JP2023513208A - 神経変性の発症を遅延させるかまたは神経変性を処置するためのメタボロームのリプログラミング - Google Patents

神経変性の発症を遅延させるかまたは神経変性を処置するためのメタボロームのリプログラミング Download PDF

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Abstract

本開示は、細胞及び組織の生存及び機能の改善をもたらす、１つのある特定の網膜細胞型及び神経細胞型における代謝をリプログラミングするための方法及び化合物に関する。特に、本開示は、様々な神経変性状態、特に失明の原因となる状態における細胞の代謝及び生存をリプログラミングするために、ＰＧＣ１α／Ｐｇｃ１αもしくはＮＲＦ２／Ｎｒｆ２を増加させるか、またはＨＩＦ／ＨｉｆもしくはＫＥＡＰ１／Ｋｅａｐ１を阻害することに関する。

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月７日出願の米国仮特許出願第６２／９７１，３７０号の優先権を主張するものであり、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＵ５４ＯＤ０２０３５１、Ｒ２４ＥＹ０２８７５８、Ｒ０１ＡＲ０５９７０３、Ｒ２４ＥＹ０２７２８５、Ｒ０１ＥＹ０１８２１３、Ｒ０１ＥＹ０２４６９８、Ｒ０１ＥＹ０２６６８２、Ｕ０１ＥＹ０３０５８０、及びＲ２１ＡＧ０５０４３７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本開示は、組織の生存及び機能の改善をもたらす、１つのある特定の網膜細胞型及び神経細胞型における代謝をリプログラミングするための方法及び化合物に関する。特に、本開示は、様々な神経変性状態、特に失明の原因となる状態における細胞及び組織の代謝及び生存をリプログラミングするために、ＰＧＣ１α／Ｐｇｃ１αもしくはＮＲＦ２／Ｎｒｆ２を増加させるか、またはＨＩＦ／ＨｉｆもしくはＫＥＡＰ１／Ｋｅａｐ１を阻害することに関する。
〔背景技術〕
失明の原因となる神経変性疾患は、処置選択肢が限られている。これらの疾患としては、網膜色素変性症、緑内障、加齢黄斑変性症、及び常染色体優性視神経萎縮症が挙げられる。
網膜色素変性症（ＲＰ）は、桿体光受容体の死滅を主に引き起こす７１を超える変異に起因する、最も一般的な遺伝性網膜ジストロフィーである。錐体はＲＰの原因となる変異によって直接死滅するわけではないが、錐体の死滅は常に桿体の死滅に続き（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ａｎｄ Ｍｉｒ．２０１８）、主要な桿体の死滅期の後に始まる（Ｐｕｎｚｏ，ｅｔ ａｌ．２００９）。人工網膜（ｄａ Ｃｒｕｚ，ｅｔ ａｌ．２０１６）またはＲＰＥ６５遺伝子治療（Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．２０１７）を使用した近年の進歩により、末期ＲＰ患者またはＲＰＥ６５変異を保有する患者にそれぞれ処置選択肢がもたらされている。単一遺伝子の増強または修復に焦点を当てたＲＰの遺伝子治療臨床試験は、仮に成功したとしても、その特定の遺伝子変異を保有する患者にのみ適用可能である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．２０１８）。したがって、全てのＲＰに共通する経路を標的とする、より一般的に適用可能な治療は、様々な桿体特異的変異に起因するＲＰの潜在的処置として役立つ可能性がある（Ｄｕｎｃａｎ，ｅｔ ａｌ．２０１８）。
緑内障は、７０００万を超える人々が罹患しており、全世界的に失明の原因となっている最も一般的な神経変性疾患である（Ｑｕｉｇｌｅｙ ａｎｄ Ｂｒｏｍａｎ ２００６）。網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性及び死滅は、緑内障及び常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）など、失明の原因となる神経変性疾患の一般的な特徴である。薬物は眼圧を下げ、ＲＧＣ死滅の速度を低下させることができるが、これらの処置は治癒をもたらさない。再言すると、単一遺伝子の増強または修復に焦点を当てた遺伝子治療臨床試験は、仮に成功したとしても、その特定の遺伝子変異を保有する患者にのみ適用可能である（Ｌａｍ，ｅｔ ａｌ．２０１０）。したがって、ＲＧＣ死滅の共通経路を標的とする、より一般的に適用可能な治療は、緑内障及び視神経萎縮症患者の潜在的処置として役立つ可能性がある。
したがって、更なる治療薬のみならず、ＲＰなどの網膜変性疾患を軽減するための、ならびにより広範には、緑内障、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー小体型認知症などの神経変性疾患、及び同様の神経変性状態または他の状態（神経細胞の生存を促進するための同化のアップレギュレーション及び異化のダウンレギュレーションから恩恵を受けるもの）における神経細胞の生存を促進するための、より広範に効果的な遺伝子治療が早急に必要とされている。
〔発明の概要〕
本開示は、全ての網膜色素変性症（ＲＰ）患者、緑内障患者、及び常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）患者を、それらの遺伝的背景にかかわらず、代謝平衡を回復させることによって処置する、予防する、及び／またはその発症を遅延させるための非遺伝子特異的方策を提供し、これにより、光受容体の死滅及び視力喪失を予防することができる。本開示は、失明の原因となる網膜変性疾患、例えば、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、及び緑内障、ならびに神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症の発症を遅延させるか、それらの疾患を治癒するか、処置するか、または予防するために、増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）もしくは赤血球系転写因子２関連転写因子（ＮＲＦ２）を過剰発現もしくは増加させるための、または低酸素誘導因子（ＨＩＦ）もしくはＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（ＫＥＡＰ１）を阻害するか、切除するか、もしくは減少させるための、組成物及び方法を提供する。
予防に関して、本発明の組成物は、失明の原因となるものを含む神経変性疾患の１つ以上の症状の発症を予防するために対象に投与することができる。一実施形態では、対象は、無症候性であり得る。
本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得るか、または対象に投与され得る。投与は、局所、静脈内、鼻腔内、または本明細書に記載の他の任意の適切な経路であり得る。本発明の組成物は、硝子体内注射、網膜下注射、または脈絡膜上注射によって投与され得る。
本開示の組成物及び方法を使用して、本明細書に記載の疾患を有するか、または発症するリスクがある対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に、本明細書に記載のタンパク質のうちの１つ以上をコードする導入遺伝子を含む組成物を投与することができる。組成物は、ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＰＧＣ１αをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＮＲＦ２をコードする。
更に、本開示の組成物及び方法を使用して、本明細書に記載の疾患を有するか、または発症するリスクがある対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に、核酸阻害剤、またはタンパク質のうちの１つ以上の阻害剤をコードする核酸、または本明細書に記載のタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ以上を標的とする核酸、を含む組成物を投与することができる。組成物は、ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＨＩＦに対するものである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＫＥＡＰ１に対するものである。
本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＰＧＣ１αを増加させる治療有効量の薬剤を投与することを含む方法を提供する。
更なる実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＮＲＦ２を増加させる治療有効量の薬剤を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２を増加させる薬剤は、ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２をコードする核酸である。
本開示はまた、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＰＧＣ１αをコードする核酸を含む治療有効量のウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＮＲＦ２をコードする核酸を含む治療有効量のウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＰＧＣ１αを増加させる治療有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。
更なる実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＮＲＦ２を増加させる治療有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＧＣ１α及び／またはＮＲＦ２をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＧＣ１α及び／またはＮＲＦ２をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換え型またはｒＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２血清型である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８血清型である。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞を標的とするプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、これらの標的細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子を含む治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子を含む治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２血清型である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８血清型である。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞を標的とするプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、これらの標的細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。
本明細書ではまた、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１を阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、タンパク質、核酸、小分子、化学物質、及びそれらの組み合わせの群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、アプタマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本開示はまた、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＨＩＦを阻害する核酸、またはＨＩＦを阻害するかもしくはＨＩＦを標的とする核酸をコードする核酸を含む治療有効量のウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＫＥＡＰ１を阻害する核酸、またはＫＥＡＰ１を阻害するかもしくはＫＥＡＰ１を標的とする核酸をコードする核酸を含む治療有効量のウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。
更なる実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＨＩＦを阻害するかまたはＨＩＦを標的とする治療有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＩＦを阻害する核酸、またはＨＩＦを阻害するかもしくはＨＩＦを標的とする核酸をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＨＩＦを阻害する核酸、またはＨＩＦを阻害するかもしくはＨＩＦを標的とする核酸をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む。
更なる実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＫＥＡＰ１を阻害するかまたはＫＥＡＰ１を標的とする治療有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１を阻害するかまたはＫＥＡＰ１を標的とする核酸を阻害するかまたはコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１を阻害する核酸、またはＫＥＡＰ１を阻害するかもしくはＫＥＡＰ１を標的とする核酸をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換え型またはｒＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２血清型である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８血清型である。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞を標的とするプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、これらの標的細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＨＩＦを阻害するかまたはＨＩＦを標的とする核酸を含む治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＨＩＦを阻害するかまたはＨＩＦを標的とする核酸を含む治療有効量のレンチウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＥＩＡＶである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞を標的とするプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、これらの標的細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＫＥＡＰ１を阻害するかまたはＫＥＡＰ１を標的とする核酸を含む治療有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、ＫＥＡＰ１を阻害するかまたはＫＥＡＰ１を標的とする核酸を含む治療有効量のレンチウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＥＩＡＶである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞を標的とするプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、これらの標的細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のａ）患者の内因性ＨＩＦ遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする第１の核酸配列（複数可）、及びＣａｓヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を投与することを含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、内因性ＨＩＦ遺伝子を切断し、対象において内因性ＨＩＦ遺伝子のＨＩＦノックアウトを生じさせる方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のａ）患者の内因性ＫＥＡＰ１遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする第１の核酸配列（複数可）、及びＣａｓヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を投与することを含み、Ｃａｓヌクレアーゼが、内因性ＫＥＡＰ１遺伝子を切断し、対象において内因性ＫＥＡＰ１遺伝子のＫＥＡＰ１ノックアウトを生じさせる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、１つのベクター上にある。いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、異なるベクター上にある。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換え型またはｒＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２血清型である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８血清型である。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＥＡＩＶである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞を標的とするプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ）である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、干渉ＲＮＡに特異的に使用されるプロモーターである。
前述の方法及び組成物のいずれかを使用して、細胞の生存を増加させ、細胞内の代謝をリプログラミングすることができる。そのような細胞には、光受容体細胞、神経細胞、及び網膜細胞が含まれる。
本開示の上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、リポソーム、小胞、合成小胞、エキソソーム、合成エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子を更に含み得る。
本明細書ではまた、本開示の方法のいずれかを実施するためのキットも提供される。
本発明を説明する目的で、本発明の特定の実施形態が図面に示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の正確な構成及び手段に限定されない。
Ｐｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑと略されるＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑは、常染色体劣性ＲＰの前臨床モデルである。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＡＡＶ８－ＶＭＤ２コンストラクトの設計マップである。Ａは、対照ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ｅＧＦＰを示す。Ｂは、ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰコンストラクトを示す。
〔図２〕ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＰＧＣ１αの１ヶ月の網膜下注射後（実線）及び対照非注射眼（点線）のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ前臨床劣性モデルのＥＲＧのグラフである。暗順応ａ波（Ａ）、暗順応ｂ波（Ｂ）、及び明順応ｂ波（Ｃ）の振幅が統計学的に有意に増加している。
〔図３〕ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙコンストラクト（Ａ）及びＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－ｍｃｈｅｒｒｙ（対照ＡＡＶ）（Ｂ）の設計マップである。
〔図４〕ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙをＰ２８に注射した５匹のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０ＱマウスのＥＲＧの結果の箱ひげ図である。白内障または網膜剥離を理由に除外したマウスはなかった。暗順応ａ波及びｂ波、ならびに明順応ｂ波中の連続強度を比較する。白塗りボックスは注射した右眼を表し、白抜きボックスは非注射の対照左眼を表す。暗順応応答のいくつかの強度及び明順応応答の全ての強度で、注射眼と非注射眼との間に統計学的有意差が存在する。ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
〔図５〕ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙをＰ２８（桿体と錐体との組み合わせの最大応答）及びＰ４７（錐体応答）に注射した５匹のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑマウス（最初の同腹仔）のＥＲＧの結果の箱ひげ図である。４つの異なる時点での最大応答のａ波及びｂ波、及び錐体応答のｂ波と、Ｐ２８の対照ＡＡＶウイルスは、第１レーンにある。Ｐ２８及びＰ４７では注射眼と非注射眼との間に統計学的有意差が存在するが、Ｐ５５及びＰ７２では有意差は存在しない。Ｐ５５及びＰ７２でのＥＲＧの結果は、それより前のいずれかの時点でＥＲＧにより試験したマウスのものであった。これらのマウスの一部では、初回ＥＲＧ試験後に角膜混濁が生じ、ＥＲＧ振幅が影響を受けた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
〔図６〕機能的及び解剖学的レスキューを示したＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙで処置した１匹のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑマウスの更なる結果を示す。Ａは、ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙ処置眼のＰ２８でのＥＲＧ応答のグラフである。Ｂは、対照非処置眼のＰ２８でのＥＲＧ応答のグラフである。ＡＡＶ８処置眼はより高い振幅を示し、光受容体機能Ｂが維持されていることを示している。Ｃは、ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙ処置眼のＰ６４での組織像を示す。Ｄは、対照眼のＰ６４での組織像を示す。Ｃ及びＤにおいて、左側の画像は、組織が採取された眼の部分を示す。中央の画像は、染色された中間周辺部を示す。右側の画像は、視神経乳頭を示す。組織像の結果は、対照眼と比較して、注射眼の光受容体変性が減速していることを示す。
〔図７〕ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙで処置したＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ眼のホールマウント網膜の色素移動が少ないこと（Ａ）と、対照非注射眼（Ｂ）を示す。色素移動は、網膜色素変性症の重症度のマーカーである。
〔図８〕錐体特異的Ａｒｒ３抗体で染色したホールマウント網膜の画像を示す。Ａは、ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙで処置したＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ眼を示し、Ｂは、未処置のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ対照を示す。
〔図９〕ＰＧＣ１α用のＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧコンストラクトの設計マップを示す。Ａは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰの設計を示す。Ｂは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰの設計を示す。
〔図１０〕ＮＲＦ２用のＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧコンストラクトの設計マップを示す。Ａは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰの設計を示す。Ｂは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰの設計を示す。
〔図１１Ａ〕桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの切除の結果を示す。暗順応、明順応、及び桿体錐体混合のｂ波振幅（μＶ）を取得するために、暗順応及び明順応条件下で４週目及び６週目に得たＥＲＧデータである。ＲＰＥ中でＨｉｆ２ａを切除したＨｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑの網膜機能のトレース（明色トレース）を、年齢を一致させたＨｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ対照（暗色トレース）と比較して、４週間時点、６週間時点で示した。
〔図１１Ｂ〕桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの除去の結果を示す。Ｈｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ（左側のバー）のＥＲＧトレースの振幅のグラフであり、年齢を一致させた対照ｈｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ（右側のバー）と比較してプロットする。群ごとにマウスは４～５匹であった。
〔図１１Ｃ〕桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの除去の結果を示す。４週目時点で、ｈｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑマウスと比較して、Ｈｉｆ－／－；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑで、ＯＮＬ層及びＯＳ層がより厚く、光受容体外顆粒（ＯＮＬ）層（上部、黄色）及びＩＳ／ＯＳ層（下部、緑色）の幅がより広いことを示している、網膜のパラフィン切片のＨ＆Ｅ染色画像である（スケールバー＝５０μｍ）。
〔図１１Ｄ〕桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの除去の結果を示す。測定しプロットしたＯＮＬ及びＩＳ／ＯＳ層の幅のグラフである。
〔発明を実施するための形態〕
定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈及び各用語が使用される特定の文脈内で、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語は、本発明の方法及びそれらの使用方法を説明する際に実施者に追加の指針を提供するために、以下または本明細書の他の箇所で論じられる。更に、同じことを複数の方法で言えることが理解されよう。したがって、本明細書で論じられる用語のいずれか１つ以上について、代替語及び同義語を使用することができ、用語が本明細書で詳述されているかまたは論じられているか否かには特別な重要性は置かれていない。特定の用語の同義語が提供される。１つ以上の同義語の記述は、他の同義語の使用を排除するものではない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む、明細書の任意の箇所での例の使用は、例示のみを目的としており、本発明または任意の例示された用語の範囲及び意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、その好ましい実施形態に限定されない。
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、値を測定または決定する方法、すなわち、測定システムの限界（すなわち、医薬製剤などの特定の目的に必要とされる精度の程度）に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣例に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、更により好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載される場合、別途記載のない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味すると想定されるべきである。
「神経細胞の」とは、中枢または末梢神経系を構成する任意の細胞を指し、それらを含むことを意味する。
「網膜の」とは、眼内の任意の光感受性細胞、及び光伝達カスケードを可能にするか、促進するか、またはそれに関連する支持細胞を指し、それらを含むことを意味する。
本出願で使用される「対象」という用語は、治療的または予防的処置を必要とする動物を指す。対象には、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及び霊長類などの哺乳動物が含まれる。したがって、本発明は、例えば、コンパニオンアニマル、家畜、動物園の実験動物、及び野生動物を処置するための動物用医薬品で使用することができる。本発明は、ヒトの医療用途に特に望ましい。
本出願で使用される「患者」という用語は、ヒト対象を意味する。いくつかの実施形態では、「患者」は、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない神経変性疾患または障害を有することが知られているか、またはその疑いがある。
「治療有効量」という語句は、本明細書では、対象の臨床的に重要な状態を改善するのに、または疾患もしくは障害に関連する１つ以上の症状を遅延させるかもしくは最小限に抑えるかもしくは緩和するのに、または対象の生理機能の望ましい有益な変化をもたらすのに十分である量を意味するために使用される。
「処置する」、「処置」などの用語は、疾患または障害の症状の少なくとも１つを遅らせる、緩和する、改善する、または軽減する、または発症後に疾患もしくは障害を回復に向かわせる手段を指す。
「予防する」、「予防」などの用語は、明白な疾患または障害の発症前に手を打ち、疾患もしくは障害の発生を予防するか、または疾患もしくは障害の程度を最小限に抑えるか、またはその発生過程を遅らせることを指す。
「治癒する」などの用語は、治すこと、健康にすること、または良好な健康状態に回復させること、または再発リスクが少なくなるように疾患の再発のない時間をもたらすことを意味する。
「それを必要とする」という用語は、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない神経変性疾患または障害を有することが知られているか、またはその疑いがあるか、またはそれを有するリスクがある対象である。
「薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、効果を生じさせるか、または効果を生じさせることができる物質を意味し、これには、化学物質、医薬品、生物製剤、有機小分子、抗体、核酸、ペプチド、及びタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
「組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、複数の要素または成分の混合または組み合わせから生じる生成物を意味する。
本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、治療薬が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指し、あらゆる全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。
「薬学的に許容される」という用語は、宿主に投与された場合に、ヒトに投与された場合に、胃不調、めまいなどのアレルギー反応または同様の有害反応を引き起こさず、動物、より詳細にはヒトにおける使用を対象として、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されている、分子実体及び組成物を指す。
「単離された核酸分子」とは、ゲノムＤＮＡもしくはゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成起源のもの、またはそれらの組み合わせであって、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と会合していないか、またはそれが天然に連結されていないポリヌクレオチドに連結しているものを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、インタクトな染色体を含まないことを理解されたい。特定の核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定の配列に加えて、最大１０または更には最大２０以上の他のタンパク質またはその部分もしくは断片のコード配列を含んでもよく、または列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含んでもよく、及び／またはベクター配列を含んでもよい。
「制御配列」という語句は、特定の宿主生物における、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列としては、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを用いることが知られている。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合に、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接していること（分泌リーダーの場合には、隣接しており、かつリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあること）を意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと会合した場合に複製可能であり、細胞間で遺伝子配列を移動させることができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、またはビリオンなどの任意の遺伝エレメントを含む。したがって、この用語は、クローニング媒体及び発現媒体、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、有用なベクターは、転写される核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置するベクターであると考えられる。「プロモーター」とは、遺伝子の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。「作動的に配置された」、「作動的に連結された」、「制御下にある」、または「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが核酸に対して正しい位置及び方向にあり、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御することを意味する。
「発現ベクター」または「発現コンストラクト」、または「コンストラクト」という用語は、核酸コード配列の一部または全部が転写され得る核酸を含む任意のタイプの遺伝子コンストラクトを意味する。いくつかの実施形態では、発現は、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または阻害性ＲＮＡを産生するための核酸の転写を含む。
いくつかの態様では、本開示は、単離されたアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、その天然環境から（例えば、宿主細胞、組織、もしくは対象から）単離された、または人工的に産生されたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え法を使用して産生させることができる。このようなＡＡＶを、本明細書では、「組換えＡＡＶ」と呼ぶ。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ｒＡＡＶの導入遺伝子が１つ以上の所定の組織（複数可）に特異的に送達されるように、組織特異的標的化能を有することが好ましい。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的標的化能を決定する重要な要素である。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ１」、「ＡＡＶ２」、「ＡＡＶ３」、「ＡＡＶ４」などの用語は、それぞれＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、またはＡＡＶ４由来のＩＴＲ、及びそれぞれＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、またはＡＡＶ４由来のカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを指す。「ＡＡＶ２／１」、「ＡＡＶ２／８」、「ＡＡＶ２／９」などの用語は、ＡＡＶ２由来のＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９由来のカプシドタンパク質とをそれぞれ含むシュードタイプ化ＡＡＶベクターを指す。
トランスフェクトされた宿主細胞に関して、「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたとき、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技法が当該技術分野で一般に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６（１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １３：１９７（１９８１）を参照されたい。このような技法を使用して、ヌクレオチド組込みベクター及び他の核酸分子などの１つ以上の外因性核酸を適切な宿主細胞に導入することができる。
「宿主細胞」とは、目的の物質を保有する、または保有することができる任意の細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組換えＡＡＶの産生に関連する他の導入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の後代を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指す場合がある。単一の親細胞の後代は、自然、偶発的、または意図的な変異により、元の親と形態上またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体において必ずしも完全に同一であるとは限らないことが理解される。
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのそのような呼称は、後代を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、導入数にかかわらず初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。意図的なまたは偶発的な変異により、全ての後代のＤＮＡ含量が厳密に同一というわけではないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する変異後代が含まれる。異なる呼称が意図される場合は、文脈から明らかとなるであろう。
細胞に関して、「単離された」という用語は、その天然環境から（例えば、組織または対象から）単離された細胞を指す。「細胞株」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連続的または長期的な増殖及び分裂が可能な細胞集団を指す。多くの場合、細胞株は単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。更に、そのようなクローン集団の保存または導入中に、核型に自発的または誘発された変化が起こり得ることが当該技術分野で知られている。したがって、言及された細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または培養物と正確に同一ではない場合があり、言及された細胞株はそのようなバリアントを含む。本明細書で使用される場合、「組換え細胞」という用語は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡなどの生物学的に活性な核酸の産生をもたらすＤＮＡセグメントなどの外因性ＤＮＡセグメントが導入されている細胞を指す。
分子生物学における標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２ ＆ １９８９ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）、Ｗｕ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１９９３）に記載されている。標準的方法は、Ａｕｓｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）にも示されている。
略称
ＲＰ－ 網膜色素変性症
ＡＤＯＡ－ 常染色体優性視神経萎縮症
ＲＰＥ－ 網膜色素上皮
ＲＧＣ－ 網膜神経節細胞
ＯＸＰＨＯＳ－ 酸化的リン酸化
ＲＯＳ－ 活性酸素種
ＰＧＣ１α－ ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベーター１アルファ
ＮＲＦ２－ 赤血球系転写因子２関連転写因子
Ｋｅａｐ１－ Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１
ＨＩＦ－ 低酸素誘導因子
ＥＲＧ－ 網膜電図
ＰＥＲＧ－ パターン網膜電図
ＯＮＬ－ 外顆粒層
本明細書には、網膜色素変性症（ＲＰ）、緑内障、黄斑変性症、及び常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）を含むがこれらに限定されない失明の原因となる様々な神経変性疾患、ならびにアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー小体型認知症、及び同様の神経変性状態を含むがこれらに限定されない他の神経変性疾患の発症を遅延させるため、及びそれらの疾患を予防する、処置する、及び／または治癒するための遺伝子治療が開示される。様々な変異がこれらの疾患の原因となるが、これらの疾患の根本原因は、疾患に関与する様々な細胞の代謝機能不全である。いかなる理論にも束縛されるものではないが、これらの細胞の代謝をリプログラミングすることにより、疾患の原因となる変異にかかわらずこれらの神経変性疾患を予防する、処置する、及び／または治癒することができる。特定の因子を増加または減少させ、更に様々な疾患に関与する特定の細胞に特異的に治療をもたらす標的遺伝子治療によって、代謝をリプログラミングすることができる。
本明細書では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の代謝をリプログラミングすることによって、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を予防する、処置する、及び／または治癒するための方法及び組成物が、具体的に開示される。これは、
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベーター１アルファ（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＰＧＣ１αとしても知られている）の発現を増加させること；
赤血球系転写因子２関連転写因子（ＮＲＦ２）の発現を増加させること；
Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（ＫＥＡＰ１）の発現を減少させるかまたは阻害すること；及び／または
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）の発現を減少させるかまたは阻害すること、によって実現される。
本明細書ではまた、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の代謝をリプログラミングすることによって、神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を予防する、処置する、及び／または治癒するための方法及び組成物が開示される。これは、
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベーター１アルファ（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＰＧＣ１αとしても知られている）の発現を増加させること；または
赤血球系転写因子２関連転写因子（ＮＲＦ２）の発現を増加させること；及び／または
Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（ＫＥＡＰ１）の発現を減少させるかまたは阻害すること、によって実現される。
特定の細胞への遺伝子送達を目的とするこれらの方法及び組成物を使用して、網膜色素変性症（ＲＰ）、緑内障、黄斑変性症、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない様々な神経変性疾患の発症を遅延させる、神経変性疾患を予防する、処置する、及び／または治癒することができる。これらの方法及び組成物を使用して、細胞内の代謝をリプログラミングし、神経細胞、網膜細胞、及び光受容体細胞を含む細胞の生存を増加させることもできる。
緑内障は、ミトコンドリア機能不全によるミトコンドリア生合成の減少及び酸化ストレスの増加に関連している。緑内障は、７０００万を超える人々が罹患しており、全世界的に失明の原因となっている最も一般的な神経変性疾患である（Ｑｕｉｇｌｅｙ ａｎｄ Ｂｒｏｍａｎ ２００６）。実際、緑内障は、進行性のＲＧＣ死滅及び視力喪失を特徴とする多因子性疾患の群である。遺伝性緑内障のマウスモデルにおける近年の研究では、視神経損傷の発症と同時に、神経節細胞層におけるミトコンドリア生合成が減少することが示された（Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ ２０１４）。ミトコンドリア生合成は、新規ミトコンドリアの数及び／または体積を増加させるプロセスであるため、ミトコンドリア生合成の増加は、損傷したミトコンドリアが補充され、健常ミトコンドリア集団が維持され得ることを確実にするための適応手段であると仮定されている。更に、緑内障性神経変性において、酸化ストレスをミトコンドリア機能不全と関連付けるエビデンスが蓄積されつつある。異常なミトコンドリア代謝及び酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）障害は、ＲＯＳレベルの上昇によるミトコンドリア損傷及び酸化ストレスを招き、続いてＲＧＣのアポトーシスを生じさせることが示されている。緑内障においてＲＧＣ生存が促進される際のミトコンドリア生合成及び抗酸化応答の役割を評価した先行研究は存在しない。緑内障及び他の視神経萎縮症に対する現行の臨床的アプローチは、眼圧を低下させること、特にＲＧＣ死滅を抑制することに焦点を当てている。しかしながら、概ね半数の患者の緑内障性視野喪失は、眼圧を下げても低減しない。したがって、ＲＧＣ死滅に関連する疾患に対するミトコンドリア標的治療が大いに必要とされている。
常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）は、ミトコンドリア機能不全に関連している。ＡＤＯＡは、最も一般的な遺伝性視神経症であり、推定疾患有病率は１：１２，０００～１：５０，０００．１７である。これは、核内のＯＰＡ１遺伝子の変異に関連している。ＯＰＡ１は、ミトコンドリアダイナミクス（内膜融合）、結晶完全性、エネルギー特性、及びミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の維持を制御するミトコンドリアのダイナミン関連ＧＴＰアーゼであるＯＰＡ１タンパク質をコードする（Ｄｅｌｅｔｔｒｅ，ｅｔ ａｌ．２００２）。ＯＰＡ１機能に関する先行研究は、ＯＰＡ１欠損により、クリステ組織、生合成、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）、及びミトコンドリア膜電位の維持に異常が生じ、アポトーシス感受性が増加し、ｍｔＤＮＡレベル／安定性、及びエネルギー活性が減少することを示している。しかしながら、ミトコンドリア機能不全がどのようにＲＧＣ死滅を引き起こすかについては明確に描写されていない。
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅は、ミトコンドリア機能不全に関連している。ＲＧＣは、脳内の遠位末端及び結合を形成するために視神経を通って伸長する長い軸索を含む独自の細胞構築に関連する、高度に区画化されたエネルギー需要に起因して、ミトコンドリア機能不全に対して極めて脆弱である（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２００３）。ミトコンドリア生合成は、損傷したミトコンドリアを確実に交換するためのミトコンドリアの品質制御の極めて重要な構成要素であり、ミトコンドリア生合成の低減は、緑内障及び視神経萎縮症などの多くの神経変性障害に関連している（Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．２０１４、ＭａｃＶｉｖａｒ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ，２０１６）。蓄積されつつあるエビデンスにより、酸化ストレスはＲＧＣ死滅におけるミトコンドリア機能不全と関連付けられており、異常なミトコンドリア代謝及び酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）障害は、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルの増加によるミトコンドリア損傷及び酸化ストレスを招き、ＲＧＣのアポトーシスを生じさせる。ミトコンドリア機能不全がどのようにＲＧＣ死滅を招くか、及びＲＧＣ内に健常ミトコンドリア集団を維持するために必要なメカニズム（複数可）については、完全には理解されていない。本明細書では、ＲＧＣの数及び機能の低減を示す新規ＡＤＯＡマウスモデル、及びＲＧＣ死滅に関する他のマウスモデルを使用して、ミトコンドリア機能の回復がＲＧＣ死滅を予防すること、更にこれを使用して、ＡＤＯＡ、緑内障、及び他の神経変性疾患を処置、予防及び／または治癒することができることを示している。
ＲＰは、最も一般的な遺伝性網膜ジストロフィーであり、有病率は全世界で約３，０００人に１人であり、合計で１００万人超が罹患している。ＲＰは、桿体光受容体の死滅を主に引き起こす７１を超える変異のいずれか１つに起因する。錐体はこれらの変異によって直接死滅するわけではないが、特定の変異にかかわらず、桿体の死滅に続いて（通常は主要な桿体の死滅期の後に）死滅する（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｐｕｎｚｏ，ｅｔ ａｌ．２００９）。錐体は明所視、色覚、及び中心視覚に不可欠であるため、錐体の死滅が失明の原因となる。ＲＰに関する先行研究及び臨床試験は、単一遺伝子の増強または修復に焦点を当ててきたが、これらの方策は、仮に成功したとしても、単一の特定の変異を保有する患者にのみ適用可能である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．２０１８）。近年、ＦＤＡは、末期ＲＰ患者のみを対象に承認された人工網膜と、ＲＰＥ６５変異保有患者のみを対象に承認されたＲＰＥ６５遺伝子治療という、ＲＰに対する２つの潜在的治療を承認した（Ｄｕｎｃａｎ、ｅｔ ａｌ．２０１８）。多数の桿体特異的変異に起因するＲＰに対するより広範に適用可能な処置として役立つ可能性がある、ＲＰの錐体死滅に共通する経路を標的とする治療の開発が大いに必要とされている。
網膜内の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成と排除との不均衡を表す明らかな酸化ストレスが、ＲＰにおける錐体死滅の進行に重要な役割を果たすことが、増加しつつあるエビデンスにより示唆されている。桿体は外顆粒層の細胞の９５％を構成し、外網膜に送達される酸素の大部分を消費するため、ＲＰにおける桿体死滅は酸素を高濃度にし、これが組織の酸素を過剰にして、スーパーオキシドラジカルの生成を増加させる。過剰なスーパーオキシドラジカルは、他のＲＯＳ、例えば、脂質、タンパク質、及びＤＮＡを攻撃し、続いて錐体が死滅するペルオキシナイトライトを生成する。先行研究では、抗酸化物質の全身投与によるＲＰの動物モデルにおける錐体保存作用が実証されており、酸化ストレスがＲＰにおける錐体死滅に重要な役割を果たしていることが示唆されている（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ ２０１１）。
Ｎｒｆ２／ＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１）シグナル伝達経路は、細胞の最も重要な抗酸化防御及び生存経路のうちの１つである。複数の研究により、ＮＲＦ２がいくつかの眼疾患において酸化ストレスに対して保護的役割を果たしていることが示された（Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｌａｒａｂｅｅ，ｅｔ ａｌ．２０１６）。しかしながら、外網膜のどの細胞がＲＰの錐体死滅の原因となる主要なＲＯＳの一因であるかについての知識の欠落があり、したがって、標的処置の指針はほとんど提供されていない。網膜内の特定の細胞における抗酸化応答を増強させることで光受容体の生存を促進させることが可能か否かについて評価した先行研究は存在しない。外網膜のどの細胞が主要なＲＯＳの一因であるかについての理解の欠如は、極めて重大な知識の欠落を示している。本明細書には、細胞特異的抗酸化応答を増強させることが、光受容体死滅の予防の一助となり得、これが更に、疾患を予防、処置、及び／または治癒し得ることが示されている。
ＲＰに対する更なる遺伝子治療ソリューションは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び光受容体（桿体（９５％）及び錐体（５％））における、グルコースをエネルギーに変える酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）及びグルコースを脂肪に変える同化作用という、２つの普遍的な代謝プロセスの均衡を回復することと、「代謝カップリング」仮説とを中心とする。これら２つのプロセスは密接に関連している。健常眼では、桿体光受容体は、ＲＰＥからグルコースを取り込みそれを脂肪及び乳酸に変換する。次に、ＲＰＥは、生成された乳酸を消費し、同化を抑制するＡＴＰ生成経路であるＯＸＰＨＯＳを介してエネルギーを生成する。桿体細胞が死滅または老化し始めると、乳酸濃度が低下し、ＲＰＥがグルコースを使用して脂肪及び脂質を生成するように促される。ＲＰＥが利用可能なグルコースのほぼ全てを消費すると、錐体細胞も死滅する。Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１６Ａ及びＺｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１６Ｂを参照されたい。したがって、中心的仮説は、ＲＰＥ代謝のリプログラミングが、根底にある特定の遺伝子変異とは無関係にＲＰにおける錐体の生存を促進し得る、というものである。
哺乳動物の光受容体の９５％超が桿体であり、この代謝カップリング仮説が桿体－ＲＰＥ代謝カップリングに焦点を当てた研究に基づいていることから、ＲＰにおける錐体死滅の根底にあるメカニズムを明らかにすることは困難である。したがって、錐体における細胞代謝または錐体とＲＰＥとの間の代謝カップリングについてはほとんど知られていない。錐体死滅がＲＰにおいて失明を招くことを考慮すると、ＲＰに対する治療の開発には、網膜代謝カップリングにおける錐体の役割をより良く理解することが極めて重要である。
疾患を処置するための代謝リプログラミングは、ＲＧＣ、ＲＰＥ、及び光受容体細胞の特定の転写因子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることにより実現され得る。特定の細胞におけるこれらの転写因子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、様々な薬剤を特定の細胞へと送達する細胞特異的プロモーターを使用して実現される。
有望な介入アプローチの１つは、細胞特異的な形で代謝区画化のノード（ｎｏｄｅ）を調節することにより、ＲＰＥと光受容体との間の代謝相利作用を回復することである。魅力的な治療標的として注目されている２つの遺伝子は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）及びＰＰａｒ（ガンマ）－コアクチベーター－１アルファ（ＰＧＣ１α）であり、どちらも酸化的リン酸化に極めて重要な役割を果たす転写因子をコードしている。ＨＩＦ及びＰＧＣ１αは、それぞれ酸化的リン酸化の負及び正の調節因子であることが知られている。病的解糖状態から神経保護酸化状態へのＲＰＥ細胞の自律的リプログラミングの救済効果を評価するために、網膜色素変性症（ＲＰ）マウスモデルにおけるＨＩＦのＲＰＥ特異的切除及びＰＧＣ１αの過剰発現が別々に誘導された。注目すべきことに、処置マウスは光受容体の形態及び機能が維持されていることを示し、この革新的で不明確な医療アプローチの治療有効性が実証された。加齢黄斑変性症からパーキンソン病に至るまで、多種多様な神経変性疾患の根底に代謝不均衡があることを考慮すると、本発明者らの治療方策の臨床的影響及び重要性は誇張してもし過ぎることはない。
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベーター１アルファ（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ；ＰＧＣ１αとしても知られている）は、ｍｔＤＮＡ、タンパク質、及び膜の合成を含むミトコンドリア生合成を誘導すると考えられている。ＰＧＣ１αコアクチベーターは、ミトコンドリア生合成のマスターレギュレーターである（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｍａｒｃｕｓ，ｅｔ ａｌ．２０１１）。ＰＧＣ－１αは、ミトコンドリアの活性を調節し、解糖を抑制することにより、細胞代謝を解糖からＯＸＰＨＯＳにリモデリングする。
脳では、ＰＧＣ１αのノックダウンにより海馬樹状突起のミトコンドリア数が減少し、樹状突起棘及びシナプスの密度が低下したが、一方でＰＧＣ１αの過剰発現は、ミトコンドリア生合成及びシナプス形成を促進した。眼におけるＰＧＣ１αの役割は議論の余地があり、ｉｎ ｖｉｖｏではほとんど研究されていない。
ＨＩＦのダウンレギュレーションまたは切除の有益な効果を裏付けるのは、加齢でＲＰＥにおいてＨＩＦの発現が２倍増加することである（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０２０）。したがって、標的送達を使用したＲＰＥにおけるＨｉｆ１ａ／２ａのダウンレギュレーションは、代謝を健常状態へとリプログラミングする（すなわち、ＲＰＥでＯＸＰＨＯＳを増加させ、光受容体細胞で同化を増加させる）。
赤血球系転写因子２関連転写因子（ＮＲＦ２）は、全身の抗酸化防御系にとって重要な核転写因子である。通常の生理学的条件下では、ＮＲＦ２は急速に代謝回転し、ユビキチン－プロテアソーム系によって常に分解されるため、低レベルで見出される（ＭｃＭａｈｏｎ，ｅｔ ａｌ．２００４）。ストレス条件下では、ＮＲＦ２は、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（ＫＥＡＰ１、主要なＮｒｆ２阻害物質）から解離し、核内移行し、そこでＤＮＡプロモーター領域の抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）に結合する。次に、ＮＲＦ２はＡＲＥ関連遺伝子（ＮＱＯ１、ＨＯ－１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、及びグルタチオン合成酵素）の転写を開始し、これらは全て、グルタチオンの調節を通じてＲＯＳを解毒する。複数の研究により、Ｎｒｆ２が糖尿病性網膜症及び網膜虚血再灌流における酸化ストレスから保護し、神経変性及び視神経炎における神経細胞の生存を促進することが実証されている（Ｌａｒａｂｅｅ，ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１５）。しかしながら、Ｎｒｆ２／Ｋｅａｐ１／ＡＲＥシグナル伝達経路の誘導を標的化してＲＧＣの神経保護を促進することが可能か否かについては、ほとんど知られていない。
ＲＰマウスモデルにおける近年の研究において、網膜ＰＧＣ１α過剰発現の有害な影響が報告された（Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１５）。このｉｎ ｖｉｖｏマウス研究の潜在的な問題は、この研究がヒトＣＭＶプロモーターを使用したことである。このプロモーターは錐体での強力な発現を駆動するが、著者らはまた、桿体及びＲＰＥでのある程度の発現も認めており、このため、このプロモーターの使用により非特異的な過剰発現がもたらされた。したがって、ＲＰＥ特異的プロモーターまたはＣｒｅドライバーを使用した更なる研究が、ＲＰＥの生物学的性質におけるＰＧＣ１αの役割の決定に役立つ可能性がある。本明細書には、ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２の両方の過剰発現ならびにＨＩＦの阻害の有益な効果を生み出す細胞特異的プロモーターの使用が示される。
本明細書には、代謝不均衡を救済し、それにより変異特異的ではない疾患の進行を遅らせる遺伝子治療が示される。ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２の増加または過剰発現、及びＨＩＦ及びＫＥＡＰ１の阻害または切除は、特定の細胞の代謝不均衡を救済し、疾患の処置、予防、及び治癒をもたらす。開示された遺伝子治療で細胞特異的プロモーターを使用することにより、核酸が標的化された形で確実に送達される。この技術は単一遺伝子ではなく疾患メカニズムを標的としているため、全てのＲＰ患者を処置する可能性を有している。更に、この治療アプローチは、アルツハイマー病などの代謝調節不全を伴う他の変性状態にも適用可能であり得る。
ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２を過剰発現または増加させるための方法及び組成物
本開示の組成物及び方法を使用して、様々な病態の発症を遅延させ、その病態を処置し、予防し、及び／または治癒することができる。例えば、本明細書に記載の遺伝子治療は、過剰発現により、疾患、特に神経変性疾患、より詳細には、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、及び常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）を含むがこれらに限定されない失明の原因となる神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒することができるタンパク質をコードする核酸を含有する１つ以上の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、アルツハイマー病を予防する、処置する、及び／または治癒することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない他の神経変性疾患を予防する、処置する、及び／または治癒することができる。
いくつかの実施形態では、過剰発現されるタンパク質は、ＰＧＣ１αである。いくつかの実施形態では、過剰発現されるタンパク質は、ＮＲＦ２である。
いくつかの実施形態では、本開示は、神経変性疾患または障害の発症を遅延させる、神経変性疾患または障害を処置する、予防する、治癒する、及び／またはその重症度もしくは程度を低減させる方法であって、それを必要とする対象に、ＰＧＣ１α及び／またはＮＲＦ２をコードする核酸を含む治療有効量の１つの組成物または複数の組成物、例えばウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を投与することによる方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ｒＡＡＶ２、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ２／１０、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２／９などのＡＡＶである。更に、組成物、例えばウイルスベクターは、適切な細胞への核酸送達を標的とする細胞特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、標的化される細胞は、網膜神経節細胞であり、使用されるプロモーターには、ｈＳＮＣＧ及びＰｌｅ３４５（ＮＥＦＬ）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化される細胞は、網膜色素上皮細胞であり、使用されるプロモーターには、ＶＭＤ２、ＲＰＥ６５、及びＴＹＲが含まれるがこれらに限定されない。
ＰＧＣ１α及び／またはＮＲＦ２の減少を増加させるために、ＡＡＶ、レンチウイルスベクター、または他の適切なベクターを含む、任意の適切なウイルス系を利用することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１α及び／またはＮＲＦ２をコードする核酸を含む１つの組成物または複数の組成物（例えば、ＡＡＶなどのウイルスベクター）は、神経変性疾患または障害と診断されるかまたはそれが疑われると直ちに投与される。これらの組成物は、単独で、または神経変性疾患もしくは障害の処置用の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。
本明細書に記載の導入遺伝子の核酸配列は、導入遺伝子を発現する特定の組成物（例えば、ウイルスベクター）の知識に基づいて設計され得る。例えば、導入遺伝子配列の１つのタイプは、発現時に検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を含む。別の例では、導入遺伝子は、治療用タンパク質または治療用機能性ＲＮＡをコードする。別の例では、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子産物の機能を試験するために、例えば、導入遺伝子を保有する体細胞トランスジェニック動物モデルを作り出すために、研究目的での使用が意図されているタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。別の例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作り出すための使用が意図されているタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。適切な導入遺伝子コード配列は、当業者には明らかであろう。
本開示のいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２を含むがこれらに限定されない、機能性タンパク質をコードする。
「ＰＧＣ１α」、「ＰＧＣ１α」、「Ｐｇｃ１α」、及び「Ｐｇｃ１α」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＰＧＣ１αから生じるタンパク質を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、ＰＧＣ１αは、用いられる特定の文脈において適宜、遺伝子またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指し得ることに留意されたい。更に、特定の文脈では、言及されるのはマウスの遺伝子またはタンパク質であり、その他の場合には、言及されるのは、特定の文脈において適宜、ヒトの遺伝子またはタンパク質である。
ヒトＰＧＣ１α遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：１０８９１）を使用して導入遺伝子を得ることができる。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＰＧＣ１αをコードする。ＰＧＣ１αは、ヒトＰＧＣ１αのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列（例えば、ヒトＰＧＣ１αのアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、ヒトＰＧＣ１αのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列（例えば、ヒトＰＧＣ１αのアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、ヒトＰＧＣ１αのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列（例えば、ヒトＰＧＣ１αのアミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）ヒトＰＧＣ１αとは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）ヒトＰＧＣ１αとは異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列（例えば、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列（例えば、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列（例えば、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列（例えば、ヒトＰＧＣ１αの核酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１を含むＰＧＣ１αをコードする。ＰＧＣ１αは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有し得る。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αは、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、配列番号１をコードする核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列（例えば、配列番号１をコードする核酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、配列番号１をコードする核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列（例えば、配列番号１をコードする核酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、配列番号１をコードする核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列（例えば、配列番号１をコードする核酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、配列番号１をコードする核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列（例えば、配列番号１をコードする核酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＧＣ１αをコードする導入遺伝子は、効率を高めるためにコドン最適化されている。
コドン最適化ツールは、当該技術分野において公知である。
「ＮＲＦ２」、「ＮＲＦ２」、「Ｎｒｆ２」、及び「Ｎｒｆ２」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＮＲＦ２から生じるタンパク質を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、ＮＲＦ２は、用いられる特定の文脈において適宜、遺伝子またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指し得ることに留意されたい。更に、特定の文脈では、言及されるのはマウスの遺伝子またはタンパク質であり、その他の場合には、言及されるのは、特定の文脈において適宜、ヒトの遺伝子またはタンパク質である。
ヒトＮＲＦ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：４７８０）を使用して導入遺伝子を得ることができる。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＮＲＦ２をコードする。ＮＲＦ２は、ヒトＮＲＦ２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列（例えば、ヒトＮＲＦ２のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有し得る。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、ヒトＮＲＦ２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列（例えば、ヒトＮＲＦ２のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、ヒトＮＲＦ２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列（例えば、ヒトＮＲＦ２のアミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）ヒトＮＲＦ２とは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）ヒトＮＲＦ２とは異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列（例えば、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列（例えば、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列（例えば、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列（例えば、ヒトＮＲＦ２の核酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２を含むＮＲＦ２をコードする。ＮＲＦ２は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有し得る。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって、例えば、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって）配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、配列番号２をコードする核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列（例えば、配列番号２をコードする核酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、配列番号２をコードする核酸配列と少なくとも８５％同一である核酸配列（例えば、配列番号２をコードする核酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、配列番号２をコードする核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列（例えば、配列番号２をコードする核酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、配列番号２をコードする核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列（例えば、配列番号２をコードする核酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２をコードする導入遺伝子は、効率を高めるためにコドン最適化されている。
コドン最適化ツールは、当該技術分野において公知である。
ＨＩＦ及びＫＥＡＰ１を阻害する、切除する、または減少させるための方法及び組成物
本開示の組成物及び方法を使用して、様々な病態の発症を遅延させ、その病態を処置し、予防し、及び／または治癒することができる。例えば、本明細書に記載の遺伝子治療は、疾患、特に神経変性疾患、より詳細には、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、及び常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）を含むがこれらに限定されない失明の原因となる神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒することができる核酸またはタンパク質の阻害剤を含有する１つ以上の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、アルツハイマー病を予防する、処置する、及び／または治癒することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない他の神経変性疾患を予防する、処置する、及び／または治癒することができる。
いくつかの実施形態では、阻害されるタンパク質は、ＨＩＦである。
「ＨＩＦ」、「ＨＩＦ」、「Ｈｉｆ」、「Ｈｉｆ」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＨＩＦ遺伝子もしくはＨＩＦ相互作用物質から生じるタンパク質を含むことを意味する。更に、本明細書で使用されるＨＩＦは、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ２Ａ、及びＨＩＦ３Ａを含むことを意味する。ＨＩＦ１Ａ及びＨＩＦ２Ａのヒト参照配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ３０９１及び２０３４に見出すことができる。ＨＩＦ３Ａの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ－０２２４６２、ＮＭ－１５２７９４、及びＮＭ－１５２７９５に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、ＨＩＦは、用いられる特定の文脈において適宜、遺伝子またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指し得ることに留意されたい。更に、特定の文脈では、言及されるのはマウスの遺伝子またはタンパク質であり、その他の場合には、言及されるのは、特定の文脈において適宜、ヒトの遺伝子またはタンパク質である。
任意のＨＩＦの任意のアイソフォームが、本発明の阻害剤によって阻害され得る。本発明の阻害剤は、ＨＩＦの野生型または変異型を標的とし得る。
いくつかの実施形態では、阻害されるタンパク質は、ＫＥＡＰ１である。
「ＫＥＡＰ１」、「ＫＥＡＰ１」、「Ｋｅａｐ１」、「Ｋｅａｐ１」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＫＥＡＰ１遺伝子もしくはＫＥＡＰ１相互作用物質から生じるタンパク質を含むことを意味する。ヒト参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋ９８１７に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、ＫＥＡＰ１は、用いられる特定の文脈において適宜、遺伝子またはその遺伝子によってコードされるタンパク質を指し得ることに留意されたい。更に、特定の文脈では、言及されるのはマウスの遺伝子またはタンパク質であり、その他の場合には、言及されるのは、特定の文脈において適宜、ヒトの遺伝子またはタンパク質である。
任意のＫＥＡＰ１の任意のアイソフォームが、本発明の阻害剤によって阻害され得る。本発明の阻害剤は、ＫＥＡＰ１の野生型または変異型を標的とし得る。
本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、ＨＩＦ及び／またはＫＥＡＰ１の量／レベル及び／または活性をダウンレギュレートさせるか、またはそうでなければ減少させるかもしくは抑制することができる薬剤を指す。
阻害のメカニズムは、遺伝子レベル（例えば、発現、転写もしくは翻訳への干渉もしくは阻害など）、またはタンパク質レベル（例えば、結合、競合など）であり得る。
有効性、毒性、安定性、特異性、及び半減期などの当該技術分野において認識されている基準によって導かれる、多種多様な適切な阻害剤を用いることができる。
いくつかの実施形態では、本開示は神経変性疾患または障害を処置する、予防する、治癒する、及び／またはその重症度もしくは程度を低減させる方法であって、それを必要とする対象に、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１の阻害剤を含む治療有効量の１つの組成物または複数の組成物、例えばウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）を投与することによる方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ｒＡＡＶ２、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ２／１０、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２／９などのＡＡＶである。
ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１のｍＲＮＡレベルを減少させるために、ＡＡＶ、レンチウイルスベクター、または他の適切なベクターを含む、任意の適切なウイルスノックダウン系を利用することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶベースのものである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＥＩＡＶベースのものである。
更に、組成物、例えばウイルスベクターは、適切な細胞への核酸送達を標的とする細胞特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、標的化される細胞は、網膜色素上皮細胞であり、使用されるプロモーターには、ＶＭＤ２、ＲＰＥ６５、及びＴＹＲが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的化される細胞は、網膜神経節細胞であり、使用されるプロモーターには、ｈＳＮＣＧ及びＰｌｅ３４５（ＮＥＦＬ）が含まれるがこれらに限定されない。
更に、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１遮断分子（核酸、ペプチド、または小分子）の特異的標的送達は、標的化リポソーム、ナノ粒子または他の適切な手段によって送達され得る。
いくつかの実施形態では、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１の阻害剤を含む１つの組成物または複数の組成物（例えば、ＡＡＶなどのウイルスベクター）は、神経変性疾患または障害と診断されるかまたはそれが疑われると直ちに投与される。これらの組成物は、単独で、または神経変性疾患もしくは障害の処置用の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。
エンドヌクレアーゼ
ゲノムＤＮＡの改変方法は、当該技術分野で周知である。例えば、方法は、ＤＮＡ消化剤を使用して、非相同末端結合ＤＮＡ修復経路（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）経路のいずれかによってＤＮＡを改変することができる。「ＤＮＡ消化剤」という用語は、核酸のヌクレオチドサブユニット間の結合（すなわち、ホスホジエステル結合）を切断することができる薬剤を指す。
一実施形態では、ＤＮＡ消化剤は、ヌクレアーゼである。ヌクレアーゼは、核酸を加水分解する酵素である。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに分類され得る。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の内部にある核酸間の結合の加水分解を触媒する酵素群のいずれかである。エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の末端から単一ヌクレオチドの加水分解を触媒する酵素群のいずれかである。ヌクレアーゼはまた、ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に消化するか否かに基づいて分類され得る。ＤＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼまたはＤＮアーゼと称される場合があり、一方でＲＮＡの加水分解を特異的に触媒するヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼまたはＲＮアーゼと称される場合がある。一部のヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸配列に特異的である。一部の酵素は、エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方の特性を有する。更に、一部の酵素は、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方を消化することができる。
ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１は、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１をコードする遺伝子を標的とする配列特異的エンドヌクレアーゼを使用することにより阻害され得る。
エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、ＺＦニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）が挙げられる。メガヌクレアーゼは、大型ＤＮＡ配列（１２塩基対以上）を認識して切断する能力を特徴とするエンドヌクレアーゼである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ及びＰＩ－Ｓｃｅファミリーのエンドヌクレアーゼを含む、任意の適切なメガヌクレアーゼを本発明の方法で使用して、宿主ゲノムに二本鎖切断を生じさせることができる。
本開示の一態様は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを提供する。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはまた、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインと、ガイドＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインとを含む。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡによって特定の核酸配列（または標的部位）に向けられる。ガイドＲＮＡは、標的部位に向けられると、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが二本鎖切断を標的部位核酸配列に導入できるように、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及び標的部位と相互作用する。ガイドＲＮＡにより標的切断のための特異性がもたらされるため、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは汎用的であり、様々なガイドＲＮＡとともに使用して、様々な標的核酸配列を切断することができる。
本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用することができるＲＮＡ誘導型配列特異的ヌクレアーゼ系の一例には、ＣＲＩＳＰＲ系（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｎａｔｕｒｅ ４８２：３３１－３３８、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１、Ｍａｌｉ，ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６、Ｃｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３）が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）系は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合及び標的ＤＮＡの配列特異的切断を利用する。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓの組み合わせにより、ヌクレアーゼに部位特異性が付与される。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ゲノムＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）部位（例えば、ＮＧＧ）及び定常ＲＮＡ足場領域の上流の標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的である約２０ヌクレオチドを含む。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質は、ｓｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ部位上流の所定位置に二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨ及びＲｕｖＣエンドヌクレアーゼに相同な２つの独立したヌクレアーゼドメインを保有しており、２つのドメインのいずれかを変異させることにより、Ｃａｓ９タンパク質を一本鎖切断を導入するニッカーゼに変換することができる（Ｃｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３）。本開示の方法及び組成物は、Ｃａｓ９の一本鎖または二本鎖誘導型に加えて、他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、他の細菌Ｃａｓ９様系とともに使用できることが具体的に企図される。本明細書に記載の本発明の方法及び組成物の配列特異的ヌクレアーゼは、生物から操作するか、キメラ化するか、または単離することができる。ヌクレアーゼは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質の形態で細胞に導入することができる。
一実施形態では、本開示の方法は、ＨＩＦを標的とする及び／または除去もしくは抑制するために、１つ以上のｓｇＲＮＡを使用することを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＩＦを標的とする及び／またはＨＩＦを除去もしくは抑制するためのｓｇＲＮＡは、表１及び２に記載されている。
Figure 2023513208000002
Figure 2023513208000003
一実施形態では、本開示の方法は、ＫＥＡＰ１を標的とする及び／または除去もしくは抑制するために、１つ以上のｓｇＲＮＡを使用することを含む。
いくつかの実施形態では、ＫＥＡＰ１を標的とする及び／または除去もしくは抑制するためのｓｇＲＮＡは、ＫＥＡＰ１エクソン１を標的とする。いくつかの実施形態では、ＫＥＡＰ１を標的とする及び／または除去もしくは抑制するためのｓｇＲＮＡは、以下の配列：
ＡＧＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＧ（配列番号１４）；
ＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧ（配列番号１５）；
ＣＣＧＡＣＡＧＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＡＣＣ（配列番号１６）；
ＡＣＡＧＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧ（配列番号１７）；
ＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＣＴＣＧＣＣＣＡ（配列番号１８）；
ＧＡＣＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＣＡＧＣ（配列番号１９）；及び
ＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＴ（配列番号２０）のうちの１つを有する。
一実施形態では、ＤＮＡ消化剤は、部位特異的ヌクレアーゼであり得る。別の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓファミリーヌクレアーゼであり得る。より具体的な実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の機能的誘導体であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を改変する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）（または触媒的に不活性化された／不完全なＣａｓ９もしくはｄＣａｓ９）である。一実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）は、野生型Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣ及びＨＮＨ）の一方または両方の点変異によってエンドヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である。例えば、ｄＣａｓ９は触媒活性残基（Ｄ１０及びＨ８４０）の変異を含み、ヌクレアーゼ活性を有さない。場合によっては、ｄＣａｓは標的ＤＮＡの相補鎖と非相補鎖の両方を切断する能力が低減している。場合によっては、ｄＣａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のアミノ酸配列のＤ１０ＡとＨ８４０Ａの両方の変異を保有する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９の触媒活性が低減している場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／またはＤ９８６Ａを有する場合）、Ｃａｓタンパク質は、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＣａｓ結合配列と相互作用する能力を保持している限り、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＤＮＡ標的化配列によって標的ポリヌクレオチド配列へと依然として誘導されるため、依然として標的ＤＮＡに部位特異的に結合することができる。
本発明の方法及び系は、ＣＲＩＳＰＲ欠失（ＣＲＩＳＰＲｄ）を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲｄは、ＤＮＡ修復方策がデフォルトでＮＨＥＪに向かう傾向を利用しており、切断された鎖を修復するためにドナー鋳型を必要としない。代わりに、Ｃａｓはまず変異を保有する遺伝子にＤＳＢを生じさせ、次にＮＨＥＪが起こり、配列を破壊する挿入、及び／または欠失（インデル）が導入される。このようにして、遺伝子の発現が妨げられるか、または適切なタンパク質フォールディングが行われなくなる。この方策は、優性の状態に特に適用可能であり得、この場合、表現型を野生型に戻すには、変異した優性アレルをノックアウトし、野生型アレルをそのままにしておくことで十分であり得る。
十分に特徴付けられたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に加えて、Ｃｐｆ１（ＰｒｅＦｒａｎサブタイプのＣａｓタンパク質１）と呼ばれる新規ＣＲＩＳＰＲ酵素を、本発明の方法及び系で使用することができる（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ）。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単独のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。著者らは、Ｃｐｆ１がＣａｓ９とは異なる特徴を有する強力なＤＮＡ干渉を媒介することを実証した。したがって、本発明の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系を使用して、標的遺伝子内の所望の領域を切断することができる。
更なる実施形態では、ヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬＥＮは、特定のヌクレオチド配列に結合するＴＡＬエフェクタードメインと、標的部位で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼドメインとを含む（ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１１０７２２４６号、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４３－１４８、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３９：ｅ８２）。配列特異的エンドヌクレアーゼは、本質的にモジュール型であり得、ＤＮＡ結合特異性は１つ以上のモジュールを配置することによって得られる。Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９－２９７、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２。
ＺＦＮは、エフェクターエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ）に融合した２つ以上の（例えば、２～８つ、３～６つ、６～８つ、またはそれ以上の）配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン）を含み得る。Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７－９７３、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ＵＳＡ，９３：１１５６－１１６０、米国特許第６，８２４，９７８号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ１９９５／０９２３３号及び同第ＷＯ１９９４０１８３１３号。
一実施形態では、ヌクレアーゼは、オメガ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの群の部位特異的ヌクレアーゼであるか、またはオメガ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓからなる群から選択される。
本明細書に記載の方法及び組成物の配列特異的エンドヌクレアーゼは、生物から操作するか、キメラ化するか、または単離することができる。エンドヌクレアーゼは、例えば、変異誘発によって特定のＤＮＡ配列を認識するように操作することができる。Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３８７０－３８７９。コンビナトリアルアセンブリは、様々な酵素を形成するタンパク質サブユニットを会合または融合することができる方法である。Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５５：４４３－４５８。特定の実施形態では、変異誘発及びコンビナトリアルアセンブリというこれら２つのアプローチを組み合わせて、所望のＤＮＡ認識配列を有する操作エンドヌクレアーゼを生成することができる。
配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのより大きなコンストラクトの一部として、または直接、例えばエレクトロポレーション、脂質小胞、ウイルス輸送体、マイクロインジェクション、及び微粒子銃によって送達することができる。同様に、１つ以上の導入遺伝子を含むコンストラクトを、核酸を細胞に導入するのに適した任意の方法によって送達することができる。
本開示の方法において使用されるガイドＲＮＡ（複数可）は、それらがゲノム内の所定の切断部位へのＣａｓ－ｇＲＮＡ複合体の結合を誘導するように設計することができる。一実施形態では、切断部位は、フレームシフト変異の領域を含む断片または配列を放出するように選択され得る。更なる実施形態では、切断部位は、過剰染色体を含む断片または配列を放出するように選択され得る。
Ｃａｓファミリー酵素（Ｃａｓ９など）がＤＮＡと問題なく結合するために、ゲノムＤＮＡ内の標的配列がｇＲＮＡ配列に相補的である場合があり、その直後に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ、すなわち「ＰＡＭ」配列が続く場合があり得る。「相補性」とは、伝統的なワトソン・クリックまたは他の非伝統的なタイプのいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す。ハイブリダイゼーションを生じさせ、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある限り、完全な相補性は必ずしも必要とされない。標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭから遠位のミスマッチを許容することができる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌の種によって異なる。最も広く使用されているＣＲＩＳＰＲ系は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、ＰＡＭ配列は、ｓｇＲＮＡ認識配列の３’末端側直近に位置するＮＧＧである。例示的な細菌種に由来するＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭ配列としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＮＡＧＡＡ）、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＮＡＡＡＡＣ）が挙げられる。
本開示で使用されるｇＲＮＡ（複数可）は、約５～１００ヌクレオチド長、またはそれ以上（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００ヌクレオチド長、またはそれ以上）であり得る。一実施形態では、ｇＲＮＡ（複数可）は、約１５～約３０ヌクレオチド長（例えば、約１５～２９、１５～２６、１５～２５；１６～３０、１６～２９、１６～２６、１６～２５；または約１８～３０、１８～２９、１８～２６、または１８～２５ヌクレオチド長）であり得る。
ｇＲＮＡの設計を容易にするために、多くの計算ツールが開発されている（Ｐｒｙｋｈｏｚｈｉｊ ｅｔ ａｌ．２０１５ ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（３）：Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１４ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（９）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｊａｎ ２１（２０１４）、Ｈｅｉｇｗｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（２）：１２２－１２３を参照されたい）。ガイドＲＮＡ設計のための方法及びツールは、Ｚｈｕ ２０１５ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（４）：２８９－２９６（参照により本明細書に組み込まれる）で論じられている。更に、ｇＲＮＡ（複数可）の設計を容易にするために使用可能な公開ソフトウェアツールが存在する（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄｅｓｉｇｎ－ｔｏｏｌ及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｒｉｓｐｒ－ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ／ａｌｔ－ｒ－ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ９－ｓｙｓｔｅｍ）。
ＨＩＦ及びＫＥＡＰ１にハイブリダイズするかまたはそれらを標的とする阻害性核酸
特定の実施形態では、本発明の方法及び組成物で使用されるＨＩＦ阻害剤は、ＨＩＦの発現を低減させるポリヌクレオチドである。したがって、本方法は、ＨＩＦをコードするヌクレオチド配列（複数可）を特異的に標的とする有効量のポリヌクレオチドを投与することを含む。ポリヌクレオチドはＨＩＦの発現を低減させ、遺伝子産物（翻訳されたポリペプチド）のレベルを低減させる。
ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム）の核酸標的は、ＨＩＦの遺伝子または転写物内の任意の位置であり得る。
更なる実施形態では、本発明の方法及び組成物で使用されるＫＥＡＰ１阻害剤は、ＫＥＡＰ１の発現を低減させるポリヌクレオチドである。したがって、本方法は、ＫＥＡＰ１をコードするヌクレオチド配列（複数可）を特異的に標的とする有効量のポリヌクレオチドを投与することを含む。ポリヌクレオチドはＫＥＡＰ１の発現を低減させ、遺伝子産物（翻訳されたポリペプチド）のレベルを低減させる。
ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム）の核酸標的は、ＫＥＡＰ１の遺伝子または転写物内の任意の位置であり得る。
阻害性核酸は、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、またはそれらの組み合わせであり得る。
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、転写後遺伝子サイレンシング（「ＰＴＧＳ」）の一形態であり、例えば、二本鎖ＲＮＡの細胞への導入を含む。ＲＮＡｉにおける活性剤は長い二本鎖（逆平行二重鎖）ＲＮＡであり、鎖の一方は阻害対象のＲＮＡに対応するかまたはそれに対して相補的である。阻害されるＲＮＡが標的ＲＮＡである。長い二本鎖ＲＮＡは、およそ２０～２５ヌクレオチド対のより小さな二重鎖に切断され、その後、そのより小さなＲＮＡが標的の発現を阻害するメカニズムについては、現時点ではほとんど不明である。ＲＮＡ鎖が約１９ヌクレオチド対の予め定められたサイズの二重鎖として提供される場合、ＲＮＡｉはヒト細胞中で機能することができ、ＲＮＡｉは各鎖末端の対になっていない小さな３’伸長部で特に良好に機能した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－４９８（２００１））。
ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などであり得る。
阻害性核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの短いＲＮＡ分子であり得る。低分子干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡ分解経路を通じて遺伝子をサイレンシングするが、ｓｔＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、内因的にコードされたヘアピン構造の前駆体からプロセシングされ、翻訳抑制を介して遺伝子をサイレンシングするように機能するおよそ２１または２２ｎｔのＲＮＡである。例えば、ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，８（６）：８４２－５０（２００２）、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５（５６８８）：１２８９－９２（２００４）、Ｈｅ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．５（７）：５２２－３１（２００４）を参照されたい。
標的タンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ配列を予測するためのソフトウェアプログラムは市販されており、使用されている。１つのプログラム、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）のｓｉＤＥＳＩＧＮは、任意の核酸配列についてｓｉＲＮＡを予測することを可能にし、インターネット上のｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍで利用可能である。ｓｉＲＮＡを設計するためのプログラムはまた、他所、例えばＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（インターネット上のｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｓｓｌ－ｂｉｎ／ａｐｐ／ｒｎａｉで利用可能）から、また学術研究者及び非営利研究者については、ワールドワイドウェブ上の「ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｕｂｉｎｔ／ｈｔｔｐ：／／ｉｏｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／」で見られる、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の直接導入によって誘導される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の方法であり、様々な生物における特定の遺伝子の発現をノックアウトするための有用なツールとして登場している。ＲＮＡｉは、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６－８１１（１９９８）によって説明されている。ＰＴＧＳの他の方法が公知であり、例えば、導入遺伝子またはウイルスの導入が含まれる。一般に、ＰＴＧＳでは、サイレンシングされた遺伝子の転写物は、合成されるが急速に分解されるため蓄積されない。ＲＮＡｉを含むＰＴＧＳの方法については、例えば、ワールドワイドウェブサイトＡｍｂｉｏｎ．ｃｏｍのディレクトリ「／ｈｏｔｔｏｐｉｃｓ／」のファイル「ｒｎａｉ」中で説明されている。
いくつかの実施形態では、ＨＩＦのレベルは、ＲＰＥ細胞などの所望の標的細胞中で減少する。更に、そのような実施形態では、処置は、所望の標的細胞を標的とするものであるか、またはそれに特異的なものであり得る。ＨＩＦの発現は、ＲＰＥ細胞などの所望の標的細胞内でのみ特異的に減少し、細胞内では実質的に減少しない場合がある。したがって、そのような実施形態では、処置中または処置後の非標的細胞においては、ＨＩＦのレベルは実質的に同じまたは同様のままである。
いくつかの実施形態では、ＫＥＡＰ１のレベルは、ＲＰＥ細胞またはＲＧＣなどの所望の標的細胞中で減少する。更に、そのような実施形態では、処置は、所望の標的細胞を標的とするものであるか、またはそれに特異的なものであり得る。ＫＥＡＰ１の発現は、ＲＰＥ細胞またはＲＧＣなどの所望の標的細胞内でのみ特異的に減少し、細胞内では実質的に減少しない場合がある。したがって、そのような実施形態では、処置中または処置後の非標的細胞においては、ＫＥＡＰ１のレベルは実質的に同じまたは同様のままである。
あるいは、ウイルスベクター、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、または他の阻害剤、または関連化合物を、全身的ではなく局所的に、例えば、所望の標的部位への直接注射を介して、多くの場合デポーまたは徐放性製剤で投与することができる。更に、例えば、特定の神経細胞、または硝子体など、より具体的には肝細胞を標的とする、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームなどの標的薬物送達系で組成物を投与することができる。リポソームは、所望の組織を標的とし、その組織に選択的に取り込まれる。標的薬物送達系にはまた、ウイルスベクター、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、または他のＨＩＦ阻害剤の単独または組み合わせのナノ粒子特異的送達も含まれる。
阻害性核酸は、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１のｍＲＮＡ内の標的領域に相補的なアンチセンス核酸配列であり得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的領域に結合して翻訳を阻害し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得るか、またはリボデオキシヌクレオチドの合成類似体を含み得る。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１の発現を阻害する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０ヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。
本発明のアンチセンス核酸分子は、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１のｍＲＮＡとハイブリダイズするかまたは結合するように、対象に投与するか、またはｉｎ ｓｉｔｕで生成することができる。
リボザイム
阻害剤は、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１遺伝子の発現を阻害するリボザイムであり得る。
リボザイムは、当技術分野で公知の方法を使用して、化学合成し、構造的に修飾して、その安定性及び触媒活性を増加させることができる。リボザイムをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知の遺伝子送達メカニズムを通じて宿主細胞に導入することができる。
抗体
本発明の阻害剤は、ＨＩＦまたはＫＥＡＰ１に特異的な抗体またはその抗原結合部分であり得る。
抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）免疫グロブリン分子全体；（ｂ）ｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆａｂ断片；（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２；及び（ｅ）ジスルフィド結合Ｆｖであり得る。抗体またはその抗原結合部分は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、及びヒト化されたものであり得る。抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、またはヒト抗体／ヒト化抗体であり得る。
ベクター
本開示のいくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための核酸は、ウイルスベクターなどのベクターに含まれる。本開示のいくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための組成物は、ウイルスベクターなどのベクターを含む。ウイルスベクターは、例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルス（例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、またはシュードタイプウイルス、及び／または外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、または小分子を含むウイルス）であり得る。
ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞において、導入遺伝子に、その転写、翻訳、及び／または発現を可能にする形で作動可能に連結された、従来の制御エレメントを含み得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的遺伝子と隣接する発現制御配列と、トランスでまたは一定の距離で作用して目的遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；ならびに必要に応じて、コードされた産物の分泌を高める配列が含まれる。天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が当該技術分野で公知であり、利用可能であり得る。
本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）及び調節配列は、核酸配列の発現または転写を調節配列の影響下または制御下に置くような方法でそれらが共有結合している場合、作動可能に連結されているとされる。核酸配列が機能性タンパク質に翻訳されることが望まれる場合は、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合に、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されているとされる。したがって、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合、プロモーター領域は核酸配列に作動可能に連結されている。
本開示のいくつかの実施形態では、導入遺伝子、例えばＰＧＣ１αまたはＮＲＦ２は、適切な細胞での、例えばＲＧＣまたはＲＰＥでの導入遺伝子の発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、核酸阻害剤またはコード化阻害剤、例えば、ＨＩＦの阻害剤をプロモーターに連結して、適切な細胞での、例えばＲＰＥでの核酸の発現を誘導する。
いくつかの実施形態では、核酸阻害剤またはコード化阻害剤、例えば、ＫＥＡＰ１の阻害剤をプロモーターに連結して、適切な細胞での、例えばＲＧＣまたはＲＰＥでの核酸の発現を誘導する。
ＲＧＣを標的とするためのプロモーターは、例えば、ｈＳＮＣＧまたはＰｌｅ（ＮＥＦＬ）であり得る。
ＲＰＥを標的とするためのプロモーターは、例えば、ＶＭＤ２またはＲＰＥ６５であり得る。
あるいは、ＣＭＶ、ＥＦ１、ＣＡＧ、ＣＢ７、ＰＧＫ、及びＳＦＦＶを含むがこれらに限定されない、ユビキタスプロモーターを使用することができる。
ポリアデニル化配列及び転写後調節エレメントなどの他の調節エレメントも、それぞれ効率的なプレｍＲＮＡプロセシング及び遺伝子発現の増加のために使用することができる。タンパク質をコードする核酸の場合、ポリアデニル化配列は、一般に導入遺伝子配列の後に挿入される。ポリアデニル化配列の例としては、ＳＶ４０、ｂＧＨｐｏｌｙＡ、及びｓｐＡが挙げられる。転写後調節エレメントの例としては、ＷＰＲＥ、ＷＰＲＥ３、及びＨＰＲＥが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列及び転写後調節エレメントの最適化された組み合わせを、ベクター中で使用することができる。
宿主細胞での遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種、組織、または細胞タイプの間で異なり得るが、一般に、必要に応じて、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写配列及び５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサーエレメントなどを含む必要がある。特に、そのような５’非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流活性化配列を含み得る。ベクターは、任意選択で、５’リーダー配列またはシグナル配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能を付与する。場合によっては、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。
組換えＡＡＶベクター
本明細書に記載の「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、一般に導入遺伝子（例えば、ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２をコードする）を含む。導入遺伝子は、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲに隣接し、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び／または発現を可能にする形で、１つ以上の調節エレメントに作動可能に連結され得る。このような調節エレメントには、本明細書に記載されているものの中でも、ニワトリベータアクチンプロモーターまたはサイトメガロウイルスエンハンサーなどのプロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。組換えＡＡＶゲノムは、一般にカプシドタンパク質（例えば、ＩＴＲが由来するものと同じＡＡＶ血清型に由来する、またはＩＴＲが由来するものとは異なるＡＡＶ血清型に由来する）によってカプシド形成される。次に、ＡＡＶベクターは、選択された標的細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ベクター配列とは異種の核酸配列であり、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）または他の目的遺伝子産物（例えば、ＰＧＣ１α）をコードする。本開示の組成物及び方法と併せて使用することができる例示的なＡＡＶベクターの構成要素は、以下に記載される。
任意のＡＡＶ血清型またはＡＡＶ血清型の組み合わせを、本発明の方法及び組成物で使用することができる。本発明の方法及び組成物は、ミトコンドリア障害を処置及び治癒するためのものであることから、いくつかの実施形態では、少なくとも筋、または少なくとも筋及び中枢神経系を標的とするＡＡＶ血清型を使用することができ、それらには、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。
いくつかの実施形態では、広い指向性を有するＡＡＶ９血清型が使用される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２血清型が使用される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８血清型が使用される。
ＡＡＶベクターの構成要素
本明細書に記載のＡＡＶベクターは、シス作用性５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含み得る（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ “Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、通常約１４５ｂｐ長である。ＩＴＲをコードする配列の実質的に全体が分子内で使用されることが好ましいが、これらの配列のある程度の軽微な改変は許容される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，（１９８９）及びＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）などのテキストを参照されたい）。そのような分子の例は、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントが、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型を含む、任意の公知のＡＡＶから得ることができる。
組換えＡＡＶベクターについて上記で明確にしたエレメントに加えて、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞において、導入遺伝子に、その転写、翻訳、及び／または発現を可能にする形で作動可能に連結された、従来の制御エレメントを含み得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的遺伝子と隣接する発現制御配列と、トランスでまたは一定の距離で作用して目的遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；ならびに必要に応じて、コードされた産物の分泌を高める配列が含まれる。天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が当該技術分野で公知であり、利用可能であり得る。
本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）及び調節配列は、核酸配列の発現または転写を調節配列の影響下または制御下に置くような方法でそれらが共有結合している場合、作動可能に連結されているとされる。核酸配列が機能性タンパク質に翻訳されることが望まれる場合は、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合に、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されているとされる。したがって、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合、プロモーター領域は核酸配列に作動可能に連結されている。同様に、２つ以上のコード領域は、共通のプロモーターからのそれらの転写がインフレームで翻訳された２つ以上のタンパク質の発現をもたらすような方法で連結されている場合、作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、作動可能に連結されたコード配列は、機能性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をもたらす。
タンパク質をコードする核酸の場合、ポリアデニル化配列は、一般に導入遺伝子配列の後、かつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本発明において有用なｒＡＡＶコンストラクトはまた、イントロン（望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置する）を含み得る。１つの考えられるイントロン配列は、ＳＶ－４０に由来し、ＳＶ－４０ Ｔイントロン配列と称される。
使用することができる別のベクターエレメントは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写物から複数のポリペプチドを生成するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、複数のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使用される。これら及び他の一般的なベクターエレメントの選択は慣習的であり、多くのそのような配列が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ及び引用文献を参照されたい）。そのようなモチーフは、例えば、複数の遺伝子またはその部分が同じＡＡＶベクターから発現される場合に有用であり得る。
宿主細胞での遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種、組織、または細胞タイプの間で異なり得るが、一般に、必要に応じて、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写配列及び５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサーエレメントなどを含む必要がある。特に、そのような５’非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流活性化配列を含み得る。ベクターは、任意選択で、５’リーダー配列またはシグナル配列を含み得る。
構成的プロモーターの例としては、ニワトリベータアクチンプロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、１３－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦｌａプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境要因、または特定の生理学的状態（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態）の存在、または複製細胞中のみによって調節することができる。誘導性プロモーター及び誘導性系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含むがこれらに限定されない様々な商業的供給源から入手可能である。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３３４６－３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７－５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２－４４１（１９９７））ならびにラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５－２８７２（１９９７））が挙げられる。この文脈において有用であり得る更なる他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞中のみによって調節されるものである。
別の実施形態では、導入遺伝子のための天然プロモーターまたはその断片が使用される。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきであることが望まれる場合、天然プロモーターが好ましい場合がある。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現を一時的もしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節する必要がある場合に使用され得る。更なる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントも、天然の発現を模倣するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能を付与する。場合によっては、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡに対する１つ以上の結合部位が、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子に組み込まれて、導入遺伝子を保有する対象の１つ以上の組織における導入遺伝子の発現を阻害する。ｍＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはコード領域にあり得る。通常、標的部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにある。更に、導入遺伝子は、複数のｍｉＲＮＡが同じまたは複数の部位を認識することによってｍＲＮＡを調節するように設計され得る。複数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在すると、複数のＲＩＳＣの協調作用がもたらされ、極めて効率的に発現阻害され得る。標的部位配列は、合計５～１００、１０～６０、またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。標的部位配列は、標的遺伝子結合部位の配列の少なくとも５ヌクレオチドを含み得る。
例えば、肝臓における導入遺伝子の発現を阻害する３’ＵＴＲ部位を導入遺伝子に組み込むことができる。投与されたウイルスの大部分（およそ６０～９０％）が最終的に肝臓で見出されるため、このことは、肝臓に対して毒性である治療用タンパク質をコードする導入遺伝子にとって有益である。このように、肝臓での治療遺伝子の発現を抑制することで、肝細胞の負担を緩和する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、自己相補型ＡＡＶとなるように改変される。自己相補型ＡＡＶは、導入遺伝子の相補配列（すなわち、導入遺伝子の二重コピー）を保持する。自己相補性は、細胞に入った後の遺伝子をより安定させる。
ＡＡＶベクターの入手方法
所望のカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法が記載されている（例えば、米国特許第７，９０６，１１１号を参照されたい）。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８（１２）：６３８１－６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００（１０）：６０８１－６０８６（Ｍａｙ １３，２００３）、及び米国特許第７，９０６，１１１号、米国特許第８，９９９，６７８号に開示されているものなど、多くの様々なＡＡＶカプシドタンパク質が記載されている。本明細書に記載されているコンストラクト及び方法の所望のパッケージングのためには、ＡＡＶ９ベクター及びカプシド、またはＡＡＶ２ベクター及びカプシドが好ましい。但し、ｒＡＡＶｒｈ．８及びｒＡＡＶｒｈ．１０などの他の適切なＡＡＶ、または他の同様のベクターを、本発明の組成物での使用に適合させることができることに留意されたい。方法は、通常、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列と；機能的ｒｅｐ遺伝子と；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子から構成される組換えＡＡＶベクターと；ＡＡＶカプシドタンパク質への組換えＡＡＶベクターのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含む宿主細胞を培養することを含む。
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシドにパッケージングするために宿主細胞で培養される構成要素は、宿主細胞にトランスで提供され得る。あるいは、必要な構成要素のいずれか１つ以上（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）は、当業者に公知の方法を使用して、必要な構成要素の１つ以上を含むように操作された安定宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、そのような安定宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要な構成要素（複数可）を含む。しかしながら、必要な構成要素（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。更に別の選択肢では、選択された安定宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された構成要素（複数可）及び１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された構成要素（複数可）を含み得る。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含む、安定宿主細胞を生成することができる。
ｒＡＡＶを産生するための組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝エレメント（ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝エレメントは、本明細書に記載のものを含む任意の適切な方法によって送達され得る。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：５２０－５３２（１９９３）及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載されているように）トリプルトランスフェクション法を使用して産生され得る。典型的には、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子にパッケージングされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及び補助機能ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードし、増殖的なＡＡＶ複製及びカプシド形成のためにトランスで機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的なｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生成させずに効率的なＡＡＶベクター産生を支援する。本発明とともに使用するのに適したベクターの非限定的な例には、米国特許第６，００１，６５０号に記載されているｐＨＬＰ１９、及び米国特許第６，１５６，３０３号に記載されているｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが含まれ、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。補助機能ベクターは、ＡＡＶの複製を左右する非ＡＡＶ由来ウイルス及び／または細胞の機能（すなわち、「付属機能」）に関するヌクレオチド配列をコードする。補助機能には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分を含むがこれらに限定されない、ＡＡＶ複製に必要な機能が含まれる。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、及びワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。
例示的組換えＡＡＶ組成物
本開示は、機能性タンパク質をコードする核酸配列を含む組換えＡＡＶを含む組成物を提供する。そのようなタンパク質としては、ＰＧＣ１αまたはＮＲＦ２が挙げられるが、これらに限定されない。
ＰＧＣ１αをＲＰＥに送達するための例示的な組換えＡＡＶを図３に示す。
ＮＲＦ２をＲＰＥに送達するための例示的な組換えＡＡＶを図１に示す。
ＰＧＣ１αをＲＧＣに送達するための例示的な組換えＡＡＶを図９に示す。
ＮＲＦ２をＲＧＣに送達するための例示的な組換えＡＡＶを図１０に示す。
医薬組成物、投与経路、及び投薬
本開示は、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない神経変性疾患もしくは障害の発症を遅延させる、それらの神経変性疾患もしくは障害を処置する、予防する、及び／または治癒する方法、及び／またはこれらの疾患に関連する症状のうちの少なくとも１つを対象において軽減する方法に使用するための、ベクター、例えば、ＡＡＶ及びレンチウイルスを提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、薬学的に許容される担体中の１つ以上のペプチド、ポリペプチド、エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスヌクレオチドをコードするｒＡＡＶベクターを、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない神経変性疾患または障害を有するか、または有することが疑われる対象のそのような障害の発症を遅延させ、そのような障害を処置し、予防し、及び／または治癒するのに十分な量及び期間、対象に投与することを含む。
ｒＡＡＶは、当該技術分野で公知の任意の適切な方法に従って、組成物で対象に送達され得る。好ましくは、生理学的に適合性のある担体（例えば、組成物中の担体）に懸濁されたｒＡＡＶを対象に投与することができる。特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１つ以上の他のウイルス（例えば、１つ以上の異なる導入遺伝子またはエンドヌクレアーゼを有するものをコードする第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含み得る。
一実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＰＧＣ１αを含むがこれに限定されない）及びｈＳＮＣＧプロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ２／２ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＰＧＣ１αを含むがこれに限定されない）及びＰｌｅ（ＮＥＦＬ）プロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ２／２ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＮＲＦ２を含むがこれに限定されない）及びｈＳＣＮＧプロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ２／２ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＮＲＦ２を含むがこれに限定されない）及びＰｌｅ（ＮＥＦＬ）プロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ２／２ベクターを含み得る。
更なる実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＰＧＣ１αを含むがこれに限定されない）及びＶＭＤプロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
更なる実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＮＲＦ２を含むがこれに限定されない）及びＶＭＤプロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
更なる実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＰＧＣ１αを含むがこれに限定されない）及びＲＰＥ６５プロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
更なる実施形態では、組成物は、機能性タンパク質（ＮＲＦ２を含むがこれに限定されない）及びＲＰＥ６５プロモーターをコードする導入遺伝子を含む核酸配列を含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＨＩＦの阻害剤またはＨＩＦの阻害剤をコードする核酸配列、及びＶＭＤ２プロモーターを含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１の阻害剤またはＫＥＡＰ１の阻害剤をコードする核酸配列、及びＶＭＤ２プロモーターを含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＨＩＦの阻害剤またはＨＩＦの阻害剤をコードする核酸配列、及びＲＰＥ６５プロモーターを含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１の阻害剤またはＫＥＡＰ１の阻害剤をコードする核酸配列、及びＲＰＥ６５プロモーターを含むｒＡＡＶ８ベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１の阻害剤またはＫＥＡＰ１の阻害剤をコードする核酸配列、及びｈＳＣＮＧプロモーターを含むｒＡＡＶ２／２ベクターを含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、薬学的に許容される担体中の１つ以上のペプチド、ポリペプチド、エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスヌクレオチドをコードするレンチウイルスベクターを、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症を含むがこれらに限定されない神経変性疾患または障害を有するか、または有することが疑われる対象のそのような障害の発症を遅延させ、そのような障害を処置し、予防し、及び／または治癒するのに十分な量及び期間、対象に投与することを含む。
レンチウイルスベクターは、当該技術分野で公知の任意の適切な方法に従って、組成物で対象に送達され得る。好ましくは、生理学的に適合性のある担体（例えば、組成物中の担体）に懸濁されたレンチウイルスベクターを対象に投与することができる。特定の実施形態では、組成物は、レンチウイルスベクターを単独で、または１つ以上の他のウイルス（例えば、１つ以上の異なる導入遺伝子またはエンドヌクレアーゼを有するものをコードするウイルスベクター）と組み合わせて含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＨＩＦの阻害剤またはＨＩＦの阻害剤をコードする核酸配列、及びＶＭＤ２プロモーターを含むレンチウイルスベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＨＩＦの阻害剤またはＨＩＦの阻害剤をコードする核酸配列、及びＲＰＥ６５プロモーターを含むレンチウイルスベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１の阻害剤またはＫＥＡＰ１の阻害剤をコードする核酸配列、及びＶＭＤ２プロモーターを含むレンチウイルスベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１の阻害剤またはＫＥＡＰ１の阻害剤をコードする核酸配列、及びＲＰＥ６５プロモーターを含むレンチウイルスベクターを含み得る。
一実施形態では、組成物は、ＫＥＡＰ１の阻害剤またはＫＥＡＰ１の阻害剤をコードする核酸配列、及びｈＳＣＮＧプロモーターを含むレンチウイルスベクターを含み得る。
適切な担体は、ｒＡＡＶまたはレンチウイルスベクターが対象とする適応症を考慮して、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体としては生理食塩水が挙げられ、これは様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）で製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択は、本発明を限定するものではない。
任意選択で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶまたはレンチウイルスベクター及び担体（複数可）に加えて、防腐剤または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。適切な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に高ｒＡＡＶ濃度（例えば、約１０１３ＧＣ／ｍｌ以上）が存在する場合に、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減させる方法は当該技術分野で周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨの調整、及び塩濃度の調整が含まれる（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：１７１－１７８（２００５）を参照されたい）。
薬学的に許容される賦形剤及び担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、同様に、本明細書に記載される特定の組成物を様々な処置レジメンで使用するのに適した投薬及び処置レジメンの策定も当業者に周知である。典型的には、これらの製剤は少なくとも約０．１％の活性成分もしくはそれ以上を含有し得るが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、当然ながら変動してもよく、好都合には、製剤全体の重量または体積の約１％または２％～約７０％もしくは８０％またはそれ以上の間であり得る。当然のことながら、各治療上有用な組成物の活性成分の量は、化合物の任意の所与の単位用量で適切な投与量が得られるように調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間、及び他の薬理学的考慮事項などの因子が、そのような医薬製剤を調製する当業者によって考慮され、したがって、様々な投与量及び処置レジメンが望ましい場合がある。
注射用途に適した医薬形態には、注射用滅菌溶液または滅菌分散液を即時調製するための滅菌水溶液または滅菌分散液及び滅菌粉末が含まれる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、及び油中で調製することができる。これらの調製物は、通常の保存条件及び使用条件下で、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。多くの場合、その形態は、無菌であり、容易に注射できる程度の流動性を有している。これはまた、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌または真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、及び／または植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによりもたらされ得る。
注射用水溶液の投与では、例えば、溶液を必要に応じて適切に緩衝する場合があり、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで液体希釈剤を等張にする場合がある。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与に特に適している。この点に関して、用いることができる滅菌水性媒体は当業者に公知である。例えば、１投与量を１ｍｌのＮａＣｌ等張液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に加えるか、または注入予定部位に注射することができる。投与量については、宿主の状態に応じて、ある程度の変動が必然的に生じることになる。いずれにせよ、投与を担当する者が個々の宿主に対して適切である用量を決定する。
注射用滅菌溶液は、本明細書に列挙された様々な他の成分とともに、活性ｒＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを必要量で適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、滅菌された様々な活性成分を、ベースとなる分散媒と、上に列挙した成分のうち必要とされる他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、その調製の好ましい方法は、活性成分と任意の所望の追加成分とを合わせた粉末が、その予め滅菌濾過した溶液から得られる、真空乾燥及び凍結乾燥技法である。
上記の送達方法に加えて、組成物を宿主に送達する別の方法として、以下の技法も企図される。ソノフォレシス（すなわち、超音波）は、循環系への、及び循環系を通る薬物透過の速度及び有効性を高めるためのデバイスとして使用され、米国特許第５，６５６，０１６号に記載されている。考えられる薬物送達の他の代替法は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼科用製剤、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号及び同第５，７８３，２０８号）、ならびにフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。
ｒＡＡＶ及びレンチウイルスベクターは、過度の悪影響なしに、所望組織の細胞をトランスフェクトし、十分なレベルの遺伝子導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の及び薬学的に許容される投与経路としては、選択された組織への直接送達（例えば、脳内投与、髄腔内投与）、静脈内、経口、吸入（鼻腔内及び気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、ならびにその他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。所望により、投与経路を組み合わせてもよい。投与レジメンは、治療用組成物の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、及び生物学的マトリックス中の標的細胞への到達性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、望ましくない副作用を最小限に抑えると同時に、標的疾患状態を改善するのに十分な治療用組成物を送達する。したがって、送達される生物製剤の量は、特定の治療用組成物及び処置される状態の重症度に部分的に依存する。
本発明は、ｒＡＡＶビリオンを含む安定医薬組成物を提供する。組成物は、凍結／融解サイクルに晒された場合、またガラスを含む様々な素材で作製された容器に保管されている場合であっても、依然として安定しており、活性である。
適切な用量は、数ある因子の中でも、処置される対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、処置される対象の年齢及び全身状態、処置される状態の重症度、ｒＡＡＶビリオンの投与方式に依存する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。
所望の効果または「治療効果」を得るために必要なｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、ベクターゲノム／キログラム体重（ｖｇ／ｋｇ）での用量単位は、ｒＡＡＶの投与経路；治療効果を得るために必要な遺伝子またはＲＮＡの発現レベル；処置されている特定の疾患または障害；及び遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に基づいて変動する。当業者は、前述の因子、及び当該技術分野で周知の他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する対象を処置するためのｒＡＡＶビリオンの用量範囲を容易に決定することができる。ｒＡＡＶの有効量は、一般に、１対象あたり約１０９～１０１６ゲノムコピーを含有する溶液約１０μｌ～約１００ｍｌの範囲である。他の量の溶液を使用することができる。使用される量は、典型的には、とりわけ、対象のサイズ、ｒＡＡＶの用量、及び投与経路に依存する。場合によっては、１対象あたり約１０１０～１０１２ｒＡＡＶゲノムコピーの投与量が適切である。特定の実施形態では、１対象あたり１０１２ｒＡＡＶゲノムコピーが、所望の組織を標的とするのに有効である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、１対象あたり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ゲノムコピーの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、１ｋｇあたり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ゲノムコピーの用量で投与される。
したがって、「治療有効量」は、臨床試験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ることになる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ注射、すなわち、対象へ直接注射する場合、治療有効用量は、約１０５～約１０１６程度のｒＡＡＶビリオン、より好ましくは、約１０８～１０１４のｒＡＡＶビリオンである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入の場合、細胞に送達される有効量のｒＡＡＶビリオンは、１０５～１０１３程度、好ましくは、１０８～１０１３のｒＡＡＶビリオンである。対象に戻される形質導入細胞を組成物が含む場合、医薬組成物中の形質導入細胞の量は、約１０４～１０１０細胞、より好ましくは１０５～１０８細胞である。当然ながら、用量は、形質導入効率、プロモーター強度、伝達暗号及びそれによってコードされるタンパク質の安定性などに依存する。有効投与量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を通じて、当業者によって容易に確立され得る。
投薬処置は、最終的に上記に指定された量を送達するための単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。更に、対象は、必要に応じて多くの用量を投与され得る。したがって、例えば１０５～１０１６のｒＡＡＶビリオンを単回用量で、または例えば、１０５～１０１６のｒＡＡＶビリオンを合わせて送達させる２回、４回、５回、６回、またはそれ以上の用量で、対象に与えることができる。当業者は、投与する適切な用量数を容易に決定することができる。
したがって、医薬組成物は、目的タンパク質の治療有効量、すなわち、当該疾患状態の症状を低減させるかもしくは改善するのに十分な量、または所望の利益を与えるのに十分な量を生じさせるのに十分な遺伝物質を含む。したがって、ｒＡＡＶビリオンは、１回以上の用量で投与された場合に治療効果をもたらすのに十分な量で対象組成物中に存在する。ｒＡＡＶビリオンは、凍結乾燥調製物として提供され、即時または将来使用するためのビリオン安定化組成物に希釈され得る。あるいは、ｒＡＡＶビリオンは、生成直後に提供され、将来の使用のために保存され得る。
医薬組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤または担体も含有する。そのような賦形剤は、それ自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品を含む。薬学的に許容される賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩がその中に含まれ得る。更に、湿潤剤または乳化剤などの補助物質、ｐＨ緩衝物質などが、そのようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に許容される賦形剤の完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）にて入手可能である。
治療剤及び診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または水性懸濁液の形態で、許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製することができる。
単独で投与されるか、または別の薬剤と組み合わせて投与される治療用組成物の毒性及び治療有効性は、細胞培養物または実験動物で標準薬学的手順により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対する治療上有効な用量）を決定することにより、決定することができる。毒性作用と治療効果と間の用量比は、治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様では、高い治療指数を示す治療用組成物が望ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための用量範囲を策定する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響を与えることが当該技術分野で公知であるか、または疑われるパラメータまたは因子を使用して、臨床医によって行われる。一般に、用量は最適用量より幾分少ない量から開始し、その後、あらゆる負の副作用と比較して所望の効果または最適効果が達成されるまで、用量を少しずつ増加させる。重要な診断尺度には、症状（例えば、炎症症状）または産生される炎症性サイトカインのレベルの診断尺度が含まれる。一般に、使用される生物製剤は、処置の対象となる動物と同じ種に由来し、それによって試薬に対するあらゆる免疫応答を最小限に抑えることが望ましい。
投与レジメンは、治療用組成物の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、及び生物学的マトリックス中の標的細胞への到達性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、望ましくない副作用を最小限に抑えると同時に、標的疾患状態を改善するのに十分な治療用組成物を送達する。したがって、送達される生物製剤の量は、特定の治療用組成物及び処置される状態の重症度に部分的に依存する。
特定の実施形態では、投与経路は、網膜下注射、硝子体内注射、または脈絡膜上注射である。
用量は、対象における効果を最適化するために調整することができる。更に、投与量を増加させる前に、対象の状態の改善についてモニタリングすることができる。
キット
本開示はまた、キットの形態で本明細書に開示される組み合わせの構成要素を含むキットを提供する。本開示のキットは、本明細書に記載のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター）を含むがこれらに限定されない、１つ以上の構成要素を含む。キットは、本明細書で論じられたように、薬学的に許容される担体を更に含み得る。ウイルスベクターは、純粋な組成物として、または薬学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物中に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを１つの容器（例えば、無菌のガラスまたはプラスチックバイアル）中に含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の阻害剤を含むＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを１つの容器（例えば、無菌のガラスまたはプラスチックバイアル）中に含む。
キットが対象への網膜下注射または硝子体内注射用の１つ以上の医薬組成物を含む場合、キットはそのような投与を行うためのデバイスを含み得る。
キットは、キット中の医薬組成物及び剤形に関する情報を含む添付文書を含み得る。一般に、そのような情報は、患者及び医師が同梱の医薬組成物及び剤形を効果的かつ安全に使用するのに役立つ。例えば、組み合わせに関する以下の情報が添付文書に記載され得る：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメータ、適応症及び使用法、禁忌、警告、注意事項、副作用、過量投与、適切な投与量及び投与、供給方法、適切な保存条件、参照文献、製造者／販売者情報、ならびに特許情報。
〔実施例〕
本発明は、本発明の好ましい実施形態をより十分に説明するために提示される以下の非限定的な実施例を参照することによって、より良く理解され得る。それらは、本発明の広い範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。
実施例１－標的化ＡＡＶベクターは、ＮＲＦ２を送達し、錐体及び桿体の生存を促進するＲＰＥの抗酸化応答を増強させる
材料及び方法
ＲＰマウスモデル
Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑマウス（Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑホモ接合体）は、十分に確立された前臨床ＲＰマウスモデルであり、ホスホジエステラーゼ６触媒ドメインにミスセンス変異を保有しており、正常な光受容体分化を経て、変性の発症前に網膜機能を保持している。Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑマウスが出生後（Ｐ）３０日目に桿体応答を喪失し、Ｐ６０以降に錐体応答を喪失したことを示すために、ＥＲＧを使用している。網膜切片の組織像により、Ｐ２８に４列、Ｐ４９に２列の核が示された。Ｐｄｅ６ｂｒｄ１マウスと比較して、Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑマウスの光受容体変性は比較的遅延していることが示され、生後２～３週間という早期に始まり、３ヶ月までに光受容体がほぼ完全に喪失する（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．２００８）。
ＡＡＶベクターの構築
ＲＰＥにおける抗酸化応答を増強させるために、－２５３～＋３８ｂｐ（およそ３００ｂｐ）のＶＭＤ２上流領域をＲＰＥ特異的プロモーターとして使用し（Ｅｓｕｍｉ，ｅｔ ａｌ．２００４）、マウスＮｒｆ２（１．８ｋｂ）を送達させる（図１）。マウスＮｒｆ２は、Ｎｒｆ２を核内に輸送することができる２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）モチーフを含むことが報告された（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．２００８）。検証用の対照としてのＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ｅＧＦＰと、本発明者らの仮説を試験するためのＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰという２つのベクターを作製する（図１）。陰性対照として、ＲＰＥをＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ｅＧＦＰで形質導入する。
網膜下注射
手順を既に記載されているように実施する（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．２００８、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１３）。これらの手順では、新生マウスの片眼の眼瞼を、顕微手術用剪刀を使用して人為的に切開する。ウイルス溶液およそ１μｌ（１０１２ＧＣ／ｍｌ）を、出生後５日目（Ｐ５）に右眼に網膜下注射する。左眼は陰性対照として機能させる。これらの手順は過去に、３０％～５０％の網膜細胞の形質導入をもたらしたことがある。
対照ベクターを最初に注射すると、ＲＰＥに限定されたＧＦＰの発現が見られる。次に、ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰをマウスに注射する。
マウスを以下の通り評価する。
免疫ブロット。タンパク質をＲＰＥから抽出し、ＮＱＯ１（ＳＣ－１６４６４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＨＯ－１（ＳＣ－１０７８９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びローディング対照としてのマウスベータアクチン抗体（ａｂ８２２４；Ａｂｃａｍ）に対するモノクローナル抗体でプローブする。
ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＰＣＲ。ＲＰＥからＲＮＡを抽出し、逆転写する。リアルタイムｑＰＣＲを、Ｎｒｆ２標的遺伝子ＮＱＯ１、ＨＯ－１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、及びグルタチオン合成酵素に対するプライマーを使用して実施する。
ＥＲＧ。ＥＲＧを記載されている通りに実施する（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．２００８、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１０）。簡潔に述べると、Ｅｓｐｉｏｎ ＥＲＧ Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ装置（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＬ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を使用して記録する。試行ごとに応答を平均化する。桿体特異的機能を評価するために暗光での暗順応ｂ波を測定し、内網膜機能を評価するために暗順応最大ｂ波を測定し、光受容体特異的機能を評価するために暗順応最大ａ波を測定し、錐体特異的機能を評価するために明順応ｂ波を測定する。ＥＲＧは、Ｐｄｅ６ｂＨ６２０ＱマウスのＰ３０及びＰ６０に実施する。
光受容体のスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）ライブイメージング定量化。光受容体の生存を、ライブイメージング、ならびに桿体及び錐体の外節長の測定によって定量化する。簡潔に述べると、Ｃｏｌｕｍｂｉａコアマウス施設にあるＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ装置（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＳＤ－ＯＣＴイメージングからの読み取り値を使用してＯＮＬ厚を決定する。
免疫組織化学及び蛍光染色。Ｐｄｅ６ｂＨ６２０ＱマウスのＰ６０に組織を収集する。網膜凍結切片及び神経網膜フラットマウントの免疫標識及び蛍光染色を、既に記載されているように（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｔｏｓｉ，ｅｔ ａｌ．２０１０）、但し以下の変更を加えて実施する。動物１匹ごとに、片眼を凍結切片用に処理し、他方をフラットマウント用の神経網膜に切開する。凍結切片用の眼杯を４％冷パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中で一晩固定し、神経網膜をフラットマウントにして１時間固定する。次の一次及び二次抗体ならびに希釈液を使用する：ウサギ抗ａｒｒ３（錐体アレスチン１：１，０００；ａｂ１５２８２；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；脂質過酸化反応用のマウス抗アクロレイン（１：２５０；ａｂ４８５０１；Ａｂｃａｍ）；ミトコンドリアマーカー用のウサギα－ＶＤＡＣ（１：１０００；Ｄ７３Ｄ１２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ヤギ抗ウサギ（１：１，０００；Ａ－１１０３４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核をＤＡＰＩで対比染色する。
桿体の生存の定量化。桿体数の別の尺度として、網膜のロドプシンｍＲＮＡを測定する。シクロフィリンの発現は、多くの異なる条件下で安定しており、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるロドプシンの正規化の基準として使用される。
錐体の生存の定量化。錐体数の定量化を、記載されているように、両方の眼杯からの凍結切片及び神経網膜フラットマウントを使用して実施する。１０個の連続切片を抗Ａｒｒ３抗体とインキュベートする。核をＤＡＰＩで対比染色する。全ての画像を、本発明者らの共焦点及び特殊顕微鏡コア施設（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）内のＮｉｋｏｎ Ｔｉ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立共焦点顕微鏡で取得する。アレスチン＋細胞を、半自動定量化ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計数する。
実験的比較。Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑマウスの右眼（ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰを注射）と左眼（対照ＡＡＶを注射）との暗順応最大ｂ波及び明順応ｂ波の振幅（２時点）ならびにＯＮＬ厚（１時点）を比較する。この設計により、対応のあるｔ検定を使用することができる。異なるウイルス群間の左右の眼の相違を評価する。
結果
ＡＡＶ８－ＶＭＤ－ｅＧＦＰ形質導入により、ＲＰＥでのＧＦＰの特異的発現が可能となる。したがって、ＲＰのマウスモデルにおけるＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰベクターの注射を実施する。
ＥＲＧ解析及び組織像から明らかなように、ＲＰＥにおけるＮＲＦ２の過剰発現は桿体及び錐体の変性を遅延させる。更に、ＲＰマウスモデルにおいて、ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ｅＧＦＰ注射眼または非注射眼と比較して、ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰ注射眼から収集したＲＰＥにおけるＡＲＥ関連遺伝子のアップレギュレーションも見られる。
実施例２－標的化ＡＡＶベクターは、ＰＧＣ１αを送達し、錐体及び桿体の生存を促進するＲＰＥの抗酸化応答を増強させた
材料及び方法
ＲＰマウスモデル、ならびに網膜下注射、ならびに評価（酸化的リン酸化マーカー、ＥＲＧ、ならびに抗ａｒｒ抗体を用いた免疫組織化学及び蛍光染色、ならびに実験的比較を含む）について、実施例１と同じ材料及び方法を使用した。
網膜色素変性症マウスモデルにおける近年の研究において、網膜ＰＧＣ１α過剰発現の有害な影響が報告された。このｉｎ ｖｉｖｏマウス研究の潜在的な弱点は、非特異的ＣＭＶプロモーターを使用しており、ＲＰＥ及び光受容体で非特異的な過剰発現を引き起こしたことである。しかし、本発明者らのｉｎ ｖｉｖｏマウス研究では、ＲＰＥプロモーターによって駆動されたＰＧＣ１αの過剰発現が、本発明者らのＲＰマウスモデルの光受容体を有意に保護することを示した（図２）。これは、ＣＭＶプロモーターでＰＧＣ１αの過剰発現を駆動させると、ＲＰＥ及び光受容体において代謝が異なるようにリプログラミングされる場合があり、これにより光受容体に予期しない細胞損傷が生じ得ることを示している。したがって、細胞特異的な標的治療が必要とされている。
論じられたように、ＲＰＥにおける抗酸化応答を増強させるために、－２５３～＋３８ｂｐ（およそ３００ｂｐ）のＶＭＤ２上流領域をＲＰＥ特異的プロモーターとして使用し（Ｅｓｕｍｉ，ｅｔ ａｌ．２００４）、マウスＰＧＣ１αを送達させた（図３）。検証用の対照としてのＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－ｍｃｈｅｒｒｙ（図３Ｂ）と、本発明者らの仮説を試験するためのＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－ＰＧＣ１α－ｍｃｈｅｒｒｙ（図３Ａ）という２つのベクターを作製した。
対照として、マウスの左眼には注射しなかった。
結果
ＥＲＧの結果は、１ヶ月齢でレスキューを示した（図４）。
暗順応ａ波及びｂ波、ならびに明順応ｂ波中の連続強度を比較した。白塗りボックスは注射した右眼を表し、白抜きボックスは非注射の対照左眼を表す。暗順応応答のいくつかの強度及び明順応応答の全ての強度で、注射眼と非注射眼との間に統計学的有意差が存在した。
同様の結果が、Ｐ２８、Ｐ４７、Ｐ５５、Ｐ７２で、及びＰ２８の対照ＡＡＶで見られた。
比較のために、最大応答（桿体と錐体を組み合わせたもの）及び錐体応答を比較した（図５）。４つの異なる時点での最大応答のａ波及びｂ波、及び錐体応答のｂ波と、Ｐ２８の対照ＡＡＶウイルスとを、図８の第１レーンで比較した。Ｐ２８及びＰ４７では注射眼と非注射眼との間に統計学的有意差が存在したが、Ｐ５５及びＰ７２では有意差は存在しなかった。Ｐ５５及びＰ７２でのＥＲＧの結果は、それより前のいずれかの時点でＥＲＧにより試験したマウスのものであった。これらのマウスの一部では、初回ＥＲＧ試験後に角膜混濁が生じ、これによりＥＲＧ振幅が影響を受けた。
図６は、機能的及び解剖学的レスキューを示した１匹のマウスの結果を示している。１ヶ月齢での暗順応ＥＲＧは、対照の非注射左眼（図６Ｂ）の振幅と比較して、注射した右眼（図６Ａ）でより大きな振幅を示し、光受容体機能Ｂが維持されていることを示した。
図６Ｃ及び６Ｄは、２ヶ月齢でのこれら２つの眼のＨ＆Ｅ染色を示す。注射眼には、もう一方の眼と比較してより多くの外顆粒層が存在する。この相違は、網膜ひだ、剥離、または眼球変形によって引き起こされたものではなく、視神経乳頭周囲で観察可能であった。したがって、Ｐ６４での組織像により、対照眼と比較して、注射眼の光受容体変性の減速が示され、ＡＡＶ８－ＰＧＣ１α注射眼の光受容体の生存レベルが高いことが明らかとなった。
図７は、３ヶ月齢マウスの注射眼（図７Ａ）及び非注射眼（図７Ｂ）のホールマウント網膜を示している。非注射眼と比較して、注射眼のホールマウント網膜の色素移動が少ないことが極めて明らかである。色素移動は、ＲＰ患者に見られるように、重度の光受容体変性の徴候である。
図８に示すように、非注射眼と比較して、注射眼には錐体特異的に標識されたＡｒｒ３細胞もより多く存在する。
これらの結果は、ＲＰＥへのＰＧＣ１αの標的投与が、ＲＰマウスモデルにおける光受容体変性を減少させたことを示している。
実施例３－ＮＲＦ２の条件的過剰発現及びＫＥＡＰの条件的ノックアウトによるＲＰＥにおける抗酸化応答の増強は、錐体及び桿体の生存を促進する
材料及び方法
ＲＰＥ特異的誘導型Ｃｒｅリコンビナーゼ系統（Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウス）
Ｃｒｅが内因性のナイーブＲｐｅ６５遺伝子座によって制御され、マウスの生涯にわたって安定的に発現する、ＲＰＥ特異的誘導型Ｃｒｅリコンビナーゼ系統（Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウス）を作製した。他のＲＰＥ－Ｃｒｅドライバーとは異なり、Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウスは、Ｃｒｅ－エストロゲン受容体（ＣｒｅＥＲ－Ｔ２）融合コンストラクトを保有している。具体的には、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）は、活性のためにタモキシフェンを必要とする変異型エストロゲンリガンド結合ドメイン（ＥＲＴ２）に融合しており、Ｔ２バリアントは、エストロゲンよりも高い親和性でタモキシフェンに結合し、Ｃｒｅ活性は対照の雌では検出不可能である。タモキシフェン誘導時に、ＣｒｅＥＲＴ２は核に移動し、そこでｌｏｘＰ部位と相互作用してから細胞質に戻り、意図しない変異誘発の可能性を最小限に抑える。これらのマウスをＡｉ７５Ｄレポーターマウス（ＪＡＸ＃２５１０６）と交配することで、タモキシフェン誘導後にＲＰＥ細胞核においてｔｄＴｏｍａｔｏが発現する。ＲＰＥにおいてＮＲＦ２の過剰発現またはＫＥＡＰ１のノックアウトのいずれかによりそれぞれ抗酸化応答を増強させることによって、ＲＰでの光受容体の生存が促進されるか否かを、誘導型Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウスを使用して判定することができる。
ＮＲＦ２の条件的過剰発現によるＲＰＥの抗酸化応答の増強
ＲＰＥでの抗酸化応答を増強させるために、Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウスと交配するとＲＰＥでマウスＮＲＦ２を条件的に過剰発現する、Ｒ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋マウスを作製した。これらの交配により、対照Ｒ２６＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｒ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。Ｒ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統もまた、Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑマウスと交配させる。
ＫＥＡＰ１の条件的ノックアウトによるＲＰＥの抗酸化応答の増強
ＮＲＦ２の安定性は、主にＫＥＡＰ１によって制御される。したがって、ＲＰＥの抗酸化応答を増強させるために、Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウスと交配するとＲＰＥで条件的にＫＥＡＰ１がノックアウトされ、その後ＮＲＦ２の活性化が生じる、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｋｅａｐ１ｔｍ１．１ Ｍｒｌマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、モデル８７９９；以下Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ）を利用する。これらの交配により、対照Ｋｅａｐ１＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統もまた、Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑマウスと交配させる。
タモキシフェン誘導Ｒ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウス、Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウス、及びＲｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスの眼杯のＲＰＥを、トリプシン中、３７℃、５％ＣＯ２で４５分間インキュベートしてから単離して（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．２０１６）、実施例１に記載したように免疫ブロット及びｑＰＣＲを実施する。
更に、以下のアッセイを実施して、実施例１に記載したように光受容体の機能及び生存を評価する：ＥＲＧ；光受容体のスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）ライブイメージング定量化；免疫組織化学及び蛍光染色；桿体の生存の定量化；ならびに錐体の生存の定量化。
暗順応最大ｂ波、明順応ｂ波（Ｐ３０及びＰ６０の２時点）の振幅、ならびにＯＮＬ厚（Ｐ６０の１地点）を、Ｐｄｅ６ｂＨ６２０ＱマウスＲＰモデルにおいて、実験用Ｒ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型と対照Ｒ２６＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型との間、実験用Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型と対照Ｋｅａｐ１＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型との間で比較する。
グルタミン酸は、グルタチオンの合成に必要であることから、代謝産物として重要である。酸化経路からのグルタミン酸の分離は、サイトゾルＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋に依存している。スーパーオキシド検出用のジヒドロエチジウム染色（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１３）、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（＃２６４０６、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．２０１７）、及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ定量比色キット（Ｋ３３７、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．２０１７）などの追加の実験を実施して、酸化還元状態を明らかにする。
結果
タモキシフェン誘導Ｒ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウス、Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスから単離したＲＰＥにおけるＡＲＥ関連遺伝子（ＮＱＯ１、ＨＯ－１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、及びグルタチオン合成酵素）は、アップレギュレートされる。ＲＰＥでＮＲＦ２を過剰発現させることにより抗酸化応答を増強させると、ＲＰマウスモデルの光受容体の生存及び機能が促進される。同様に、ＲＰＥでＫＥＡＰ１を条件的にノックアウトすることにより抗酸化応答を増強させると、ＲＰマウスモデルの光受容体の生存及び機能が促進される。ＮＲＦ２の条件的過剰発現による神経保護効果は、ＫＥＡＰ１の条件的ノックアウトと同様であるか、それよりもわずかに小さい。これは、ＮＲＦ２が急速に代謝回転し、ユビキチンプロテアソーム系によって常に分解されるため、低レベルで見出されるためである（ＭｃＭａｈｏｎ，ｅｔ ａｌ．２００４）。
実施例４－ＲＰＥでのＯＸＰＨＯＳ／異化が、Ｐｇｃ１αの条件的過剰発現及び条件的ノックアウトによる錐体及び桿体の生存を促進するか否かの判定
材料及び方法
ＲＰＥ特異的誘導型Ｃｒｅリコンビナーゼ系統（Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウス）
ＲＰＥにおいてＰｇｃ１αの過剰発現またはノックアウトのいずれかによりそれぞれＯＸＰＨＯＳを増強または抑制させることによって、ＲＰでの光受容体の生存が促進されるか否かを、実施例３で使用したものと同じマウスを使用して判定する。
ＲＰＥにおけるＯＸＰＨＯＳの増強
ＲＰＥにおけるＯＸＰＨＯＳを増強させるために、Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウスと交配するとＲＰＥでマウスＰｇｃ１ａを条件的に過剰発現する、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋マウスを作製する。これらの交配により、対照Ｒｏｓａ２６＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統もまた、Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ及びＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋ＲＰモデルと交配させる。ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋マウスは、Ｒｈｏ遺伝子にノックイン変異（Ｒｏｓａ２６遺伝子と同様に第６染色体に位置している）を有しているが、この方策はそれでもなお実行可能である。
ＲＰＥにおけるＯＸＰＨＯＳの抑制
本実験では、ＯＸＰＨＯＳを、ＰＧＣ１αノックアウトにより、また条件的Ｐｇｃ１αノックアウトマウス（Ｐｐａｒｇｃ１ａｔｍ２．１Ｂｒｓｐ／Ｊ、ＪＡＸ＃９６６６；またはＰｇｃ１αｆ／ｆ）の使用により抑制する。Ｐｇｃ１αｆ／ｆマウスを、Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウスと２世代にわたり交配させて、対照Ｐｇｃ１α＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｐｇｃ１αｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。網膜変性の際のＲＰＥにおけるＯＸＰＨＯＳの抑制の効果を調査するために、Ｐｇｃ１αｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統を、ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋ＲＰモデルと交配させ、全てのマウスの遺伝子型を同定して、ｒｄ８及びｒｄ１変異がないことを確認する。
タモキシフェン誘導Ｒ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウス、Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウス、及びＲｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスの眼杯のＲＰＥを、トリプシン中、３７℃、５％ＣＯ２で４５分間インキュベートしてから単離して（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．２０１６）、免疫ブロット、ｑＰＣＲ、グルコース取り込みアッセイ、及びＵ－１３Ｃグルコースフラックスを以下のように実施する。
免疫ブロット。タンパク質をＲＰＥから抽出し、Ｔｏｔａｌ ＯＸＰＨＯＳ Ｒｏｄｅｎｔ ＷＢ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｋｉｔ（ａｂ１１０４１３；Ａｂｃａｍ）と、ローディング対照としてウサギ抗アルファチューブリン抗体（ａｂ４０７４；Ａｂｃａｍ）を使用して、ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニット（複合体Ｉ ＮＤＵＦＢ８、複合体ＩＩ ＳＤＨＢ、複合体ＩＩＩ ＵＱＣＲＣ２、複合体ＩＶ ＭＴＣＯ１、及び複合体Ｖ ＡＴＰ５Ａ）に対する５つのモノクローナル抗体でプローブする。
ＲＮＡ抽出及びリアルタイムｑＰＣＲ。ＲＰＥからＲＮＡを抽出し、逆転写する。リアルタイムｑＰＣＲを、ＰＰＡＲＡ（脂肪酸の利用に必要な遺伝子を調節する）；ＥＳＲＲＡ、ＮＲＦ１、及びＧＡＢＰＡ（これらは全てＯＸＰＨＯＳ遺伝子を調節する）；ならびにＮＲＥ２Ｌ２及びＦＯＸＯ３（抗酸化遺伝子を調節する）に対するプライマーを使用して実施する。ＯＸＰＨＯＳサブユニットの場合、Ｆ１－ＦＯ ＡＴＰアーゼの構成要素であるＡＴＰ５Ｏ；複合体ＩＶの構成要素であるＣＯＸ４Ｉ１及びＣＯＸ５Ｂ；ならびに複合体Ｉの構成要素であるＮＤＵＦＢ５に対するプライマーを使用する。
グルコース取り込みアッセイ。網膜を冷ＤＭＥＭ中で切開し、蛍光グルコース類似体２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＮＢＤＧ、１ｍＭ）の存在下でＤ－グルコースを含むかまたは含まないＤＭＥＭ中で培養し、氷冷ＰＢＳ及びＤＡＰＩで４回洗浄し、２枚の予冷カバースライドの間にフラットマウントにして、直ちにイメージングした。
Ｕ－１３Ｃグルコースフラックス。実験用Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋由来の培養ＲＰＥを、Ｕ－１３Ｃグルコースとインキュベートし、解糖及びクエン酸回路によるフラックスをモニタリングするか、またはＵ－１３Ｃグルタミンとインキュベートして、酸化フラックスに限定してモニタリングする。ＲＰＥを採取し、既に記載されているように（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１６）、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール中に抽出して、ＧＣ／ＭＳにより解析する。
更に、以下のアッセイを実施して、実施例１に記載したように光受容体の機能及び生存を評価する：ＥＲＧ；及び光受容体のスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）ライブイメージング定量化。
ＯＸＰＨＯＳの増強については、Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ及びＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋マウスＲＰモデルにおいて、実験用Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型と対照Ｒｏｓａ２６＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型との間の、暗順応最大ｂ波、明順応ｂ波（２時点）の振幅、及びＯＮＬ厚（１地点）の実験的比較を実施する。
ＯＸＰＨＯＳの抑制については、ＲｈｏＤ１９０Ｎ／＋マウスＲＰモデルを使用して、実験用Ｐｇｃ１αｆ／ｆ；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型と対照Ｐｇｃ１α＋／＋；Ｒｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型との間の、暗順応最大ｂ波（２地点）、明順応ｂ波（２時点）の振幅、及びＯＮＬ厚（１地点）の実験的比較を実施する。
結果
ＲＰＥにおいてＰＧＣ１αの過剰発現後にＯＸＰＨＯＳを増強させると、ＲＰマウスモデルの光受容体の生存及び機能が促進される。ＲＰＥにおいてＰＧＣ１αを阻害すると光受容体変性が加速し、仮説が更に裏付けられる。
実施例５－標的化ＡＡＶベクターは、ＰＧＣ１αまたはＮＲＦ２を送達し、ＲＧＣのミトコンドリア機能を回復する
材料及び方法
緑内障マウスモデル
ＤＢＡ／２Ｊマウス（色素性緑内障マウスモデル、以下Ｄ２マウスと呼ぶ）は近交系であり、Ｄ２は緑内障関連ＧｐｎｍｂＲ１５０Ｘ及びＴｙｒｐ１ｉｓａ変異についてホモ接合型である。Ｄ２マウスは、緑内障研究に広く使用されており、これは、このマウスがヒト色素性緑内障の表現型を模写し、虹彩色素の分散が５～６ヶ月で、眼圧上昇が６～８ヶ月で、ＲＧＣの死滅が１０～１２ヶ月で生じるためである（Ｊｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．１９９８）。ＤＢＡ／２ＪマウスのＰＥＲＧは、網膜神経線維層厚が失われる前に、疾患初期に障害される（Ｓａｌｅｈ，ｅｔ ａｌ．２００７、Ｈｏｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．２００７）。
ＲＧＣ特異的プロモーターを使用してＲＧＣにおいてＰＧＣ１α及びＮＲＦ２を過剰発現させるためのウイルスベクター
ＡＡＶ２／２は、網膜の他のあらゆる細胞型よりも効率的にＲＧＣを形質導入することが示されているが、プロモーターの選択は、標的治療における細胞特異的発現及びトランスジェニック発現にとって重要である。近年の研究では、重要なＮＡＤ（＋）産生酵素をコードする遺伝子であるＯｐａ１及びＮｍｎａｔ１をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で送達することによる、ＡＤＯＡ及び色素性緑内障のモデルにおける効率的な遺伝子治療が実証された。ＣＭＶプロモーター及びＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）のハイブリッドは、成体ラットの眼でＲＧＣの約８５％の形質導入を促進することが示されており、マウスでも同様の発現が見られる（Ｎｉｃｋｅｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．２００３、Ｈａｒｖｅｙ，ｅｔ ａｌ．２００２）が、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＡＡＶ硝子体内注射による予備データは、他の型の網膜細胞も形質導入されたことを示した（結果は示さず）。したがって、オフターゲット導入遺伝子の発現が確実に他の網膜細胞に悪影響を及ぼさないようにするために、慎重に検討する必要がある。
網膜におけるＰＧＣ１αの役割は議論の余地があり、ｉｎ ｖｉｖｏではほとんど研究されていない（Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１５）。網膜色素変性症マウスモデルにおける近年の研究において、網膜ＰＧＣ１α過剰発現の有害な影響が報告された（Ｘｉｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１５）。このｉｎ ｖｉｖｏマウス研究の潜在的な弱点は、ＣＭＶプロモーターを使用しており、非特異的な過剰発現を引き起こしたことである。
更に、ＣＭＶプロモーターを使用すると、ＮＲＦ２の核内蓄積がアポトーシスを低減させ、発がん及び薬剤耐性を促進する可能性があるため、他の細胞のＮＲＦ２が非生理学的な形で構成的に活性化される可能性があり、それが予期しない合併症につながり得る。
本明細書に示す仮説は、ＲＧＣにおいてのみミトコンドリア生合成を増強させることが、緑内障及びＡＤＯＡなどのＲＧＣ死滅を伴う疾患の潜在的な治療になり得るというものである。このアプローチは、ＲＧＣ死滅のモデルである上記の２つのマウスモデルで、ミトコンドリア生合成を標的とするためのＲＧＣ特異的プロモーターを用いた前臨床遺伝子治療を試験することである。ＰＧＣ１α及びＮＲＦ２の発現を、ＲＧＣのミトコンドリアの生物学的性質におけるその役割を決定するために駆動するためのＲＧＣ特異的プロモーター。
ＲＧＣでのミトコンドリア生合成を増強させるために、－７８５～＋１６３ｂｐ（およそ９４８ｂｐ）のｈＳｎｃｇ（ヒトガンマシヌクレイン）上流領域をＲＧＣ特異的プロモーター（Ｃｈａｆｆｉｏｌ，ｅｔ ａｌ．２０１７）として使用し、マウスＰｐａｒｇｃ１ａ（Ｐｇｃ１α）（２．４ｋｂ）を送達する（図９Ａ）。ｈＳＮＣＧプロモーター（９４８ｂｐ）は、Ｔｈｙ１プロモーター（６，５００ｂｐ）と比較してより小さく、より強力で、より特異的なＲＧＣプロモーターであり、ＰＧＣ１αをこのＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰベクターに一緒にパッケージングすることを可能にする。検証用の対照としてのＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰと、仮説を試験するためのＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰという２つのベクターを作製する（図９Ｂ）。陰性対照として、ＲＧＣをＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰで形質導入する。
ＲＧＣの抗酸化応答を増強させるために、マウスＮｒｆ２（１．８ｋｂ）を送達するためのｈＳｎｃｇプロモーターを使用する（図１４）。マウスＮｒｆ２は、Ｎｒｆ２を核内に輸送することができる２つの核局在化シグナルモチーフを含むことが報告された（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．２００８）。検証用の対照としてのＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰと、仮説を試験するためのＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰという２つのベクターを作製する（図１０）。陰性対照として、ＲＧＣをＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰで形質導入する。
マウスへのベクターの硝子体内注射を、既に記載されているように（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．２００８）網膜下注射から改変した手順を使用して実施する。４週齢のマウスを、既に記載されているように、必要な場合にケタミン／キシラジンの腹腔内注射により麻酔した。およそ１．５μｌのウイルス溶液（２×１０７形質導入単位［ＴＵ］／ｍｌ）を、先の丸いガラスピペットを穿刺孔から４５°の角度で強膜を通して硝子体に挿入することにより、右眼の角膜輪部に硝子体内注射した。左眼は陰性対照として機能させた。これらのプロトコルを使用した硝子体内注射は、過去に、ＣＭＶプロモーターを使用した広汎性の網膜形質導入をもたらしたことがある。
対照ベクターＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰ及びＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰを最初に注射すると、ＲＧＣに限定されたＧＦＰの発現が見られる。ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰ及びＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰをマウスに注射する。
マウスを以下の通り評価する。
パターン網膜電図（ＰＥＲＧ）。ＰＥＲＧを記載されている通りに実施する（Ｃｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｐｏｒｃｉａｔｔｉ ２０１３）。簡潔に述べると、Ｃｅｌｅｒｉｓ Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ装置（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を使用して記録する。各セッションの開始時に、陰性対照マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの成体）を試験してから、処置マウスを試験する。応答を試行ごとに平均化する。Ｐ１からＮ２までのＰ１Ｎ２振幅を測定して、ＲＧＣ特異的機能を評価する。Ｄ２マウスのＰ１８０～Ｐ３６０にＰＥＲＧを実施する。
明順応下陰性応答（ＰｈＮＲ）。ＰＥＲＧを記載されているように評価する（Ｃｈｒｙｓｏｓｔｏｍｏｕ ａｎｄ Ｃｒｏｗｓｔｏｎ ２０１３）。簡潔に述べると、０．３４～２．２２ｌｏｇ ｃｄ・ｓ／ｍ２の６つの異なる刺激強度に対する明順応応答を、４０－ｃｄ・ｓ／ｍ２の桿体が飽和する緑色背景上で示す。強度ごとに、３，０００ｍｓの刺激間隔での２５回のフラッシュを平均化する。ＲＧＣ特異的機能を評価するために、ベースラインからＰｈＮＲトラフまで（ＢＴ）のＰｈＮＲ振幅を測定する。Ｄ２マウスのＰ１８０～Ｐ３６０にＰＥＲＧを実施する。
免疫組織化学及び蛍光染色。Ｄ２マウスのＰ１８０及びＰ３６０に組織を収集する。網膜凍結切片及び神経網膜フラットマウントの免疫標識及び蛍光染色を、既に記載されているように（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｔｏｓｉ，ｅｔ ａｌ．２０１０）、但し以下の変更：動物１匹ごとに、片眼を凍結切片用に処理し、他方をフラットマウント用の神経網膜に切開する、を加えて実施する。凍結切片用の眼杯を４％冷パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中で一晩固定し、フラットマウントにする神経網膜を１時間固定する。以下の一次及び二次抗体ならびに希釈液を使用する：ヤギ抗Ｂｒｎ３（１：２００；ＳＣ－６０２６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ウサギ抗ＲＢＰＭＳ（１：５００；ＮＢＰ２－２０１１２；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；ロバ抗ヤギ（１：１，０００；Ａ－２１４３２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ロバ抗ウサギ（１：１，０００；Ａ－３１５７２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核をＤＡＰＩで対比染色する。
ＲＧＣの生存の定量化。記載されているように（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｔｏｓｉ，ｅｔ ａｌ．２０１０）、両方の眼杯からの凍結切片及び神経網膜フラットマウントを使用して、ＲＧＣ数を定量化する。１０個の連続切片を抗Ｂｒｎ３抗体とインキュベートする。核をＤＡＰＩで対比染色する。全ての画像を、本発明者らの共焦点及び特殊顕微鏡コア施設内にあるＮｉｋｏｎ Ｔｉ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立共焦点顕微鏡で取得する。Ｂｒｎ３＋細胞を、半自動定量化ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計数する。
光受容体の非侵襲的スペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）ライブイメージング定量化。Ｃｏｌｕｍｂｉａコアマウス施設にあるＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ装置（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＳＤ－ＯＣＴイメージングからの読み取り値を使用して、ＲＧＣの生存をライブイメージングにより定量化し、神経節細胞複合体厚を測定する。
ミトコンドリアＤＮＡ。ＲＧＣのｍｔＤＮＡ及び核ＤＮＡの相対コピー数を、記載されているように（Ｍａｌｉｋ，ｅｔ ａｌ．２０１６）定量的ＰＣＲによって決定する。記載されているように、ミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び核β２ミクログロブリン遺伝子に対して特異的なプライマーを設計した。標準的な希釈系列を使用して、各プライマー対の指数関数的増幅の効率を確認した。
ミトコンドリアの形態及び軸索の髄鞘形成を評価するための電子顕微鏡法。マウスの視神経を記載されているように処理する（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．２０１３）。超薄切片を視神経を貫通して横方向に採取し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、ＡＭＴデジタルカメラを備えたＨｉｔａｃｈｉ ７１００ ＴＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して画像を撮影する。
実験的比較。Ｄ２マウスの右眼（ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰまたはＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰを注射）と左（非注射）との間の、２時点（Ｐ１８０及びＰ３６０）でのＰｈＮＲ（ＢＴ）及びＰＥＲＧ（Ｐ１Ｎ２）の振幅、及び１時点（Ｐ３６０）でのＲＧＣ数を比較する。科学的厳密性を向上させるために、対照として追加の群の右眼にＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰを注射する。この設計により、対応のあるｔ検定を使用することができる。
結果
ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰ形質導入により、ＲＧＣでのＧＦＰの特異的発現が可能となる。したがって、ＲＧＣ死滅のマウスモデルにおけるＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰまたはＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰベクターの注射を実施する。
ｈＳＮＣＧまたはＰｌｅ（ＮＥＦＬ）はＲＧＣ特異的プロモーターであるため、ＰＧＣ１αまたはＮＲＦ２の発現はＲＧＣに限定され、Ｐｇｃ１αまたはＮｒｆ２遺伝子のＲＧＣ特異的発現はＲＧＣ死滅を遅延させる。
ＲＧＣからＲＮＡ及びタンパク質を抽出し、ＭｉｔｏＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ＷＢ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｋｉｔを使用した免疫ブロッティング及びリアルタイムｑＰＣＲを実施して、ミトコンドリア生合成関連遺伝子及びマイトファジー関連遺伝子の相対的発現量を算出する。ＡＡＶベクター注射眼（ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰ）から収集したＲＧＣにおけるミトコンドリア生合成遺伝子及びタンパク質のアップレギュレーションが、対照と比較して見られる。
ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰベクター注射眼に関して、Ｎｒｆ２遺伝子のＲＧＣ特異的発現はＲＧＣ死滅を遅延させる。ＦＡＣＳを使用して、ｅＧＦＰ＋ＲＧＣを選別し、次にＡＲＥ関連遺伝子を解析して、ＲＧＣの酸化還元状態を明らかにする。２つの異なるＲＧＣ死滅マウスモデルにおいて、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰ注射眼と比較して、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰ注射眼から収集したＲＧＣにおけるＡＲＥ関連遺伝子のアップレギュレーションが見られる。
実施例６－ＲＧＣでのミトコンドリア生合成が、Ｐｇｃ１αの条件的過剰発現及び条件的ノックアウトによるＲＧＣの生存を促進するか否かの判定
材料及び方法
条件的に過剰発現するＲｏｓａ２６ＬＳＬ－ＰＧＣ１α／＋マウス系統
ＰＧＣ１αは、ミトコンドリア生合成のマスターレギュレーターであり、海馬ニューロンでミトコンドリア生合成を誘導することが示されている。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでのミトコンドリア生合成を増強させるために、マウスＰｇｃ１αを条件的に過剰発現するノックインマウス系統を作製した。この系統を作り出すために、ＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－Ｐｇｃ１α－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ－ｐｏｌｙＡカセットを、Ｒｏｓａ２６遺伝子標的化プラスミド（ＣＴＶプラスミド、Ｋｌａｕｓ Ｒａｊｅｗｓｋｙ博士の寄贈品）に挿入した。ＰＧＣ１αタンパク質の発現は、ｌｏｘ－転写停止－ｌｏｘカセット（ＬＳＬ）をＣＲＥが切除するまで抑制される。ＫＶ１（１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えと、それに続く標的化ＥＳ細胞のＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞への注入により、マウス系統を作製した。生殖細胞系列伝達のためにキメラを繁殖させた。マウスを、少なくとも６世代にわたってＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに戻し交配した。ＡＡＶ８－ＣｒｅでトランスフェクトしたＲｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋マウス由来の線維芽細胞は、ＧＦＰ陽性かつＰＧＣ１αを過剰発現しており、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋マウスが、Ｃｒｅリコンビナーゼ系統と交配した後にＳＴＯＰカセットを除去すると、ＰＧＣ１αを過剰発現することが示された。ＲＧＣの大部分におけるＰＧＣ１αの過剰発現を標的とするために、Ｔｇ（Ｔｈｙ１－ｃｒｅ／ＥＲＴ２，－ＥＹＦＰ）ＨＧｆｎｇ／ＰｙｎｇＪマウス（ＪＡＸ＃１２７０８；以下、Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２マウス）を使用して、ＲＧＣをＣｒｅリコンビナーゼの標的とした。
ＰＧＣ１αの条件的ノックアウトによるＲＧＣにおけるミトコンドリア生合成の抑制
本実験では、条件的ＰＧＣ１αノックアウトマウス（Ｐｐａｒｇｃ１ａｔｍ２．１Ｂｒｓｐ／Ｊ、ＪＡＸ＃９６６６；またはＰｇｃ１αｆ／ｆ）を利用する。Ｐｇｃ１αｆ／ｆマウスを、Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスと２世代にわたり交配させて、対照Ｐｇｃ１α＋／＋；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｐｇｃ１αｆ／ｆ；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。変性の際のＲＧＣにおけるミトコンドリア生合成の抑制の効果を調査するために、Ｐｇｃ１αｆ／ｆ；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統を、Ｄ２マウスと交配させる。全てのマウスの遺伝子型を同定して、光受容体機能に影響を及ぼし得るｒｄ８及びｒｄ１変異がないことを確認する（Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ，ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｅｒｒｊｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．２００７）。
ＰＧＣ１αの条件的過剰発現によるＲＧＣにおけるミトコンドリア生合成の増強
Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２マウスと交配するとＲＧＣでマウスＰｇｃ１ａを条件的に過剰発現する、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋マウスを作製した。これらの交配により、対照Ｒｏｓａ２６＋／＋；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。Ｄ２マウスは第６染色体（Ｒｏｓａ２６遺伝子のノックインＰＧＣ１ａも位置する）にホモ接合型ＧｐｎｍｂＲ１５０Ｘを保有しているため、Ｄ２マウスとＲｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｐｇｃ１α／＋；マウスとの交配を行うことはできない。
マウスの網膜を、記載されているように（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｃｈｉｔａｌａｐｕｄ，ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｃｈｉｎｔａｌａｐｕｄｉ，ｅｔ ａｌ．２０１６）、酵素消化とそれに続くＦａｌｃｏｎ ７０μｍナイロンストレーナーを使用した濾過により分離して、その後以下のアッセイを実施する。
ＲＧＣの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）。抗マウスＣＤ１６／３２抗体（クローン９３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、Ｆｃγ受容体ＩＩ及びＩＩＩを発現する細胞への抗体の非特異的結合を最小限に抑える。表面抗原を検出するために、細胞を次の一次抗体のカクテルとともに氷上で３０分間インキュベートする：抗ＣＤ９０．２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７００（Ｔｈｙ１．２、クローン３０－Ｈ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；抗ＣＤ４８ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＨＭ４８－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、単球及びミクログリアを標識する）；抗ＣＤ１５ ＰＥ（クローンＭＣ－４８０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、アマクリン細胞を標識する）；ならびに抗ＣＤ５７（クローンＶＣ１．１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；同様にアマクリン細胞を標識する）。抗ＣＤ５７抗体はコンジュゲートされていないため、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１タグ付き二次抗体（クローンＰｏｌｙ４０５３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して選別を可能にする。このカクテルにより、ＦＡＣＳ中に他の網膜細胞型を正確に除去することが可能であった。Ｔｈｙ１．２＋ＣＤ４８ｎｅｇＣＤ１５ｎｅｇＣＤ５７ｎｅｇ細胞を選別し、更に処理するまで－８０℃で凍結する。
免疫ブロット。選別したＴｈｙ１．２＋ＣＤ４８ｎｅｇＣＤ１５ｎｅｇＣＤ５７ｎｅｇ生存細胞からタンパク質を抽出し、ＭｉｔｏＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ＷＢ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｋｉｔ（ａｂ１２３５４５；Ａｂｃａｍ）を使用して、ＯＸＰＨＯＳ酵素複合体のサブユニットである複合体ＩＩ ＳＤＨ－Ａ（核ＤＮＡにコードされている）及び複合体ＩＶ（ＣＯＸ－１、ｍｔＤＮＡにコードされている）に対する２つのモノクローナル抗体でプローブする。マウス抗ベータアクチン抗体（ａｂ８２２４；Ａｂｃａｍ）をローディング対照として使用する。
ＲＮＡ抽出及びリアルタイムｑＰＣＲ。ＲＮＡをＴｈｙ１．２＋ＣＤ４８ｎｅｇＣＤ１５ｎｅｇＣＤ５７ｎｅｇ細胞から抽出し、逆転写する。リアルタイムｑＰＣＲを、ミトコンドリア生合成関連遺伝子ＰｏｌｇＡ及びＴｆａｍ、ならびにマイトファジー関連遺伝子Ｐｉｎｋ１、Ｐａｒｋ２、Ｂｎｉｐ３ｌ、及びＬｃ３ｂに対するプライマーを使用して実施する。
ＰＥＲＧ、ＰｈＮＲ、免疫組織化学及び蛍光染色、ＲＧＣの生存の定量化、ＳＤ－ＯＣＴ、ミトコンドリアＤＮＡの試験、ならびに電子顕微鏡法を含む、実施例５に記載したものと同じ試験を行って、ＲＧＣの機能及び生存を評価する。
Ｄ２マウスにおける実験用遺伝子型と対照遺伝子型との間の、ＰｈＮＲ（ＢＴ）及びＰＥＲＧ（Ｐ１Ｎ２）（Ｐ１８０及びＰ３６０の２地点）の振幅ならびにＲＧＣ数（Ｐ３６０の１地点）を、２つの異なる方策（ミトコンドリア生合成の抑制及び増強）を使用して比較する。
結果
ＲＧＣにおいてＰＧＣ１αの過剰発現によりミトコンドリア生合成を増強させると、ＲＧＣ死滅のマウスモデルにおけるＲＧＣの生存及び機能が増強される。ＲＧＣのＰＧＣ１αを阻害すると、ＲＧＣの変性が加速する。ＰＧＣ１αの過剰発現は、ＲＧＣ死滅を遅延させ、ＲＧＣ及び視神経のミトコンドリア数を増加させる。
実施例７－ＲＧＣでのミトコンドリア生合成が、ＮＲＦ２の条件的過剰発現及び条件的ノックアウト、ならびにＫＥＡＰ１の条件的ノックアウトによるＲＧＣの生存を促進するか否かの判定
材料及び方法
条件的に過剰発現するＲｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋系統
ＮＲＦ２は、全身の抗酸化防御系の重要な核転写因子である。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗酸化応答を増強させるために、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋マウスと同じ方策を使用して、マウスＮｒｆ２を条件的に過剰発現するノックインマウス系統を作製した。生殖細胞系列伝達のためにキメラを繁殖させた。マウスを、少なくとも６世代にわたってＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに戻し交配した。Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋マウスにおけるＮＲＦ２の条件的過剰発現を検証するために、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋をＰｄｅ６ｇＣｒｅＥＲＴ２／＋と交配させて、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｐｄｅ６ｇＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスを作製した。タモキシフェン誘導後、網膜からタンパク質を抽出し、抗ＮＲＦ２抗体（１：１，０００；ＨＰＡ００３０９７；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）でプローブした。免疫ブロッティングによりＮＲＦ２発現の増加が明らかとなり（結果は示さず）、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋マウスが、Ｃｒｅリコンビナーゼ系統と交配した後にＳＴＯＰカセットを除去すると、ＮＲＦ２を過剰発現することが示された。ＲＧＣの大部分におけるＮＲＦ２の過剰発現を標的とするために、Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２マウスを使用して、ＲＧＣにおいてＣｒｅリコンビナーゼを標的とした。
ＮＲＦ２の条件的ノックアウトによるＲＧＣにおける抗酸化応答の抑制
条件的Ｎｒｆ２ノックアウトマウス（Ｎｆｅ２ｌ２ｔｍ１．１Ｓｒｅｄ／ＳｂｉｓＪ、ＪＡＸ＃２５４３３；またはＮｒｆ２ｆ／ｆ）を、本実験に使用する。Ｎｒｆ２ｆ／ｆマウスを、Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスと２世代にわたり交配させて、対照Ｎｒｆ２＋／＋；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｎｒｆ２ｆ／ｆ；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。変性ＲＧＣにおける抗酸化応答の抑制の効果を調査するために、Ｎｒｆ２ｆ／ｆ；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統をＯｐａ１Ｖ３４６Ｄ／＋及びＤ２マウスと交配させる。全てのマウスの遺伝子型を同定して、ｒｄ８及びｒｄ１変異がないことを確認する（Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ，ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｅｒｒｊｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．２００７）。
ＮＲＦ２の条件的過剰発現によるＲＧＣにおける抗酸化応答の増強
Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２マウスと交配するとＲＧＣでマウスＮＲＦ２を条件的に過剰発現する、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋マウスを作製した。これらの交配により、対照Ｒｏｓａ２６＋／＋；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ－Ｎｒｆ２／＋；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を作製する。Ｄ２マウスは第６染色体に位置するホモ接合型ＧｐｎｍｂＲ１５０Ｘを保有しているため、この方策はＤ２系統では行うことができない。
Ｋｅａｐ１の条件的ノックアウトによるＲＧＣにおける抗酸化応答の増強
ＮＲＦ２の安定性は、主にＥ３リガーゼアダプターＫＥＡＰ１によって制御される。したがって、ＲＧＣの抗酸化応答を増強させるために、Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２マウスと交配するとＲＧＣで条件的にＫｅａｐ１遺伝子がノックアウトされ、その後Ｎｒｆ２の活性化が生じる、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｋｅａｐ１ｔｍ１．１ Ｍｒｌマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、モデル８７９９；以下Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ）を利用する。これらの交配により、対照Ｋｅａｐ１＋／＋；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型及び実験用Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋遺伝子型を有するマウスを作製する。Ｋｅａｐ１ｆ／ｆ；Ｔｈｙ１ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統もＤ２マウスと交配させ、全てのマウスの遺伝子型を同定して、ｒｄ８及びｒｄ１変異がないことを確認する（Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ，ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｅｒｒｊｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．２００７）。
マウスの網膜を、実施例６に記載したように酵素消化によって分離し、実施例６に記載したように評価を実施する。
結果
ＲＧＣでＮＲＦ２を阻害すると、緑内障のモデルにおいてＲＧＣ死滅が加速する。ＲＧＣでのＮＲＦ２の過剰発現またはＫＥＡＰ１のノックアウトにより抗酸化応答を増強させると、ＡＤＯＡのマウスモデルにおけるＲＧＣの生存及び機能が促進された。ＮＲＦ２過剰発現方策（Ｒｏｓａ２６遺伝子のノックイン）は、Ｄ２マウスがＲｏｓａ２６遺伝子も位置している第６染色体にホモ接合型ＧｐｎｍｂＲ１５０Ｘを保有しているためＤ２マウスでは行うことができないものの、これらの結果はＲＧＣ死滅の両方のマウスモデルで同等である。ＡＲＥ関連遺伝子（ＮＱＯ１、ＨＯ－１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、及びグルタチオン合成酵素）は、２つの異なるＲＧＣ死滅マウスモデルにおいて、Ｎｒｆ２ノックアウト後のＦＡＣＳ選別ＲＧＣでダウンレギュレートされ、そのＡＲＥ関連遺伝子は、ＡＤＯＡのＮＲＦ２過剰発現マウスモデルにおいてアップレギュレートされる。
実施例８－ＲＰＥでのＨＩＦの切除は錐体及び桿体の生存を促進させた
材料及び方法
Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ；Ｈｉｆ－２αｔｍ１Ｍｃｓ／Ｈｉｆ－２αｔｍ１Ｍｃｓマウスを以下の通りに作製した。
３系統のマウスを交配して繁殖系統を発生させた。Ｈｉｆ－２αｔｍ１Ｍｃｓ／Ｈｉｆ－２αｔｍ１ＭｃｓＪａｘストック＃００８４０７マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑマウスを、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｔａｎｔ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＭＭＡ）桑実胚を使用した卵管移植によって再誘導した（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．２００８、Ｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．２００５）；及び実施例３に記載のＲｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウス。全てのマウスを、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｎｅｘ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容し、１２時間明／１２時間暗のサイクルで維持した。
Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０ＱマウスをＲｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２マウスと交配させ、その子孫をＨｉｆ－２αｔｍ１Ｍｃｓ／Ｈｉｆ－２αｔｍ１ＭｃｓＪａｘマウスと繁殖させた。繁殖用マウスを作製するには、６世代の戻し交配が必要であった。得られた子孫は、目的の全てのアレル（Ｐｄｅ６ｂ、Ｈｉｆ２、及びＲｐｅ６５）についてホモ接合型であったが、一部はＲｐｅ６５で野生型であり、他のものはＲｐｅ６５ＣｒｅＥＲＴ２変異を有していた。繁殖系統として使用するために、これら２つの系統を分離した。繁殖系統を交配させ、Ｐｄｅ６ｂ及びＨｉｆ２遺伝子座でホモ接合型であり、Ｒｐｅ６５遺伝子座でヘテロ接合型である実験用マウスを産生した。Ｐ７に、実験用マウスの半数に、コーン油で濃度１０ｍｇ／ｍＬに希釈して４２℃で完全に混合したタモキシフェン（エタノール中１００ｍｇ／ｍｌ；カタログＴ５６４８；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μｇ／ｇ体重（ＢＷ）で注射した。Ｐ７、Ｐ８、及びＰ９に１回注射を行った。実験用マウスの残りの半数には、タモキシフェンと同じ投与量に従ってエタノール（コーン油中１０％）を注射し、対照群として機能させた。マウスの性に基づく区別は行わなかった。
Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により、開始前に全ての実験が承認された。マウスは、視覚と眼科学研究協会の眼科学と視覚研究における動物の使用に関する声明（Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）及び北米神経科学学会の神経科学研究における動物の使用に関する方針（Ｐｏｌｉｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って使用した。
Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ；Ｈｉｆ－２αｔｍ１Ｍｃｓ／Ｈｉｆ－２αｔｍ１Ｍｃｓ及び対照マウスの両方の眼杯のＲＰＥを、トリプシン中、３７℃、５％ＣＯ２で４５分間インキュベートしてから単離して（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．２０１６）、実施例１に記載したようにＥＲＧで解析し、実施例２に記載したようにＨ＆Ｅ染色を行った。
結果
図１１に示すように、ＲＰＥでＨｉｆ２を特異的に切除すると、桿体及び錐体の両方の電気生理学的機能及び生存が増強される。ＲＰＥ細胞中でＨｉｆを切除した後、光受容体機能は桿体、桿体＋錐体、及び錐体を含めて良好に維持された。
図１１Ａは、暗順応、明順応、及び桿体錐体混合のｂ波振幅（μＶ）を取得するために、暗順応条件下及び暗順応・明順応条件下で４週目及び６週目に得たＥＲＧデータを示す。ＲＰＥ中でＨｉｆ２ａを切除したＨｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑの網膜機能のトレース（赤色トレース）を、年齢を一致させたＨｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰＰｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ対照（黒色トレース）と比較して、４週間時点、６週間時点で示した。
ＥＲＧトレースの振幅を定量化している図１１Ｂは、Ｈｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑマウスにおける桿体細胞及び錐体細胞の応答の増加を示している。
４週目の組織像は、対照マウスと比較して、Ｈｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑマウスで、ＯＮＬ層及びＯＳ層がより厚く、光受容体外顆粒（ＯＮＬ）層及びＩＳ／ＯＳ層の幅がより広いことを示している（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。
実施例９－標的化ＡＡＶベクターは、ＨＩＦ阻害剤をＲＰＥに送達し、錐体及び桿体の生存を促進した
材料及び方法
ＲＰマウスモデル、ならびに網膜下注射、ならびに評価（ＥＲＧ、抗ａｒｒ抗体を用いた免疫組織化学及び蛍光染色、ならびに実験的比較を含む）について、実施例１と同じ材料及び方法を使用する。
論じられたように、ＲＰＥにおけるＯＸＰＨＯＳ及びベータ酸化を増加させるために、－２５３～＋３８ｂｐ（およそ３００ｂｐ）のＶＭＤ２上流領域をＲＰＥ特異的プロモーターとして使用し（Ｅｓｕｍｉ，ｅｔ ａｌ．２００４）、ＨＩＦのｇＲＮＡ阻害剤を送達させる。検証用の対照としてのＥＩＡＶ：：Ｕ６－ｇＲＮＡｓ＿ｓｃｒａｍｂｌｅ；Ｖｍｄ２：：Ｃａｓ９と、ＥＩＡＶ：：Ｕ６－ｇＲＮＡｓ＿ＨＩｆ２ａ；Ｖｍｄ２：：ｓｐＣａｓ９という２つのベクターを作製する。配列番号１～４の配列を有するｇＲＮＡをベクター中で使用する。
結果
ＥＲＧ解析及び組織像から明らかなように、ＲＰＥにおけるＨＩＦの切除は桿体及び錐体の変性を遅延させる。更に、ＲＰマウスモデルにおいて、注射眼から収集したＲＰＥでは、非注射眼と比較してＯＸＰＨＯＳ及びベータ酸化の増加も見られる。
これらの結果は、ＲＰＥへのＨＩＦの阻害剤の標的投与が、ＲＰマウスモデルにおける光受容体変性を減少させたことを示している。
実施例１０－標的化ベクターは、ＫＥＡＰ１阻害剤をＲＰＥに送達し、錐体及び桿体の生存を促進した
材料及び方法
ＲＰマウスモデル、ならびに網膜下注射、ならびに評価（ＥＲＧ、抗ａｒｒ抗体を用いた免疫組織化学及び蛍光染色、ならびに実験的比較を含む）について、実施例１と同じ材料及び方法を使用する。
論じられたように、ＲＰＥにおける抗酸化応答を増強させるために、－２５３～＋３８ｂｐ（およそ３００ｂｐ）のＶＭＤ２上流領域をＲＰＥ特異的プロモーターとして使用し（Ｅｓｕｍｉ，ｅｔ ａｌ．２００４）、ＫＥＡＰ１のデュアルｇＲＮＡを送達させる。検証用の対照としてのＥＩＡＶ：：Ｕ６－ｇＲＮＡｓ＿ｓｃｒａｍｂｌｅと、本発明者らの仮説を試験するためのＥＩＡＶ：：Ｕ６－ｇＲＮＡｓ＿ＫＥＡＰ１；Ｖｍｄ２：：ｓｐＣａｓ９という２つのベクターを作製した。配列番号５を含むｇＲＮＡは、ベクター中で使用するｇＲＮＡの１つである。
結果
ＥＲＧ解析及び組織像から明らかなように、ＲＰＥにおけるＫＥＡＰ１の切除は桿体及び錐体の変性を遅延させる。更に、ＲＰマウスモデルにおいて、非注射眼と比較して、注射眼から収集したＲＰＥにおけるＡＲＥ関連遺伝子のアップレギュレーションも見られる。
これらの結果は、ＲＰＥへのＫＥＡＰ１の阻害剤の標的投与が、ＲＰマウスモデルにおける光受容体変性を減少させたことを示している。
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Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ａｘｏｎｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｉｎｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｅａｒｌｙ ｉｎ ＤＢＡ／２Ｊ ｇｌａｕｃｏｍａ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００７；１７９（７）：１５２３－１５３７．
Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｉｒｉｓ ａｔｒｏｐｈｙ，ｐｉｇｍｅｎｔ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ，ａｎｄ ｇｌａｕｃｏｍａ ｉｎ ＤＢＡ／２Ｊ ｍｉｃｅ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．１９９８；３９（６）：９５１－９６２．
Ｌａｒａｂｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｎｒｆ２ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｔｈｅ ｖｉｓｕａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｉｔｉｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｍｏｌ Ｖｉｓ．２０１６；２２：１５０３－１５１３．
Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｂｅｒ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ：ｙｅａｒ １．Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１０；１２８（９）：１１２９－１１３５．
Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｃｏｎｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１；２２６（７）：１８４３－１８４９．
ＭａｃＶｉｃａｒ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ．ＯＰＡ１ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ － ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｏｆ ｉｔ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２０１６；１２９（１２）：２２９７－２３０６．
Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｏ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ．２０１６；２９：５９－６４．
Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｇｌａｕｃｏｍａ ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００３；４４（１０）：４３５７－４３６５．
Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒｄ８ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｒｂ１ ｇｅｎｅ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖｅｎｄｏｒ ｌｉｎｅｓ ｏｆ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｃｏｎｆｏｕｎｄｓ ｏｃｕｌａｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１２；５３（６）：２９２１－２９２７．
ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｄｏｘ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ Ｎｒｆ２ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ，ｔｈｅ ｒｅｄｏｘ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎｅｈ２ ｄｅｇｒｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｄｏｘ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎｅｈ６ ｄｅｇｒｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（３０）：３１５５６－３１５６７．
Ｎｉｃｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ２－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｔｉｎａ Ａｆｔｅｒ Ｏｐｔｉｃ Ｎｅｒｖｅ Ｉｎｊｕｒｙ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１７；５８（１４）：６０９１－６１０４．
Ｐｏｒｃｉａｔｔｉ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１５；１４１：１６４－１７０．
Ｐｕｎｚｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ／ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ ｄｅｌａｙｓ ｃｏｎｅ ｄｅａｔｈ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９；１２（１）：４４－５２．
Ｑｕｉｇｌｅｙ ａｎｄ Ｂｒｏｍａｎ．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｅｏｐｌｅ ｗｉｔｈ ｇｌａｕｃｏｍａ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｉｎ ２０１０ ａｎｄ ２０２０．Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００６；９０（３）：２６２－２６７．
Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ（ＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＲＰＥ６５－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ３ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１７；３９０（１００９７）：８４９－８６０．
Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＩＯＰ ｉｎ ｔｈｅ ＤＢＡ／２Ｊ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｌａｕｃｏｍａ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７；４８（１０）：４５６４－４５７２．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ．２０１８；３９（５）：５６０－５６８．
Ｔｏｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｌｉｖｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｇｌａｕｃｏｍａ．Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．２０１０；１２（４）：３８６－３９３．
Ｔｈｅｏｄｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｎｒｆ２．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８；２８３（１４）：８９８４－８９９４．
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｖａｒｉｃｏｓｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ａｘｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００３；４４（１）：２－９．
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｖｉｓｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１０；８９（８）：９１１－９１９．
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｆｕｎｄｕｓ ｈｙｐｅｒａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｐｏｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｇｏｌｄｍａｎｎ－Ｆａｖｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．２０１３；６（５）：１１１３－１１２２．
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｐｒｉｍａｔｅ ｒｅｔｉｎａｌ ａｇｉｎｇ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ２０２０；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１３２３８－０２０－００７９１－ｘ
Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ３ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｇｌａｕｃｏｍａ ｉｎ ａｇｅｄ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７；３５５（６３２６）：７５６－７６０．
Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．ＮＲＦ２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｕｔｅ ｎｅｒｖｅ ｄａｍａｇｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（４）：１４３３－１４４５．
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｒｆ２ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｆａｓｔｉｎｇ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒｓ ｏｆ ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（３）：ｅ５９１２２．
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｒｔｕｉｎ ６ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６Ａ；１２６（１２）：４６５９－４６７３．
Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏｗａｒｄｓ ａｎａｂｏｌｉｓｍ ｉｍｐｅｄｅｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏ．Ｇｅｎｅｔｉｃ．２０１６Ｂ ２５（１９），４２４４－４２５５．
ＡＡＶ８－ＶＭＤ２コンストラクトの設計マップである。Ａは、対照ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ｅＧＦＰを示す。Ｂは、ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰコンストラクトを示す。 ＡＡＶ８－ＶＭＤ２－ＰＧＣ１αの１ヶ月の網膜下注射後（実線）及び対照非注射眼（点線）のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ前臨床劣性モデルのＥＲＧのグラフである。暗順応ａ波（Ａ）、暗順応ｂ波（Ｂ）、及び明順応ｂ波（Ｃ）の振幅が統計学的に有意に増加している。 ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙコンストラクト（Ａ）及びＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－ｍｃｈｅｒｒｙ（対照ＡＡＶ）（Ｂ）の設計マップである。 ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙをＰ２８に注射した５匹のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０ＱマウスのＥＲＧの結果の箱ひげ図である。白内障または網膜剥離を理由に除外したマウスはなかった。暗順応ａ波及びｂ波、ならびに明順応ｂ波中の連続強度を比較する。白塗りボックスは注射した右眼を表し、白抜きボックスは非注射の対照左眼を表す。暗順応応答のいくつかの強度及び明順応応答の全ての強度で、注射眼と非注射眼との間に統計学的有意差が存在する。ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙをＰ２８（桿体と錐体との組み合わせの最大応答）及びＰ４７（錐体応答）に注射した５匹のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑマウス（最初の同腹仔）のＥＲＧの結果の箱ひげ図である。４つの異なる時点での最大応答のａ波及びｂ波、及び錐体応答のｂ波と、Ｐ２８の対照ＡＡＶウイルスは、第１レーンにある。Ｐ２８及びＰ４７では注射眼と非注射眼との間に統計学的有意差が存在するが、Ｐ５５及びＰ７２では有意差は存在しない。Ｐ５５及びＰ７２でのＥＲＧの結果は、それより前のいずれかの時点でＥＲＧにより試験したマウスのものであった。これらのマウスの一部では、初回ＥＲＧ試験後に角膜混濁が生じ、ＥＲＧ振幅が影響を受けた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 機能的及び解剖学的レスキューを示したＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙで処置した１匹のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑマウスの更なる結果を示す。Ａは、ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙ処置眼のＰ２８でのＥＲＧ応答のグラフである。Ｂは、対照非処置眼のＰ２８でのＥＲＧ応答のグラフである。ＡＡＶ８処置眼はより高い振幅を示し、光受容体機能Ｂが維持されていることを示している。Ｃは、ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙ処置眼のＰ６４での組織像を示す。Ｄは、対照眼のＰ６４での組織像を示す。Ｃ及びＤにおいて、左側の画像は、組織が採取された眼の部分を示す。中央の画像は、染色された中間周辺部を示す。右側の画像は、視神経乳頭を示す。組織像の結果は、対照眼と比較して、注射眼の光受容体変性が減速していることを示す。 ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙで処置したＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ眼のホールマウント網膜の色素移動が少ないこと（Ａ）と、対照非注射眼（Ｂ）を示す。色素移動は、網膜色素変性症の重症度のマーカーである。 錐体特異的Ａｒｒ３抗体で染色したホールマウント網膜の画像を示す。Ａは、ＡＡＶ８：：ＲＰＥ６５－Ｐｇｃ１α－ｍｃｈｅｒｒｙで処置したＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ眼を示し、Ｂは、未処置のＰｄｅ６ｂＨ６２０ＱＨ６２０Ｑ対照を示す。 ＰＧＣ１α用のＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧコンストラクトの設計マップを示す。Ａは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＰＧＣ１α－ｅＧＦＰの設計を示す。Ｂは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰの設計を示す。 ＮＲＦ２用のＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧコンストラクトの設計マップを示す。Ａは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ＮＲＦ２－ｅＧＦＰの設計を示す。Ｂは、ＡＡＶ２／２－ｈＳＮＣＧ－ｅＧＦＰの設計を示す。 桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの切除の結果を示す。暗順応、明順応、及び桿体錐体混合のｂ波振幅（μＶ）を取得するために、暗順応及び明順応条件下で４週目及び６週目に得たＥＲＧデータである。ＲＰＥ中でＨｉｆ２ａを切除したＨｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑの網膜機能のトレース（明色トレース）を、年齢を一致させたＨｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ対照（暗色トレース）と比較して、４週間時点、６週間時点で示した。 桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの除去の結果を示す。Ｈｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ（左側のバー）のＥＲＧトレースの振幅のグラフであり、年齢を一致させた対照ｈｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ（右側のバー）と比較してプロットする。群ごとにマウスは４～５匹であった。 桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの除去の結果を示す。Ｈｉｆ－／－Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ（左側のバー）のＥＲＧトレースの振幅のグラフであり、年齢を一致させた対照ｈｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑ（右側のバー）と比較してプロットする。群ごとにマウスは４～５匹であった。 桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの除去の結果を示す。４週目時点で、ｈｉｆｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑマウスと比較して、Ｈｉｆ－／－；Ｐｄｅ６ｂＨ６２０Ｑ／Ｈ６２０Ｑで、ＯＮＬ層及びＯＳ層がより厚く、光受容体外顆粒（ＯＮＬ）層（上部、黄色）及びＩＳ／ＯＳ層（下部、緑色）の幅がより広いことを示している、網膜のパラフィン切片のＨ＆Ｅ染色画像である（スケールバー＝５０μｍ）。 桿体細胞及び錐体細胞の生存及び機能に対するＨＩＦの除去の結果を示す。測定しプロットしたＯＮＬ及びＩＳ／ＯＳ層の幅のグラフである。

Claims (26)

  1. 神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒することを必要とする対象において前記神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、
    ＰＧＣ１αまたはＮＲＦ２をコードする導入遺伝子を含む有効量の１つ以上のウイルスベクターを、前記対象に投与することを含み、
    前記ウイルスベクターが、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を標的とする、前記方法。
  2. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ウイルスベクターが、ＲＰＥ特異的プロモーターを更に含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＲＰＥ特異的プロモーターが、ＶＭＤ２及びＲＰＥ６５からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒することを必要とする対象において前記神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、
    ＨＩＦもしくはＫＥＡＰ１を阻害する核酸を含むか、またはＨＩＦもしくはＫＥＡＰ１を阻害するかもしくは標的とする核酸をコードする、治療有効量の１つ以上のウイルスベクターを、前記対象に投与することを含み、
    前記ウイルスベクターが、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を標的とする、前記方法。
  6. 前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、アプタマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ウイルスベクターが、ＲＰＥ特異的プロモーターを更に含む、請求項５に記載の方法。
  8. 前記ＲＰＥ特異的プロモーターが、ＶＭＤ２及びＲＰＥ６５からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記核酸が、ＨＩＦを標的とするｇＲＮＡであり、配列番号１～１３からなる群から選択される配列を有する、請求項６に記載の方法。
  10. 前記核酸が、ＫＥＡＰ１を標的とするｇＲＮＡであり、配列番号１４～２０からなる群から選択される配列を有する、請求項６に記載の方法。
  11. 神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、
    それを必要とする対象に、治療有効量のａ）前記対象の内因性ＨＩＦ遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする第１の核酸配列（複数可）、及び（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を投与することを含み；
    前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記内因性ＨＩＦ遺伝子を切断し、前記対象において前記内因性ＨＩＦ遺伝子のＨＩＦノックアウトを生じさせる、前記方法。
  12. 神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、
    それを必要とする対象に、治療有効量のａ）前記対象の内因性ＫＥＡＰ１遺伝子にハイブリダイズする少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする第１の核酸配列（複数可）、及び（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を投与することを含み；
    前記Ｃａｓヌクレアーゼが、前記内因性ＫＥＡＰ１遺伝子を切断し、前記対象において前記内因性ＫＥＡＰ１遺伝子のＫＥＡＰ１ノックアウトを生じさせる、前記方法。
  13. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記ウイルスベクターが、ＲＰＥを標的とし、プロモーターが、ＶＭＤ２及びＲＰＥ６５からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第１の核酸が、配列番号１～１３からなる群から選択される配列を有する、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記第１の核酸が、配列番号１４～２０からなる群から選択される配列を有する、請求項１２に記載の方法。
  17. 神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒することを必要とする対象において前記神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、
    ＰＧＣ１αまたはＮＲＦ２をコードする導入遺伝子を含む有効量の１つ以上のウイルスベクターを、前記対象に投与することを含み、
    前記ウイルスベクターが、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を標的とする、前記方法。
  18. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ウイルスベクターが、ＲＧＣ特異的プロモーターを更に含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記ＲＧＣ特異的プロモーターが、ｈＳＮＣＧ及びＰｌｅ（ＮＥＦＬ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒することを必要とする対象において前記神経変性疾患の発症を遅延させる、前記神経変性疾患を処置する、予防する、及び／または治癒する方法であって、
    ＫＥＡＰ１を阻害するかもしくは標的とする核酸を含むか、またはＫＥＡＰ１を阻害するかもしくは標的とする核酸をコードする、治療有効量の１つ以上のウイルスベクターを、前記対象に投与することを含み、
    前記ウイルスベクターが、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を標的とする、前記方法。
  22. ＫＥＡＰ１を阻害する前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、アプタマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記核酸が、ｇＲＮＡであり、配列番号１４～２０からなる群から選択される配列を有する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ウイルスベクターが、ＲＧＣ特異的プロモーターを更に含む、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記ＲＧＣ特異的プロモーターが、ｈＳＮＣＧ及びＰｌｅ（ＮＥＦＬ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記神経変性疾患が、緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、常染色体優性視神経萎縮症（ＡＤＯＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。

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