KR20220150906A - 신경변성의 발병 지연 또는 치료를 위한 대사체의 재프로그래밍 - Google Patents

신경변성의 발병 지연 또는 치료를 위한 대사체의 재프로그래밍 Download PDF

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KR20220150906A
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pgc1α
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스티븐 에이치. 창
슈안 쿠이
난-카이 왕
페이-캉 리우
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더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

본 개시내용은 개선된 세포 및 조직 생존 및 기능을 야기하는 하나의 특정 망막 및 뉴런 세포 유형에서 대사를 재프로그래밍하기 위한 방법 및 화합물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 다양한 신경퇴행성 병태, 특히 실명을 유발하는 병태에서 세포의 대사 및 생존을 재프로그래밍하기 위해 PGC1α/Pgc1α 또는 NRF2/Nrf2를 증가시키거나 HIF/Hif 또는 KEAP1/Keap1을 저해하는 것에 관한 것이다.

Description

신경변성의 발병 지연 또는 치료를 위한 대사체의 재프로그래밍
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 2월 7일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/971,370호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
정부 지원
이 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)이 수여한 U54OD020351, R24EY028758, R01AR059703, R24EY027285, R01EY018213, R01EY024698, R01EY026682, U01EY030580 및 R21AG050437에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
기술분야
본 개시내용은 개선된 조직 생존 및 기능을 야기하는 하나의 특정 망막 및 뉴런 세포 유형에서 대사를 재프로그래밍하기 위한 방법 및 화합물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 다양한 신경퇴행성 병태, 특히 실명을 유발하는 병태에서 세포 및 조직의 대사 및 생존을 재프로그래밍하기 위해 PGC1α/Pgc1α 또는 NRF2/Nrf2를 증가시키거나 HIF/Hif 또는 KEAP1/Keap1을 저해하는 것에 관한 것이다.
실명을 유발하는 신경퇴행성 질환은 치료 옵션이 제한적이다. 이러한 질환은 망막색소 변성증, 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 및 상염색체 우성 시신경 위축을 포함한다.
망막색소 변성증(RP)은 주로 간상체 광수용체 사멸을 유발하는 71개 초과의 돌연변이에 의해 유발되는 가장 흔한 유전성 망막 이영양증이다. 추상체는 RP의 원인이 되는 돌연변이에 의해 직접 살해되지 않지만, 추상체 사멸은 항상 간상체 사멸에 뒤따라 일어나고(Campochiaro and Mir. 2018) 주요 간상체 사멸 단계 후에 시작된다(Punzo, et al. 2009). 인공 망막(da Cruz, et al. 2016) 또는 RPE65 유전자 요법(Russell, et al. 2017)을 사용한 최근의 발전은 말기 RP 또는 RPE65 돌연변이를 보유한 환자에게 각각의 치료 옵션을 제공한다. 단일 유전자의 증대 또는 회복에 초점을 맞춘 RP에 대한 임상 유전자 요법 시험은 성공하더라도 해당 특정 유전자 돌연변이를 보유한 환자에게만 적용 가능할 것이다(Takahashi, et al. 2018). 따라서, 모든 RP에 공통적인 경로를 표적화하는 보다 일반적으로 적용 가능한 요법은 다양한 간상체-특이적 돌연변이에 의해 유발된 RP에 대한 잠재적인 치료법으로 작용할 수 있다(Duncan, et al. 2018).
녹내장은 7천만 명 초과의 사람들에게 영향을 미치며 전 세계적으로 실명을 유발하는 가장 흔한 신경퇴행성 질환이다(Quigley and Broman 2006). 망막 신경절 세포(RGC) 변성 및 사멸은 실명을 유발하는 신경퇴행성 질환, 예컨대, 녹내장 및 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)의 일반적인 특징이다. 약물이 안압을 낮추고 RGC 사멸률을 감소시킬 수 있지만, 이러한 치료법은 치유를 제공하지 않는다. 다시 말하지만, 성공하더라도 단일 유전자의 증대 또는 회복에 초점을 맞춘 임상 유전자 요법 시험은 특정 유전자 돌연변이를 보유한 환자에게만 적용 가능할 것이다(Lam, et al. 2010). 따라서, RGC 사멸의 공통적인 경로를 표적화하는 보다 일반적으로 적용 가능한 요법은 녹내장 및 시신경 위축 환자에 대한 잠재적인 치료법으로 작용할 수 있다.
따라서, 망막 퇴행성 질환, 예컨대, RP를 안화하고, 보다 광범위하게는 신경퇴행성 질환, 예컨대, 녹내장, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 루이소체 치매, 및 유사한 신경퇴행성 병태 또는 뉴런 생존을 촉진시키기 위해 동화작용을 상향조절하고 이화작용을 하향조절함으로써 이익을 얻는 다른 병태에서 뉴런 생존을 촉진시키기 위한 추가적인 치료제뿐만 아니라 보다 광범위하게 효과적인 유전자 요법에 대한 시급한 필요성이 존재한다.
본 개시내용은 환자의 유전적 배경에 관계없이, 대사 균형을 회복시킴으로써, 모든 망막색소 변성증(RP), 녹내장, 및 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA) 환자의 발병을 치료, 예방 및/또는 지연시키기 위한 비-유전자-특이적 전략을 제공하며, 이는 결국 광수용체 사멸 및 시력 손실을 예방할 수 있다. 본 개시내용은 실명을 유발하는 망막 퇴행성 질환, 예컨대, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA) 및 녹내장뿐만 아니라, 신경퇴행성 질환, 예컨대, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매의 발병을 지연, 상기 질환을 치유, 치료 또는 예방하기 위하여, 증식체-활성화 수용체 감마, 공동활성인자 1 알파(proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha: PGC1α) 또는 핵 인자 적혈구 2-관련 인자(nuclear factor erythroid 2-related factor: NRF2)를 과발현 또는 증가시키기 위한, 또는 저산증-유도 인자(hypoxia-inducible factor: HIF) 또는 Kelch-유사 ECH-연관 단백질 1(Kelch-like ECH-associated protein 1: KEAP1)을 저해, 제거 또는 감소시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
예방을 위해, 본 조성물은 실명을 유발하는 증상을 포함하여, 신경퇴행성 질환의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하기 위하여 대상체에게 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 무증상일 수 있다.
본 조성물은 시험관내에서 사용되거나 대상체에게 투여될 수 있다. 투여는 국소, 정맥내, 비강내, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 다른 적합한 경로일 수 있다. 본 조성물은 유리체내 주사, 망막하 주사 또는 맥락막상 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하여, 본 명세서에 기재된 질환을 가지거나 발병할 위험이 있는 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 대상체)에 본 명세서에 기재된 단백질 중 하나 이상을 인코딩하는 이식유전자를 함유하는 조성물을 투여할 수 있다. 조성물은 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 PGC1α를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 NRF2를 인코딩한다.
추가적으로, 본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하여, 본 명세서에 기재된 질환을 가지거나 발병할 위험이 있는 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 대상체)에 핵산 저해제 또는 단백질 중 하나 이상의 저해제를 인코딩하는 핵산 또는 본 명세서에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자 중 하나 이상을 표적화하는 핵산을 함유하는 조성물을 투여할 수 있다. 조성물은 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 저해제는 HIF에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 저해제는 KEAP1에 대한 것이다.
본 개시내용은 PGC1α를 증가시키는 작용제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용은 NRF2를 증가시키는 작용제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, PGC1α 및 NRF2를 증가시키는 작용제는 PGC1α 및 NRF2를 인코딩하는 핵산이다.
본 개시내용은 또한 PGC1α를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 NRF2를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 PGC1α를 증가시키는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용은 NRF2를 증가시키는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 PGC1α 및/또는 NRF2를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 PGC1α 및/또는 NRF2를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 재조합 또는 rAAV이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV2 혈청형이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV8 혈청형이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 특정 세포를 표적화하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 표적화된 세포는 망막 상피 세포(RPE)이다. 일부 실시형태에서, 표적화된 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 PGC1α를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 NRF2를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, rAAV는 AAV2 혈청형이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV8 혈청형이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 특정 세포를 표적화하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 표적화된 세포는 망막 상피 세포(RPE)이다. 일부 실시형태에서, 표적화된 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다.
HIF 또는 KEAP1을 저해하는 작용제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 작용제는 단백질, 핵산, 소분자, 화학물질 및 이들의 조합물의 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 가이드 RNA(gRNA), 앱타머, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 HIF를 저해하거나, HIF를 저해하거나 HIF를 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 KEAP1을 저해하거나, KEAP1을 저해하거나 KEAP1을 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 치료적 유효량의 바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용은 HIF를 저해하거나 HIF를 표적화하는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 HIF를 저해하거나, HIF를 저해하거나 HIF를 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 HIF를 저해하거나, HIF를 저해하거나 HIF를 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용은 KEAP1을 저해하거나 KEAP1을 표적화하는 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 KEAP1을 저해하거나, KEAP1을 저해하거나 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 KEAP1을 저해하거나, KEAP1을 저해하거나 KEAP1을 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 재조합 또는 rAAV이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV2 혈청형이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV8 혈청형이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 특정 세포를 표적화하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 표적화된 세포는 망막 상피 세포(RPE)이다. 일부 실시형태에서, 표적화된 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 HIF를 저해하거나 HIF를 표적화하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 HIF를 저해하거나 HIF를 표적화하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 EIAV이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 특정 세포를 표적화하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 표적화된 세포는 망막 상피 세포(RPE)이다. 일부 실시형태에서, 표적화된 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 KEAP1을 저해하거나 KEAP1을 표적화하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 KEAP1을 저해하거나 KEAP1을 표적화하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 EIAV이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 특정 세포를 표적화하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 표적화된 세포는 망막 상피 세포(RPE)이다. 일부 실시형태에서, 표적화된 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 a) 환자에서 내인성 HIF 유전자에 혼성화하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열(들), 및 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 제2 핵산 서열의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공하며, 여기서 Cas 뉴클레아제는 내인성 HIF 유전자를 절단하여 대상체에서 내인성 HIF 유전자의 HIF 넉아웃을 생성한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 a) 환자에서 내인성 KEAP1 유전자에 혼성화하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열(들), 및 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 제2 핵산 서열의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법을 제공하며, 여기서 Cas 뉴클레아제는 내인성 KEAP1 유전자를 절단하여 대상체에서 내인성 KEAP1 유전자의 KEAP1 넉아웃을 생성한다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 하나의 벡터 상에 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 상이한 벡터 상에 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 재조합 또는 rAAV이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV2 혈청형이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV8 혈청형이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 EAIV이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 특정 세포를 표적화하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 세포는 망막 상피 세포(RPE)이다. 일부 실시형태에서, 표적화된 세포는 망막 신경절 세포(RGC)이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 간섭 RNA에 특이적으로 사용되는 프로모터이다.
임의의 전술한 방법 및 조성물을 사용하여 세포의 생존을 증가시키고 세포에서 대사를 재프로그래밍할 수 있다. 이와 같은 세포는 광수용체 세포, 뉴런 세포, 및 망막 세포를 포함할 것이다.
본 개시내용의 상기 양태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 조성물은 리포솜, 소포, 합성 소포, 엑소좀, 합성 엑소좀, 덴드리머, 또는 나노입자를 추가로 포함할 수 있다.
또한 개시된 방법 중 임의의 것을 실행하기 위한 키트가 본 명세서에서 제공된다.
본 발명을 예시할 목적으로, 본 발명의 특정 실시형태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
Pde6b H620QH620Q 로 약칭되는 Pde6b H620QH620Q 는 상염색체 열성 RP의 전임상 모델이다.
도 1은 AAV8-VMD2 작제물의 설계 맵. 도 1A는 대조군 AAV8-VMD2-eGFP를 나타낸다. 도 1B는 AAV8-VMD2-NRF2-eGFP 작제물을 나타낸다.
도 2는 AAV8-VMD2-PGC1α(실선)의 망막하 주사 1개월 후 및 대조군인 주사되지 않은 눈(점선)의 Pde6b H620QH620Q 전임상 열성 모델의 ERG의 그래프. 암소시(scotopic) a파(도 2A), b파(도 2B), 및 명소시(photopic) b파(도 2C)에서 진폭의 통계적으로 유의한 증가가 있다.
도 3은 AAV8:: RPE65-Pgc1α-mcherry 작제물(도 3A) 및 AAV8::RPE65-mcherry(대조군 AAV)(도 3B)의 설계 맵.
도 4는 P28에서 AAV8::RPE65-Pgc1α-mcherry를 주사한 5마리의 Pde6b H620QH620Q 마우스로부터의 ERG 결과의 상자그림. 백내장 또는 망막 박리로 인해 제외된 마우스는 없었다. 암소시 a파와 b파, 및 명소시 b파의 연속 강도를 비교하였다. 흰색 상자는 주입된 오른쪽 눈을 나타내고, 빈 상자는 주사되지 않은 대조군 왼쪽 눈을 나타낸다. 암소시 반응의 일부 강도와 명소시 반응의 모든 강도에서 주사된 눈과 주사되지 않은 눈 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있다. n=5; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001
도 5는 P28(간상체와 추상체가 결합된 최대 반응) 및 P47(추상체 반응)에서 AAV8::RPE65-Pgc1α-mcherry를 주사한 5마리의 Pde6b H620QH620Q 마우스(첫 번째 동복자)로부터의 ERG 결과의 상자그림. 4개의 상이한 시점에서 최대 반응의 a파 및 b파와 추상체 반응의 b파, 및 P28에서의 대조군 AAV 바이러스는 첫 번째 레인에 있다. P28과 P47에서는 주사된 눈과 주사되지 않은 눈 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있지만, P55와 P72에서는 그렇지 않다. P55 및 P72에서의 ERG 결과는 이전 시점에서 ERG로 테스트한 마우스에서 얻은 것이었다. 이들 마우스 중 일부는 첫 번째 ERG 테스트 후 각막 혼탁이 발생하여 ERG 진폭에 영향을 미쳤다. *P<0.05, **P<0.01.
도 6은 기능적 및 해부학적 구제가 있는 1마리의 AAV8::RPE65-Pgc1α-mcherry 처리된 Pde6b H620QH620Q 마우스의 추가 결과를 나타내는 도면. 도 6A는 AAV8::RPE65-Pgc1α-mcherry 처리된 눈에 대한 P28에서의 ERG 반응의 그래프이다. 도 6B는 대조군인 주사되지 않은 눈에 대한 P28에서의 ERG 반응의 그래프이다. AAV8 처리된 눈은 더 높은 진폭을 나타내며, 이는 보존된 광수용체 기능 B를 나타낸다. 도 6C는 AAV8::RPE65-Pgc1α-mcherry 처리된 눈의 P64에서의 조직학을 나타낸다. 도 6D는 대조군 눈의 P64에서의 조직학을 나타낸다. 도 6C 및 도 6D에서, 좌측 이미지는 조직이 채취된 눈의 부분을 나타낸다. 중앙 이미지는 염색된 중간 주변부를 나타낸다. 우측 이미지는 시신경 유두를 나타낸다. 조직학 결과는 대조군 눈과 비교하여 주사된 눈에서 광수용체 변성의 감속을 나타낸다.
도 7은 AAV8::RPE65-Pgc1α-mcherry로 처리된 Pde6b H620QH620Q 눈(도 7A) 및 대조군인 주사되지 않은 눈(도 7B)에서 홀 마운트 망막의 더 적은 색소 이동을 나타내는 도면. 색소 이동은 망막색소 변성증 중증도의 마커이다.
도 8은 추상체-특이적 Arr3 항체로 염색된 홀 마운트 망막의 이미지. 도 8A는 AAV8::RPE65-Pgc1α-mcherry로 처리된 Pde6b H620QH620Q 눈을 나타내고 도 8B는 비처리 Pde6b H620QH620Q 대조군을 나타낸다.
도 9는 PGC1α에 대한 AAV2/2-hSNCG 작제물의 설계 맵. 도 9A는 AAV2/2-hSNCG-PGC1α-eGFP의 설계를 나타낸다. 도 9B는 AAV2/2- hSNCG-eGFP의 설계를 나타낸다.
도 10은 AAV2/2-hSNCG 작제물 NRF2의 설계 맵. 도 10A는 AAV2/2-hSNCG-NRF2-eGFP의 설계를 나타낸다. 도 10B는 AAV2/2- hSNCG-eGFP의 설계를 나타낸다.
도 11은 간상체 및 추상체 세포의 생존 및 기능에 대한 HIF의 제거 결과를 나타내는 도면. 도 11A는 암소시, 명소시, 및 혼합 간상체-추상체 b파 진폭(μV)을 획득하기 위해 암순응 및 명순응 조건 하에서 4주째와 6주째에 얻은 ERG 데이터이다. RPE에서 Hif2a가 제거된 Hif -/- Pde6b H620Q/H620Q 의 망막 기능의 추적(광 추적)을 연령 일치 Hif loxP/loxP ;Pde6b H620Q/H620Q 대조군(암 추적)과 비교하여 4주째 및 6주째에 나타내었다. 도 11B는 Hif -/- Pde6b H620Q/H620Q (좌측 막대)의 ERG 추적 진폭의 그래프이며 연령 일치 대조군 hif loxP/loxP ;Pde6b H620Q/H620Q (우측 막대)와 비교하여 플롯팅되어 있다. 4 내지 5마리의 마우스가 각각의 그룹에 있었다. 도 11C는 4주째에 hif loxP/loxP; Pde6b H620Q/H620Q 마우스와 비교하여 Hif -/-; Pde6b H620Q/H620Q 에서 더 두꺼운 ONL 및 OS 층과 광수용체 외부 핵(ONL) 층(상단, 노란색) 및 IS/OS 층(하단, 녹색)의 더 큰 폭을 나타내는 망막의 파라핀 절편의 H & E 염색 이미지이다. (스케일 바 = 50 ㎛). 도 11D는 측정 및 플롯팅된 바와 같은 ONL 및 IS/OS 층의 폭의 그래프이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 본 발명의 맥락 및 각각의 용어가 사용되는 특정 맥락 내에서, 당업계의 통상적인 의미를 가진다. 특정 용어는 본 발명의 방법 및 이를 사용하는 방법을 설명함에 있어 실무자에게 추가적인 지침을 제공하기 위해, 아래 또는 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 더욱이, 동일한 것이 하나 초과의 방식으로 언급될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 결과적으로, 대체 언어 및 동의어가 본 명세서에서 논의된 용어 중 임의의 하나 이상에 사용될 수 있으며, 용어가 본 명세서에서 상세히 설명되거나 논의되는지 여부에 어떠한 특별한 의미를 두지 않는다. 특정 용어에 대한 동의어가 제공된다. 하나 이상의 동의어의 자세한 설명은 다른 동의어의 사용을 제외하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 용어의 예를 포함하여 명세서의 어느 곳에서 예를 사용하는 것은 단지 예시일 뿐이며, 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범주 및 의미를 결코 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 바람직한 실시형태로 제한되지 않는다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하고, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법에 부분적으로 의존할 것이며, 즉 측정 시스템의 제한, 즉 약제학적 제형과 같은 특정 목적에 필요한 정밀도의 정도를 의미한다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 훨씬 더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 열배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 가정해야 한다.
"뉴런"은 중추 또는 말초 신경계를 구성하는 임의의 세포를 지칭하고 포함하는 것을 의미한다.
"망막"은 눈의 임의의 감광성 세포뿐만 아니라 광변환 캐스케이드를 가능하게 하거나 촉진시키거나 이와 관련된 지지 세포를 지칭하고 포함하는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이 용어 "대상체"는 치료 또는 예방적 치료가 필요한 동물을 지칭한다. 대상체는 포유동물, 예컨대, 개, 고양이, 설치류, 소, 말, 돼지, 양, 및 영장류를 포함한다. 따라서, 본 발명은 수의학에서, 예를 들어, 반려 동물, 농장 동물, 동물원의 실험실 동물, 및 야생 동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 인간 의료 적용에 특히 바람직하다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이 용어 "환자"는 인간 대상체를 의미한다. 일부 실시형태에서, "환자"는 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는 것으로 알려져 있거나 의심된다.
어구 "치료적 유효량"은 본 명세서에서 대상체에서 임상적으로 유의한 상태의 개선을 유발하거나, 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 지연 또는 최소화 또는 완화하거나, 대상체에서 원하는 유익한 생리 변화를 초래하는 데 충분한 양을 의미하는 데 사용된다.
용어 "치료하다", "치료" 등은 질환 또는 장애의 증상 중 적어도 하나를 늦추거나, 경감시키거나, 개선시키거나 완화시키거나, 발병 후 질환 또는 장애를 역전시키는 수단을 지칭한다.
용어 "예방하다", "예방" 등은 질환 또는 장애의 발병을 방지하거나 질환 또는 장애의 정도를 최소화하거나, 발병 과정을 늦추기 위해 명백한 질환 또는 장애 발병 전에 작용하는 것을 지칭한다.
용어 "치유하다" 등은 병을 고치거나, 낫게 하거나, 건강하게 회복시키거나, 또는 질환의 재발이 없는 시간을 가능하게 하여 재발 위험이 적도록 하는 것을 의미한다.
용어 "이를 필요로 하는"은 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는 것으로 알려져 있거나 의심되거나 가질 위험이 있는 대상체일 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "작용제"는 효과를 생성하거나 생성할 수 있는 물질을 의미하며, 화학물질, 제약, 생물의약품, 작은 유기 분자, 항체, 핵산, 펩타이드, 및 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "조성물"은 하나 초과의 요소 또는 성분의 혼합 또는 조합으로부터 생성된 생성물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 비히클을 지칭하며, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 숙주에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 부반응, 예컨대, 인간에게 투여될 때 위경련, 현기증 등을 일으키지 않고, 연방 또는 주 정부의 규제 기관이 승인하거나 동물, 보다 특히 인간에서 사용하기 위해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다.
"분리된 핵산 분자"는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 자연에서 발견되거나 자연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 연관되지 않은 합성 기원 또는 이의 일부 조합을 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정 뉴클레오타이드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 온전한 염색체를 포함하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 명시된 핵산 서열을 "포함하는" 분리된 핵산 분자는 명시된 서열에 추가적으로, 최대 10개 또는 심지어 최대 20개 이상의 다른 단백질 또는 이의 일부 또는 단편에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 열거된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.
어구 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 그것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 수행된다. 이와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다.
용어 "벡터"는 임의의 유전 요소, 예컨대, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 또는 비리온을 포함하며, 이는 적절한 제어 요소와 연관될 때 복제할 수 있고 세포 간에 유전자 서열을 전달할 수 있다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라, 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 절편이 프로모터의 전사 제어 하에 위치하는 벡터인 것으로 고려된다. "프로모터"는 유전자의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 어구 "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어 하에", 또는 "전사 제어 하에"는 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자 발현을 제어하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 방향에 있음을 의미한다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물" 또는 "작제물"은 서열을 인코딩하는 핵산의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전적 작제물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 발현은, 예를 들어, 전사된 유전자로부터 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 생성물 또는 저해 RNA를 생성하기 위한 핵산의 전사를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 분리된 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV)를 제공한다. AAV와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분리된"은 AAV의 자연 환경으로부터(예를 들어, 숙주 세포, 조직 또는 대상체로부터) 분리되거나 인공적으로 생산된 AAV를 지칭한다. 분리된 AAV는 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 이와 같은 AAV는 본 명세서에서 "재조합 AAV"로 지칭된다. 재조합 AAV(rAAV)는 바람직하게는 rAAV의 이식유전자가 하나 이상의 미리 결정된 조직(들)에 특이적으로 전달될 수 있도록 조직-특이적 표적화 능력을 가진다. AAV 캡시드는 이러한 조직-특이적 표적화 능력을 결정하는 중요한 요소이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "AAV1", "AAV2", "AAV3", "AAV4" 등은 각각 AAV1, AAV2, AAV3, 또는 AAV4 유래의 ITR뿐만 아니라, 각각 AAV1, AAV2, AAV3, 또는 AAV4 유래의 캡시드 단백질을 함유하는 AAV 벡터를 지칭한다. 용어 "AAV2/1", "AAV2/8", "AAV2/9" 등은 각각 AAV2 유래의 ITR 및 AAV1, AAV8, 또는 AAV9 유래의 캡시드 단백질을 함유하는 위형 AAV 벡터를 지칭한다.
형질감염된 숙주 세포와 관련하여, 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하는 데 사용되며, 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입되었을 때 세포는 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기법이 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al., Virology 52:456 (1973), Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986), 및 Chu et al., Gene 13:197 (1981)]을 참조한다. 이와 같은 기법은 하나 이상의 외인성 핵산, 예컨대, 뉴클레오타이드 통합 벡터 및 기타 핵산 분자를 적합한 숙주 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다.
"숙주 세포"는 관심 물질을 보유하거나 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 작제물, AAV 미니유전자 플라스미드, 부속 기능 벡터, 또는 재조합 AAV의 생산과 연관된 다른 전달 DNA의 수용체로서 사용될 수 있다. 이 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 모 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 형태가 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체가 원래 모체와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있음이 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 호환 가능하게 사용되며 이와 같은 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 횟수에 관계없이 1차 대상 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적이거나 우발적인 돌연변이로 인해 모든 자손이 정확히 동일한 DNA 함량을 갖지 않을 것이라는 것도 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도된 경우, 문맥에서 명확해질 것이다.
세포와 관련하여, 용어 "분리된"은 세포의 자연 환경으로부터(예를 들어, 조직 또는 대상체로부터) 분리된 세포를 지칭한다. 용어 "세포주"는 시험관내에서 연속적 또는 연장된 성장 및 분열이 가능한 세포 집단을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 전구 세포로부터 유래된 클론 집단이다. 이와 같은 클론 집단의 저장 또는 이동 동안 핵형에서 자발적 또는 유도된 변화가 발생할 수 있다는 것이 당업계에 추가로 알려져 있다. 따라서, 지칭된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확히 동일하지 않을 수 있으며, 지칭된 세포주는 이와 같은 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 세포"는 외인성 DNA 절편, 예컨대 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드의 전사 또는 생물학적으로 활성인 핵산, 예컨대 RNA의 생산을 야기하는 DNA 절편이 도입된 세포를 지칭한다.
분자 생물학의 표준 방법은 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition); Sambrook and Russell Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Wu Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA) (1993)]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 문헌[Ausbel, et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY (2001)]에도 보인다.
약어
RP- 망막색소 변성증
ADOA- 상염색체 우성 시신경 위축
RPE- 망막 색소 상피
RGC- 망막 신경절 세포
OXPHOS- 산화적 인산화
ROS- 활성 산소종
PGC1α- 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 공동활성인자 1 알파
NRF2- 핵 인자 적혈구 2-관련 인자
Keap1- Kelch-유사 ECH-연관 단백질 1
HIF- 저산소증-유도 인자
ERG- 망막전도
PERG- 패턴화 망막전도
ONL- 외과립층
망막색소 변성증(RP), 녹내장, 황반 변성 및 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 유발하는 다양한 신경퇴행성 질환뿐만 아니라, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 루이소체 치매, 및 유사한 신경퇴행성 병태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 신경퇴행성 질환의 발병을 지연시키고 상기 질환을 예방, 치료 및/또는 치유하기 위한 유전자 요법이 본 명세서에 개시되어 있다. 상이한 돌연변이가 이러한 질환을 유발하지만, 이러한 질환의 궁극적인 원인은 질환과 관련된 다양한 세포의 기능 장애성 대사이다. 어떠한 이론에 구속되지 않지만, 이들 세포에서 대사를 재프로그래밍함으로써, 이러한 신경퇴행성 질환은 질환을 유발하는 돌연변이에 관계없이 예방, 치료 및/또는 치유될 수 있다. 대사는 특정 인자를 증가시키거나 감소시키고 또한 다양한 질환에 관련된 특정 세포에 특이적으로 치료법을 전달하는 표적화 유전자 요법에 의해 재프로그래밍될 수 있다.
망막 색소 상피(RPE)에서 대사를 재프로그래밍함으로써 신경퇴행성 질환의 발병을 지연시키고, 상기 질환을 예방, 치료 및/또는 치유하는 방법 및 조성물이 본 명세서에 구체적으로 개시되어 있다. 이는 다음에 의해 달성된다:
퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 공동활성인자 1 알파(PPARGC1A; 또한 PGC1α로도 알려짐)의 발현 증가;
핵 인자 적혈구 2-관련 인자(NRF2)의 발현 증가;
Kelch-유사 ECH-연관 단백질 1(KEAP1)의 발현 감소 또는 저해; 및/또는
저산소증-유도 인자(HIF)의 발현 감소 또는 저해.
또한 망막 신경절 세포(RGC)에서 대사를 재프로그래밍함으로써 신경퇴행성 질환의 발병을 지연시키고, 상기 질환을 예방, 치료 및/또는 치유하는 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시되어 있다. 이는 다음에 의해 달성된다:
퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 공동활성인자 1 알파(PPARGC1A; 또한 PGC1α로도 알려짐)의 발현 증가; 또는
핵 인자 적혈구 2-관련 인자(NRF2)의 발현 증가; 및/또는
Kelch-유사 ECH-연관 단백질 1(KEAP1)의 발현 감소 또는 저해.
특정 세포로의 유전자 전달을 표적화하는 이러한 방법 및 조성물은 망막색소 변성증(RP), 녹내장, 황반 변성, 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 신경퇴행성 질환의 발병을 지연시키고 상기 질환을 예방, 치료 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법 및 조성물은 또한 뉴런 세포, 망막 세포, 및 광수용체 세포를 포함하여 세포에서 대사를 재프로그래밍하고, 세포의 생존을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
녹내장은 미토콘드리아 기능 장애로 인한 미토콘드리아 생합성 감소 및 산화 스트레스 증가와 연관되어 있다. 녹내장은 7천만 명 초과의 사람들에게 영향을 미치며 전 세계적으로 실명을 유발하는 가장 흔한 신경퇴행성 질환이다(Quigley and Broman 2006). 사실, 이는 진행성 RGC 사멸 및 시력 손실을 특징으로 하는 다인성 질환의 그룹이다. 유전성 녹내장의 마우스 모델에서의 최근 연구는 시신경 손상의 발병과 동시에 신경절 세포층에서 미토콘드리아 생합성 감소를 입증하였다(Guo, et al 2014). 미토콘드리아 생합성은 새로운 미토콘드리아의 수 및/또는 부피의 증가를 초래하는 과정이기 때문에, 미토콘드리아 생합성 증가는 손상된 미토콘드리아가 보충되고 건강한 미토콘드리아 집단이 유지될 수 있음을 보장하는 적응적 조치로 가정된다. 또한, 축적된 증거는 산화 스트레스를 녹내장성 신경퇴행의 미토콘드리아 기능 장애와 연결시킨다. 비정상적인 미토콘드리아 대사 및 손상된 산화적 인산화(OXPHOS)는 후속적으로 RGC 아폽토시스를 초래하는 ROS 수준 증가로 인해 미토콘드리아 손상 및 산화 스트레스를 야기하는 것으로 나타났다. 녹내장에서 RGC 생존을 촉진시키는 데 있어서 미토콘드리아 생합성과 항산화 반응의 역할을 평가한 이전 연구는 없었다. 녹내장 및 기타 시신경 위축에 대한 현재 임상 접근법은 안압을 낮추는 데, 특히 RGC 사멸을 저해하는 데 초점을 맞추고 있으나; 안압을 낮추는 것은 대략 절반의 환자에서 녹내장성 시야 손실을 감소시키지 않는다. 따라서, RGC 사멸과 연관된 질환에 대한 미토콘드리아-표적 요법에 대한 큰 필요성이 존재한다.
상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)은 미토콘드리아 기능 장애와 연관되어 있다. ADOA는 가장 흔한 유전성 시신경병증으로, 추정되는 질환 유병률이 1:12,000 내지 1:50,000이다.17 이는 핵 OPA1 유전자의 돌연변이와 연관되어 있다. OPA1은 미토콘드리아 역학(내막 융합), 결정 무결성, 에너지, 및 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 유지를 제어하는 미토콘드리아 디나민-관련 GTPase인 OPA1 단백질을 인코딩한다(Delettre, et al. 2002). OPA1 기능에 대한 이전 연구는 OPA1 결핍이 크리스테 조직, 생합성, 산화적 인산화(OXPHOS), 및 미토콘드리아 막 전위의 유지에서 결함을 유발하고, 아폽토시스 민감도를 증가시키며, mtDNA 수준/안정성 및 에너지 활성을 감소시킴을 나타내었다. 그러나, 미토콘드리아 기능 장애가 RGC 사멸을 유발하는 방법은 명확하게 기술되지 않았다.
망막 신경절 세포(RGC) 사멸은 미토콘드리아 기능 장애와 연관되어 있다. RGC는 시신경을 통해 확장되어 뇌에서 원위 말단 및 연결을 형성하는 긴 축삭을 갖는 독특한 세포구축과 연관된 고도로 구획화된 에너지 요구로 인해 미토콘드리아 기능 장애에 매우 취약하다(Wang, et al. 2003). 미토콘드리아 생합성은 손상된 미토콘드리아의 대체를 보장하기 위한 미토콘드리아 품질 관리의 중요한 구성요소이며, 미토콘드리아 생합성의 감소는 많은 신경퇴행성 장애, 예컨대, 녹내장 및 시신경 위축과 연관되어 있다(Guo, et al. 2014; MacVivar and Langer, 2016). 축적된 증거는 산화 스트레스와 RGC 사멸에서의 미토콘드리아 기능 장애를 연결하고 비정상적인 미토콘드리아 대사 및 손상된 산화 인산화(OXPHOS)는 활성 산소종(ROS)의 수준 증가로 인한 미토콘드리아 손상 및 산화 스트레스로 이어져, RGC 아폽토시스를 초래한다. 미토콘드리아 기능 장애가 RGC 사멸로 이어지는 방법뿐만 아니라 RGC에서 건강한 미토콘드리아 집단을 유지하는 데 필요한 메커니즘(들)은 완전히 이해되지 않는다. RGC 수 및 기능 감소를 나타내는 신규 ADOA 마우스 모델, 및 RGC 사멸의 다른 마우스 모델의 사용으로 미토콘드리아 기능 회복이 RGC 사멸을 예방하고, 이는 결국 ADOA, 녹내장 및 다른 신경퇴행성 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있음이 본 명세서에 나타나 있다.
RP는 전 세계적 유병률이 약 3,000명 중 1명이고 총 1백만 명 초과의 개체가 이환된 가장 흔한 유전성 망막 이영양증이다. RP는 주로 간상체 광수용체 사멸을 유발하는 71개 초과의 돌연변이 중 어느 하나에 의해 유발된다. 추상체는 이들 돌연변이에 의해 직접 살해되지 않지만, 추상체 사멸은 특정 돌연변이에 관계없이, 보통 주요 간상체 사멸 단계 후에, 항상 간상체 사멸을 뒤따른다(Campochiaro, et al. 2018; Punzo, et al. 2009). 추상체는 일광, 색상 및 중심 시력에 필수적이기 때문에 추상체의 사멸은 실명을 유발한다. RP에 대한 이전 연구 및 임상 시험은 단일 유전자를 증대시키거나 회복시키는 데 초점을 맞추었으나; 이러한 전략은 성공하더라도 단일 특정 돌연변이를 보유한 환자에게만 적용할 수 있다(Takahashi, et al. 2018). FDA는 최근 RP에 대해 2가지 잠재적인 치료법, 즉 말기 RP 환자에 대해서만 승인된 인공 망막 및 RPE65 돌연변이를 보유한 환자에 대해서만 승인된 RPE65 유전자 요법을 승인하였다(Duncan, et al. 2018). 수많은 간상체-특이적 돌연변이로 인한 RP에 대해 보다 광범위하게 적용 가능한 치료법으로 작용할 수 있는 RP에서 추상체 사멸에 공통적인 경로를 표적화하는 요법을 개발할 큰 필요성이 존재한다.
증가하는 증거는 망막 내에서 활성 산소종(ROS)의 생산과 제거 사이의 불균형을 나타내는 명백한 산화 스트레스가 RP에서 추상체 사멸의 진행에 중요한 역할을 함을 시사한다. 간상체는 외과립층에 있는 세포의 95%를 구성하고 외부 망막으로 전달되는 대부분의 산소를 소비하기 때문에, RP에서 간상체의 사멸은 과도한 조직 산소를 유발하고 과산화물 라디칼의 생산을 증가시키는 높은 수준의 산소를 생성한다. 과잉 과산화물 라디칼은 지질, 단백질 및 DNA를 공격하는 다른 ROS, 예를 들어, 퍼옥시니트라이트를 생성하고, 후속적으로 추상체 사멸을 초래한다. 이전 연구는 항산화제를 전신 투여한 RP 동물 모델에서 추상체-보존 효과를 입증하였으며, 이는 산화 스트레스가 RP에서 추상체 사멸의 중요한 역할을 함을 시사한다(Lee, et al 2011).
Nrf2/KEAP1(Kelch-유사 ECH-연관 단백질 1) 신호 전달 경로는 가장 중요한 세포 항산화 방어 및 생존 경로 중 하나이다. 여러 연구에서 NRF2가 여러 안구 질환에서 산화 스트레스에 대한 보호 역할을 함이 입증되었다(Xiong, et al. 2015; Larabee, et al. 2016). 그러나, 외부 망막의 세포가 RP에서 추상체 사멸의 원인이 되는 주요 ROS에 기여하고, 따라서 표적 치료에 대한 지침을 거의 제공하지 않는다는 지식 격차가 있다. 망막의 특정 세포에서 항산화 반응을 향상시키는 것이 광수용체 생존을 촉진시킬 수 있는지 여부를 평가한 이전 연구는 없었다. 외부 망막의 어떤 세포가 주요 ROS에 기여하는지에 대한 이해 부족은 중요한 지식 격차를 나타낸다. 세포-특이적 항산화 반응을 향상시키는 것이 광수용체 사멸을 예방하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 다시 결국 질환을 예방, 치료 및/또는 치유할 수 있음이 본 명세서에 나타나 있다.
RP에 대한 추가 유전자 요법 해결책은 2가지 보편적인 대사 과정과 "대사 커플링" 가설, 즉 망막 색소 상피(RPE) 및 광수용체(간상체(95%) 및 추상체(5%))에서 글루코스를 에너지로 바꾸는 산화적 인산화(OXPHOS) 및 글루코스를 지방으로 바꾸는 동화작용의 균형을 회복하는 데 집중한다. 이들 두 과정은 밀접하게 연결되어 있다. 건강한 눈에서, 간상체 광수용체는 RPE에서 글루코스를 흡수하여 이를 지방과 락테이트로 전환한다. RPE는 결국 생성된 락테이트를 소비하고 동화작용을 억제하는 ATP-생성 경로인 OXPHOS를 통해 에너지를 생산한다. 간상체 세포가 죽거나 노화되기 시작하면, 락테이트 농도가 감소하여, RPE가 글루코스를 사용하여 지방과 지질을 생산한다. RPE가 이용 가능한 글루코스를 거의 모두 소비하면, 추상체 세포도 또한 죽을 것이다. 문헌[Zhang, et al. 2016A 및 Zhang, et al. 2016B]을 참조한다. 따라서, 중심 가설은 RPE 대사의 재프로그래밍으로 기본적인 특정 유전자 돌연변이와 독립적으로 RP에서 추상체 생존을 촉진할 수 있다는 것이다.
포유류 광수용체의 95% 초과가 간상체이며 이러한 대사 커플링 가설은 간상체-RPE 대사 커플링에 초점을 맞춘 연구를 기반으로 하기 때문에, RP에서 추상체 사멸의 기초가 되는 메커니즘을 정의하는 것은 어렵다. 따라서 추상체의 세포 대사 또는 추상체와 RPE 간의 대사 커플링에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 추상체 사멸이 RP에서 실명으로 이어진다는 것을 고려하면, 망막 대사 커플링에서 추상체의 역할에 대한 더 나은 이해는 RP에 대한 요법을 개발하는 데 중요하다.
질환을 치료하기 위한 대사 재프로그래밍은 RGC, RPE 및 광수용체 세포에서 특정 전사 인자를 상향조절하거나 하향조절함으로써 달성될 수 있다. 특정 세포에서 이들 전사 인자의 상향조절 또는 하향조절은 다양한 작용제를 특정 세포에 전달할 세포 특이적 프로모터를 사용하여 달성될 것이다.
한 가지 유망한 중재적 접근법은 세포-특이적 방식으로 대사 구획을 위한 노드를 조절함으로써 RPE와 광수용체 사이의 대사 상리작용을 회복하는 것이다. 매력적인 치료 표적으로 주목받고 있는 2개의 유전자는 저산소증-유도 인자(HIF)와 PPar(감마)-공동활성인자-1 알파(PGC1α)이며, 둘 다 산화적 인산화에서 중요한 역할을 하는 전사 인자를 인코딩한다. HIF 및 PGC1α는 각각 산화적 인산화의 음성 및 양성 조절인자인 것으로 알려져 있다. RPE 세포를 병리학적-해당작용 상태에서 신경보호-산화 상태로 자율적으로 재프로그래밍하는 구제 효과를 평가하기 위해, 망막색소 변성증(RP) 마우스 모델에서 HIF의 RPE-특이적 제거 및 PGC1α의 과발현을 별도로 유도하였다. 특히, 처리된 마우스는 보존된 광수용체 형태와 기능을 나타내어, 이 혁신적인 부정확 의학 접근법의 치료 효능을 검증하였다. 대사 불균형이 연령-관련 황반 변성에서 파킨슨병에 이르기까지 광범위한 신경퇴행성 질환의 기저에 있다는 점을 고려하면, 본 발명자들의 치료 전략의 임상적 영향과 중요성은 과장이라고 할 수 없다.
퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 감마, 공동활성인자 1 알파(PPARGC1A; 또한 PGC1α라고도 알려짐) mtDNA, 단백질, 및 막의 합성을 포함하여, 미토콘드리아 생합성을 유도하는 것으로 생각된다. PGC1α 공동활성인자는 미토콘드리아 생합성의 마스터 조절인자이다(Fernandez-Marcus, et al. 2011). PGC-1α는 미토콘드리아 활성을 조절하고 해당작용을 억제함으로써 해당작용에서 OXPHOS로 세포 대사를 리모델링한다.
뇌에서 PGC1α 넉다운은 해마 수상돌기에서 미토콘드리아 수를 감소시켜, 수상돌기 가시와 시냅스의 밀도를 낮추는 반면, PGC1α 과발현은 미토콘드리아 생합성과 시냅스 생성을 신장시켰다. 눈에서 PGC1α의 역할은 논란의 여지가 있으며 생체내에서 거의 연구되지 않았다.
HIF 하향조절 또는 제거의 유익한 효과에 대한 지지는 노화 시 HIF 발현이 RPE에서 2배 증가한다는 것이다(Wang, et al. 2020). 따라서 표적 전달을 사용한 RPE에서 Hif1a/2a의 하향조절은 대사를 건강한 상태로 재프로그래밍할 것이며, 즉 RPE에서 OXPHOS를 증가시키고 그리고 광수용체 세포에서 동화작용을 증가시킬 것이다.
핵 인자 적혈구 2-관련 인자(NRF2)는 전신 항산화 방어 시스템을 위한 핵심 핵 전사 인자이다. 정상적인 생리학적 조건 하에서, NRF2는 빠르게 전환되고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 지속적인 분해로 인해 낮은 수준에서 발견된다(McMahon, et al. 2004). 스트레스 조건 하에서, NRF2는 Kelch-유사 ECH-연관 단백질 1(KEAP1, 1차 Nrf2 저해제)에서 해리되고 핵으로 전위되며, 핵에서 DNA 프로모터 영역의 항산화 반응 요소(ARE)에 결합한다. 그 다음 NRF2는 ARE-관련 유전자(NQO1, HO-1, GCLC, GCLM, 및 글루타티온 합성효소)의 전사를 개시하며, 이들 모두는 글루타티온 조절을 통해 ROS를 해독한다. 여러 연구는 Nrf2가 당뇨망막병증 및 망막 허혈-재관류에서 산화 스트레스로부터 보호하고 신경퇴행 및 시신경염에서 뉴런 생존을 촉진시킴을 입증하였다(Larabee, et al. 2016; Xiong, et al. 2015). 그러나, Nrf2/Keap1/ARE 신호 전달 경로의 유도가 RGC의 신경보호를 촉진시키기 위해 표적화될 수 있는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.
RP의 마우스 모델에 대한 최근 연구는 망막 PGC1α 과발현의 해로운 영향을 보고하였다(Xiong, et al. 2015). 이러한 생체내 마우스 연구를 이용하는 잠재적인 문제는 인간 CMV 프로모터를 사용했다는 것이다. 이 프로모터가 추상체에서 강력한 발현을 유도하지만 간상체 및 RPE에서의 일부 발현도 또한 저자에 의해 언급되었으며; 따라서 이 프로모터의 사용은 비특이적 과발현을 야기한다. 따라서, RPE-특이적 프로모터 또는 Cre-드라이버를 사용하는 추가 연구는 RPE 생물학에서 PGC1α의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있다. PGC1α 및 NRF2 둘 모두의 과발현뿐만 아니라, HIF 저해의 유익한 효과를 생성하는 세포-특이적 프로모터의 사용이 본 명세서에 나타내 있다.
여기에는 대사 불균형을 구제하여 돌연변이 특이적이지 않은 질환의 진행을 늦추는 유전자 요법이 본 명세서에 나타나 있다. PGC1α 및 NRF2의 증가 또는 과발현 및 HIF 및 KEAP1의 저해 또는 제거는 특정 세포의 대사 불균형을 구제하여, 질환의 치료, 예방 및 치유로 이어진다. 개시된 유전자 요법에서 세포-특이적 프로모터를 사용하면 핵산이 표적화된 방식으로 전달됨을 보장한다. 이 기술은 단일 유전자가 아닌 질환 메커니즘을 표적화하기 때문에, 모든 RP 환자를 치료할 수 있는 가능성이 있다. 추가적으로, 이러한 치료 접근법은 알츠하이머병과 같은 대사 조절장애를 포함하는 다른 퇴행성 병태에 적용될 수 있다.
PGC1α 및 NRF2를 과발현 또는 증가시키는 방법 및 조성물
본 개시내용의 조성물 및 방법은 다양한 병리의 발병을 지연, 상기 병리를 치료, 예방 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자 요법 방법은 과발현이 질환, 구체적으로 신경퇴행성 질환, 보다 구체적으로 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 및 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 실명을 유발하는 신경퇴행성 질환을 치료, 예방 및/또는 치유할 수 있는 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 하나 이상의 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 알츠하이머병을 예방, 치료 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 신경퇴행성 질환을 예방, 치료 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 과발현되는 단백질은 PGC1α이다. 일부 실시형태에서, 과발현되는 단백질은 NRF2이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PGC1α 및/또는 NRF2를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물, 또는 조성물들, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 신경퇴행성 질환 또는 장애의 발병을 지연, 상기 질환 또는 장애를 치료, 예방, 치유, 및/또는 상기 질환 또는 장애의 중증도 또는 정도를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV, 예컨대, rAAV2, AAV10, AAV2/10, AAV9 또는 AAV2/9이다. 추가적으로, 조성물, 예를 들어, 바이러스 벡터는 적절한 세포로의 핵산 전달을 표적화하는 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화될 세포는 망막 신경절 세포이고 사용된 프로모터는 hSNCG, 및 Ple345(NEFL)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적화될 세포는 망막 색소 상피 세포이고 사용된 프로모터는 VMD2, RPE65 및 TYR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
임의의 적합한 바이러스 시스템이 AAV, 렌티바이러스 벡터, 또는 다른 적합한 벡터를 포함하는 감소하는 PGC1α 및/또는 NRF2를 증가시키는 데 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, PGC1α 및/또는 NRF2를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물 또는 조성물들(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, AAV)은 신경퇴행성 질환 또는 장애가 진단되거나 의심되는 즉시 투여된다. 이들 조성물은 단독으로 또는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 치료를 위한 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 이식유전자의 핵산 서열은 이식유전자를 발현할 특정 조성물(예를 들어, 바이러스 벡터)에 대한 지식을 기반으로 설계될 수 있다. 예를 들어, 한 유형의 이식유전자 서열은 발현 시 검출 가능한 신호를 생산하는 리포터 서열을 포함한다. 다른 예에서, 이식유전자는 치료 단백질 또는 치료 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 연구 목적, 예를 들어, 이식유전자를 보유하는 체세포 유전자이식 동물 모델을 생성하기 위해, 예를 들어, 이식유전자 생성물의 기능을 연구하기 위해 사용되도록 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하는 데 사용되도록 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 적절한 이식유전자 코딩 서열은 당업자에게 명백할 것이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 이식유전자는 PGC1α 및 NRF2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩할 것이다.
"PGC1α", "PGC1α", "Pgc1α" 및 "Pgc1α"라 함은 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 재조합 DNA 또는 RNA, 또는 PGC1α에서 생성되는 단백질을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, PGC1α는 이용된 특정 맥락에서 적절하게 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭할 수 있음을 주목한다. 추가적으로, 특정 맥락에서 언급은 마우스 유전자 또는 단백질에 대한 것이고, 다른 경우 특정 맥락에서 적절하게 인간 유전자 또는 단백질에 대한 것일 것이다.
인간 PGC1α 유전자(GenBank: 10891)가 이식유전자를 얻는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이식유전자는 PGC1α를 인코딩한다. PGC1α는 인간 PGC1α의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 인간 PGC1α의 아미노산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, PGC1α는 인간 PGC1α의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 인간 PGC1α의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α는 인간 PGC1α의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 인간 PGC1α의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, PGC1α는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 인간 PGC1α와 상이한 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 인간 PGC1α와 상이한 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 인간 PGC1α의 핵산 서열과 적어도 70% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 PGC1α의 핵산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 인간 PGC1α의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 PGC1α의 핵산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 인간 PGC1α의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 PGC1α의 핵산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 인간 PGC1α의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 PGC1α의 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, 이식유전자는 서열번호 1을 포함하는 PGC1α를 인코딩한다. PGC1α는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, PGC1α는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, PGC1α는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 서열번호 1과 상이한 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 서열번호 1과 상이한 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 70% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 1을 인코딩하는 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, PGC1α를 인코딩하는 이식유전자는 효율을 증가시키도록 코돈 최적화된다.
코돈 최적화 도구는 당업계에 알려져 있다.
"NRF2", "NRF2", "Nrf2", 및 "Nrf2"라 함은 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 재조합 DNA 또는 RNA, 또는 NRF2에서 생성되는 단백질을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, NRF2는 이용된 특정 맥락에서 적절하게 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭할 수 있음을 주목한다. 추가적으로, 특정 맥락에서 언급은 마우스 유전자 또는 단백질에 대한 것이고, 다른 경우 특정 맥락에서 적절하게 인간 유전자 또는 단백질에 대한 것일 것이다.
인간 NRF2 유전자(GenBank: 4780)가 이식유전자를 얻는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이식유전자는 NRF2를 인코딩한다. NRF2는 인간 NRF2의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 인간 NRF2의 아미노산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, NRF2는 인간 NRF2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 인간 NRF2의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2는 인간 NRF2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 인간 NRF2의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, NRF2는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 인간 NRF2와 상이한 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 인간 NRF2와 상이한 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 인간 NRF2의 핵산 서열과 적어도 70% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 NRF2의 핵산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 인간 NRF2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 NRF2의 핵산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 인간 NRF2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 NRF2의 핵산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 인간 NRF2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 인간 NRF2의 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, 이식유전자는 서열번호 2를 포함하는 NRF2를 인코딩한다. NRF2는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, NRF2는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, NRF2는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 서열번호 2와 상이한 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 통해, 예컨대, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개, 또는 그 초과의 보존적 아미노산 치환에 의해) 서열번호 2와 상이한 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 70% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다. 일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 가진다.
일부 실시형태에서, NRF2를 인코딩하는 이식유전자는 효율을 증가시키도록 코돈 최적화된다.
코돈 최적화 도구는 당업계에 알려져 있다.
HIF 및 KEAP1을 저해, 제거 또는 감소시키는 방법 및 조성물
본 개시내용의 조성물 및 방법은 다양한 병리의 발병을 지연, 상기 병리를 치료, 예방 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자 요법 방법은 질환, 구체적으로 신경퇴행성 질환, 보다 구체적으로 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 및 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 실명을 유발하는 신경퇴행성 질환을 치료, 예방 및/또는 치유할 수 있는 핵산 또는 단백질의 저해제를 함유하는 하나 이상의 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 알츠하이머병을 예방, 치료 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 신경퇴행성 질환을 예방, 치료 및/또는 치유하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 저해될 단백질은 HIF이다.
"HIF", "HIF", "Hif", "Hif"라 함은 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 재조합 DNA 또는 RNA, 또는 HIF 유전자 또는 HIF 상호작용자에서 생성되는 단백질을 포함하는 것을 의미한다. 더욱이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 HIF는 HIF1A, HIF2A, 및 HIF3A를 포함하는 것을 의미한다. HIF1A 및 HIF2A에 대한 인간 참조 서열은 각각 GenBank 3091 및 2034에서 찾을 수 있다. HIF3A에 대한 서열은 GenBank 수탁 번호 NM―022462, NM―152794 및 NM―152795에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, HIF는 이용된 특정 맥락에서 적절하게 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭할 수 있음을 주목한다. 추가적으로, 특정 맥락에서 언급은 마우스 유전자 또는 단백질에 대한 것이고, 다른 경우 특정 맥락에서 적절하게 인간 유전자 또는 단백질에 대한 것일 것이다.
임의의 HIF의 임의의 아이소형은 본 발명의 저해제에 의해 저해될 수 있다. 본 발명의 저해제는 HIF의 야생형 또는 돌연변이체 형태를 표적화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 저해될 단백질은 KEAP1이다.
"KEAP1", "KEAP1", "Keap1", "Keap1"이라 함은 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 재조합 DNA 또는 RNA, 또는 KEAP1 유전자 또는 KEAP1 상호작용자에서 생성되는 단백질을 포함하는 것을 의미한다. 인간 참조 서열은 각각 GenBank 9817에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, KEAP1은 이용된 특정 맥락에서 적절하게 유전자 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭할 수 있음을 주목한다. 추가적으로, 특정 맥락에서 언급은 마우스 유전자 또는 단백질에 대한 것이고, 다른 경우 특정 맥락에서 적절하게 인간 유전자 또는 단백질에 대한 것일 것이다.
임의의 KEAP1의 임의의 아이소형은 본 발명의 저해제에 의해 저해될 수 있다. 본 발명의 저해제는 KEAP1의 야생형 또는 돌연변이체 형태를 표적화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "저해제"는 HIF 및/또는 KEAP1의 양/수준 및/또는 활성을 하향조절하거나 그렇지 않으면 이를 감소 또는 억제할 수 있는 작용제를 지칭한다.
저해 메커니즘은 유전적 수준(예를 들어, 발현, 전사 또는 번역 등의 간섭 또는 저해) 또는 단백질 수준(예를 들어, 결합, 경쟁 등)에 있을 수 있다.
당업계에 인정된 기준, 예컨대, 효능, 독성, 안정성, 특이성, 및 반감기에 의해 안내된 매우 다양한 적합한 저해제가 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 HIF 또는 KEAP1의 저해제를 포함하는 조성물, 또는 조성물들, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 또는 렌티바이러스 벡터)의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료, 예방, 치유, 및/또는 상기 질환 또는 장애의 중증도 또는 정도를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV, 예컨대, rAAV2, AAV10, AAV2/10, AAV9 또는 AAV2/9이다.
AAV, 렌티바이러스 벡터, 또는 기타 적합한 벡터를 포함하여, 임의의 적합한 바이러스 넉다운 시스템이 HIF 또는 KEAP1 mRNA 수준을 감소시키는 데 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV 기반이다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 EIAV 기반이다.
추가적으로, 조성물, 예를 들어, 바이러스 벡터는 적절한 세포로의 핵산 전달을 표적화하는 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화될 세포는 망막 색소 상피 세포이고 사용된 프로모터는 VMD2, RPE65 및 TYR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적화될 세포는 망막 신경절 세포이고 사용된 프로모터는 hSNCG, 및 Ple345(NEFL)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가적으로, HIF 또는 KEAP1 차단 분자(핵산, 펩타이드, 또는 소분자)의 특이적으로 표적화된 전달은 표적화된 리포솜, 나노입자 또는 기타 적합한 수단에 의해 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서, HIF 또는 KEAP1의 저해제를 포함하는 조성물 또는 조성물들(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, AAV)은 신경퇴행성 질환 또는 장애가 진단되거나 의심되는 즉시 투여된다. 이들 조성물은 단독으로 또는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 치료를 위한 다른 작용제와 조합하여 투여될 수 있다.
엔도뉴클레아제
게놈 DNA의 변형 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 방법은 DNA 분해제를 사용하여 비상동성 말단 연결 DNA 복구 경로(NHEJ) 또는 상동성 지정 복구(HDR) 경로에 의해 DNA를 변형하는 DNA 소화제를 사용할 수 있다. 용어 "DNA 소화제"는 핵산의 뉴클레오타이드 서브유닛 사이의 결합(즉, 포스포다이에스터 결합)을 절단할 수 있는 작용제를 지칭한다.
일 실시형태에서, DNA 분해제는 뉴클레아제이다. 뉴클레아제는 핵산을 가수분해하는 효소이다. 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로 분류될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 분자의 내부에 있는 핵산 사이 결합의 가수분해를 촉매하는 효소 그룹 중 임의의 것이다. 엑소뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 사슬의 말단으로부터 단일 뉴클레오타이드의 가수분해를 촉매하는 효소 그룹 중 임의의 것이다. 뉴클레아제는 또한 DNA 또는 RNA를 특이적으로 분해하는지 여부를 기반으로 하여 분류될 수 있다. DNA의 가수분해를 특이적으로 촉매하는 뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제 또는 DN아제(DNase)로 지칭될 수 있는 반면, RNA의 가수분해를 특이적으로 촉매하는 뉴클레아제는 리보뉴클레아제 또는 RN아제(RNase)로 지칭될 수 있다. 일부 뉴클레아제는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 서열에 특이적이다. 일부 효소는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 특성을 둘 모두 가진다. 추가적으로, 일부 효소는 DNA와 RNA 서열을 둘 모두 분해시킬 수 있다.
HIF 또는 KEAP1은 HIF 또는 KEAP1을 인코딩하는 유전자를 표적화하는 서열-특이적 엔도뉴클레아제를 사용함으로써 저해될 수 있다.
엔도뉴클레아제의 비제한적인 예는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, ZF닉카제(ZFNickase), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas)를 포함한다. 메가뉴클레아제는 대형 DNA 서열(12개 염기쌍 이상)을 인식하고 절단하는 능력을 특징으로 하는 엔도뉴클레아제이다. LAGLIDADG 및 PI-Sce 패밀리의 엔도뉴클레아제를 포함하여 숙주 게놈에서 이중-가닥 파손을 생성하기 위해 임의의 적합한 메가뉴클레아제가 본 방법에서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 일 양태는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 제공한다. RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 또한 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 가이드 RNA에 의해 특정 핵산 서열(또는 표적 부위)로 지시된다. 가이드 RNA는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제뿐만 아니라 표적 부위와 상호작용하여, 일단 표적 부위로 향하면 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 파손을 표적 부위 핵산 서열에 도입할 수 있다. 가이드 RNA는 표적화 절단에 대해 특이성을 제공하므로, RNA-가이드 엔도뉴클레아제의 엔도뉴클레아제는 보편적이며 상이한 표적 핵산 서열을 절단하기 위해 상이한 가이드 RNA와 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 RNA 가이드 서열-특이적 뉴클레아제 시스템의 일 예는 CRISPR 시스템을 포함한다(Wiedenheft, et al. 2012 Nature 482:331-338; Jinek, et al. 2012 Science 337:816-821; Mali, et al. 2013 Science 339:823-826; Cong, et al. 2013. Science 339:819-823). CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문 반복 서열 집합) 시스템은 표적 DNA의 서열-특이적 절단 및 RNA-가이드 DNA-결합을 활용한다. 가이드 RNA/Cas 조합은 뉴클레아제에 대해 부위 특이성을 부여한다. 단일 가이드 RNA(sgRNA)는 게놈 PAM(protospacer adjacent motif; 프로토스페이서 인접 모티프) 부위(예를 들어, NGG) 및 불변 RNA 스캐폴드 영역의 상류에 있는 표적 게놈 DNA 서열에 상보적인 약 20개의 뉴클레오타이드를 함유한다. Cas(CRISPR-연관) 단백질은 sgRNA 및 sgRNA가 결합하는 표적 DNA에 결합하고 PAM 부위의 상류에 정의된 위치에서 이중-가닥 파손을 도입한다. Cas9는 HNH 및 RuvC 엔도뉴클레아제에 상동성인 2개의 독립적인 뉴클레아제 도메인을 보유하며, 2개 도메인 중 어느 하나를 돌연변이시킴으로써, Cas9 단백질은 단일-가닥 파손을 도입하는 닉카제로 전환될 수 있다(Cong, et al. 2013 Science 339:819-823). 본 개시내용의 방법 및 조성물은 Cas9의 단일- 또는 이중-가닥-유도 형태뿐만 아니라, 다른 박테리아의 Cas9-유사 시스템과 같은 다른 RNA-가이드 DNA 뉴클레아제와 함께 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 본 명세서에 기재된 본 방법 및 조성물의 서열-특이적 뉴클레아제는 조작되거나, 키메라이거나, 유기체로부터 분리될 수 있다. 뉴클레아제는 DNA, mRNA 및 단백질의 형태로 세포에 도입될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 sgRNA를 사용하여 HIF를 표적화 및/또는 제거 또는 억제하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, HIF를 표적화하고/하거나 HIF를 제거 또는 억제하는 sgRNA가 표 1 및 2에 제시되어 있다.
HIF 제거 또는 억제에 사용하기 위한 sgRNA
PAM 서열 표적 유전자
TGG GTTATGGTTCTCACAGATGA(서열번호 3) HIF1A 엑손 3~4
AGG TACTCATCCATGTGACCATG(서열번호 4) HIF1A 엑손 3~4
GGG AGATGGGAGCTCACACTGTG(서열번호 5) HIF2A 엑손 2
GGG CAGCATGTTCCTATATGCAG(서열번호 6) HIF2A 엑손 2
HIF를 표적화하는 추가적인 sgRNA
PAM 서열 특이성 점수 효율성 점수
AGG CTTGTACCTGAAAGCCTTGG(서열번호 7) 38.0998779 48.3847139
AGG AAGTGCACGGTCACCAACAG(서열번호 8) 41.1576188 64.0211178
TGG ATGTGGGATGGGTGCTGGAT(서열번호 9) 37.365837 30.548208
GGG GGGGGATGTCCATGTGGGAT(서열번호 10) 38.9185111 43.4462625
AGG GATGGCCTTGCCATAGGCTG(서열번호 11) 40.8643978 52.2189843
AGG ACTGACCAGATATGACTGTG(서열번호 12) 38.6271508 76.093746
TGG AAGGCCACTGCTTGGTGACC(서열번호 13) 37.8177689 46.5173893
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 sgRNA를 사용하여 KEAP1을 표적화 및/또는 제거 또는 억제하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, KEAP1을 표적화 및/또는 제거 또는 억제하는 sgRNA는 KEAP1 엑손 1을 표적화한다. 일부 실시형태에서, KEAP1을 표적화 및/또는 제거 또는 억제하는 sgRNA는 다음 서열 중 하나를 가진다:
AGCGTCCTGCCATTGGCTTG(서열번호 14);
Gcgggagcagggcatggagg(서열번호 15);
Ccgacagtcgctcagctacc(서열번호 16);
acagtcgctcagctacctgg(서열번호 17);
GAGGACACACTTCTCGCCCA(서열번호 18);
GACCAGGTAGTCCTTGCAGC(서열번호 19); 및
CCAGGTAGCTGAGCGACTGT(서열번호 20).
일 실시형태에서, DNA 분해제는 부위-특이적 뉴클레아제일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 Cas-패밀리 뉴클레아제일 수 있다. 보다 구체적인 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제일 수 있다.
일 실시형태에서, Cas 단백질은 천연 발생 Cas 단백질의 기능적 유도체일 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 단백질의 활성을 변경하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제는 촉매 불활성 Cas(예를 들어, Cas9)(또는 촉매 불활성/결함 Cas9 또는 dCas9)이다. 일 실시형태에서, dCas(예를 들어, dCas9)는 야생형 Cas(예를 들어, Cas9)의 엔도뉴클레아제 촉매 부위(RuvC 및 HNH) 중 하나 또는 둘 모두에서 점 돌연변이로 인해 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)이다. 예를 들어, dCas9는 촉매 활성 잔기(D10 및 H840)의 돌연변이를 함유하며 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 일부 경우에, dCas는 표적 DNA의 상보적 가닥과 비상보적 가닥을 둘 모두 절단하는 감소된 능력을 가진다. 일부 경우에, dCas9는 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9의 아미노산 서열의 D10A 및 H840A 돌연변이를 둘 모두 보유한다. 일부 실시형태에서 dCas9가 감소된 촉매 활성을 갖는 경우(예를 들어, Cas9 단백질이 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 및/또는 A987 돌연변이, 예를 들어, D10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A 및/또는 D986A를 갖는 경우), Cas 단백질이 대상 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA)의 Cas-결합 서열과 상호작용하는 능력을 보유하는 한, Cas 단백질은 여전히 대상 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA)의 DNA-표적화 서열에 의해 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로 유도되기 때문에, Cas 단백질은 여전히 부위-특이적 방식으로 표적 DNA에 결합할 수 있다.
본 방법 및 시스템은 CRISPR 결실(CRISPRd)을 사용할 수 있다. CRISPRd는 NHEJ에 대해 디폴팅하는 DNA 복구 전략의 경향을 활용하며 절단된 가닥을 복구하기 위해 공여체 주형을 필요로 하지 않는다. 대신, Cas는 먼저 돌연변이를 보유하는 유전자에서 DSB를 생성한 다음, NHEJ가 발생하고, 서열을 손상시키는 삽입 및/또는 결실(INDEL)을 도입하여, 유전자가 발현되거나 적절한 단백질 접힘이 일어나는 것을 방지한다. 이러한 전략은, 돌연변이된 우성 대립유전자를 넉아웃시키고 야생형 대립유전자를 원래 상태로 두는 경우가 표현형을 야생형으로 회복시키기에 충분할 수 있는 우성 조건에 특히 적용 가능할 수 있다.
잘 특성화된 CRISPR-Cas 시스템에 추가적으로, Cpf1(PreFran 하위유형의 Cas 단백질 1)이라고 하는 새로운 CRISPR 효소가 본 방법 및 시스템에서 사용될 수 있다(Zetsche et al. 2015. Cell). Cpf1은 tracrRNA가 결여되고, T-풍부 프로토스페이서-인접 모티프를 이용하는 단일 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. 저자는 Cpf1이 Cas9와는 구별되는 특징으로 강한 DNA 간섭을 매개한다는 것을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, CRISPR-Cpf1 시스템은 표적화 유전자 내의 원하는 영역을 절단하는 데 사용될 수 있다.
추가 실시형태에서, 뉴클레아제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. TALEN은 특정 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 TAL 이펙터 도메인 및 표적 부위에서 이중 가닥 파손을 촉매하는 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다(PCT 특허 공개 제WO2011072246호; Miller et al., 2011 Nat. Biotechnol. 29:143-148; Cermak et al., 2011 Nucleic Acid Res. 39:e82). 서열-특이적 엔도뉴클레아제는 사실상 모듈식일 수 있고, DNA 결합 특이성은 하나 이상의 모듈을 배열함으로써 얻어진다(Bibikova et al., 2001 Mol. Cell. Biol. 21:289-297; Boch et al., 2009 Science 326:1509-1512).
ZFN은 이펙터 엔도뉴클레아제 도메인(예를 들어, FokI 엔도뉴클레아제)에 융합된 2개 이상(예를 들어, 2 내지 8, 3 내지 6, 6 내지 8개, 또는 그 이상)의 서열-특이적 DNA 결합 도메인(예를 들어, 징크 핑거 도메인)을 함유할 수 있다(Porteus et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:967-973; Kim et al., 2007 Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,　93:1156-1160; 미국 특허 제6,824,978호; PCT 공개 제WO1995/09233호 및 제WO1994018313호).
일 실시형태에서, 뉴클레아제는 오메가, 징크 핑거, TALEN, 및 CRISPR/Cas로 이루어진 군의 또는 이러한 군으로부터 선택되는 부위-특이적 뉴클레아제이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 서열-특이적 엔도뉴클레아제는 조작되거나, 키메라이거나, 유기체로부터 분리될 수 있다. 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 돌연변이유발에 의해 특정 DNA 서열을 인식하도록 조작될 수 있다(Seligman et al. 2002 Nucleic Acids Research 30:3870-3879). 조합 조립은 상이한 효소 유래의 단백질 서브유닛이 회합하거나 융합될 수 있는 방법이다(Arnould et al. 2006 Journal of Molecular Biology 355:443-458). 특정 실시형태에서, 이들 2가지 접근법, 즉 돌연변이유발 및 조합 조립은 조합되어 원하는 DNA 인식 서열을 갖는 조작된 엔도뉴클레아제를 생성할 수 있다.
서열-특이적 뉴클레아제는 단백질의 형태로 또는 서열-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, 예컨대, mRNA 또는 cDNA의 형태로 세포에 도입될 수 있다. 핵산은 더 큰 작제물, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 부분으로서, 또는 예를 들어 전기천공, 지질 소포, 바이러스 수송체, 미세주입, 및 유전자총에 의해 직접 전달될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 이식유전자를 함유하는 작제물은 핵산을 세포에 도입하는 데 적절한 임의의 방법에 의해 전달될 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 가이드 RNA(들)는 이것이 게놈에서 미리 결정된 절단 부위에 대한 Cas-gRNA 복합체의 결합을 지시하도록 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 절단 부위는 프레임 이동 돌연변이의 영역을 함유하는 단편 또는 서열을 방출하도록 선택될 수 있다. 추가 실시형태에서, 절단 부위는 여분의 염색체를 함유하는 단편 또는 서열을 방출하도록 선택될 수 있다.
Cas 패밀리 효소(예컨대, Cas9)가 DNA에 성공적으로 결합하기 위해, 게놈 DNA의 표적 서열은 gRNA 서열에 상보적일 수 있으며 올바른 프로토스페이서 인접 모티프 또는 "PAM" 서열이 바로 뒤에 올 수 있다. "상보성"은 전통적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 다른 비-전통적인 유형에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 잔기의 백분율을 나타낸다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, DNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. Cas9 단백질은 PAM에서 먼 쪽의 불일치를 견딜 수 있다. PAM 서열은 Cas9가 유래된 박테리아의 종에 따라 다르다. 가장 널리 사용되는 CRISPR 시스템은 에스. 피오게네스로부터 유래되며 PAM 서열은 sgRNA 인식 서열의 바로 3' 말단에 위치하는 NGG이다. 예시적인 박테리아 종 유래의 CRISPR 시스템의 PAM 서열은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(NGG), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)(NNNNGATT), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)(NNAGAA) 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)(NAAAAC)를 포함한다.
본 개시내용에서 사용되는 gRNA(들)는 약 5 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 이상(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 그 이상)일 수 있다. 일 실시형태에서, gRNA(들)는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 약 15 내지 29, 15 내지 26, 15 내지 25개; 16 내지 30, 16 내지 29, 16 내지 26, 16 내지 25개; 또는 약 18 내지 30, 18 내지 29, 18 내지 26, 또는 18 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이)일 수 있다.
gRNA 설계를 용이하게 하기 위해, 다수의 컴퓨터를 이용한 도구가 개발되었다(문헌[Prykhozhij et al. 2015 PLoS ONE 10(3): Zhu et al. 2014 PLoS ONE 9(9); Xiao et al. 2014 Bioinformatics. Jan 21 (2014)); Heigwer et al. 2014 Nat Methods 11(2):122-123] 참조). 가이드 RNA 설계를 위한 방법 및 도구는 문헌[Zhu 2015 Frontiers in Biology 10(4):289-296]에 논의되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 추가적으로, gRNA(들)의 설계를 용이하게 하는 데 사용될 수 있는 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 도구가 있다(www.genscript.com/gRNA-design-tool 및 https://www.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system).
HIF 및 KEAP1에 혼성화하거나 이를 표적화하는 저해 핵산
특정 실시형태에서, 본 방법 및 조성물에서 사용되는 HIF 저해제는 HIF의 발현을 감소시키는 폴리뉴클레오타이드이다. 따라서, 방법은 HIF를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 특이적으로 표적화하는 유효량의 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 HIF의 발현을 감소시켜, 감소된 수준의 유전자 생성물(번역된 폴리펩타이드)을 산출한다.
폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 리보자임)의 핵산 표적은 HIF의 유전자 또는 전사체 내의 임의의 위치일 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 방법 및 조성물에서 사용되는 KEAP1 저해제는 KEAP1의 발현을 감소시키는 폴리뉴클레오타이드이다. 따라서, 방법은 KEAP1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 특이적으로 표적화하는 유효량의 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 KEAP1의 발현을 감소시켜, 감소된 수준의 유전자 생성물(번역된 폴리펩타이드)을 산출한다.
폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 리보자임)의 핵산 표적은 KEAP1의 유전자 또는 전사체 내의 임의의 위치일 수 있다.
저해 핵산은 RNA 간섭 또는 RNAi, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
"RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 전사후 유전자 침묵("PTGS")의 한 형태이며, 예를 들어, 이중-가닥 RNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. RNAi의 활성제는 긴 이중-가닥(역평행 이중나선) RNA로, 가닥 중 하나가 저해되어야 하는 RNA에 해당하거나 이에 상보적이다. 저해된 RNA는 표적 RNA이다. 긴 이중 가닥 RNA는 대략 20 내지 25개 뉴클레오타이드 쌍의 더 작은 이중나선으로 절단되며, 그 후 더 작은 RNA가 표적의 발현을 저해하는 메커니즘은 현재로서는 대체로 알려져 있지 않다. RNAi는 RNA 가닥이 약 19개 뉴클레오타이드 쌍의 미리 크기가 지정된 이중나선으로 제공되는 경우 인간 세포에서 작동할 수 있으며, RNAi는 각각의 가닥 말단에 작은 짝을 이루지 않은 3' 확장으로 특히 잘 작동한다(Elbashir et al. Nature 411:494-498 (2001)).
RNAi는 작은 간섭 RNA 또는 siRNA, 작은 헤어핀 RNA 또는 shRNA, 마이크로RNA 또는 miRNA, 이중-가닥 RNA(dsRNA) 등일 수 있다.
저해성 핵산은 짧은 RNA 분자, 예컨대, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 작은 시간적 RNA(stRNA), 및 마이크로-RNA(miRNA)일 수 있다. 짧은 간섭 RNA는 mRNA 분해 경로를 통해 유전자를 침묵시키는 반면, stRNA와 miRNA는 내인적으로 인코딩된 헤어핀-구조의 전구체로부터 가공되는 대략 21 또는 22개 nt의 RNA이며 번역 억제를 통해 유전자를 침묵시키는 기능을 한다. 예를 들어, 문헌[McManus et al., RNA, 8(6):842-50 (2002); Morris et al., Science, 305(5688):1289-92 (2004); He and Hannon, Nat Rev Genet. 5(7):522-31 (2004)]을 참조한다.
표적 단백질의 발현을 저해하기 위해 siRNA 서열을 예측하기 위한 소프트웨어 프로그램은 상업적으로 이용 가능하고 사용된다. 한 가지 프로그램인 Dharmacon, Inc.(미국 콜로라도주 라피엣 소재)의 siDESIGN은 임의의 핵산 서열에 대한 siRNA의 예측을 허용하며, 인터넷 상 dharmacon.com에서 이용 가능하다. siRNA 설계를 위한 프로그램은 또한 Genscript(인터넷 상 genscript.com/ssl-bin/app/rnai에서 이용 가능함)를 포함하여 다른 곳에서 이용 가능하며, 학계 및 비영리 연구원에 대해서는 월드와이드 웹 상 "jura.wi.mit.edu/pubint/http://iona.wi.mit.edu/siRNAext/"에서 확인되는 화이트헤드 바이오메디칼 연구소(Whitehead Institute for Biomedical Research)에서 이용 가능하다.
RNA 간섭(RNAi)은 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 직접 도입에 의해 유도되는 전사 후 유전자 침묵(PTGS)의 방법이며 다양한 유기체에서 특정 유전자의 발현을 넉아웃시키는 유용한 도구로 등장하였다. RNAi는 문헌[Fire et al., Nature 391:806-811 (1998)]에 기재되어 있다. PTGS의 다른 방법이 알려져 있으며, 예를 들어, 이식유전자 또는 바이러스의 도입을 포함한다. 일반적으로 PTGS에서는 침묵된 유전자의 전사체가 합성되지만 이는 빠르게 분해되기 때문에 축적되지 않는다. RNAi를 포함한 PTGS 방법은, 예를 들어, Ambion.com 월드 와이드 웹 사이트의 "/hottopics/" 디렉토리, "rnai" 파일에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, HIF의 수준은 RPE 세포와 같은 원하는 표적 세포에서 감소된다. 또한, 이와 같은 실시형태에서, 치료는 원하는 표적 세포에 표적화되거나, 특이적일 수 있다. HIF의 발현은 RPE 세포와 같은 원하는 표적 세포에서만 특이적으로 감소될 수 있고, 실질적으로 세포에서는 감소되지 않을 수 있다. 따라서, 이와 같은 실시형태에서, HIF의 수준은 치료 중 또는 치료 후에 비-표적 세포에서 실질적으로 동일하거나 유사하게 유지된다.
일부 실시형태에서, KEAP1의 수준은 RPE 세포 또는 RGC와 같은 원하는 표적 세포에서 감소된다. 또한, 이와 같은 실시형태에서, 치료는 원하는 표적 세포에 표적화되거나, 특이적일 수 있다. KEAP1의 발현은 RPE 세포 또는 RGC와 같은 원하는 표적 세포에서만 특이적으로 감소될 수 있고, 실질적으로 세포에서는 감소되지 않을 수 있다. 따라서, 이와 같은 실시형태에서, KEAP1의 수준은 치료 중 또는 치료 후에 비-표적 세포에서 실질적으로 동일하거나 유사하게 유지된다.
대안적으로, 바이러스 벡터, RNAi, shRNA 또는 기타 저해제, 또는 관련 화합물을 전신 방식보다는 국소 방식으로, 예를 들어, 종종 데포(depot) 또는 지속 방출 제형으로 원하는 표적 부위에 직접 주사함으로써 투여할 수 있다. 또한, 예를 들어, 특정 뉴런, 또는 유리체, 보다 구체적으로 간세포를 표적화하는, 표적화된 약물 전달 시스템으로, 예를 들어, 조직-특이적 항체로 코팅된 리포솜으로, 조성물을 투여할 수 있다. 리포솜은 원하는 조직을 표적화하고 이에 의해 선택적으로 흡수될 것이다. 또한 표적화된 약물 전달 시스템에는 바이러스 벡터, RNAi, shRNA 또는 기타 HIF 저해제의 나노입자 특이적 전달이 단독으로 또는 조합되어 포함된다.
저해성 핵산은 HIF 또는 KEAP1의 mRNA 내의 표적 영역에 상보적인 안티센스 핵산 서열일 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 영역에 결합하여 번역을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA일 수 있거나, 리보-데옥시뉴클레오타이드의 합성 유사체를 포함할 수 있다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HIF 또는 KEAP1의 발현을 저해한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 약 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개, 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 대상체에게 투여되거나 HIF 또는 KEAP1의 mRNA와 혼성화하거나 이에 결합하도록 동일계내(in situ)에서 생성될 수 있다.
리보자임
저해제는 HIF 또는 KEAP1 유전자의 발현을 저해하는 리보자임일 수 있다.
리보자임은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 안정성 및 촉매 활성을 증가시키기 위해 화학적으로 합성되고 구조적으로 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 리보자임은 당업계에 알려진 유전자-전달 메커니즘을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
항체
본 발명의 저해제는 HIF 또는 KEAP1에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 부분일 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 부분은, (a) 전체 면역글로불린 분자; (b) scFv; (c) Fab 단편; (d) F(ab')2; 및 (e) 이황화물 연결된 Fv일 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 모노클로날, 폴리클로날, 키메라 및 인간화된 것일 수 있다. 항체는 뮤린, 토끼 또는 인간/인간화 항체일 수 있다.
벡터
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 개시된 방법에 사용하기 위한 핵산은 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터에 함유된다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 개시된 방법에 사용하기 위한 조성물은 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는, 예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 합성 바이러스(예를 들어, 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스, 또는 위형 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 고분자, 나노 입자, 또는 소분자를 함유하는 바이러스)일 수 있다.
벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 본 발명에 의해 생산된 바이러스로 감염된 세포에서 이식유전자의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 통상적인 제어 요소를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 원 거리에서 작용하는 발현 제어 서열을 둘 모두 포함한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함하는 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 알려져 있고 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열(예를 들어, 코딩 서열) 및 조절인자 서열은 조절인자 서열의 영향 또는 제어 하에 핵산 서열의 발현 또는 전사를 위치시키는 방식으로 공유적으로 연결되어 있을 때 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다. 핵산 서열이 기능성 단백질로 번역되는 것이 바람직한 경우, 5' 조절인자 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 초래한다면 그리고 2개의 DNA 서열 사이의 연결 특성이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 초래하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역될 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는다면 2개의 DNA 서열은 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다. 따라서, 프로모터 영역이 생성된 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역될 수 있도록 해당 DNA 서열의 전사를 이행할 수 있는 경우에 프로모터 영역은 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 것이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 이식유전자, 예를 들어, PGC1α 또는 NRF2는 적절한 세포, 예를 들어, RGC 또는 RPE에서 이식유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 핵산 저해제 또는 인코딩 저해제, 예를 들어, HIF의 저해제는 적절한 세포, 예를 들어, RPE에서 핵산의 발현을 유도하기 위해 프로모터에 연결된다.
일부 실시형태에서, 핵산 저해제 또는 인코딩 저해제, 예를 들어, KEAP1의 저해제는 적절한 세포, 예를 들어, RGC 또는 RPE에서 핵산의 발현을 유도하기 위해 프로모터에 연결된다.
RGC를 표적화하기 위한 프로모터는, 예를 들어, hSNCG 또는 Ple(NEFL)일 수 있다.
RPE를 표적화하기 위한 프로모터는, 예를 들어, VMD2 또는 RPE65일 수 있다.
대안적으로, CMV, EF1, CAG, CB7, PGK 및 SFFV를 제한 없이 포함하는 유비쿼터스 프로모터가 사용될 수 있다.
각각 효율적인 프리-mRNA(pre-mRNA) 가공 및 유전자 발현 증가를 위해, 폴리아데닐화 서열 및 전사후 조절인자 요소와 같은 기타 조절인자 요소가 사용될 수 있다. 단백질을 인코딩하는 핵산의 경우, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 이식유전자 서열 다음에 삽입된다. 폴리아데닐화 서열의 예는 SV40, bGH폴리A 및 spA를 포함한다. 전사 후 조절인자 요소의 예는 WPRE, WPRE3 및 HPRE를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열 및 전사후 조절인자 요소의 최적화된 조합이 벡터에서 사용될 수 있다.
숙주 세포에서 유전자 발현에 필요한 조절인자 서열의 정확한 특성은 종, 조직 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 필요에 따라 각각 전사 및 번역의 개시와 관련된 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 인핸서 요소 등을 포함할 것이다. 특히, 이와 같은 5' 비전사 조절인자 서열은 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절인자 서열은 또한 원하는 대로 인핸서 서열 또는 상류 활성인자 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 선택적으로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절인자 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절인자 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적 전사 인자에 결합한다.
재조합 AAV 벡터
본 명세서에 기재된 "재조합 AAV(rAAV) 벡터"는 일반적으로 이식유전자(예를 들어, PGC1α 및 NRF2를 인코딩함)를 포함한다. 이식유전자는 5' 및 3' ITR에 측접하며, 표적 조직의 세포에서 이식유전자 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 하나 이상의 조절인자 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이와 같은 조절인자 요소는 본 명세서에 기재된 다른 것들 중에서 닭 베타 액틴 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스 인핸서와 같은 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 재조합 AAV 게놈은 일반적으로 (예를 들어, ITR이 유래된 것과 동일한 AAV 혈청형 또는 ITR이 유래된 것과 상이한 AAV 혈청형 유래의) 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된다. 그 다음 AAV 벡터는 선택된 표적 세포에 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 폴리펩타이드, 단백질, 기능성 RNA 분자(예를 들어, miRNA, miRNA 저해제) 또는 다른 관심 유전자 생성물(예를 들어, PGC1α)을 인코딩하는 벡터 서열에 이종성인 핵산 서열이다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 AAV 벡터의 구성요소가 하기에 기재되어 있다.
임의의 AAV 혈청형 또는 AAV 혈청형의 조합이 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 미토콘드리아 장애의 치료 및 치유를 위한 것이기 때문에, 적어도 근육, 또는 적어도 근육 및 중추 신경계를 표적화하는 AAV 혈청형이 일부 실시양태에서 사용될 수 있고, 상기 AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 광범위한 향성을 갖는 AAV9 혈청형이 사용된다.
일부 실시형태에서, AAV2 혈청형이 사용된다.
일부 실시형태에서, AAV8 혈청형이 사용된다.
AAV 벡터의 구성요소
본 명세서에 기재된 AAV 벡터는 시스-작용 5' 및 3' ITR을 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)] 참조). ITR 서열은 전형적으로 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 인코딩하는 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 어느 정도의 사소한 변형은 허용 가능하다. (예를 들어, [Sambrook et al, (1989) 및 Fisher et al., (1996)]과 같은 문서 참조). 이와 같은 분자의 예는 이식유전자를 함유하는 "시스-작용" 플라스미드이며, 여기서 선택된 이식유전자 서열 및 연관된 조절인자 요소는 5' 및 3' AAV ITR에 측접되어 있다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 포유동물 AAV 유형을 포함하는 임의의 알려진 AAV로부터 얻을 수 있다.
재조합 AAV 벡터에 대해 위에서 확인된 요소에 추가적으로, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 본 발명에 의해 생산된 바이러스로 감염된 세포에서 이식유전자의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 통상적인 제어 요소를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 원 거리에서 작용하는 발현 제어 서열을 둘 모두 포함한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함하는 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 알려져 있고 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열(예를 들어, 코딩 서열) 및 조절인자 서열은 조절인자 서열의 영향 또는 제어 하에 핵산 서열의 발현 또는 전사를 위치시키는 방식으로 공유적으로 연결되어 있을 때 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다. 핵산 서열이 기능성 단백질로 번역되는 것이 바람직한 경우, 5' 조절인자 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 초래한다면, 그리고 2개의 DNA 서열 사이의 연결 특성이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 초래하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역될 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는다면 2개의 DNA 서열이 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다. 따라서, 프로모터 영역이 생성된 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역될 수 있도록 해당 DNA 서열의 전사를 이행할 수 있는 경우에 프로모터 영역은 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 것이다. 유사하게, 2개 이상의 코딩 영역은 공통 프로모터로부터의 전사가 프레임 내에서 번역된 2개 이상의 단백질의 발현을 초래하는 방식으로 연결될 때 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 코딩 서열은 융합 단백질을 산출한다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 코딩 서열은 기능성 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA)를 산출한다.
단백질을 인코딩하는 핵산의 경우, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 이식유전자 서열 다음에 그리고 3' AAV ITR 서열 앞에 삽입된다. 본 발명에 유용한 rAAV 작제물은 또한 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 이식유전자 사이에 위치하는 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되며, SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다.
사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 유입점(IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체에서 하나 초과의 폴리펩타이드를 생산하는 데 사용된다. IRES 서열은 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬을 함유하는 단백질을 생산하는 데 사용될 것이다. 이들 및 기타 공통 벡터 요소의 선택은 통상적이고 많은 이와 같은 서열이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al] 및 인용된 참조문헌 참조). 이와 같은 모티프는, 예를 들어, 다수의 유전자 또는 이의 부분이 동일한 AAV 벡터로부터 발현되는 경우에 유용할 수 있다.
숙주 세포에서 유전자 발현에 필요한 조절인자 서열의 정확한 특성은 종, 조직 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 필요에 따라 각각 전사 및 번역의 개시와 관련된 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 인핸서 요소 등을 포함할 것이다. 특히, 이와 같은 5' 비전사 조절인자 서열은 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절인자 서열은 또한 원하는 대로 인핸서 서열 또는 상류 활성인자 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 선택적으로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다.
구성적 프로모터의 예는 닭 베타 액틴 프로모터, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 포함함), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 포함함), SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EFla 프로모터(Invitrogen)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고 외인성 공급 화합물, 온도와 같은 환경 요인, 또는 특정 생리학적 상태(예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태 또는 복제 세포에서만)의 존재에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 상업적 출처로부터 이용 가능하다. 외인성 공급 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로싸이오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(제WO 98/10088호); 엑디손 곤충 프로모터(No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen et al., Science 268:1766-1769 (1995)), RU486-유도성 시스템(Wang et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) 및 Wang et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이와 관련해서 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제 세포에서만 조절되는 것들이다.
또 다른 실시형태에서, 이식유전자에 대한 천연 프로모터, 또는 이의 단편이 사용될 것이다. 이식유전자의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 바람직한 경우 천연 프로모터가 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 이식유전자의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 대한 반응으로 조절되어야 할 때 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 컨센서스 서열이 또한 천연 발현을 모방하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절인자 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절인자 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적 전사 인자에 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위는 rAAV 벡터의 이식유전자에 통합되어, 이식유전자를 보유하는 대상체의 하나 이상의 조직에서 이식유전자의 발현을 저해한다. mRNA의 miRNA 표적 부위는 5' UTR, 3' UTR 또는 코딩 영역에 있을 수 있다. 전형적으로, 표적 부위는 mRNA의 3' UTR에 있다. 또한, 이식유전자는 다중 miRNA가 동일 부위 또는 다중 부위를 인식함으로써 mRNA를 조절하도록 설계될 수 있다. 다중 miRNA 결합 부위의 존재는 다중 RISC의 협력 작용을 초래하고 매우 효율적인 발현 저해를 제공할 수 있다. 표적 부위 서열은 총 5 내지 100, 10 내지 60개, 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 부위 서열은 표적 유전자 결합 부위 서열의 적어도 5개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
예를 들어, 간에서 이식유전자의 발현을 저해할 3'UTR 부위는 이식유전자에 통합될 수 있다. 이것은 투여된 바이러스의 대부분(대략 60 내지 90%)이 결국 간에서 발견되기 때문에 간에 독성이 있는 치료 단백질을 인코딩하는 이식유전자에 유익할 것이다. 따라서 간에서 치료 유전자 발현을 억제함으로써 간세포의 부담을 경감시킨다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 자가-보완 AAV가 되도록 변형될 것이다. 자가-보완 AAV는 이식유전자의 상보적 서열(즉, 이식유전자의 이중 복사체)을 운반한다. 자가 보완은 유전자가 세포에 들어간 후 유전자를 더 안정적으로 만든다.
AAV 벡터의 수득 방법
원하는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV를 수득하는 방법이 기재된 바 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,906,111호 참조). 다수의 상이한 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어, 문헌[Gao, et al., J. Virology 78(12):6381-6388 (2004년 6월); Gao, et al., Proc Natl Acad Sci USA 100(10):6081-6086 (2003년 5월 13일)]; 및 미국 특허 제7,906,111호; 미국 특허 제8,999,678호에 개시된 것이 기재되었다. 현재 기재된 작제물 및 방법의 원하는 패키징을 위해, AAV9 벡터 및 캡시드, 또는 AAV2 벡터 및 캡시드가 바람직하다. 그러나, rAAVrh.8 및 rAAVrh.10과 같은 다른 적합한 AAV, 또는 다른 유사한 벡터가 본 조성물에 사용하기 위해 적합화될 수 있음에 주목한다. 전형적으로 방법은 AAV 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열; 기능성 rep 유전자; AAV 역위 말단 반복부(ITR) 및 이식유전자로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 재조합 AAV 벡터의 AAV 캡시드 단백질로의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
AAV 캡시드에서 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포에서 배양될 구성요소는 트랜스로 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 필요한 구성요소(예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, 캡 서열, 및/또는 헬퍼 기능) 중 임의의 하나 이상은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 필요한 구성요소 중 하나 이상을 함유하도록 조작된 안정적인 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이와 같은 안정적인 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에 필요한 구성요소(들)를 함유할 것이다. 그러나, 필요한 구성요소(들)는 구성적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 또 다른 대안에서, 선택된 안정적인 숙주 세포는 구성적 프로모터의 제어 하에 선택된 구성요소(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 다른 선택된 구성요소(들)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포(구성적 프로모터의 제어 하에 E1 헬퍼 기능을 함유함)로부터 유래하지만 유도성 프로모터의 제어 하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정적인 숙주 세포가 생성될 수 있다.
rAAV를 생산하기 위한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전 요소(벡터)를 사용하여 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전 요소는 본 명세서에 기재된 방법을 포함하여 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fisher et al, J. Virology 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 제5,478,745호를 참조한다.
일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질감염 방법을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,001,650호에 상세히 기재된 바와 같음). 전형적으로, 재조합 AAV는 AAV 입자, AAV 헬퍼 기능 벡터, 및 보조 기능 벡터로 패키징될 재조합 AAV 벡터(이식유전자를 포함함)로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 생산된다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 생산적인 AAV 복제 및 캡슐화를 위해 트랜스로 기능하는 "AAV 헬퍼 기능" 서열(즉, rep 및 cap)을 인코딩한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출 가능한 야생형 AAV 비리온(즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하지 않고 효율적인 AAV 벡터 생산을 지원한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 벡터의 비제한적인 예는 미국 특허 제6,001,650호에 기재된 pHLP19 및 미국 특허 제6,156,303호에 기재된 pRep6cap6 벡터를 포함하며, 이들 둘 모두의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 보조 기능 벡터는 AAV가 복제에 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능(즉, "보조 기능")에 대한 뉴클레오타이드 서열을 인코딩한다. 보조 기능은 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, 캡 발현 생성물의 합성, 및 AAV 캡시드 조립체의 활성화와 관련된 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 AAV 복제에 필요한 기능을 포함한다. 바이러스-기반 보조 기능은 임의의 알려진 헬퍼 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(단순 포진 바이러스 유형-1 제외), 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.
예시적인 재조합 AAV 조성물
본 개시내용은 기능성 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 AAV를 함유하는 조성물을 제공한다. 이와 같은 단백질은 PGC1α 또는 NRF2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
PGC1α를 RPE로 전달하기 위한 예시적인 재조합 AAV가 도 3에 나타나 있다.
NRF2를 RPE로 전달하기 위한 예시적인 재조합 AAV가 도 1에 나타나 있다.
PGC1α를 RGC로 전달하기 위한 예시적인 재조합 AAV가 도 9에 나타나 있다.
NRF2를 RGC로 전달하기 위한 예시적인 재조합 AAV가 도 10에 나타나 있다.
약제학적 조성물, 투여 경로 및 투약
본 개시내용은 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 상염색체 우성 시신경 위축 (ADOA), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 발병을 지연, 상기 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 치유, 및/또는 대상체에서 이들 질환과 연관된 증상 중 적어도 하나를 완화하는 방법에서 사용하기 위한 벡터, 예를 들어, AAV 및 렌티바이러스를 제공한다.
일부 실시형태에서, 방법은 약제학적으로 허용 가능한 담체 중, 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드, 엔도뉴클레아제, gRNA, shRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 인코딩하는 rAAV 벡터를 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 발병을 지연, 상기 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 치유하기에 충분한 양으로 및 기간 동안 이와 같은 장애를 가지거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 투여하는 것을 포함한다.
rAAV는 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 따른 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리학적으로 양립 가능한 담체(예를 들어, 조성물)에 현탁된 rAAV가 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 rAAV를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 바이러스(예를 들어, 하나 이상의 상이한 이식유전자 또는 엔도뉴클레아제를 갖는 것을 인코딩하는 제2 rAAV)와 조합하여 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 PGC1α 및 hSNCG 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2/2 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 PGC1α 및 Ple(NEFL) 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2/2 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 NRF2 및 hSCNG 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2/2 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 NRF2 및 Ple(NEFL) 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2/2 벡터를 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 조성물은 PGC1α 및 VMD 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 조성물은 NRF2 및 VMD 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 조성물은 PGC1α 및 RPE65 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 조성물은 NRF2 및 RPE65 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능성 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 HIF의 저해제, 및 VMD2 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 KEAP1의 저해제, 및 VMD2 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 HIF의 저해제, 및 RPE65 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 KEAP1의 저해제, 및 RPE65 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 KEAP1의 저해제, 및 hSCNG 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2/2 벡터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 약제학적으로 허용 가능한 담체 중, 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드, 엔도뉴클레아제, gRNA, shRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 발병을 지연, 상기 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 치유하기에 충분한 양으로 및 기간 동안 이와 같은 장애를 가지거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 투여하는 것을 포함한다.
렌티바이러스 벡터는 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 따른 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리학적으로 양립 가능한 담체(예를 들어, 조성물)에 현탁된 렌티바이러스 벡터가 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 렌티바이러스 벡터를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 바이러스(예를 들어, 하나 이상의 상이한 이식유전자 또는 엔도뉴클레아제를 갖는 것을 인코딩하는 바이러스 벡터)와 조합하여 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 HIF의 저해제, 및 VMD2 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 HIF의 저해제, 및 RPE65 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 KEAP1의 저해제, 및 VMD2 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 KEAP1의 저해제, 및 RPE65 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 KEAP1의 저해제, 및 hSCNG 프로모터를 인코딩하는 저해제 또는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
적합한 담체는 rAAV 또는 렌티바이러스 벡터가 지시되는 표시의 관점에서 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 다양한 완충 용액(예를 들어, 인산염 완충 식염수)과 함께 제형화될 수 있는 식염수를 포함한다. 다른 예시적인 담체는 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참기름, 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 발명의 제한 사항이 아니다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 rAAV 또는 렌티바이러스 벡터 및 담체(들)에 추가적으로, 기타 통상적인 약제학적 성분, 예컨대, 보존제, 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 솔빈산칼륨, 솔빈산, 이산화황, 갈산프로필, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 조성물은 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 경우(예를 들어, 약 1013 GC/㎖ 이상), 조성물에서 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제형화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 계면활성제의 첨가, pH 조정, 및 염 농도 조정을 포함한다(예를 들어, 문헌[Wright, et al., Molecular Therapy 12:171-178 (2005)] 참조).
약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형화는, 다양한 치료 요법에서 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투약 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이들 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 활성 성분을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 변할 수 있고, 편리하게는 전체 제형 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 70% 또는 80% 또는 그 이상일 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 성분의 양은 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 적합한 투약량이 얻어질 수 있는 그러한 식이다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 저장 수명뿐만 아니라, 기타 약리학적 고려사항과 같은 인자는 이와 같은 약제학적 제형을 제조하는 분야의 당업자에 의해 고려될 것이며, 그 자체로 다양한 투약량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글라이콜, 및 이들의 혼합물, 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 많은 경우에, 형태는 쉽게 주사할 수 있을 정도로 멸균 상태이며 유동적이다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하며, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔빈산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에 등장화제, 예를 들어, 당분 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 조성물에서 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
주사용 수용액의 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요하다면 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투약량을 등장성 NaCl 용액 1㎖에 용해시키고 피하주사액 1000㎖에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다. 투약량의 약간의 변화는 숙주의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여 책임자는 어떤 경우에도 개별 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
멸균 주사 용액은 활성 rAAV 또는 렌티바이러스 벡터를 필요에 따라 본 명세서에 열거된 다양한 기타 성분과 함께 필요한 양으로 적절한 용매에 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말과 이의 사전 멸균-여과 용액으로부터 임의의 추가적인 원하는 성분을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다.
상기 기재된 전달 방법에 추가적으로, 다음 기법이 또한 조성물을 숙주에 전달하는 대안적 방법으로서 고려된다. 초음파영동법(즉, 초음파)은 순환계로 및 순환계를 통한 약물 투과의 속도 및 효능을 향상시키기 위한 장치로서 미국 특허 제5,656,016호에 사용 및 기재되었다. 고려되는 기타 약물 전달 대안은 골내 주사(미국 특허 제5,779,708호), 마이크로칩 장치(미국 특허 제5,797,898호), 안과용 제형, 경피 매트릭스(미국 특허 제5,770,219호 및 제5,783,208호) 및 피드백 제어 전달(미국 특허 제5,697,899호)이다.
rAAVS 및 렌티바이러스 벡터는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약학적으로 허용 가능한 투여 경로는 선택된 조직으로의 직접 전달(예를 들어, 뇌내 투여, 척추강내 투여), 정맥내, 경구, 흡입(비강내 및 기관내 전달을 포함함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 및 기타 비경구 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 원하는 경우, 투여 경로를 조합할 수 있다. 투여 요법은 치료 조성물의 혈청 또는 조직 대사회전율, 증상의 수준 및 생물학적 기질에서 표적 세포의 접근성을 포함하여 여러 요인에 따라 달라진다. 바람직하게는, 투여 요법은 원하지 않는 부작용을 최소화하면서 동시에 표적 질환 상태의 개선에 영향을 미치기에 충분한 치료 조성물을 전달한다. 따라서, 전달되는 생물학적 제제의 양은 특정 치료 조성물 및 치료되는 병태의 중증도에 부분적으로 의존한다.
본 발명은 rAAV 비리온을 포함하는 안정적인 약제학적 조성물을 제공한다. 조성물은 동결/해동 주기를 거치고 유리를 포함한 다양한 재료로 만들어진 용기에 저장될 때에도 계속 안정적이고 활성적이다.
적절한 용량은 인자 중에서도 치료되는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류 또는 기타 포유동물), 치료될 대상체의 연령 및 일반적인 상태, 치료되는 상태의 중증도, rAAV 비리온의 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 적절한 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
원하는 효과 또는 "치료 효과"를 달성하는 데 필요한 rAAV 비리온의 용량, 예를 들어, 체중 킬로그램당 벡터 게놈(vg/㎏)의 용량 단위는, rAAV 투여 경로; 치료 효과를 달성하는 데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준; 치료 중인 특정 질환 또는 장애; 및 유전자 또는 RNA 생성물의 안정성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 요인을 기반으로 하여 달라질 것이다. 당업자는 상기 언급한 요인뿐만 아니라, 당업계에 잘 알려진 다른 요인을 기반으로 하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위해 rAAV 비리온 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다. rAAV의 유효량은 일반적으로 대상체당 약 109 내지 1016개의 게놈 복제물을 함유하는 용액의 약 10㎕ 내지 약 100㎖의 범위이다. 다른 양의 용액이 사용될 수 있다. 사용되는 부피는 전형적으로 무엇보다도 대상체의 크기, rAAV의 용량, 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에, 대상체당 약 1010 내지 1012개 rAAV 게놈 복제물의 투약량이 적절하다. 특정 실시형태에서, 대상체당 1012개의 rAAV 게놈 복제물은 원하는 조직을 표적화하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 대상체당 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개 게놈 복제물의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV는 ㎏당 1010, 1011, 1012, 1013 또는 1014개 게놈 복제물의 용량으로 투여된다.
따라서, "치료적 유효량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다. 예를 들어, 생체내 주사, 즉 대상체에 대한 직접 주사의 경우, 치료적 유효 용량은 약 105 내지 1016개의 rAAV 비리온, 더 바람직하게는 108 내지 1014개의 rAAV 비리온 정도일 것이다. 시험관내 형질도입의 경우, 세포에 전달될 rAAV 비리온의 유효량은 105 내지 1013개, 바람직하게는 108 내지 1013개의 rAAV 비리온 정도일 것이다. 조성물이 대상체에게 다시 전달될 형질도입된 세포를 포함하는 경우, 약제학적 조성물 중 형질도입된 세포의 양은 약 104 내지 1010개의 세포, 더 바람직하게는 105 내지 108개의 세포일 것이다. 물론, 용량은 형질도입의 효율성, 프로모터 강도, 메시지의 안정성 및 이에 의해 인코딩된 단백질 등에 따라 다르다. 유효 투약량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시험을 통해 당업자에 의해 용이하게 확립될 수 있다.
투약 치료는 궁극적으로 위에 명시된 양을 전달하기 위한 단일 투약 스케줄 또는 다중 투약 스케줄일 수 있다. 더욱이, 대상체는 적절한 만큼 많은 용량을 투여받을 수 있다. 따라서, 대상체는 단일 용량으로, 예를 들어, 105 내지 1016개 rAAV 비리온, 또는 집합적으로, 예를 들어, 105 내지 1016개 rAAV 비리온의 전달을 초래하는 2, 4, 5, 6회 또는 그 초과의 용량을 제공받을 수 있다. 당업자는 투여하기에 적절한 투약 수를 용이하게 결정할 수 있다.
따라서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 관심 단백질을 생산하기에 충분한 유전 물질, 즉, 문제의 질환 상태의 증상을 감소 또는 개선시키기에 충분한 양 또는 원하는 이익을 부여하기에 충분한 양을 포함할 것이다. 따라서, rAAV 비리온은 하나 이상의 용량으로 제공될 때 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 대상 조성물에 존재할 것이다. rAAV 비리온은 동결건조된 제제로 제공될 수 있고 즉시 또는 향후 사용을 위해 비리온-안정화 조성물에 희석될 수 있다. 대안적으로, rAAV 비리온은 생산 직후에 제공되고 향후 사용을 위해 저장될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 함유할 것이다. 이와 같은 부형제는 조성물을 받는 개체에게 유해한 항체의 생산을 자체적으로 유도하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제학적 작용제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어, 무기산염, 예컨대, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산의 염, 예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등이 상기 부형제에 포함된다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이와 같은 비히클에 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제에 대한 철저한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]에서 이용 가능하다.
치료제 및 진단제의 제형은, 예를 들어, 동결건조된 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액의 형태로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 투여되는 치료 조성물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수(LD50/ED50)이다. 특정 양태에서, 높은 치료 지수를 나타내는 치료 조성물이 바람직하다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투약량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 화합물의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투약량은 이용된 투약 형태 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양할 수 있다.
적절한 용량의 결정은, 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에 알려져 있거나 의심되는 매개변수 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 약간 적은 양으로 시작하고, 이후에 임의의 부정적인 부작용에 비해 원하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가된다. 중요한 진단 척도는, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 사이토카인의 수준을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물학적 제제는 치료 대상 동물과 동일한 종에서 유래하여, 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화하는 것이 바람직하다.
투여 요법은 치료 조성물의 혈청 또는 조직 회전율, 증상의 수준, 및 생물학적 기질에서 표적 세포의 접근성을 포함하는 여러 요인에 따라 달라진다. 바람직하게는, 투여 요법은 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서, 동시에 표적 질환 상태의 개선에 영향을 미치기에 충분한 치료 조성물을 전달한다. 따라서, 전달되는 생물학적 제제의 양은 특정 치료 조성물 및 치료되는 병태의 중증도에 부분적으로 의존한다.
특정 실시형태에서, 투여 경로는 망막하 주사, 유리체내 주사 또는 맥락막상 주사이다.
용량은 대상체의 효과를 최적화하기 위해 조정될 수 있다. 추가적으로, 대상체는 투약량을 증가시키기 전에 대상체의 상태의 개선을 위해 모니터링될 수 있다.
키트
본 개시내용은 또한 키트 형태로 본 명세서에 개시된 조합물의 구성요소를 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용의 키트는 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 구성요소를 포함한다. 키트는 본 명세서에 논의된 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 약제학적 조성물에서 순수한 조성물로서 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나의 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 본 명세서에 기재된 이식유전자를 함유하는 AAV 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 하나의 용기(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 본 명세서에 기재된 저해제를 함유하는 AAV 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
키트가 대상체에 대한 망막하 주사 또는 유리체내 주사를 위한 하나 이상의 약제학적 조성물을 포함하는 경우, 키트는 이와 같은 투여를 수행하기 위한 장치를 포함할 수 있다.
키트는 키트 내의 약제학적 조성물 및 투약 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 정보는 동봉된 약제학적 조성물 및 투약 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는 데 있어서 환자 및 의사를 돕는다. 예를 들어, 조합에 관한 다음 정보가 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 매개변수, 적응증 및 사용법, 금기, 경고, 예방 조치, 역반응, 과량투약, 적절한 투약량 및 투여, 공급 방법, 적절한 저장 조건, 참조, 제조업체/유통업체 정보 및 특허 정보.
실시예
본 발명은 본 발명의 바람직한 실시형태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시된 다음의 비제한적인 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 다음의 실시예는 결코 본 발명의 넓은 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 - 표적화된 AAV 벡터는 NRF2를 전달하고 추상체 및 간상체 생존을 촉진시키는 RPE에서 항산화제 반응을 향상시킨다
재료 및 방법
RP 마우스 모델
잘 확립된 전임상 RP 마우스 모델인 Pde6b H620Q 마우스(Pde6b H620Q 동형접합체)는 포스포다이에스테라제 6 촉매 도메인에 미스센스 돌연변이를 보유하고, 정상적인 광수용체 분화를 거치며, 퇴행이 시작되기 전에 망막 기능을 유지한다. Pde6b H620Q 마우스가 출생 후 (P)30일째에 간상체 반응을 상실하고 P60 후에 추상체 반응을 상실함을 보여주기 위해 ERG를 사용하였다. 망막 절편의 조직학은 P28에서 4열의 핵과 P49에서 2열의 핵을 보여주었다. Pde6b rd1 마우스와 비교하여, Pde6b H620Q 마우스는 출생 후 빠르면 2 내지 3주째에 시작하여 3개월까지 광수용체의 거의 완전한 손실과 함께 상대적으로 지연된 광수용체 변성을 나타낸다(Davis, et al. 2008).
AAV 벡터 구성
RPE에서 항산화 반응을 향상시키기 위해, -253 내지 +38 bp(대략 300 bp)의 VMD2 상류 영역을 마우스 Nrf2(1.8 kb)를 전달하기 위한 RPE-특이적 프로모터(Esumi, et al. 2004)로 사용한다(도 1). 뮤린 Nrf2는 Nrf2를 핵으로 왕복 수송할 수 있는 2개의 핵 위치 신호(nuclear localization signal; NLS) 모티프를 함유하는 것으로 보고되었다(Theodore, et al. 2008). 검증을 위한 대조군으로 AAV8-VMD2-eGFP와 본 발명자들의 가설을 테스트하기 위한 AAV8-VMD2-NRF2-eGFP의 2가지 벡터를 생성하였다(도 1). 음성 대조군으로서, RPE를 AAV8-VMD2-eGFP로 형질도입한다.
망막하 주사
이전에 기재된 바와 같이 절차를 수행한다(Davis, et al. 2008; Wang, et al. 2013). 이 절차에서, 신생아 마우스의 한쪽 눈의 눈꺼풀을 미세 수술 가위를 사용하여 인공적으로 개방한다. 대략 1㎕의 바이러스 용액((1012 GC/㎖)을 출생 후 5일째(P5)에 오른쪽 눈에 망막하 주사한다. 왼쪽 눈은 음성 대조군의 역할을 한다. 이러한 절차는 이전에 30% 내지 50%의 망막 세포 형질도입을 초래하였다.
대조군 벡터를 먼저 주입하고 RPE에 제한된 GFP의 발현을 확인한다. 그 다음 AAV8-VMD2-NRF2-eGFP를 마우스에 주사한다.
마우스를 다음과 같이 평가한다:
면역블롯. 단백질을 RPE에서 추출하고 NQO1(SC-16464; Santa Cruz), HO-1(SC-10789; Santa Cruz) 및 로딩 대조군으로서 마우스 베타 액틴 항체(ab8224; Abcam)에 대한 모노클로날 항체로 탐침하였다.
RNA 추출 및 실시간 qPCR. RNA를 RPE에서 추출하고 역전사시킨다. 실시간 qPCR을 Nrf2 표적 유전자인 NQO1, HO-1, GCLC, GCLM, 및 글루타티온 합성효소에 대한 프라이머를 사용하여 수행한다.
ERG. ERG를 기재된 바와 같이 수행한다(Davis, et al. 2008; Wang, et al. 2010). 간단히 말해서, Espion ERG Diagnosys 장비(Diagnosys LLL, 미국 메사추세츠주 로웰 소재)를 사용하여 기록을 한다. 반응은 각각의 시도에 대한 평균이다. 약광 암소시 b파를 측정하여 간상체-특이적 기능을 평가하고, 암소시 최대 b파를 측정하여 내측 망막 기능을 평가하며, 암소시 최대 a파를 측정하여 광수용체-특이적 기능을 평가하고, 명소시 b파를 측정하여 추상체-특이적 기능을 평가한다. ERG를 Pde6b H620Q 마우스에 대해 P30 및 P60에서 수행한다.
광수용체의 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영(SD-OCT) 실시간-이미징 정량화. 실시간 이미징, 및 간상체 및 추상체 외부 단편 길이의 측정을 통해 광수용체 생존을 정량화한다. 간단히 말해서, 콜롬비아 코어 마우스 시설에 위치한 Spectralis 장비(Heidelberg, 독일 소재)를 이용한 SD-OCT 이미징의 판독값을 사용하여 ONL 두께를 결정한다.
면역조직화학 및 형광 염색. Pde6b H620Q 마우스에 대해 P60에서 조직을 수집한다. 망막 동결절편 및 신경망막 평면 마운트에 대한 면역표지 및 형광 염색을 다음과 같은 변형을 가하여 이전에 기재된 바와 같이 수행한다(Wang, et al. 2013; Tosi, et al. 2010). 동물당 하나의 눈은 동결절편화를 위해 처리하고; 나머지 눈은 평면 마운트를 위해 신경망막 안으로 절개한다. 동결절편화를 위한 아이컵(eyecup)은 밤새 차가운 4% 파라폼알데하이드 PBS 용액에 고정시킨 반면, 신경망막은 평평하게 장착하여 1시간 동안 고정시킨다. 다음의 1차 및 2차 항체 및 희석액을 사용한다: 토끼 항-arr3(추상체 아레스틴 1:1,000; ab15282; Millipore); 지질 과산화를 위한 마우스 항-아크롤레인(1:250; ab48501; Abcam); 미토콘드리아 마커에 대한 토끼 α-VDAC(1:1000; D73D12; 세포 신호 전달); 염소 항-토끼(1:1,000; A-11034; Invitrogen). 핵을 DAPI로 대비염색한다.
간상체 생존의 정량화. 망막의 로돕신 mRNA를 간상체 수의 또 다른 척도로 측정한다. 사이클로필린의 발현은 다수의 상이한 조건 하에서 안정적이며, 실시간 RT-PCR에 의한 로돕신의 정규화에 대한 표준으로 사용될 것이다.
추상체 생존의 정량화. 기재된 바와 같이, 아이컵 둘 모두의 동결절편 및 신경망막 평면 마운트를 사용하여 추상체 수의 정량화를 수행한다. 10개의 연속 절편을 항-Arr3 항체와 함께 인큐베이션한다. 핵을 DAPI로 대비염색한다. 본 발명자들의 공초점 및 특수 현미경 코어 시설(Confocal and Specialized Microscopy Core Facility)에서 Nikon Ti Eclipse 도립 공초점 현미경으로 모든 이미지를 획득한다. 반자동 정량 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 아레스틴+ 세포를 계수한다.
실험적 비교. Pde6b H620Q 마우스의 암소시 최대 b파 진폭과 명소시 b파 진폭(2개 시점), 및 오른쪽 눈(AAV8-VMD2-NRF2-eGFP를 주사함)과 왼쪽 눈(대조군 AAV를 주사함) 사이의 ONL 두께(1개 시점)를 비교한다. 이러한 설계에서는 대응표본 t-검정(paired t test)의 사용이 가능하다. 상이한 바이러스 그룹 간의 좌우 눈 차이를 평가할 것이다.
결과
AAV8-VMD-eGFP 형질도입은 RPE에서 GFP의 특이적 발현을 가능하게 한다. 따라서, RP의 마우스 모델에서 AAV8-VMD2-NRF2-eGFP 벡터의 주입을 수행한다.
ERG 분석 및 조직학에서 명백한 바와 같이, RPE에서 NRF2의 과발현은 간상체 및 추상체 변성을 늦춘다. 추가적으로, RP 마우스 모델에서 AAV8-VMD2-eGFP가 주사된 눈 또는 주사되지 않은 눈에 비해 AAV8-VMD2-NRF2-eGFP가 주사된 눈에서 수집된 RPE의 ARE-관련 유전자의 상향조절도 또한 보인다.
실시예 2 - 추상체 및 간상체 생존을 촉진시킨 RPE에서 표적화된 AAV 벡터로 전달된 PGC1α 및 향상된 항산화 반응
재료 및 방법
RP 마우스 모델, 산화적 인산화 마커, ERG, 면역조직화학 및 항-arr 항체를 이용한 형광 염색을 포함하는 망막하 주사 및 평가, 및 실험적 비교에 있어서 실시예 1과 동일한 재료 및 방법을 사용하였다.
망막색소 변성증의 마우스 모델에서의 최근 연구는 망막 PGC1α 과발현의 해로운 영향을 보고하였다. 이 생체내 마우스 연구에 의한 잠재적인 약점은 상기 연구가 비특이적 CMV 프로모터를 사용하여 RPE 및 광수용체에서 비특이적 과발현을 야기하였다는 점이다. 그러나, 본 발명자들의 생체내 마우스 연구에서, RPE 프로모터에 의해 구동되는 PGC1α 과발현은 RP 마우스 모델에서 광수용체를 유의하게 보호하는 것으로 나타났다(도 2). 이는 CMV 프로모터를 이용한 PGC1α 과발현의 유도로 RPE와 광수용체에서 대사를 상이하게 재프로그래밍할 수 있으며, 이는 광수용체에 예상치 못한 세포 손상을 유발할 수 있음을 나타낸다. 따라서 세포-특이적 표적 요법에 대한 필요성이 존재한다.
논의된 바와 같이, RPE에서 항산화 반응을 향상시키기 위해, RPE-특이적 프로모터(Esumi, et al. 2004)로서 -253 내지 +38 bp(대략 300 bp)의 VMD2 상류 영역을 마우스 PGC1α를 전달하는 데 사용하였다(도 3). 검증을 위한 대조군으로 AAV8::RPE65-mcherry(도 3B)와 본 발명자들의 가설을 테스트하기 위한 AAV8::RPE65- PGC1α- mcherry(도 3A)의 2가지 벡터를 생성하였다.
대조군의 경우, 마우스의 왼쪽 눈에 주사하지 않았다.
결과
ERG의 결과는 생후 1개월째에 구제를 나타내었다(도 4).
암소시 a파와 b파, 및 명소시 b파의 연속 강도를 비교하였다. 흰색 상자는 주입된 오른쪽 눈을 나타내고, 빈 상자는 주사되지 않은 대조군 왼쪽 눈을 나타낸다. 암소시 반응의 일부 강도와 명소시 반응의 모든 강도에서 주사된 눈과 주사되지 않은 눈 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있었다.
P28, P47, P55, P72뿐만 아니라, P28의 대조군 AAV에서 유사한 결과가 보였다.
비교를 위해, 최대 반응(간상체와 추상체가 결합됨) 및 추상체 반응을 비교하였다(도 5). 4개의 상이한 시점에서 최대 반응의 a파 및 b파와 추상체 반응의 b파, 및 P28에서의 대조군 AAV 바이러스를 도 8의 첫 번째 레인에서 비교하였다. P28과 P47에서는 주사된 눈과 주사되지 않은 눈 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있지만, P55와 P72에서는 그렇지 않았다. P55 및 P72에서의 ERG 결과는 이전 시점에서 ERG로 테스트한 마우스에서 얻은 것이었다. 이들 마우스 중 일부는 첫 번째 ERG 테스트 후 각막 혼탁이 발생하여 ERG 진폭에 영향을 미쳤다.
도 6은 기능적 및 해부학적 구제가 있는 1마리 마우스의 결과를 나타낸다. 생후 1개월째의 암소시 ERG는 대조군인 주사되지 않은 왼쪽 눈의 진폭(도 6B)과 비교하여 주사된 오른쪽 눈에서 더 큰 진폭을 보였으며(도 6A), 이는 보존된 광수용체 기능 B를 나타낸다.
도 6C 및 6D는 생후 2개월째에 이들 두 눈의 H&E 염색을 나타낸다. 주사된 눈에는 다른 쪽 눈과 비교하여 더 많은 외과립층이 존재한다. 이러한 차이는 망막 주름, 박리 또는 안구 기형에 의해 유발된 것이 아니며 시신경 유두 근처에서 관찰될 수 있었다. 따라서, P64의 조직학은 대조군 눈과 비교하여 주사된 눈에서 광수용체 변성의 감속을 나타내었으며, 이는 AAV8 - PGC1α 주사된 눈에서 더 높은 수준의 광수용체 생존을 나타낸다.
도 7은 생후 3개월째에 마우스에서 주사된 눈(도 7A) 및 주사되지 않은 눈(도 7B)에서 홀 마운트 망막을 나타낸다. 주사된 눈에서 홀 마운트 망막이 주사되지 않은 눈과 비교하여 더 적은 색소 이동이 있음이 매우 명확하다. 색소 이동은 RP 환자에서 보이는 바와 같이 심각한 광수용체 변성의 징후이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 주사되지 않은 눈과 비교하여 주사된 눈에서 더 많은 추상체 특이적 표지 Arr3 세포가 존재한다.
이러한 결과는 RPE에 대한 PGC1α의 표적화된 투여가 RP의 마우스 모델에서 광수용체 변성을 감소시켰음을 나타낸다.
실시예 3 - NRF2의 조건부 과발현 및 KEAP의 조건부 넉아웃에 의한 RPE에서의 항산화 반응 향상은 추상체 및 간상체 생존을 촉진시킨다
재료 및 방법
RPE-특이적 유도성 Cre 재조합효소 계통(Rpe65 CreERT2 마우스)
Cre가 내인성 무경험 Rpe65 유전자좌에 의해 제어되고 마우스 일생에 걸쳐 안정적으로 발현되는 유도성 RPE-특이적 Cre 재조합효소 계통(Rpe65 CreERT2 마우스)을 생성하였다. 다른 RPE-Cre 구동인자와 달리, Rpe65 CreERT2 마우스는 Cre-에스트로겐 수용체(CreER-T2) 융합 작제물을 보유한다. 구체적으로, Cre 재조합효소(Cre)는 활성을 위해 타목시펜을 필요로 하는 돌연변이 에스트로겐 리간드-결합 도메인(ERT2)에 융합되며; T2 변이체는 에스트로겐보다 더 높은 친화도로 타목시펜에 결합하고, Cre 활성은 대조군 암컷에서 검출 가능하지 않다. 타목시펜 유도 시, CreERT2는 핵으로 전위하며, 핵에서 loxP 부위와 상호작용한 다음, 세포질로 돌아가서, 의도하지 않은 돌연변이유발 가능성을 최소화한다. 이 마우스를 Ai75D 리포터 마우스(JAX #25106)와 교배하면 타목시펜 유도 후 RPE 세포 핵에서 tdTomato 발현이 초래된다. 유도성 Rpe65 CreERT2 마우스를 사용하여 RPE에서 각각 NRF2를 과발현시키거나 KEAP1을 넉아웃시킴으로써 항산화 반응을 향상시키는 것이 RP에서 광수용체 생존을 촉진시키는지 여부를 결정할 수 있다.
NRF2의 조건부 과발현에 의한 RPE에서 항산화 반응 향상
RPE에서 항산화 반응을 향상시키기 위해, Rpe65 CreERT2 마우스와 교배할 때 RPE에서 마우스 NRF2를 조건부로 과발현하는 R26 LSL-Nrf2/+ 마우스가 생성되었다. 이러한 교배는 대조군 R26 +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 및 실험용 R26 LSL-Nrf2/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. R26 LSL-Nrf2/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 계통도 또한 Pde6b　 H620Q 마우스와 교배된다.
KEAP1의 조건부 넉아웃에 의한 RPE에서의 항산화 반응 향상
NRF2 안정성의 주요 제어는 KEAP1에 의해 발휘된다. 따라서 RPE에서 항산화 반응을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 Rpe65 CreERT2 마우스와 교배할 때 KEAP1을 조건부로 넉아웃시키고 후속적으로 RPE에서 NRF2 활성화를 유발하는 C57BL/6-Keap1 tm1.1 Mrl 마우스(Taconic Biosciences, 모델 8799; 이하 Keap1 f/f)를 이용할 것이다. 이러한 교배는 대조군 Keap1 +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 및 실험용 Keap1 f/f ;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. Keap1 f/f ;Rpe65 CreERT2/+ 계통도 또한 Pde6b　 H620Q 마우스와 교배된다.
타목시펜-유도 R26 LSL-Nrf2/+ ;Rpe65 CreERT2/+ , Keap1 f/f ;Rpe65 CreERT2/+ 및 Rpe65 CreERT2/+ 마우스의 아이컵에서 RPE를 37℃, 5% CO2에서 45분 동안 트립신에서 배양한 후 분리하고(Fernandez, et al. 2016), 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역블롯 및 qPCR을 수행한다.
추가적으로, 실시예 1에 기재된 바와 같이 광수용체 기능 및 생존을 평가하기 위해 다음 분석을 수행한다: ERG; 광수용체의 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영(SD-OCT) 실시간-이미징 정량화; 면역조직화학 및 형광 염색; 간상체 생존의 정량화; 및 추상체 생존의 정량화.
암소시 최대 b파, 명소시 b파(2개 시점, P30 및 P60), 및 ONL 두께(1개 시점, P60)의 진폭을 Pde6b H620Q 마우스 RP 모델의 실험용 R26 LSL-Nrf2/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 및 대조군 R26 +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형; 실험용 Keap1 f/f ;Rpe65 CreERT2/+ 및 대조군 Keap1 +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형 사이에서 비교한다.
글루타메이트는 글루타티온 합성에 필요하기 때문에 대사 산물로서 중요하다. 산화 경로에서 글루타메이트의 분리는 세포질 NADH/NAD+에 의존한다. 추가적인 실험, 예컨대, 과산화물 검출을 위한 다이하이드로에티듐 염색(Zhang, et al. 2013), GSH/GSSG(#26406, Cayman Chemical)(Williams, et al. 2017) 및 NAD+/NADH 정량화 비색 키트(K337, Biovision)(Williams, et al. 2017)를 산화환원 상태를 정의하기 위해 수행한다.
결과
타목시펜-유도 R26 LSL-Nrf2/+ ;Rpe65 CreERT2/+ , Keap1 f/f ;Rpe65 CreERT2/+ 마우스에서 분리된 RPE의 ARE-관련 유전자(NQO1, HO-1, GCLC, GCLM, 및 글루타티온 합성효소)가 상향조절된다. RPE에서 NRF2의 과발현에 의한 항산화 반응의 향상은 RP의 마우스 모델에서 광수용체 생존과 기능을 촉진시킨다. RPE에서 KEAP1의 조건부 넉아웃에 의한 항산화 반응의 향상도 또한 RP의 마우스 모델에서 광수용체 생존과 기능을 촉진시킨다. NRF2의 조건부 과발현에 의한 신경보호 효과는, NRF2가 빠르게 전환되고 유비퀴틴 프로테아좀 시스템에 의한 지속적인 분해로 인해 낮은 수준에서 발견되기 때문에, 조건부 넉아웃 KEAP1과 유사하거나 약간 더 적다(McMahon, et al. 2004).
실시예 4 - RPE의 OXPHOS/이화작용이 Pgc1α의 조건부 과발현 및 조건부 넉아웃에 의해 추상체 및 간상체 생존을 촉진시키는지 여부의 결정
재료 및 방법
RPE-특이적 유도성 Cre 재조합효소 계통( Rpe65 CreERT2 마우스)
실시예 3에서 사용된 동일한 마우스를 사용하여 RPE에서 각각 Pgc1α를 과발현시키거나 넉아웃시킴으로써 OXPHOS를 향상시키거나 억제하는 것이 RP에서 광수용체 생존을 촉진시키는지 여부를 결정한다.
RPE에서 OXPHOS 향상
RPE에서 OXPHOS를 향상시키기 위해, Rpe65 CreERT2 마우스와 교배할 때 RPE에서 마우스 Pgc1a를 조건부로 과발현하는 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ 마우스가 생성된다. 이러한 교배는 대조군 Rosa26 +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 및 실험용 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. Rosa26 LSL-Pgc1α/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 계통도 또한 Pde6b H620Q 및 Rho D190N/+ RP 마우스와 교배된다. Rho D190N/+ 마우스는 Rosa26 유전자와 마찬가지로 6번 염색체에 위치한 Rho 유전자에 넉인 돌연변이가 있지만, 이 전략은 여전히 실행 가능하다.
RPE에서 OXPHOS 억제
이 실험을 위해 PGC1α 넉아웃 및 조건부 Pgc1α 넉아웃 마우스(Ppargc1a tm2.1Brsp /J, JAX #9666; 또는 Pgc1α f/f )의 사용에 의해 OXPHOS를 억제시킨다. Pgc1α f/f 마우스를 Rpe65 CreERT2 마우스와 2세대에 걸쳐 교배하여 대조군 Pgc1α +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 및 실험용 Pgc1α f/f;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. 망막 변성 동안 RPE에서 OXPHOS를 억제시키는 효과를 조사하기 위해, Pgc1α f/f;Rpe65 CreERT2/+ 계통을 Rho D190N/+ RP 모델과 교배하고 모든 마우스의 유전자형을 분석하여 rd8 및 rd1 돌연변이의 부재를 확인한다.
타목시펜-유도 R26 LSL-Nrf2/+ ;Rpe65 CreERT2/+ , Keap1 f/f ;Rpe65 CreERT2/+ 및 Rpe65 CreERT2/+ 마우스의 안구 컵에서 RPE를 37℃, 5% CO2에서 45분 동안 트립신에서 배양한 후 분리하고(Fernandez, et al. 2016), 다음과 같이 면역블롯, qPCR, 글루코스 흡수 분석 및 U-13C 글루코스 플럭스를 수행한다:
면역블롯. RPE에서 단백질을 추출하고 Total OXPHOS Rodent WB 항체 칵테일 키트(ab110413; Abcam) 및 로딩 대조군으로서 토끼 항-알파 튜불린 항체(ab4074; Abcam)를 사용하여 OXPHOS 복합체(Complex I NDUFB8, Complex II SDHB, Complex III UQCRC2, Complex IV MTCO1, 및 Complex V ATP5A)의 서브유닛에 대한 5가지의 모노클로날 항체로 탐침한다.
RNA 추출 및 실시간 qPCR. RNA를 RPE에서 추출하고 역전사시킨다. PPARA(지방산 이용에 필요한 유전자를 조절함); ESRRA, NRF1, 및 GABPA(이들 모두 OXPHOS 유전자를 조절함); 및 NRE2L2 및 FOXO3(항산화 유전자를 조절함)에 대한 프라이머를 사용하여 실시간 qPCR을 수행한다. OXPHOS 서브유닛의 경우, F1-FO ATP아제(ATPase)의 구성요소인 ATP5O에 대한 프라이머; 복합체 IV의 구성요소인 COX4I1 및 COX5B; 및 복합체 I의 구성요소인 NDUFB5를 사용한다.
글루코스 흡수 분석. 망막을 차가운 DMEM에서 절개하고 형광성 글루코스 유사체인 2-데옥시-D-글루코스(2-NBDG, 1mM)의 존재 하에 D-글루코스가 있거나 없는 DMEM에서 배양한 다음, 얼음처럼 차가운 PBS 및 DAPI로 4회 세척하고, 2개의 미리 냉각된 커버 슬라이드 사이에 평평하게 장착한 다음 즉시 이미지화한다.
U- 13 C 글루코스 플럭스. 실험용 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 에서 배양된 RPE를 U-13C 글루코스와 함께 인큐베이션하여 해당작용과 시트르산 회로를 통해 플럭스를 모니터링하거나, U-13C 글루타민과 함께 인큐베이션하여 산화 플럭스를 구체적으로 모니터링한다. RPE를 수확하고 균질화한 다음 클로로폼/메탄올에서 추출하고 이전에 기재된 바와 같이 GC/MS에 의해 분석한다(Zhang, et al. 2016).
추가적으로, 실시예 1에 기재된 바와 같이 광수용체 기능 및 생존을 평가하기 위해 다음 분석을 수행한다: ERG; 광수용체의 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영(SD-OCT) 실시간-이미징 정량화.
OXPHOS 향상의 경우, Pde6b H620Q 및 Rho D190N/+ 마우스 RP 모델의 실험용 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 및 대조군 Rosa26 +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형 사이에서 암소시 최대 b파, 명소시 b파(2개 시점), 및 ONL 두께(1개 시점)의 진폭의 실험 비교를 수행한다.
OXPHOS 억제의 경우, Rho D190N/+ 마우스 RP 모델을 사용하여 실험용 Pgc1α f/f ;Rpe65 CreERT2/+ 및 대조군 Pgc1α +/+ ;Rpe65 CreERT2/+ 유전자형 사이에서 암소시 최대 b파(2개 시점), 명소시 b파(2개 시점), 및 ONL 두께(1개 시점)의 진폭의 실험 비교를 수행한다.
결과
RPE에서 PGC1α 과발현 후 OXPHOS의 향상은 RP 마우스 모델에서 광수용체 생존과 기능이 촉진시킨다. RPE에서 PGC1α의 억제는 광수용체 변성을 가속화시키며, 이는 가설을 추가로 뒷받침한다.
실시예 5 - 표적화된 AAV 벡터는 PGC1α 또는 NRF2를 전달하고 RGC에서 미토콘드리아 기능을 회복시킨다
재료 및 방법
녹내장 마우스 모델
DBA/2J 마우스(색소 녹내장 마우스 모델, 이하 D2 마우스라고 지칭함)는 근친교배 품종이며 D2는 녹내장-관련 Gpnmb R150X 　및　Tyrp1 isa 돌연변이에 대해 동형접합성이다. D2 마우스는 인간 색소 녹내장의 표현형을 모사하고 5 내지 6개월에 홍채 색소 분산, 6 내지 8개월에 안압 상승, 및 10 내지 12개월에 RGC 사멸을 나타내기 때문에, 녹내장 연구에 널리 사용된다(John, et al. 1998). DBA/2J 마우스의 PERG는 망막 신경 섬유층 두께의 손실에 앞서 질환 초기에 손상된다(Saleh, et al. 2007; Howell, et al. 2007).
RGC-특이적 프로모터를 사용하여 RGC에서 PGC1α 및 NRF2를 과발현하는 바이러스 벡터
AAV2/2가 망막의 임의의 다른 세포 유형보다 더 효율적으로 RGC를 형질도입하는 것으로 나타났지만, 프로모터 선택은 표적 요법 내에서 세포-특이적 및 이식유전자의 발현에 중요하다. 최근 연구는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 주요 NAD(+)-생산 효소를 인코딩하는 유전자인 Opa1 및 Nmnat1을 전달함으로써 ADOA 및 색소 녹내장의 모델에서 효율적인 유전자 요법을 입증하였다. CMV 프로모터와 하이브리드 CMV 초기 인핸서/닭 β-액틴 프로모터(CAG)가 성체 쥐의 눈에서 RGC의 약 85%의 형질도입을 촉진시키고, 마우스에서도 유사한 발현이 보이는 것으로 나타났지만(Nickells, et al. 2017; Martin, et al. 2003; Harvey, et al. 2002), CMV 프로모터에 의해 구동되는 AAV 유리체내 주사를 이용한 예비 데이터는 다른 유형의 망막 세포도 또한 형질도입되었음을 나타내었다(결과는 나타내지 않음). 따라서 표적외 이식유전자 발현이 다른 망막 세포에 역효과를 미치지 않음을 보장하도록 주의 깊게 고려해야 한다.
망막의 PGC1α 기능은 논란의 여지가 있으며 생체내에서 거의 연구되지 않았다(Xiong, et al. 2015). 망막색소 변성증의 마우스 모델에서의 최근 연구는 망막 PGC1α 과발현의 해로운 영향을 보고하였다(Xiong, et al. 2015). 이러한 생체내 마우스 연구를 이용한 잠재적인 약점은 CMV 프로모터를 사용하여 비특이적 과발현을 야기하였다는 점이다.
추가적으로, NRF2의 핵 축적이 아폽토시스를 감소시키고 종양 발생 및 약물 내성을 촉진시킬 수 있기 때문에, CMV 프로모터의 사용은 예상치 못한 합병증을 야기할 수 있는 비생리학적 방식으로 다른 세포에서 구성적 NRF2 활성화를 강제할 가능성이 있다.
본 명세서에 나타낸 가설은 RGC에서만 미토콘드리아 생합성을 향상시키는 것이 녹내장 및 ADOA와 같은 RGC 사멸이 있는 질환에 대한 잠재적 치료법이 될 수 있다는 것이다. 접근법은 상기한 2가지 마우스 모델, 즉 RGC 사멸 모델에서 미토콘드리아 생합성을 표적화하기 위해 RGC-특이적 프로모터를 이용한 전임상 유전자 요법을 테스트하는 것이다. RGC에서 미토콘드리아 생물학에서의 역할을 결정하기 위해 PGC1α 및 NRF2 발현을 유도하는 RGC-특이적 프로모터.
RGC에서 미토콘드리아 생합성을 향상시키기 위해, 마우스 Ppargc1a(Pgc1α)(2.4 kb)를 전달하기 위한 RGC-특이적 프로모터(Chaffiol, et al. 2017)로서 -785 내지 +163 bp(대략 948 bp)의 hSncg(인간 감마-시누클레인) 상류 영역을 사용한다(도 9A). hSNCG 프로모터(948 bp)는 Thy1 프로모터(6,500 bp)와 비교하여 더 작고 더 강력하며 더 특이적인 RGC 프로모터이므로, PGC1α가 이 AAV2/2-hSNCG-PGC1α-eGFP 벡터에서 함께 패키징될 수 있게 한다. 검증을 위한 대조군으로 AAV2/2-hSNCG-eGFP와 가설을 테스트하기 위한 AAV2/2-hSNCG-PGC1α-eGFP의 2가지 벡터를 생성하였다(도 9B). 음성 대조군으로서, RGC가 AAV2/2- hSNCG-eGFP로 형질도입될 것이다.
RGC에서 항산화 반응을 향상시키기 위해, 마우스 Nrf2(1.8kb)를 전달하는 hSncg 프로모터를 사용한다(도 14). 뮤린 Nrf2는 Nrf2를 핵으로 왕복 수송할 수 있는 2개의 핵 위치 신호 모티프를 함유하는 것으로 보고되었다(Theodore, et al. 2008). 검증을 위한 대조군으로 AAV2/2-hSNCG-eGFP와 가설을 테스트하기 위한 AAV2/2-hSNCG-NRF2-eGFP의 2가지 벡터를 생성하였다(도 10). 음성 대조군으로서, RGCE를 AAV2/2-hSNCG-eGFP로 형질도입한다.
이전에 기재된 바와 같이, 망막하 주사에서 변형된 절차를 사용하여 마우스로의 벡터의 유리체내 주사를 수행한다(Wang, et al. 2010; Davis, et al. 2008). 4주령 마우스를 이전에 기재된 바와 같이 필요할 때 케타민/자일라진을 복강내 주사하여 마취하였다. 대략 1.5㎕의 바이러스 용액(2×107 형질도입 단위[TU]/㎖)을 공막을 통해 유리체 내로, 45° 각도로 천공 구멍을 통해 뭉툭한 말단 유리 피펫을 삽입하여 각막윤부에서 오른쪽 눈에 유리체내로 주사하였다. 왼쪽 눈은 음성 대조군의 역할을 하였다. 이러한 프로토콜을 사용하는 유리체내 주사는 이전에 CMV 프로모터를 사용하여 확산 망막 형질도입을 초래하였다.
대조군 벡터 AAV2/2-hSNCG-eGFP 및 AAV2/2-hSNCG-eGFP를 먼저 주입하고 RGC에 제한된 GFP의 발현을 관찰한다. AAV2/2-hSNCG-PGC1α-eGFP 및 AAV2/2-hSNCG-NRF2-eGFP를 마우스에 주사한다.
마우스를 다음과 같이 평가한다:
패턴 망막전도(PERG). PERG를 기재된 바와 같이 수행한다(Chou, et al. 2018; Porciatti 2013). 간단히 말해서, Celeris Diagnosys 장비(Diagnosys LLC, 미국 메사추세츠주 로웰 소재)를 사용하여 기록을 한다. 각각의 세션이 시작될 때, 처리된 마우스를 테스트하기 전에 음성 대조군 마우스(성체 C57BL/6J)를 테스트한다. 반응은 각각의 시도에 대한 평균이다. P1에서 N2까지의 P1N2 진폭을 측정하여 RGC-특이적 기능을 평가한다. PERG를 D2 마우스에 대해 P180 내지 P360에서 수행한다.
명소시 음성 반응(PhNR). PERG를 기재된 바와 같이 평가한다(Chrysostomou and Crowston 2013). 간단히 말해서, 0.34 내지 2.22 log cd·s/㎡의 6가지 상이한 자극 강도에 대한 명소시 반응이 40-cd·s/㎡ 간상체-포화 녹색 배경에 표시된다. 각각의 강도에서, 3,000㎳의 자극 간 간격으로 25번의 플래시가 평균화된다. RGC-특이적 기능을 평가하기 위해, 기준선에서 PhNR 저점(BT)까지의 PhNR 진폭을 측정한다. PERG를 D2 마우스에 대해 P180 내지 P360에서 수행한다.
면역조직화학 및 형광 염색. D2 마우스에 대해 P180 및 P360에서 조직을 수집한다. 망막 동결절편 및 신경망막 평면 마운트에 대한 면역표지 및 형광 염색을 다음과 같은 변형을 가하여 이전에 기재된 바와 같이 수행할 것이다(Wang, et al. 2010; Tosi, et al. 2010): 동물당 하나의 눈은 동결절편화를 위해 처리하고; 나머지 눈은 평면 마운트를 위해 신경망막 안으로 절개한다. 동결절편화를 위한 아이컵은 밤새 차가운 4% 파라폼알데하이드 PBS 용액에 고정시킨 반면, 신경망막은 평평하게 장착하여 1시간 동안 고정시킨다. 다음의 1차 및 2차 항체 및 희석액을 사용한다: 염소 항-Brn3(1:200; SC-6026; Santa Cruz), 토끼 항-RBPMS(1:500; NBP2-20112; Novus Biologicals); 당나귀 항-염소(1:1,000; A-21432; Invitrogen), 당나귀 항-토끼(1:1,000; A-31572; Invitrogen). 핵을 DAPI로 대비염색한다.
RGC 생존의 정량화. 기재된 바와 같이, 아이컵 둘 모두의 동결절편 및 신경망막 평면 마운트를 사용하여 RGC 수를 정량화한다(Wang, et al. 2010; Tosi, et al. 2010). 10개의 연속 절편을 항-Brn3 항체와 함께 인큐베이션한다. 핵을 DAPI로 대비염색한다. 본 발명자들의 공초점 및 특수 현미경 코어 시설에 위치한 Nikon Ti Eclipse 도립 공초점 현미경으로 모든 이미지를 획득한다. 반자동 정량 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 Brn3+ 세포를 계수한다.
광수용체의 비침습적 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영(SD-OCT) 실시간-이미징 정량화. 실시간 이미징을 통해 RGC 생존을 정량화하고, 콜롬비아 코어 마우스 시설에 위치한 Spectralis 장비(Heidelberg, 독일 소재)를 이용한 SD-OCT 이미징의 판독값을 사용하여 신경절 세포 복합체의 두께를 측정한다.
미토콘드리아 DNA. RGC에서 mtDNA 및 핵 DNA의 상대적인 복제 수는 기재된 바와 같이 정량적 PCR에 의해 결정된다(Malik, et al. 2016). 기재된 바와 같이 미토콘드리아 16S rRNA 유전자 및 핵 β2 마이크로글로불린 유전자에 대한 특이적 프라이머를 설계하였다. 표준 희석 시리즈를 사용하여 각각의 프라이머 쌍에 대한 지수 증폭의 효율성을 확인하였다.
미토콘드리아 형태 및 축삭 수초화를 평가하기 위한 전자 현미경. 기재된 바와 같이 마우스의 시신경을 처리한다(Wang, et al. 2013). 시신경을 가로질러 초박막 절편을 취하고, 우라닐 아세테이트와 시트르산납으로 염색한 다음, AMT 디지털 카메라가 장착된 Hitachi 7100 TEM(Hitachi, 일본 도쿄 소재)을 사용하여 이미지를 촬영한다.
실험적 비교. D2 마우스에서의 오른쪽 눈(AAV2/2-hSNCG-PGC1α-eGFP 또는 AAV2/2-hSNCG-NRF2-eGFP를 주사함)과 왼쪽 눈(주사하지 않음) 사이의 2개 시점(P180 및 P360)에서의 PhNR(BT) 및 PERG(P1N2)의 진폭, 및 1개 시점(P360)에서의 RGC 수를 비교한다. 과학적 엄밀성을 개선시키기 위해, 대조군으로 추가적인 그룹의 오른쪽 눈에 AAV2/2-hSNCG-eGFP를 주사한다. 이러한 설계는 대응표본 t-검정의 사용을 가능하게 할 것이다.
결과
AAV2/2-hSNCG-eGFP 형질도입은 RGC에서 GFP의 특이적 발현을 가능하게 한다. 따라서, RGC 사멸의 마우스 모델에서 AAV2/2-hSNCG-PGC1α-eGFP 또는 AAV2/2-hSNCG-NRF2-eGFP 벡터의 주입을 수행한다.
hSNCG 또는 Ple(NEFL)는 RGC-특이적 프로모터이므로, PGC1α 또는 NRF2 발현은 RGC로 제한되고 Pgc1α 또는 Nrf2 유전자의 해당 RGC-특이적 발현은 RGC 사멸을 지연시킨다.
MitoBiogenesis WB 항체 칵테일 키트를 사용하여 RGC 및 면역블롯팅에서 RNA와 단백질을 추출하고 실시간 qPCR을 수행하여 미토콘드리아 생합성-관련 유전자 및 마이토파지(mitophagy)-관련 유전자의 상대적 발현을 계산한다. 대조군에 비해 AAV 벡터-주사 눈(AAV2/2-hSNCG-PGC1α-eGFP)에서 수집된 RGC에서 미토콘드리아 생합성 유전자 및 단백질의 상향조절이 보인다.
AAV2/2-hSNCG-NRF2-eGFP 벡터 주사 눈과 관련하여, Nrf2 유전자의 RGC-특이적 발현은 RGC 사멸을 지연시킨다. FACS를 사용하여 eGFP+ RGC를 분류한 다음 ARE-관련 유전자를 분석하고 RGC의 산화환원 상태를 정의한다. 2가지 상이한 RGC 사멸 마우스 모델에서 AAV2/2-hSNCG-eGFP 주사 눈에 비해 AAV2/2-hSNCG-NRF2-eGFP 주사 눈에서 수집된 RGC에서 ARE-관련 유전자의 상향조절이 보인다.
실시예 6 - RGC에서 미토콘드리아 생합성이 Pgc1α의 조건부 과발현 및 조건부 넉아웃에 의해 RGC 생존을 촉진시키는지 여부의 결정
재료 및 방법
조건부 과발현 Rosa26 LSL-PGC1α/+ 마우스 계통
PGC1α는 미토콘드리아 생합성의 마스터 조절인자이며 해마 뉴런에서 미토콘드리아 생합성을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 생체내 미토콘드리아 생합성을 향상시키기 위해, 마우스 Pgc1α를 조건부로 과발현하는 넉인 마우스 계통을 생성하였다. 이 계통을 형성하기 위해, CAG-loxP-STOP-loxP-Pgc1α-IRES-GFP-폴리A 카세트를 Rosa26 유전자-표적 플라스미드(CTV 플라스미드, Klaus Rajewsky 박사의 선물)에 삽입하였다. PGC1α 단백질의 발현은 lox-전사 정지-lox 카세트(LSL)가 CRE에 의해 절제될 때까지 억제된다. 마우스 계통을 KV1(129S6/SvEvTac×C57BL/6J) 배아 줄기(ES) 세포에서 상동 재조합에 의해 생성한 다음, 표적화된 ES 세포를 C57BL/6J 배반포에 주사하였다. 키메라를 생식선 전달을 위해 사육하였다. 마우스를 적어도 6세대 동안 C57BL/6J 배경으로 역교배하였다. AAV8-Cre로 형질감염된 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ 마우스 유래의 섬유아세포는 GFP-양성이고 PGC1α를 과발현하였는데, 이는 Cre 재조합효소 계통과 교배한 후 STOP 카세트가 제거될 때 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ 마우스가 PGC1α를 과발현한다는 것을 나타낸다. 대다수의 RGC에서 PGC1α 과발현을 표적화하기 위해, Tg(Thy1-cre/ER T2 ,-EYFP)HGfng/PyngJ 마우스(JAX #12708; 이하 Thy1 CreERT2 마우스)를 사용하여 RGC에 대해 Cre 재조합효소를 표적화하였다.
PGC1α의 조건부 넉아웃에 의한 RGC의 미토콘드리아 생합성 억제
본 발명자들은 이 실험을 위해 조건부 Pgc1α 넉아웃 마우스(Ppargc1a tm2.1Brsp /J, JAX #9666; 또는 Pgc1α f/f )를 이용할 것이다. Pgc1α f/f 마우스를 Thy1 CreERT2/+ 마우스와 2세대에 걸쳐 교배하여 대조군 Pgc1α +/+ ;Thy1 CreERT2/+ 및 실험용 Pgc1α f/f;Thy1 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. 변성 동안 RGC에서 미토콘드리아 생합성을 억제시키는 효과를 조사하기 위해, Pgc1α f/f;Thy1 CreERT2/+ 계통을 D2 마우스와 교배한다. 모든 마우스의 유전자형을 분석하여, 광수용체 기능에 영행을 미칠 수 있는 rd8 및 rd1 돌연변이의 부재를 확인할 것이다(Mattapallil, et al. 2012; Errjgers, et al. 2007).
PGC1α의 조건부 과발현에 의한 RGC에서의 미토콘드리아 생합성 향상
Thy1 CreERT2 마우스와 교배할 때 RGC에서 마우스 Pgc1a를 조건부로 과발현하는 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ 마우스가 생성되었다. 이러한 교배는 대조군 Rosa26 +/+ ;Thy1 CreERT2/+ 및 실험용 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ ;Thy1 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. D2 마우스는 D2와 Rosa26 LSL-Pgc1α/+ 를 교배하는 6번 염색체(여기에 Rosa26 유전자의 넉인 PGC1a가 또한 위치함)에 동형접합 Gpnmb R150X 를 보유하고 있기 때문에; 마우스는 실행 가능하지 않다.
기재된 바와 같이(Williams, et al. 2017; Chitalapud, et al. 2017; Chintalapudi, et al. 2016), 마우스 망막을 효소 분해에 의해 해리한 후, Falcon 70 ㎛ 나일론 스트레이너를 사용하여 여과한 다음, 다음 분석을 수행한다:
RGC의 형광-활성화 세포 분류(FACS). 항-마우스 CD16/32 항체(클론 93; BioLegend)를 사용하여 Fcγ 수용체 II 및 III을 발현하는 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 최소화한다. 표면 항원을 검출하기 위해, 세포를 다음의 1차 항체 칵테일과 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다: 항-CD90.2 Alexa Fluor-700(Thy1.2, 클론 30-H12, BioLegend); 항-CD48 PE-Cy7(클론 HM48-1, BioLegend, 단핵구 및 미세아교세포를 표지함); 항-CD15 PE(클론 MC-480, BioLegend, 무축삭 세포를 표지함); 및 항-CD57(클론 VC1.1, Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재; 또는 무축삭 세포를 표지함). 항-CD57 항체가 접합되어 있지 않으므로, Brilliant Violet 421-태깅 2차 항체(클론 Poly4053, BioLegend)를 사용하여 분류할 수 있다. 이 칵테일은 FACS 동안 다른 망막 세포 유형의 정확한 제거를 가능하게 하였다. 추가 처리가 있을 때까지 Thy1.2+CD48negCD15negCD57neg 세포를 분류하고 -80℃에서 동결시킬 것이다.
면역 블롯. 살아있는 분류된 Thy1.2+CD48negCD15negCD57neg 세포에서 단백질을 추출하고 MitoBiogenesis WB 항체 칵테일 키트(ab123545; Abcam)를 사용하여 OXPHOS 효소 복합체, 복합체 II SDH-A(핵 DNA-인코딩) 및 복합체 IV(COX-1, mtDNA-인코딩)의 서브유닛에 대한 2개의 모노클로날 항체로 탐침한다. 마우스 항-베타-액틴 항체(ab8224; Abcam)를 로딩 대조군으로 사용한다.
RNA 추출 및 실시간 qPCR. RNA를 Thy1.2+CD48negCD15negCD57neg 세포에서 추출하고 역전사시킨다. 실시간 qPCR을 미토콘드리아 생합성-관련 유전자인 PolgA 및 Tfam과 마이토파지-관련 유전자인 Pink1, Park2, Bnip3l, 및 Lc3b에 대한 프라이머를 사용하여 수행한다.
PERG, PhNR, 면역조직화학 및 형광 염색, RGC 생존의 정량화, SD-OCT, 미토콘드리아 DNA의 테스트, 및 전자 현미경을 포함하는 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행된 동일한 테스트를 수행하여 RGC 기능 및 생존을 평가한다.
2가지 상이한 전략(미토콘드리아 생합성의 억제 및 향상)을 사용하여 D2 마우스에서 실험용 및 대조군 유전자형 사이의 PhNR(BT) 및 PERG(P1N2)(2개 시점, P180 및 P360) 진폭 및 RGC 수(1개 시점, P360) 를 비교한다.
결과
RGC에서 PGC1α 과발현에 의한 미토콘드리아 생합성 향상은 RGC 사멸의 마우스 모델에서 RGC 생존 및 기능을 향상시킨다. RGC에서 PGC1α의 저해는 RGC 변성을 가속화시킨다. PGC1α 과발현은 RGC 사멸을 지연시키고 RGC와 시신경에서 미토콘드리아 수를 증가시킨다.
실시예 7 - RGC에서 미토콘드리아 생합성이 NRF2의 조건부 과발현과 조건부 넉아웃 및 KEAP1의 조건부 넉아웃에 의해 RGC 생존을 촉진시키는지 여부의 결정
재료 및 방법
조건부 과발현 Rosa26 LSL-Nrf2/+ 계통
NRF2는 전신 항산화 방어 시스템에 대한 핵심 핵 전사 인자이다. 따라서, 생체내 항산화 반응을 향상시키기 위해, Rosa26 LSL-Nrf2/+ 마우스와 동일한 전략을 사용하여 마우스 Nrf2를 조건부로 과발현하는 넉인 마우스 계통을 생성하였다. 키메라를 생식선 전달을 위해 사육하였다. 마우스를 적어도 6세대 동안 C57BL/6J 배경으로 역교배하였다. Rosa26 LSL-Nrf2/+ 마우스에서 NRF2의 조건부 과발현을 검증하기 위해, Rosa26 LSL-Nrf2/+ 를 Pde6g CreERT2/+ 와 교배하여 Rosa26 LSL-Nrf2/+ ;Pde6g CreERT2/+ 마우스를 생성하였다. 타목시펜 유도 후, 망막에서 단백질을 추출하고 항-NRF2 항체(1:1,000; HPA003097; MilliporeSigma)로 탐침하였다. 면역블롯팅은 NRF2 발현 증가를 나타내었는데(결과는 나타내지 않음), 이는 Cre 재조합효소 계통과 교배한 후 STOP 카세트가 제거될 때 Rosa26 LSL-Nrf2/+ 마우스가 NRF2를 과발현한다는 것을 나타낸다. 대다수의 RGC에서 NRF2 과발현을 표적화하기 위해, Thy1 CreERT2 마우스를 사용하여 RGC에서 Cre 재조합효소를 표적화하였다.
NRF2의 조건부 넉아웃에 의한 RGC에서의 항산화 반응 억제
조건부 Nrf2 넉아웃 마우스(Nfe2l2 tm1.1Sred /SbisJ, JAX #25433; 또는 Nrf2 f/f )를 이 실험에 사용한다. Nrf2 f/f 마우스를 Thy1 CreERT2/+ 마우스와 2세대에 걸쳐 교배하여 대조군 Nrf2 +/+ ;Thy1 CreERT2/+ 및 실험용 Nrf2 f/f;Thy1 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. 변성하는 RGC에서 항산화 반응을 억제시키는 효과를 조사하기 위해, Nrf2 f/f;Thy1 CreERT2/+ 계통을 Opa1 V346D/+ 및 D2 마우스와 교배한다. 모든 마우스의 유전자형을 분석하여 rd8 및 rd1 돌연변이의 부재를 확인한다Mattapallil, et al. 2012; Errjgers, et al. 2007).
NRF2의 조건부 과발현에 의한 RGC에서의 항산화 반응 향상
Thy1 CreERT2 마우스와 교배할 때 RGC에서 마우스 NRF2를 조건부로 과발현하는 Rosa26 LSL-Nrf2/+ 마우스를 생성하였다. 이러한 교배는 대조군 Rosa26 +/+ ;Thy1 CreERT2/+ 및 실험용 Rosa26 LSL-Nrf2/+ ;Thy1 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. D2 마우스는 6번 염색체에 동형접합 Gpnmb R150X 를 보유하고 있기 때문에, 이 전략은 D2 품종에서 실행 가능하지 않다.
Keap1 의 조건부 넉아웃에 의한 RGC에서의 항산화 반응 향상
NRF2 안정성은 E3 리가제 어댑터인 KEAP1에 의해 크게 제어된다. 따라서, RGC에서 항산화 반응을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 Thy1 CreERT2 마우스와 교배할 때 Keap1 유전자가 조건부로 넉아웃되어 후속 Nrf2 활성화를 유발하는 C57BL/6-Keap1 tm1.1 Mrl 마우스(Taconic Biosciences, Model 8799; 이하 Keap1 f/f)를 이용할 것이다. 이러한 교배는 대조군 Keap1 +/+ ;Thy1 CreERT2/+ 및 실험용 Keap1 f/f ;Thy1 CreERT2/+ 유전자형을 생성한다. Keap1 f/f ;Thy1 CreERT2/+ 계통을 또한 D2 마우스와 교배하고 모든 마우스의 유전자형을 분석하여 rd8 및 rd1 돌연변이의 부재를 확인한다(Mattapallil, et al. 2012; Errjgers, et al. 2007).
마우스 망막을 실시예 6에 기재된 바와 같이 효소 분해에 의해 해리하고 실시예 6에 기재된 바와 같은 평가를 수행한다.
결과
RGC에서 NRF2의 저해는 녹내장 모델에서 RGC 사멸을 가속화시킨다. RGC에서 NRF2의 과발현 또는 KEAP1의 넉아웃에 의한 항산화 반응 향상은 ADOA의 마우스 모델에서 RGC 생존 및 기능을 촉진시켰다. 이러한 결과는, NRF2 과발현 전략(Rosa26 유전자 넉인)이 Rosa26 유전자가 있는 6번 염색체에 동형접합 GpnmbR150X를 보유하고 있기 때문에 D2 마우스에서 실현 가능하지 않더라도 RGC 사멸의 두 마우스 모델에서 비슷하다. ARE-관련 유전자(NQO1, HO-1, GCLC, GCLM, 및 글루타티온 합성효소)는 2가지 상이한 RGC 사멸 마우스 모델에서 Nrf2 넉아웃 후 FACS-분류 RGC에서 하향조절되고 ARE-관련 유전자는 ADOA의 NRF2 과발현 마우스 모델에서 상향조절된다.
실시예 8 - RPE에서 HIF의 제거는 추상체 및 간상체 생존을 촉진시켰다
재료 및 방법
Pde6b H620Q/H620Q ; Hif-2α tm1Mcs /Hif-2α tm1Mcs 마우스를 다음과 같이 생성하였다.
3가지 마우스 계통을 교배하여 번식 품종을 개발하였다. Hif-2α tm1Mcs /Hif-2α tm1Mcs Jax Stock #008407 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하였다. 유럽 마우스 돌연변이체 보관소(European Mouse Mutant Archive; EMMA) 상실배(Davis, et al. 2008; Hart, et al. 2005); 및 실시예 3에 기재된 Rpe65 CreERT2 마우스를 사용하여 난관 이식을 통해 Pde6b H620Q /Pde6b H620Q 마우스를 재유도하였다. 모든 마우스를 컬럼비아 대학교 무균 안과 연구소 부속 동물 보호 서비스 시설(Columbia University Pathogen-free Eye Institute Annex Animal Care Services Facility)에 수용하였고 12시간 명/12시간 암 주기로 유지하였다.
Pde6b H620Q/H620Q 마우스를 Rpe65 CreERT2 마우스와 교배하였고, 이들의 자손은 Hif-2α tm1Mcs /Hif-2α tm1Mcs Jax 마우스와 함께 사육하였다. 번식 마우스를 생성하기 위해 6세대의 역교배가 필요하였다. 생성된 자손은 관심 있는 모든 대립유전자(Pde6b, Hif2, 및 Rpe65)에 대해 동형접합성이었지만, 일부는 Rpe65에서 야생형인 반면, 다른 일부는 Rpe65 CreERT2 돌연변이를 가졌다. 본 발명자들은 번식 품종으로 사용하기 위해 이들 두 계통을 분리하였다. 번식 품종을 교배하여 Pde6b 및 Hif2 유전자좌에서 동형접합성이고 Rpe65 유전자좌에서 이형접합성인 실험용 마우스를 생산하였다. P7에서 실험용 쥐의 절반에게, 10 ㎎/㎖의 농도로 옥수수 기름으로 희석하고 42℃에서 완전히 혼합한 타목시펜(에탄올 중 100 ㎎/㎖, 카탈로그 T5648; Sigma-Aldrich)을 100 ㎍/g 체중(BW)으로 주사하였다. 1회 주사를 P7, P8, 및 P9에 투여하였다. 실험용 쥐의 나머지 절반에 타목시펜과 동일한 투약량에 따라 에탄올(옥수수 기름 중 10%)을 주사하고 대조군으로 사용하였다. 마우스의 성별에 따른 차별은 없었다.
콜롬비아 대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)는 개시 전에 모든 실험을 승인하였다. 시력 및 안과 연구 협회의 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용을 위한 성명서 및 신경 과학 학회의 신경 과학 연구에서의 동물 사용 정책(Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research of the Association for Research in Vision and Ophthalmology and the Policy for the Use of Animals in Neuroscience Research of the Society for Neuroscience)에 따라 마우스를 사용하였다.
37℃, 5% CO2에서 45분 동안 트립신에서 인큐베이션한 후 Pde6b H620Q/H620Q ; Hif-2α tm1Mcs /Hif-2α tm1Mcs 및 대조군 마우스 둘 모두의 아이컵으로부터 RPE를 분리한 다음(Fernandez, et al. 2016), 실시예 1에 기재된 바와 같이 ERG에 의해 분석하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 H&E 염색에 의해 분석하였다.
결과
도 11에 나타낸 바와 같이, 특히 RPE에서 Hif2의 제거는 간상체와 추상체 둘 모두에서 전기생리학적 기능과 생존을 향상시킨다. RPE 세포에서 Hif를 제거한 후 간상체, 간상체+추상체, 및 추상체를 포함하여 광수용체 기능이 잘 보존되었다.
도 11A는 암소시, 명소시, 및 혼합 간상체-추상체 b파 진폭(μV)을 획득하기 위해 암순응 및 암순응 및 명순응 조건 하에서 4주째와 6주째에 얻은 ERG 데이터를 나타낸다. RPE에서 Hif2a가 제거된 Hif -/- Pde6b H620Q/H620Q 의 망막 기능의 추적(빨강색 추적)을 연령 일치 Hif loxP/loxP Pde6b H620Q/H620Q 대조군(검정색 추적)과 비교하여 4주째, 6주째에 나타내었다.
ERG 추적 진폭을 정량화하는 도 11B는, Hif -/- Pde6b H620Q/H620Q 마우스에서 간상체 및 추상체 세포 반응의 증가를 나타낸다.
4주째의 조직학은 대조군 마우스와 비교하여 Hif -/- Pde6b H620Q/H620Q 마우스에서 더 두꺼운 ONL 및 OS 층, 광수용기 외부 핵(ONL) 층 및 IS/OS 층의 더 큰 폭을 나타낸다. 도 11C 및 11D.
실시예 9 - 표적화된 AAV 벡터는 HIF 저해제를 RPE로 전달하여 추상체 및 간상체 생존을 촉진시켰다
재료 및 방법
RP 마우스 모델, ERG, 면역조직화학 및 항-arr 항체를 이용한 형광 염색을 포함하는 망막하 주사 및 평가, 및 실험적 비교에 있어서 실시예 1과 동일한 재료 및 방법을 사용하였다.
논의된 바와 같이, RPE에서 OXPHOS 및 베타-산화를 증가시키기 위해, RPE-특이적 프로모터(Esumi, et al. 2004)로서 -253 내지 +38 bp(대략 300 bp)의 VMD2 상류 영역을 HIF의 gRNA 저해제를 전달하는 데 사용한다. 검증을 위한 대조군으로 EIAV::U6-gRNAs_scramble;Vmd2::Cas9와 EIAV::U6-gRNAs_HIf2a; Vmd2::spCas9의 2가지 벡터를 생성한다. 서열번호 1 내지 4의 서열을 갖는 gRNA를 벡터에서 사용한다.
결과
RPE에서 HIF의 제거는 ERG 분석 및 조직학에서 명백한 바와 같이 간상체 및 추상체 변성을 늦춘다. 추가적으로, RP 마우스 모델에서 주사되지 않은 눈에 비해 주사된 눈에서 수집된 RPE에서의 OXPHOS 및 베타-산화의 증가도 또한 보인다.
이러한 결과는 RPE에 대한 HIF 저해제의 표적화된 투여가 RP의 마우스 모델에서 광수용체 변성을 감소시켰음을 나타낸다.
실시예 10 - 표적화된 벡터는 KEAP1 저해제를 RPE로 전달하여 추상체 및 간상체 생존을 촉진시켰다
재료 및 방법
RP 마우스 모델, ERG, 면역조직화학 및 항-arr 항체를 이용한 형광 염색을 포함하는 망막하 주사 및 평가, 및 실험적 비교에 있어서 실시예 1과 동일한 재료 및 방법을 사용하였다.
논의된 바와 같이, RPE에서 항산화 반응을 향상시키기 위해, RPE-특이적 프로모터(Esumi, et al. 2004)로서 -253 내지 +38 bp(대략 300 bp)의 VMD2 상류 영역을 KEAP1의 이중 gRNA를 전달하는 데 사용한다. 검증을 위한 대조군으로 EIAV::U6-gRNAs_scramble과 본 발명자들의 가설을 테스트하기 위한 EIAV::U6-gRNAs_KEAP1; Vmd2::spCas9의 2가지 벡터를 생성하였다. 서열번호 5의 gRNA가 벡터에서 사용된 하나의 gRNA이다.
결과
RPE에서 KEAP1의 제거는 ERG 분석 및 조직학에서 명백한 바와 같이 간상체 및 추상체 변성을 늦춘다. 추가적으로, RP 마우스 모델에서 주사되지 않은 눈에 비해 주사된 눈에서 수집된 RPE에서의 ARE-관련 유전자의 상향조절도 또한 보인다.
이러한 결과는 RPE에 대한 KEAP1 저해제의 표적화된 투여가 RP의 마우스 모델에서 광수용체 변성을 감소시켰음을 나타낸다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
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Figure pct00004
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Val Ala Gln Val Ala Pro Val Asp 165 170 175 Leu Asp Gly Met Gln Gln Asp Ile Glu Gln Val Trp Glu Glu Leu Leu 180 185 190 Ser Ile Pro Glu Leu Gln Cys Leu Asn Ile Glu Asn Asp Lys Leu Val 195 200 205 Glu Thr Thr Met Val Pro Ser Pro Glu Ala Lys Leu Thr Glu Val Asp 210 215 220 Asn Tyr His Phe Tyr Ser Ser Ile Pro Ser Met Glu Lys Glu Val Gly 225 230 235 240 Asn Cys Ser Pro His Phe Leu Asn Ala Phe Glu Asp Ser Phe Ser Ser 245 250 255 Ile Leu Ser Thr Glu Asp Pro Asn Gln Leu Thr Val Asn Ser Leu Asn 260 265 270 Ser Asp Ala Thr Val Asn Thr Asp Phe Gly Asp Glu Phe Tyr Ser Ala 275 280 285 Phe Ile Ala Glu Pro Ser Ile Ser Asn Ser Met Pro Ser Pro Ala Thr 290 295 300 Leu Ser His Ser Leu Ser Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ile Asp Val Ser 305 310 315 320 Asp Leu Ser Leu Cys Lys Ala Phe Asn Gln Asn His Pro Glu Ser Thr 325 330 335 Ala Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ser Gly Ile Ser Leu Asn Thr Ser Pro 340 345 350 Ser Val Ala Ser Pro Glu His Ser Val Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asp 355 360 365 Thr Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ser Glu 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Claims (26)

  1. 필요로 하는 대상체에서 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법으로서, PGC1α 또는 NRF2를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포(RPE)를 표적화하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 RPE 특이적 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 RPE 특이적 프로모터는 VMD2 및 RPE65로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 필요로 하는 대상체에서 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법으로서, HIF 또는 KEAP1을 저해하거나 표적화하거나 HIF 또는 KEAP1을 저해하거나 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 이되, 바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포(RPE)를 표적화하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 가이드 RNA(gRNA), 앱타머, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 RPE 특이적 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 RPE 특이적 프로모터는 VMD2 및 RPE65로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 핵산은 HIF를 표적화하고 서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 gRNA인, 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 핵산은 KEAP1을 표적화하고 서열번호 14 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 gRNA인, 방법.
  11. 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법으로서, 필요로 하는 대상체에게, a) 상기 대상체에서 내인성 HIF 유전자에 혼성화하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열(들), 및 (b) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 제2 핵산 서열의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하되; 상기 Cas 뉴클레아제는 내인성 HIF 유전자를 절단하여 대상체에서 내인성 HIF 유전자의 HIF 넉아웃을 생성하는, 방법.
  12. 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법으로서, 필요로 하는 대상체에게, a) 상기 대상체에서 내인성 KEAP1 유전자에 혼성화하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열(들), 및 (b) Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 제2 핵산 서열의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하되; 상기 Cas 뉴클레아제는 내인성 KEAP1 유전자를 절단하여 대상체에서 내인성 KEAP1 유전자의 KEAP1 넉아웃을 생성하는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 RPE를 표적화하고 프로모터는 VMD2 및 RPE65로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 제1 핵산은 서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는, 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 제1 핵산은 서열번호 14 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는, 방법.
  17. 필요로 하는 대상체에서 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법으로서, PGC1α 또는 NRF2를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 벡터는 망막 신경절 세포(RGC)를 표적화하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 RPE 특이적 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 RGC 특이적 프로모터는 hSNCG 및 Ple(NEFL)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  21. 필요로 하는 대상체에서 신경퇴행성 질환의 발병을 지연, 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 치유하는 방법으로서, KEAP1을 저해하거나 표적화하거나 KEAP1을 저해하거나 표적화하는 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 벡터는 망막 신경절 세포(RGC)를 표적화하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 KEAP1을 저해하는 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 가이드 RNA(gRNA), 앱타머, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 14 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 gRNA인, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 RGC 특이적 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 RGC 특이적 프로모터는 hSNCG 및 Ple(NEFL)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 녹내장, 망막색소 변성증(RP), 연령-관련 황반 변성(AMD), 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 루이소체 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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