JP6875856B2 - 対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物に関する。

遺伝性網膜ジストロフィー（ＩＲＤ）は、遺伝的および臨床的に異質な大きな疾患群である。上記疾患は進行性の視力喪失を特徴とするが、法的盲に達する年齢は様々である。個々に珍しいが総称してＩＲＤは、世界全体において２０００人中約１人を冒している（Ｂｅｒｇｅｒら，２０１０）。ＩＲＤの最も一般的な形態は、網膜の光受容細胞の変性および眼底に見られる色素沈着の存在を特徴とする網膜色素変性症群である。その良い例はコロイデレミア（ＣＭＨ）である。ＣＨＭは、ＩＲＤの２％を表すＸ連鎖性色素性網膜症である（Ｂｏｃｑｕｅｔら，２０１３）。これは、幼児期における夜盲症と４０〜５０歳までに失明に至るその後の進行的な視野消失を特徴とする。ＣＨＭは、色素沈着および網膜の後ろに位置する脈絡膜の脈絡毛細管板萎縮を含む特徴的な表現型を有する。Rab GTPアーゼの正しいプレニル化およびその後のそれらの膜標的への送達を可能にする遍在性シャペロンタンパク質であるＲＥＰ１（Ｒａｂエスコートタンパク質−１）（Ｓｅａｂｒａら，１９９２）をコードする１つのＣＨＭ原因遺伝子が存在する。

網膜は一般に、ｉ）非侵襲経路を介してアクセス可能であり、ｉｉ）小さくかつ封入されているため低いベクター用量の使用を可能にし、かつｉｉｉ）網膜色素上皮（ＲＰＥ）と網膜循環の無窓毛細血管との密着結合からなる血液網膜関門の存在により循環への漏出が防止され、かつ免疫特権を持つようになるという理由から、遺伝子治療に非常に適している（Ｃｏｌｅｌｌａら，２００９）。これらの好ましい性質により、２００８年の網膜遺伝子治療の最初の臨床試験に至り（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら，２００８；Ｍａｇｕｉｒｅら，２００８）、すぐに他の研究者もそれに続いた（Ｂｅｎｎｅｔｔら，２０１２；Ｈａｕｓｗｉｒｔｈら，２００８；Ｊａｃｏｂｓｏｎら，２０１２；Ｍａｇｕｉｒｅら，２００９）。標的ＩＲＤであるレーベル先天黒内障（ＬＣＡ）は、視覚サイクルの鍵酵素をコードするＲＰＥ特異的遺伝子ＲＰＥ６５における突然変異により生じる（Ｍａｒｌｈｅｎｓら，１９９７）。組換えアデノ随伴ウイルス（血清型２）ベクター（ＡＡＶ２／２）を用いてＲＰＥ６５をＲＰＥの中に上手く運んだ。良好な結果から、遺伝子導入により視覚障害のある対象の視力を改善することができるという原理証明が得られ、研究者らは、特にＲＰＥにおける目的のポリヌクレオチドの発現のために最も効率的なベクターを同定するように促されている。

本発明は、対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定められている。

本発明者らは、ＣＨＭ^−／ｙ患者からのＲＥＰ１欠乏線維芽細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）の中にリプログラミングし、それらを網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化させた。本発明者らは、このｉＰＳｃ由来ＲＰＥは古典的な形態を有する極性単層であり、特徴的なマーカーを発現し、流体輸送および食作用に対して機能的であり、かつ患者の生化学的表現型を模倣することを実証した。次いで、本発明者らは、ＡＡＶベクター血清型のパネルをアッセイし、ＡＡＶ２／５はヒトＲＰＥ細胞に対して最も効率的（６０％超の形質導入）であり、かつＣＨＭ遺伝子導入により生化学的表現型を正常化することができることを初めて示した。この比類がない程に高い生体外での形質導入効率は、恐らく食作用によって促進され、ＡＡＶベクターが網膜下腔において生体内で遭遇する状況を模倣している。従って、本発明者らは、ヒトの対照およびＣＨＭのＲＰＥにおけるＡＡＶ２／５の優位性を実証している。

従って、本発明の第１の態様は、目的のポリヌクレオチドを含むある量のｒＡＡＶ２／５ベクターを用いて網膜色素上皮に形質導入する工程を含む、それを必要とする対象の眼の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを選択的に発現させるための方法に関する。

本明細書で使用される「対象」または「それを必要とする対象」という用語は、ヒトを意図している。典型的には、当該対象は、網膜色素上皮を冒す網膜疾患に罹患しているか罹患する可能性がある。従って、本明細書に示されている教示を所与として多種多様な網膜疾患を治療することができ、これらの疾患としては典型的に、遺伝性もしくは非遺伝性網膜変性症、網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、黄斑変性症、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、錐体杆体ジストロフィー、眼内血管新生疾患、脈絡膜変性症、脈絡膜硬化症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、コロイデレミア、緑内障、スライ症候群（MPS VII、β−グルクロニダーゼ遺伝子の欠損が原因）および脳回転状網膜脈絡膜萎縮（オルニチン−δ−アミノ基転移酵素遺伝子（ＯＡＴ）の欠損が原因）などの代謝異常、網膜剥離または外傷および網膜症（遺伝性、手術誘発性、外傷性、毒性化合物誘発性、薬剤誘発性または光誘発性のいずれであるかは問わない）が挙げられる。

従って、本発明の別の目的は、ＲＰＥ細胞で発現された場合に網膜疾患に対して有益な効果を有する目的のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ２／５ベクターを対象の眼の中に送達することによる、それを必要とする対象における網膜疾患の治療方法を提供することにある。

従って、本発明の別の目的は、ＲＰＥ細胞で発現された場合に網膜疾患に対して有益な効果を有する目的のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ２／５ベクターを対象の眼の中に送達することによる、それを必要とする対象における網膜疾患の治療方法を提供することにある。

本明細書で使用される「目的のポリヌクレオチド」という表現は、本明細書ではあらゆる理由のために標的細胞においてその発現が望まれている、任意のポリペプチド、構造タンパク質、酵素などをコードするあらゆるヌクレオチド配列を表す。この表現は、非コード配列、例えばアンチセンス配列または遺伝子の発現の減少を目的とした干渉ＲＮＡの配列を表すこともできる。当業者は、自身の分野における科学文献によるその知識によって、特定の網膜疾患を治療するのにより適し得るポリヌクレオチドがどれであるかを知っている。

本発明のｒＡＡＶ２／５ベクターを用いた眼の遺伝子治療は、その中で欠損している目的のポリヌクレオチド（例えば遺伝子）の機能的コピーをＲＰＥ細胞に導入する（遺伝子置換療法）か、あるいは治療される眼疾患に対して有益な効果を有する目的のポリヌクレオチドをＲＰＥ細胞に送達すること（対症療法）により行うことができる。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチド産物は、網膜色素上皮細胞の機能を高めるポリペプチドである。遺伝子置換療法で使用することができる目的のポリヌクレオチドの例は、ＲＰＥ細胞において特異的かつ優先的に発現される遺伝子、例えば、ＲＧＲ（網膜色素変性症、ＲＰ、染色体（ｃｈｒ．）１０）、ＲＤＨ５（白点眼底、ｃｈｒ．１２）、ＲＰＥ６５（レーバー先天性黒内障、ＬＣＡ、ｃｈｒ．１）、ＲＬＢＰ１（ＲＰ、ｃｈｒ．１５）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ、ｃｈｒ．２）、ＬＲＡＴ（ＲＰ、ｃｈｒ．４）、ＲＥＰ１（コロイデレミア、Ｘｐ２１）、ＲＢＰ４（ＲＰＥ変性、ｃｈｒ．１０）または他の細胞型においても発現される遺伝子、例えば、ＭＹＯ７Ａ（アッシャー症候群１型、ｃｈｒ．１１）、ＥＬＯＶＬ４（黄斑変性症、ｃｈｒ．６）、ＥＦＥＭＰ１（家族性ドルーゼン(Malattia Leventinese)、ｃｈｒ．１５）、ＢＥＳＴ１（ベスト病、ｃｈｒ．１１）、ＴＩＭＰ３（ソースビー眼底変性症、ｃｈｒ．２２）、ＡＩＰＬ１（ＬＣＡ、ｃｈｒ．７）、およびＣＲＢ１（ＲＰ、ｃｈｒ．１）である。

いくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ＲＥＰ１（Ｒａｂエスコートタンパク質−１）（すなわちＣＨＭ遺伝子）をコードするポリヌクレオチドである。

特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、神経栄養因子をコードするものであってもよい。本明細書で使用される「神経栄養因子」とは、神経細胞の生存や維持、神経細胞分化の促進などの生理作用を有するタンパク質の一般名称である。神経栄養因子の例としては、限定されるものではないが、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＩＬ−１β、ＮＴ−３、ＩＧＦ−ＩＩ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦおよびＲｄＣＶＦが挙げられる。

ある特定の状況では、目的のポリヌクレオチド産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを行う部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、エンドヌクレアーゼは網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、野生型の場合は網膜構造タンパク質であり、かつ／または正常な網膜機能を与える遺伝子の不完全なコピーを優性対立遺伝子がコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたは亜鉛フィンガーヌクレアーゼなど）は、欠損対立遺伝子を標的にし、欠損対立遺伝子をノックアウトすることができる。欠損対立遺伝子のノックアウトに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、欠損対立遺伝子によってコードされたタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡとの相同組み換えを促進することができる。従って、例えば、本発明の方法を使用して欠損対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼを送達することができる共に、これを使用して欠損対立遺伝子の機能的コピーを送達することができ、これにより欠損対立遺伝子を修復し、よって、機能的網膜タンパク質の産生が得られる。いくつかの実施形態では、当該ベクターは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、機能的網膜タンパク質をコードする欠損対立遺伝子の機能的コピーをコードするポリヌクレオチドとを含む。使用に適した部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ、ここでは、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは天然に生じないものであり、特定の遺伝子を標的にするように修飾されている。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように遺伝子操作することができ、次いでいくつかのヌクレオチドを挿入または除去する間に非相同末端結合によりその切断を修復することができる。次いで、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」ともいう）は、当該タンパク質をフレームの外に出し、当該遺伝子を有効にノックアウトする。例えば、米国特許第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチド産物は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、アデノ随伴ウイルスの略語であり、そのウイルスそのものまたはその誘導体を指すように使用することができる。この用語は、全ての血清型および変異体（天然に生じる形態および遺伝操作された形態の両方）を包含する。本発明に係る「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）およびＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）を指す。ＡＡＶの各種血清型のゲノム配列、ならびに天然の末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列が当該技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはジェンバンクなどの公開データベースで確認することができる。例えば、ジェンバンク受入番号ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ−２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ−２）およびＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ−５）を参照されたい。

本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」とは、ＲＰＥ細胞の形質転換のために目的のポリヌクレオチド（すなわち非相同ポリヌクレオチド）を含むＡＡＶベクターを指す。ｒＡＡＶベクターは、５’および３’側のアデノ随伴ウイルス末端逆位配列（ＩＴＲ）と、標的細胞においてその発現を制御する配列に機能的に連結される目的のポリヌクレオチドとを含む。

「ＡＡＶハイブリッドベクター」という語句は本明細書では、そのＣａｐ、ＲｅｐおよびＩＴＲが少なくとも２種の異なるＡＡＶ血清型に由来するｒＡＡＶベクターゲノムとAAV Repタンパク質とを含む、天然のＡＡＶカプシドを含むベクター粒子を表す。本発明のハイブリッドベクターは、ＡＡＶ−２のＩＴＲと共にＡＡＶ−５カプシドおよびｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ２／５ベクターである。例えば、発現されたタンパク質がカプシド（ＡＡＶ−５カプシド）を形成することができるような方法でＡＡＶ−２のｃａｐ遺伝子からのｃａｐ遺伝子をＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子からの配列で置き換えることにより、ＡＡＶ−２のｃａｐ遺伝子からあるｃａｐ遺伝子を誘導することができる。

当該技術分野で知られている方法を用いて、本発明のｒＡＡＶ２／５ベクターを産生する。要するに、本方法は一般に、（ａ）ｒＡＡＶベクターの宿主細胞への導入、（ｂ）ｒＡＡＶベクターに欠けているウイルス機能を含むＡＡＶヘルパー構築物の宿主細胞への導入、および（ｃ）ヘルパーウイルスの宿主細胞への導入を含む。ｒＡＡＶベクターの複製およびｒＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングを達成するためには、ｒＡＡＶウイルス粒子の複製およびパッケージングのための全機能が存在しなければならない。同時または連続的に、標準的なウイルス学的技術を用いて宿主細胞への導入を行うことができる。最後に、宿主細胞を培養してｒＡＡＶウイルス粒子を産生し、ＣｓＣｌ勾配などの標準的な技術を用いて精製する。例えば熱不活性化などの公知の方法を用いて残留するヘルパーウイルスの活性を不活性化することができる。次いで、精製したｒＡＡＶウイルス粒子を本方法での使用のために準備する。

当該ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列などの、コードされるタンパク質の発現および分泌を可能にする制御配列を含んでいてもよい。この点に関しては、当該ベクターは、感染細胞におけるタンパク質の発現を引き起こすか向上させるために目的のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター領域を含む。そのようなプロモーターは、感染組織におけるタンパク質の効率的かつ好適な産生を可能にするために、遍在性プロモーター、組織特異的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、調節プロモーター、キメラプロモーター、誘導プロモーターなどであってもよい。当該プロモーターはコードされるタンパク質に相同であっても非相同であってもよく、細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、真菌プロモーター、植物プロモーターまたは合成プロモーターを含む。本発明で使用するのに好ましいプロモーターは、ＲＰＥ細胞において機能的でなければならない。そのような調節プロモーターの例としては、限定されるものではないが、Tet on/offエレメントを含むプロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが挙げられる。遍在性プロモーターの例としては、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサーを有するニワトリβ−アクチンプロモーター）、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、およびＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターなどの細胞プロモーターが挙げられる。また、当該プロモーターは、シナプシンまたはＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）プロモーター（または遍在性ＰＧＫプロモーターから上流に配置されたＮＲＳＥ（ニューロン特異的サイレンサエレメント）配列）などのニューロン特異的（ｎｅｕｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）プロモーター、あるいはＲＰＥ６５、ＢＥＳＴ１、ロドプシンまたは錐体アレスチン(cone arrestin)プロモーターなどのＲＰＥ細胞型に特異的なプロモーターであってもよい。また、当該ベクターは、所望でない細胞における導入遺伝子発現の抑制を達成するｍｉＲＮＡのための標的配列を含んでいてもよい。特定の実施形態では、当該ベクターは、コードされたタンパク質の分泌を可能にするリーダー配列を含む。目的のポリヌクレオチドと分泌シグナルペプチドをコードする配列（通常は分泌されるポリペプチドのＮ末端に位置する）との融合により、形質導入細胞から分泌することができる形態で治療用タンパク質を産生させることができる。そのようなシグナルペプチドの例としては、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリ性プロテアーゼまたはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドが挙げられる。最も好ましい実施形態では、当該プロモーターは網膜の細胞、特に網膜の光受容体もしくは神経節細胞またはＲＰＥにおいて特異的または機能的であり、すなわち前記細胞における導入遺伝子の（優先的な）発現を可能にする。例えば、好適な光受容体特異的調節エレメントとしては、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター(Youngら (2003) Ophthalmol.Vis.Sci. 44:4076)、βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター(Nicoudら (2007) J.Gene Med. 9:1015)、網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）上記）、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）上記）、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター(Yokoyamaら (1992) Exp Eye Res. 55:225)が挙げられる。

ベクターの用量は、病状、対象（例えば、対象の体重、代謝など）、治療スケジュールなどに応じて変更してもよい。本発明の内容の範囲内で好ましい有効な用量は、ＲＰＥ細胞への最適な形質導入を可能にする用量である。典型的には、マウスにおける１回の投薬当たり１０^８〜１０^１０ウイルスゲノム（ｖｇ）を投与する。典型的には、ヒトにおいて投与されるＡＡＶベクターの用量は、１０^１０〜１０^１２ｖｇの範囲であってもよい。

本発明のベクターの対象への投与は、直接網膜注射、網膜下もしくは硝子体内注射により行ってもよい。この方法に従い、網膜下送達によりベクター粒子の投与を行うことが好ましい。

いくつかの態様では、本発明は、ＲＥＰ１をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ２／５ベクターに関する。いくつかの実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、ＣＡＧプロモーターの制御下にある。前記ベクターは、それを必要とする対象におけるコロイデレミアを治療するのに特に適している。

ＲＥＰ１の例示的なアミノ酸配列は配列番号６であり、ＲＥＰ１の例示的な核酸配列は配列番号７である。

配列番号６：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１３８８８６．１
MADTLPSEFD VIVIGTGLPE SIIAAACSRS GRRVLHVDSR SYYGGNWASF SFSGLLSWLK EYQENSDIVS DSPVWQDQIL ENEEAIALSR KDKTIQHVEV FCYASQDLHE DVEEAGALQK NHALVTSANS TEAADSAFLP TEDESLSTMS CEMLTEQTPS SDPENALEVN GAEVTGEKEN HCDDKTCVPS TSAEDMSENV PIAEDTTEQP KKNRITYSQI IKEGRRFNID LVSKLLYSRG LLIDLLIKSN VSRYAEFKNI TRILAFREGR VEQVPCSRAD VFNSKQLTMV EKRMLMKFLT FCMEYEKYPD EYKGYEEITF YEYLKTQKLT PNLQYIVMHS IAMTSETASS TIDGLKATKN FLHCLGRYGN TPFLFPLYGQ GELPQCFCRM CAVFGGIYCL RHSVQCLVVD KESRKCKAII DQFGQRIISE HFLVEDSYFP ENMCSRVQYR QISRAVLITD RSVLKTDSDQ QISILTVPAE EPGTFAVRVI ELCSSTMTCM KGTYLVHLTC TSSKTAREDL ESVVQKLFVP YTEMEIENEQ VEKPRILWAL YFNMRDSSDI SRSCYNDLPS NVYVCSGPDC GLGNDNAVKQ AETLFQEICP NEDFCPPPPN PEDIILDGDS LQPEASESSA IPEANSETFK ESTNLGNLEE SSE

配列番号７：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００３９０．２
TAATAGTCAC ATGACACGTT TCCCGTCAAG ATGGCGGATA CTCTCCCTTC GGAGTTTGAT GTGATCGTAA TAGGGACGGG TTTGCCTGAA TCCATCATTG CAGCTGCATG TTCAAGAAGT GGCCGGAGAG TTCTGCATGT TGATTCAAGA AGCTACTATG GAGGAAACTG GGCCAGTTTT AGCTTTTCAG GACTATTGTC CTGGCTAAAG GAATACCAGG AAAACAGTGA CATTGTAAGT GACAGTCCAG TGTGGCAAGA CCAGATCCTT GAAAATGAAG AAGCCATTGC TCTTAGCAGG AAGGACAAAA CTATTCAACA TGTGGAAGTA TTTTGTTATG CCAGTCAGGA TTTGCATGAA GATGTCGAAG AAGCTGGTGC ACTGCAGAAA AATCATGCTC TTGTGACATC TGCAAACTCC ACAGAAGCTG CAGATTCTGC CTTCCTGCCT ACGGAGGATG AGTCATTAAG CACTATGAGC TGTGAAATGC TCACAGAACA AACTCCAAGC AGCGATCCAG AGAATGCGCT AGAAGTAAAT GGTGCTGAAG TGACAGGGGA AAAAGAAAAC CATTGTGATG ATAAAACTTG TGTGCCATCA ACTTCAGCAG AAGACATGAG TGAAAATGTG CCTATAGCAG AAGATACCAC AGAGCAACCA AAGAAAAACA GAATTACTTA CTCACAAATT ATTAAAGAAG GCAGGAGATT TAATATTGAT TTAGTATCAA AGCTGCTGTA TTCTCGAGGA TTACTAATTG ATCTTCTAAT CAAATCTAAT GTTAGTCGAT ATGCAGAGTT TAAAAATATT ACCAGGATTC TTGCATTTCG AGAAGGACGA GTGGAACAGG TTCCGTGTTC CAGAGCAGAT GTCTTTAATA GCAAACAACT TACTATGGTA GAAAAGCGAA 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ATTGCCTATA AATAAACAAA CAAATGAACT ATTTGTTTTT TTTTCTCACA ACATCTGGCC TATATTGTCT GTCAGGAAGC CATGGCTCCA ATGTAAAGTA CATAGTTCTT ACATACTTCA ACTGCAGCTG GTCCCTGACC TCACCAGGTT TCAGAGATGT TCTTAAAGGA AGCCAGCTGT GGCAGGTCAC AGATTCATGG GAAATGGAAA GAACCAAGGA ATATAGCTCT TGCCTCACCT TTCTACCCAC TGCAGATATA GTTCAAGCCA GAGTAATGGA AGAACTTAAC TTACTAGCCT CTCAGGCTGC TCCTATCCCT ACCTCCCAGT GTACAGCCCC TCCCCATCTC TTTAGTCCCC TTTCCCTCAC TTCCCCTTTT ATAATGTCAC ACAAATCAGG GACAGTAGGA TCACATTATA ACCTACTTTG TCATAGGGAT TCGATTTTTC TTATATCAAA TCATGTTTCC TGAAACCCAG CTGGGGCATA TGCACTCAAT GTCTAATACA TACTTATTAA TGTACCGGAT ATTGGCCTTG CCCCTGGATA TCAGCAATAT ATTATAAAAG GTTCCAGTAG ATGAGACGAT TGAGTCTGAA TACAATTGCA GTAAATTGTG CCAATAAAGA TATTGTACTG TTACGGTCTT AGAGTTAAAG CCGCTTGAAT GCAGCATGCA CATTCATGTA AACAGACAAT CAGGGTAGGC CTAGAATAAC CACAAAAATT CTATTGGCCT TACTGCAGCC ACCTATATGT AGAACAATGG AGGAGATAGT TTGTGGTCCA TTATTGTACC CTGTTTCATC CATTAGCATC AGAATCTCTC TTTCAGGTCA TTTATTAAAT ATGATTGAAA TGTTTAAAAG TTCCTGAACA TGATTCATGA TGATTAAAAT ATCATACAAC 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本発明のベクターは、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、当該ベクターに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または当業者によく知られている他の材料を含んでいてもよい。そのような材料は非毒性でなければならず、有効成分（すなわち本発明のベクター）の有効性を妨げるものであってはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、すなわち、ここでは直接網膜注射、網膜下もしくは硝子体内注射に従って当業者が決定することができる。本医薬組成物は、典型的には液体形態である。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれていてもよい。注射のために、当該有効成分は発熱物質を含まず、かつ好適なｐＨ、等張性および安定性を有する水溶液の形態であってもよい。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などの等張性媒体を用いて好適な溶液を良好に調製することができる。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要に応じて含めてもよい。遅延放出のために当該技術分野で知られている方法に従って、当該ベクターを生体適合性ポリマーから作られたマイクロカプセルまたはリポソーム担体系などに入れて徐放のために製剤化される医薬組成物に含めてもよい。

以下の図および実施例により、本発明をさらに説明する。但し、これらの実施例および図は決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

ｉＰＳｃ由来ＲＰＥにおけるＡＡＶベクターの形質導入効率。ａ）ＣＭＶプロモーターの制御下でＥＧＦＰを発現しているＡＡＶベクター（２／２、２／４、２／５、２／８、２／９）のパネルの形質導入効率の比較。この形質導入効率をＣＡＧプロモーターの制御下でＥＧＦＰを発現しているＡＡＶ２／５ベクターとも比較した。２５０００ｖｇ／細胞により形質導入を行い、ＦＡＣＳによりＥＧＦＰ陽性細胞の数を分析した。 ｉＰＳｃ由来ＲＰＥにおけるＡＡＶベクターの形質導入効率。ｂ）より多くの数のウイルス粒子（１０００００ｖｇ／細胞）を用いて達成されたＣＭＶプロモーターの制御下でＥＧＦＰを発現しているＡＡＶベクター２／２、２／５、２／８、２／９の形質導入効率の比較。ＦＡＣＳによりＥＧＦＰ陽性細胞の数を分析した。 ｉＰＳｃ由来ＲＰＥにおけるＡＡＶベクターの形質導入効率。ｃ）ＡＡＶベクターの同じパネルからのＥＧＦＰ発現の経時変化。 ｉＰＳｃ由来ＲＰＥにおけるＡＡＶベクターの形質導入効率。ｄ）ＡＡ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰを用いて、同等の効率で野生型およびＣＨＭ１のＲＰＥに形質導入する。 ＣＨＭ１線維芽細胞におけるベクターＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭからのＲＥＰ１発現。ａ）野生型線維芽細胞におけるＲＥＰ１発現のＩＦ研究。ｂ）ＣＨＭ１線維芽細胞においてＲＥＰ１の発現が認められない。ｃ）１０００００ｖｇ／細胞によるＣＨＭ１線維芽細胞への形質導入から４８時間後のＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭからのＲＥＰ１発現。ｄ）１０００００ｖｇ／細胞のＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭによる形質導入から４８時間後の線維芽細胞のウエスタンブロット分析から、野生型（ＷＴ）の約１７％のレベルでＲＥＰ１が発現されたことが分かった。ｅ）１０００００ｖｇ／細胞のＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭによる形質導入から４週間後のＲＰＥのウエスタンブロット分析から、野生型の約５３％のレベルでＲＥＰ１が発現されたことが分かった。ｄ）およびｅ）の両方において非形質導入（ＮＴ）ＣＨＭ１細胞においてＲＥＰ１の発現が認められないことに留意されたい。 ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭによる形質導入後のＣＨＭのＲＰＥにおける正常な細胞表現型の回復。Ａ）野生型、非形質導入ＣＨＭ１のＲＰＥ、およびＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭにより形質導入されたＣＨＭ１のＲＰＥにおける、組み込まれたビオチン化プレニルドナーの生体外でのプレニル化およびその後のウエスタンブロット分析。Ｂ）野生型、非形質導入ＣＨＭ１のＲＰＥ、およびＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭまたはＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰにより形質導入されたＣＨＭ１のＲＰＥにおける、細胞質画分および膜画分の分画遠心分離およびウエスタンブロット分析。Ｃ）βアクチンローディングレベルへの正規化後の定量化により、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭによるＣＨＭ１のＲＰＥへの形質導入後に野生型レベルに対して細胞質Ｒａｂプールの低下が示された。Ｄ）定量化分析により、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭによるＣＨＭ１のＲＰＥへの形質導入後に野生型レベルに対してＲａｂ２７Ａの細胞内分布プロファイルの回復が示された。対照的に、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰによる形質導入後にレベルは変化しなかった。 マウスの網膜への生体内遺伝子導入。ａ）４．６８×１０^９ｖｇのＡＡＶ５−ＣＡＧ−ＣＨＭもしくは−ＥＧＦＰの投与から２週後に、ｑ−ＰＣＲ研究により導入遺伝子発現を検出することができた。ｂ）ウエスタンブロット分析により、ＡＡＶ５−ＣＡＧ−ＣＨＭもしくは−ＥＧＦＰのそれぞれの投与後にＲＥＰ１およびＥＧＦＰの特異的発現が確認された。ｃ）眼底検査研究により、ＡＡＶ５−ＣＡＧ−ＣＨＭの投与後に注射部位を超える健康な網膜と、ＡＡＶ５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰの注射後に注射部位においてより強い広範な導入遺伝子発現が示された。ｄ）注射部位（縮尺表示）を含む視神経側の全網膜に沿ってＥＧＦＰ発現が検出された。挿入図はＲＰＥおよび光受容体におけるＥＧＦＰ発現を示す拡大図である。

材料および方法
皮膚線維芽細胞の単離および増幅
１６歳の少年の上腕内側（ＣＨＭ１と称す）に対して、the Centre of Reference for Genetic Sensory Disorders（CHRU Montpellier）におけるコロイデレミアの確定分子診断（ＲＴ−ＰＣＲ（Klinkum der Universitat、ドイツのレーゲンスブルク）によりＣＨＭのエクソン８の欠失を同定）と共に、無菌条件下で皮膚生検を行った。皮膚生検組織をＰＢＳ中で洗い流し、切断して小片にし、１０％の補体除去された（ｄｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）ＦＣＳ（Ｌｏｎｚａ社、ベルギーのヴェルヴィエ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンＢ（Ｌｏｎｚａ社）および２％AmnioMax C100サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Life Technologies社）を含有するＬ−グルタミンを含むAmnioMAX C100基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Life Technologies社、フランスのサン・トーバン）を入れた３５ｍｍの培養皿（１皿当たり２片）において５％ＣＯ_２下３７℃で培養した。新たに出現した線維芽細胞が８０％の集密に達したら、生検組織を新しい皿に取り出した。この生検組織を全部で４回移し、各別個の培養物からのＰ１〜Ｐ５の範囲の細胞を、１０％ＤＭＳＯを含有するＦＣＳ（Sigma Aldrich社、フランスのサン・カンタン・ファラヴィエ）中で凍結した。

突然変異の特性評価
製造業者の指示に従い、DNeasy Blood & Tissueキット（Ｑｉａｇｅｎ社、フランスのレ・ジュリス）を用いて、初代線維芽細胞からゲノムＤＮＡを単離した。ＣＨＭ患者が保有するＣＨＭにおけるエクソン８の欠失の境界を定めるために、１．６ｋｂのゲノムＤＮＡの５’側からエクソン８にわたって分布する３つのプライマー対、および３８ｋｂの３’側からエクソン８にわたって分布する８つのプライマー対を、標準的な条件を用いる対照および患者のＤＮＡのＰＣＲ増幅のために試験した。間隔の減少が確立されたら、エクソン８の７８ｂｐ上流に位置するイントロン７Ｆプライマー（５’−ＴＴＣ−ＡＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＴＧ−ＴＧＧ−ＧＧ−３’）（配列番号１）およびエクソン８の３６２ｂｐ下流に位置するイントロン８Ｒプライマー（５’−ＣＴＧ−ＧＡＡ−ＡＣＡ−ＴＣＣ−ＴＧＴ−ＧＴＴ−ＣＡＴ−Ｃ−３’）（配列番号２）を使用して、６６６ｂｐのゲノムＤＮＡ断片を増幅させ、Applied Biosystems社製３１３０ｘＬジェネティックアナライザー（Applied Biosystems社、米国カリフォルニア州フォスターシティ）上でのBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionキットＶ３．１を用いるシークエンシングの前に、ExoSAP-IT PCR Clean-upキット（GE Healthcare社、フランスのヴェリジー＝ヴィラクブレー）を用いて精製した。

突然変異の検出
エクソン７、８および９のＰＣＲ増幅のために３つのプライマー対を使用して、異なる細胞型からのゲノムＤＮＡにおけるＣＨＭ欠失の存在について試験した。エクソン７のためのプライマー対で４９３ｂｐ断片を増幅させ、エクソン８のためのプライマー対で１７７ｂｐ断片を増幅させ、エクソン９のプライマー対で９７５ｂｐ断片を増幅させた。製造業者の指示に従い、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒおよびＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて異なる細胞型からＲＮＡを単離した。単離されたＲＮＡをリボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ社）で処理し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素キット（Life Technologies社）を用いて逆転写した。対照ｃＤＮＡからの５５９ｂｐ断片および患者ｃＤＮＡからの３３３ｂｐ断片を表すエクソン７〜１１のＰＣＲ増幅により、ＣＨＭ欠失の存在または非存在を確認した。

ウエスタンブロット分析
Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ社、フランスのメラン）を含有する冷たいＰＢＳの中に細胞を掻き落とし、２００ｇおよび４℃で５分間遠心分離した。このペレットを、ベンゾナーゼ（Sigma Aldrich社）を含有する２×Ｌａｅｍｍｌｉの試料緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ社、フランスのマルヌ＝ラ＝コケット）に再懸濁した。溶解物のタンパク質濃度をPierce BCAタンパク質アッセイキット（ThermoFisher Scientific社、フランスのグラフェンスタデン）を用いて測定し、この溶解物をAnyKD MiniProtean TGX Stain Freeプレキャストゲル（Ｂｉｏｒａｄ社）上にロードした。分離されたタンパク質をＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ミニＰＶＤＦ転写パックおよびシステム（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて電気泳動転写した。０．５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを含む５％スキムミルク（ブロッキング溶液）中で１時間ブロッキングした後、この膜を１／１０００希釈のモノクローナルマウス抗ＲＥＰ１抗体（クローン２Ｆ１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、フランスのサンカンタン・アン・イヴリーヌ）のブロッキング溶液と共に室温で１時間インキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで３回洗浄した後、このフィルタをマウス全免疫グロブリン（Life Technologies社）に対する１／１００００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ抗体と共にインキュベートした。Amersham ECL Primeウエスタンブロット検出試薬（GE Healthcare社）を用いて、検出工程を行った。

レンチウイルスベクターの産生
ドキシサイクリン誘導性転写因子ｃ−ＭＹＣ（ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ｈＭＹＣ、プラスミドＩＤ：２０７２３）、ＳＯＸ２（ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ＳＯＸ２、２０７２４）、ＫＬＦ４（ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ＫＬＦ４、２０７２５）、ＯＣＴ４（ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ＯＣＴ４、２０７２６）、リバースドキシサイクリン制御性トランス活性化因子Ｍ２ｒｔＴＡ（ＦＵＷ−Ｍ２ｒｔＴＡ、２０３４２）およびＧＦＰを含むレンチウイルス系プラスミド（ＦＵＧＷ、１４８８３）を、Ａｄｄｇｅｎｅ社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。レンチウイルス産生プラットフォーム（フランスのモンペリエ）により、レンチウイルスベクターを産生した。ＦＵＧＷの感染力価を計算すると１０１０ＴＵ／ｍｌであった。残りのウイルスの感染力価は、それらのＰ２４濃度をＦＵＧＷの濃度と比較して、ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ｈＭＹＣは２×１０^９ＴＵ／ｍｌ、ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ＳＯＸ２は７×１０^９ＴＵ／ｍｌ、ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ＫＬＦ４は８×１０^９ＴＵ／ｍｌ、ＦＵＷ−ｔｅｔＯ−ＯＣＴ４は３×１０^９ＴＵ／ｍｌ、ＦＵＷ−Ｍ２ｒｔＴＡは９．８×１０^９ＴＵ／ｍｌと推定した。

フィーダー細胞
ヒト新生児包皮線維芽細胞をＡＴＣＣ（ｈＦＦ−１、LTC standards社、フランス）から購入した。１０％ＦＣＳを添加し、かつCegelec BloodXrad照射器（Etablissement Francais du Sang、フランスのモンペリエ）を用いて３５グレイの線量を照射したＧｌｕｔａｍａｘを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社、Life Technologies社）中で細胞を培養した。フィーダー細胞を２．５×１０^５細胞／３５ｍｍプレートの密度で播種した。

リプログラミングおよびｉＰＳｃ培養
リプログラミングを開始する前に、ＧＦＰをコードするＦＵＧＷベクターを用いて、形質導入実験に適したＭＯＩを計算した。次いで、０日目に、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンＢを添加したＧｌｕｔａｍａｘを含有するＤＭＥＭを入れた６ウェルプレートの１ウェル当たり１０^５細胞の密度で、ＣＨＭ患者の線維芽細胞を６ウェルプレートに播種した。１日目に、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、５種類のウイルスを用いて１ベクター当たり１０のＭＯＩ（総ＭＯＩは５０）で細胞に形質導入した（リプログラミング実験のために対照ＦＵＧＷベクターは使用しなかった）。２日目に、これらの細胞をＰＢＳで洗い流し、新しい培地を添加した。５日目に、この培地を新しくして、２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した。６日目に、形質導入細胞を０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ社）で解離し、１つのウェルからの細胞を、フィーダー細胞層（１／４希釈）を含む４つのウェルに分けた。これらの細胞を２０％ＫＯ血清代替物（Ｇｉｂｃｏ社）、２００ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１％Ｂ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）、および、２μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich社）を含有する１０ｎｇ／ｍｌの□ＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、フランスのヌイイ＝シュル＝セーヌ）を添加したＥＳ培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社））で培養し、この培地を毎日交換した。Ｌｙｎｘ実体顕微鏡（Vision Engineering社、フランスのLe Plessis Pate）下で、得られたｉＰＳｃを、ＥＳ培地中にフィーダー細胞を含む３５ｍｍプレート上でメスを用いて機械的に継代した。

奇形腫形成および分析
ｉＰＳｃを１０μＭのＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ）阻害剤（Ｙ−２７６３２、Sigma Aldrich社）により３７℃で１時間事前処理し、次いで、１×TrypLE Select（Ｇｉｂｃｏ社）により３７℃で１０分間酵素解離した。解離細胞を、フィーダー細胞層を含む１０ｃｍのプレートに５０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、継代後ＲＯＣＫ阻害剤を含むＥＳ培地で２４時間培養した。注射前に細胞を酵素的に５回継代した。解離細胞を２００μｌの注射当たり２×１０^６細胞の濃度で３０％ＢＤマトリゲル基底膜マトリックス（BD Biosciences社、フランスのル・ポン＝ド＝クレ）を含むＥＳ培地に再懸濁した。実験動物の管理と使用に関する欧州および国家指針（欧州議会および理事会指令２０１０／６３／ＥＵ）に準拠し、かつ施設および地域倫理委員会によって認可されている（認可番号：ＣＥＡＡ−ＬＲ−１２１５７）動物育種および実験を行った。NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウス（Charles River社、フランスのラルブレル）を３５ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｍｅｒｉａｌ社、フランスのリヨン）および１４ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Bayer Healthcare社、フランスのロース）で麻酔し、左右の後側腹部の毛を剃り、２７ゲージ針を取り付けた１ｍｌ注射器を用いて２００μｌの細胞混合物を皮下注射した。対照として、細胞を含有しないか以前に特性評価した野生型ｉＰＳｃ（Ｍ４Ｃ７、（Ｒａｍｉｒｅｚら，２０１３））からの細胞を含有する３０％マトリゲル／ＥＳ培地をマウスに注射した。これらのマウスを個別換気ケージに収容し、腫瘍が最大１ｃｍ^２の大きさに到達したら安楽死させた（注射後約２ヶ月）。腫瘍を切開し、ＰＢＳで洗い流し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、かつパラフィンで包埋した。４μｍの切片をヘマトキシリン−エオシンで染色し、かつ３種類の胚葉の存在について分析した。

ＲＰＥの産生
ｉＰＳｃをＲＰＥに分化させるために、本発明者らは小さい修正を伴う先に記載した自然発生的手順（Ｌｉａｏら，２０１０）を使用した。簡単に言うと、ｉＰＳｃコロニーをフィーダー細胞上で集密になるまで増殖させ、次いで□ＦＧＦをＥＳ培地から除去した。この培地を分化プロセス中に毎日交換し続けた。□ＦＧＦ枯渇後その月にわたって着色された病巣が現れ、これらを手で切開した。１つのプレートからの病巣を貯蔵し、０．２５％トリプシンで解離し、マトリゲル（１：３０で希釈）でコーティングした２４もしくは６ウェルの培養皿に播種し、ＦＧＦ枯渇ＥＳ培地で培養した。集密した単層に達すると、細胞は着色された多角形の形態になり、培養物中に長期間維持することができた。細胞をトリプシン解離によって継代し、必要に応じて増幅させた。第３継代（Ｐ３）において全ての分析をＲＰＥに対して行った。流体で満たされたドームをSteREO Discovery V2.0 顕微鏡(Carl Zeiss S.A.S社、フランスのル・ペック)で観察した。

電子顕微鏡法
高密度の０．４μＭの孔を有する半透明のBD Falcon細胞培養インサート（BD Biosciences社）上でＲＰＥを継代した。特徴的な形態に達したら、フィルタをチャンバから取り外し、３．３％グルタルアルデヒドで固定し、２％四酸化オスミウムで後固定し、エポキシ樹脂で包埋した。半薄（７００ｎｍ）切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察した。７０ｎｍの切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、Hitachi H7100透過電子顕微鏡(Centre Regional d’Imagerie Cellulaire（ＣＲＩＣ）、フランスのモンペリエ)を用いて可視化した。

免疫蛍光顕微鏡検査
免疫蛍光研究のために、ｉＰＳｃおよびＲＰＥをプラスチック製の９６ウェル皿に播種し、線維芽細胞をガラス製カバーガラス上に播種した。全ての細胞型を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、５％ロバ血清／１％ＢＳＡでブロッキングした。０．２％Triton x-100または０．０５％サポニンで細胞を透過処理した。適当であればＤａｋｏ蛍光マウント培地（Dako France S.A.S.社、フランスのレ・ジュリス）に載せる前に、一次抗体を切片上で４℃で一晩インキュベートし、二次抗体を０．２μｇ／ｍｌのbisBenzimide Hoechst（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および１ｎｇ／ｍｌのファロイジン−ＴＲＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と共に室温で４５分間インキュベートした。ｉＰＳｃのために使用した一次抗体は、１：５希釈のラットＩｇＭ抗ヒトＳＳＥＡ３（Developmental Studies Hybridoma Bank、アイオワ大学、米国アイオワ州アイオワシティ）および１：１０希釈のヤギ抗ヒトＮＡＮＯＧ（R&D Systems Europe、フランスのリール）であった。ＲＰＥのために使用した一次抗体は、１：１００希釈のウサギ抗ヒトＺＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Life Technologies社）、１：２５０ウサギ抗ヒトＭＥＲＴＫ（ＡｂＣａｍ社、英国ケンブリッジ）、１／１５０希釈のマウス抗ヒトＲＰＥ６５（ＡｂＣａｍ社）および１：１０００のマウス抗ヒトＣＲＡＬＢＰ（組換えタンパク質に対する抗体、Ａｇｒｏｂｉｏ社、フランスのラ・フェルテ＝サン＝トーバン）であった。線維芽細胞のために使用した一次抗体は、１／５００希釈のマウス抗ヒトＲＥＰ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）であった。全てのための二次抗体は、１：８００希釈のロバ抗マウスＩｇＭ−Ａｌｅｘａ５９４もしくは−Ａｌｅｘａ４８８または１：１０００希釈のロバ抗マウス、抗ウサギもしくは抗ヤギIgG-Alexa Fluor 594もしくは−Alexa 488（Molecular probes社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。食作用研究のために、細胞を、１個の細胞当たり１６０ビーズの量の１μｍの直径の黄色−緑色（５０５／５１５ｎｍ）のカルボン酸修飾されたミクロスフェア（FluoSpheres、Molecular probes社、Life Technologies社）と共にインキュベートした。Zeiss 5 live duo高速／スペクトル共焦点顕微鏡を用いて細胞を観察し、対応する画像収集ソフトウェア（Carl Zeiss S.A.S.社、Montpellier RIOイメージングプラットフォーム）を用いて画像収集を行った。

逆転写および定量的ＰＣＲ研究
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、形質導入された線維芽細胞における外来性導入遺伝子の発現ならびにｉＰＳｃにおける外来性導入遺伝子のサイレンシングおよび内因性多能性遺伝子の活性化を分析した。ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成後に、遺伝子特異的プライマー（別記、表）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録）480 IIサーマルサイクラー（Ｒｏｃｈｅ社）上のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）480 SYBR Green I Master Mixを用いてｑＰＣＲ増幅を行った。遺伝子発現をＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアおよびマイクロソフトエクセルを用いて結果を分析した。ＲＰＥ特異的マーカーの発現を遺伝子特異的プライマーによる古典的なＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いて分析し、かつ２％アガロースゲル上で増幅産物を分析した。

生体外でのプレニル化アッセイ
２４ウェルプレートのウェルで培養したＲＰＥを冷たいＰＢＳで洗浄し、抗プロテアーゼを含有するＰＢＳの中に掻き落とし、ペレット化し、先に記載したように新しく調製した冷たい脱気したプレニル化／溶解緩衝液に再懸濁した（Ｗｕら，２００７）。細胞を氷上で１５分インキュベートし、次いで４０ヘルツで４５秒間の超音波処理を３回行った。次いで、これらの細胞を１５００ｇおよび４℃で５分間遠心分離し、上澄みを回収し、さらにOptima MAX-TL超遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎ社、フランスのVillepinte Roissy）で４５００００ｇおよび４℃で３０分間遠心分離した。プレニル基ドナーとして５μＭのビオチンで標識したゲラニルピロリン酸（Ｂ−ＧＰＰ）（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、フランスのゾウフェルヴァイヤースハイム）、０．５μＭの組換えＲＥＰ１（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ社）、０．５μＭのＲａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＲＧＧＴ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ社）および２０μＭのＧＤＰを含むプレニル化／溶解緩衝液を用いて、新たに調製した溶解物に対して生体外プレニル化アッセイを３７℃で１時間行った（Ｎｇｕｙｅｎら，２０１０；Ｗｕら，２００７）。プレニル化反応物を６×ＳＤＳで失活させ、９０℃で５分間沸騰させ、ウエスタンブロットで分析した。この膜を１：５０００のＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch社、英国ケンブリッジ）または１：５００００のマウス抗β−アクチン（Sigma Aldrich社）と共にインキュベートした。ChemiDoc MPイメージングシステム（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて検出を行い、ビオチン−ゲラニルの取込みの程度を適当なソフトウェアパッケージ（Image Lab、Ｂｉｏｒａｄ社）を用いる走査デンシトメトリーにより定量化し、β−アクチンシグナルの関数として表した。相対的比較を可能にするために、ＣＨＭのＲＰＥにおけるビオチン取込み量を１００％に設定した。

分画遠心分離
２４ウェルプレートのウェルからのペレット状のＲＰＥ細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＧＤＰおよび記載されているタンパク質阻害剤（Ｓｅａｂｒａら，１９９５）を含有する３体積の細胞内画分溶解緩衝液（ＳＦＬＢ）中で完全にホモジナイズした。このホモジネートを８００×ｇおよび４℃で遠心分離し、ペレットを破棄し、上澄みを４５００００×ｇおよび４℃で１時間超遠心分離して、細胞質画分および膜画分を得た。超遠心分離後に、ペレットを１％Nonidet P-40 (Sigma Aldrich社）に調整した１体積のＳＦＬＢに再懸濁した。細胞質の上澄みのタンパク質含有量および１％Nonidet P-40可溶化膜画分をウエスタンブロット分析で分析した。これらの膜を１：２５０のマウス抗Ｒａｂ２７Ａ（ＡｂＣａｍ社）または１：５００００のマウス抗β−アクチン抗体と共にインキュベートした。細胞質および膜のＲａｂ２７Ａレベルをβ−アクチンローディングコントロールに対して定量化し、各ウェルについて総Ｒａｂ２７Ａ含有量の割合として表した。

ＡＡＶベクターの産生
ウイルスベクター産生プラットフォーム（フランスのナント）により、この作業で使用するＡＡＶベクターを産生した。簡単に言うと、２９３個の細胞の一過性形質移入によりウイルスベクターを産生し、ＰＥＧを用いてウイルス粒子を上澄みから沈殿させるか、ＡＡＶ２／４および−２／５ベクターの場合は、硫酸アンモニウムを用いて細胞ペレットから沈殿させた。これらのベクターを二重ＣｓＣｌ遠心分離により精製し、透析し、ドットブロットアッセイにより滴定した。形質導入効率実験のために、ＣＭＶプロモーターの制御下でＥＧＦＰを発現しているＡＡＶベクターの力価は、ＡＡＶ２／２−ＣＭＶ−ＥＧＦＰが３．５×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍｌ、ＡＡＶ２／４−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（Ｄｒ．Ｆ．Ｒｏｌｌｉｎｇを介して提供、Inserm UMR 1089、ナント）が３×１０^１１ｖｇ／ｍｌ、ＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰが３．３×１０^１２ｖｇ／ｍｌ、ＡＡＶ２／８−ＣＭＶ−ＥＧＦＰが９×１０^１２ｖｇ／ｍｌ、ＡＡＶ２／９−ＣＭＶ−ＥＧＦＰが２．５５×１０^１２ｖｇ／ｍｌであった。概念実証実験のために、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサーを有するニワトリのβ−アクチンプロモーター）の制御下でＣＨＭ遺伝子（米国ペンシルベニア州ペンシルバニア大学Ｊ．Ｂｅｎｎｅｔｔ教授によって提供）またはＥＧＦＰ遺伝子（ナントウイルスベクター産生プラットフォームによって提供）のいずれかを保有するＡＡＶプラスミド使用して、以下のベクター：ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭ（４．４×１０^１２ｖｇ／ｍｌ）およびＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰ（２．３４×１０^１２ｖｇ／ｍｌ）を産生した。

生体外でのＡＡＶ形質導入
形質導入効率実験のために、ｉＰＳｃ由来ＲＰＥを９６ウェルプレートに播種し、集密時では１ウェル当たり２×１０^５個の細胞と推定した。最小体積（５０μｌ）の□ＦＧＦ枯渇ＥＳ培地中に２５０００ｖｇ（最も低い力価を有する血清型により規定）で細胞に６時間形質導入して、ベクターと細胞との相互作用を促進させた。次いで、これらのウェルに予備の培地を補充し、これらの培地を３〜４日ごとに交換した。所望の時点で、細胞を０．２５％トリプシンで解離し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、形質導入から４８時間、１週間、２週間、４週間および６週間後に、ＥＧＦＰを発現している細胞の数をBD FACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences社）を用いて分析した。実験を２回ずつ行った。導入遺伝子発現実験のために、２×１０^４個の線維芽細胞をカバーガラスのある２４ウェルプレートに播種した。１０００００ｖｇのＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭを用いて播種から２４時間後の細胞に４８時間形質導入した。同時に、カバーガラスのないウェルに、フローサイトメトリー分析のために当量のＭＯＩのＡＡＶ２／５−ＣＨＭ−ＥＧＦＰを用いて形質導入した。概念実証実験のために、ｉＰＳｃ由来ＲＰＥを２４ウェルプレートに播種し、集密時では１．２×１０^６個の細胞と推定した。１０００００のＭＯＩで細胞に形質導入し、形質導入から４週間後にプレニル化アッセイを行った。実験を３回ずつ行った。

網膜下注射
８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Harlan France SARL、フランスのガナ）を７０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび２８ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔し、各眼に０．５％トロピカミド（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ社、フランスのＴｈｅａ）を１滴注して瞳孔を散大させた。角膜を一滴のＬａｃｒｙｖｉｓｃ（Ａｌｃｏｎ社、フランスのリュエイユマルメゾン）およびガラス製カバーガラスで覆った。外科用顕微鏡下で、最初に角膜と強膜との接合部において眼を穿刺した。その後、５μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ社製注射器および傾斜つき（ｂｅｖｅｌｌｅｄ）３４Ｇ針を用いて網膜下注射を行った。これらの眼に２μｌのＰＢＳまたは４．６８×１０^９ｖｇのＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭまたはＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰのいずれかを含む２μｌのＰＢＳを注射した。これらの眼を眼底検査により一定間隔で（注射から２、４、６および８週間後）追跡した。各時点でマウスに麻酔をかけ、瞳孔を散大させ、ＭｉｃｒｏｎＩＩ網膜イメージング顕微鏡（Phoenix Research Laboratories社、米国カリフォルニア州プレザントン）を用いて眼底写真を撮った。先に記載したように屠殺前に網膜電図研究を行った（Ｃｈｅｋｒｏｕｄら，２０１１）。Kruskall Wallis ANOVAを用いて統計比較を行い、Siegel-Castellanの２×２比較（Ｓｉｅｇｅｌ＆Ｃａｓｔｅｌｌａｎ，１９８８）を用いて事後比較（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ比較）を行った。

導入遺伝子発現の分析
注射から２週間後にマウスを屠殺し、それらの眼から眼球を取り出し、眼球の前部を除去した。ウエスタンブロット分析のために、神経網膜を切開し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％グリセリンおよび２％ＳＤＳ）にそれぞれ入れた。その後、ＲＰＥおよび脈絡膜を鉗子を用いて溶解緩衝液の中に掻き出して、神経網膜と共に貯蔵した。総タンパク質試料の一部（７．５％）を遊走させ、移し、上記のような抗ＲＥＰ１または１／２０００希釈のウサギ抗ＥＧＦＰ血清（Molecular probes社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とハイブリッド形成させた。ｑ−ＰＣＲ分析のために、ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成前に神経網膜およびＲＰＥ／脈絡膜試料を急速凍結させた。Ｌ２７遺伝子発現に対して正規化された遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｑ−ＰＣＲ分析を行った。

組織学的分析
ＥＧＦＰ発現をアッセイするために、それらの眼から眼球を取り出し、３．７％ホルムアルデヒドで４℃で６時間固定し、ＯＣＴマトリックスへの包埋および１４μＭでの切片化前に、１０％、２０％、３０％および４０％スクロースの連続浴中でインキュベートした（Reseau d’Histologie Experimentale de Montpellier（ＲＨＥＭ））。組織構造をアッセイするために、それらの眼から眼球を取り出し、３．７％ホルムアルデヒドで４℃で２４時間固定し、連続的なエタノール浴で脱水し、パラフィンで包埋し、かつ４μｍで切片化した（ＲＨＥＭ）。光受容体の計数のために、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。スライドスキャナー（Hamamatsu Photonics社、日本、Montpellier RIOイメージングプラットフォーム）で顕微鏡画像を取得した。１つの網膜当たり少なくとも４つの矢状方向切片を計数し（注射状況は不明）、光受容体の核の数を平均した。

結果
患者突然変異の特性評価
患者ＣＨＭ１の線維芽細胞からのゲノムＤＮＡの特性評価により、エクソン８の開始点の４０ｂｐ上流に位置するイントロン７において７ｂｐ（ＴＡＧＴＴＣＴ）（配列番号３）配列の重複が明らかとなった。重複配列の間には４ｂｐの挿入（ＧＡＴＴ）（配列番号４）が存在した。この第１の重複に続いて、その開始点の６８ｂｐ後方に位置するエクソン８（ＧＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＴ）（配列番号５）内に１５ｂｐの配列の第２の重複が存在した。イントロン７の終了点およびエクソン８の開始点を含む２つの重複の間に位置する９７ｂｐのＤＮＡ配列は欠失していた。イントロン７受容スプライス部位の喪失およびその後のエクソン８の欠失により、アミノ酸位置３１４における予測されたフレームシフトと、ＲＥＰ１の第２のＧＤＰ解離阻害因子（ＧＤＩ）ドメインを切断する位置３３２（野生型ＲＥＰ１は６５３ａａである）における未熟終止コドンが生じた。野生型および切断型ＲＥＰ１（７３．４９ｋＤａ）の両方ならびにＲＥＰ２（７４．０８ｋＤａ）中に存在するＮ末端エピトープに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析により、対照細胞の２つのバンドおよびＣＨＭ細胞（ＲＥＰ２に対応）の１つのバンドが検出され、これは、切断型タンパク質が不安定であることを示している。第２のＲＥＰ１特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析により、対照細胞とは対照的にＣＨＭ１細胞においてタンパク質は検出されなかった。

従って、患者ＣＨＭ１が保有する突然変異によってＲＥＰ１タンパク質産生が消失した。さらに、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質レベルで開発された検出試験は、その後に産生されるあらゆる細胞型における患者の突然変異の存在を確認するのに有用であろう。

患者特異的ｉＰＳ細胞の産生および確認
本発明者らは、ＣＨＭ１線維芽細胞のリプログラミングのために、山中転写因子カクテル（ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２）を運ぶドキシサイクリン誘導性レンチウイルスベクターを使用した。本発明者らは、ｑＰＣＲ研究により、ドキシサイクリン誘導から２４時間後に各導入遺伝子の発現を確認した。ドキシサイクリン誘導から１週間後に、線維芽細胞は、時間と共に現れて消える部分的にリプログラミングされたコロニー（前駆ｉＰＳｃコロニー）を有する形態に変化し始めた。対照的に、ドキシサイクリン誘導から５週間後に、形態学的に特徴的なコロニーが検出され、これによりドキシサイクリンを含まないＥＳ培地への機械的継代が残存した。CHM1 iPSc DNAのＰＣＲ増幅により、元のＣＨＭ欠失が存在し、かつ野生型およびCHM1 iPSc RNAから産生されたｃＤＮＡ断片間の２２６ｂｐの差異によって明らかなように、それがｍＲＮＡからのエクソン８の完全な欠失を引き起こすことが分かった。さらに、CHM1 iPScは、核型分析によって示されるように、リプログラミング中に生じ得るどんな大きな染色体異常も示さなかった。

陽性対照として野生型クローンＭ４Ｃ７（Ｒａｍｉｒｅｚら，２０１３）を用いて、様々な技術によりCHM1 iPScの多能性を確認した。第１に、ｍＲＮＡレベルでは、ｑＰＣＲ研究によりCHM1 iPScにおける外来性ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のサイレンシングならびに内因性ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧの発現の活性化が実証された。第２に、アルカリホスファターゼ染色は陽性であり、免疫蛍光（ＩＦ）研究によりＮＡＮＯＧの発現が確認され、かつＳＳＥＡ３の発現が示された。最後に、CHM1 iPScは皮下注射された場合に免疫不全マウスにおいて奇形腫の形成を誘導し、組織学的分析により３種類の胚葉層すなわち外胚葉、中胚葉および内胚葉のマーカーの発現を確認した。

結論として、本発明者らは、ＣＨＭ患者の本物のｉＰＳｃを産生した。

患者特異的ＲＰＥの産生および確認
本発明者らは自然発生的分化手順を使用して、野生型Ｍ４Ｃ７およびCHM1 iPScから網膜色素上皮（ＲＰＥ）を産生した。ｉＰＳｃを集密まで培養し、かつｂＦＧＦを培地から除去してから約３０日後に、プレート内に着色された病巣が現れた。これらの病巣を機械的に継代し、集密時にＲＰＥに特徴的な多角形の着色された細胞の層が形成された。半透明の多孔性フィルタ上に細胞を播種することにより、切片化および組織学的分析が可能となった。半薄切片の観察により、細胞層が規則的な単層であることが実証された。透過電子顕微鏡法により、この単層が頂端側に微絨毛を有し、かつ基底側に核を有し、細胞質メラノソームおよび密着結合を示す接着斑を有する極性上皮であることが分かった。上皮は、ＲＰＥ細胞とマトリゲルコーティングとの間で検出可能な基底膜を分泌しているように見えた。ＲＴ−ＰＣＲ研究により、ｉＰＳｃ由来上皮が、視覚サイクル（ＲＬＢＰ１、ＲＰＥ６５、ＬＲＡＴ、ＲＤＨ５など）、網膜発生（ＰＡＸ６）、食作用（ＭＥＲＴＫ）、色素沈着（ＴＹＲ）、イオン輸送（ＢＥＳＴ１）および細胞接着（ＺＯ−１）のための古典的な遺伝子を発現することが実証された。さらに、ＩＦ研究により、それらのそれぞれの役割に応じて、ＭＥＲＴＫは頂端の微絨毛（図４Ｆ）、ＣＲＡＬＢＰおよびＲＰＥ６５は細胞質、ＺＯ−１は頂端の接合部に局在化していることが分かった。さらに、接着斑の存在は陽性のＺＯ−１標識化と一致していた。この古典的なＲＰＥ形態に加えて、生体内機能のうちの２つもｉＰＳｃ由来ＲＰＥにおいて保存されていた。第１に、時間と共に、様々な大きさの流体で満たされたドームがプレート内に現れた。これらは、ＲＰＥを培養皿から持ち上げる頂端側から基底側への流体輸送により形成されたと思われる。第２に、ＲＰＥはＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓを貪食することができ、これを落射蛍光顕微鏡により検出することができた。ＦＡＣＳ分析により、内部に取り込まれる球体の量が時間と共に増加することが分かった。最後に、元のＣＨＭ突然変異はＤＮＡおよびＲＮＡレベルで存在し、ＲＥＰ１はＣＨＭ１のＲＰＥに存在しなかった。

まとめると、これらの結果から野生型およびCHM1 iPScの両方からのこのｉＰＳｃ由来上皮は本物であり、かつ機能的ＲＰＥであることが確認された。

生化学的欠陥の検出
個体のＣＨＭ１からのｉＰＳｃ由来ＲＰＥが患者の生化学的欠陥を再現するか否かを判断するために、本発明者らは２つの異なる技術を準備し、細胞内Ｒａｂのプレニル化状態、ＲＥＰ１の活性の反映をアッセイした。第１に、本発明者らは、生体外プレニル化アッセイを用いて、細胞における非プレニル化Ｒａｂプールの大きさをアッセイした。この目的のために、本発明者らは、組換えＲＧＧＴ、ＲＥＰ１およびビオチン化プレニルドナーを野生型およびＣＨＭ１細胞の溶解物に添加した。従って、プレニル化のために非プレニル化Ｒａｂプールが利用可能であれば、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを用いるウエスタンブロット分析により一体化されたビオチンを検出することができる。ビオチン化Ｒａｂに対応する検出されたバンドを□−アクチンローディングコントロールに従って正規化し、ＣＨＭ１のＲＰＥにおいて検出されたプレニル化Ｒａｂプールを１００％に設定して相対的比較を可能にした。平均して、約４倍低いレベルのビオチン化Ｒａｂタンパク質が野生型ＲＰＥにおいて検出され、これは、ＲＥＰ１およびＲＥＰ２の存在下で大部分のＲａｂがプレニル化され、かつ膜に結合されているという事実と一致している。第２に、本発明者らは、網膜において高発現されるＲａｂタンパク質であるＲａｂ２７Ａの細胞内分布を特異的にアッセイした（Ｓｅａｂｒａら，１９９５）。分画遠心分離により、本発明者らは、野生型およびＣＨＭ１細胞溶解物の細胞質画分および膜画分を分離し、特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析によりＲａｂ２７Ａのそれぞれの含有量を分析した。プレニル化アッセイに関しては、各画分中のＲａｂ２７Ａの量をβ−アクチンローディングコントロールに従って正規化した。その後、各細胞溶解物中のＲａｂ２７Ａの総量（細胞質＋膜）を１００％に設定し、各画分中の量を総Ｒａｂ２７Ａ含有量の割合として表した。野生型細胞では、細胞質Ｒａｂ２７Ａの量は膜に結合した量よりも平均して約４．７倍低かった。対照的に、ＣＨＭ１のＲＰＥでは、細胞質Ｒａｂ２７Ａの量は野生型細胞で観察される量よりも平均して約２倍高く、膜に結合した量よりも約１．８倍低かった。

従って、結論としてＣＨＭ１のＲＰＥ細胞は、ＣＨＭ患者において見られる生化学的な差異、すなわちＲＥＰ１の非存在によるＲａｂタンパク質の不十分なプレニル化を模倣していた。

ＲＰＥへの形質導入
本発明者らがＡＡＶベクターを用いてｉＰＳｃ由来ＲＰＥに形質導入することができるか否かを判断し、かつ最も効率的な血清型を確認するために、本発明者らは、ＣＭＶプロモーター：ＡＡＶ２／２、−２／４、−２／５、−２／８および−２／９の制御下でＥＧＦＰを発現しているベクターのパネルを試験した。第１に、ＥＧＦＰ発現によって判断されるように、全ての血清型によりｉＰＳｃ由来ＲＰＥに形質導入することができ、形質導入効率は用量依存的であった。第２に、当量のウイルスゲノムでは、各血清型の効率は２／５＞２／２＞２／４＞２／８／＞２／９であった（図１ａ）。注目すべきことに、平均してＡＡＶ２／５ベクターの発現はＡＡＶ２／２よりも１．５倍高く（１．４５±０．２６、ｎ＝５）、ＡＡＶ２／８および２／９の両方よりも約６倍高かった。これらの４種類の血清型の用量依存的効果を調べるために、本発明者らは、１つの細胞当たりのウイルスゲノムの数を１０００００まで増加させた。ＡＡＶ２／５の形質導入効率はＥＧＦＰ陽性細胞の５５％から８０％に増加したが、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８もしくは２／９の形質導入効率は、それぞれ約１．５倍および６倍低いままであった（図１ｂ）。さらに、本発明者らは、最も効率的な血清型（ＡＡＶ２／５）を使用して２種類の異なるプロモーターＣＭＶおよびＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサーを有するニワトリβ−アクチン）の有効性を比較した。平均して、ＣＡＧはＣＭＶよりも２倍高いレベルの発現を誘導した（２．０４±０．２１、ｎ＝５、図１ａ）。第３に、経時的実験により、形質導入から４週間後に発現がピークとなることが示唆された（図１ｃ）。最後に、ｉＰＳｃ由来ＲＰＥの遺伝子型（すなわち野生型およびＣＨＭ）は、形質導入効率に影響を与えなかった（図１ｄ）。

まとめると、これらの結果からＡＡＶ２／５ベクターは、他の血清型、特にＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８よりも良好にヒトｉＰＳｃ由来ＲＰＥに形質導入することが実証された。

ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭに誘導されるＲＥＰ１発現
従って、本発明者らは、ＣＡＧプロモーターの制御下でＣＨＭを発現するＡＡＶ２／５ベクターを産生した。ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭにより形質導入されたＣＨＭ１線維芽細胞のＩＦ研究により、コードされたＲＥＰ１が発現され、細胞質において主として小胞の染色として正確に局在化されていることを確認した（図２ａ〜図２ｃ）。形質導入された線維芽細胞のウエスタンブロット分析（図２ｄ）、次いでβ−アクチンレベルに正規化されたＲＥＰ１発現の半定量化により、ＲＥＰ１発現が野生型の約１７％に等しいことが分かった。同時にウエスタンブロットデータに従い、本発明者らは、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰを用いて線維芽細胞に形質導入し、フローサイトメトリーによりＥＧＦＰ陽性細胞の１４％を検出した。一貫して、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭによるＲＰＥの最初の形質導入実験、次いでウエスタンブロット（図２ｅ）および半定量化分析により、ＲＥＰ１発現がＥＧＦＰ陽性細胞の４０％に対して野生型の５３％に等しいことが分かった（ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰにより形質導入されたＲＰＥ細胞のフローサイトメトリーにより決定）。

従って、まとめると、これらのデータからＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭにより形質導入されたＣＨＭ１細胞におけるＲＥＰ１の発現は、野生型の発現と少なくとも等しいことが分かる。

ＣＨＭ遺伝子の導入
次いで、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭベクターを用いてＣＨＭ１のＲＰＥに形質導入し、経時的実験の結果に基づき、形質導入から４週間後にＲＥＰ１活性を分析した。代表的な実験は図３ａに示されている。上記のとおり、プレニル化実験では、ビオチン化Ｒａｂの検出されたプールを１００％に設定した。ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭベクターによるＣＨＭ１のＲＰＥの形質導入後に、ビオチン化Ｒａｂタンパク質の量の４．５倍の減少があり、これは野生型ＲＰＥにおけるレベルに等しい（図３ｃ）。同様に、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭによる形質導入後のＲａｂ２７Ａの細胞内分布分析（図３ｂ）により、Ｒａｂ２７Ａの細胞質画分が非形質導入ＲＰＥと比較して２．４倍減少し、かつ膜結合画分が１．３倍増加し、これは野生型ＲＰＥにおけるレベルと等しいことが分かった（図３ｄ）。さらに、対照ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰベクターによるＣＨＭ１のＲＰＥへの形質導入により、各画分におけるＲａｂ２７Ａの割合は劇的に変化しなかった。

結論として、本発明者らは、ＡＡＶ２／５によって媒介されるＣＨＭ遺伝子導入によりＣＨＭ患者のＲＰＥにおける正常な細胞表現型が回復するという概念実証を行った。

生体内での遺伝子導入
これらの生体外研究を補完するために、本発明者らは、マウスの眼にＰＢＳ、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰまたはＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭを注射し、発現についてアッセイした。注射から早くも３日後に、ＡＡＶ−ＣＡＧ−ＥＧＦＰを注射したマウスの眼底においてＥＧＦＰ発現を僅かに認めることができた。注射から２週間後に網膜抽出物に対して行ったＱ−ＰＣＲ研究により、ＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＨＭを注射したマウスの網膜抽出物におけるヒトＣＨＭ、およびＣＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＥＧＦＰを注射した眼におけるＥＧＦＰの特異的な発現が示された（図４ａ）。同時点におけるウエスタンブロット分析により、タンパク質レベルにおけるこの特異的な発現が確認された（図４ｂ）。本発明者らは、注射から１週間、２週間（図４ｃ）および１ヶ月後における眼底検査によるＥＧＦＰ発現の漸進的変化を追跡し、広範な形質導入を検出し、これは安定しているように見えた。蛍光顕微鏡法により視神経までの網膜の半分の形質導入が確認され、ＥＧＦＰ発現がＲＰＥおよび光受容体の両方において検出された（図４ｄ）。

結論として、マウス網膜における生体内でのＡＡＶ２／５によって媒介される遺伝子導入により、ＲＰＥおよび光受容体の両方において遺伝子発現が生じた。

考察
幹細胞は理論上体内のあらゆる細胞型に分化することができる多能性細胞の不死増殖を表すように、ヒト細胞培養の分野に革命をもたらした（Ｙｕ＆Ｔｈｏｍｓｏｎ，２００８）。特に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）は成人の体細胞から産生させることができるため、ヒトの胚幹（ＥＳ）細胞の使用に関わる倫理規定を回避する例外的な手段を表す（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００７；Ｙｕら，２００７）。さらに、幹細胞は理論上体のあらゆる細胞型に分化することができるため、従来の技術では単離させることができなかった初代細胞型へのアクセスを可能にする（Ｇｒｉｍｍ，２００４）。さらに、出発物質が特定の遺伝子疾患を有する個体に由来している場合、標的にされる細胞型は疾患特異的細胞モデルを表すことができる（Ｐａｒｋら，２００８）。

本発明者らはｉＰＳｃ技術を使用して疾患特異的網膜色素上皮（ＲＰＥ）モデルを作製し、本発明者らはそれを用いて遺伝子治療手法の概念実証を行うことができた。これは、そのような戦略の最初の例である。一般に、薬物の薬理学的効率をスクリーニングするため（Ｅｇａｗａら，２０１２）、あるいは細胞移植を視野に入れた細胞前駆体の生成のため（Ｔｕｃｋｅｒら，２０１１）に、ｉＰＳｃ由来細胞モデルを使用して当該疾患の病態生理をさらに理解する（Ｓｉｎｇｈら，２０１３）。本発明者らは、対応する治験において標的にされる細胞型における遺伝子置換戦略の効率を試験するためのｉＰＳｃ由来モデルのさらなる可能性をここに示す。

ＡＡＶベクターは、網膜遺伝子治療にとって安全かつ効率的なものとして現在広く受け入れられている。同定されている各種ＡＡＶ血清型のうち、ＡＡＶ２／２、−２／４、−２／５、−２／８もしくは−２／９は全て、生物種に応じて様々な効率で網膜細胞型に形質導入することが分かっている（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ＆Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，２０１２）。これらの５種類全ての血清型がＲＰＥへの形質導入を行い、ＡＡＶ２／４以外の全てが光受容体への形質導入を行う（Ｗｅｂｅｒら，２００３）。さらに、光受容体への形質導入に関しては、マウスおよびブタの眼において、ＡＡＶ２／５、−２／８および−２／９がＡＡＶ２／２よりも高い効率を示すことが分かっている（Ａｌｌｏｃｃａら，２００７；Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏら，２０１１）。これまでヒトにおいて２種類の血清型、すなわちＡＡＶ２／２（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら，２００８；Ｈａｕｓｗｉｒｔｈら，２００８；Ｍａｇｕｉｒｅら，２００８）および−２／４（未公開）について試験されており、蓄積中の毒性データにより、ヒトの眼に対してこれらのベクターが安全であることが示唆されているが、最も効率的なベクターはまだ確認されていない。

本発明者らは、ｉＰＳｃ由来ヒトＲＰＥにおける上記ＡＡＶ血清型の形質導入効率をアッセイした。文献と一致して、ＡＡＶ２／５では、ＡＡＶ２／２よりも同じプロモーターに対して２倍高い発現レベルが得られた。しかし、本発明者らは、予期せぬことにＡＡＶ２／８での発現はＡＡＶ２／２で観察された発現よりも低いことが分かった。本発明者らは最初、これは本発明者らが使用した第１のストックのＡＡＶ２／８が他の血清型とは異なるベクター産生プラットフォームにより産生されたことが理由だと考えた。従って、本発明者らは、同じ産生プラットフォームからの第２のストックを得たが、その結果は同じであった。さらに、本発明者らは用量依存的効果を調査したが、ＡＡＶ２／５はヒトＲＰＥにおいて一貫してＡＡＶ２／８よりも有効であった。さらに、その結果はＡＡＶ２／９と同じであった。このことは、ＡＡＶ２／５はα−２−３Ｎ結合型シアル酸のいずれかに結合するが、ＡＡＶ２／２、２／８および２／９はこの受容体を使用しないため、細胞表面受容体における差異に起因している可能性がある（概説については（Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ＆Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，２０１１）を参照されたい）。本発明者らが、ヒトのｉＰＳｃ由来ＲＰＥ細胞が機能的な生体内ＲＰＥの古典的な特性を特徴とすることを示しているように、生体外で観察される全ての用量におけるＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９に対するＡＡＶ２／５の優位性は生体内でも当て嵌まるものでなければならない。従って、ヒトＲＰＥにおいて、より低用量のＡＡＶ２／５ウイルスベクターは他の血清型と比較して優れた形質導入を行うものであり、重要な安全性を示しているものと思われる。

本発明者らは、ＡＡＶ２／５によるＲＰＥへの形質導入は用量依存的であり、ＣＭＶプロモーターとは対照的にＣＡＧプロモーターを用いることにより形質導入効率をさらに高めることができることを示した。本発明者らは、最大８５％の形質導入効率に達したが、これは、本発明者らが生体外での形質導入のためにＡＡＶベクターを用いることについてよく知られている難しさを考慮した場合、驚くべきことであった。形質導入はＲＰＥの食作用特性によって促進されると思われ、これは眼におけるその重要な役割のうちの１つを表している（Ｓｐａｒｒｏｗら，２０１０）。生体内では、光受容体はそれらの外節円板を常に新しくし、ＲＰＥ側でそれらの古い部分を毎日捨てる。ＲＰＥは、蓄積されると有害になる捨てられた円板の食作用に関与している。従って、ｉＰＳｃ由来ＲＰＥの食作用能力は、網膜下腔内に投与されたＡＡＶベクターが遭遇する状況を模倣し、このモデルの例外的な潜在能力をさらに強調している。生体内では、光受容体はそれらの外節円板を頂端側で常に新しくし、このようにして、それらの古い部分をそれらの基底側で毎日捨てる。ＲＰＥは、蓄積されると有害になる捨てられた円板の食作用に関与している。この特性は、全ての生物種におけるＡＡＶベクターによる光受容体の効率と比較して、ＲＰＥのより高い形質導入効率も説明することができる（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅら，２０１１）。最後に、培養物中でＲＰＥが集密になると、細胞分裂は停止し、従って、ＡＡＶベクターは時間と共に失われないため、長期間にわたって導入遺伝子発現を追跡するが可能となる。

本発明者らが、ＡＡＶ２／５によって媒介される遺伝子導入手法の効率を試験するためにヒトＲＰＥの細胞モデルを使用することができるか否かを判断するために、本発明者らは、コロイデレミアを有する個体の線維芽細胞からｉＰＳｃ由来ＲＰＥを産生した。コロイデレミアは、ＲＰＥ分解が病態生理において重要な役割を担うと思われる網膜ジストロフィーである（Ｋｒｏｃｋら，２００７；Ｔｏｌｍａｃｈｏｖａら，２０１０）。さらに、遺伝子レスキュー研究にとって情報的な疾患特異的動物モデルが存在しないため、それはｉＰＳｃ由来手法のための完璧な候補である（Ｔｏｌｍａｃｈｏｖａら，２０１３；Ｔｏｌｍａｃｈｏｖａら，２０１２）。本発明者らは、コロイデレミア特異的ＲＰＥは特徴的なタンパク質を発現し、機能的であり、かつ患者に見られる生化学的欠陥を模倣する、すなわちコードされるタンパク質（ＲＥＰ１）の非存在により、Ｒａｂタンパク質、特にＲａｂ２７Ａの不十分なプレニル化が生じ、それにより膜結合Ｒａｂの数が減少し、かつ細胞質プールが増加することをここに示す。これにより、機能の回復を評価するための定量的読み出し値が得られた。２つの独立したアッセイを使用して、本発明者らは、ＣＨＭ遺伝子導入により一般に細胞質Ｒａｂ、具体的にはＲａｂ２７Ａのプールを減少させることができた。これにより、ＡＡＶ２／５によって媒介されるＣＨＭ遺伝子導入により正常な細胞表現型を回復させることができるというヒトＲＰＥにおける概念実証を行う。

本明細書に記載されている作業により、適当な動物モデルの非存在下で、概念実証研究のためにヒトの疾患特異的細胞モデルを使用することができることが実証されている。これは、媒体そのものが（異なる血清型に関わらず）網膜を標的とする臨床試験によって既に確認されているという事実によって支援されているため、生体外研究では主に導入遺伝子の機能を評価している。ＡＡＶによって媒介される網膜遺伝子治療の分野が確実に前進し続ければ、この同じ戦略をＲＰＥが冒される数多くのＩＲＤに適用することができ、故に臨床応用が促進される。

冒された網膜の適切なヒト細胞モデルにおいて概念実証を行う本発明者らの手法は、その種の最初の例であり、『前臨床的』思考に革命をもたらした。コロイデレミアのための表現型回復研究のために条件付きマウスモデルを使用すること、および本質的に細胞モデル（ＣＨＭ線維芽細胞およびｉＰＳｃ）に関する概念実証を行うことの難しさを確認する２つの他の記事が公開されている（Ｔｏｌｍａｃｈｏｖａら，２０１３；Ｖａｓｉｒｅｄｄｙら，２０１３）。ここでは、本発明者らは一歩先に進み、ＲＰＥ細胞（すなわち冒される主要な細胞型）における概念実証を行い、故に疾患病因に関与しない細胞型からの推定を回避している。さらに、これらの上記記事では、本発明者らが示すＡＡＶ２／２によって媒介されるＣＨＭ遺伝子治療の効率は、ヒトＲＰＥにおいてＡＡＶ２／５よりも効率的でないと評価されていた。

結論として、これらのデータは、ＣＡＧプロモーターの制御下でＣＨＭ遺伝子を運ぶために本発明者らが使用したＡＡＶ２／５ベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９ベクターよりもコロイデレミアを有する患者のヒトＲＰＥ細胞に対する遺伝子治療のための良好なベクターであるという初めての実証を行うものである。

参考文献
本出願全体を通して参照される各種参考文献には、本発明が属する最先端技術について記述されている。
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Claims (13)

1. ＣＡＧプロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ２／５ベクターを含む医薬組成物であって、それを必要とするヒト対象の眼の網膜色素上皮に形質導入することにより、前記ヒト対象の眼の網膜色素上皮において前記目的のポリヌクレオチドを選択的に発現させることにおいて使用するための、医薬組成物。
2. 前記ヒト対象は、遺伝性もしくは非遺伝性網膜変性症、網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、黄斑変性症、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、錐体杆体ジストロフィー、眼内血管新生疾患、脈絡膜変性症、脈絡膜硬化症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、コロイデレミア、緑内障、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ）および脳回転状網膜脈絡膜萎縮などの代謝異常、網膜剥離または外傷からなる群から選択される前記網膜色素上皮を冒す網膜疾患に罹患しているか罹患する可能性がある、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記目的のポリヌクレオチドは、遺伝子置換療法のために使用され、かつＲＧＲ、ＲＤＨ５、ＲＰＥ６５、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＬＲＡＴ、ＲＥＰ１、ＲＢＰ４、ＥＬＯＶＬ４、ＥＦＥＭＰ１、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＡＩＰＬ１、およびＣＲＢ１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記目的のポリヌクレオチドはＲＬＢＰ１をコードする、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 前記目的のポリヌクレオチドはＲＥＰ１をコードする、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記目的のポリヌクレオチドは神経栄養因子をコードし、好ましくはｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＩＬ−１ｂｅｔａ、ＮＴ−３、ＩＧＦ−ＩＩ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦおよびＲｄＣＶＦからなる群から選択される神経栄養因子をコードする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
7. 前記目的のポリヌクレオチド産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを行う部位特異的エンドヌクレアーゼであり、好ましくは亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）からなる群から選択されるエンドヌクレアーゼである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
8. 前記目的のポリヌクレオチド産物は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
9. 網膜色素上皮を冒す網膜疾患に罹患しているか罹患する可能性があるヒト対象の治療において使用するための、ＣＡＧプロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ２／５ベクターを含む、医薬組成物。
10. 前記ヒト対象は、遺伝性もしくは非遺伝性網膜変性症、網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、黄斑変性症、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、錐体杆体ジストロフィー、眼内血管新生疾患、脈絡膜変性症、脈絡膜硬化症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、コロイデレミア、緑内障、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ）および脳回転状網膜脈絡膜萎縮などの代謝異常、網膜剥離または外傷からなる群から選択される前記網膜色素上皮を冒す網膜疾患に罹患しているか罹患する可能性がある、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記目的のポリヌクレオチドは、遺伝子置換療法のために使用され、かつＲＧＲ、ＲＤＨ５、ＲＰＥ６５、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＬＲＡＴ、ＲＥＰ１、ＲＢＰ４、ＥＬＯＶＬ４、ＥＦＥＭＰ１、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＡＩＰＬ１、およびＣＲＢ１からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
12. 前記目的のポリヌクレオチドはＲＬＢＰ１をコードするポリヌクレオチドであって、かつ前記ヒト対象は網膜色素変性症に罹患しているか罹患する可能性がある、請求項９から１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 前記目的のポリヌクレオチドはＲＥＰ１をコードするポリヌクレオチドであって、かつ前記ヒト対象はコロイデレミアに罹患しているか罹患する可能性がある、請求項９から１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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