EA044520B1 - Вирусные векторы, содержащие области, кодирующие rdh12, и способы лечения дистрофий сетчатки - Google Patents
Вирусные векторы, содержащие области, кодирующие rdh12, и способы лечения дистрофий сетчатки Download PDFInfo
- Publication number
- EA044520B1 EA044520B1 EA202091194 EA044520B1 EA 044520 B1 EA044520 B1 EA 044520B1 EA 202091194 EA202091194 EA 202091194 EA 044520 B1 EA044520 B1 EA 044520B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rdh12
- retinal
- human
- gene
- aav2
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title claims description 23
- 208000032430 Retinal dystrophy Diseases 0.000 title description 5
- 102100038054 Retinol dehydrogenase 12 Human genes 0.000 claims description 73
- 101710178616 Retinol dehydrogenase 12 Proteins 0.000 claims description 73
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 101000742938 Homo sapiens Retinol dehydrogenase 12 Proteins 0.000 claims description 40
- 102000046986 human RDH12 Human genes 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 201000003533 Leber congenital amaurosis Diseases 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 102000004437 G-Protein-Coupled Receptor Kinase 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 claims description 11
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 101000611338 Homo sapiens Rhodopsin Proteins 0.000 claims description 7
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 claims description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 210000000964 retinal cone photoreceptor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims 2
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 claims 2
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 claims 2
- 208000036443 AIPL1-related retinopathy Diseases 0.000 claims 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 1
- 201000006754 cone-rod dystrophy Diseases 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 claims 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 47
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 27
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 25
- 235000020945 retinal Nutrition 0.000 description 25
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 23
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 23
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 20
- 239000011604 retinal Substances 0.000 description 19
- NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N Retinaldehyde Chemical compound O=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 18
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- NCYCYZXNIZJOKI-HPNHMNAASA-N 11Z-retinal Natural products CC(=C/C=O)C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-HPNHMNAASA-N 0.000 description 14
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 11
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 11
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 239000011717 all-trans-retinol Substances 0.000 description 8
- 229940100609 all-trans-retinol Drugs 0.000 description 8
- 235000019169 all-trans-retinol Nutrition 0.000 description 8
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 7
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 7
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 6
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 6
- 108091004242 G-Protein-Coupled Receptor Kinase 1 Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100467898 Mus musculus Rdh12 gene Proteins 0.000 description 6
- 108090000799 Rhodopsin kinases Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 6
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 101001010792 Homo sapiens Transcriptional regulator ERG Proteins 0.000 description 5
- 206010057430 Retinal injury Diseases 0.000 description 5
- 108010015231 alcohol dehydrogenase (NAD(P)+) Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 238000002571 electroretinography Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 208000017532 inherited retinal dystrophy Diseases 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 102100026663 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH7 Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010003730 Cone Opsins Proteins 0.000 description 4
- 208000032578 Inherited retinal disease Diseases 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 4
- 108010035291 retinol dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 4
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 3
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101150033365 Rdh12 gene Proteins 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 201000006321 fundus dystrophy Diseases 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 3
- FPIPGXGPPPQFEQ-HPNHMNAASA-N 11-cis-retinol Natural products OCC=C(C)C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-HPNHMNAASA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001137074 Homo sapiens Long-wave-sensitive opsin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000687592 Homo sapiens Retinol dehydrogenase 8 Proteins 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000008886 Leber congenital amaurosis 14 Diseases 0.000 description 2
- 102100035576 Long-wave-sensitive opsin 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000006550 Mydriasis Diseases 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 2
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 2
- 102100024844 Retinol dehydrogenase 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 108010005264 metarhodopsins Proteins 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 2
- 150000003726 retinal derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000004243 retinal function Effects 0.000 description 2
- 210000000880 retinal rod photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000027653 severe early-childhood-onset retinal dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 2
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 2
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 2
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHUUPUMBZGWODW-UHFFFAOYSA-N 3,6-dihydro-1,2-dioxine Chemical compound C1OOCC=C1 JHUUPUMBZGWODW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000033810 Choroidal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101000829506 Homo sapiens Rhodopsin kinase GRK1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000287127 Passeridae Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- KCLANYCVBBTKTO-UHFFFAOYSA-N Proparacaine Chemical compound CCCOC1=CC=C(C(=O)OCCN(CC)CC)C=C1N KCLANYCVBBTKTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010048955 Retinal toxicity Diseases 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- 102220643026 Retinol dehydrogenase 12_L274P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100023742 Rhodopsin kinase GRK1 Human genes 0.000 description 1
- 108010005063 Rod Opsins Proteins 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000009105 Short Chain Dehydrogenase-Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108010048287 Short Chain Dehydrogenase-Reductases Proteins 0.000 description 1
- 101710142587 Short-chain dehydrogenase/reductase Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 208000021018 autosomal dominant inheritance Diseases 0.000 description 1
- 208000021024 autosomal recessive inheritance Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000003571 choroideremia Diseases 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000004300 dark adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010569 immunofluorescence imaging Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000004298 light response Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000968 medical method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000003733 optic disk Anatomy 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000003144 pneumothorax Diseases 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960003981 proparacaine Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 description 1
- 231100000385 retinal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108091011071 retinoid binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000021439 retinoid binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102200139407 rs121434337 Human genes 0.000 description 1
- 102200139398 rs28940313 Human genes 0.000 description 1
- 102200139437 rs28940314 Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 108010027126 short chain trans-2-enoyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008625 synaptic signaling Effects 0.000 description 1
- 229940080150 systane Drugs 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
По изобретению испрашивается приоритет по временной заявке на патент США № 62/586624, поданной 15 ноября 2017 г., которая включена в настоящее описание посредством ссылки.
Включение посредством ссылки материалов, поданных в электронном виде
Изобретение содержит, в качестве отдельной части раскрытия, перечень последовательностей в машиночитаемой форме (имя файла: 51914A_Seqlisting.txt; создан 9 ноября 2018 г.; 5230 байт - текстовый файл ASCII), который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
Область техники
Это изобретение относится к медицинским способам лечения, таким как способы лечения человека с офтальмологической патологией, например, врожденным амаврозом Лебера, вследствие по меньшей мере одной мутации с потерей функции в гене, кодирующем белок ретинол-дегидрогеназу 12 (RDH12), при этом способ включает в себя введение субъекту эффективного количества нуклеиновой кислоты, содержащей аденоассоциированный вирусный вектор, содержащий комплементарную ДНК (кДНК) RDH12 человека.
Уровень техники
Наследственные заболевания сетчатки (НЗС) являются основной причиной практической слепоты у детей. Врожденный амавроз Лебера (ВАЛ) и тяжелая дистрофия сетчатки с началом в раннем возрасте (ТДСРН) приводят к серьезному нарушению зрения, возникающему в период от рождения до возраста в несколько лет, и вместе составляют 5% или больше от всех НЗС (Koenekoop et al. 2004). ВАЛ/ТДСРН ассоциируется с аутосомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типами наследования, вовлекая пигментный эпителий сетчатки и фоторецепторы - палочки и колбочки, в качестве основных мишеней (Weleber et al. 2013). Примерно 10% ВАЛ/ТДСРН вызвается мутациями в гене, кодирующем RDH12 (Kumaran et al. 2017). Учитывая роль RDH12 в цикле превращений родопсина, который обеспечивает хромофор для фоторецепторных клеток (Haeseleer et al. 2002; Chen et al. 2012), и который является критической терапевтической мишенью, RDH12 является одним из наиболее важных генов ВАЛ.
Несмотря на распространенность офтальмологических патологий, таких как наследственное заболевание сетчатки у людей и не относящихся к человеку млекопитающих, и знания о генах, кодирующих ретинол-дегидрогеназы, а также эффекте, который оказывают некоторые мутации в этих генах, не существует известного лечения ВАЛ, вызванного одним или большим количеством мутации в RDH12. Соответственно, в данной области техники по-прежнему существует потребность в материалах и способах, полезных для лечения дистрофий сетчатки, таких как ВАЛ, а также в материалах и способах, полезных для коррекции генетических аномалий, которые могут привести к таким дистрофиям.
Краткое описание сущности изобретения
Данное изобретение предлагает вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий кодирующую область для генного продукта гена RDH12, гена, кодирующего фермент ретинолдегидрогеназу. Вектор AAV, содержащий RDH12, полезен для лечения дистрофических нарушений сетчатки, таких как врожденный амавроз Лебера (ВАЛ), путем предоставления рекомбинантной конструкции, в которой кодирующая область RDH12 находится под контролем регулируемого или контролируемого промотора, такого как гетерологичный промотор, чтобы обеспечить восполнение функции ретинолдегидрогеназы у субъектов, у которых отсутствует активность RDH12 уровней дикого типа, как это будет происходить при мутациях в RDH12. Несмотря на преимущества относительно небольшого размера генома, относительно низкой тенденции к интеграции в ДНК хозяина и относительно низкого иммуногенного профиля, неожиданным открытием стало то, что некоторые комбинации серотипа AAV, или псевдотипы, дают уровни экспрессии для кодируемого продукта RDH12, которые не являются терапевтически эффективным и/или которые демонстрируют нежелательную токсичность при введении субъектам для лечения дистрофии сетчатки. Совпадением с этим открытием является обнаружение того, что некоторые псевдотипы, такие как псевдотип AAV2/5, демонстрируют неожиданные и удивительно эффективные уровни экспрессии и профили токсичности, совместимые с терапевтическим применением для лечения дистрофии сетчатки. Субъекты, которых можно лечить с помощью данных способов, могут включать в себя тех, кто имеет потерю зрительной функции (например, нарушенный ответ при исследовании с электроретинограммой (ЭРГ)), но которые сохраняют некоторые фоторецепторные клетки, как определено с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ). Таким образом, в одном аспекте, данное изобретение относится к способу лечения субъекта-человека, у которого имеется офтальмологическая патология, такая как врожденный амавроз Лебера или ВАЛ, или другая клинически определенная офтальмологическая патология вследствие одной или большего количества мутаций с потерей функций в гене, кодирующем белок ретинол-дегидрогеназу 12 (RDH12). Более конкретно, один аспект данного изобретения относится к способу лечения субъекта-человека, который имеет офтальмологическую патологию вследствие одной или большего количества мутаций с потерей функции в гене, кодирующем белок ретинол-дегидрогеназу 12 (RDH12), причем способ включает в себя введение в по меньшей мере в один глаз субъекта адено-ассоцированого вирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, причем нуклеиновая кислота содержит ДНК RDH12 человека, например кДНК RDH12 человека, и при этом ДНК
- 1 044520
RDH12 (например, ДНК RDH12 человека) кодирует белок, который по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 99% идентичен полноразмерной SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, офтальмологическая патология представляет собой врожденный амавроз Лебера (ВАЛ). В некоторых вариантах осуществления, отмеченных выше, офтальмологическая патология представляет собой врожденный амавроз Лебера (ВАЛ). В некоторых вариантах осуществления, ДНК RDH12, например кДНК RDH12, находится под контролем, на уровне экспрессии, промотора родопсин-киназы 1 (hGRK1) человека таким образом, что при этом промотор hGRK1 содержит или состоит по существу из SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, аденоассоциированный вирусный вектор представляет собой AAV-2, серотип-5 (AAV2/5) или AAV-5. В некоторых вариантах осуществления, ДНК RDH12, например кДНК RDH12, содержит последовательность, которая, по меньшей мере, на 60 или 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновую кислоту вводят в титре около от 2х1010 вирусных геномов на миллилитр (вг/мл) до около 2х1012 вг/мл, например, в титре около от 2x10 вирусных геномов на миллилитр (вг/мл) до около 2х1012 вг/мл, например около 2x1011 вг/мл или около 2х1012 вг/мл. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновую кислоту вводят в субретинальное пространство, например, при этом микроинъекционную канюлю вводят в субретинальное пространство.
Другой аспект изобретения относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей ДНК RDH12 человека, например кДНК RDH12 человека, причем ДНК RDH12 (например, ДНК RDH12 человека, такая как кДНК) кодирует белок, который по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 99% идентичен полноразмерной SEQ ID NO: 2, причем ДНК RDH12 находится под контролем промотора родопсинкиназы 1 (hGRK1) человека. В некоторых вариантах осуществления, промотор hGRK1 содержит или состоит по существу из SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, ДНК RDH12 человека, например кДНК RDH12 человека, кодирует белок, содержащий SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, ДНК RDH12 человека, например кДНК RDH12 человека, по меньшей мере на 60 или 70% идентична полноразмерной SEQ ID NO: 1.
Еще один аспект данного изобретения представляет собой нуклеиновую кислоту, раскрытую в данном документе, для применения в лечении субъекта-человека, который имеет офтальмологическую патологию вследствие одной или большего количества мутаций с потерей функции в гене, кодирующем белок ретинол-дегидрогеназу 12 (RDH12). В некоторых вариантах осуществления, офтальмологическая патология представляет собой врожденный амавроз Лебера (ВАЛ).
Еще один аспект данного изобретения представляет собой вирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую RDH12, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления, вирусный вектор представляет собой аденоассоциированный вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления, аденоассоциированный вирусный вектор представляет собой AAV-2, серотип5 (AAV2/5) или AAV-5.
Другой аспект данного изобретения представляет собой вирусный вектор, описанный в данном документе, для применения в лечении субъекта-человека, который имеет офтальмологическую патологию вследствие одной или большего количества мутаций с потерей функции в гене, кодирующем белок ретинол-дегидрогеназу 12 (RDH12). В некоторых вариантах осуществления, офтальмологическая патология представляет собой врожденный амавроз Лебера (ВАЛ).
Другой аспект данного изобретения относится к выделенной клетке-хозяину, содержащей вирусный вектор, как описано в данном документе, или нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления, выделенная клетка-хозяин экспрессирует белок RDH12 человека.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в данной области техники, к которой относится данное изобретение. В данном документе описаны способы и материалы для использования в данном изобретении; также могут быть использованы другие подходящие способы и материалы, известные в данной области техники. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, заявки на патенты, патенты, последовательности, записи в базе данных и другие источники, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта, данное описание, включая определения, будет иметь преимущество.
Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и фигур, а также из формулы изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Активность RDH в цикле превращений родопсина и фоторецепторных клетках. (А) В цикле превращений родопсина витамин А преобразуется в 11-цис-ретиналь, хромофор зрительных пигментов, и утилизируется полностью-транс-ретиналь, высвобождающийся после обесцвечивания. (В) Для пары ПЭС-фоторецепторных клеток продемонстрировн ретиноидный путь. RDH8 в наружном сегменте может уменьшать количество транс-ретиналя. RDH12 во внутреннем сегменте может уменьшать количество
- 2 044520 полностью-транс-ретиналя, 11-цис-ретиналя и других токсичных коротко-цепочечных альдегидов. Сокращения: ПцРАЛ, 11-цис-ретиналь; ПцРОЛ, 11-цис-ретинол; ПтРАЛ, полностью-транс-ретиналь;
ПтРОЛ, полностью-транс-ретинол; RCHO, коротко-цепочечный альдегид; RCHOH, коротко-цепочечный спирт; Рд, родопсин; Мрд, метародопсин.
Фиг. 2. Экспрессия и локализация рекомбинантного RDH12 в мышах, инъецированных AAV2/5hGRK1p.hRDH12. (А) Схема AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 генно-терапевтической конструкции, в которой кДНК RDH12 человека клонируют ниже промотора родопсинкиназы человека, между последовательностями инвертированных концевых повторов, полученных из генома AAV2. (В, С) Экспрессия белка RDH12 человека в сетчатках мыши спустя 6 недель после субретинальной инъекции AAV2/5hGRK1p.hRDH12 (1,3x109 вг) или ФСБ, оцененная с использованием антител, специфичных к Rdh12 мыши или RDH12 человека. (В) Вестерн-анализ лизатов сетчатки из мышей C57BL/6J, мышей Rdh12’/’, инъецированных ФСБ, и мышей Rdh12’/’, инъецированных AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. (С) Иммуногистохимический анализ демонстрирует локализацию нативного Rdh12 мыши (темно-серый) в ВС, НЯС и НСС сетчатки у мышей C57BL/6J, но не у мышей Rdh12’/’, тогда как рекомбинантный RDH12 человека (светло-серый) в результате инъекции AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 демонстрирует одинаковую локализацию как для мышей C57BL/6J, так и для Rdh12’7 Фазово-контрастные изображения (слева). Сокращения: ИКП, инвертированный концевой повтор; hGRK1, промотор родопсин-киназы человека; СД/СА, сплайсдонорный/сплайс-акцепторный сайт вируса обезьян 40 (Simian virus 40); hRDH12, кДНК RDH12 человека; полиА, сигнал полиаденилирования вируса обезьян 40; ПЭС, пигментный эпителий сетчатки; НС, наружные сегменты; ВС, внутренние сегменты; НЯС, наружный ядерный слой; НСС, наружный сетчатый слой; ВЯС, внутренний ядерный слой; ВСС, внутренний сетчатый слой; СГК, слой ганглиозных клеток.
Фиг. 3. AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 генно-заместительная терапия восстанавливает функцию RDH12 у мышей с дефектом Rdh12. (А) ВЭЖХ анализ редуктазной активности сетчатки в сетчатках из мышей C57BL/6J и Rdh12’/·, инъецированных AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3x109 вг) или ФСБ, или не инъецированных. Спустя 6 недель после инъекции формирование полностью-транс-ретинола количественно определяли в анализах с полностью-транс-ретиналем в качестве субстрата. Каждая точка на графике представляет собой среднее ± среднеквадратическая ошибка для минимум 5 независимых экспериментов, где сетчатки из от 3 до 5 мышей объединяли и анализировали в трех повторностях. C57BL/6J; Rdh12’/’; Rdh12’/’, инъецированные ФСБ; Rdh12’/’, инъецированные AAV. (В) Иммуногистохимия рекомбинантной экспрессии RDH12 в полном срезе сетчатки мыши Rdh12’/’, оцененная 16 недель после инъекции AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. RDH12 человека (светло-серый) локализуется в ВС, НЯС и НСС инъецированной области сетчатки (правая сторона изображения).
Фиг. 4. AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 генно-заместительная терапия уменьшает световое повреждение у мышей-альбиносов с дефектом Rdh12. Анализ ЭРГ проводили за одну неделю до и одну неделю после воздействия 5000 люкс в течение 2 ч, на мышах, которым инъецировали в один глаз AAV2/5hGRK1p.hRDH12 и которых не инъецировали в контралатеральный глаз. Реакции в сумраке (только для палочек и комбинированные для палочек-колбочек) были количественно определены для групп из 10-13 мышей, и был рассчитан процент первоначальной реакции по ЭРГ, оставшейся после светового повреждения. Представлены усредненные результаты с среднеквадратическими ошибками, а также значимость различий между инъецированными и неинъецированными глазами, рассчитанная с использованием анализа двустороннего парного критерия Стьюдента.
Фиг. 5. AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 не оказывает существенного влияния на установившиеся уровни 11-цис-ретиналя в сетчатке. Мыши получали AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3x109 вг) или ФСБ путем субретинальной инъекции, или они не были инъецированы. После темновой адаптации в течение ночи ретиноиды экстрагировали в тусклом красном свете и количественно определяли анализом ВЭЖХ. (А) Типичные хроматограммы для каждого режима обработки; указаны пики для син-11-цис-ретиналь оксима, анти-11-цис-ретиналь оксима и син-полностью-транс-ретиналь оксима. Общие уровни в сетчатке (В) 11цис-ретиналя и (С) полностью-транс-ретиналя для каждого режима обработки ± среднеквадратическая ошибка ( неинъецированные C57BL/6J; неинъецированные Rdh12’/’; инъецированные AAV Rdh12'/’; инъецированные ФСБ Rdh12’/’).
Фиг. 6. AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 не влияет отрицательно на функцию сетчатки. Электроретинограммные (ЭРГ) реакции в сумраке (только для палочек и комбинированные для палочек-колбочек) и при дневном свете (опосредованные колбочками) записывали спустя 6 недель после обработки для мышей C57BL/6J, неинъецированных; Rdh12’/’, неинъецированных; и Rdh12’/’, инъецированных AAV2/5hGRK1p.hRDH12 (вплоть до 2x109 вг). Показаны ЭРГ для репрезентативного животного в каждой группе обработки, измеренные спустя 6 недель после инъекции.
Фиг. 7. Локализация зрительных пигментов не нарушается AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. Спустя 16 недель после обработки оценивали иммуногистохимическую локализацию родопсина и опсина колбочек у неинъецированных и инъецированных (1,3x109 вг) мышей Rdh12’7 Экспрессия белка RDH12 человека
- 3 044520 в ВС и НЯС (светло-серый). Родопсин и красный/зеленый опсин (темно-серый) в глазах, инъецированных AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. Сокращения такие же, как для фиг. 2.
Фиг. 8. Структура сетчатки не повреждается при длительной экспрессии AAV2/5-hGRK1p.hRDH12.
Анализ с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) глаз мышей C57BL/6J и Rdh12’/’, проведенный спустя 54 недели после введения AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (вплоть до 2x109 вг).
Фиг. 9. Инфильтрация макрофагов CD68+ и экспрессия RDH12 в сетчатках, инъецированных AAV2/8-hGRK1p.hRDH12. Мышей Rdh12’/’ и C57BL/6J оценивали с помощью иммуногистохимического анализа спустя 8 недель после субретинальной инъекции AAV2/8-hGRK1p.hRDH12 (2x109 вг). Экспрессия RDH12 человека в ВС, НЯС и НСС (светло-серый) и CD68-мечение макрофагов (белый). Сокращения такие же, как для фиг. 2.
Подробное описание сущности изобретения
Наследственная дегенерация сетчатки является редкой причиной полной потери зрения, которая находится в центре современных усилий по разработке целевой генной терапии. Опосредованная вирусным вектором соматическая генная терапия продемонстрировала большие перспективы в лечении животных моделей для человеческих дегенеративных заболеваний сетчатки. На сегодняшний день был проведен ряд успешных исследований с использованием доставки генов, опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV), для избавления от дегенерации фоторецепторов в моделях с небольшими животными (АН et al. 2000; Pang et al. 2012; Pawlyk et al. 2010; Pawlyk et al. 2005; Tan et al. 2009) и в моделях с большими животными (Acland et al. 2001; Alexander et al. 2007; Beltran et al. 2012; Komaromy et al. 2010; Lheriteau et al. 2009). В этих случаях, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) или фоторецепторы были основными целями для экспрессии трансгена. Кроме того, клинические испытания фазы I, включающие в себя генную терапию для пациентов с врожденным амаврозом Лебера (ВАЛ), нацеленную на ПЭС (Bainbridge et al. 2008; Cideciyan et al. 2008; Maguire et al. 2008), и совсем недавно хориоидеремию (Maclaren et al. 2014), уже достигли некоторых успехов. В данный момент нет клинических испытаний с использованием AAV-опосредованной генной заместительной терапии для лечения пациентов с наследственной дегенерацией сетчатки, вызванной мутациями в RDH12.
Заинтересовавшись разработкой AAV-опосредованной генной терапии для лечения индивидов с мутациями в RDH12, мы создали аденоассоциированные вирусные векторы, несущие кДНК RDH12 человека, экспрессия которых находится под контролем промотора родопсин-киназы. В данном раскрытом исследовании векторов с капсидами, полученными из серотипа AAV 5 или серотипа AAV 8, мы продемонстрировали, что субретинальная доставка AAV2/5-hGRK1p.RDH12 у мышей с дефектным Rdh12 (Rdh12’/_) приводит к экспрессии рекомбинантного RDH12 человека, который стабилен, правильно локализован, восстанавливает редуктазную активность сетчатки, снижает восприимчивость к световым повреждениям и не вызывает токсичности сетчатки, наблюдаемой при AAV2/8-hGRK1p.hRDH12. Эта конструкция AAV2/5-hGRK1p.RDH12 обеспечивает продукт для заместительной генной терапии RDH12.
RDH12.
Мутации в гене, кодирующем ретинол-дегидрогеназу 12 (RDH12), вызывают тяжелую дегенерацию сетчатки с началом в раннем возрасте, чаще всего диагностируемую как врожденный амавроз Лебера (ВАЛ) или тяжелая дистрофия сетчатки с началом в раннем возрасте (ТДСРН). Член семейства короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз, RDH12 необходим для уменьшения уровней ретинальдегидов, которые порождаются активностью цикла превращений витамина А, который является неотъемлемой частью светового ответа фоторецепторных клеток. Когда зрительные пигменты, содержащие хромофор 11-цисретиналь, поглощают фотон света, 11-цис-ретиналь изомеризируется в полностью-транс-ретиналь, инициируя, таким образом, каскад трансдукции сигнала, который регулирует синаптическую передачу сигналов. Инактивация зрительных пигментов включает в себя высвобождение полностью-транс-ретиналя, его восстановление до полностью-транс-ретинола и возврат в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) для возобновления хромофора 11-цис-ретиналя (фиг. 1А). Когда эти реакции переработки неэффективны или нарушаются, например, в результате старения или наследственного заболевания, ретинальдегиды и конденсированные продукты ретинальдегидов накапливаются в фоторецепторах и пигментном эпителии сетчатки, что приводит к серьезному повреждению внешней сетчатки (Ben-Shabat et al. 2001; Thompson et al. 2003; Sparrow, 2010; Chen et al. 2012).
Для защиты от токсичности в сетчатке экспрессируется ряд белков и ферментов, связывающих ретиноиды. RDH12 является членом семейства короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз, которые используют НАДФН для восстановления широкого спектра субстратов, включая цис- и трансретинальдегиды (Haeseleer et al. 2002), альдегиды С9, образованные в результате липидного фотоокисление (Belyaeva et al. 2005; Lee et al. 2008; Marchette et al. 2010), и стероидные субстраты (Keller et al. 2007). Индивиды с мутациями с потерей функции в гене RDH12 демонстрируют фенотип тяжелой дегенерации сетчатки, часто диагностируемой как врожденный амавроз Лебера (ВАЛ) (Janecke et al. 2004; Thompson et al. 2005; Perrault et al. 2004; den Hollander et al. 2008; Mackay et al. 2011), для которой в данный момент нет лечения или лекарств. RDH12 локализуется в внутренних сегментах фоторецепторных клеток - пало- 4 044520 чек и колбочек (Haeseleer et al. 2002; Maeda et al. 2006), где он защищает от светового повреждения, вызванного, по меньшей мере частично, реакционноспособными ретинальдегидами (Maeda et al. 2006). Было продемонстрировано, что полностью-транс-ретиналь, формирующийся после воздействия света, просачивается из наружных сегментов фоторецептора во внутренние сегменты, и для его эффективного удаления из фоторецепторных клеток требуется активность как RDH8, присутствующего в наружных сегментах, так и RDH12, присутствующего во внутренних сегментах (Chen et al. и др. 2012) (фиг. 1В). Таким образом, RDH12 также может играть важную роль в уменьшении присутствия 11-цис-ретиналя в избытке по сравнению с биосинтезом опсина, который может проникать во внутренний сегмент из субретинального пространства (Chen et al. 2012).
Чтобы исследовать потенциал генной заместительной терапии для ВАЛ/ТДСРН вследствие мутаций RDH12, мы создали аденоассоциированные вирусные векторы, несущие кДНК RDH12 человека, в которых экспрессия находится под контролем промотора родопсин-киназы, который управляет специфической для фоторецепторных клеток экспрессией (Khani et al. 2007; Sun et al. 2010; Young et al. 2003). ДНК-конструкцию упаковывали в капсид, полученный из AAV серотипа 8, который опосредует эффективную и надежную трансдукцию фоторецепторных клеток (Allocca et al. 2007; Natkunarajah et al. 2008; Vandenberghe et al. 2011; Vandenberghe et al. 2013), или в капсид AAV серотипа 5, который опосредует трансдукцию фоторецепторов, но с более медленной кинетикой и менее выраженной экспрессией по сравнению с капсидом AAV серотипа 8 (Yang et al. 2002; Lotery et al. 2003; Allocca et al. 2007; Lebherz et al. 2008).
В сравнительных исследованиях, выполненных на мышиной модели с дефектным Rdh12 (Rdh12’/_) (Kurth et al. 2007), наша работа продемонстрировала, что два вектора имеют существенно разные профили безопасности, при этом AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 демонстрирует неожиданные и удивительные эффективные уровни экспрессии и профили токсичности, совместимые с терапевтическим применением для лечения дистрофии сетчатки.
Последовательность RDH12 человека.
Последовательность иллюстративной кДНК RDH12 человека, состоящая из нуклеотидов от -10 до +980 относительно сайта инициации трансляции, кодирующая все семь транслируемых экзонов RDH12 (GenBank № NM_152443), представлена в SEQ ID NO: 1.
Полноразмерная последовательность белка RDH12 человека представлена в SEQ ID NO: 2.
Промотор родопсин-киназы (hGRK1p).
В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в данном документе, используют замещающую генную конструкцию, в которой кДНК RDH12 человека, как описано в данном документе, помещают под контроль промотора родопсин-киназы человека (hGRK1). В некоторых вариантах осуществления, промотор hGRK1 имеет длину примерно 200 пар оснований (п. о.), и содержит короткий промотор, полученный из гена hGRK1 родопсин-киназы (РК), который, как было продемонстрировано, управляет специфической для клеток экспрессией в палочках и колбочках (Khani et al. 2007; Sun et al. 2010; Young et al. 2003). Иллюстративная последовательность промотора hGRK1 содержит нуклеотиды от -112 до +87 SEQ ID NO: 3 (Khani et al. 2007).
Вирусный вектор доставки.
Укороченную кДНК RDH12 человека, как описано выше, упаковывали в вектор доставки, например вектор AAV5 или AAV2/5.
Замещающие гены (кДНК) могут быть введены в любом эффективном носителе, например в любом препарате или композиции, способных эффективно доставлять компонент-ген в клетки in vivo. Подходы включают в себя вставку гена в непатогенные нереплицирующиеся вирусные векторы, включая рекомбинантные ретровирусы, аденовирус, аденоассоциированный вирус, лентивирус и вирус простого герпеса-1, или рекомбинантные бактериальные или эукариотические плазмиды. Вирусные векторы трансфицируют клетки напрямую; плазмидная ДНК может доставляться голой или с помощью, например, катионных липосом (липофектамина) или дериватизированных (например, конъюгированных с антителами) конъюгатов полизина, грамацидина S, искусственных вирусных оболочек или других таких внутриклеточных носителей, а также in vivo выполняют прямую инъекцию генной конструкции или преципитацию Са3(РО4)2.
Предпочтительным подходом для введения in vivo нуклеиновой кислоты в клетку является использование вирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, например кДНК. Инфицирование клеток вирусным вектором имеет то преимущество, что большая часть клеток-целей может получить нуклеиновую кислоту. Кроме того, молекулы, кодируемые в пределах вирусного вектора, например, кДНК, содержащейся в вирусном векторе, эффективно экспрессируются в клетках, которые поглощают нуклеиновую кислоту вирусного вектора. Ретровирусные векторы и векторы, полученные из аденовирусов, можно использовать в качестве системы доставки рекомбинантных генов для переноса экзогенных генов in vivo, в частности в людей, в ряд типов клеток. Однако они не трансдуцируют фоторецепторные клетки с достаточной эффективностью, чтобы сделать их полезными для этого применения.
Еще одной вирусной векторной системой, полезной для доставки нуклеиновых кислот, является аденоассоциированный вирус (AAV). Аденоассоциированный вирус представляет собой встречающийся
- 5 044520 в природе дефектный вирус, которому требуется другой вирус, такой как аденовирус или вирус герпеса, в качестве вспомогательного вируса для эффективной репликации и продуктивного жизненного цикла (Muzyczka et al. 1992). Это также один из немногих вирусов, которые могут интегрировать свою ДНК в неделящиеся клетки и проявляют высокую частоту стабильной интеграции (смотрите, например, Flotte et al. 1992; Samulski et al. 1989; и McLaughlin et al. 1988). Векторы, содержащие всего 300 пар оснований AAV, могут быть упакованы и могут интегрироваться. Пространство для экзогенной ДНК ограничено коло 4,5 кб. Вектор AAV, такой как описанный в Tratschin et al., 1985, можно использовать для введения ДНК в клетки. С использованием векторов AAV в различные типы клеток были введены различные нуклеиновые кислоты (смотрите, например, Hermonat et al. 1984; Tratschin et al. 1984a; Tratschin et al. 1984b; Wondisford et al. 1988; и Flotte et al. 1993).
В предпочтительных вариантах осуществления, вирусный вектор доставки представляет собой рекомбинантный вирус AAV2/5. Перед введением конечный продукт может пройти серию этапов ультраочистки, чтобы соответствовать критериям клинической степени чистоты.
Выбор субъекта.
Субъекты, которые являются кандидатами для данных способов лечения, включают в себя тех, которые имеют диагноз ВАЛ, вызванный мутациями в гене, кодирующем RDH12. Субъекты, страдающие от других офтальмологических клинически определенных патологий, вызванных мутациями в гене, кодирующем RDH12, например, пигментная дистрофия сетчатки с началом в раннем возрасте, также могут лечиться с использованием способов, описанных в данном документе. Диагноз ВАЛ или другой офтальмологической патологии, вызванной мутациями в гене, кодирующем RDH12, может быть поставлен с использованием способов, известных в данной области техники.
Способы, описанные в данном документе, могут включать в себя идентификацию субъекта, например ребенка, подростка или молодого взрослого субъекта, у которого имеется ВАЛ или другая офтальмологическая патология, вызванная одной или большим количеством мутаций в гене, кодирующем RDH12, или у которого подозревают наличие ВАЛ или другой офтальмологической патологии, вызванной одной или большим количеством мутаций в гене, кодирующем RDH12 (например, исходя из наличия симптомов патологии и отсутствия другой очевидной причины), и получение образца, содержащего геномную ДНК из субъекта, обнаружение наличия мутаций в RDH12 с использованием известных молекулярно-биологических способов, и выбор пациента, который имеет мутацию в обоих аллелях RDH12, которые вызывают ВАЛ или другую патологию. Симптомы патологии включают в себя атрофию желтого пятна, истончение фовеальной зоны и нарушение ламинарной архитектуры, что приводит к ранней потере макулярного зрения и прогрессированию до зрения ПС (практической слепоты). Поля зрения сужаются в самом раннем возрасте измерения, и реакции по ЭРГ становятся не регистрируемыми в раннем взрослом возрасте. Обнаружение мутаций в RDH12 может включать в себя секвенирование всего или части гена RDH12 у субъекта и сравнение последовательности с контрольной последовательностью (например, номер доступа GenBank - NG_008321.1) для обнаружения мутации. Мутации со сдвигом рамки считывания, укорачивающие мутации, мутации, которые изменяют консервативную аминокислоту, мутации, которые влияют на сплайсинг транскрипта, или мутации, которые влияют на регуляторную (например, промоторную) область, рассматриваются как мутации, которые могут вызывать ВАЛ или другую офтальмологическую патологию, как описано в данном документе; изменение функции может быть подтверждено экспрессией мутанта in vitro (например, в культивируемых клетках) и анализом, например, ферментной функции. Иллюстративные мутации в гомозиготном состоянии включают в себя: Glu127X, Gln189X, Tyr226Cys, Ala269GlyfsX1 и Leu274Pro (все ссылки на позиции относятся к последовательности белка RDH12 SEQ ID NO: 2). Иллюстративные мутации в компаунд-гетерозиготном состоянии включают: Thr49Met/Arg62X; Arg65X/Ala269GlyfsX1; His151D/Thr155Ile; His151D/Arg269GlyfsX1 (Janecke et al. 2004; Schuster et al. 2007). (Позиции относятся к последовательности белка SEQ ID NO: 2).
Пациенты с ВАЛ или другой офтальмологической патологией вследствие по меньшей мере одной мутации RDH12, которые можно лечить с использованием способа, описанного в данном документе, предпочтительно сохраняют некоторые фоторецепторы и зрительные функции, например, как это измерено с помощью стандартных проверок зрительных функций или полевых проверок и/или оптической когерентной томографии (ОКТ, например, ОКТ спектральной области (ОКТ-СО)). Способы, описанные в данном документе, могут включать в себя идентификацию субъектов, которым был поставлен диагноз ВАЛ или другой офтальмологической патологии вследствие по меньшей мере одной мутации RDH12, которые имеют по меньшей мере одну подтвержденную мутацию в RDH12, которая является причиной их патологии, и проверку их зрительной способности и обнаружение присутствия остаточных центральных фоторецепторов.
Примеры
Раскрытый и заявленный объект данного изобретения дополнительно описан в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.
Материалы и способы.
Следующие материалы и способы были использованы в экспериментах, раскрытых в приведенных ниже примерах.
- 6 044520
Животные.
Разведение и анализ мышей Rdh12-/- были описаны ранее (Kurth et al. 2007). Мыши Rdh12-/-, использованные в данном исследовании, были выведены путем спаривания братьев и сестер среди нульзиготных самцов и самок, которых содержали в виварии нашего учреждения. Мыши ДТ (дикого типа), использованные в данном исследовании, представляли собой C57BL/6 из Лаборатории Джексона (The Jackson Laboratory) (Уилмингтон, Массачусетс).
Были использованы трансгенные мыши следующих генотипов для исследований, описанных в данном документе: Мыши Rdh12-/- на основе C57BL/6J, гомозиготные по варианту Rpe65-Met450 (M/M) (Kurth, 2007), и мыши-альбиносы Rdh12-/- на осное BALB/c, гомозиготные по варианту Rpe65-Leu450 (L/L) (Chrispell, 2009), которые были получены скрещиванием. Мышей выращивали в цикле 12 ч (свет)/12 ч (тьма) и подвергали эвтаназии путем вдыхания СО2 с последующим двусторонним пневмотораксом.
Конструирование плазмиды и получение рекомбинантных AAV2/5 и AAV2/8.
Человеческую кДНК RDH12 амплифицировали из кДНК сетчатки человека с помощью ПЦР с использованием праймеров, предназначенных для охвата всей кодирующей области RDH12, клонированной и секвенированной для проверки точности, как описано ранее (Janecke et al. 2004). Для конструирования векторов AAV, кДНК RDH12 встраивали в полилинкер исходного вектора pAAV-hGRK1-hrGFP. Полученный в результате вектор pAAV-hGRK1-Rdh12 был упакован в AAV. Псевдотипированные векторы AAV2/5 и AAV2/8 были получены путем двойной трансфекции: (1) векторной плазмиды AAV, кодирующей ген интереса, (2) вспомогательной плазмиды AAV, кодирующей белки Rep AAV из серотипа 2 и белки Сар из серотипа 5 или серотипа 8, и аденовирусные вспомогательные элементы, в клетки 293Т. Трансфекцию и очистку осуществляли с использованием опубликованного протокола (Nishiguchi et al 2015). Через два дня после трансфекции клетки лизировали путем повторных циклов замораживания и оттаивания. После первоначальной очистки клеточного дебриса, компонент нуклеиновой кислоты клеток-продуцентов вируса удаляли обработкой Бензоназой. Частицы рекомбинантного вектора AAV очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием матрицы AVB, промывали в 1х ФСБ и концентрировали до объема 100-150 мл с использованием концентраторов Vivaspin 4 (10 кДа). Векторы титровали путем амплификации кПЦР.
Субретинальные инъекции.
Подгруппы мышей в возрасте примерно 4 недели находились под общей анестезией внутрибрюшинной инъекцией кетамина (90 мг/кг)/ксилазина (9 мг/кг). 0,5% раствор пропаракаина наносили на роговицу в качестве местного анестетика. Зрачки расширяли местным применением тропикамида (0,5%). Под офтальмологическим хирургическим микроскопом был сделан небольшой разрез в роговице, прилегающей к каемке, с помощью иглы 30-го калибра. Тупая игла 34-го калибра, установленная на шприц Гамильтона, была введена через разрез позади хрусталика и протиснута через сетчатку. Все инъекции были выполнены субретинально в пределах носового квадранта сетчатки. Каждый глаз получал вплоть до 2x109 вг AAV2/5-(hGRK1)-hRDH12 в объеме вплоть до 2 мкл. Вектор, кодирующий RDH12, вводили отдельно в один глаз каждой мыши, получающей лечение, а контрлатеральные глаза не были инъецированы. При осмотре глазного дна после инъекции было обнаружено, что в большинстве случаев отслоилось больше чем 30% сетчатки, что подтверждает успешную субретинальную доставку.
Антитела.
В качестве первичных антител использовали: анти-Rdh12 кроличье поликлональное антитело (CSP), специфичное к белку мыши (к 252SPFFKSTSQGAQ263, SEQ ID NO: 4), и анти-RDH12 моноклональное антитело мыши (2С9), специфичное к белку человека (к C-284DCKRTWVSPRARNNKT299; SEQ ID NO: 5) (Kurth et al. 2007); анти-RHO моноклональное антитело мыши (1D4) (MacKenzie et al. 1984); анти-RHO поликлональное антитело кролика, полученное к денатурированному белку; и поликлональное антитело кролика к красному/зеленому опсину колобочек (Millipore кат. № АВ5405).
Анализ иммуноблоттингом.
Белки в гомогенатах сетчатки разделяли с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, переносили на нитроцеллюлозные мембраны, которые затем блокировали, инкубировали с первичным антителом в течение ночи, промывали, инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с щелочной фосфатазой, и проводили определение с использованием 5-бром-4-хлор-3'-индолилфосфат п-толуидин и нитросиний хлорид тетразолия.
Гистология и иммунофлюоресценция.
Мышей умерщвляли, оценивали ориентацию глаз, затем их энуклеировали. Для криосрезов хрусталик и передние сегменты были удалены, глаза быстро фиксировали 4% параформальдегидом, промывали ФСБ, переносили в сахарозу/ОКТ, мгновенно замораживали и делали срезы толщиной 10 мкм. Для подготовки криозамещения целые глаза мгновенно замораживали в изопентане, охлажденном сухим льдом, в течение 30 с а затем переносили в метанол, охлажденный сухим льдом, содержащий 3% ледяной уксусной кислоты. Глаза инкубировали при 80°С в течение 48 ч, затем в течение ночи при -20°С, погружали в парафин и делали срезы толщиной 6 мкм. Парафиновые срезы депарафинизировали, и получали ан
- 7 044520 тигены путем инкубации в 1 мМ ЭДТА, 0,05% Твин 20, рН 8,0, при 90°С в течение 30 мин перед иммуномечением, как указано ниже. Вкратце, поперечные срезы сетчатки промывали ФСБ и просачивали ФСБ-Т (0,3% Triton Х-100); блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином, 10% нормальной козьей сывороткой и 0,3% Тритон Х-100; и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°С, промывали, затем инкубировали с конъюгированными с флуорофором вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Срезы накрывали покровным стеклом с использованием гелевой гистологической среды ProLong Gold, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; Invitrogen), и визуализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM6000.
Запись ЭРГ.
ЭРГ выполняли, как описано ранее (Thompson, 2012), с использованием системы записи Espion e2 (Diagnosys, Лоуэлл, Массачусетс). Вкратце, мышей адаптировали к темноте в течение ночи и анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (93 мг/кг) и ксилазина (8 мг/кг). Зрачки расширяли местным применением тропикамида (0,5%). Температуру тела поддерживали при 37°С с помощью электрогрелки. ЭРГ роговицы записывали для обоих глаз с использованием петель из золотой проволоки с местной анестезией 0,5% тетракаином и каплей 2% метилцеллюлозы для гидратации роговицы. Золотая проволочная петля, помещенная во рту, использовалась в качестве контроля, а заземляющий электрод был на хвосте. Протокол ЭРГ состоял из регистрации адаптированных к темноте (сумеречных) реакций на короткие белые вспышки (-2,31 log кд.с.м-2 для В-волн только палочек; 1,09 log кд.с.м-2 для А- и В-волн комбинированных палочек-колбочек). Адаптированные к свету (дневные) ЭРГ записывали через 10 мин после адаптации к белому фону 32 log кд.с.м-2, подавляющему палочки, в ответ на вспышки с интенсивностью 1,09 log кд.с.м-2 (для В-волн только колбочек). Ответы усиливали с кратностью 1000 при 1,251000 Гц, и оцифровывали при частоте 2000 Гц. Для удаления шума линии 60 Гц был использован режекторный фильтр. Ответы усреднялись с помощью компьютера и записывались с интервалами от 3 до 60 с в зависимости от интенсивности стимула. Для статистического анализа использовали двусторонний tкритерий Стьюдента, чтобы определить, значительно ли отличались амплитуды ЭРГ обработанных глаз от необработанных.
Анализ индуцированного светом повреждения.
Мышам-альбиносам Rdh12-/- инъецировали в один глаз AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3x109 вг), или сопоставимый объем ФСБ, и при этом контралатеральные глаза оставались неинъецироваными. Через 6 недель после инъекции был проведен анализ ЭРГ и количественный анализ сумеречных ответов, как описано выше. Через неделю мышей адаптировали к темноте в течение ночи, их зрачки расширяли тропикамидом (0,5%), и затем их помещали в коробку со светом в отдельные прозрачные отсеки. Мышей подвергали воздействию 5000 люкс в течение 2 ч, а затем их возвращали в виварий (12 ч тьма/12 ч свет (<20 люкс)) на 7 дней, после чего повторяли анализ ЭРГ. Процент исходного ответа при ЭРГ, оставшегося после светового повреждения, рассчитывали для каждого глаза, и на график наносили средние значения со среднеквадратическими ошибками. Двухсторонние парные проверки по t-критерию Стьюдента использовали для определения того, значительно ли амплитуды ЭРГ в обработанных глазах отличались от необработанных глаз.
Оптическая когерентная томография.
Мышей анестезировали, а зрачки расширяли 0,5% тропикамидом. Система оптической когерентной томографии (ОКТ) в спектральной области (система Bioptigen Envisu R2200 SD-OCT (Дарем, Северная Каролина, США)) с размером объемного анализа 1,4x1,4 мм была нацелена на головку зрительного нерва. Смазывающие капли Systane (Alcon) использовались на протяжении всего процесса визуализации.
Анализ содержания ретиноидов.
Полностью-транс-ретиналь и 11-цис-ретиналь в глазах мыши были извлечены с использованием модификации ранее описанного способа (Bligh and Dyer, 1959). Шестинедельные мыши после инъекции были адаптированы к темноте в течение ночи, затем в тускло-красном свете, подвергнуты эвтаназии путем передозировки СО2, и глаза были энуклеированы и заморожены в жидком N2. В тусклом красном свете и на льду каждый глаз гомогенизировали в 1 мл смеси хлороформ:метанол:гидроксиламин (2 М) (3:6:1) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем добавляли 200 мкл хлороформа и 240 мкл воды, и каждый образец встряхивали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин. Нижнюю фазу собирали, растворитель выпаривали в атмосфере азота и образец растворяли в гексане. Ретиноиды в экстрактах идентифицировали и определяли количественно с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя модуль разделения Waters Alliance и матричный фотодиодный детектор с колонкой Supelcosil LC-31 (25 см на 4,6 мм на 3 мкм), с заполнением 5% 1,4диоксаном в гексане. Идентификация пиков была выполнена путем сравнения с временем удержания стандартных соединений и оценки максимумов длины волны. Количественный анализ выполняли путем сравнения площадей пиков при 347 и 351 нм для син- и анти-11-цис-ретиналь оксима соответственно, и при 357 и 361 нм для син- и анти-полностью-транс-ретиналь-оксима соответственно (Kurth et al. др. 2007).
Анализ редуктазной активности сетчатки.
- 8 044520
Гомогенаты сетчаток мышей анализировали на редуктазную активность сетчатки спустя 6 недель после инъекции. Адаптированных к свету мышей умерщвляли и каждую сетчатку гомогенизировали отдельно в 125 мкл 0,25 М сахарозы, 25 мМ трис-ацетата, рН 7, 1 мМ дитиотреитола. Гомогенаты центрифугировали при 1000 х g в течение 5 мин для удаления неразрушенных клеток, и затем супернататы обрабатывали ультразвуком с помощью микрокончикового зонда (30 раз в течение 1 с каждый) на льду. Концентрации белка определяли модификацией процедуры Лоури (Peterson et al. 1977), а уровни RDH12 оценивали вестерн-блоттингом. Подобные образцы объединяли и 20 мкг каждого объединенного лизата анализировали (в трех повторностях) в буфере, содержащем 200 мкМ полностью-транс-ретиналь и 200 мкМ НАДФН в буфере HEPES (рН 8); реакционные смеси инкубировали в течение 0-45 мин на водяной бане при 37°С (температуре реакции, которая сводила к минимуму термическую изомеризацию ретиноидных субстратов, а также инактивацию ферментов). Формирование полностью-транс-ретинола определяли количественно с помощью анализа ВЭЖХ с обычной фазой в сравнении с известными стандартами (Chrispell et al. 2009).
Пример 1. AAV-опосредованная экспрессия RDH12 человека.
Было разработано и испытано множество векторов для заместительной терапии RDH12. Оптимальная векторная конструкция RDH12 продемонстрирована на фиг. 2А. Она содержит кДНК RDH12 человека под контролем промоторного фрагмента родопсин-киназы (GRK1). Конструкцию упаковывали в серотип AAV2/5. Было продемонстрировано, что капсид AAV серотипа 5 опосредует трансдукцию фоторецепторов, но с более медленной кинетикой и менее выраженной экспрессией по сравнению с капсидом AAV8 (Yang et al. 2002; Lotery et al. 2003; Allocca et al. 2007; Lebherz et al. 2008). Экспрессию белка RDH12 человека в сетчатке мыши через 6 недель после субретинальной инъекции AAV2/5hGRK1p.hRDH12 (1,3х109 вг) оценивали с использованием антител, специфичных к Rdh12 мыши или белкам RDH12 человека. Обусловленные вектором уровни RDH12 человека, по-видимому, примерно сопоставимы с количеством Rdh12 мыши (фиг. 2В). Непрямая иммунофлуоресцентная визуализация на срезах сетчатки была использована для оценки нативного Rdh12 мыши и рекомбинантного RDH12 человека с использованием видоспецифических антител. Локализация эндогенного и рекомбинантного RDH12, по-видимому, идентична, что указывает на то, что белок процессируется нормально (фиг. 2С).
Способность сетчатки мышей Rdh12’/’ уменьшать уровни экзогенных ретинальдегидов значительно снижена по сравнению с мышами дикого типа (Chri spell et al. 2009). Спустя шесть недель после субретинальной инъекции мышам Rdh12’/’ 1,3х109 вг AAV2/5-hGRK1p.hRDH12, анализировали гомогенаты сетчатки на in vitro редуктазную активность сетчатки. Формирование полностью-транс-ретинола определяли количественно с использованием анализа ВЭЖХ с обычной фазой. Каждая точка на графике представляет собой среднее ± среднеквадратическая ошибка для минимум 5 независимых экспериментов, где сетчатки из от 3 до 5 мышей объединяли и анализировали в трех повторностях. Начальные скорости формирования полностью-транс-ретинола в сетчатках из неинъецированных мышей Rdh12’/’ и C57BL/6J составляли 0,013 пмоль мин-1 мкг белка-1, и 0,071 пмоль мин-1 мкг белка-1, соответственно (фиг. 3А). Остаточная активность, присутствующая у мышей Rdhl2, отражает присутствие других изоформ RDH, которые способны уменьшать уровни полностью-транс-ретиналя (Rattner et al. 2000; Haeseleer et al. 2002). У мышей Rdh12-/-, инъецированных AAV2/5-hGRK1p.hRDH12, скорость формирования полностью-транс-ретинола, составляющая 0,046 пмоль мин-1 мкг белка-1 была значительно больше чем у мышей Rdh12-/-, инъецированных ФСБ (0,016 пмоль мин-1 мкг белка-1). Восстановление редуктазной активности сетчатки (около 50%) согласуется с частичной трансдукцией сетчатки (около 30%) и указывает на то, что вектор восстанавливает обычные уровни активности в трансдуцированных фоторецепторах. Трансген экспрессировался в течение 12 месяцев (наиболее длительный исследованный момент времени). Иммунофлуоресцентное мечение продемонстрировало степень трансдукции сетчатки и рекомбинантной экспрессии RDH12 у мыши Rdh12-/-, оцененные спустя 16 недель после инъекции, покрывающие примерно одну треть поверхности сетчатки (фиг. 3В).
Влияние AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 на чувствительность к повреждениям, вызванным светом, оценивали на мышах-альбиносах Rdh12-/-, которым инъецировали в один глаз 1,3 х 109 вг или равный объем ФСБ, и которые не получали лечения для контралатерального глаза. Анализ ЭРГ сумеречной активности сетчатки (отдельно для палочек и комбинированно для палочек-колбочек) проводили за 1 неделю до и спустя 1 неделю после воздействия на мышей уровней света, которые вызывают значительное повреждение сетчатки у животных-альбиносов (5000 люкс в течение 2 ч). Процент активности сетчатки, остающейся в обработанных вектором глазах, был значительно выше, чем оставшийся в необработанных глазах (р < 0,0168) (фиг. 4). Напротив, у контрольных животных, которым инъецировали ФСБ, процент сумеречной активности сетчатки, остающейся в неинъецированных глазах, не был значительно выше, чем в необработанных глазах (р > 0,2255). Эти данные согласуются с опосредованной AAV2/5hGRK1p.hRDH12 защитой от повышенной чувствительности к вызванному светом повреждению, связанной с дефектом RDH12.
Токсичность вектора оценивали по прямому влиянию активности RDH12 человека на метаболизм ретиноидов и по косвенным воздействиям на структуру и функцию сетчатки, как описано в следующем
- 9 044520 абзаце.
Широкая субстратная специфичность RDH12, которая позволяет уменьшить уровни как 11-цисретиналя, так и полностью-транс-ретиналя, создает потенциал для сверхэкспрессии или неправильной локализации рекомбинантного белка, что негативно влияет на функцию цикла превращений родопсина. ВЭЖХ-анализ содержания ретиноидов использовали для оценки активности цикла превращений родопсина в глазах мышей Rdh12-/-, которым инъецировали AAV2/5-hGRK1p.hRDH12, или ФСБ, или неинъецированных контролей C57BL/6J. Анализ ретиноидов через 6 недель после субретинальной инъекции AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3x109 вг) мышам Rdh12πродемонстрировал, что экспрессия hRDH12 не влияет значительно на установившиеся уровни 11-цис-ретиналя в сетчатке (фиг. 5А). Иллюстративная хроматограмма демонстрирует различные контроли с указанным временем элюирования для различных ретиноидов. Общие уровни 11-цис-ретиналя и полностью-транс-ретиналя представляют собой средние значения ± среднеквадратическая ошибка для минимум 5 независимых экспериментов (фиг. 5В, С). Ответы ЭРГ активности сетчатки были измерены у мышей C57BL/6J и Rdh12-/-, которые получили 1,3x109 вг AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 и содержались в виварии (12 ч тьма/12 ч свет (<20 lux)). Сумеречные (только для палочек, стимул -2,3 log кд.с.м-2), комбинированные для палочек-колобочек (стимул 1,09 log кд.с.м-2 стимул), и дневные (реакции, опосредованные колбочками, стимул 1,09 log кд.с.м-2) ЭРГ от репрезентативного животного в каждой группе лечения, измеренные спустя 6 недель после инъекции, не продемонстрировали значительного влияния экспрессии RDH12 человека на функцию сетчатки (фиг. 6).
Неправильная локализация родопсина и опсина колбочек является хорошо охарактеризованным показателем снижения жизнеспособности фоторецепторных клеток (Adamian et al. 2006; Tumey et al. 2007; Brunner et al. 2010; Lopes et al. 2010). Иммуногистохимическую локализацию родопсина и красного/зеленого опсина оценивали у мышей Rdh12-/-, неинъецированных или инъецированных AAV2/5hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 вг). У мышей, демонстрирующих устойчивую экспрессию трансгена, не наблюдали снижения уровней экспрессии опсина или признаков неправильной локализации опсина палочек и колбочек спустя 16 недель после обработки; структура сетчатки оставалась нетронутой спустя 54 недели после инъекции (фиг. 7).
Анализ с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) мышей C57BL/6J и Rdh12-/-, оцененных спустя 54 недели после введения AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (2 x 109 вг), не выявил серьезных изменений в отслоении сетчатки на широкой площади, включая обе стороны зрительного нерва. Структура сетчатки была стабильной в течение по меньшей одного года после инъекции при сравнении с неинъецированными контралатеральными глазами (фиг. 8).
Пример 2. Повреждение сетчатки, вызванное AAV2/8.
Повреждение сетчатки у мышей, инъецированных AAV2/8-hGRK1p.hRDH12.
Продемонстрировано, что капсид, полученный из серотипа AAV 8, обеспечивает эффективную и надежную трансдукцию фоторецепторных клеток (Allocca et al. 2007; Natkunarajah et al. 2008; Vandenberghe et al. 2011; Vandenberghe et al. 2013). Первоначальные исследования проводили с серотипом AAV2/8, несущим векторную конструкцию, описанную выше. Мышей Rdh12-/- обрабатывали с помощью субретинальной инъекции AAV2/8-hGRK1p.hRDH12 в дозах 10 -10 вирусных геномов (вг), что в результате давало устойчивую экспрессию рекомбинантного белка RDH12 человека. Однако в инъецированных глазах возникло значительное повреждение сетчатки, начавшееся уже спустя 3 недели после инъекции и почти во всех случаях спустя 6 недель после инъекции. Инфильтрация макрофагов наблюдалась в большинстве случаев вследствие наличия клеток CD68+ (фиг. 9). Повреждение сетчатки не смягчалось системным введением мышам Rdh12-/- циклоспорина (Borel et al. 1976), непрерывно с раннего возраста до момента усыпления, что указывает на то, что иммунные ответы против вектора или трансгена не были причиной, вызывающей повреждение. Эта версия согласуется с результатами, полученными для мышей дикого типа C57BL/6J, которым инъецировали конструкции, кодирующие либо RDH12 человека (AAV2/8-hGRK1p.hRDH12), либо Rdh12 мыши (AAV2/8-hGRK1p.mRdh12), у которых значительное истончение сетчатки и инфильтрация макрофагов также произошла спустя 6 недель после инъекции.
- 10 044520
Список литературы
ADAMIAN М, PAWLYK BS, HONG DH, BERSON EL. (2006). Rod and cone opsin mislocalization in an autopsy eye from a carrier of X-linked retinitis pigmentosa with a Gly436Asp mutation in the RPGR gene. Am J Ophthalmol 142, 515-8.
ACLAND GM, AGUIRRE GD, RAY J, ZHANG Q, et al. (2001). Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness. Nat Genet 28, 92-5.
ALEXANDER JJ, UMINO Y, EVERHART D, CHANG B, et al. (2007). Restoration of cone vision in a mouse model of achromatopsia. Nat Med 13, 685-7.
ALI RR, SARRA GM, STEPHENS C, ALWIS MD, et al. (2000). Restoration of photoreceptor ultrastructure and function in retinal degeneration slow mice by gene therapy. Nat Genet 25,306-10.
ALLOCCA M, MUSSOLINO C, GARCIA-HOYOS M, SANGES D, et al. (2007). Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol 81, 11372-80.
BAINB RIDGE JW, SMITH AJ, BARKER SS, ROBBIE S, et al. (2008). Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358, 2231-9.
BELTRAN WA, CIDECIYAN AV, LEWIN AS, IWABE S, et al. (2012). Gene therapy rescues photoreceptor blindness in dogs and paves the way for treating human X-linked retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci USA 109, 2132-7.
BEN-SHABAT S, PARISH CA, HASHIMOTO M, LIU J, et al. (2001). Fluorescent pigments of the retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration. Bioorg Med Chern Lett 11, 1533-40.
BELYAEVA OV, KORKINA OV, STETSENKO AV, KIM T, et al. (2005). Biochemical properties of purified human retinol dehydrogenase 12 (RDH12): catalytic efficiency toward retinoids and C9 aldehydes and effects of cellular retinol-binding protein type I (CRB PI) and cellular retinaldehyde-binding protein (CRALBP) on the oxidation and reduction of retinoids. Biochemistry 44, 7035-47.
BLIGH EG, DYER WJ. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37, 911-7.
BOREL JF, FEURER C, GUBLER HU, STAHELIN H. (1976). Biological effects of cyclosporin A: a new antilymphocytic agent. Agents Actions 6, 468-75.
BRUNNER S, SKOSYRSKI S, KIRSCHNER-SCHWABE R, KNOBELOCH KP, et al. (2010). Cone versus rod disease in a mutant Rpgr mouse caused by different genetic backgrounds. Invest Ophthalmol Vis Sci, 51, 1106-15.
CARLSON NB, KURTZ D, HEATH DA, HINES C. in: Clinical Procedures for Ocular Examination. 3rd Ed. Appleton & Lange, Norwalk, CT; 1990:63-77.
CHEN C, THOMPSON DA, KOUTALOS Y. (2012). Reduction of all-trans-retinal in vertebrate rod photoreceptors requires the combined action of RDH8 and RDH12. J Biol Chern, 287, 24662-70.
CHEN Y, OKANO K, MAEDA T, CHAUHAN V, et al. (2012). Mechanism of all-transretinal toxicity with implications for Stargardt disease and age-related macular degeneration. J
- 11 044520
Biol Chem 287, 5059-69.
CHRISPELL JD, FEATHERS KL, KANE MA, KIM, CY, et al. (2009). Rdhl2 activity and effects on retinoid processing in the murine retina. J Biol Chem 284, 21468-77.
CIDECIYAN AV, ALEMAN TS, BOYE SL, SCHWARTZ SB, et al. (2008). Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proc Natl Acad Sci USA 105, 151 12-7.
DEN HOLLANDER AI, ROEPMAN R, KOENEKOOP RK, CREMERS FP. (2008). Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Prog Retin Eye Res 27, 391-419.
FLOTTE TR, SOLOW R, OWENS RA, AFIONE S, et al. (1992). Gene expression from adeno-associated virus vectors in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 7, 349-56.
FLOTTE TR, AFIONE SA, SOLOW R, DRUMM ML, et al. (1993). Expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from a novel adeno-associated virus promoter. J Biol Chem 268, 3781-90.
HAESELEER F, JANG GF, IMANISHI Y, DRIESSEN CA, et al. (2002). Dual-substrate specificity short chain retinol dehydrogenases from the vertebrate retina. J Biol Chem 277, 45537-46.
HERMONAT PL, MUZYCZKA N. (1984). Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 6466-70.
JANECKE AR, THOMPSON DA, UTERMANN G, BECKER C, et al. (2004). Mutations in RDH12 encoding a photoreceptor cell retinol dehydrogenase cause childhood-onset severe retinal dystrophy. Nat Genet 36, 850-854.
JOHNSON DD. Deafness and Vision Disorders: Anatomy and Physiology, Assessment Procedures, Ocular Anomalies, and Educational Implications, Charles C. Thomas Publisher; 1999.
KELLER B, ADAMSKI J. (2007). RDH12, a retinol dehydrogenase causing Leber's congenital amaurosis, is also involved in steroid metabolism. J Steroid Biochem Mol Biol 104, 190-4.
KHANI SC, PAWLYK BS, BULGAKOV OV, KASPEREK E, et al. (2007). AAVmediated expression targeting of rod and cone photoreceptors with a human rhodopsin kinase promoter. Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 3954-61.
KOENEKOOP RK. (2004). An overview of Leber congenital amaurosis: a model to understand human retinal development. Surv Ophthalmol 49, 379-98.
KOMAROMY AM, ALEXANDER JJ, ROWLAN JS, GARCIA MM, et al. (2010). Gene therapy rescues cone function in congenital achromatopsia. Hum Mol Genet 19, 2581-93.
KUMARAN N, MOORE AT, WELEBER RG, MICHAELIDES M. (2017). Leber congenital amaurosis/early-onset severe retinal dystrophy: clinical features, molecular genetics and therapeutic interventions. Br J Ophthalmol 101, 1147-1154.
KURTH I, THOMPSON DA, ROTHER K, FEATHERS KL, et al. (2007). Targeted
- 12 044520 disruption of the murine retinal dehydrogenase gene Rdhl2 does not limit visual cycle function. Mol Cell Biol 27, 1370-9.
LEBHERZ C, MAGUIRE A, TANG W, BENNETT J, et al. (2008). Novel AAV serotypes for improved ocular gene transfer. J Gene Med 10, 375-82.
LEE SA, BELYAEVA OV, KEDISHVILI NY. (2008). Effect of lipid peroxidation products on the activity of human retinol dehydrogenase 12 (RDH12) and retinoid metabolism. Biochim Biophys Acta 1782, 421-5.
LHERITEAU E, LIBEAU L, STIEGER K, DESCHAMPS JY, et al. (2009). The RPGRIP 1 -deficient dog, a promising canine model for gene therapy. Mol Vis 15, 349-61.
LOPES VS, UMENO D, KHANOBDEE K, SONG X, et al. (2010). Dysfunction of heterotrimeric kinesin-2 in rod photoreceptor cells and the role of opsin mislocalization in rapid cell death. Mol Biol Cell 21, 4076-88.
LOTERY AJ, YANG GS, MULLINS RF, RUSSELL SR, et al. (2003). Adeno-associated virus type 5: transduction efficiency and cell-type specificity in the primate retina. Hum Gene Ther 14, 1663-71.
MACKAY DS, DEV BORMAN A, MORADI P, HENDERSON RH, et al. (2011). RDH12 retinopathy: novel mutations and phenotypic description. Mol Vis 17, 2706-16.
MAEDA A, MAEDA T, IMANISHI Y, SUN W, et al. Retinol dehydrogenase (RDH12) protects photoreceptors from light-induced degeneration in mice. J Biol Chem 281, 37697-704.
MAGUIRE AM, SIMONELLI F, PIERCE EA, PUGH EN, JR., et al. (2008). Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358, 2240-8.
MARCHETTE LD, THOMPSON DA, KRAVTSOVA M, NGANSOP TN, et al. (2010). Retinol dehydrogenase 12 detoxifies 4-hydroxynonenal in photoreceptor cells. Free Radic Biol Med 48, 16-25.
MCLAUGHLIN SK, COLLIS P, HERMONAT PL, MUZYCZKA N. (1988). Adenoassociated virus general transduction vectors: analysis of proviral structures. J Virol 62, 1963-73.
MACKENZIE D, ARENDT A, HARGRAVE P, MCDOWELL JH, et al. (1984). Localization of binding sites for carboxyl terminal specific anti-rhodopsin monoclonal antibodies using synthetic peptides. Biochemistry 23, 6544-9.
MACLAREN RE, GROPPE M, BARNARD AR, COTTRIALL CL, et al. (2014). Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet 383, 1129-37.
MUZYCZKA N. (1992). Use of adeno-associated virus as a general transduction vector for mammalian cells. Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129.
NATKUNARAJAH M, TRITTIBACH P, MCINTOSH J, DURAN Y, et al. (2008). Assessment of ocular transduction using single-stranded and self-complementary recombinant adeno-associated virus serotype 2/8. Gene Ther 15, 463-7.
NISHIGUCHI KM, CARVALHO LS, RIZZI M, POWELL K, et al. (2015). Gene therapy restores vision in rdl mice after removal of a confounding mutation in Gprl79. Nat Commun 6, 6006.PANG JJ, LEI L, DAI X, SHI W, et al. (2012). AAV-mediated gene therapy in
- 13 044520 mouse models of recessive retinal degeneration. Curr Mol Med 12, 316-30.
PAWLYK BS, SMITH AJ, BUCH PK, ADAMIAN M, et al. (2005). Gene replacement therapy rescues photoreceptor degeneration in a murine model of Leber congenital amaurosis lacking RPGRIP. Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 3039-45.
PAWLYK BS, BULGAKOV OV, LIU X, XU X, et al. (2010). Replacement gene therapy with a human RPGRIP1 sequence slows photoreceptor degeneration in a murine model of Leber congenital amaurosis. Hum Gene Ther 21, 993-1004.
PERRAULT I, HANEIN S, GERBER S, BARBET F, et al. (2004). Retinal dehydrogenase 12 (RDH12) mutations in leber congenital amaurosis. Am J Hum Genet 75, 63946.
PETERSON GL. (1977). A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal Biochem 83, 346-56.
RATTNER A, SMALLWOOD PM, NATHANS J. (2000). Identification and characterization of all-trans-retinol dehydrogenase from photoreceptor outer segments, the visual cycle enzyme that reduces all-trans-retinal to all-trans-retinol. J Biol Chern 275, 11034-43.
SAMULSKI RJ, CHANG LS, SHENK T. (1989). Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol 63, 3822-8.
SCHUSTER A, JANECKE AR, WILKE R, SCHMID E, et al. (2007). The phenotype of early-onset retinal degeneration in persons with RDH12 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 1824-31.
SPARROW JR. (2010). Bisretinoids of RPE lipofuscin: trigger for complement activation in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol 703, 63-74.
SUN X, PAWLYK B, XU X, LIU X, et al. (2010). Gene therapy with a promoter targeting both rods and cones rescues retinal degeneration caused by AIPL1 mutations. Gene Ther 17, 117-31.
TAN MH, SMITH AJ, PAWLYK B, XU X, et al. (2009). Gene therapy for retinitis pigmentosa and Leber congenital amaurosis caused by defects in AIPL1 : effective rescue of mouse models of partial and complete Aipll deficiency using AAV2/2 and AAV2/8 vectors. Hum Mol Genet.
THOMPSON DA, GAL A. (2003). Vitamin A metabolism in the retinal pigment epithelium: genes, mutations, and diseases. Prog Retin Eye Res 22, 683-703.
THOMPSON DA, JANECKE AR, LANGE J, FEATHERS KL, et al. (2005). Retinal degeneration associated with RDH12 mutations results from decreased 11-cis retinal synthesis due to disruption of the visual cycle. Hum Mol Genet 14, 3865-75.
THOMPSON DA, KHAN NW, OTHMAN MI, CHANG B, et al. (2012). Rd9 is a naturally occurring mouse model of a common form of retinitis pigmentosa caused by mutations in RPGR-ORF15. PLoS One 7, e35865.
TRATSCHIN JD, WEST MH, SANDBANK T, CARTER BJ. (1984a). A human parvovirus, adeno-associated virus, as a eucaryotic vector: transient expression and
-
Claims (5)
- encapsidation of the procaryotic gene for chloramphenicol acetyltransferase. Mol Cell Biol 4, 2072-81.TRATSCHIN JD, MILLER IL, CARTER BJ. (1984b). Genetic analysis of adenoassociated virus: properties of deletion mutants constructed in vitro and evidence for an adenoassociated virus replication function. J Virol 51, 611-9.TRATSCHIN JD, MILLER IL, SMITH MG, CARTER BJ. (1985). Adeno-associated virus vector for high-frequency integration, expression, and rescue of genes in mammalian cells. Mol Cell Biol 5, 3251-60.TURNEY C, CHONG NH, ALEXANDER RA, HOGG CR, et al. (2007). Pathological and electrophysiological features of a canine cone-rod dystrophy in the miniature longhaired dachshund. Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 4240-9.VANDENBERGHE LH, BELL P, MAGUIRE AM, CEARLEY CN, et al. (2011).Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med3, 88ra54.VANDENBERGHE LH, BELL P, MAGUIRE AM, XIAO R, et al. (2013). AAV9 targets cone photoreceptors in the nonhuman primate retina. PLoS One 8, e53463.XIAO X, LI J, SAMULSKI RJ. (1998). Production of high-titer recombinant adenoassociated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol 72, 2224-32.YANG GS, SCHMIDT Μ, YAN Z, LINDBLOOM JD, et al. (2002). Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol 76, 7651-60.YOUNG JE, VOGT T, GROSS KW, KHANI SC. (2003). A short, highly active photoreceptor-specific enhancer/promoter region upstream of the human rhodopsin kinase gene. Invest Ophthalmol Vis Sci 44, 4076-85.WELEBER RG, FRANCIS PJ, TRZUPEK KM, BEATTIE C. (2004). Leber CongenitalAmaurosis. In: PAGON RA, ADAM MP, ARDINGER HH, WALLACE SE, et al.GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2017.[updated 2013 May 2].WONDISFORD FE, USALA SJ, DECHERNEY GS, CASTREN M, et al. (1988).Cloning of the human thyrotropin beta-subunit gene and transient expression of biologically active human thyrotropin after gene transfection. Mol Endocrinol 2, 32-9.Каждый из источников, процитированных в данном документе, тем самым включен посредством ссылки в полном объеме или как соответствующая часть, что будет очевидно из контекста цитирования.Следует понимать, что хотя заявленный объект изобретения был описан вместе с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема данного заявленного объекта изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ лечения субъекта-человека, который имеет офтальмологическую патологию вследствие одной или более мутаций с потерей функции в гене, кодирующем белок ретинол-дегидрогеназу 12 (RDH12), включающий введение в по меньшей мере один глаз субъекта аденоассоциированного вирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, причем нуклеиновая кислота содержит ДНК RDH12 человека, и причем ДНК RDH12 человека кодирует белок, который по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 99% идентичен полноразмерной SEQ ID NO: 2, причем аденоассоциированный вирусный вектор представляет собой AAV-2, серотип-5 (AAV2/5), и в котором офтальмологическая патология представляет собой врожденный амавроз Лебера (ВАЛ).
- 2. Способ по п.1, в котором ДНК RDH12 находится под экспрессионным контролем промотора родопсин-киназы 1 (hGRK1) человека.
- 3. Способ по п.2, в котором промотор hGRK1 содержит SEQ ID NO: 3.
- 4. Способ по п.3, в котором промотор hGRK1 по существу состоит из SEQ ID NO: 3.
- 5. Способ по п.1, в котором ДНК RDH12 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 60 или 70% идентична SEQ ID NO: 1.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/586,624 | 2017-11-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044520B1 true EA044520B1 (ru) | 2023-08-31 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tan et al. | Gene therapy for retinitis pigmentosa and Leber congenital amaurosis caused by defects in AIPL1: effective rescue of mouse models of partial and complete Aipl1 deficiency using AAV2/2 and AAV2/8 vectors | |
| Mihelec et al. | Long-term preservation of cones and improvement in visual function following gene therapy in a mouse model of leber congenital amaurosis caused by guanylate cyclase-1 deficiency | |
| JP6827320B2 (ja) | ＬＣＡ−８及び進行性ＲＰを治療するための組換えＡＡＶ−Ｃｒｕｍｂｓホモログ組成物及び方法 | |
| Carvalho et al. | Long-term and age-dependent restoration of visual function in a mouse model of CNGB3-associated achromatopsia following gene therapy | |
| US10040835B2 (en) | Vectors encoding rod-derived cone viability factor | |
| Han et al. | Genomic DNA nanoparticles rescue rhodopsin-associated retinitis pigmentosa phenotype | |
| US20230190884A1 (en) | Viral vectors comprising rdh12 coding regions and methods of treating retinal dystrophies | |
| EP4331590A2 (en) | Nuclear factor erythroid 2-like 2 (nrf2) for use in treatment of age-related macular degeneration | |
| Stieger et al. | Adeno-associated virus mediated gene therapy for retinal degenerative diseases | |
| US20160256571A1 (en) | Invention | |
| Bouaita et al. | Downregulation of apoptosis-inducing factor in Harlequin mice induces progressive and severe optic atrophy which is durably prevented by AAV2-AIF1 gene therapy | |
| JP2011512145A (ja) | 遺伝子治療による眼疾患の処置方法 | |
| Feathers et al. | Development of a gene therapy vector for RDH12-associated retinal dystrophy | |
| JP2019524090A (ja) | Ｒｄｈ１２が関与する疾患及び疾病を治療する方法及び組成物 | |
| JP2020527335A (ja) | 眼疾患のための遺伝子療法 | |
| US11793887B2 (en) | Gene therapy for treating peroxisomal disorders | |
| EA044520B1 (ru) | Вирусные векторы, содержащие области, кодирующие rdh12, и способы лечения дистрофий сетчатки | |
| US20220088222A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of degenerative ocular diseases | |
| US20230065365A1 (en) | Elovl2 constructs for human gene therapy | |
| WO2023213817A1 (en) | Gene therapy for gyrate atrophy of the choroid and retina | |
| WO2024052413A1 (en) | Beta-hexosaminidase vectors | |
| JP2023513208A (ja) | 神経変性の発症を遅延させるかまたは神経変性を処置するためのメタボロームのリプログラミング | |
| JP2023517929A (ja) | Ｎｍｎａｔ１関連網膜変性に対する遺伝子療法 | |
| Minella | The Leber Congenital Amaurosis CEP290 Cat Model: Working Towards a Cure |