JP2017500060A - 対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 - Google Patents
対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017500060A JP2017500060A JP2016557191A JP2016557191A JP2017500060A JP 2017500060 A JP2017500060 A JP 2017500060A JP 2016557191 A JP2016557191 A JP 2016557191A JP 2016557191 A JP2016557191 A JP 2016557191A JP 2017500060 A JP2017500060 A JP 2017500060A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chr
- polynucleotide
- rpe
- cells
- aav2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Virology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
Abstract
Description
MADTLPSEFD VIVIGTGLPE SIIAAACSRS GRRVLHVDSR SYYGGNWASF SFSGLLSWLK EYQENSDIVS DSPVWQDQIL ENEEAIALSR KDKTIQHVEV FCYASQDLHE DVEEAGALQK NHALVTSANS TEAADSAFLP TEDESLSTMS CEMLTEQTPS SDPENALEVN GAEVTGEKEN HCDDKTCVPS TSAEDMSENV PIAEDTTEQP KKNRITYSQI IKEGRRFNID LVSKLLYSRG LLIDLLIKSN VSRYAEFKNI TRILAFREGR VEQVPCSRAD VFNSKQLTMV EKRMLMKFLT FCMEYEKYPD EYKGYEEITF YEYLKTQKLT PNLQYIVMHS IAMTSETASS TIDGLKATKN FLHCLGRYGN TPFLFPLYGQ GELPQCFCRM CAVFGGIYCL RHSVQCLVVD KESRKCKAII DQFGQRIISE HFLVEDSYFP ENMCSRVQYR QISRAVLITD RSVLKTDSDQ QISILTVPAE EPGTFAVRVI ELCSSTMTCM KGTYLVHLTC TSSKTAREDL ESVVQKLFVP YTEMEIENEQ VEKPRILWAL YFNMRDSSDI SRSCYNDLPS NVYVCSGPDC GLGNDNAVKQ AETLFQEICP NEDFCPPPPN PEDIILDGDS LQPEASESSA IPEANSETFK ESTNLGNLEE SSE
TAATAGTCAC ATGACACGTT TCCCGTCAAG ATGGCGGATA CTCTCCCTTC GGAGTTTGAT GTGATCGTAA TAGGGACGGG TTTGCCTGAA TCCATCATTG CAGCTGCATG TTCAAGAAGT GGCCGGAGAG TTCTGCATGT TGATTCAAGA AGCTACTATG GAGGAAACTG GGCCAGTTTT AGCTTTTCAG GACTATTGTC CTGGCTAAAG GAATACCAGG AAAACAGTGA CATTGTAAGT GACAGTCCAG TGTGGCAAGA CCAGATCCTT GAAAATGAAG AAGCCATTGC TCTTAGCAGG AAGGACAAAA CTATTCAACA TGTGGAAGTA TTTTGTTATG CCAGTCAGGA TTTGCATGAA GATGTCGAAG AAGCTGGTGC ACTGCAGAAA AATCATGCTC TTGTGACATC TGCAAACTCC ACAGAAGCTG CAGATTCTGC CTTCCTGCCT ACGGAGGATG AGTCATTAAG CACTATGAGC TGTGAAATGC TCACAGAACA AACTCCAAGC AGCGATCCAG AGAATGCGCT AGAAGTAAAT GGTGCTGAAG TGACAGGGGA AAAAGAAAAC CATTGTGATG ATAAAACTTG TGTGCCATCA ACTTCAGCAG AAGACATGAG TGAAAATGTG CCTATAGCAG AAGATACCAC AGAGCAACCA AAGAAAAACA GAATTACTTA CTCACAAATT ATTAAAGAAG GCAGGAGATT TAATATTGAT TTAGTATCAA AGCTGCTGTA TTCTCGAGGA TTACTAATTG ATCTTCTAAT CAAATCTAAT GTTAGTCGAT ATGCAGAGTT TAAAAATATT ACCAGGATTC TTGCATTTCG AGAAGGACGA GTGGAACAGG TTCCGTGTTC CAGAGCAGAT GTCTTTAATA GCAAACAACT TACTATGGTA GAAAAGCGAA TGCTAATGAA ATTTCTTACA TTTTGTATGG AATATGAGAA ATATCCTGAT GAATATAAAG GATATGAAGA GATCACATTT TATGAATATT TAAAGACTCA AAAATTAACC CCCAACCTCC AATATATTGT CATGCATTCA ATTGCAATGA CATCAGAGAC AGCCAGCAGC ACCATAGATG GTCTCAAAGC TACCAAAAAC TTTCTTCACT GTCTTGGGCG GTATGGCAAC ACTCCATTTT TGTTTCCTTT ATATGGCCAA GGAGAACTCC CCCAGTGTTT CTGCAGGATG TGTGCTGTGT TTGGTGGAAT TTATTGTCTT CGCCATTCAG TACAGTGCCT TGTAGTGGAC AAAGAATCCA GAAAATGTAA AGCAATTATA GATCAGTTTG GTCAGAGAAT AATCTCTGAG CATTTCCTCG TGGAGGACAG TTACTTTCCT GAGAACATGT GCTCACGTGT GCAATACAGG CAGATCTCCA GGGCAGTGCT GATTACAGAT AGATCTGTCC TAAAAACAGA TTCAGATCAA CAGATTTCCA TTTTGACAGT GCCAGCAGAG GAACCAGGAA CTTTTGCTGT TCGGGTCATT GAGTTATGTT CTTCAACGAT GACATGCATG AAAGGCACCT ATTTGGTTCA TTTGACTTGC ACATCTTCTA AAACAGCAAG AGAAGATTTA GAATCAGTTG TGCAGAAATT GTTTGTTCCA TATACTGAAA TGGAGATAGA AAATGAACAA GTAGAAAAGC CAAGAATTCT GTGGGCTCTT TACTTCAATA TGAGAGATTC GTCAGACATC AGCAGGAGCT GTTATAATGA TTTACCATCC AACGTTTATG TCTGCTCTGG CCCAGATTGT GGTTTAGGAA ATGATAATGC AGTCAAACAG GCTGAAACAC TTTTCCAGGA AATCTGCCCC AATGAAGATT TCTGTCCCCC TCCACCAAAT CCTGAAGACA TTATCCTTGA TGGAGACAGT TTACAGCCAG AGGCTTCAGA ATCCAGTGCC ATACCAGAGG CTAACTCGGA GACTTTCAAG GAAAGCACAA ACCTTGGAAA CCTAGAGGAG TCCTCTGAAT AATGGATATA CACCAAACTG GATACCCAAC TTTGGAAATT CTGACTGGTC TCAGAGTCTA CTTGATAGAA GGACTGTTTG AGAAATGTTA GAAAGCAGCA GCAATTATAA GGCAAAATAG GTAATAGAAA TCCAAAAGGG GATTTTCCTT ATAGAGGACA TTCCAAGAAC ACACAACACT TATAAAGCAC ATTGACTTGC TCATTTTAAA TACCAAACTT GTGTGACTAG CAGATGAAAA TTATAAATCA ATTGATTCTC AGGAATGTAA CTGTGGATAT GAAAGTGATC CTATGCATTG TTAATAATTC CATGGTCTTA GGACAATTTT GCTTACCACT TTGGATCTTT GTTTGAAAGC CACATTTTCA GAACCAGCTC ATGTATTTTC TTTGGTTATT TGAATTTTAT TTTCTTTATG GACAAGAGCA TCATAACATA ATGATAAAAA CATATAGAAA AACTAAAGTA TCATGATCTA GATAGAAGCC TGTATTTGGA ATACAGGTTT GTTTTGCTTT CTATGTTGAG AAGCATTGAA AATGCTAATA TAAAGGTGTT TAGACATTTT TACGAATAAG TCAGTAGTGT TTTTTAGTAT CAGTAGTGAT ATTTGTTTGT AAATTATTTA CATATTGGGA AAGGTCAATA ATGAAGAAAT GAAAGAATGG AAGGAAAGGT GTGGATAGGC TCATTGGTAT TTGAATATTC TGTCTGTCAA GTAACTAGAG TATTAGGCTA ATTGTCTACA GACCTAATTT AATCCTGGCT GTCCTACTGA TGATATTTGG TAAATTGTTT AACTTCTGAG CCTACGTTTC TCCATATATA AAGTGGAAAT AGTATTACTA TGCCTACTAT ATGAGAATGG TTATGAAGAC AATGCAATGC CATGTTTAGA ATCGGTTTGC CAGAAGAAAA TTGTTTTAGA ATTTTCCCAT TGACTTGATG AATCTCAAAA GTCTCACGCA GGAAATAATT GCTTGCTGTC AGTCAACTTC CAAACAAAAT AGATCACAGT GTTTTTATTG CATTAAGCTT TTTAAATGAA AATTTCTTTT TTAAAGTAGT ATTTTATAGT CTTACAGACC AGTAAAAATA GTAACAAGTA GAATTGTGGT TTTGAAATATTACTAAGGAA AACACTCTAT AAATTGTTTT ATTCCTTTTC TGGTAGGTAA ACCTGCAACC ACCAAGGACT CCAAATTGTG TATGACAGTT GGTAAGCCCT AATATACACT ACATAAAAAC GTTAGGGCTG CCTGTAATCC CAGCACTTTG GGAAGCTGAG GTGGGTAGAT CACTTGAGGT CAGGAGTTCG AGACCAGCCT GGCCAACATG GCGAAACCCT GTCTCTACTA AAAATACAAA ATTTTAGCTG GGTGTTATGG TGGGCACCTG TAATCCCAGC TACTTTGAAG ATGAGGTAGC AGACTCACTT GAACCAGGGA GGCGGAGGTT GCAGTGAGCC AAGATTTTGC CACTGCACTC CAGCCTGGGT GACAGAGCAA GACTCTGTCT CACAAAAAAA AAAAAAGGGG GCTGTACATA GGCAGCAAAC TAAGCTGCAG TGATGTTGCC TATATTTAAA TTTTCTCAAA TGGCCAAGCT CTGATGGTCT ACTTTATTTG AGCAATAGTT GAGACTTATA ATTGCCTATA AATAAACAAA CAAATGAACT ATTTGTTTTT TTTTCTCACA ACATCTGGCC TATATTGTCT GTCAGGAAGC CATGGCTCCA ATGTAAAGTA CATAGTTCTT ACATACTTCA ACTGCAGCTG GTCCCTGACC TCACCAGGTT TCAGAGATGT TCTTAAAGGA AGCCAGCTGT GGCAGGTCAC AGATTCATGG GAAATGGAAA GAACCAAGGA ATATAGCTCT TGCCTCACCT TTCTACCCAC TGCAGATATA GTTCAAGCCA GAGTAATGGA AGAACTTAAC TTACTAGCCT CTCAGGCTGC TCCTATCCCT ACCTCCCAGT GTACAGCCCC TCCCCATCTC TTTAGTCCCC TTTCCCTCAC TTCCCCTTTT ATAATGTCAC ACAAATCAGG GACAGTAGGA TCACATTATA ACCTACTTTG TCATAGGGAT TCGATTTTTC TTATATCAAA TCATGTTTCC TGAAACCCAG CTGGGGCATA TGCACTCAAT GTCTAATACA TACTTATTAA TGTACCGGAT ATTGGCCTTG CCCCTGGATA TCAGCAATAT ATTATAAAAG GTTCCAGTAG ATGAGACGAT TGAGTCTGAA TACAATTGCA GTAAATTGTG CCAATAAAGA TATTGTACTG TTACGGTCTT AGAGTTAAAG CCGCTTGAAT GCAGCATGCA CATTCATGTA AACAGACAAT CAGGGTAGGC CTAGAATAAC CACAAAAATT CTATTGGCCT TACTGCAGCC ACCTATATGT AGAACAATGG AGGAGATAGT TTGTGGTCCA TTATTGTACC CTGTTTCATC CATTAGCATC AGAATCTCTC TTTCAGGTCA TTTATTAAAT ATGATTGAAA TGTTTAAAAG TTCCTGAACA TGATTCATGA TGATTAAAAT ATCATACAAC TGATAAAAGA CTTTAAGAAC TTTATATATT TCCTGTTGCC TCAAAATGTA ACAGAAATTA TTCTTAGAGC TTTGATTTTA GCTATCCTAA TTACTGCAAA TAAATATTTG TTCTTATAGT TTTAAATCAA AAAGAAAAGT CTTGTTATAA AACCTTAAGC TTGAAATCAT ATTAATAAAA TATATTGTAC ATAGTGGAAA ATTTTCAGTA GCTAATTTAA AATTTCAGAA AATGCTATTA AAGAATTTTG ATTCAAGTAT TTAAACTGTT TAGTTATGCA TGCTTCTTAT TAACCGAAAA TGATAATACC ATTTAGTTTA GTGATCAGTA TGAGAAGCAA TACCTAATCC TATGTTGCTA TTGTATTTTT TCCTAGTTGG TGTGCCTGCT CAGAAAAACA TATACTGTAT GTGTATACAT ACCTGTGTAT ATATAAAAGG TCAATTTATA TATTTTTCTA TAGGAAAATG GAGTAACAAG TTCCCTATCT CCCATATTTA TTTGTCCATA GTAAAATGGC CACATTGATG ATAATTTCTA GAACTAGTTT CTGAGATTGT CAGCCCTTTG TCTAAAATAA TGGCAGTATT AATGATTGAC TTCTGTCACT GCCATAGTTA CCTGGATTGT CAGCCTTGGT AGCCTTTGTC TAAAGTCCTA AAGAGTTCCA AAAAAAATGT GTTGAAATTT AATTGCTAAA TAGTGGTTGG TGATTCTTTA CAGTAGGAAT TGTAATAATT TTCTTGCAAA TAAGTTATTT ACTGCTATTG ATATTGAATA ATTTGTCTTT TATTCAGATA TATTTCAAAA AGCATGAATA TATGATTATT CATAAATTGT ATACTTTACC AGTAAGTTTT CAGAGGAAAT AAAGACTTTT AAATCCTTTT CA
皮膚線維芽細胞の単離および増幅
16歳の少年の上腕内側(CHM1と称す)に対して、the Centre of Reference for Genetic Sensory Disorders(CHRU Montpellier)におけるコロイデレミアの確定分子診断(RT−PCR(Klinkum der Universitat、ドイツのレーゲンスブルク)によりCHMのエクソン8の欠失を同定)と共に、無菌条件下で皮膚生検を行った。皮膚生検組織をPBS中で洗い流し、切断して小片にし、10%の補体除去された(decomplemented)FCS(Lonza社、ベルギーのヴェルヴィエ)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンB(Lonza社)および2%AmnioMax C100サプリメント(Invitrogen社、Life Technologies社)を含有するL−グルタミンを含むAmnioMAX C100基本培地(Invitrogen社、Life Technologies社、フランスのサン・トーバン)を入れた35mmの培養皿(1皿当たり2片)において5%CO2下37℃で培養した。新たに出現した線維芽細胞が80%の集密に達したら、生検組織を新しい皿に取り出した。この生検組織を全部で4回移し、各別個の培養物からのP1〜P5の範囲の細胞を、10%DMSOを含有するFCS(Sigma Aldrich社、フランスのサン・カンタン・ファラヴィエ)中で凍結した。
製造業者の指示に従い、DNeasy Blood & Tissueキット(Qiagen社、フランスのレ・ジュリス)を用いて、初代線維芽細胞からゲノムDNAを単離した。CHM患者が保有するCHMにおけるエクソン8の欠失の境界を定めるために、1.6kbのゲノムDNAの5’側からエクソン8にわたって分布する3つのプライマー対、および38kbの3’側からエクソン8にわたって分布する8つのプライマー対を、標準的な条件を用いる対照および患者のDNAのPCR増幅のために試験した。間隔の減少が確立されたら、エクソン8の78bp上流に位置するイントロン7Fプライマー(5’−TTC−ATC−TCC−TTT−TTG−TGG−GG−3’)(配列番号1)およびエクソン8の362bp下流に位置するイントロン8Rプライマー(5’−CTG−GAA−ACA−TCC−TGT−GTT−CAT−C−3’)(配列番号2)を使用して、666bpのゲノムDNA断片を増幅させ、Applied Biosystems社製3130xLジェネティックアナライザー(Applied Biosystems社、米国カリフォルニア州フォスターシティ)上でのBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionキットV3.1を用いるシークエンシングの前に、ExoSAP-IT PCR Clean-upキット(GE Healthcare社、フランスのヴェリジー=ヴィラクブレー)を用いて精製した。
エクソン7、8および9のPCR増幅のために3つのプライマー対を使用して、異なる細胞型からのゲノムDNAにおけるCHM欠失の存在について試験した。エクソン7のためのプライマー対で493bp断片を増幅させ、エクソン8のためのプライマー対で177bp断片を増幅させ、エクソン9のプライマー対で975bp断片を増幅させた。製造業者の指示に従い、QiaShredderおよびRNeasyミニキット(Qiagen社)を用いて異なる細胞型からRNAを単離した。単離されたRNAをリボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼ(Qiagen社)で処理し、SuperscriptIII逆転写酵素キット(Life Technologies社)を用いて逆転写した。対照cDNAからの559bp断片および患者cDNAからの333bp断片を表すエクソン7〜11のPCR増幅により、CHM欠失の存在または非存在を確認した。
Completeプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット(Roche社、フランスのメラン)を含有する冷たいPBSの中に細胞を掻き落とし、200gおよび4℃で5分間遠心分離した。このペレットを、ベンゾナーゼ(Sigma Aldrich社)を含有する2×Laemmliの試料緩衝液(Biorad社、フランスのマルヌ=ラ=コケット)に再懸濁した。溶解物のタンパク質濃度をPierce BCAタンパク質アッセイキット(ThermoFisher Scientific社、フランスのグラフェンスタデン)を用いて測定し、この溶解物をAnyKD MiniProtean TGX Stain Freeプレキャストゲル(Biorad社)上にロードした。分離されたタンパク質をTrans−Blot(登録商標)Turbo(商標)ミニPVDF転写パックおよびシステム(Biorad社)を用いて電気泳動転写した。0.5%Tween−PBSを含む5%スキムミルク(ブロッキング溶液)中で1時間ブロッキングした後、この膜を1/1000希釈のモノクローナルマウス抗REP1抗体(クローン2F1、Millipore社、フランスのサンカンタン・アン・イヴリーヌ)のブロッキング溶液と共に室温で1時間インキュベートした。0.5%Tween−PBSで3回洗浄した後、このフィルタをマウス全免疫グロブリン(Life Technologies社)に対する1/10000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヒツジ抗体と共にインキュベートした。Amersham ECL Primeウエスタンブロット検出試薬(GE Healthcare社)を用いて、検出工程を行った。
ドキシサイクリン誘導性転写因子c−MYC(FUW−tetO−hMYC、プラスミドID:20723)、SOX2(FUW−tetO−SOX2、20724)、KLF4(FUW−tetO−KLF4、20725)、OCT4(FUW−tetO−OCT4、20726)、リバースドキシサイクリン制御性トランス活性化因子M2rtTA(FUW−M2rtTA、20342)およびGFPを含むレンチウイルス系プラスミド(FUGW、14883)を、Addgene社(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)から購入した。レンチウイルス産生プラットフォーム(フランスのモンペリエ)により、レンチウイルスベクターを産生した。FUGWの感染力価を計算すると1010TU/mlであった。残りのウイルスの感染力価は、それらのP24濃度をFUGWの濃度と比較して、FUW−tetO−hMYCは2×109TU/ml、FUW−tetO−SOX2は7×109TU/ml、FUW−tetO−KLF4は8×109TU/ml、FUW−tetO−OCT4は3×109TU/ml、FUW−M2rtTAは9.8×109TU/mlと推定した。
ヒト新生児包皮線維芽細胞をATCC(hFF−1、LTC standards社、フランス)から購入した。10%FCSを添加し、かつCegelec BloodXrad照射器(Etablissement Francais du Sang、フランスのモンペリエ)を用いて35グレイの線量を照射したGlutamaxを含有するDMEM(Gibco社、Life Technologies社)中で細胞を培養した。フィーダー細胞を2.5×105細胞/35mmプレートの密度で播種した。
リプログラミングを開始する前に、GFPをコードするFUGWベクターを用いて、形質導入実験に適したMOIを計算した。次いで、0日目に、10%FCSおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンBを添加したGlutamaxを含有するDMEMを入れた6ウェルプレートの1ウェル当たり105細胞の密度で、CHM患者の線維芽細胞を6ウェルプレートに播種した。1日目に、8μg/mlポリブレンの存在下で、5種類のウイルスを用いて1ベクター当たり10のMOI(総MOIは50)で細胞に形質導入した(リプログラミング実験のために対照FUGWベクターは使用しなかった)。2日目に、これらの細胞をPBSで洗い流し、新しい培地を添加した。5日目に、この培地を新しくして、2μg/mLのドキシサイクリンを添加した。6日目に、形質導入細胞を0.25%トリプシン(Gibco社)で解離し、1つのウェルからの細胞を、フィーダー細胞層(1/4希釈)を含む4つのウェルに分けた。これらの細胞を20%KO血清代替物(Gibco社)、200mMのL−グルタミン(Gibco社)、1%非必須アミノ酸(Gibco社)、0.1%B−メルカプトエタノール(Gibco社)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco社)、および、2μg/mlのドキシサイクリン(Sigma Aldrich社)を含有する10ng/mlの□FGF(Peprotech社、フランスのヌイイ=シュル=セーヌ)を添加したES培地(KO−DMEM(Gibco社))で培養し、この培地を毎日交換した。Lynx実体顕微鏡(Vision Engineering社、フランスのLe Plessis Pate)下で、得られたiPScを、ES培地中にフィーダー細胞を含む35mmプレート上でメスを用いて機械的に継代した。
iPScを10μMのROCK(Rho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/トレオニンキナーゼ)阻害剤(Y−27632、Sigma Aldrich社)により37℃で1時間事前処理し、次いで、1×TrypLE Select(Gibco社)により37℃で10分間酵素解離した。解離細胞を、フィーダー細胞層を含む10cmのプレートに5000細胞/cm2の密度で播種し、継代後ROCK阻害剤を含むES培地で24時間培養した。注射前に細胞を酵素的に5回継代した。解離細胞を200μlの注射当たり2×106細胞の濃度で30%BDマトリゲル基底膜マトリックス(BD Biosciences社、フランスのル・ポン=ド=クレ)を含むES培地に再懸濁した。実験動物の管理と使用に関する欧州および国家指針(欧州議会および理事会指令2010/63/EU)に準拠し、かつ施設および地域倫理委員会によって認可されている(認可番号:CEAA−LR−12157)動物育種および実験を行った。NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウス(Charles River社、フランスのラルブレル)を35mg/kgのケタミン(Merial社、フランスのリヨン)および14mg/kgのキシラジン(Bayer Healthcare社、フランスのロース)で麻酔し、左右の後側腹部の毛を剃り、27ゲージ針を取り付けた1ml注射器を用いて200μlの細胞混合物を皮下注射した。対照として、細胞を含有しないか以前に特性評価した野生型iPSc(M4C7、(Ramirezら,2013))からの細胞を含有する30%マトリゲル/ES培地をマウスに注射した。これらのマウスを個別換気ケージに収容し、腫瘍が最大1cm2の大きさに到達したら安楽死させた(注射後約2ヶ月)。腫瘍を切開し、PBSで洗い流し、3.7%ホルムアルデヒドで固定し、かつパラフィンで包埋した。4μmの切片をヘマトキシリン−エオシンで染色し、かつ3種類の胚葉の存在について分析した。
iPScをRPEに分化させるために、本発明者らは小さい修正を伴う先に記載した自然発生的手順(Liaoら,2010)を使用した。簡単に言うと、iPScコロニーをフィーダー細胞上で集密になるまで増殖させ、次いで□FGFをES培地から除去した。この培地を分化プロセス中に毎日交換し続けた。□FGF枯渇後その月にわたって着色された病巣が現れ、これらを手で切開した。1つのプレートからの病巣を貯蔵し、0.25%トリプシンで解離し、マトリゲル(1:30で希釈)でコーティングした24もしくは6ウェルの培養皿に播種し、FGF枯渇ES培地で培養した。集密した単層に達すると、細胞は着色された多角形の形態になり、培養物中に長期間維持することができた。細胞をトリプシン解離によって継代し、必要に応じて増幅させた。第3継代(P3)において全ての分析をRPEに対して行った。流体で満たされたドームをSteREO Discovery V2.0 顕微鏡(Carl Zeiss S.A.S社、フランスのル・ペック)で観察した。
高密度の0.4μMの孔を有する半透明のBD Falcon細胞培養インサート(BD Biosciences社)上でRPEを継代した。特徴的な形態に達したら、フィルタをチャンバから取り外し、3.3%グルタルアルデヒドで固定し、2%四酸化オスミウムで後固定し、エポキシ樹脂で包埋した。半薄(700nm)切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察した。70nmの切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、Hitachi H7100透過電子顕微鏡(Centre Regional d’Imagerie Cellulaire(CRIC)、フランスのモンペリエ)を用いて可視化した。
免疫蛍光研究のために、iPScおよびRPEをプラスチック製の96ウェル皿に播種し、線維芽細胞をガラス製カバーガラス上に播種した。全ての細胞型を3.7%ホルムアルデヒドで固定し、5%ロバ血清/1%BSAでブロッキングした。0.2%Triton x-100または0.05%サポニンで細胞を透過処理した。適当であればDako蛍光マウント培地(Dako France S.A.S.社、フランスのレ・ジュリス)に載せる前に、一次抗体を切片上で4℃で一晩インキュベートし、二次抗体を0.2μg/mlのbisBenzimide Hoechst(Sigma−Aldrich社)および1ng/mlのファロイジン−TRITC(Sigma−Aldrich社)と共に室温で45分間インキュベートした。iPScのために使用した一次抗体は、1:5希釈のラットIgM抗ヒトSSEA3(Developmental Studies Hybridoma Bank、アイオワ大学、米国アイオワ州アイオワシティ)および1:10希釈のヤギ抗ヒトNANOG(R&D Systems Europe、フランスのリール)であった。RPEのために使用した一次抗体は、1:100希釈のウサギ抗ヒトZO−1(Invitrogen社、Life Technologies社)、1:250ウサギ抗ヒトMERTK(AbCam社、英国ケンブリッジ)、1/150希釈のマウス抗ヒトRPE65(AbCam社)および1:1000のマウス抗ヒトCRALBP(組換えタンパク質に対する抗体、Agrobio社、フランスのラ・フェルテ=サン=トーバン)であった。線維芽細胞のために使用した一次抗体は、1/500希釈のマウス抗ヒトREP1(Millipore社)であった。全てのための二次抗体は、1:800希釈のロバ抗マウスIgM−Alexa594もしくは−Alexa488または1:1000希釈のロバ抗マウス、抗ウサギもしくは抗ヤギIgG-Alexa Fluor 594もしくは−Alexa 488(Molecular probes社、Invitrogen社)であった。食作用研究のために、細胞を、1個の細胞当たり160ビーズの量の1μmの直径の黄色−緑色(505/515nm)のカルボン酸修飾されたミクロスフェア(FluoSpheres、Molecular probes社、Life Technologies社)と共にインキュベートした。Zeiss 5 live duo高速/スペクトル共焦点顕微鏡を用いて細胞を観察し、対応する画像収集ソフトウェア(Carl Zeiss S.A.S.社、Montpellier RIOイメージングプラットフォーム)を用いて画像収集を行った。
定量的RT−PCR(qPCR)を使用して、形質導入された線維芽細胞における外来性導入遺伝子の発現ならびにiPScにおける外来性導入遺伝子のサイレンシングおよび内因性多能性遺伝子の活性化を分析した。RNA単離およびcDNA合成後に、遺伝子特異的プライマー(別記、表)およびLightCycler(登録)480 IIサーマルサイクラー(Roche社)上のLightCycler(登録商標)480 SYBR Green I Master Mixを用いてqPCR増幅を行った。遺伝子発現をGAPDH発現に対して正規化した。LightCycler(登録商標)480ソフトウェアおよびマイクロソフトエクセルを用いて結果を分析した。RPE特異的マーカーの発現を遺伝子特異的プライマーによる古典的なRT−PCR増幅を用いて分析し、かつ2%アガロースゲル上で増幅産物を分析した。
24ウェルプレートのウェルで培養したRPEを冷たいPBSで洗浄し、抗プロテアーゼを含有するPBSの中に掻き落とし、ペレット化し、先に記載したように新しく調製した冷たい脱気したプレニル化/溶解緩衝液に再懸濁した(Wuら,2007)。細胞を氷上で15分インキュベートし、次いで40ヘルツで45秒間の超音波処理を3回行った。次いで、これらの細胞を1500gおよび4℃で5分間遠心分離し、上澄みを回収し、さらにOptima MAX-TL超遠心分離器(Beckman社、フランスのVillepinte Roissy)で450000gおよび4℃で30分間遠心分離した。プレニル基ドナーとして5μMのビオチンで標識したゲラニルピロリン酸(B−GPP)(Euromedex、フランスのゾウフェルヴァイヤースハイム)、0.5μMの組換えREP1(Euromedex社)、0.5μMのRabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ(RGGT、Euromedex社)および20μMのGDPを含むプレニル化/溶解緩衝液を用いて、新たに調製した溶解物に対して生体外プレニル化アッセイを37℃で1時間行った(Nguyenら,2010;Wuら,2007)。プレニル化反応物を6×SDSで失活させ、90℃で5分間沸騰させ、ウエスタンブロットで分析した。この膜を1:5000のHRP結合ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch社、英国ケンブリッジ)または1:50000のマウス抗β−アクチン(Sigma Aldrich社)と共にインキュベートした。ChemiDoc MPイメージングシステム(Biorad社)を用いて検出を行い、ビオチン−ゲラニルの取込みの程度を適当なソフトウェアパッケージ(Image Lab、Biorad社)を用いる走査デンシトメトリーにより定量化し、β−アクチンシグナルの関数として表した。相対的比較を可能にするために、CHMのRPEにおけるビオチン取込み量を100%に設定した。
24ウェルプレートのウェルからのペレット状のRPE細胞を、50mMのTris−HCl(pH7.5)、150mMのNaCl、2mMのMgCl2、0.5mMのEGTA、0.5mMのEDTA、5mMのDTT、0.1mMのGDPおよび記載されているタンパク質阻害剤(Seabraら,1995)を含有する3体積の細胞内画分溶解緩衝液(SFLB)中で完全にホモジナイズした。このホモジネートを800×gおよび4℃で遠心分離し、ペレットを破棄し、上澄みを450000×gおよび4℃で1時間超遠心分離して、細胞質画分および膜画分を得た。超遠心分離後に、ペレットを1%Nonidet P-40 (Sigma Aldrich社)に調整した1体積のSFLBに再懸濁した。細胞質の上澄みのタンパク質含有量および1%Nonidet P-40可溶化膜画分をウエスタンブロット分析で分析した。これらの膜を1:250のマウス抗Rab27A(AbCam社)または1:50000のマウス抗β−アクチン抗体と共にインキュベートした。細胞質および膜のRab27Aレベルをβ−アクチンローディングコントロールに対して定量化し、各ウェルについて総Rab27A含有量の割合として表した。
ウイルスベクター産生プラットフォーム(フランスのナント)により、この作業で使用するAAVベクターを産生した。簡単に言うと、293個の細胞の一過性形質移入によりウイルスベクターを産生し、PEGを用いてウイルス粒子を上澄みから沈殿させるか、AAV2/4および−2/5ベクターの場合は、硫酸アンモニウムを用いて細胞ペレットから沈殿させた。これらのベクターを二重CsCl遠心分離により精製し、透析し、ドットブロットアッセイにより滴定した。形質導入効率実験のために、CMVプロモーターの制御下でEGFPを発現しているAAVベクターの力価は、AAV2/2−CMV−EGFPが3.5×1012ベクターゲノム(vg)/ml、AAV2/4−CMV−EGFP(Dr.F.Rollingを介して提供、Inserm UMR 1089、ナント)が3×1011vg/ml、AAV2/5−CMV−EGFPが3.3×1012vg/ml、AAV2/8−CMV−EGFPが9×1012vg/ml、AAV2/9−CMV−EGFPが2.55×1012vg/mlであった。概念実証実験のために、CAGプロモーター(CMVエンハンサーを有するニワトリのβ−アクチンプロモーター)の制御下でCHM遺伝子(米国ペンシルベニア州ペンシルバニア大学J.Bennett教授によって提供)またはEGFP遺伝子(ナントウイルスベクター産生プラットフォームによって提供)のいずれかを保有するAAVプラスミド使用して、以下のベクター:AAV2/5−CAG−CHM(4.4×1012vg/ml)およびAAV2/5−CAG−EGFP(2.34×1012vg/ml)を産生した。
形質導入効率実験のために、iPSc由来RPEを96ウェルプレートに播種し、集密時では1ウェル当たり2×105個の細胞と推定した。最小体積(50μl)の□FGF枯渇ES培地中に25000vg(最も低い力価を有する血清型により規定)で細胞に6時間形質導入して、ベクターと細胞との相互作用を促進させた。次いで、これらのウェルに予備の培地を補充し、これらの培地を3〜4日ごとに交換した。所望の時点で、細胞を0.25%トリプシンで解離し、3.7%ホルムアルデヒドで固定し、形質導入から48時間、1週間、2週間、4週間および6週間後に、EGFPを発現している細胞の数をBD FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences社)を用いて分析した。実験を2回ずつ行った。導入遺伝子発現実験のために、2×104個の線維芽細胞をカバーガラスのある24ウェルプレートに播種した。100000vgのAAV2/5−CAG−CHMを用いて播種から24時間後の細胞に48時間形質導入した。同時に、カバーガラスのないウェルに、フローサイトメトリー分析のために当量のMOIのAAV2/5−CHM−EGFPを用いて形質導入した。概念実証実験のために、iPSc由来RPEを24ウェルプレートに播種し、集密時では1.2×106個の細胞と推定した。100000のMOIで細胞に形質導入し、形質導入から4週間後にプレニル化アッセイを行った。実験を3回ずつ行った。
8週齢の雄のC57BL/6Jマウス(Harlan France SARL、フランスのガナ)を70mg/kgのケタミンおよび28mg/kgのキシラジンで麻酔し、各眼に0.5%トロピカミド(Mydriaticum社、フランスのThea)を1滴注して瞳孔を散大させた。角膜を一滴のLacryvisc(Alcon社、フランスのリュエイユマルメゾン)およびガラス製カバーガラスで覆った。外科用顕微鏡下で、最初に角膜と強膜との接合部において眼を穿刺した。その後、5μlのHamilton社製注射器および傾斜つき(bevelled)34G針を用いて網膜下注射を行った。これらの眼に2μlのPBSまたは4.68×109vgのAAV2/5−CAG−CHMまたはAAV2/5−CAG−EGFPのいずれかを含む2μlのPBSを注射した。これらの眼を眼底検査により一定間隔で(注射から2、4、6および8週間後)追跡した。各時点でマウスに麻酔をかけ、瞳孔を散大させ、MicronII網膜イメージング顕微鏡(Phoenix Research Laboratories社、米国カリフォルニア州プレザントン)を用いて眼底写真を撮った。先に記載したように屠殺前に網膜電図研究を行った(Chekroudら,2011)。Kruskall Wallis ANOVAを用いて統計比較を行い、Siegel-Castellanの2×2比較(Siegel&Castellan,1988)を用いて事後比較(post−hoc比較)を行った。
注射から2週間後にマウスを屠殺し、それらの眼から眼球を取り出し、眼球の前部を除去した。ウエスタンブロット分析のために、神経網膜を切開し、溶解緩衝液(50mMのTris(pH6.8)、10%グリセリンおよび2%SDS)にそれぞれ入れた。その後、RPEおよび脈絡膜を鉗子を用いて溶解緩衝液の中に掻き出して、神経網膜と共に貯蔵した。総タンパク質試料の一部(7.5%)を遊走させ、移し、上記のような抗REP1または1/2000希釈のウサギ抗EGFP血清(Molecular probes社、Invitrogen社)とハイブリッド形成させた。q−PCR分析のために、RNA単離およびcDNA合成前に神経網膜およびRPE/脈絡膜試料を急速凍結させた。L27遺伝子発現に対して正規化された遺伝子特異的プライマーを用いて、Q−PCR分析を行った。
EGFP発現をアッセイするために、それらの眼から眼球を取り出し、3.7%ホルムアルデヒドで4℃で6時間固定し、OCTマトリックスへの包埋および14μMでの切片化前に、10%、20%、30%および40%スクロースの連続浴中でインキュベートした(Reseau d’Histologie Experimentale de Montpellier(RHEM))。組織構造をアッセイするために、それらの眼から眼球を取り出し、3.7%ホルムアルデヒドで4℃で24時間固定し、連続的なエタノール浴で脱水し、パラフィンで包埋し、かつ4μmで切片化した(RHEM)。光受容体の計数のために、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。スライドスキャナー(Hamamatsu Photonics社、日本、Montpellier RIOイメージングプラットフォーム)で顕微鏡画像を取得した。1つの網膜当たり少なくとも4つの矢状方向切片を計数し(注射状況は不明)、光受容体の核の数を平均した。
患者突然変異の特性評価
患者CHM1の線維芽細胞からのゲノムDNAの特性評価により、エクソン8の開始点の40bp上流に位置するイントロン7において7bp(TAGTTCT)(配列番号3)配列の重複が明らかとなった。重複配列の間には4bpの挿入(GATT)(配列番号4)が存在した。この第1の重複に続いて、その開始点の68bp後方に位置するエクソン8(GTCATGCATTCAATT)(配列番号5)内に15bpの配列の第2の重複が存在した。イントロン7の終了点およびエクソン8の開始点を含む2つの重複の間に位置する97bpのDNA配列は欠失していた。イントロン7受容スプライス部位の喪失およびその後のエクソン8の欠失により、アミノ酸位置314における予測されたフレームシフトと、REP1の第2のGDP解離阻害因子(GDI)ドメインを切断する位置332(野生型REP1は653aaである)における未熟終止コドンが生じた。野生型および切断型REP1(73.49kDa)の両方ならびにREP2(74.08kDa)中に存在するN末端エピトープに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析により、対照細胞の2つのバンドおよびCHM細胞(REP2に対応)の1つのバンドが検出され、これは、切断型タンパク質が不安定であることを示している。第2のREP1特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析により、対照細胞とは対照的にCHM1細胞においてタンパク質は検出されなかった。
本発明者らは、CHM1線維芽細胞のリプログラミングのために、山中転写因子カクテル(c−MYC、KLF4、OCT4、SOX2)を運ぶドキシサイクリン誘導性レンチウイルスベクターを使用した。本発明者らは、qPCR研究により、ドキシサイクリン誘導から24時間後に各導入遺伝子の発現を確認した。ドキシサイクリン誘導から1週間後に、線維芽細胞は、時間と共に現れて消える部分的にリプログラミングされたコロニー(前駆iPScコロニー)を有する形態に変化し始めた。対照的に、ドキシサイクリン誘導から5週間後に、形態学的に特徴的なコロニーが検出され、これによりドキシサイクリンを含まないES培地への機械的継代が残存した。CHM1 iPSc DNAのPCR増幅により、元のCHM欠失が存在し、かつ野生型およびCHM1 iPSc RNAから産生されたcDNA断片間の226bpの差異によって明らかなように、それがmRNAからのエクソン8の完全な欠失を引き起こすことが分かった。さらに、CHM1 iPScは、核型分析によって示されるように、リプログラミング中に生じ得るどんな大きな染色体異常も示さなかった。
本発明者らは自然発生的分化手順を使用して、野生型M4C7およびCHM1 iPScから網膜色素上皮(RPE)を産生した。iPScを集密まで培養し、かつbFGFを培地から除去してから約30日後に、プレート内に着色された病巣が現れた。これらの病巣を機械的に継代し、集密時にRPEに特徴的な多角形の着色された細胞の層が形成された。半透明の多孔性フィルタ上に細胞を播種することにより、切片化および組織学的分析が可能となった。半薄切片の観察により、細胞層が規則的な単層であることが実証された。透過電子顕微鏡法により、この単層が頂端側に微絨毛を有し、かつ基底側に核を有し、細胞質メラノソームおよび密着結合を示す接着斑を有する極性上皮であることが分かった。上皮は、RPE細胞とマトリゲルコーティングとの間で検出可能な基底膜を分泌しているように見えた。RT−PCR研究により、iPSc由来上皮が、視覚サイクル(RLBP1、RPE65、LRAT、RDH5など)、網膜発生(PAX6)、食作用(MERTK)、色素沈着(TYR)、イオン輸送(BEST1)および細胞接着(ZO−1)のための古典的な遺伝子を発現することが実証された。さらに、IF研究により、それらのそれぞれの役割に応じて、MERTKは頂端の微絨毛(図4F)、CRALBPおよびRPE65は細胞質、ZO−1は頂端の接合部に局在化していることが分かった。さらに、接着斑の存在は陽性のZO−1標識化と一致していた。この古典的なRPE形態に加えて、生体内機能のうちの2つもiPSc由来RPEにおいて保存されていた。第1に、時間と共に、様々な大きさの流体で満たされたドームがプレート内に現れた。これらは、RPEを培養皿から持ち上げる頂端側から基底側への流体輸送により形成されたと思われる。第2に、RPEはFluoSpheresを貪食することができ、これを落射蛍光顕微鏡により検出することができた。FACS分析により、内部に取り込まれる球体の量が時間と共に増加することが分かった。最後に、元のCHM突然変異はDNAおよびRNAレベルで存在し、REP1はCHM1のRPEに存在しなかった。
個体のCHM1からのiPSc由来RPEが患者の生化学的欠陥を再現するか否かを判断するために、本発明者らは2つの異なる技術を準備し、細胞内Rabのプレニル化状態、REP1の活性の反映をアッセイした。第1に、本発明者らは、生体外プレニル化アッセイを用いて、細胞における非プレニル化Rabプールの大きさをアッセイした。この目的のために、本発明者らは、組換えRGGT、REP1およびビオチン化プレニルドナーを野生型およびCHM1細胞の溶解物に添加した。従って、プレニル化のために非プレニル化Rabプールが利用可能であれば、HRP結合ストレプトアビジンを用いるウエスタンブロット分析により一体化されたビオチンを検出することができる。ビオチン化Rabに対応する検出されたバンドを□−アクチンローディングコントロールに従って正規化し、CHM1のRPEにおいて検出されたプレニル化Rabプールを100%に設定して相対的比較を可能にした。平均して、約4倍低いレベルのビオチン化Rabタンパク質が野生型RPEにおいて検出され、これは、REP1およびREP2の存在下で大部分のRabがプレニル化され、かつ膜に結合されているという事実と一致している。第2に、本発明者らは、網膜において高発現されるRabタンパク質であるRab27Aの細胞内分布を特異的にアッセイした(Seabraら,1995)。分画遠心分離により、本発明者らは、野生型およびCHM1細胞溶解物の細胞質画分および膜画分を分離し、特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析によりRab27Aのそれぞれの含有量を分析した。プレニル化アッセイに関しては、各画分中のRab27Aの量をβ−アクチンローディングコントロールに従って正規化した。その後、各細胞溶解物中のRab27Aの総量(細胞質+膜)を100%に設定し、各画分中の量を総Rab27A含有量の割合として表した。野生型細胞では、細胞質Rab27Aの量は膜に結合した量よりも平均して約4.7倍低かった。対照的に、CHM1のRPEでは、細胞質Rab27Aの量は野生型細胞で観察される量よりも平均して約2倍高く、膜に結合した量よりも約1.8倍低かった。
本発明者らがAAVベクターを用いてiPSc由来RPEに形質導入することができるか否かを判断し、かつ最も効率的な血清型を確認するために、本発明者らは、CMVプロモーター:AAV2/2、−2/4、−2/5、−2/8および−2/9の制御下でEGFPを発現しているベクターのパネルを試験した。第1に、EGFP発現によって判断されるように、全ての血清型によりiPSc由来RPEに形質導入することができ、形質導入効率は用量依存的であった。第2に、当量のウイルスゲノムでは、各血清型の効率は2/5>2/2>2/4>2/8/>2/9であった(図1a)。注目すべきことに、平均してAAV2/5ベクターの発現はAAV2/2よりも1.5倍高く(1.45±0.26、n=5)、AAV2/8および2/9の両方よりも約6倍高かった。これらの4種類の血清型の用量依存的効果を調べるために、本発明者らは、1つの細胞当たりのウイルスゲノムの数を100000まで増加させた。AAV2/5の形質導入効率はEGFP陽性細胞の55%から80%に増加したが、AAV2/2およびAAV2/8もしくは2/9の形質導入効率は、それぞれ約1.5倍および6倍低いままであった(図1b)。さらに、本発明者らは、最も効率的な血清型(AAV2/5)を使用して2種類の異なるプロモーターCMVおよびCAG(CMVエンハンサーを有するニワトリβ−アクチン)の有効性を比較した。平均して、CAGはCMVよりも2倍高いレベルの発現を誘導した(2.04±0.21、n=5、図1a)。第3に、経時的実験により、形質導入から4週間後に発現がピークとなることが示唆された(図1c)。最後に、iPSc由来RPEの遺伝子型(すなわち野生型およびCHM)は、形質導入効率に影響を与えなかった(図1d)。
従って、本発明者らは、CAGプロモーターの制御下でCHMを発現するAAV2/5ベクターを産生した。AAV2/5−CAG−CHMにより形質導入されたCHM1線維芽細胞のIF研究により、コードされたREP1が発現され、細胞質において主として小胞の染色として正確に局在化されていることを確認した(図2a〜図2c)。形質導入された線維芽細胞のウエスタンブロット分析(図2d)、次いでβ−アクチンレベルに正規化されたREP1発現の半定量化により、REP1発現が野生型の約17%に等しいことが分かった。同時にウエスタンブロットデータに従い、本発明者らは、AAV2/5−CAG−EGFPを用いて線維芽細胞に形質導入し、フローサイトメトリーによりEGFP陽性細胞の14%を検出した。一貫して、AAV2/5−CAG−CHMによるRPEの最初の形質導入実験、次いでウエスタンブロット(図2e)および半定量化分析により、REP1発現がEGFP陽性細胞の40%に対して野生型の53%に等しいことが分かった(AAV2/5−CAG−EGFPにより形質導入されたRPE細胞のフローサイトメトリーにより決定)。
次いで、AAV2/5−CAG−CHMベクターを用いてCHM1のRPEに形質導入し、経時的実験の結果に基づき、形質導入から4週間後にREP1活性を分析した。代表的な実験は図3aに示されている。上記のとおり、プレニル化実験では、ビオチン化Rabの検出されたプールを100%に設定した。AAV2/5−CAG−CHMベクターによるCHM1のRPEの形質導入後に、ビオチン化Rabタンパク質の量の4.5倍の減少があり、これは野生型RPEにおけるレベルに等しい(図3c)。同様に、AAV2/5−CAG−CHMによる形質導入後のRab27Aの細胞内分布分析(図3b)により、Rab27Aの細胞質画分が非形質導入RPEと比較して2.4倍減少し、かつ膜結合画分が1.3倍増加し、これは野生型RPEにおけるレベルと等しいことが分かった(図3d)。さらに、対照AAV2/5−CAG−EGFPベクターによるCHM1のRPEへの形質導入により、各画分におけるRab27Aの割合は劇的に変化しなかった。
これらの生体外研究を補完するために、本発明者らは、マウスの眼にPBS、AAV2/5−CAG−EGFPまたはAAV2/5−CAG−CHMを注射し、発現についてアッセイした。注射から早くも3日後に、AAV−CAG−EGFPを注射したマウスの眼底においてEGFP発現を僅かに認めることができた。注射から2週間後に網膜抽出物に対して行ったQ−PCR研究により、AAV2/5−CAG−CHMを注射したマウスの網膜抽出物におけるヒトCHM、およびCAV2/5−CAG−EGFPを注射した眼におけるEGFPの特異的な発現が示された(図4a)。同時点におけるウエスタンブロット分析により、タンパク質レベルにおけるこの特異的な発現が確認された(図4b)。本発明者らは、注射から1週間、2週間(図4c)および1ヶ月後における眼底検査によるEGFP発現の漸進的変化を追跡し、広範な形質導入を検出し、これは安定しているように見えた。蛍光顕微鏡法により視神経までの網膜の半分の形質導入が確認され、EGFP発現がRPEおよび光受容体の両方において検出された(図4d)。
幹細胞は理論上体内のあらゆる細胞型に分化することができる多能性細胞の不死増殖を表すように、ヒト細胞培養の分野に革命をもたらした(Yu&Thomson,2008)。特に、人工多能性幹細胞(iPSc)は成人の体細胞から産生させることができるため、ヒトの胚幹(ES)細胞の使用に関わる倫理規定を回避する例外的な手段を表す(Takahashiら,2007;Yuら,2007)。さらに、幹細胞は理論上体のあらゆる細胞型に分化することができるため、従来の技術では単離させることができなかった初代細胞型へのアクセスを可能にする(Grimm,2004)。さらに、出発物質が特定の遺伝子疾患を有する個体に由来している場合、標的にされる細胞型は疾患特異的細胞モデルを表すことができる(Parkら,2008)。
本出願全体を通して参照される各種参考文献には、本発明が属する最先端技術について記述されている。
Agbandje-McKenna M, Kleinschmidt J (2011) AAV capsid structure and cell interactions. Methods Mol Biol 807: 47-92
Allocca M, Mussolino C, Garcia-Hoyos M, Sanges D, Iodice C, Petrillo M, Vandenberghe LH, Wilson JM, Marigo V, Surace EM, Auricchio A (2007) Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol 81: 11372-11380
Bainbridge JW, Smith AJ, Barker SS, Robbie S, Henderson R, Balaggan K, Viswanathan A, Holder GE, Stockman A, Tyler N, Petersen-Jones S, Bhattacharya SS, Thrasher AJ, Fitzke FW, Carter BJ, Rubin GS, Moore AT, Ali RR (2008) Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358: 2231-2239
Bennett J, Ashtari M, Wellman J, Marshall KA, Cyckowski LL, Chung DC, McCague S, Pierce EA, Chen Y, Bennicelli JL, Zhu X, Ying GS, Sun J, Wright JF, Auricchio A, Simonelli F, Shindler KS, Mingozzi F, High KA, Maguire AM (2012) AAV2 gene therapy readministration in three adults with congenital blindness. Science translational medicine 4: 120ra115
Berger W, Kloeckener-Gruissem B, Neidhardt J (2010) The molecular basis of human retinal and vitreoretinal diseases. Prog Retin Eye Res 29: 335-375
Bocquet B, Lacroux A, Surget MO, Baudoin C, Marquette V, Manes G, Hebrard M, Senechal A, Delettre C, Roux AF, Claustres M, Dhaenens CM, Rozet JM, Perrault I, Bonnefont JP, Kaplan J, Dollfus H, Amati-Bonneau P, Bonneau D, Reynier P, Audo I, Zeitz C, Sahel JA, Paquis-Flucklinger V, Calvas P, Arveiler B, Kohl S, Wissinger B, Blanchet C, Meunier I, Hamel CP (2013) Relative frequencies of inherited retinal dystrophies and optic neuropathies in Southern France: assessment of 21-year data management. Ophthalmic epidemiology 20: 13-25
Chekroud K, Arndt C, Basset D, Hamel CP, Brabet P, Pequignot MO (2011) Simple and efficient: validation of a cotton wick electrode for animal electroretinography. Ophthalmic research 45: 174-179
Colella P, Cotugno G, Auricchio A (2009) Ocular gene therapy: current progress and future prospects. Trends Mol Med 15: 23-31
Egawa N, Kitaoka S, Tsukita K, Naitoh M, Takahashi K, Yamamoto T, Adachi F, Kondo T, Okita K, Asaka I, Aoi T, Watanabe A, Yamada Y, Morizane A, Takahashi J, Ayaki T, Ito H, Yoshikawa K, Yamawaki S, Suzuki S, Watanabe D, Hioki H, Kaneko T, Makioka K, Okamoto K, Takuma H, Tamaoka A, Hasegawa K, Nonaka T, Hasegawa M, Kawata A, Yoshida M, Nakahata T, Takahashi R, Marchetto MC, Gage FH, Yamanaka S, Inoue H (2012) Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science translational medicine 4: 145ra104
Grimm S (2004) The art and design of genetic screens: mammalian culture cells. Nat Rev Genet 5: 179-189
Hauswirth WW, Aleman TS, Kaushal S, Cideciyan AV, Schwartz SB, Wang L, Conlon TJ, Boye SL, Flotte TR, Byrne BJ, Jacobson SG (2008) Treatment of leber congenital amaurosis due to RPE65 mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: short-term results of a phase I trial. Hum Gene Ther 19: 979-990
Jacobson SG, Cideciyan AV, Ratnakaram R, Heon E, Schwartz SB, Roman AJ, Peden MC, Aleman TS, Boye SL, Sumaroka A, Conlon TJ, Calcedo R, Pang JJ, Erger KE, Olivares MB, Mullins CL, Swider M, Kaushal S, Feuer WJ, Iannaccone A, Fishman GA, Stone EM, Byrne BJ, Hauswirth WW (2012) Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol 130: 9-24
Krock BL, Bilotta J, Perkins BD (2007) Noncell-autonomous photoreceptor degeneration in a zebrafish model of choroideremia. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 4600-4605
Liao JL, Yu J, Huang K, Hu J, Diemer T, Ma Z, Dvash T, Yang XJ, Travis GH, Williams DS, Bok D, Fan G (2010) Molecular signature of primary retinal pigment epithelium and stem-cell-derived RPE cells. Human molecular genetics 19: 4229-4238
Maguire AM, High KA, Auricchio A, Wright JF, Pierce EA, Testa F, Mingozzi F, Bennicelli JL, Ying GS, Rossi S, Fulton A, Marshall KA, Banfi S, Chung DC, Morgan JI, Hauck B, Zelenaia O, Zhu X, Raffini L, Coppieters F, De Baere E, Shindler KS, Volpe NJ, Surace EM, Acerra C, Lyubarsky A, Redmond TM, Stone E, Sun J, McDonnell JW, Leroy BP, Simonelli F, Bennett J (2009) Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 374: 1597-1605
Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN, Jr., Mingozzi F, Bennicelli J, Banfi S, Marshall KA, Testa F, Surace EM, Rossi S, Lyubarsky A, Arruda VR, Konkle B, Stone E, Sun J, Jacobs J, Dell'Osso L, Hertle R, Ma JX, Redmond TM, Zhu X, Hauck B, Zelenaia O, Shindler KS, Maguire MG, Wright JF, Volpe NJ, McDonnell JW, Auricchio A, High KA, Bennett J (2008) Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358: 2240-2248
Marlhens F, Bareil C, Griffoin J-M, Zrenner E, Amalric P, Eliaou C, Liu S-Y, Harris E, Redmond TM, Arnaurd B, Claustres M, Hamel CP (1997) Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nat Genet 17: 139-14
Mussolino C, della Corte M, Rossi S, Viola F, Di Vicino U, Marrocco E, Neglia S, Doria M, Testa F, Giovannoni R, Crasta M, Giunti M, Villani E, Lavitrano M, Bacci ML, Ratiglia R, Simonelli F, Auricchio A, Surace EM (2011) AAV-mediated photoreceptor transduction of the pig cone-enriched retina. Gene Ther 18: 637-645
Nguyen UTT, Wu Y, Goodall A, Alexandrov K (2010) Analysis of Protein Prenylation In Vitro and In vivo Using Functionalized Phosphoisoprenoids. Current Protocols in Protein Science 62: 14.13.11-14.13.15
Park IH, Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H, Ince TA, Lerou PH, Lensch MW, Daley GQ (2008) Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 451: 141-146
Ramirez JM, Bai Q, Pequignot M, Becker F, Kassambara A, Bouin A, Kalatzis V, Dijon-Grinand M, De Vos J (2013) Side scatter intensity is highly heterogeneous in undifferentiated pluripotent stem cells and predicts clonogenic self-renewal. Stem Cells Dev 22: 1851-1860
Seabra MC, Brown MS, Slaughter CA, Sudhof TC, Goldstein JL (1992) Purification of component A of Rab geranylgeranyl transferase: possible identity with the choroideremia gene product. Cell 70: 1049-1057
Seabra MC, Ho YK, Anant JS (1995) Deficient geranylgeranylation of Ram/Rab27 in choroideremia. J Biol Chem 270: 24420-24427
Siegel S, Castellan NJ (1988) Non parametric statistics for the behavioral sciences, New York: McGraw-Hill.
Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE, Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM (2013) iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet 22: 593-607
Sparrow JR, Hicks D, Hamel CP (2010) The retinal pigment epithelium in health and disease. Curr Mol Med 10: 802-823
Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872
Tolmachova T, Tolmachov OE, Barnard AR, de Silva SR, Lipinski DM, Walker NJ, Maclaren RE, Seabra MC (2013) Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl) 91: 825-837
Tolmachova T, Tolmachov OE, Wavre-Shapton ST, Tracey-White D, Futter CE, Seabra MC (2012) CHM/REP1 cDNA delivery by lentiviral vectors provides functional expression of the transgene in the retinal pigment epithelium of choroideremia mice. J Gene Med 14: 158-168
Tolmachova T, Wavre-Shapton ST, Barnard AR, MacLaren RE, Futter CE, Seabra MC (2010) Retinal pigment epithelium defects accelerate photoreceptor degeneration in cell type-specific knockout mouse models of choroideremia. Invest Ophthalmol Vis Sci 51: 4913-4920
Tucker BA, Park IH, Qi SD, Klassen HJ, Jiang C, Yao J, Redenti S, Daley GQ, Young MJ (2011) Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice. PLoS One 6: e18992
Vandenberghe LH, Auricchio A (2012) Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Ther 19: 162-168
Vandenberghe LH, Bell P, Maguire AM, Cearley CN, Xiao R, Calcedo R, Wang L, Castle MJ, Maguire AC, Grant R, Wolfe JH, Wilson JM, Bennett J (2011) Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Science translational medicine 3: 88ra54
Vasireddy V, Mills JA, Gaddameedi R, Basner-Tschakarjan E, Kohnke M, Black AD, Alexandrov K, Zhou S, Maguire AM, Chung DC, Mac H, Sullivan L, Gadue P, Bennicelli JL, French DL, Bennett J (2013) AAV-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: Preclinical Studies in Personalized Models. PLoS One 8: e61396
Weber M, Rabinowitz J, Provost N, Conrath H, Folliot S, Briot D, Cherel Y, Chenuaud P, Samulski J, Moullier P, Rolling F (2003) Recombinant adeno-associated virus serotype 4 mediates unique and exclusive long-term transduction of retinal pigmented epithelium in rat, dog, and nonhuman primate after subretinal delivery. Mol Ther 7: 774-781
Wu YW, Alexandrov K, Brunsveld L (2007) Synthesis of a fluorescent analogue of geranylgeranyl pyrophosphate and its use in a high-throughput fluorometric assay for Rab geranylgeranyltransferase. Nature protocols 2: 2704-2711
Yu J, Thomson JA (2008) Pluripotent stem cell lines. Genes Dev 22: 1987-1997
Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318: 1917-1920
Claims (11)
- REP1をコードするポリヌクレオチドを含むrAAV2/5ベクター。
- 前記ポリヌクレオチドはCAGプロモーターの制御下にある、請求項1に記載のrAAV2/5ベクター。
- それを必要とする対象に治療的有効量の請求項1に記載のrAAV2/5ベクターを投与する工程を含む、前記対象におけるコロイデレミアの治療方法。
- 目的のポリヌクレオチドを含むある量のrAAV2/5ベクターを用いて網膜色素上皮に形質導入することにより、それを必要とする対象の眼の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを選択的に発現させるための方法。
- 前記rAAV2/5はCAGプロモーターを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記対象は、遺伝性もしくは非遺伝性網膜変性症、網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、黄斑変性症、レーバー先天性黒内障(LCA)、錐体杆体ジストロフィー、眼内血管新生疾患、脈絡膜変性症、脈絡膜硬化症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、コロイデレミア、緑内障、スライ症候群(MPS VII)および脳回転状萎縮などの代謝異常、網膜剥離または外傷からなる群から選択される前記網膜色素上皮を冒す網膜疾患に罹患しているか罹患する可能性がある、請求項4に記載の方法。
- 前記目的のポリヌクレオチドは遺伝子置換療法のために使用され、RGR(網膜色素変性症、RP、chr.10)、RDH5(白点眼底、chr.12)、RPE65(レーバー先天性黒内障、LCA、chr.1)、RLBP1(RP、chr.15)、MERTK(RP、chr.2)、LRAT(RP、chr.4)、REP1(コロイデレミア、Xp21)、RBP4(RPE変性、chr.10)または他の細胞型でも発現される遺伝子、例えば、MYO7A(アッシャー症候群1型、chr11)、ELOVL4(黄斑変性症、chr.6)、EFEMP1(家族性ドルーゼン(Malattia Leventinese)、chr.15)、BEST1(ベスト病、chr.11)、TIMP3(ソースビー眼底変性症、chr.22)、AIPL1(LCA、chr.7)、およびCRB1(RP、chr.1)からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記目的のポリヌクレオチドはREP1をコードする、請求項4に記載の方法。
- 前記目的のポリヌクレオチドは神経栄養因子をコードする、請求項4に記載の方法。
- 前記目的のポリヌクレオチド産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを行う部位特異的エンドヌクレアーゼである、請求項4に記載の方法。
- 前記目的のポリヌクレオチド産物は干渉RNA(RNAi)である、請求項4に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13306676 | 2013-12-06 | ||
EP13306676.1 | 2013-12-06 | ||
PCT/EP2014/076740 WO2015082690A1 (en) | 2013-12-06 | 2014-12-05 | Methods and pharmaceutical compositions for expressing a polynucleotide of interest in the retinal pigment epithelium of a subject |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019194672A Division JP2020023568A (ja) | 2013-12-06 | 2019-10-25 | 対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017500060A true JP2017500060A (ja) | 2017-01-05 |
JP6875856B2 JP6875856B2 (ja) | 2021-05-26 |
Family
ID=49885103
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016557191A Active JP6875856B2 (ja) | 2013-12-06 | 2014-12-05 | 対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 |
JP2019194672A Pending JP2020023568A (ja) | 2013-12-06 | 2019-10-25 | 対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019194672A Pending JP2020023568A (ja) | 2013-12-06 | 2019-10-25 | 対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10105452B2 (ja) |
EP (1) | EP3077520A1 (ja) |
JP (2) | JP6875856B2 (ja) |
KR (1) | KR102281881B1 (ja) |
CN (1) | CN105940109A (ja) |
AU (1) | AU2014359136B2 (ja) |
BR (1) | BR112016012716A2 (ja) |
CA (1) | CA2932495A1 (ja) |
IL (1) | IL245989A0 (ja) |
MA (1) | MA39082B2 (ja) |
MX (1) | MX2016007278A (ja) |
RU (1) | RU2723101C2 (ja) |
TN (1) | TN2016000220A1 (ja) |
WO (1) | WO2015082690A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021500071A (ja) * | 2017-10-18 | 2021-01-07 | リジェネックスバイオ インコーポレイテッド | ヒト翻訳後修飾vegf−trapによる眼疾患および転移性大腸がんの処置 |
JP2021500917A (ja) * | 2017-07-31 | 2021-01-14 | リフレクション バイオテクノロジーズ リミテッド | 眼疾患のための細胞モデル及び治療関連出願への相互参照 |
JP2021520232A (ja) * | 2018-04-05 | 2021-08-19 | オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッドOxford University Innovation Limited | 黄斑ジストロフィーを処置するための組成物及び方法 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201604146D0 (en) * | 2016-03-10 | 2016-04-27 | Nightstarx Ltd | Prenylation assay |
CN107287238B (zh) * | 2016-04-11 | 2020-10-16 | 厦门继景生物技术有限责任公司 | 一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物 |
KR20190058388A (ko) | 2016-10-11 | 2019-05-29 | 웰스테이트 옵탈믹스 코퍼레이션 | 짧은 형태의 간상체 유래 원추체 생존능 인자와 친수성 펩타이드 사이의 융합 단백질 |
CA3043013A1 (en) | 2016-11-07 | 2018-05-11 | Spark Therapeutics, Inc. | Rab escort protein potency assay |
CN109136266B (zh) * | 2018-08-10 | 2022-02-18 | 深圳泓熙生物科技发展有限公司 | 用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体及其用途 |
CN109112134B (zh) * | 2018-09-28 | 2020-06-02 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 一种视网膜变性疾病的best1新突变致病基因及其试剂盒 |
RU2732479C2 (ru) * | 2018-12-21 | 2020-09-17 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора |
JP2022524747A (ja) * | 2019-03-04 | 2022-05-10 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | Akt経路を標的とする神経保護遺伝子療法 |
CN110791502B (zh) * | 2019-12-04 | 2022-07-08 | 陕西理工大学 | 人源rbp4启动子片段及其应用 |
WO2023213817A1 (en) * | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Fondazione Telethon Ets | Gene therapy for gyrate atrophy of the choroid and retina |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012114090A1 (en) * | 2011-02-22 | 2012-08-30 | Isis Innovation Limited | Aav -vectors for use in gene therapy of choroideremia |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101506369B (zh) * | 2006-06-21 | 2014-02-12 | 尤尼克尔生物制药股份有限公司 | 具有经修饰的用于在昆虫细胞中产生aav的aav-rep78翻译起始密码子的载体 |
EP2247258A4 (en) * | 2008-02-07 | 2012-01-18 | Ceregene Inc | PRESERVATION OF PHOTORECEPTORS BY INTRAVITRENE DELIVERY OF AN EXPRESSION VECTOR ENCODING A THERAPEUTIC PROTEIN |
US20120172419A1 (en) * | 2009-09-15 | 2012-07-05 | Medical College Of Wisconsin Research Foundation Inc. | Reagents and methods for modulating cone photoreceptor activity |
CN103025344B (zh) | 2010-05-17 | 2016-06-29 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 新型dna-结合蛋白及其用途 |
-
2014
- 2014-12-05 KR KR1020167018183A patent/KR102281881B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-05 RU RU2016127246A patent/RU2723101C2/ru active
- 2014-12-05 JP JP2016557191A patent/JP6875856B2/ja active Active
- 2014-12-05 MA MA39082A patent/MA39082B2/fr unknown
- 2014-12-05 CN CN201480074447.1A patent/CN105940109A/zh active Pending
- 2014-12-05 CA CA2932495A patent/CA2932495A1/en not_active Abandoned
- 2014-12-05 TN TN2016000220A patent/TN2016000220A1/en unknown
- 2014-12-05 AU AU2014359136A patent/AU2014359136B2/en not_active Ceased
- 2014-12-05 MX MX2016007278A patent/MX2016007278A/es unknown
- 2014-12-05 BR BR112016012716-1A patent/BR112016012716A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-12-05 WO PCT/EP2014/076740 patent/WO2015082690A1/en active Application Filing
- 2014-12-05 US US15/101,591 patent/US10105452B2/en active Active
- 2014-12-05 EP EP14830801.8A patent/EP3077520A1/en not_active Ceased
-
2016
- 2016-06-02 IL IL245989A patent/IL245989A0/en unknown
-
2019
- 2019-10-25 JP JP2019194672A patent/JP2020023568A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012114090A1 (en) * | 2011-02-22 | 2012-08-30 | Isis Innovation Limited | Aav -vectors for use in gene therapy of choroideremia |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. Vol. 118, No. 5, JPN5016012383, 2008, pages pp. 1955 - 1964 * |
JOURNAL OF GENE MEDICINE, vol. Vol. 10, No. 4, JPN5016012382, 2008, pages pp. 375 - 382 * |
JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE, vol. Vol. 91, No. 7, JPN5016012385, 12 June 2013 (2013-06-12), pages pp. 825 - 837 * |
NEURON, vol. Vol. 29, JPN6018030270, 2001, pages pp. 739-748 * |
PLOS ONE, vol. Vol. 8, No. 5, JPN5016012384, 7 May 2013 (2013-05-07), pages E61396 * |
日本遺伝カウンセリング学会誌, vol. 32(2), JPN6018030268, 2011, pages pp. 80 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021500917A (ja) * | 2017-07-31 | 2021-01-14 | リフレクション バイオテクノロジーズ リミテッド | 眼疾患のための細胞モデル及び治療関連出願への相互参照 |
TWI820034B (zh) * | 2017-07-31 | 2023-11-01 | 香港商映像生物有限公司 | 眼部疾病之細胞模式及用於眼部疾病的療法 |
JP7448953B2 (ja) | 2017-07-31 | 2024-03-13 | リフレクション バイオテクノロジーズ リミテッド | 眼疾患のための細胞モデル及び治療関連出願への相互参照 |
JP2021500071A (ja) * | 2017-10-18 | 2021-01-07 | リジェネックスバイオ インコーポレイテッド | ヒト翻訳後修飾vegf−trapによる眼疾患および転移性大腸がんの処置 |
JP2021520232A (ja) * | 2018-04-05 | 2021-08-19 | オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッドOxford University Innovation Limited | 黄斑ジストロフィーを処置するための組成物及び方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105940109A (zh) | 2016-09-14 |
MA39082A1 (fr) | 2017-10-31 |
US10105452B2 (en) | 2018-10-23 |
EP3077520A1 (en) | 2016-10-12 |
MX2016007278A (es) | 2016-09-16 |
AU2014359136A1 (en) | 2016-06-16 |
IL245989A0 (en) | 2016-07-31 |
CA2932495A1 (en) | 2015-06-11 |
KR20170009812A (ko) | 2017-01-25 |
TN2016000220A1 (en) | 2017-10-06 |
KR102281881B1 (ko) | 2021-07-27 |
WO2015082690A1 (en) | 2015-06-11 |
RU2723101C2 (ru) | 2020-06-08 |
AU2014359136B2 (en) | 2020-06-25 |
US20160310618A1 (en) | 2016-10-27 |
BR112016012716A2 (pt) | 2020-11-24 |
MA39082B2 (fr) | 2021-11-30 |
JP2020023568A (ja) | 2020-02-13 |
JP6875856B2 (ja) | 2021-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6875856B2 (ja) | 対象の網膜色素上皮において目的のポリヌクレオチドを発現させるための方法および医薬組成物 | |
US11951121B2 (en) | Compositions and methods for treating Huntington's disease | |
JP6985250B2 (ja) | 深部イントロン突然変異の遺伝子編集 | |
JP6293664B2 (ja) | 桿体由来錐体生存因子をコードするベクター | |
KR20180043373A (ko) | 색소성망막염의 치료 | |
WO2020079033A1 (en) | Genome editing methods and constructs | |
Kotterman et al. | Directed evolution of AAV targeting primate retina by intravitreal injection identifies R100, a variant demonstrating robust gene delivery and therapeutic efficacy in non-human primates | |
US20230330269A1 (en) | Treatment of rpe65-associated eye diseases and disorders | |
US20230070477A1 (en) | Reprogramming the metabolome to delay onset or treat neurodegeneration | |
KR20230169250A (ko) | 신경보호를 위한 유전자 요법 | |
CN117377482A (zh) | 用于神经保护的基因疗法 | |
JP2023527578A (ja) | 眼疾患を処置するための方法及び医薬組成物 | |
CN116806158A (zh) | 密码子优化的rep1基因及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160812 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170801 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180807 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181102 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190107 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20190625 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20191025 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20191028 |
|
C116 | Written invitation by the chief administrative judge to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C116 Effective date: 20191119 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20191119 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20200728 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20201102 |
|
C28A | Non-patent document cited |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C2838 Effective date: 20201102 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210122 |
|
C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20210309 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20210125 |
|
C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20210406 |
|
C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20210406 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210423 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6875856 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |