0050] Em algumas modalidades, uma sequência recodificada tem entre cerca de 70 a 90%, cerca de 75 a 85%, cerca de 80 a 85% ou cerca de 82 a 85% de identidade com a sequência codificante nativa correspondente. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleo- tídeos recodificada tem no mínimo 15% dos nucleotídeos diferentes em comparação com uma sequência de nucleotídeos nativa correspondente. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos recodificada é menos do que 90% idêntica a uma sequência de nucle- otídeos nativa correspondente.
[0051] Recodificação também pode ser usada para alterar a com posição química de uma sequência codificante de DNA e/ou uma sequência codificante de RNA tal como a percentagem de guanina / cito- sina (GC). Em algumas modalidades, a recodificação de uma região codificante para RdCVF aumenta o teor de GC para no mínimo 60%. Em algumas modalidades, uma região codificante para RdCVF recodi- ficada tem uma percentagem de GC entre 60 a 64% ou 60,4% a 63,5%.
[0052] Recodificação pode ser usada para alterar a estrutura se cundária de mRNA. Recodificação também pode ser usada para remover ou adicionar motivos ou sítios particulares a uma sequência co- dificante ou a uma molécula de ácido nucleico, tais como motivos inibidores de procarya, sítios doadores de junção de consenso, sítios doadores de junção críticos ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, uma sequência codificante para RdCVF recodifica- da tem menos motivos inibidores de procarya, sítios doadores de junção de consenso, sítios doadores de junção crípticos ou uma combinação dos mesmos do que a sequência nativa. Em algumas modalidades, uma sequência codificante para RdCVF recodificada não contém motivos inibidores de procarya, não contém sítios doadores de junção de consenso e/ou não contém sítios doadores de junção crípticos.
[0053] Hoover et al. (Nucleic Acids Res. (2002) 30:e43, pp1-7); Fath et al. (PLoS ONE (2011) 6:e17596 pp 1-14); Graf et al.(J Virol (2000) 74:10822-10826; Raabet al. Syst Synth Biol (2010) 4:215-225; e o Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20070141557 descrevem recodificação de regiões codificantes.
[0054] Em algumas modalidades da invenção, uma sequência co- dificante para RdCVF recodificada não contém o códon de RdCVF ATG inicial e/ou códon de parada (stop codon) de RdCVF (por exemplo, TAG). Por exemplo, uma sequência codificante recodificada RdCVF pode ser ligada operativamente 5’ ou 3’ a outra sequência co- dificante resultando em uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos heteróloga, N-terminal e/ou C-terminal à sequência de aminoácidos de RdCVF, respectivamente. Em algumas destas modalidades, o códon de RdCVF ATG inicial e/ou o códon de parada de RdCVF pode ser deletado ou estar presente na região codificante para RdCVF. Por exemplo, vide a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 3. Se outra sequência codificante for fundida in frame à extremidade 3’ de uma região codificante para RdCVF, então o códon de parada de RdCVF nativo tipicamente não estará presente na extremidade da sequência codificante para RdCVF.
[0055] Em algumas modalidades, uma região codificante para RdCVF recodificada compreende os nucleotídeos 106 a 741 de SEQ ID NO: 1, os nucleotídeos 106 a 429 de SEQ ID NO: 1, os nucleotí- deos 106 a 432 de SEQ ID NO: 3 ou os nucleotídeos 106 a 744 de SEQ ID NO: 3.
[0056] Em algumas modalidades, uma sequência codificante para RdCVF recodificada é uma sequência recodificada que codifica para os aminoácidos 36 a 246 de SEQ ID NO: 2
[0057] Em algumas modalidades, uma sequência codificante da invenção codifica para uma proteína contendo uma sequência de sinal.
Peptídeos de sinal / Sinais de secreção
[0058] Sequências de sinal são traduzidas in frame como um pep- tídeo anexado, tipicamente, à extremidade de terminal amino de um polipeptídeo de escolha. Uma sequência de sinal secretora vai provocar a secreção do polipeptídeo pela célula interagindo com o mecanismo da célula hospedeira. Como parte do processo secretor, esta sequência de sinal secretora tipicamente será clivada ou no mínimo será parcialmente clivada. O termo "sequência de sinal" também se refere a uma sequência de ácido nucleico codificando para o peptídeo de sinal. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal é heteró- loga em comparação com uma RdCVF em particular.
[0059] A estrutura de um peptídeo de sinal típico pode incluir três regiões distintas: (i) uma região N-terminal que contém um número de aminoácidos positivamente carregados (por exemplo, lisinas e argini- nas); (ii) uma região de núcleo hidrofóbico central (região h); (iii) uma região de clivagem hidrofílica (região c) que contém o motivo de sequência reconhecido pela peptidase de sinal. (Por exemplo, vide von Heijne, G. (1983) Eur. J. Biochem., 133: 17-21; von Heijne, G. (1985) J. Mol. Biol., 184: 99-105; von Heijne, G. (1997) Protein Engineering (10): 1-6). Exemplos de proteínas com peptídeos de sinal que podem ser usadas na invenção incluem, mas não estão limitadas a, hormônio do crescimento humano (HGH), proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), proteína morfogenética óssea 2 (BMP2), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de insulina 1 (IGF-1), β-glucoronidase (GUSB), fator neu- rotrófico derivado de células gliais (GDNF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator inibitório de leucemia (LIF), proteínas imunoglobulinas, hormônio do crescimento bovino, pró-albumina bovina, pró-insulina humana, gama interferon humano, alfa-fibrinogênio humano, cadeia pesada de IgG humana, amilase de rato, alfa-fetoproteína murina, lisozima de galinha, fosfatase alcalina placentária humana e proteína reína de Zea mays 22.1. Estes peptídeos de sinal podem ser usados de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, um peptídeo de sinal usado de acordo com a invenção é selecionado entre o grupo consistindo em HGH, BDNF, IGF-1 e GUSB. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal é de uma imunoglobulina tal como uma IgK.
[0060] Uma sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal de mamífero, murina ou humana. Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou vetor da invenção compreende os nucleotídeos 1 a 105 de SEQ ID NO: 1 ou 4 a 105 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal codifica para uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 2 a 34 de SEQ ID NO: 2 ou compreende a SEQ ID NO: 15. Uma sequência de nucleotídeos codificando para um peptídeo de sinal pode ser uma sequência selvagem ou pode ser uma sequência recodificada.
[0061] Em algumas modalidades da invenção, uma sequência de peptídeo de sinal é codificada para o N-terminal ou o C-terminal de uma RdCVF. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal direciona o trânsito da proteína para caminhos secretores, por exemplo, para o retículo endoplasmático (ER). Em algumas modalidades, um peptídeo de sinal facilita o transporte de proteína do citoplasma para destina- ções fora da célula. Sequências de peptídeo de sinal podem ser selecionadas entre sequências de peptídeo de sinal que ocorrem naturalmente, derivados das mesmas, ou uma sequência projetada sintética. Em algumas modalidades, parâmetros não limitantes para algumas sequências de peptídeo de sinal projetadas incluem uma sequência de 3 a 40 resíduos, compreendendo um núcleo hidrofóbico de 3 a 20 resíduos flanqueado por vários resíduos relativamente hidrofílicos.
[0062] Em algumas modalidades, uma sequência de peptídeo de sinal carece de um núcleo hidrofóbico. Exemplos não limitantes de proteínas secretoras de mamífero que carecem de uma sequência de sinal hidrofóbico típica que podem ser usadas na invenção incluem, mas não estão limitadas a, IL-1α humana, IL1β, bFGF, aFGF, PDEGF, proteína anticoagulante, lectina L-14, fator derivado de ATL, Fator XIIIa, Ancorina CII, lipocortina I, paratimosina, α-protimosina, e transglutaminase de roedor, paratimosina e MDGI.
Ácidos nucleicos
[0063] A invenção inclui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando para uma RdCVF e inclui vetores compreendendo estes ácidos nucleicos.
[0064] De modo a assegurar a expressão local e/ou de longo ter mo de um ácido nucleico se interesse, algumas modalidades da invenção contemplam a transdução de uma célula com um ácido nucleico ou com um vetor codificando uma RdCVF. A presente invenção não deve ser considerada como limitada a qualquer método de liberação de ácido nucleico em particular, e qualquer veículo de liberação de ácido nucleico disponível com ou uma estratégia de liberação de ácido nucleico in vivo ou in vitro, ou a utilização de células manipuladas (tal como a tecnologia da Neurotech, Lincoln, RI, por exemplo, vide os documentos de Patente dos Estados Unidos Nos. 6.231.879; 6.262.034; 6.264.941; 6.303.136; 6.322.804; 6.436.427; 6.878.544) bem como ácidos nucleicos da invenção codificando uma RdCVF per se (por exemplo, "DNA naked"), podem ser usados na prática da invenção. Vários veículos de liberação, tais como vetores podem ser usados com a invenção. Por exemplo, vetores virais, lipídeos amfitròficos, polímeros catiônicos, tais como polietilenimina (PEI) e polilisina, dendrímeros, tais como moléculas de combburst e moléculas de starburst, lipídeos não iônicos, lipídeos aniônicos, vesículas, lipossomas e outros meios de liberação de ácidos nucleicos sintéticos (por exemplo, vide os documentos de Patente dos Estados Unidos Nos. 6.958.325 e 7.098.030; Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in "Liposomes" in "The Therapy of Infectious Disease and Cancer"; e Lopez-Berestein & Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 317-327 e 353-365 (1989); ácidos nucleicos "naked" e assim por diante podem ser usados na prática da presente invenção.
[0065] Em algumas modalidades, é usada uma molécula de ácido nucleico na qual as sequências codificantes para RdCVF e quaisquer outras sequências desejadas são flanqueadas por regiões que estimulam a recombinação homóloga em um sítio desejado no genoma, deste modo proporcionando expressão intracromossômica do ácido nu- cleico de RdCVF (Kolleret al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstraet al. (1989) Nature 342: 435-438). A liberação de um ácido nucleico para um paciente pode ser ou direta, em cujo caso o paciente é diretamente exposto ao ácido nucleico ou ao vetor que carrega o ácido nucleico, ou indireta, em cujo caso as células são primeiro transformadas com o ácido nucleico in vitro, e em seguida transplantadas para o paciente.
[0066] Um vetor é um meio pelo qual um ácido nucleico de inte resse (por exemplo, um ácido nucleico terapêutico que pode codificar uma proteína terapêutica) é introduzido em uma célula alvo de interesse. Métodos para a obtenção ou para a construção um vetor de interesse incluem, mas não estão limiados a, técnicas de manipulação genética de rotina, reações de sequenciamento, digestos de enzimas de restrição, reações de polimerase, PCR, PCR SOEing, ligações, reações de recombinase (por exemplo, tecnologia GATEWAY® da Invitro- gen) outras enzimas ativas sobre ácidos nucleicos, bactérias e materiais de propagação de vírus e métodos, produtos químicos e reagentes, protocolos de mutagênese sítio direcionada e assim por diante, conforme é de conhecimento na arte, vide, por exemplo, o texto de Mania- tis et al., "Molecular Cloning."
[0067] Os ácidos nucleicos da invenção tipicamente vão compre- ender uma sequência de promotor ligada operativamente a uma sequência codificante para RdCVF. Um promotor pode ser um promotor de tecido específico, um promotor de célula específica, um promotor indutível, um promotor repressível, um promotor constitutivo, um promotor sintético ou um promotor híbrido, por exemplo. Exemplos de promotores úteis nos constructos da invenção incluem, mas não estão limitados a, um promotor de fago lâmbda (PL); um promotor precoce SV40; um promotor de herpes simples viral (HSV); um promotor de citomegalovírus (CMV), tal como o promotor precoce imediato de CMV humano; um promotor híbrido com reforçador de CMV e promotor de beta-actina de galinha; um sistema de promotor responsivo a trans- ativador controlado por tetraciclina (tet); um promotor de repetição de terminal longo (LTR), tal como um MoMLV LTR, BIV LTR ou um HIV LTR; um promotor da região U3 do sarcoma vírus murino de Moloney; um promotor de Granzyme A; uma ou mais sequências reguladoras do gene de metalotioneína; um promotor de CD34; um promotor de CD8; um promotor de timidina quinase (TK); um promotor de parvovírus B19; um promotor de PGK; um promotor de glicocorticoide; um promo-tor da proteína do choque térmico (HSP), tais como promotores de HSP65 e HSP70; um promotor de imunoglobulina; um promotor de MMTV; um promotor do sarcoma vírus Rous (RSV); um promotor lac; um promotor de CaMV 35S; e um promotor de nopalina sintetase. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor de MND (Robbins et al., 1997, J. Virol. 71:9466-9474), ou um promotor de MNC, o qual é um derivado do promotor de MND no qual os reforçadores de LTR são combinados com um promotor de CMV mínimo (Habermanet al., J. Virol. 74(18): 8732-8739, 2000). Em algumas modalidades, uma sequência codificante para RdCVF é ligada operativamente a uma sequência de promotor compreendendo a sequência de nucleotídeos 150 a 812 da SEQ ID NO: 11.
[0068] Em algumas modalidades, um vetor ou ácido nucleico da invenção compreende um íntron, ligado operativamente a uma sequência codificante para uma proteína RdCVF. Um íntron pode ser de um gene de RdCVF ou ser um íntron heterólogo. Íntrons heterólogos são conhecidos e exemplos não limitantes inclum um íntron do gene de β-globina humana e um íntron de beta-actina. Em algumas modalidades, uma sequência de íntron é uma sequência de íntron do gene de β-globina humana. Em algumas modalidades, uma sequência de íntron compreende os nucleotídeos 820 a 1312 de SEQ ID NO: 11 ou 908 a 1307 de SEQ ID NO: 11.
[0069] Em algumas modalidades, um ácido nucleico da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência codificante para uma proteína RdCVF, em que a sequência codifi- cante para RdCVF compreende uma sequência de nucleotídeos reco- dificada. Um ácido nucleico pode codificar para uma proteína RdCVF1 e/ou uma proteína RdCVF2. Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF é uma versão curta da proteína RdCVF. Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF é uma versão longa da proteína RdCVF. Para fins de esclarecimento, uma proteína RdCVF pode ser uma proteína RdCVF1 curta, RdCVF1 longa, RdCVF2 curta ou RdCVF2 longa. Em algumas modalidades, a proteína RdCVF é uma proteína RdCVF humana.
[0070] Tipicamente uma região codificante de nucleotídeo de ma mífero inicia com a sequência de nucleotídeos ATG (códon de metio- nina de inicialização), tal como encontrado em uma região codificante para RdCVF humana. Conforme discutido aqui, neste Pedido de patente, algumas modalidades da invenção proporcionam uma região codificante para RdCVF recodificada e em algumas modalidades adicionais a região codificante é fundida, in frame com uma segunda região codificante, por exemplo, uma sequência codificante para uma sequência de sinal. Em alguns destes casos, a sequência de nucleotí- deos de ATG não está necessariamente no início da região codificante para RdCVF, por exemplo, a região codificante para RdCVF inicia codificando para o segundo aminoácido da proteína RdCVF em particular. No entanto, a sequência de nucleotídeos de ATG pode estar no início da região codificante para RdCVF, mesmo quando a região codi- ficante para RdCVF é ligada operativamente a outra região codificante 5’ à região codificante para RdCVF.
[0071] Em algumas modalidades, um ácido nucleico da invenção compreende SEQ ID NOs: 1, 3 ou 11. Em algumas modalidades, um ácido nucleico da invenção compreende os nucleotídeos 150 a 812, 820 a 1312 e 1340 a 2080 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um ácido nucleico da invenção compreende os nucleotídeos 150 a 812, 908 a 1307 e 1340 a 2080 de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um ácido nucleico compreende adicionalmente os nucleotí- deos 2130 a 2608 de SEQ ID NO: 11.
[0072] Em algumas modalidades um ácido nucleico da invenção compreende uma região codificante para uma RdCVF, em que a sequência codificante para RdCVF foi recodificada.
[0073] Em algumas modalidades da invenção, um ácido nucleico da invenção está em um vetor, tal como um vetor viral.
Vetores virais
[0074] A invenção inclui vetores virais compreendendo uma região codificante para RdCVF da invenção. Exemplos de vetores virais úteis na presente invenção são descritos na Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO08/106644 e Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. US20100120665. Em algumas modalidades, a invenção não é limitada a um vetor viral en particular. Vetores virais incluem, mas não estão limitadas a, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais (vide, por exemplo, a Patente dos Esta- dos Unidos No. 7.045.344), vetores AAV (por exemplo, vide a Patente dos Estados Unidos No. 7.105.345), vetores virais de Herpes (por exemplo, vide as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.830.727 e 6.040.172), vetores virais de hepatite (por exemplo, hepatite D) (por exemplo, vide a Patente dos Estados Unidos No. 5.225.347), vetores de SV40, vetores de EBV (por exemplo, vide a Patente dos Estados Unidos No. 6.521.449) e vetores do vírus da doença de Newcastle (por exemplo, vide as Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.146.642, 7.442.379, 7.332.169 e 6.719.979). Em algumas modalidades, um vetor lentiviral é um vetor de HIV, EIAV, SIV, FIV ou BIV. Em algumas modalidades, um vetor é selecionado entre um vetor AAV ou um vetor adenoviral. A invenção também proporciona uma célula que produz um vetor viral da invenção.
[0075] Vírions de vetores da invenção podem ser administrados in vivo ou in vitro a células (por exemplo, células de mamífero). Vetores (virais ou não virais) podem ser usados para transduzir ou transformar células incluindo, mas não limitadas a, células indiferenciadas, células diferenciadas, células somáticas, células primitivas e/ou Células- tronco. Em algumas modalidades, células-tronco são tencionadas para administração a um humano e não para implantação em uma mulher convenientemente pseudoprenha para diferenciação e desenvolvimento em um bebê.
[0076] Em algumas modalidades, um vetor viral da invenção com preende um fator de aceleração de declínio (DAF). Por exemplo, um vetor viral envelopado inclui um DAF sobre a membrana viral. Em algumas modalidades, um DAF é um DAF selvagem. Em algumas modalidades, um DAF é parte de uma proteína de fusão com uma proteína de envelope, por exemplo, vide Guibinga et al. Mol Ther. 2005 11(4): 645-51.
[0077] Adenovírus é um vírus de DNA nuclear não-envelopado com um genoma tipicamente de cerca de 36 kb. Os adenovírus humanos são divididos em numerosos sorotipos (aproximadamente 47, numerados de acordo e classificados em 6 grupos: A, B, C, D, E e F).
[0078] Vetores adenovirais recombinantes têm tropismo tanto para células em divisão e não em divisão, mínimo potencial patogênico, ca-pacidade para replicar até alto título para preparação de estoques de vetores e o potencial de carregar insertos de sequências de nucleotí- deos relativamente grandes (Berkner, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39-66; Jolly, (1994) Cancer Gene Therapy 1: 51-64). Vetores adenovirais com deleções de várias sequências genéticas adenovirais têm sido projetados como veículos adequados para liberação de ácidos nucleicos para células. Em algumas modalidades, um vetor adenoviral da invenção é um vetor adenoviral dependente de helper ou um vetor adenoviral "gutless". Podem ser usados vetores adenovirais que são deletados em um ou mais dos seguintes genes: E1a, E1b, E2a, E2b e E3. Métodos para a condução de liberação de ácido nucleico à base de adenoviírus são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.824.544; 5.868.040; 5.871.722; 5.880.102; 5.882.877; 5.885.808; 5.932.210; 5.981.225; 5.994.106; 5.994.132; 5.994.134; e 6.001.557.
[0079] Vetores AAV são derivados de parvovírus de DNA de fila mento único (ss). Uma única partícula de AAV pode acomodar até 5 kb de ssDNA, deixando cerca de 4,5 kb para um transgene e elementos reguladores. Sistemas de trans-junção conforme descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 6.544.785, podem quase dobrar este limite e estes tipos de vetores também podem ser usados com a invenção. Com respeito à invenção, pode ser usado essencialmente AAV de qualquer sorotipo. Em algumas modalidades da invenção, pode ser usado um sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 ou AAV9 (por exemplo, vide as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.173.414, 5.252.479, 5.552.311, 5.658.776, 5.658.785, 5.763.416, 5.773.289, 5.843.742, 5.869.040, 5.942.496, 5.948.675, 6.001.650 e 7.790.449; a Publicação de Patente Internacional No. WO2009134681; Kassimet al., PLoS ONE (2010) 5(10) e13424:1-10; Kotin, Hum Mol Genet (2011) 20(R1):R2-6), embora a invenção não seja limitada a estes sorotipos (vide, por exemplo, Gao et al. (2002) PNAS 99:11854-11859; e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003).
[0080] Um vetor AAV da invenção também pode ser pseudotipado. Vetores AAV pseudotipados contêm o genoma de um sorotipo de AAV no capsídeo de um segundo sorotipo de AAV (por exemplo, vide Auri- cchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26): 3075-81). Um vetor AAV da invenção pode conter um capsídeo mutado e/ou ser redirecionado. Por exemplo, vide Griegeret al. (Adv Biochem Eng Biotechnol. (2005) 99: 119-45); Gonçalves et al. (Mol Ther. (2006) 13(5): 976-86); e Warrington et al. (J Virol. (2004) 78(12): 6595-609).
[0081] Em algumas modalidades da invenção, um vetor AAV é re vestido com polímeros, por exemplo, polímeros reativos de modo a reduzir o tropismo natural ou a ligação natural do vetor AAV; a redirecionar o vetor AAV e/ou a proporcionar resistência a antissoros neutra- lizantes. Por exemplo, vide Carlisleet al. (J Gene Med. (2008) 10(4): 400-11).
[0082] Retrovírus são vírus de RNA em que o genoma viral é RNA. Quando uma célula hospedeira é infectada com um retrovírus, o RNA genômico é transcrito reverso em um intermediário de DNA o qual é integrado de modo eficaz no DNA cromossômico de células infectadas. Lentivírus contêm outros genes com função reguladora ou estrutural. O uso de vetores retrovirais para liberação de gene é descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 6.013.516; e na Patente dos Estados Unidos No. 5.994.136. Exemplos de sistemas de BIV são descritos, por exemplo, em Matukonis et al., 2002 Hum. Gene Ther. 13, 1293-1303; Molina et al., 2002 Virology. 304, 10-23; Molina et al., 2004 Hum. Gene Ther., 15, 65-877; Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.864.085, 7.125.712, e 7.153.512; Publicação de Patente Internacional No.WO08/106644 e Publicação de Patente dos Estados Unidos No. US20100120665.
[0083] Um vetor viral de DNA é um vetor viral á base de ou deriva do de um vírus que tem um genoma à base de DNA. Um vetor viral de vírus não envelopado é um vetor viral á base de ou derivado de um vírus que carece de uma membrana bicamada de lipídeos.
[0084] Em algumas modalidades, um vetor viral da invenção é um vetor AAV. Em algumas modalidades, um vetor viral da invenção não é um vetor viral da imunodeficiência bovina ou não é um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, um vetor viral é selecionado entre o grupo consistindo de um vetor viral de DNA, um vetor viral não envelopado e um vetor adenoviral.
Liberação Celular de RdCVF, Incluindo Células Encapsuladas
[0085] Outra abordagem para terapia genética ou liberação de pro teína envolve a transferência de um gene para células in vitro ou ex vivo e em seguida a administração das células a um mamífero ou a um paciente. A transferência de um ácido nucleico para células pode ser por qualquer método, tais como, transfecção, microinjeção, eletropora- ção, fusão celular, transferência genética mediada por cromossoma, transferência genética mediada por microcélula, fusão de esferoplas- tos, lipofecção, bombardeamento de micropartículas, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transdução de bacteriófago ou vetor viral e assim por diante. Opcionalmente, um marcador selecionável também pode ser introduzido nas células. Se um for utilizado um marcador se- lecionável, as células podem ser então colocadas sob seleção, por exemplo, de modo a reforçar a expressão e/ou a isolar / selecionar as células que expressam a região codificante transferida (vide, por exemplo, Loeffler& Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); e Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)). Estas células podem ser então liberadas para um paciente diretamente ou depois de encapsulação.
[0086] Em algumas modalidades, um ácido nucleico é introduzido em uma célula antes de administração in vivo da célula recombinante resultante. Em algumas modalidades, uma técnica pode proporcionar a transferência estável do ácido nucleico para a célula, de modo a que o ácido nucleico seja expressável pela célula e em alguns casos transmissível e expressável por sua progênie celular. Células recombi- nantes podem ser liberadas para um paciente por meio de vários métodos. Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF é expressada a partir de uma célula através de um promotor regulável, indutível e/ou repressível.
[0087] Em algumas modalidades, uma célula usada é autóloga, alogênica ou xenogênica com respeito a um paciente. Em algumas modalidades, células autólogas são manipuladas ex vivo para fazer com que elas contenham um ácido nucleico da invenção o qual vai possibilitar que a célula venha a produzir ou secretar uma proteína RdCVF e as células são introduzidas de volta no paciente.
[0088] Em algumas modalidades, as células são administradas localmente (por exemplo, em uma articulação, intravitreal, intraretinal, intracranialmente etc.) ou sistemicamente (por exemplo, i.v.).
[0089] Em algumas modalidades, células sanguíneas recombinan- tes (por exemplo, células tornco hematopoiéticas e/ou progenitoras) são administradas por via intravenosa. Em algumas modalidades, células oculares e/ou células pluripotenciais podem ser injetadas diretamente no olho.
[0090] Uma célula-tronco e/ou progenitora a qual pode ser isolada e mantida in vitro pode ser usada potencialmente de acordo com algumas modalidades da invenção. As células-tronco referidas incluem, mas não estão limitadas, a Células-troncos hematopoiéticas (HSC), Células-troncos de tecidos epiteliais tais como a pele e o revestimento dos intestinos, células do músculo cardíaco embrionário, Células- troncos do fígado (vide, por exemplo, patente internacional No. WO 94/08598), e Células-troncos neurais (por exemplo, Stemple e Anderson (1992) Cell 71:973-985). Em algumas modalidades, a célula administrada é uma Célula-tronco compreendendo um ácido nucleico da invenção e é capaz de expressar e de secretar uma RdCVF.
[0091] Células encapsuladas podem permitir a liberação controla da e/ou contínua de uma proteína, tal como RdCVF, in vivo. Em algumas modalidades, células compreendendo um ácido nucleico da invenção e expressando e/ou secretando uma RdCVF são encapsuladas. Em algumas modalidades, as células são encapsuladas dentro de uma membrana semipermeável que possibilita a difusão de RdCVF através da membrana. Mais informação relacionada com células encapsuladas e implantes de células encapsuladas é encontrada em Sieving et al. (Proc Natl Acad Sci USA, (2006) 103(10):3896-901); nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 7.115.257 e 7.820.195; e na Publicação de Patente Internacional No. WO2011044216. Em algumas modalidades da invenção, células encapsuladas que expressam uma proteína RdCVF são liberadas para um animal.
[0092] Em algumas modalidades, células encapsuladas são im plantadas em um mamífero, por exemplo, implantadas no olho, no cérebro ou na região olfativa. Em algumas modalidades, células encapsuladas são células de pigmento do epitélio retinal, por exemplo, AR- PE-19 (disponível na ATCC, Manassas, VA). Em algumas modalidades, células encapsuladas são usadas para liberar RdCVF no olho, por exemplo, na parte detrás do olho.
[0093] Em algumas modalidades, um implante de células encapsu ladas da invenção consiste de células que tenham sido encapsuladas em uma seção de membrana de fibra oca semipermeável e as células tenham sido geneticamente modificadas de modo a produzir uma RdCVF. Em algumas modalidades, um implante de células encapsuladas tem uma sutura em loop em uma extremidade para ancorar à esclera no corpo vitreo-retinal dentro do olho. Em algumas modalidades, um implante de células encapsuladas tem 3, 4, 5, 6, 7, 8 ,9 ou 10 mm de extensão.
Secreção e Produção de Proteína RdCVF
[0094] Ácidos nucleicos e vetores virais da invenção podem ser usados para expressar, produzir e/ou secretar uma RdCVF a partir de uma células. Esta expressão, produção e/ou secreção pode ocorrer in vitro, in vivo ou ex vivo.
[0095] Algumas modalidades da invenção proporcionam métodos de secreção de uma proteína RdCVF a partir de uma célula compreendendo a administração, à célula, de um ácido nucleico e/ou de um vetor viral da invenção. Em algumas modalidades, a célula pode ser uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula ocular, uma célula de pigmento do epitélio retinal (RPE), um bastonete ou uma célula cone.
[0096] Algumas modalidades da invenção utilizam células de ver tebrado ou de mamífero. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero são uma linhagem celular de rim de macaco CVI transformada por SV40 (por exemplo, COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (por exemplo, células 293 ou 293T incluindo ou linhagem celular subclonada para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) tal como 293 Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA)) ou 293FT; células de rim de bebê de hamster (por exemplo, BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês (células CHO); células de ovário de hamster chinês /-DHFR (por exemplo, CHO, Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (por exemplo, TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (por exemplo, CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (por exemplo, VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (por exemplo, HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (por exemplo, MOCK, ATCC CCL 34); células CF2TH; células de fígado de búfalo rato (por exemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (por exemplo, W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (por exemplo, Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (por exemplo, MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1983)); células MRC 5; células ARPE-19 (ATCC) e células FS4.
[0097] Em algumas modalidades, uma célula é selecionada entre o grupo consistindo de uma célula 293, uma célula CHO, uma célula PerC6, uma célula Vero, uma célula BHK, uma célula HeLa, uma célula COS, uma célula MDCK, uma célula 3T3 ou uma célula WI38.
[0098] Algumas modalidades da invenção proporcionam uma célu la isolada compreendendo um ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é integrado no DNA / genoma celular.
[0099] A invenção também inclui métodos para a produção de uma proteína RdCVF compreendendo cultivar uma célula sob condições que permitam a expressão e a secreção da proteína RdCVF e isolar a proteína RdCVF da cultura celular, em que a célula compreende um ácido nucleico da invenção que codifica para e permite a expressão da proteína RdCVF, por exemplo, secreção de uma proteína RdCVF. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos compreende uma sequência codificante para uma proteína RdCVF, em que a sequência codificante para RdCVF compreende uma sequência recodificada. A proteína RdCVF pode ser uma proteína RdCVF 1 ou 2 ou pode ser a forma longa ou curta. Em algumas modalidades, estes métodos compreendem adicionalmente purificação da proteína RdCVF da célula e/ou do sobrenadante da cultura.
[00100] A invenção também inclui uma proteína RdCVF expressada por uma célula de um ácido nucleico da invenção. A invenção também proporciona formas secretadas de proteínas RdCVF da invenção e composições compreendendo uma proteína RdCVF secretada da invenção.
[00101] Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF expressada a partir de uma célula é purificada até no mínimo 90%, no mínimo 93%, no mínimo 95%, no mínimo 98%, no mínimo 99,5% ou no mínimo 99,9% pura em relação à proteína total.
Composições, Formulações e Preparações
[00102] Algumas modalidades da invenção proporcionam composições, formulações ou preparações, por exemplo, composições farmacêuticas, contendo um ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção, uma proteína RdCVF da invenção, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00103] Formulações (por exemplo, para injeção) são geralmente, mas não necessariamente, soluções biocompatíveis do ingrediente ativo, por exemplo, compreendendo solução de Hank, solução de Ringer ou salina tamponada com fosfato. Em algumas modalidades, uma formulação ou uma composição farmacêutica compreende um ou mais dos seguintes: citrato, NaCl, cloreto de potássio (KCl), diidrato de cloreto de cálcio (CaCh2H2O), hexaidrato de cloreto de magnésio (MgCh6H2O), triidrato de acetato de sódio (CH3CO2Na^3H2O), diidrato de citrato de sódio (CeH5θ7Na3^2H2θ), sacarose, hidróxido de sódio e/ou ácido clorídrico (para ajustar o pH) e água. A lista precedente inclui algumas moléculas que são listadas como hidratos particulares, por exemplo, diidrato, triidrato, hexaidrato, etc. Deve ser entendido que vários hidratos destes compostos podem ser usados na invenção e a invenção não é limitada a estas formas de hidrato em particular das moléculas listadas. Em algumas modalidades, uma formulação ou uma composição farmacêutica compreende um ou mais ingredientes selecionados entre o grupo consistindo de histidina, MgCl2, trehalose, um polissorbato, polissorbato 20, NaCl, sacarose, arginina e prolina. Em algumas modalidades, uma formulação compreende one ou mais dos seguintes: histidina; α, α-trehalose dehidrato; MgCl2; um polissorbato tal como polissorbato 20; e NaCl. Em algumas modalidades, uma formulação ou uma composição farmacêutica compreende um ou mais dos seguintes: salina tamponada com fosfato (PBS) e pluronic F-68. Em algumas modalidades, a concentração de pluronic F-68 pode ser 0,0001%, 0,001%, 0,005%, 0,01% ou 0,1%.
[00104] Exemplos de formulações adequadas e de métodos formu- latórios para um modo de administração desejado podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, última edição, Mack Publishing Co., Easton, PA e na Patente dos Estados Unidos No. 7.208.577.
[00105] Em algumas modalidades, uma composição para utilização in vivo contém um "veículo" ou um "veículo farmaceuticamente aceitável". O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual o um ácido nucleico, um vetor ou uma proteína da invenção é administrado. O termo "veículo" inclui, mas não é limitado a, material ou sólido ou líquido, o qual pode ser inorgânico ou orgânico e de origem sintética ou natural, com o qual um ou mais componentes ativos da composição são misturados ou formulados de modo a facilitar a administração a um indivíduo. São adequados quaisquer ou- tros materiais habitualmente empregados na formulação de um farma-cêutico. Veículos farmacêuticos podem diferir de soluções e suspensões típicas em que são especificamente preparados para utilização in vivo de modo a excluir substâncias que podem ser prejudiciais para o hospedeiro ao qual a composição é administrada (por exemplo, remoção de toxinas bacterianas).
[00106] Exemplos de veículos líquidos adequados incluem água e soluções aquosas contendo compostos orgânicos oxigenados tais como etanol. Tampões e outros materiais normalmente presentes em preparações farmacêuticas, tais como agentes aromatizantes e de suspensão, também podem estar presentes. Em geral, um ou mais óleos adequados, salina, dextrose aquosa (glicose), e soluções de açúcar relacionadas e glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicóis são tipicamente veículos adequados para soluções parenterais. Em algumas modalidades, soluções para administração parenteral contêm um sal solúvel em água do ingrediente ativo, agentes estabili- zantes adequados, e caso desejável ou necessário, substâncias tampão. Agentes antioxidantes tais como bissulfito de sódio, sulfito de sódio, ou ácido ascórbico, quer isolados ou combinados, podem ser usados como agentes estabilizantes. Além disso, são usados ácido cítrico e seus sais e sódio EDTA. Além disso, soluções parenterais podem conter preservantes, tais como cloreto de benzalcônio, metil parabeno ou propil parabeno e clorobutanol.
[00107] Veículos podem incluir carboidratos tais como trealose, manitol, glutationa, xilitol, sacarose, lactose e sorbitol. Outros ingredientes para utilização em formulações podem incluir, por exemplo, DPPC (1,2-Didecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-Dioleoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina), DSPC (1,2-Diestearoil-sn-glicero-3- fosfocolina 1,2-Diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) e DOPC (1,2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina). Podem ser usados surfatantes natu- rais ou sintéticos. Pode ser usado polietileno glicol (mesmo além de sua utilização na derivação de uma proteína). Podem ser usados dex- tranos, tais como ciclodextrano. Em algumas modalidades, podem ser usadas ciclodextrina, aminas terciárias e/ou beta-ciclodextrina. Podem ser usados sais biliares e outros reforçadores relacionados. Podem ser usados celulose e derivados celulósicos. Podem ser usados aminoáci- dos, tal como utilização em uma formulação tampão. Além disso, é contemplada a utilização de lipossomas, microcápsulas ou microsfe- ras, complexos de inclusão, ou outros tipos de veículos.
[00108] Uma composição, caso desejado, também pode conter agentes umectantes e/ou emulsificantes, e/ou agentes de tampona- mento do pH. Onde necessário, uma composição também pode incluir um agente solubilizante e/ou um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no sítio de injeção.
[00109] Em algumas modalidades, uma preparação farmacêutica ou composição da invenção compreende um (i) veículo farmaceutica- mente aceitável e (ii) um ácido nucleico da invenção, um vetor viral da invenção, uma proteína RdCVF da invenção ou qualquer combinação dos mesmos.
Administração, Liberação e Tratamento
[00110] Deve ser entendido que quando é discutida a introdução ou a administração de um ácido nucleico ou de um vetor codificando uma proteína RdCVF, que a invenção também contempla a introdução ou a administração da própria proteína RdCVF. Deve ser entendido que quando é discutida a introdução de uma proteína RdCVF, que a invenção também contempla a introdução de um ácido nucleico ou de um vetor codificando uma proteína RdCVF.
[00111] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas localmente ou sistemicamente. Vias de administração úteis são descritas aqui, neste Pedido de patente, e são conhecidas na arte. Métodos de introdução ou administração incluem, mas não estão limitadas a, vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, intratraqueal, tópica, inalada, transdérmica, retal, parenteral, injeção epidural, intracraniana, dentro do cérebro, intraventricular, subdural, intra-articular, intratecal, intracardíaca, intracoronária, intravitreal, sub-retiniana, intracâmara anterior do olho, localmente sobre a córnea, subconjuntival, subteno- niana, por aplicação de gotas oculares, vias orais, através de cateter de balão, através de stent ou quaisquer combinações dos mesmos. A administração sistêmica pode ser, mas não é limitada a, por injeção intravenosa ou intra-arterial ou por liberação transmucosa, subcutânea, transdérmica e/ou intraperitoneal.
[00112] Em algumas modalidades, por exemplo, compreendendo administração ao olho, um vetor ou um ácido nucleico codificando para RdCVF da invenção é administrado cerca de uma vez a cada semana, mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, ano, 18 meses, 2 anos, 30 meses, 3 anos, 5 anos, 10 anos ou conforme necessário. Em algumas modalidades, por exemplo, compreendendo administração ao olho, um vetor ou um ácido nucleico codificando para RdCVF da invenção é administrado a partir de em torno de a cada 1 a 4 semanas, em torno de a cada 4 a 8 semanas, em torno de a cada 1 a 4 meses, em torno de a cada 3 a 6 meses, em torno de a cada 4 a 8 meses, em torno de a cada 6 a 12 meses, em torno de a cada 9 a 15 meses, em torno de a cada 12 a 18 meses, em torno de a cada 15 a 21 meses, em torno de a cada 18 a 24 meses, em torno de a cada 1 a 2 anos, em torno de a cada 1,5 a 3 anos, em torno de a cada 2 a 4 anos, em torno de a cada 3 a 5 anos, em torno de a cada 5 a 7 anos, em torno de a cada 7 a 10 anos ou em torno de a cada 10 a 20 anos. Espera-se que a administração de um vetor codificando para uma proteína RdCVF venha a ser menos frequente do que a administração da própria proteína RdCVF. Em algumas modalidades da invenção, uma preparação farmacêutica compreende um vetor codificando uma proteína RdCVF da invenção e a preparação farmacêutica é administrada somente uma vez ao paciente.
[00113] Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF da invenção é administrada por injeção intravitreal ou sub-retiniana a um olho humano. Em algumas modalidades, cerca de 15 μg a cerca de 5 mg; cerca de 15 μg a cerca de 500 μg; cerca de 100 μg a cerca de 900 μg; cerca de 300 μg a cerca de 700 μg; cerca de 500 μg a cerca de 1 mg; cerca de 1 mg a cerca de 5 mg; cerca de 1mg; ou cerca de 500 μg de uma proteína RdCVF é administrado por injeção intravitreal ou sub- retiniana a um olho humano.
[00114] Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF é administrada por injeção sub-retiniana ou por injeção intravitreal de um vetor AAV que codifica para RdCVF. Em algumas modalidades, cerca de 5x108 a cerca de 1x109; cerca de 5x108 a cerca de 7.5x108; cerca de 7.5x108 a cerca de 1x109; cerca de 6x108 a cerca de 9x108; cerca de 7x108 a cerca de 8x108; cerca de 5x108; cerca de 6x108; cerca de 7x108; cerca de 8x108; cerca de 9x108; ou cerca de 1x109 número de cópias de genoma do vetor (GC) de um vetor AAV é administrado por injeção sub-retiniana. Em algumas modalidades, cerca de 5x108 a cerca de 1x1010; cerca de 5x108 a cerca de 5x109; cerca de 5x108 a cerca de 2x109; cerca de 2x109 a cerca de 5x109; cerca de 5x109 a cerca de 1x1010; cerca de 5x108 a cerca de 1x109; cerca de 1x109 a cerca de 3x109; cerca de 3x109 a cerca de 6x109; cerca de 6x109 a cerca de 1x1010; cerca de 1x109 a cerca de 1x1010; cerca de 1x1010 a cerca de 1x1011; ou 1x1011 a cerca de 1x1012 GC de um vetor AAV é administrado por injeção intravitreal. Deve ser entendido que a quantidade de vetor AAV é algumas vezes medida em unidades de transdução ou em número de cópias de genoma. Os números de cópias de genoma são tipicamente entre 25 a 300 vezes maiores do que quanto a mesma amostra de vetor AAV é medida para unidades de transdução.
[00115] Em algumas modalidades, um anti-inflamatório pode ser liberado em combinação com uma proteína RdCVF, com um vetor ou com um ácido nucleico da invenção. Um anti-inflamatório pode ser liberado antes de, concomitantemente com, e/ou depois da administração de uma molécula ou de um vetor da invenção. Em algumas modalidades, um anti-inflamatório é administrado na mesma solução e/ou na mesma seringa que uma proteína RdCVF, que um ácido nucleico ou que um vetor da invenção. Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF, um ácido nucleico ou um vetor da invenção e um anti- inflamatório são co-administrados ao olho.
[00116] Muitos fármacos anti-inflamatórios são conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitadas a, dexametasona, dexametasona sódio metassulfobenzoato, dexametasona sódio fosfato, fluorometolo- na, bronfenac, pranoprofeno, emulsão oftálmica de ciclosporina (por exemplo, RESTASIS™), naproxeno, glicocorticoides, cetorolac, ibupro- feno, tolmetina, fármacos anti-inflamatórios não-esteroides, fármacos anti-inflamatórios esteroides, diclofenaco, flurbiprofeno, indometacina, e suprofeno.
[00117] Algumas modalidades da invenção incluem a administração de tanto uma proteína RdCVF quanto um vetor a codificando. Uma proteína RdCVF pode ser liberada antes de, concomitantemente com, e/ou depois da administração de um vetor da invenção. Em algumas modalidades, uma proteína RdCVF é administrada na mesma solução e/ou na mesma seringa que um vetor da invenção. Em algumas modalidades, um vetor da invenção e uma proteína RdCVF são co- administrados ao olho.
[00118] Em algumas modalidades da invenção, um sistema de liberação genética pode resultar em transdução e/ou integração estável de um gene ou região codificante para uma proteína RdCVF em uma célula-alvo. Em algumas modalidades, células-alvo são células de mamífero tais como células de primatas ou células humanas. Em algumas modalidades, células-alvo são células do olho, tais como células de pigmento do epitélio retinal, bastonetes fotorreceptores, células cone fotorreceptoras, células bipolares, células horizontais, células amácri- nas, células ganglionares, células retinais, ou células pluripotenciais. Células alvo podem ser in vitro, ex vivo ou in vivo. Em algumas modalidades, uma célula alvo é uma Célula-tronco. Células-tronco incluem, mas não estão limitadas a, Células-tronco pluripotentes, Células- tronco totipotentes, Células-tronco hematopoiéticas, Células-tronco cancerígenas e Células-tronco embrionárias. Em algumas modalidades, células pluripotenciais contempladas aqui, neste Pedido de patente, não são aquelas para propagação de uma entidade viva a partir de um zigoto ou blastômero. A presente invenção também contempla a utilização de uma célula parcialmente indiferenciada para implantação no olho de um paciente que necessite de tratamento, por exemplo, para regenerar as células do olho.
[00119] A invenção também proporciona métodos de tratamento. Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos de preservação de bastonetes oculares compreendendo a administração, ao olho de um mamífero, de um ácido nucleico da invenção, de um vetor viral da invenção, de uma proteína RdCVF da invenção, de uma composição farmacêutica da invenção ou de uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um vetor viral e/ou ácido nucleico da invenção é administrado por injeção sub-retiniana, injeção intravitreal, injeção na câmara intra-anterior do olho, injeção subconjuntival, injeção subtenoniana ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um humano é tratado. Em algumas modalidades, o mamífero a ser tratado sofre de uma doença ocular selecionada entre o grupo consistindo de uma distrofia retinal, doença de Stargardt, retinite pigmentosa, degeneração macular seca relacionada com a idade (em inglês, dry AMD), atrofia geográfica (estágio avançado de dry AMD), degeneração macular úmida relacionada com a idade (em inglês, wet AMD), glaucoma / hipertensão ocular, retinopatia diabética, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-Kornzweig, doença de Best, coroidema, atrofia girada, amaurose congênita, síndrome de Refsum, síndrome de Usher, doença dos olhos relacionada com a tiroide, doença de Grave, uma doença associada com células epiteliais pigmentadas retinais, doença do segmento anterior, doença de lente / catarata, um distúrbio do copo ocular, ou uveíte. Em algumas modalidades, o bastonete ocular preservado não contém um ácido nucleico e/ou vetor viral da invenção. Por exemplo, a célula ocular preservada não é preservada através de transdução da própria célula ocular preservada.
[00120] Algumas modalidades da invenção proporcionam um método de preservação de bastonetes oculares compreendendo a administração, ao olho de um mamífero, de um ácido nucleico da invenção e/ou de um vetor viral da invenção, em que o ácido nucleico e/ou o vetor viral é administrado por injeção sub-retiniana e os bastonetes e/ou células cone são preservados em um sítio no mínimo 1 mm, no mínimo 2 mm, no mínimo 3 mm, no mínimo 5 mm, no mínimo 7 mm, no mínimo 10 mm, no mínimo 15 mm, no mínimo 20 mm ou no mínimo 25 mm do sítio da injeção sub-retiniana. Por exemplo, e não desejando ser limitados pela teoria, as células transduzidas com o ácido nucleico ou com o vetor viral no sítio de injeção sub-retiniana expressam e/ou se- cretam uma proteína longa RdCVF e/ou uma proteína curta RdCVF a qual pode proporcionar um efeito de preservação de bastonetes e/ou células cone oculares em um sítio distante das células transduzidas ou do sítio de injeção.
[00121] Além de sua expressão no olho, a proteína RdCVF também é naturalmente expressada em outros tecidos. Usando uma abordagem proteômica foi visto que 90 proteínas interagem com RdCVFL incluindo a proteína tau de ligação de microtúbulos (Fridlich et al .Mol Cell Proteomics (2009) 8(6): 1206-1218). Fridlich et al. demonstraram que o nível de fosforilação de TAU está aumentado na retina dos camundongos Nxnl1-/- (RdCVF1-/-) uma vez que é hiperfosforilada no cérebro de pacientes sofrendo da doença de Alzheimer, presumivelmente em alguns casos através de stress oxidativo. Fridlich et al. tam-bém mostraram que RdCVFL inibe a fosforilação de TAU. Cronin et al. (Cell Death e Diferentiation (2010) 17: 1199-1210) verificaram que retinas Nxnl1-/- (RdCVF1-/-) continham proteína TAU agregada, conforme encontrado no cérebro de pacientes sofrendo da doença de Alzheimer.
[00122] Camundongos carecendo de RdCVF2 têm visão e olfato prejudicados. Camundongos normais expressam RdCVF2 no epitélio olfativo. Jaillard et al. (ARVO meeting (2009) program#/poster# 491/D636) reportaram que foi visto que neurônios olfativos sobrevivem até uma taxa mais elevada quando cultivados na presença de RdCVF2. Jaillard et al. também compararam camundongos RdCVF2-/- com controle, realizando testes de aprendizado de discriminação olfativa. Por volta de 12 meses de idade, os camundongos RdCVF2-/- não conseguiram responder corretamente ao estímulo.
[00123] As proteínas RdCVF têm atividade neuroprotetora e são não somente um fator para sobrevida de células cone e/ou bastonetes, mas são fatores de sobrevida geral de neurônios.
[00124] Portanto com base no acima exposto, um ácido nucleico codificando RdCVF, um vetor viral codificando RdCVF ou uma proteína RdCVF da invenção pode ser usado para tratar ou melhorar doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson e doenças olfativas.
[00125] A invenção inclui métodos de tratamento de uma doença compreendendo a administração, a um mamífero, de um ácido nuclei- co da invenção, de um vetor viral da invenção, de uma proteína RdCVF da invenção, de uma composição farmacêutica da invenção ou de uma combinação dos mesmos, em que a doença é selecionada entre o grupo consistindo de doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson e uma doença olfativa. Em algumas modalidades, o vetor viral desta invenção é um vetor AAV.
EXEMPLOS
[00126] A invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos são proporcionados para o fim de ilustração somente e a invenção não deve ser de modo algum considerada como sendo limitada a estes exemplos mas de preferência deve ser considerada como engloban do qualquer uma e todas as variações as quais se tornem evidentes como um resultado dos ensinamentos proporcionados aqui, neste Pedido de patente.
[00127] Considerando que modalidades particulares da invenção foram descritas aqui, neste Pedido de patente, para fins de descrição, será reconhecido por aqueles versados na arte que numerosas variações dos detalhes podem ser feitas sem se afastar da invenção conforme descrito nas reivindicações anexadas.
[00128] Todas as publicações, patentes e Pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui, a este Pedido de patente, incorporados por meio de referência em sua totalidade na especificação na mesma extensão como se cada publicação, patente ou Pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado aqui, a este Pedido de patente, por meio de referência. Além disso, é incorporada por meio de referência qualquer informação suplementar que tenha sido publicada junto com qualquer uma das publicações, patentes e Pedidos de patente mencionados acima. Por exemplo, alguns artigos de periódicos são publicados com informação suplementar que está tipicamente disponível on line. Exemplo 1 - Sequências codificantes recodificadas para formas longa e curta de RdCVF1.
[00129] Regiões codificantes de nucleotídeos RdCVF1S e RdCVF1L humanas recodificadas foram projetadas (por exemplo, nucleotídeos 106 a 741 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 106 a 744 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12 ou 14). GENEART® (Regensburg, Alemanha) sequências de ácido nucleico sintetizadas que, entre outras coisas, continham sequências codificantes de nucleotídeos códon otimizados para RdCVF1S e RdCVF1L. Estas sequências codificantes foram também recodificadas de modo a minimizar motivos tais como motivos inibidores de procarya, sítios doadores de junção de consenso e sítios doadores de junção crípticos.
[00130] A recodificação de uma sequência codificante para RdCVF1L humana também proporcionou uma região codificante para RdCVF1S recodificada, nucleotídeos 1 a 327 de SEQ ID NO: 12 com um códon de parada (stop codon) na extremidade 3’. Alinhamento de uma região codificante para RdCVF1L nativa a uma região codificante recodificada RdCVF1L (1-639): Identidades = 529/639 (82,8%) 89/213 códons diferentes (41,7%) RdCVF1S (1-327): Identidades = 274/327 (83,8%) 44/109 códons diferentes (40,4%) RdCVF1S (1-327 e TGA) Identidades = 277/330 (83,9%) 44/110 códons diferentes (40,0%) ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGACGAGCTG 60 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I ATGGCCAGÇCT G T TCAGCGGCÇGG AT C C TGA.TC A G GAAC AAC AGOGACCAG GAC GAGCTG 60 GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGT 120 II II I I I I I II II II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I GACACCGAGGCCGAAGTGAGCAGGAGGCTGGAGAACAGACTGGTGCTGCTGTTCTTTGGC 120 GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGG 180 II II II II II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I III II GCCGGAGCCTGCCCTCAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTGAAGGATTTCTTTGTGAGG 180 CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAG 240 II II II I I I I I I I I II III I II II I I I I I I I I I I I I 1 I I I I III Illi CTGACCGACGAGTTCTACGTGCTGAGAGCCGCCCAGCTGGCCCTGGTGTATGTGAGCCAG 240 GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTC 300 GACAGCACCGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTGAAGGACATGCCCAAGAAGTGGCTGTTC 300 cuta* donga CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGjGACCTCGGGCGCCAGTTCTCAGTGGAGCGCCTG 360 I I I I I I I I I I I I I II I I I I I II I I I I I II I I I I I I 1 I I I I I I I III CTGCCCTTCGAGGACGÃCCTGAGAAGArGACCTGGGCAGGCAGTTCAGCGTGGAGÃGACTG 360 CCGGCGGTCGTGGTGCTCAAGCCGGACGGGGACGTGCTCACTCGCGACGGCGCCGACGAG 420 II II II I I I I I I I I I I I I I II II I I I I I I I I II I II I I I I I I I I I I I I CCCGCCGTGGTGGTGCTGAAGCCTGATGGCGACGTGCTGACCAGAGATGGCGCCGACGAG 420 ATCCAGCGCCTGGGCACCGCCTGCTTCGCCAACTGGCAGGAGGCGGCCGAGGTGCTGGAC 480 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ATCCAGAGACTGGGCACCGCCTGCTTCGCCAACTGGCAGGAGGCCGCCGAGGTCCTGGAC 480 CGCAACTTCCAGCTGCCAGAGGACCTGGAGGACCAGGAGCCACGGAGCCTCACCGAGTGC 540 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I I I I I I I I AGAAACTTCCAGCTGCCCGAGGATCTGGAGGATCAGGAGCCCAGATCCCTGACCGAGTGC 540 CTGCGCCGCCACAAGTÃCCGCGTGGAAAAGGCGGCGCGAGGCGGGCGCGACCCCGGGGGA 600 III I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I II I I CTGAGGCGGCACAAGTACAGAGTGGAGAAGGCCGCCAGAGGCGGCAGAGACCCTGGCGGC 600 GGGGGTGGGGAGGAGGGCGGGGCCGGGGGGCTGTTCTGA 639 (SEQTDNO:?) II II II I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I GGAGGAGGAGAGGAGGGCGGAGCCGGCGGACTGTTCTGA 63 9 (SEQTDNO: 12)
[00131] Recodificação de uma sequência codificante nativa para RdCVF1L para SEQ ID NO: 12 removeu 2 motivos inibidores de pro- carya, 1 sítio doador de junção de consenso e 3 sítios doadores de junção crípticos não deixando nenhum destes elementos na sequência recodificada (SEQ ID NO: 12). Recodificação também modificou o teor médio de GC de 65% para 63%.
[00132] Os nucleotídeos 1 a 327 de SEQ ID NO: 12 também pro- porcionam uma sequência codificante recodificada para RdCVF1S mas sem um códon de parada (stop codon), tal como TGA. Alinhamento de uma região codificante de RdCVFIS nativa a uma região codificante recodificada Identidades = 278/330 (84,2%) 43/110 códons diferentes (39,1%) ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGÃTCCGCAACaATAGCGACCAGGACGAGCTG 60 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ATGGCCAGCCTGTTCAGCGGCCGGATCCTGATCAGGAACAACAGCGACCAGGACGAGCTG 60 GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGT 120 II II I I I I I II II II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GACACCGAGGCCGAAGTGAGCAGGAGGCTGGAGAACAGACTGGTGCTGCTGTTCTTTGGC 120 GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGG 180 II II II II II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GCCGGAGCCTGCCCTCAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTGAAGGATTTCTTTGTGCGG 180 CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAG 240 II II II I I I I I I I I II III I II II I I I I I I I I I I I I I I I I I III Illi CTGAGCGAGGAGT T CTACGTGCT GAGAGCCGCCCAGCTGGCCCTGGT GTATGT GAGCCAG 240 GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTC 300 III III I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III GACAGCACCGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTGAAGGACATGCCCAAGAAGTGGCTGTTC 300 CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGTGA 330 (SEQIDNO:13) I I I I I I I I I I I I I II III Illi III CTGCCCTTCGAGGACGACCTGCGGAGATGA 330 (SEQIDNO:14)
[00133] Recodificação de uma sequência codificante nativa para RdCVF1S para SEQ ID NO: 14 removeu 1 motivo inibidor de procarya, 1 sítio doador de junção de consenso e 2 sítios doadores de junção crípticos não deixando nenhum destes elementos na sequência recodi- ficada (SEQ ID NO: 14). Recodificação também modificou o teor médio de GC de 58% para 61%. Exemplo 2 - Expressão in vitro de fator de viabilidade dos cones derivado dos bastonetes de forma longa mediado por vetor viral adeno- associado
Clonagem de Plasmídeos
[00134] O cDNA da forma curta da proteína RdCVF foi amplificado por PCR a partir do ácido nucleico sintetizado por GENEART® e clo- nado no plasmídeo pSecTag2A (Invitrogen, Catálogo No. V900-20) que incorporou uma sequência de peptídeo de sinal de Igk de camundongo de tal modo que a sequência de DNA de peptídeo de sinal de Igk é orientada cinco prime a uma sequência codificante para RdCVFS. O plasmídeo resultante foi designado pAVTrRd034. O tamanho e a orientação de pAVTrRd034 foram confirmados usando digestos de enzimas de restrição. A sequência de Igk-RdCVFS foi amplificada por PCR a partir de pAVTrRd034 e inserida no plasmídeo pAAV- MCS do vetor de vírus adeno-associado (Cell Biolabs, San Diego, CA), criando o plasmídeo pAAV-SRd269 (SEQ ID NO: 8). A forma longa de RdCVF códon-otimizada foi amplificada por PCR e inserida no plasmí- deo pAVT001 de clonagem internamente, criando o plasmídeo pAVTL- rRd055 (SEQ ID NO: 9). Os plasmídeos pAVTLrRd055 e pAAV- SRd269 foram duplamente digeridos com Bgl II e Stu I. A banda de 4,8 kb de pAAV-SRd269 e a banda de 540 bp de pAVTLrRd055 foram ligadas, criando pAAV-LRd268 (SEQ ID NO: 10) que continha uma sequência codificante recodificada para RdCVF longa. O tamanho e a orientação de pAAV-LRd268 foram confirmados usando digestos de enzimas de restrição.
[00135] Como as sequências de N-terminal da forma curta e da forma longa da proteína RdCVF são idênticas, a extremidade da sequência de DNA de RdCVF curta do pAVTrRd034 foi trocada pela extremidade da sequência de DNA de RdCVF longa códon-otimizada do plasmídeo pAVTLrRdCVF055, deste modo produzindo o plasmídeo de rAAV pAAV-LRd268, contendo as seguintes características entre os AAV-ITRs:
promotor de CMV — íntron de β-globina — Igk-RdCVF1L — Poli A Produção e Purificação de Vetores Recombinantes AAV-RdCVF1L e AAV-GFP
[00136] Os plasmídeos pAAV-LRd268, pHELPER (Cell BioLabs, Catálogo No. 340202), e pRC2 (Cell BioLabs, Catálogo No. 340201) foram transformados em células de bactérias DH10B competentes (In- vitrogen, Catálogo No. 18297-010) e expandidos usando o kit Qiage- nEndoFree Plasmid Maxi Kit ou EndoFree Plasmid Mega Kit de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de plasmídeos foram determinadas usando um espectrofotômetro Beckman DU-600. A identidade de cada um dos plasmídeos foi confirmada por digestos de restrição e análise.
[00137] De modo a produzir o vetor rAAV-RdCVF1L, células 293AAV (Cell BioLabs, Catálogo No. AAV-100) foram semeadas a 4 milhões de células por placa de 15 cm em meio cDMEM (DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de Glutamina, 1% de aminoácidos não-essenciais, e 1% de Penicilina / Estreptomicina). No dia seguinte o meio foi substituído com 25 mL de meio cDMEM fresco. Duas horas depois a transfecção foi realizada. Água (57,4 mL) foi misturada com 1,3 mg de pHELPER, 650 μg de pRC2, 650 μg de pAAV-LRd268, e 8,1 mL de CaCl2 a 2 M (mistura de água / plasmídeo / CaCl2). Um volume de 12,5 mL de 2xHBS (Lonza, Sku:RR07005) foi transferido para dentro de cada um de cinco tubos cônicos de 50 mL. Enquanto em turbi- lhonamento, 12,5 mL da mistura de água / plasmídeo / CaCl2 foi lentamente adicoinada a cada um dos tubos cônicos contendo 2xHBS. Depois de uma incubação por 5 minutos, 2,5 mL da suspensão foi adicionada a cada placa de cultura celular contendo as células 293AAV.
[00138] No dia seguinte o meio foi substituído com 25 mL de novo meio cDMEM por placa. Dois dias depois as células foram colhidas usando um levantador celular (cell lifter) e a mistura de célula e meio foi transferida para dentro de tubos cônicos de 250 mL. As amostras foram centrifugadas a 3.000 rpm por 15 minutos a 4°C, o sobrenadan- te foi descartado e os péletes celulares foram ressuspendidos em 110 mL de DMEM. As amostras celulares ressuspendidas foram divididas em alíquotas (30 mL) dentro de tubos cônicos de 50 mL e foi realizada uma etapa de congelamento / degelo / congelamento usando banho de etanol / gelo seco e banho maria a 37°C. Os tubos foram armazenados a -80°C até processo posterior do material. O mesmo processo foi empregado para produzir rAAV-GFP, substituindo o plasmídeo pA- AV-LRd268 com o plasmídeo pAAV-GFP (Cell BioLabs Catálogo No. AAV-400).
[00139] De modo a purificar o vetor rAAV-RdCVF1L, quatro tubos cônicos de 50 mL contendo o vetor da etapa de congelamento / degelo / congelamento foram degelados a 37°C em um banho de água. Quarenta microlitros de BENZONASE® (Sigma, Catálogo No. E8263- 25kU) foi adicionado a cada tubo o qual foi em seguida incubado a 37°C por 30 minutos. Os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 3.000 rpm e os sobrenadantes foram transferidos para dentro de uma garrafa de 500 mL. Seis mililitros de uma solução a 10% de desoxico- lato de sódio (8,2 g em 82 mL de água) foram adicionados. A amostra foi rapidamente misturada e incubada a 37°C por 30 minutos. A suspensão foi filtrada usando filtros de 5 μm. Em seguida, foi realizada outra etapa de filtração usando filtros de 0,8 μm. Uma coluna de hepa- rina agarose (8 mL) (Sigma, Catálogo No. H6508-25mL) foi preparada e a coluna foi equilibrada com 48 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) (Invitrogen, Catálogo No. 10010-049). O lisado celular filtrado foi carregado sobre a coluna e a coluna foi lavada com 40 mL de tampão de lavagem (20 mL de NaCl a 5 M, 980 mL de PBS). O vetor foi elutri- ado usando 15 mL de tampão de elutriação (80 mL de NaCl a 5 M, 920 mL de PBS) e coletado em um novo tubo cônico de 50 mL.
[00140] O vetor foi concentrado por filtração centrífuga. Uma unidade de filtro centrifugacional Amicon Ultra-15 (Millipore, Catálogo No. UFC910024) foi enxaguada uma vez com PBS e a amotra elutriada foi adicionada ao dispositivo. Foi realizada centrifugação em uma centrífuga Beckman Allegro 6KR a 2.200 rpm, 22°C, até a amostra ter sido concentrada até um volume de 1 a 2 mL. Um volume de 15 mL de PBS foi adicionado e a centrifugação foi repetida até o volume da amostra ser < 1 mL. O vetor purificado foi coletado e as paredes do filtro foram enxaguadas com 100 μL de PBS. A amostra foi misturada e alíquotas de 30 μL do vetor foram armazenadas a -80°C em tubos cônicos de 600 μL até a utilização.
[00141] Este processo foi repetido para purificar o vetor rAAV-GFP.
[00142] A Figura 9 e a SEQ ID NO: 11 mostram a sequência de ácido nucleico do vetor rAAV-RdCVF1L.
Prova de Título Genômico de Vetores AAV Recombinantes Purificados
[00143] De modo a medir o título genômico dos vetores rAAV- RdCVF1L e rAAV-GFP purificados, 5 μL do vetor apropriado foi misturado com 5 μL de 10X tampão de DNase, 1 μL de enzima DNase I (Roche, Catálogo No. 04716728001), e água para um volume total de 50 μL. Depois de incubação por 30 minutos a 37°C, a enzima foi inati- vada por incubação a 65°C por 10 minutos. Proteinase K (0,5 μL) (Roche, Catálogo No. 03115887001) foi adicionada. A amostra foi rapidamente misturada e incubada por 60 minutos a 50°C. A proteinase K foi inativada por 95°C por 20 minutos. Em paralelo, foi usado um controle de pico onde 5 μL do padrão de pico (2x109 de DNA de filamento único de pAAV-GFP) foi adicionado à reação. Estas reações foram realizadas em faixas de 8 tubos de 0,2 mL sem tampas (Biorad, Catálogo No. TBS-0201), usando faixas de 8 tampas planas (BioRad, Catálogo No. TCS-0803), em um termo-ciclador BioRad PCR.
[00144] Uma mistura principal para a qPCR foi configurada, contendo 825 μL de água, 1,875 de μLiQ SYBR Green Supermix (BioRad, Catálogo No. 170-8882) e 337,5 μL de cada um dos primers (QPCR CMV 1 (SEQ ID NO: 5) e QPCR CMV 2 (SEQ ID NO: 6)). Um volume de 45 μL da mistura foi adicionado por cavidade em uma placa de PCR de 96 cavidades, e ou 5 μL do vetor digerido, vetor digerido de ponta (spike), vetor não digerido (5 μL de vetor purificado com 40 μL de água e 5 μL de tampão de DNase), vetor não digerido de ponta (5 μL de vetor purificado com 35 μL de água, 5 μL de tampão de DNase, e 5 μL de padrão de pico) foram adicionados e misturados. Um processo de PCR foi realizado e as amostras do ciclo 3 (Cycle 3) foram usadas para análise das curvas de fusão.
[00145] A concentração destes genomas de DNA de filamento único foi analisada por PCR quantitativo conforme descrito acima. A concentração das partículas do vetor rAAV-RdCVF1L foi determinada como sendo de 2x1011 cópias de genoma do vetor por mililitro (GC/mL) e a concentração das partículas do vetor rAAV-GFP foi determinada como sendo de 2x1011 GC/mL.
Tintura de prata de Vetor AAV Recombinante Purificado
[00146] De modo a examinar a pureza dos vetores rAAV-RdCVF1L e rAAV-GFP purificados, os lisados de vetores foram submetidos a SDS-PAGE com análise de tintura de prata. Especificamente, 20 μL de tampão de lise (8,4 mL de água, 500 μL de Tris a 1 M (pH 8,0), 1 mL de Glicerol, 300 μL de NaCl a 5 M, 50 μL de NP-40, 40 μL de EDTA, 100 μL de PMSF, 1 comprimido de inibidor de protease (Roche, Catálogo No. 11836170001)) foi adicionado a 20 μL do vetor AAV recombi- nante purificado respectivo e mantido sobre gelo por 20 minutos. A reação foi centrifugada por 2 minutos a 13.000 rpm e 4°C em uma centrífuga de bancada. O sobrenadante foi transferido para dentro de um novo tubo, 10 μL de 5x tampão de amostra redutor (Pierce, Catálogo No. 39000) foi adicionado e as amotras foram incubadas por 10 minutos a 95°C.
[00147] Foi realizada eletroforese de acordo com as instruções do fabricante. Um gel SDS-PAGE a 4 a 15% foi enxaguado com água e colocado dentro da câmara de gel. Tampão de operação (1X Tris / Gli- cin / SDS produzido diluindo tampão de operação de 10X Tris / Glicina / SDS (BioRad, Catálogo No. 161-0732) com água) foi adicionado a câmaras superior e inferior de tampão. As cavidades foram enxaguadas duas vezes com 200 μL de tampão de operação e as amostras foram carregadas. Como um controle, um volume de 1 μL de marcador (ladder) de proteína BENCHMARK™ (Invitrogen, Catálogo No. 10747012) foi adicionado às cavidades externas. Concentrações iguais dos vetores, conforme determinado por análise do título genômico, foram carregadas. O gel foi passado a 200 V até o corante ter atingido o fundo do gel. O gel foi fixado e corado com prata de acordo com as instruções do fabricante (Biorad Silver Stain Plus, Catálogo No. 1610449).
[00148] Somente as três proteínas do vírus AAV, VP1 (90 kDa), VP2 (72 kDa), e VP3 (60 kDa) foram visíveis (Figura 1). Como não são visíveis bandas de nenhuma outra proteína na análise do corante de prata, isto confirmaria que as preparações de vetor resultaram na produção de partículas de vetor altamente puras.
Expressão In Vitro de RdCVFIL Mediada por Transdução por Vetor AAV de Células ARPE-19
[00149] De modo a examinar a expressão e a secreção de RdCVF1L mediada pelo vetor rAAV-RdCVF1L, células de pigmento do epitélio retinal humano ARPE-19 (ATCC, Manassas, VA) foram semeadas a 200.000 células em 3 mL de cDMEM por cavidade em uma placa de 6 cavidades. Para a expressão de transgene depois de infecção por AAV, a etapa de limitação de tempo é a síntese do segundo filamento do genoma do DNA de filamento único, a qual pode levar várias semanas, por exemplo, vide Ferrari et al. (1996). J Virol. 70: 3227-3234. No entanto, pdoe ser usada radiação antes de transdução para agilizar a expressão de proteínas depois da transdução pelo vetor rAAV em cultura celular, por exemplo, vide Alexander et al. (1994) J Virol. 68: 8282-8287.
[00150] Vinte e quatro horas depois as células foram irradiadas com 175 Gy de 137Cs com um irradiador da Shepherd & Associates, Modelo: Mark I-68 Self-shielded. Duas horas depois o meio foi substituído com 1,5 mL de cDMEM fresco e 3 μL de vetor AAV recombinante purificado foi adicionado. Uma placa foi não transduzida (sem AAV) como um controle, uma placa foi transduzida com o vetor rAAV-GFP, e uma placa foi transduzida com o vetor rAAV-RdCVF1L.
[00151] Dois dias depois de transdução, os sobrenadantes das células transduzidas e não transduzidas foram colhidos e filtrados através de um filtro de 0,45 μm. Um volume igual de tampão de lisado (9,4 mL de água, 200 μL de Tris a 1 M (pH 8,0), 40 μL de EDTA a 0,5 M, 300 μL de NaCl a 5 M, 100 μL de NP-40, 100 μL de PMSF, 1 comprimido de inibidor de protease) foi adicionado, e armazenado a -80°C até a utilização. As células de cada placa foram lavadas com PBS, raspadas usando um levantador celular (cell lifter), reunidas e transferidas para dentor de tubos cônicos de 15 mL. As células foram centrifugadas por 4 minutos a 1.200 rpm e 4°C em uma centrífuga Beckman Coulter Allegra 6KR e o sobrenadante foi descartado. Os péletes celulares foram ressuspendidos em 1 mL de tampão de lise (vide acima), transferidos para dentro de tubos de 1,5 mL, e incubados sobre gelo por 10 minutos. Os lisados celulares foram centrifugados por 2 minutos a 13.000 rpm e 4°C em uma centrífuga de bancada. Os lisados celulares clareados foram divididos em alíquotas em volumes de 200 μL dentro de tubos de 1,5 mL e armazenados a -80°C até a utilização.
Análise Western Blot de Sobrenadantes Celulares Transduzidos e Li- sados Celulares para Expressão de RdCVFIL
[00152] Análise Western blot usando um gel SDS-PAGE a 4 a 20% foi usada para detectar a expressão de RdCVF1L usando técnicas de rotina. Como um controle, um volume de 5 μL de padrão MAGICMARK™ XP Standard (Invitrogen, Catálogo No. LC5602) foi adici- onado às cavidades externas. O gel foi passado a 200 V até o corante ter atingido o fundo do gel. A análise Western blot foi realizada com um kit de análise Western blot Vectastain ABC-Amp da Vector Laboratories, de acordo com uma versão modificada das instruções do fabricante. O SDS-PAGE foi equilibrado em tampão de transferência por 20 minutos e as proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando uma Trans Blot Semi-Dry Transfer Cell a 20 V por 40 minutos. Assim que a transferência foi completada, a membrana foi bloqueada em 200 mL de 1X solução de caseína com suave agitação sobre uma plataforma osciladora por no mínimo duas horas em temperatura ambiente (RT) para o sobrenadante e 4°C de um dia para o outro mais 1 hora em temperatura ambiente para o lisado celular. A membrana foi incubada com 50 mL com anticorpo monoclonal anti-proteína RdCVF específico de coelho (anticorpo primário, produzido pela Covance (Denver, PA) usando proteína RdCVF1L com etiqueta de histidina (His-Tag) purifi-cada produzida em E. coli (Protein One, Rockville, MD)) diluída a 1:2.000 (sobrenadante) ou 1:10.000 (lisado celular) em 1X solução de caseína com suave agitação a 4°C de um dia para o outro ou 2 horas em temperatura ambiente, respectivamente. A membrana foi lavada com 30 mL de uma 1X solução de caseína 4 vezes por 5 minutos cada em temperatura ambiente com suave agitação. A membrana foi incubada com 30 mL de IgG anti-coelho de cabra biotinilada (anticorpo secundário) diluída a 1:24.000 em 1X solução de caseína por 1 hora em temperatura ambiente com suave agitação. A membrana foi lavada em 30 mL de 1X solução de caseína 3 vezes por 5 minutos cada em temperatura ambiente com suave agitação. A membrana foi incubada por 45 minutos em Vectastain ABC-AmP em 50 mL de 1X caseína contendo 100 μL de Reagent A e 100 μL de Reagente B. A membrana foi lavada em 30 mL de 1X solução de caseína 3 vezes por 5 minutos cada em temperatura ambiente com suave agitação.
[00153] A membrana foi incubada em Tris, pH 9,5. O sinal quimiluminescente foi adquirido usando 6 mL de Duolox Substrate (Vetor Laboratories, Catálogo No. SK 6605) e expondo a membrana ao filme Kodak BioMax MS X-ray (Kodak Carestream Health, Catálogo No. 8572786) em um cassete de filme por 10 segundos até 5 minutos seguido por desenvolvimento do filme usando a solução Kodak Developer (Kodak GBX, Catálogo No. 1900984) e a solução Kodak Fixer.
[00154] O nivel de proteína RdCVF1L expressada no lisado celular (Figura 2A) indicou que o vetor rAAV-RdCVF1L transduziu células ARPE de modo eficaz. De modo mais importante, a proteína RdCVF1L foi secretada de modo eficaz no meio de cultura celular das células transduzidas por vetor (Figura 2B). No entanto, duas bandas positivas para proteína RdCVF1L com o peso molecular esperado foram observadas nas amostras de lisado celular transduzido pelo vetor rAAV- RdCVF1L (Figura 2A, alameda 3), e três destas bandas foram detectadas nas amostras de sobrenadante celular (Figura 2B, alameda 3). Sem desejar ser limitado pela teoria, as duas bandas de menores peso molecular no sobrenadante celular (Figura 2B, alameda 3) que têm os mesmos pesos moleculares que as bandas no lisado celular podem ter sido liberadas por algumas células mortas na cultura. A terceira banda com peso molecular ligeiramente maior no sobrenadante provavelmente representou uma forma secretada de RdCVF1L a qual estava ausente do lisado celular. Os dados também sugeriram que as três formas de RdCVF1L, incluindo a forma secretada de RdCVF1L, foram provavelmente modificadas pós-translacionalmente.
Sumário
[00155] O vetor RdCVF1L AAV foi capaz de transduzir de modo eficaz células de pigmento do epitélio retinal humano (ARPE-19), levan- do à expressão e à secreção da proteína RdCVF longa conforme detectada por Western Blot. Duas bandas de proteínas RdCVFL distintas foram observadas nas amostras de lisado celular transduzido pelo vetor rAAV-RdCVF1L além de uma banda maior. Três bandas de proteína RdCVFL foram detectadas no sobrenadante das células transduzi- das pelo vetor. Duas das mesmas que têm os mesmos pesos moleculares que os vistos no lisado celular foram possivelmente de células mostras na cultura celular. A terceira banda com peso molecular ligeiramente maior provavelmente representou a forma secretada de RdCVF1L. Estes dados também sugeriram que RdCVF1L, incluindo a forma secretada de RdCVF1L, foi provavelmente modificada pós- translacionalmente.
Exemplo 3 - Expressão In Vivo de RdCVFI e GFP pelo Vetor AAV nos Olhos de Camundongos
[00156] O propósito deste estudo foi determinar se a administração sub-retiniana de rAAV-RdCVF1L pode aumentar os níveis d eRdCVF na retina do olho do camundongo. Vetor rAAV-RdCVF1L sorotipo de AAV 2 recombinante e vetor rAAV-GFP de controle foram preparados conforme descrito no Exemplo 2.
[00157] Camundongos fêmeas BALB/C, de 5 a 6 semanas de idade, foram adquiridos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e usados neste estudo. Os animais foram deixados por um período de aclimatação mínimo de 1 semana antes de utilização para o estudo. Os animais foram alojados sob um ciclo de 12 horas de luz a escuridão com uma intensidade da luz de <50 lux nas gaiolas. Alimento e água estavam disponíveis à vontade. O esquema experimental é delineado na Tabela 1: Tabela 1: Esquema Experimental
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[00158] Injeções sub-retinais foram realizadas sob anestesia. Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de 25 a 30 μg/grama de quetamina combinada com 5 a 6 Dg/grama de xilazi- na. As doses anestésicas foram ajustadas para atingir um plano de anestesia profundo. Os olhos foram tratados com uma aplicação tópica de 0,5% de hidrocloreto de proparacaína (Bausch & Lomb Inc. Rochester, NY) para anestesia local e 0,3% de AK-Tob (Bausch & Lomb Inc.) para desinfecção imediatamente antes dos procedimentos. As pupilas foram dilatadas com 1% de tropicamida (Akorn, Inc., Buffalo Grove, IL).
[00159] Em resumo, o camundongo anestesiado foi posicionado sob um microscópio operacional Zeiss com o olho a ser injetado sob visão (ampliação de aproximadamente 10X). Foi aplicada suave pressão sobre as pálpebras com uma pinça de joalheiro de modo a provocar o prolapso para a frente do globo inteiro. A conjuntiva temporal superior foi cuidadosamente dissecada de modo a expor a esclera. Uma agulha calibre 30 foi usada para realizar uma punção de separação da esclera, da coroide e da retina em aproximadamente 11 horas (olho direito) e 1 hora (olho esquerdo) 0,5 mm posterior ao limbo. Uma gota de Gonak (2,5%, Akorn, Inc) foi instilada sobre a córnea e uma sobre- lâmina foi delicadamente colocada sobre a superfície da córnea de modo a auxiliar na visualização do fundo de olho. Uma agulha cega calibre 33 anexada a uma seringa Hamilton de 5 DL foi inserida atra-vés da esclerotomia em uma direção tangential em direção ao polo posterior sem tocar a lente e a ponta da agulha foi colocada sobre a superfície interna da retina. A retina foi perfurada e 1 μL de vetor foi injetado dentro do espaço sub-retiniana. Depois da injeção, a agulha foi cuidadosamente retirada e a conjuntiva foi reposicionada. O sucesso de cada injeção foi confirmado por avaliação do fundo de olho para sinais de descolamento da retina. Quaisquer olhos que apresentaram hemorragias sub-retinais ou intravitreais foram excluídos, bem como olhos que não apresentaram um deslocamento da retina (ou bolha). Foi aplicada pomada oftálmica de neomicina e sulfato de polimicina B e Bacitracina Zinco (Bausch & Lomb Inc.) à córnea de modo a minimizar a secagem deste tecido enquanto os animais estavam se recuperando da anestesia sobre uma manta aquecida.
Análise Western Blot
[00160] Western blots foram gerados com extratos de proteína dos olhos injetados com o vetor rAAV-RdCVF1L e dos olhos de controle não injetados contra laterais obtidos seis semanas depois da administração do vetor rAAV-RdCVF1L. Em resumo, globos oculares foram enucleados e foram removidos os tecidos extra-oculares e o segmento anterior. Os segmentos posteriores remanescentes foram rapidamente congelados com nitrogênio líquido. Estas amostras foram armazenadas a -80oC até serem usadas para extração de proteína. Para cada copo ocular, foram adicionados 200 μL de reagente de extração de proteína tecidual T-PER gelado (Pierce, Cat. No. 78510) com coquetel inibidor de protease (Protease Inhibitor Cocktail da Roche Diagnostics, Cat. No. 11836170001). As amostras foram sonicadas 5 segundos sobre gelo com um desmembrador Sonic (Fisher Scientific Model 100, Pittsburgh, PA). As amostras sonicadas foram mantidas sobre gelo por 15 minutos e centrifugadas a 10.000 g por 5 minutos a 4oC para remover os debris celulares. Os sobrenadantes foram coletados e as concentrações de proteína foram determinadas usando um teste de proteína Bradford. Para controles de RdCVFL, lisado de células ARPE-19 transduzidas com rAAV-RdCVF1L serviu como o controle positivo e lisado de células não transduzidas como o controle negativo. As prote- ínas foram separadas por eletroforese por gel. Para cada alameda, 36 μg de proteína total foram carregados sobre um gel a 4 a 20% Criterion™ TGX™ Precast Gel (Bio-Rad, Cat. No. 567-1094) e submetidas a eletroforeses a 200 volts por 70 minutos. As proteínas foram eletro- transferidas (N. do T.: em inglês electroblotted) sobre 0,2 μm de membranas de "borramento" (N. do T.: em inglês blotting) de nitrocelulose usando uma célula de transferência Trans Blot Semi-Dry Transfer Cell. Os blots foram bloqueados usando uma 1X solução de caseína (Vetor Laboratories, Cat. No. SP-5020) por 2 horas em temperatura ambiente e incubados com o anticorpo primário anti-RdCVFL de coelho (Covance Research Products, Denver, PA) diluído a 1:2.000 ou anticorpo po- liclonal vermelho /verde antiopsina de coelho (Millipore, Temecura, CA) diluído a 1:500. Depois de três lavagens com 1X solução de caseína cada blot (blot) foi incubado com anticorpo de IgG anticoelho de cabra com fosfatase alcalina (Vetor Laboratories, Cat. No. AP-1000) diluído a 1:3.000. As bandas de proteína foram visualizadas usando um kit de detecção de substrato quimiluminescente. Beta-tubulina (50 kD) foi usada para controle de igual carga de proteína. O blot foi stripped com tampão Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific, Cat. No. 46430) e re-sondado com um anticorpo monoclonal anti-β- tubulina (Sigma-Aldrich, Cat. No. T4026) diluído a 1:500 seguido por um anticorpo de IgG anti-camundongo de cavalo conjugado a fosfa- tase alcalina (Vetor Laboratories, Cat. No. AP-2000) diluído a 1:3.000 em 1X solução de caseína.
[00161] Densitometria de proteínas das autoradiografias, realizada com uma estação de imageamento da Kodak (Kodak Imaging Station), foi usada para quantificar as bandas de proteína escaneadas, as quais foram normalizadas com respeito ao nível de beta-tubulina no mesmo blot.
[00162] A presença de proteína RdCVF1L foi claramente detectada nos olhos que receberam injeção de rAAV-RdCVF1L como bandas imunorreativas duplas proeminentes com um tamanho molecular de aproximadamente 30 kDa (Fig. 3). Western blot de lisados celulares de células ARPE-19 transduzidas por rAAV-RdCVF1L, os quais serviram como um controle positivo, também produziram 2 bandas de proteínas individuais com tamanhos idênticos. Nem extratos de proteínas dos olhos contra laterais, os quais não receberam injeção sub-retiniana, nem os olhos injetados com rAAV-GFP, produziram bandas de proteínas similares detectadas por anticorpo anti-RdCVFL (Fig. 3). As bandas imunorreativas duplas foram similares às bandas duplas observadas in vitro em células ARPE-19 transduzida por rAAV-RdCVF1L. A razão para a ausência da terceira banda (provavelmente a forma se- cretada de RdCVF1L) foi que estas amostras in vivo foram extratos de proteínas de células retinais.
Análise Imuno-histoquímica
[00163] Imunotintura de RdCVF1L foi realizada na preparação de montagens inteiras da neuroretina e RPE-coroide-esclera. Os animais foram anestesiados terminalmente e os olhos foram enucleados e imediatamente fixados em 4% de paraformaldeído em salina tampo- nada com fosfato (PBS) 7,4 (1X), líquida (Gibco, Cat. No. 10010-031) de um dia para o outro a 4oC. Cada olho dos camundongos foi marcado no quadrante inferior da córnea com tinta da Índia antes de enucle- ação. Os copos oculares foram preparados removendo o segmento anterior sob um microscópio de dissecção Leica. Foi feita uma pequena incisão no quadrante inferior para orientação. A neuroretina foi cuidadosamente dissecada do RPE, decepada no nervo ótico. As montagens inteiras foram enxaguadas três vezes com 1X PBS, e bloqueadas com 5% de soro de burro em 2% de Triton X-100 em PBS por 2 horas em temperatura ambiente. Depois de remoção da solução de bloqueio, as montagens inteiras foram sequencialmente incubadas com o anti- corpo primário de coelho anti-RdCVF, a 1:1.000 em solução de bloqueio a 4oC de um dia para o outro e anticorpo secundário -ALEXA FLUOR® 488 de burro anti-coelho a 1:1.000 em 2% de Triton X-100 em PBS, 2 horas em temperatura ambiente. Depois de enxágues finais com PBS, foi realizada montagem plana de cada montagem inteira sobre uma lâmina de vidro com os fotorreceptores voltados para cima para a neuroretina e RPE voltados para cima para a RPE-coroide- esclera. As montagens planas foram em seguida examinadas com um microscópio Olympus BX51 equipado com câmera digital (Spot RT Color 2.2.1, Diagnostic Instruments, Inc) e epifluorescência.
[00164] Imunohistoquímica confirmou a aumentada expressão de proteína RdCVF1L nos olhos injetados com vetor rAAV-RdCVF1L. Robusta imunocoloração de RdCVF1L foi observada nas células de RPE nos olhos injetados com rAAV-RdCVF (Fig. 4A), mas não nos nos olhos contralaterais não injetados (Fig. 4). Foi vista aumentada expressão de RdCVF1L somente na área focal, cobrindo aproximadamente um quadrante de cada olho, indicando que a expressão somente foi confinada à área de bolha de injeção sub-retiniana. Amostras coradas sem anticorpo primário não apresentaram qualquer imunorreati- vidade (Fig. 4C). Um aumento acentuado na expressão desta proteína também foi observada nas células de fotorreceptores (Fig. 5A) nos olhos injetados com rAAV-RdCVF1L. Foi vista forte coloração de RdCVF1L nos segmentos externos dos fotorreceptores na neuroretina em que foi realizada montagem plana. Novamente, a tintura positiva foi localizada somente em uma área focal da retina, cobrindo de 10 a 30% da retina. Somente houve tintura de fundo nos olhos contra laterais não injetados (Fig. 5B). Não foi vista imunorreatividade nas amostras processadas sem anticorpo primário (Fig. 5C). Expressão de GFP nos Olhos de Camundongos
[00165] De modo a determinar se os vetores AAV testados podem transduzir de modo eficaz células RPE e de fotorreceptores nos olhos de camundongos, um grupo de camundongos (n = 7) foram injetados sub-retinianamente com rAAV-GFP e sacrificados 6 semanas depois. RPE-coroide-esclera e neuroretina foram separadas e foram realizadas montagens planas sobre lâminas de vidro. Microscopia fluorescente revelou robusta expressão de GFP na camada de RPE e de fotorre- ceptores (dados não mostrados). As células RPE expressando GFP se propagam a 1 a 2 quadrantes da montagem plana, com o número máximo fe células expressando GFP mais robustas presentes no sítio de injeção. Células RPE transduzidas pareceram saudáveis uma vez que mantiveram sua morfologia hexagonal. Nas neuroretinas em que foram realizadas montagens planas, foi identificada a expressão de GFP nos segmentos externos de fotorreceptores. Occasionalmente células retinais internas, tais como células ganglionares, foram positivas para GFP, possivelmente devido a vazamento de vetor para dentro do vítreo depois de injeção sub-retiniana.
Sumário
[00166] Este estudo demonstrou transdução eficiente de células RPE e de fotorreceptores pelo vetor rAAV-RdCVF1L depois de injeção sub-retiniana com sucesso. O constructo de expressão RdCVF1L liberado por este vetor levou a significativos aumentos nos níveis de proteína RdCVF1L nos olhos dos camundongos. Exemplo 4 - Efeito da Expressão de RdCVF de Forma Longa Mediada por Vetor viral Adeno-Associado Sobre a Sobrevida de Fotorrecepto- res nos Olhos de Camundongos rd10
[00167] O propósito deste estudo foi determinar se a administração sub-retiniana de um vetor de terapia genética à base de AAV codificando RdCVF1L pode estimular a sobrevida dos fotorreceptores em camundongos rd10, um modelo animal que ocorre naturalmente para degeneração retinal hereditária humana. Camundongos Rd10 são um modelo animal que ocorre naturalmente para retinite pigmentosa (RP) recessiva autossômica. Os camundongos Rd10 têm uma mutação de ponto missense no gene de fosfodiesterase cGMP dos bastonetes, resultando em apoptose de células de fotorreceptores (Chang et al. (2007) Vision Res 47: 624-633). Bastonetes fotorreceptores começam a degenerar em 18 dias de idade, com pico de morte dos fotorrecepto- res ocorrendo em P25 (Gargini et al. (2007) J Comp Neurol 500: 222238). Por volta de cinco semanas a maioria das células de fotorrecep- tores degeneraram (Chang et al. (2002) Vision Res 42: 517-525; Chang et al. (2007) Vision Res 47: 624-633; Gargini et al. (2007) J Comp Neurol 500: 222-238). De modo interessante, foi visto que a criação de camundongos rd10 no escuro retarda a degeneração dos fo- torreceptoresd por tanto quanto quatro semanas (Chang et al.(2007) Vision Res 47: 624-633), sugerindo que a exposição à luz pode acelerar a morte dos fotorreceptores. Por outro lado, delayed photoreceptor degeneração de fotorreceptores retardada mantendo estes camundongos no escuro pode prolongar a janela de tempo terapêutica para vetores que necessitam de tempo para expressão transgênica terapêutica, por exemplo, expressão transgênica adequada de um AAV geralmente vai tomar cerca de 3 semanas.
[00168] Casais reprodutores de cepa consanguínea congênica de camundongos rd10, de 4 a 5 semanas de idade, foram adquiridos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e reproduzidos em um bioté- rio. Os animais foram alojados sob um ciclo de 12 horas de luz - escuridão com uma intensidade da luz de < 50 lux nas gaiolas. Alimento e água estavam disponíveis à vontade. Depois da cirurgia, conforme descrito abaixo, os filhotes com suas mães foram mantidos no escuro até serem desmamados na idade de 3 semanas. Em seguida todos os animais foram transferidos de volta para o ambiente anterior com ciclo de 12 horas de luz - escuridão. O esquema experimental é a Tabela 2. Tabela 2: Esquema Experimental
Figure img0003
[00169] Os animais (na idade do dia 3 pós-natal) foram anestesiados por hipotermia. Este método anestésico foi bem estabelecido para camundongos neonatais e ratos para até 5 dias de idade e é apropriado para procedimentos cirúrgicos pequenos e secundários (5 a 15 minutos) nestes animais (Gaertner et al. Anesthesia and Analgesia 2nd ed. pp. 277-278). O filhote foi colocado sobre gelo moído por 3 a 4 minutos. Durante este tempo a cor do filhote foi modificada de rosa para pálido. As injeções sub-retinais foram realizadas sob este tipo de anestesia.
[00170] O camundongo anestesiado foi posicionado sob um Microscópio operacional Zeiss com o olho a ser injetado sob visão (ampliação de aproximadamente 10X). As pálpebras e a área adjacente foram desinfectadas com 5% de iodo povidona. O olho foi exposto por separação da fissura palpebral usando uma tesousa Iris. Foi aplicada suave pressão sobre as pálpebras com uma pinça de joalheiro de modo a provocar o prolapso para a frente do globo inteiro. Uma gota de 0,3% de Tobromicina (Bausch & Lomb Inc.) foi administrara para desinfecção. Uma agulha penetrante calibre 30 foi usada para realizar uma punção de separação da esclera, da coroide e da retina na posição de aproximadamente 11 horas (olho direito) cerca de 0,5 mm posterior ao limbo. Uma agulha cega calibre 33 anexada a uma seringa Hamilton de 5 DL foi inserida através da esclerotomia em uma direção tangential em direção ao polo posterior. A ponta da agulha foi colocada no espaço sub-retiniana, e 1 μL de vetor AAV foi injetado dentro do espaço sub-retiniana. Depois da injeção, a agulha foi lentamente reti- rada. Quaisquer olhos que apresentaram hemorragias sub-retinais ou intravitreais foram excluídos do estudo. Foi aplicada pomada oftálmica de neomicina e sulfato de polimicina B e Bacitracina Zinco (Bausch & Lomb Inc.) à córnea de modo a prevenir infecção e a minimizar a secagem deste tecido. Os animais foram deixados para recuperar sobre uma almofada térmica quente.
Histologia Retinal
[00171] Os camundongos foram profundamente anestesiados e seus olhos foram marcados no quadrante superior com corante de tecido vermelho para orientação. Em seguida foram sacrificados e imediatamente enucleados e fixados em fixador de Davidson por cerca de 24 horas em temperatura ambiente. Depois de desidratação sequencial em etanol e Clear-rite, os olhos foram embutidos em parafina (Fisher Sci., Houston, TX). Seções da retina de 5 μm de espessura foram cortadas ao longo do meridiano vertical para possibilitar o exame da retina superior e inferior. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina e examinadas sob um microscópio ótico (Olympus BX51). A espessura da camada nuclear externa (ONL) foi avaliada contando o número de linhas de núcleos na retina central e periférica. A morfologia dos fotorreceptores também foi examinada.
[00172] Os olhos dos camundongos rd10 tratados foram avaliados para o grau de recuperação estrutural na idade de 5 semanas. Micros- copia ótica mostrou óbvia preservação da camada nuclear externa (ONL) nos olhos tratados com AAV-RdCVF1L em comparação com os olhos contralaterais não tratados. Tipicamente, a retina tratada com o vetor RdCVF1L possuia 2 a 5 linhas de núcleos de fotorreceptores nas regiões superior e/ou inferior em oposição a 1 a 2 linhas nos olhos contralaterais não tratados nas mesmas localizações (Fig. 7). A recuperação não foi limitada à área injetada, o quadrante superior, uma vez que também foi observada proteção no quadrante inferior. Análise morfométrica mostrou que aproximadamente 75% da retina foram pro-tegidos nos olhos tratados com vetor em comparação com 34% nos olhos não tratados. Alguns fotorreceptores preservados possuíam mesmo segmentos interno e externo (Fig. 7E). É digno de nota que os fotorreceptores recuperados continham tanto bastonetes quanto células cone.
Tintura e Contagem de Cones Fotorreceptores
[00173] Aglutinina de amendoim (PNA), um marcador específico de células cone, foi usada para corar a preparação de montagens inteiras da retina. Os olhos dos camundongos foram marcados no quadrante superior da córnea com tinta da Índia e corante vermelho no quadrante temporal antes de enucleação. Foram imediatamente fixados em 4% de paraformaldeído no mínimo de um dia para o outro a 4oC. Os copos oculares foram preparados removendo o segmento anterior sob um microscópio de dissecção Leica. Foi feita uma pequena incisão no quadrante superior para orientação. Depois de 4 cortes radiais em torno da circunferência, a neuroretina inteira foi cuidadosamente dissecada do copo ocular. As retinas foram enxaguadas três vezes com 1X PBS, e bloqueadas com 6% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS (Gibco, Cat. No. 10010-031) com 0,2% de Triton-X 100 por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois de remoção da solução de bloqueio, as retinas foram incubadas com Lectin PNA Conjugates Alexa Fluor 594 (1:250 em PBS, Invitrogen Corp, Chicago, IL) de um dia para o outro a 4oC. Depois de enxágues finais com PBS, foi realizada montagem plana de cada retina sobre uma lâmina de vidro com os fotorre- ceptores voltados para cima. As montagens inteiras retinais foram em seguida examinadas com um microscópio Olympus BX51 equipado com câmera digital (Spot RT Color 2.2.1, Diagnostic Instruments, Inc) e epifluorescência.
[00174] De modo a avaliar a densidade de células cone nas monta- gens inteiras retinais, foram feitas duas imagens com objetiva 60X de cada quadrante retinal em localização a 1 e 2 mm da borda da cabeça do nervo ótico, respectivamente. O número de cones apresentados em cada imagem (390 x 293μm) foi contado com o software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Inc. Bethesda, MD).
[00175] Para alguns olhos, seções de criostato retinal (12 μm de espessura) foram cortadas com um micrótomo de criostato Leica (Leica Microsystems, Model CM 1850, Leica, Bannockburn, IL), coradas com PNA e examinadas com o microscópio fluorescente supracitado.
[00176] Células cone fotorreceptoras foram identificadas por marcação com PNA, a qual cora seletivamente segmentos de cone internos e externos, em neuroretina em que foi realizada montagem plana. Microscopia fluorescente mostrou grave degeneração de células cone nos olhos não tratados, particularmente na retina central posterior, por exemplo, em torno da cabeça do nervo ótico. As células cone perderam segmentos externos, e seus segmentos internos são curtos, atenuados e irregulares. Em contraste, os olhos tratados com vetor tiveram maior densidade de cone, segmentos de cone muito menos desorganizado, e coloração de cone mais uniformes (dados não mostrados). Sob maior ampliação, células cone PNA-positivas foram contadas em todos os 4 quadrantes em localizações a 1 e 2 mm da cabeça do nervo ótico. Quantificação da densidade de cone mostrou números significativamente elevados de células cone fotorreceptoras nos olhos tratados com vetor em relação aos olhos contralaterais não tratados: 181+/-46,4 versus 50+/-25,2 cones/0,114 mm2, p=0,001.
Imuno-histoquímica de RdCVF
[00177] Foi realizada imunocoloração de RdCVF na preparação de montagem inteira da neuroretina e RPE-coroide-esclera. As montagens inteiras foram enxaguadas três vezes com 1X PBS, e bloqueados com 5% de soro de burro e 2% de Triton X-100 em PBS por 2 horas em temperatura ambiente. Depois de remover a solução de bloqueio, as montagens inteiras foram sequencialmente incubadas com o anticorpo primário de coelho anti-RdCVF a 1:1.000 em solução de bloqueio a 4oC de um dia para o outro e anticorpo secundário Alexa Fluor® 488 de burro anti-coelho a 1:1.000 e 2% de Triton X-100 em PBS, 2 horas em temperatura ambiente. Depois de enxágues finais com PBS, foi realizada montagem plana de cada montagem inteira sobre uma lâmina de vidro com os fotorreceptores voltados para cima para a neuroretina e RPE voltado para cima para a RPE-coroide-esclera. As montagens planas foram em seguida examinadas com um microscópio Olympus BX51 equipado com uma câm digital era (Spot RT Color 2.2.1, Diagnostic Instruments, Inc) e epifluorescência.
[00178] Robusta imunorreatividade de RdCVF foi observada nas células RPE em 5 de 6 olhos injetados com rAAV-RdCVF1L (um exemplo representativo de um olho é visto na (Fig. 6A), mas não dos olhos contralaterais não injetados (Fig. 6B). Um olho que recebeu injeção de rAAV-RdCVF1L foi excluído da análise devido a microftamia. Foi vista expressão eficiente de RdCVF1L na área focal, se espalhando para aproximadamente 1,5 a 3 quadrantes de cada olho. Células RPE expressando RdCVF1L mantiveram morfologia hexagonal típica (Fig. 6E), sugerindo que não houve nenhum impacto negativo óbvio sobre o RPE a partir da administração do vetor ou da expressão de RdCVF1L. De modo similar à expressão em RPE de RdCVF1L, eficiente expressão na imunorreatividade desta proteína também foi observada na neuroretina nos olhos injetados com rAAV-RdCVF1L (Fig. 6C). Não houve coloração nos olhos contralaterais não injetados (Fig. 6D). Foi claramente vista forte coloração de RdCVF1L nas células de fotorreceptores em 3 de 5 olhos, particularmente nos segmentos internos / externos (Fig. 6F). A falta de imunorreatividade de RdCVF nos outros 2 olhos pode ser atribuída à degeneração dos fotorreceptores. Novamente, a coloração positiva foi localizada somente em uma área focal da retina. A observação de nenhuma expressão detectável de RdCVF1L nos olhos contralaterais não injetados sugere que o nível de RdCVF1L endógeno pode ser menor do que o limite de detecção por coloração imunohistoquímica.
Sumário
[00179] Este estudo demonstrou que injeção sub-retiniana dos vetores rAAV-RdCVF1L levou a eficiente transdução das células RPE e células de fotorreceptores e robusta expressão de proteína RdCVF1L nos olhos de camundongos rd10. De modo mais importante, este vetor prolongou tanto a sobrevida de bastonetes quanto de células cone de fotorreceptores e melhorou a morfologia do cone neste modelo animal clinicamente relevante de retinite pigmentosa (RP). Exemplo 5 - Injeção sub-retiniana de rAAV-RdCVF1L preservou células de fotorreceptores distantes do sítio de injeção em camundongos rd10
[00180] De modo a examinar se a recuperação de células de fotor- receptores por rAAV-RdCVF1L pode se estender para as áreas distantes do sítio de injeção, rAAV-RdCVF1L (1 DL, 2x108 GC) foi injetado sub-retinianamente dentro do quadrante superior dos olhos direitos de camundongos rd10 no dia 3 pós-natal, com os olhos contralaterais não injetados como controles. Os camundongos foram sacrificados com 5 semanas de idade. Foi examinada a histologia retinal do copo ocular inteiro. A Figura 8 mostra uma fotomicrografia ótica de um copo ocular de um camundongo rd10 de 5 semanas de idade representativo que recebeu uma injeção sub-retiniana de rAAV-RdCVF1L em um olho (Painel A, Figura 8) e nenhum tratamento no olho contralateral (Painel B, Figura 8). Notar a diferença na espessura da ONL entre o olho tratado e o olho não tratado. Foi claramente vista preservação de fotorre- ceptores seen em toda a retina do olho tratado com rAAV-RdCVF1L (Painel A, Figura 8). O sítio de injeção na retina superior foi marcado. Em contraste, a maior parte das células de fotorreceptores foi perdida com a exceção da retina periférica inferior no olho contralateral não tratado (Painel B, Figura 8). Exemplo 6- Injeção sub-retiniana de rAAV-RdCVF1L preservou basto- netes fotorreceptores
[00181] De modo a examinar se os bastonetes fotorreceptores podem ser recuperados (além de células cone fotorreceptoras) por rAAV- RdCVF1L, os olhos direitos de camundongo rd10 no dia pós-natal 3 foram injetados sub-retinianamente com rAAV-RdCVF1L (1 DL, 2x108 GC), com os olhos contralaterais não injetados como controles. Os camundongos foram sacrificados com 5 semanas de idade. O tecido retinal foi submetido à coloração imuno-histoquímica com rodopsina. As seções foram contracoradas com DAPI (diamidino-2-fenilindol, cor azul) para auxiliar na identificação das camadas retinais.
[00182] Robusta expressão de rodopsina foi observada tanao na camada de segmento quanto na camada nuclear de células fotorre- ceptoras no olho tratado com rAAV-RdCVF1L (dados não mostrados). No entanto, somente umas poucas células apresentaram coloração por rodopsina no olho não tratado (dados não mostrados). Exemplo 7 - Recuperação funcional de fotorreceptores por RdCVFL mediada por vetores virais adeno-associados em camundongos Rd10
[00183] O propósito deste estudo foi avaliar o efeito protetor de RdCVF liberada pelo vetor AAV sobre a função e a estrutura retinais nos camundongos rd10. Camundongos rd10 neonatados, com 3 ou 4 dias de idade, foram injetados sub-retinianamente com vetor rAAV- RdCVFL em um olho enquanto o olho contralateral foi deixado não tratado. Cinco semanas depois da injeção sub-retiniana os camundongos foram testados com eletrorretinograma (ERG) para avaliar as funções retinais. Depois dos ERGs, os camundongos foram sacrificados, e seus olhos foram processados para avaliação histológica da retina.
[00184] Vetor rAAV-RdCVF1L sorotipo de AAV 2 recombinante e vetor rAAV-GFP de controle foram preparados conforme descrito no Exemplo 2.
[00185] Casais reprodutores de cepa consanguínea congênita de camundongos rd10, de 4 a 5 semanas de idade, foram adquiridos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e reproduzidos em nosso biotério. Os animais foram alojados sob um ciclo de 12 horas de luz - escuridão com uma intensidade da luz de < 50 lux nas gaiolas. Alimento e água estavam disponíveis à vontade. Depois da cirurgia, os filhotes com suas mães foram mantidos no escuro até serem desmamados na idade de 3 semanas. Em seguida todos os animais foram transferidos de volta para o ambiente anterior com ciclo de 12 horas de luz - escuridão. O esquema experimental é resumido na Tabela 3. Tabela 3
Figure img0004
[00186] Os animais foram anestesiados e foi realizada injeção sub- retiniana conforme descrito acima no Exemplo 4.
[00187] Os camundongos foram adaptados à escuridão de um dia para o outro (no mínimo 14 horas) antes dos experimentos e suas pupilas foram dilatadas com gotas oculares de tropicamida (Alkorn) a 0,5%. Foi induzida anestesia por injeção intraperitoneal de quetamina e xilazina. Eletrodos de agulha de prata serviram como referência (fronte) e terra (cauda) e eletrodos de anel de DTL como eletrodos ativos. Gonesol foi aplicado de modo a assegurar bom contato elétrico e a manter o olho hidratado durante todo o procedimento. A configuração de registro se caracterizou por uma bacia de Ganzfeld, um amplifi- cador de DC, e uma unidade de controle computacional e registro do sistema de eletrorretinografia Espion E3 (Diagnosys LLC, Lowell, MA). Foram registrados ERGs de ambos os olhos simultaneamente depois dos camundongos terem sido colocados na bacia de Ganzfeld. Foram obtidos registros de flash único e de cintilação tanto sob condições de adaptação à escuridão (escotópicas) quanto de adaptação à luz (fotó- picas). Estímulos de flash único foram apresentados com intensidades crescentes, atingindo a partir de 10-2 a 25 cds/m2. Cinco respostas foram ponderadas com um intervalo inter-estímulos de 5 ou 17 segundos. Estímulos de cintilação tiveram uma intensidade de 3 cds/m2 com frequências de 2, 5, 10, 15, e 30 Hz. A adaptação à luz foi realizada com uma iluminação de fundo de 30 cds/m2 apresentada por 10 minutos de modo a atingir um nível estável das respostas fotópicas. Para comparação das amplitudes médias, foi usado t-teste pareado de Student.
[00188] Os camundongos foram profundamente anestesiados e seus olhos foram marcados no quadrante superior com corante teci- dual vermelho para orientação. Em seguida, foram sacrificados e ime-diatamente enucleados e fixados em fixador de Davidson por cerca de 24 horas em temperatura ambiente. Depois de desidratação sequencial em etanol e Clear-rite, os olhos foram embutidos em parafina (Fisher Sci., Houston, TX). Seções retinais de 5 μm de espessura foram cortadas ao longo do meridiano vertical de modo a permitir o exame da retina superior e inferior. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina e examinadas sob um microscópio ótico (Olympus BX51). A espessura da camada nuclear externa (ONL) foi avaliada contando o número de linhas de núcleos na retina central e periférica. Também foi examinada a morfologia dos fotorreceptores.
Resultados Recuperação da função retinal em olhos tratados com rAAV-RdCVF1L
[00189] Conforme esperado, na idade de 5 semanas, os camundongos rd10 apresentaram uma redução significativa das respostas escotópicas e fotópicas nos registros do ERG em comparação com os camundongos selvagens C57BL/6 com idades combinando (dados não mostrados). No entanto, nos camundongos rd 10 (n=8) os olhos tratados com rAAV-RdCVF1L apresentaram um aumento de cerca de 3 vezes nas amplitudes de ondas b (33,6 ± 14 μV) em comparação com os olhos de pares não tratados (11,5 ± 8,4 μV) sob a intensidade de flash de 25 cd no fundo escotópico (Figuras 10A e 10B). Sob esta condição, foram registradas respostas tanto de bastonetes quanto de células cone. Análises estatísticas indicam diferenças significativas nas amplitudes do ERG entre os olhos tratados com rAAV-RdCVF1L e os olhos de controle (p = 0,025). Alguns animais (n = 5) foram excluídos do experimento de ERG (excluídos antes do experimento de ERG) devido à opacidade corneal, catarata ou microftalmia provavelmente resultante de cirurgia intraocular no período neonatal. Preservação Estrutural de Fotorreceptores nos Olhos Tratados com rAAV-RdCVF1L:
[00190] De modo a determinar se as respostas aumentadas no ele- trorretinograma (ERG) em olhos tratados com rAAV-RdCVF1L se cor-relacionam com a preservação estrutural de células de fotorreceptores nos camundongos rd10, os animais foram sacrificados imediatamente depois do ERG. Seus olhos foram processados para avaliação histológica. Microscopia ótica mostrou óbvia preservação da camada nuclear externa (ONL) nos olhos tratados com AAV-RdCVFL em comparação com os olhos contralaterais não tratados. Tipicamente, a retina tratada com vetor possuía 2 a 4 linhas de núcleos de fotorreceptores nas regiões superior e/ou inferior em oposição a 1 a 2 linhas nos olhos contra- laterais não tratados (Figuras 11A e 11B). A preservação dos fotorre- ceptores não foi limitada à área injetada - o quadrante superior - uma vez que também foi observada proteção no quadrante inferior. Alguns fotorreceptores preservados possuíam mesmo segmentos internos e externos. Análises morfométricas apresentam alguns aumentos signifi-cativos no número de linhas da camada nuclear externa nos olhos tratados (2,5 + 1,0) em comparação com este número nos olhos de controle (1,2 + 0,2) (p = 0,006) (Fig. 12).
Sumário
[00191] ERG demonstrou um aumento significativo nas amplitudes de onda b em olhos tratados com rAAV-RdCVF1L (33,6 ± 14 µV) em relação aos olhos de pares não tratados (11,5 ± 8,4 µV). O aumento nas amplitudes do ERG foi correlacionado com o aprimoramento da estrutura retinal. Este estudo demonstrou que a injeção sub-retiniana de vetores rAAV-RdCVF1L melhorou significativamente a função retinal e retardou a degeneração dos fotorreceptores nos camundongos Rd10.

Claims (13)

1. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência codificante para uma proteína RdCVF operacionalmente ligada a uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de sinal N-terminal; em que sequência de sinal N-terminal compreende os nucleotídeos 1-105 de SEQ ID NO: 1; e em que a sequência de codificação RdCVF compreende os nucleotídeos 106 a 741 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 106 a 429 de SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 106 a 432 de SEQ ID NO: 3 ou nucleotídeos 106 a 744 de SEQ ID NO: 3.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência codificante de RdCVF compreende os nucleotídeos 106 a 429 de SEQ ID NO: 1.
3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora de RdCVF compreende os nucleotídeos 106 a 741 da SEQ ID NO:1.
4. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora de RdCVF compreende os nucleotídeos 106 a 432 da SEQ ID NO:3.
5. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de RdCVF compreende os nucleotídeos 106 a 744 de SEQ ID NO:3.
6. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que: (a) uma sequência de promotor é ligada operativamente à sequência codificante para a proteína RdCVF, em que opcionalmente o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV), e em que preferencialmente o promotor de CMV compreende 150 a 812 de SEQ ID NO: 11; e/ou (b) uma sequência de íntron é ligada operativamente à sequência codificante para a proteína RdCVF, em que opcionalmente (i) a sequência de íntron é uma sequência de íntron de beta-globina; ou (ii) a sequência de íntron compreende os nucleotídeos 820 a 1312 de SEQ ID NO: 11; e/ou (c) o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 11, a sequência de nucleotídeos de 150 a 2080 de SEQ ID NO: 11 ou as sequências de nucleotídeos de 150 a 812, 820 a 1312 e 1340 a 2080 de SEQ ID NO: 11.
7. Vetor viral, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que opcionalmente: (a) o vetor viral é um vetor viral adeno-associado (AAV), e preferencialmente o vetor AAV é baseado no sorotipo de AAV 2 ou no sorotipo de AAV 8; e/ou (b) o vetor viral não é um vetor viral da imunodeficiência bovina; e/ou (c) o vetor viral não é um vetor lentiviral; e/ou (d) o vetor viral é selecionado dentre o grupo consistindo de um vetor viral de DNA, um vetor viral não-envelopado e um vetor adenoviral.
8. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o microrganismo secreta a proteína RdCVF.
9. Preparação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (i) um veículo farmaceuticamente aceitável e (ii) o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o vetor viral como definido na reivindicação 4, ou uma combinação dos mesmos.
10. Método para a produção de uma proteína RdCVF, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula compreendendo o ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 sob condições que permitam a expressão e a secreção da proteína RdCVF e isolar a proteína RdCVF da cultura celular, em que opcionalmente o referido método adicionalmente compreende purificação da proteína RdCVF a partir do sobrenadante da cultura celular.
11. Método in vitro ou ex vivo de secreção de uma proteína RdCVF a partir de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, à célula, do ácido nucleico como definido na reivindicação 1 a 6 ou do vetor viral como definido na reivindicação 7 sob condições que permitam a expressão e a secreção de RdCVF codificada pelo ácido nucleico ou pelo vetor viral.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que: (a) a célula é uma célula de mamífero, opcionalmente uma célula humana; e/ou (b) a célula é: (i) uma célula ocular, opcionalmente selecionada dentre o grupo consistindo em uma célula piguimentada do epitélio retiniano (RPE), uma célula do tipo bastonete, uma célula do tipo cone, uma célula bipolar, uma célula horizontal, uma célula amácrina, uma célula ganglionar, e uma célula ARPE-19; ou (ii) selecionada dentre o grupo consistindo em uma célula 293, uma célula CHO, uma célula PerC6, uma célula Vero, uma célula BHK, uma célula HeLa, uma célula COS, uma célula MDCK, uma célula 3T3 e uma célula WI38; e/ou (c) as células são encapsuladas.
13. Uso do ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivinicações 1 a 6, ou do vetor viral como definido na reivindicação 7, ou da preparação farmacêutica como definida na reivindicação 9, ou de uma combinação dos mesmos, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para: (i) preservação de bastonetes oculares no olho de um mamífero; e/ou (ii) tratamento de distrofia retinal, doença de Stargardt, retinite pigmentosa, degeneração macular seca relacionada com a idade (em inglês, dry AMD), atrofia geográfica (estágio avançado de dry AMD), degeneração macular úmida relacionada com a idade (em inglês, wet AMD), glaucoma / hipertensão ocular, retinopatia diabética, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-Kornzweig, doença de Best, coroidema, atrofia girada, amaurose congênita, síndrome de Refsum, síndrome de Usher, doença dos olhos relacionada com a tiroide, doença de Grave, uma doença associada com células epiteliais pigmentadas retinais, doença do segmento anterior, doença de lente / catarata, um distúrbio do copo ocular, ou uveíte; e/ou (iii) tratamento de doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, ou uma doença olfativa em um mamífero.
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Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 26/10/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.