JP2021500917A - 眼疾患のための細胞モデル及び治療関連出願への相互参照 - Google Patents

眼疾患のための細胞モデル及び治療関連出願への相互参照 Download PDF

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Abstract

眼の疾患のための細胞モデルを開示する。さらに、本出願は、眼の疾患を治療又は予防するための方法及び組成物を開示する。

Description

本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づき、２０１７年７月３１日に出願された、「ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＭＯＤＥＬＳ ＯＦ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＯＣＵＬＡＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ（眼疾患のための細胞モデル及び治療）」と題される、米国特許出願第６２／５３９，４７３号の優先権を主張する。上述の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
クリスタリン網膜症（Ｂｉｅｔｔｉ’ｓ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＢＣＤ））
クリスタリン網膜症（ＢＣＤ、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィー（Ｂｉｅｔｔｉ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｃｏｒｎｅｏｒｅｔｉｎａｌ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性網膜症（Ｂｉｅｔｔｉ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、Ｂｉｅｔｔｉ網膜ジストロフィー（Ｂｉｅｔｔｉ’ｓ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）としても知られる（ＯＭＩＭ ２１０３７０））は、網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（ＲＰＥ））の萎縮、色素塊、及び脈絡膜硬化症に関連する、網膜の後極部にある多数の小さな輝く黄白色結晶のような沈着物を特徴とする、稀な常染色体劣性及び失明性網膜ジストロフィーである。本疾患は、Ｇ．Ｂ．Ｂｉｅｔｔｉ博士によって１９３７年に最初に特定された。ＢＣＤ患者の眼底写真及びＳＤ−ＯＣＴ画像から、結晶沈着物が主に網膜色素上皮（ＲＰＥ）の網膜側に位置することが示された（H. Kojima, A. Otani, K. Ogino et al., “Outer retinal circular structures in patients with Bietti crystalline retinopathy,” British Journal of Ophthalmology, vol. 96, pp. 390-393, 2012）。角膜縁の結晶沈着物は、ＢＣＤ患者の４分の１〜３分の１に発生すると推定されている（Kaiser-Kupfer et al. Clinical biochemical and pathologic correlations in Bietti’s crystalline dystrophy, Am J Ophthalmol., 1994, 118:569-82）。場合によっては、水晶体の結晶沈着も観察される（Chung et al., J Ophthalmol. 57:447-450, 2013）。進行期では、ＢＣＤ患者は高度な脈絡膜硬化症、結晶性沈着物の減少又は欠如、及び網膜血管の減弱を呈する（Wada et al. Am J Ophthalmol 2005; 139:894-9）。異常ＥＲＧ及び網膜の薄化もＢＣＤに認められる。
臨床的には、ＢＣＤは進行性であり、ＲＰＥのジストロフィー及び変性に関連している。同一患者における目の間の著しい非対称性が一般的である。疾患の発症年齢及び進行は、同じ家族内であってもＢＣＤ患者によって異なる。ほとんどの患者は、１０歳代〜３０歳代の間に夜盲症、狭視野、色覚異常、黄斑変性、及び視力低下を発症し、２０歳代から５０歳代で法的失明（ｌｅｇａｌ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）へと進行する。
脈絡膜毛細血管の血管と視細胞の光感受性外節との間に位置するＲＰＥは、視覚機能の維持において視細胞（錐体細胞及び桿体細胞）と密接に相互作用する色素細胞の単層である。ＲＰＥの重要な機能は、栄養を与え、感覚神経網膜である視細胞から老廃物を除去することである。ＲＰＥのその他の機能としては、光吸収、上皮輸送、空間に存在するイオンのバッファリング、視覚サイクル、食作用、分泌、及び免疫調節が挙げられるが、これらに限定されない（Strauss, 2005, The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev 85:845-81）。したがって、ＲＰＥの機能障害及び変性は、視細胞の機能障害と変性を引き起こし、視力の喪失をもたらす。ＢＣＤがＲＰＥの進行性ジストロフィー及び変性に関連していることを考えると、ＲＰＥはＢＣＤの研究及び治療のいずれの目的にとっても重要である。
ＢＣＤは希少疾患である。ある情報源によると、ＢＣＤ発生率は１：６７，０００と推定された（ghr.nlm.nih.gov/condition/bietti-crystalline-dystrophy#statistics、World Wide Web参照）。別の情報源によると、ＢＣＤの有病率は全てのＲＰ患者の２．５％であると推定された（ＲＰ発症患者１２１人中３人のＢＣＤ発症患者、Mataftsi et al., Retina. 24:416-426, 2004を参照）。この推定に基づき、ＲＰ発生率を１：４０００とすると（Hartong et al., Lancet. 368:1795-1809, 2006）、ＢＣＤ発生率は１：１６０，０００と推定される。ＢＣＤの症状は、網膜を進行的に損傷する他の眼疾患の症状と類似しているため、網膜色素変性症（ＲＰ）と一般的に診断されることがある（Mataftsi A et al. Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy: a cross-sectional study. Retina. 2004; 24: 416-426）。ＢＣＤの患者は、アジア、アフリカ、ヨーロッパ、中東、北米、及び南米を含む世界の様々な地域で報告されているが、ＢＣＤは東アジア系の人、特に中国人及び日本人でより一般的であると報告されている（Hu 1983, Ophthalmic genetics in China. Ophthal Paed Genet 2:39-45; Li et al., Am J Hum Genet. 2004 May; 74(5): 817-826）。
現在、承認されたＢＣＤ治療法はなく、患者は最終的に失明する。この希少疾患に苦しむ患者のために、人生を変えるような治療オプションを開発するという、強いアンメットメディカルニーズが存在する。
ＣＹＰ４Ｖ２
ＣＹＰ４Ｖ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー４、サブファミリーＶ、ポリペプチド２、（ＯＭＩＭ ６０８６１４）、同義語：ＣＹＰ４ＡＨ１）は、シトクロムＰ４５０スーパーファミリーのタンパク質の１つであり、ヘムチオレートシトクロムＰ４５０サブファミリー４（ＣＹＰ４）のメンバーである。シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は、モノオキシゲナーゼ反応で知られる重要なヘム含有タンパク質である。それらは、生体異物、及びステロイドや脂肪酸などの内因性化合物の代謝に関与している。ヒトＣＹＰは、主にミトコンドリアの内膜又は細胞の小胞体にある膜関連タンパク質である。Ｐ４５０タンパク質は、特徴的な配列要素ＦｘｘＧｘｘｘＣｘＧ（配列番号３０）によって識別可能であり、下線付きのシステインは、ヘム鉄に対する軸配位子として機能する。Ｐ４５０タンパク質の別の特徴的な配列要素はＥｘｘＲ（配列番号３１）である。ヒトゲノムプロジェクトでは、ヒトＰ４５０遺伝子の数は５７とされている。参考として、１０３個のマウスＰ４５０遺伝子と８９個のラットＰ４５０遺伝子が存在する（Guengerich & Cheng, Pharmacological Reviews, September 2011, 63(3) 684-699）。
ヒトＣＹＰ４ファミリーは、１２個の遺伝子及び１０個の偽遺伝子で構成されている。ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ＨＧＮＣ：２３１９８）は４ｑ３５に位置し、１１個のエクソンを有する。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異はＢＣＤを引き起こす（Li et al., Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004）。ＣＹＰ４Ｖ２はほぼ全ての組織で発現されるが、ＢＣＤの主要な臨床所見を示す組織では、網膜及びＲＰＥでは高レベルで、角膜ではやや低レベルで発現される（Li et al., Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004; Nakano M, Kelly EJ, Rettie AE: Expression and Characterization of CYP4V2 as a Fatty Acid omega-Hydroxylase. Drug Metab Dispos 2009; Nakano M, Kelly EJ, Wiek C, Hanenberg H, Rettie AE: CYP4V2 in Bietti’s crystalline dystrophy: ocular localization, metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids, and functional deficit of the p.H331P variant. Mol Pharmacol 2012; 82: 679-686）。
ＣＹＰ４Ｖ２はＰ４５０ファミリーの比較的新しいメンバーであり、ＢＣＤは希少疾患であるため、ＣＹＰ４Ｖ２の機能は広く研究されていない。これまでの研究において、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質が脂肪酸代謝において主に活性があることが示された。脂肪酸及びその代謝における異常は、ＢＣＤ患者の血清、リンパ球、及び皮膚線維芽細胞で示されている（Lee J, Jiao X, Hejtmancik JF et al: The metabolism of fatty acids in human Bietti crystalline dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: 1707-1714; Lai T, Chu KO, Chan KP et al: Alterations in serum fatty acid concentrations and desaturase activities in Bietti crystalline dystrophy unaffected by CYP4V2 genotypes. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010; 51: 1092-1097）。別の研究では、ＣＹＰ４Ｖ２がオメガ−３−多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）ヒドロキシラーゼであり、形質転換されたヒトＲＰＥ細胞系ＡＲＰＥ−１９で高度に発現するＰ４５０であることが示された（Nakano M, Kelly EJ, Wiek C, Hanenberg H, Rettie AE: CYP4V2 in Bietti's crystalline dystrophy: ocular localization, metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids, and functional deficit of the p.H331P variant. Molecular pharmacology 2012; 82: 679-686）。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子には、ＢＣＤを引き起こす多数の変異が確認されており、遺伝子の１１個のエクソンのそれぞれに少なくとも１つの変異がある。ＢＣＤ患者の中で最も一般的なＣＹＰ４Ｖ２変異はｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣである（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のイントロン６の終端から８塩基で始まる場所における、１７塩基の欠失と２塩基（ＧＣ）の挿入を指し、ＩＶＳ６−８ ｄｅｌ／ｉｎｓＧＣとも称される。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を含むヒトＣＹＰ４Ｖ２ゲノムＤＮＡ領域の配列を示す配列番号４６及び対応する野生型配列を示す配列番号４７を参照。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を、ヒトＣＹＰ４Ｖ２イントロン６−エクソン７接合部を示す以下の配列に示す。イントロン６配列を小文字で、エクソン７配列を大文字で示す。１７ｂｐの欠失及びＧＣの挿入を括弧内に示す）：ｃａａ ａｃａ ｇａａ ｇｃａ ｔｇｔ ｇａｔ ｔａｔ ｃａｔ ｔｃａ ａａ（ｔｃａ ｔａｃ ａｇＧ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＴ）（ＧＣ） ＧＡＡ ＣＧＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＡ（配列番号４６）。これにより、エクソン７のスキップが起こる。（Xiao et al., Biochem Biophys Res Commun. 409:181-6, 2011、Meng et al., 2014, Mol. Vis., 20:1806-14、Wada et al., Am J Ophthalmol. 139:894-9, 2005、Jiao et al., European Journal of Human Genetics(2017) 25, 461-471）。最近の研究では、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異の年代は、中国人では１，０４０〜８，２００世代、日本人では３００〜１１００世代であると推定された。Jiao et al., European Journal of Human Genetics(2017) 25, 461-471参照。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の全欠失並びにミスセンス、複製、スプライス部位、フレームシフト、欠失、挿入、インデル（挿入欠失）、ナンセンス、多型（例えば、一塩基多型）、及び早期終結など、様々な種類のＣＹＰ４Ｖ２変異がＢＣＤに関連して発見された。ヒトＢＣＤ患者の間で選択されたＣＹＰ４Ｖ２変異の概要を、本明細書の表１に示しており、それらは様々な出版物やオンラインデータベース、例えばＬＯＶＤ（databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2、World Wide Web参照）、ＯＭＩＭ（omim.org/allelicVariant/608614、World Wide Web参照）、及びＣｌｉｎＶａｒ（ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=608614[MIM]、World Wide Web参照）で確認できる。

これは単に選択されたリストであり、これまでに特定及び報告されたＢＣＤ患者のすべての病的ＣＹＰ４Ｖ２変異／バリアントが含まれているとは限らない。変異は参照配列（ＮＭ＿２０７３５２．３）及び（ＮＰ＿９９７２３５．３）と比較したものである。ＢＣＤ患者の新たなＣＹＰ４Ｖ２病的変異は継続的に特定されている。ＢＣＤに関連する既に特定された及び将来特定される全ての病的ＣＹＰ４Ｖ２変異／バリアントは、参照により本明細書に組み込まれる。
遺伝性網膜変性（Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＩＲＤ）
遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）は、失明の主な原因である。現在、２００超の遺伝子がＩＲＤ及び関連疾患に関与していることが知られている。網膜色素変性症（ＲＰ）は、ヒトの主要なＩＲＤである。ＲＰの遺伝には３つの一般的な様式がある（常染色体優性、常染色体劣性、及びＸ連鎖）。ＲＰの世界的な発生率は４０００人に１人と推定され、常染色体劣性ＲＰはＲＰの５０％〜６０％を占めている（Hartong DT, Berson EL, Dryja TP. Retinitis pigmentosa. Lancet. 2006;368:1795-809）。ヨーロッパの研究では、ＢＣＤの有病率は、全てのＲＰ患者の２．５％、及び非症候性常染色体劣性ＲＰを有する人の約１０％であると推定されている（Mataftsi A, Zografos L, Milla E, Secretan M, Munier FL. Bietti’s crystalline corneoretinal dystrophy: a cross-sectional study. Retina. 2004;24:416-26）。同研究では、ＢＣＤはＲＰとして一般的に診断されることが多いことも指摘されている。そのため、ＢＣＤは過少診断されてきた可能性がある。ＢＣＤは世界的規模の疾患であるが、東アジア、特に中国人及び日本人で最も一般的である（Li et al., Am J Hum Genet. 2004 May; 74(5): 817-826）。
表１の変異の参照：
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細胞系に関する請求
細胞系及び疾患モデルに関する請求
細胞系組成物
一態様では、細胞系を含む細胞疾患モデルが提供される。そのような疾患モデルは、標的遺伝子に１又は複数の変異を含む、（ａ）対象から提供された幹細胞、若しくは対象から提供された細胞からリプログラミングされた幹細胞、又は（２）対象から提供された幹細胞に由来する細胞、若しくは対象から提供された細胞からリプログラミングされた幹細胞に由来する細胞、を含む。
いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、体性（又は成体）幹細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態では、対象から提供される前記細胞は、前記対象の任意の細胞型及び／又は任意の組織のものである。いくつかの実施形態では、対象から提供される前記細胞は、皮膚細胞、線維芽細胞、又は血液細胞である。いくつかの実施形態では、対象から提供される前記細胞は、皮膚線維芽細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、対象から提供される前記細胞は、尿細胞、腎上皮細胞、毛包、又は真皮乳頭細胞である。
いくつかの実施形態では、幹細胞に由来する前記細胞は、眼細胞である。いくつかの実施形態では、前記眼細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ（ＰＲＣ）；桿体細胞、錐体細胞、及び光受容体前駆細胞を含む）、網膜細胞、角膜細胞、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、視神経細胞、水晶体細胞、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、視神経細胞、又は脈絡膜細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞に由来する前記細胞は、ニューロン細胞である。
いくつかの実施形態では、前記変異は、前記対象にとって内因性である。いくつかの実施形態では、前記変異は、前記対象にとって外因性である。いくつかの実施形態では、前記変異は、遺伝子編集又は遺伝子操作を介して人工的に導入される。いくつかの実施形態では、前記細胞系は、前記対象にとって内因性及び／又は外因性である複数の変異を含む。
いくつかの実施形態では、前記対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、表４に示す遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、
変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、又は
不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、
を含む。いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、ＣＹＰ４Ｖ２である。
いくつかの実施形態では、前記細胞系は、ｉＰＳ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞系は、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞系は、ｉＰＳ−光受容体（ｉＰＳ−ＰＲＣ）細胞、ｉＰＳ−角膜上皮細胞（ｉＰＳ−ＣＥＣ）、ｉＰＳ−脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、ｉＰＳ−角膜細胞、ｉＰＳ−脈絡膜細胞、ｉＰＳ−視神経細胞、ｉＰＳ−眼細胞、又はｉＰＳ−ニューロン細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞系におけるＣＹＰ４Ｖ２変異は、前記対象にとって内因性である。いくつかの実施形態では、前記対象は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のオーソログに病的変異を有する。
いくつかの実施形態では、前記対象は、表１に示す少なくとも１つの変異を有する。いくつかの実施形態では、前記対象は、遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）又は網膜色素変性症（ＲＰ）を有する。いくつかの実施形態では、前記対象は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィー、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性網膜症、Ｂｉｅｔｔｉ網膜ジストロフィーとしても知られる）を有するか、又はＢＣＤを発症するリスクがある。
いくつかの実施形態では、前記細胞系は、前記対象にとって外因性であって遺伝子編集又は遺伝子操作を介して人工的に導入されるＣＹＰ４Ｖ２変異を含む。
いくつかの実施形態では、前記細胞系は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、若しくは成体幹細胞；又はｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、若しくは成体幹細胞に由来する、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、角膜上皮細胞、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、若しくは脈絡膜細胞、を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞又は他の種類の幹細胞は、次の１又は複数によって特徴付けられる：
ａ．ｉＰＳ、ＥＳ、又はＭＳＣのｉＰＳＣの固有の形態；
ｂ．Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＮＡＮＯＧ、及びＡＰなどの１又は複数の多能性マーカー；
ｃ．所望の細胞の種類（例えば、ＲＰＥ）に分化する能力；及び／又は
ｄ．テラトーマアッセイ。
いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞又は他の種類の幹細胞に由来するＲＰＥ細胞は、
ａ．形態：色素及び六角形の形状、及び／又は
ｂ．１又は複数の以下のバイオマーカー：レチンアルデヒド結合タンパク質１（ＲＬＢＰ１、別名：ＣＲＡＬＢＰ）、ＲＰＥ６５、ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ−１、ＭＩＴＦ、ＬＲＡＴ、ＲＤＨ５、ＰＡＸ６、ＭＥＲＴＫ、ＴＹＲ、ＺＯ−１及び／又はＶＩＮＣＵＬＩＮ
によって特徴付けられる。
別の態様では、ＢＣＤヒト細胞モデル又はＣＹＰ４Ｖ２機能細胞モデルが提供される。そのようなモデルは、ＢＣＤ患者の細胞若しくは細胞系に由来する、又は人工的に作製されたＣＹＰ４Ｖ２変異を有する細胞若しくは細胞系に由来する、ｉＰＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞系又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞若しくはｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系を含む。
いくつかの実施形態では、前記細胞系は、健康な対照の対応する細胞系と比較して、以下の化合物群の１又は複数の化合物について異常な生化学的プロファイルを有する：（ｉ）脂肪酸、（ｉｉ）セラミド、（ｉｉｉ）スフィンゴミエリン、（ｉｖ）スフィンゴシン、（ｖ）スフィンガニン、又は（ｖｉ）ヒドロキシ脂肪酸。いくつかの実施形態では、前記細胞系は、健康な対照の関連する細胞系と比較して、表２に示す１又は複数の化合物について異常な生化学的プロファイルを有する。
細胞疾患モデルの作製方法：
別の態様では、ｉＰＳ由来のＢＣＤ疾患モデルの作製方法が提供される。そのような方法は、
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に内因性変異を有する細胞を対象から取得すること、又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に内因性変異を有しない細胞を取得することであって、この段階又は後続の任意の段階で遺伝子編集又は遺伝子操作を介して外因性ＣＹＰ４Ｖ２変異が人工的に導入される、前記取得すること；
前記細胞に多能性を誘導するか、前記細胞をリプログラミングしてｉＰＳＣを生産すること；
前記ｉＰＳＣが所望の眼細胞に分化する条件下で前記ｉＰＳＣを培養して、ｉＰＳ由来眼細胞系を作製すること、
を含む。
いくつかの実施形態では、前記対象から得られる前記細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態では、前記対象から得られる前記細胞は、皮膚細胞、線維芽細胞、血液細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、又は眼細胞である。いくつかの実施形態では、前記対象から得られた前記細胞は、尿細胞、腎上皮細胞、毛包、又は真皮乳頭細胞である。いくつかの実施形態では、前記眼細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、光受容体細胞（ＰＲＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、視神経細胞、網膜細胞、角膜細胞、又は脈絡膜細胞である。いくつかの実施形態では、転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣのうち１又は複数を使用して多能性が誘導され又は細胞がリプログラミングされる。
いくつかの実施形態では、前記変異は、病的なものである。いくつかの実施形態では、前記細胞系は、表１に示す変異の１又は複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞系は前記変異に関してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、前記細胞系は前記変異に関してホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、前記細胞疾患モデルは、健康な対照の関連する細胞系と比較して、以下の化合物群の１又は複数の化合物の異常なレベルを示す：（ｉ）脂肪酸、（ｉｉ）セラミド、（ｉｉｉ）スフィンゴミエリン、（ｉｖ）スフィンゴシン、（ｖ）スフィンガニン、又は（ｖｉ）ヒドロキシ脂肪酸。いくつかの実施形態では、前記細胞疾患モデルは、表２に示す１又は複数の化合物における健康な対照の関連する細胞系のレベルと比較して異常なレベルを示す。
生化学アッセイ法：
一態様では、疾患細胞モデルの異常又は表現型を発見する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、患者の細胞系（又はその疾患を引き起こす遺伝子の外因性変異を含む遺伝子編集又は遺伝子操作された細胞系）と健康な対照との間で、（ｉ）脂肪酸、（ｉｉ）セラミド、（ｉｉｉ）スフィンゴミエリン、（ｉｖ）スフィンゴシン、（ｖ）スフィンガニン、及び／又は（ｖｉ）ヒドロキシ脂肪酸から選択される１又は複数の化合物のレベルを評価及び比較することを含む。
いくつかの実施形態では、評価される化合物のうち１又は複数は、表２に示されている。いくつかの実施形態では、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳ、及び／又はＦＩＡ−ＭＳ／ＭＳを使用して化合物レベルの識別及び／又は評価が実施される。いくつかの実施形態では、前記疾患細胞モデルは、表４に示す変異又は欠陥を有する遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記疾患細胞モデルは、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、又はＣＹＰ４６Ａの遺伝子の中に、変異又は欠陥を有する遺伝子を含む。
ＢＣＤ細胞モデルの使用方法（薬物、投与量、及びデバイスのスクリーニング）
別の態様では、ＢＣＤに対する治療効果について試験薬をスクリーニングする方法が提供される。そのような方法は、典型的に、
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの細胞、又は人工の遺伝子編集又は遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの細胞を、試験薬に接触させることと；
上記試験薬による接触前と比較した、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；及び／又は細胞構造、細胞形態又は細胞機能の改善、について前記細胞を評価することと、
を含み、
上記試験薬による処理前と比較した、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；及び／又は細胞構造、細胞形態、又は細胞機能の改善は、ＢＣＤに対して治療効果を有する試験薬の指標となる。
いくつかの実施形態では、前記試験薬は、核酸又はそのアナログ、核酸配列を含む又はポリペプチドをコードするベクター、ポリペプチド又はそのアナログ、抗体、化学物質、小分子、及び／又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、機能アッセイ、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価される。
別の態様では、ＢＣＤの試験薬を含む製剤、ベクター、又はコンストラクトの有効性又は効率をスクリーニングする方法が提供される。そのような方法は、典型的に、
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料を、様々な製剤、ベクター、又はコンストラクトに製剤化又はパッケージングされた試験薬に接触させることと；
上記試験薬による処理前と比較した、及び／又は同じ試験薬ではあるものの異なる製剤、ベクター、又はコンストラクトに製剤化又はパッケージングされた試験薬で処理された細胞試料と比較した、表２に記載の１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；細胞構造、細胞形態、又は細胞機能の改善；及び／又は細胞耐性若しくは細胞死、について前記細胞試料を評価することによって、上記製剤、ベクター、又はコンストラクトの効率又は有効性を決定及び比較することと、
を含み、
前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、機能アッセイ、細胞生存率アッセイ、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価される。
一態様では、ＢＣＤのための試験薬の効果的かつ安全な投与量範囲をスクリーニングする方法が提供される。そのような方法は、典型的に、
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料を、細胞試料ごとに異なる用量で、試験薬に接触させることと、
上記試験薬による処理前と比較した、及び／又は同じ試験薬ではあるものの異なる用量の試験薬で処理された細胞試料と比較した、表２に記載の１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；細胞構造、細胞形態、又は細胞機能の改善；及び／又は細胞耐性若しくは細胞死、について前記細胞試料を評価することによって、異なる用量の有効性及び安全性を決定及び比較し、それにより適切な用量範囲を決定することと、
を含み、
前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、細胞生存率アッセイ、機能アッセイ、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価される。
別の態様では、網膜又は網膜細胞に治療薬を送達するための送達デバイス又は送達方法の有効性又は効率をスクリーニング又は評価する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、
（ｉ）ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの細胞試料を、前記送達デバイス又は送達方法を使用せずに、試験薬に接触させることと；
（ｉｉ）ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの別個の細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの別個の細胞試料を、前記送達デバイス又は送達方法を使用して、（ｉ）と同じ用量の前記試験薬に接触させることと、
（ｉｉｉ）上記試験薬による処理前と比較した、及び／又は同じ用量の同じ試験薬による処理であって前記送達デバイス又は送達方法を使用していない処理と比較した、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；細胞構造、細胞形態若しくは細胞機能の改善；細胞耐性若しくは細胞死；及び／又は前記細胞内の前記試験薬のレベル、について（ｉ）及び（ｉｉ）からの前記細胞試料を評価及び比較することによって、上記送達デバイス又は送達方法の有効性又は効率を決定及び比較すること、
を含み、
前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、機能アッセイ、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価される。
いくつかの実施形態では、網膜細胞はＲＰＥ細胞である。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法
一態様では、（ａ）ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の核酸配列、又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の隣接１００ｂｐ以内の核酸配列を（「標的配列」を）標的とするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、及び（ｂ）機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、（ｃ）ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子又はその一部の修正、破壊、又は置換のための、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の野生型配列又は機能的配列の全部又は一部を含むドナー核酸配列をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、前記組成物の１又は複数の成分は、上記成分をコードするＤＮＡ分子、上記成分をコードするｍＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、及び／又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）、又はタンパク質−ＲＮＡ複合体の形態で提供される。いくつかの実施形態では、前記組成物の２以上の成分は、別々の分子にある又は１つの分子若しくは１つの複合体に組み合わされているか、別々のベクターにある又は１つのベクターに組み合わされているか、１又は複数の核酸複合体にあるか、１又は複数のＲＮＰ複合体にある。いくつかの実施形態では、前記ドナー核酸配列は、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）又はベクター中に提供される。いくつかの実施形態では、前記ベクターはプラスミド、組換えＡＡＶベクター、組換えレンチウイルスベクター、及び／又はそれらの組み合わせである。
いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む、病的ＣＹＰ４Ｖ２変異を有する細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、
（ｉ）標的遺伝子（「標的遺伝子」）中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列、及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の相補的な領域に対応する配列、を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
（ｉｉ）前記ｃｒＲＮＡの対応する領域に相補的な領域、及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と相互作用する配列、を含むｔｒａｃｒＲＮＡと、を含み、
（ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣａｓ９を含む。
いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメントは、約２０塩基、約１９塩基、約２１塩基、約１９〜２１塩基、約１８〜２２塩基、又は約１６〜２４塩基である。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、別々の分子内にある。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）において組み合わされている。いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、約８８〜１５０ｂｐである。
いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｄ１１３５Ｅ）、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ、ＳｐＣａｓ９ＥＱＲ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｎｏｎｉａｅ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、及びエンテロコッカス・ファエカリス（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から選択されるＣａｓ９オーソログ又は変異体Ｃａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であるＣａｓ９又はＣｐｆ１は、１、２、３又はそれ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端及び／又はＣ末端にさらに含む、及び／又は、非限定的な例としてＧＦＰ又はＥＧＦＰが挙げられる選択マーカーをさらに含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、標的遺伝子中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内の標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列を含むｃｒＲＮＡを含み、（ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣｐｆ１を含む。いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメントは、約２０塩基、約２１塩基、約２２塩基、約２３塩基、約２４塩基、約１９〜２５塩基、約１８〜２６塩基、又は約１６〜２８塩基である。
いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメント配列は、配列番号４８〜５２からなる群から選択されるか、配列番号４８〜５２の一つと少なくとも８５％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を標的とするために、ＮＧＧをプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とするＣａｓタンパク質と共に使用される。いくつかの実施形態では、前記ドナー核酸配列は、配列番号５６及び５７（これは２つのドナー鋳型配列である）から選択されるか、配列番号５６及び５７のいずれか又はその相補的な配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正、破壊、又は置換するために使用される。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子治療法に関する請求
別の態様では、変異したＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を持つ対象又は細胞におけるＢＣＤを治療又は予防する方法が提供される。そのような方法は、
（ｉ）シークエンシングによって前記対象又は細胞における病的変異を特定すること、
（ｉｉ）前記変異に関与する最初のヌクレオチドの上流約１００ｂｐから、前記変異に関与する最後のヌクレオチドの下流約１００ｂｐまでに及ぶ領域内のＣａｓ関連ＰＡＭ部位を見つけること、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で特定された各ＰＡＭ部位に関連するＣＹＰ４Ｖ２配列を標的とする様々なプロトスペーサーエレメント配列を特定すること、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）で特定されたプロトスペーサーエレメント配列を含む各ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの活性レベルと、オフターゲット編集のプロファイルとを、前記プロトスペーサーエレメント配列及びＰＡＭについて評価すること、
（ｖ）（ｉｖ）に基づいて１又は複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ設計を選択すること、
（ｖｉ）標的ＣＹＰ４Ｖ２変異を修正、破壊、又は置換するための相同組換修復（ＨＤＲ）に基づく１又は複数のドナー核酸配列を設計すること、
（ｖｉｉ）組成物に関する請求項１〜請求項１８で提供される、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃａｓ、及びドナー核酸配列を構築すること、
（ｖｉｉｉ）所望により、活性レベル及び／又はオフターゲット編集プロファイルを評価するために、前記対象から単離された細胞；前記対象由来のｉＰＳ細胞、若しくは前記対象由来の幹細胞から分化した細胞；又は前記対象から単離されたゲノムＤＮＡ、又は前記対象から単離された細胞若しくはこれに由来する細胞、における（ｖｉｉ）の成分を検証し、さらに選択すること、及び
（ｉｘ）リボ核タンパク質又はタンパク質−ＲＮＡ複合体、ベクター、タンパク質、核酸分子、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される送達システムによって、前記対象又は前記細胞に（ｖｉｉｉ）の成分を投与することであって、前記送達は、エレクトロポレーションにより、若しくは、脂質媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入若しくはインジェクション、又はそれらの組み合わせによって行われる、前記投与すること、
を含み、
（ｘ）インビトロでの細胞における治療のために、非限定的な例としてＧＦＰ、ＥＧＦＰ、又はピューロマイシン耐性が挙げられる選択マーカーが、所望により前記（ｖｉｉｉ）の成分に追加又は組み込まれている。
一態様では、インビボで対象における又はインビトロで細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正又は置換するための遺伝子編集組成物が提供される。そのような組成物は、典型的に、
（ｉ）配列番号４８〜５２の１つから選択されるか、配列番号４８〜５２の配列の１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するプロトスペーサーエレメント配列を含むＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）配列番号５６及び５７の１つから選択されるか、配列番号５６及び５７の１つ又はその相補的な配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するドナー核酸配列、及び
（ｉｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質（例示的な配列を配列番号５８に示す）（所望により、１、２、３又はそれ以上のＮＬＳ、及び／又は非限定的な例としてＧＦＰ又はＥＧＦＰが挙げられる選択マーカーを含む）、
を含む。
いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメント配列の前にオプショナルなヌクレオチドＧが付加される。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（例示的な配列（ただし、５’プロトスペーサーエレメント配列は含めていない）を配列番号５３に示す）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（例示的な配列を配列番号５４に示す）を含み；前記プロトスペーサーエレメント配列は前記ｃｒＲＮＡに含まれる。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、前記プロトスペーサーエレメント配列を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（例示的なｓｇＲＮＡ配列（ただし、５’プロトスペーサーエレメント配列は含めていない）を配列番号５５に示す）を含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の１又は複数の成分は、当該成分をコードするＤＮＡ分子、当該成分をコードするｍＲＮＡ分子、核酸分子、ベクター、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、又はタンパク質−ＲＮＡ複合体、及び／又はそれらの組み合わせの形態で提供される。
ＢＣＤ細胞療法、眼疾患自家細胞療法、及び併用療法に関する請求
ＢＣＤ細胞療法
ＢＣＤに対する遺伝子修復を伴わない同種（アロジェニック）細胞療法又は自家細胞療法
いくつかの態様では、対象における眼の疾患を治療又は予防する方法が提供され、前記疾患はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の病的な遺伝的又はエピジェネティックな変化に関連している。そのような方法は、典型的に、前記対象に細胞組成物を投与することを含み、前記細胞組成物は、幹細胞由来の、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体又は光受容体前駆細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、及び／又は他の眼細胞を含む。
いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、ｉＰＣ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、ＢＣＤを有しない又は病的ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を有しない１又は複数の対象からのものであるか、又はＢＣＤを有しない又は病的ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を有しない１又は複数の対象に由来するものである。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する１又は複数の対象からのものであるか、又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する１又は複数の対象に由来するものである。いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒト対象である。
ＢＣＤに対する遺伝的に修復された自家細胞療法
別の態様では、
（ａ）ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞、若しくはＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞、又は
（ｂ）ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞から分化した細胞、若しくはＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞から分化した細胞、
を含む細胞組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、前記対象から単離された細胞からリプログラミングされた前記幹細胞は、ｉＰＣ細胞である。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳ細胞は、前記対象の任意の組織の任意の細胞からリプログラムされる。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳ細胞は、皮膚細胞、血液細胞、尿細胞、有毛細胞、線維芽細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腎上皮細胞、毛包、又は真皮乳頭細胞からリプログラミングされる。いくつかの実施形態では、前記対象から単離された前記幹細胞は、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞から分化した前記細胞は、眼細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞から分化した細胞は、ＲＰＥ細胞、ＰＲＣ、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、ＣＥＣ、又はＣＥ細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞から分化した細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又はｉＰＳ−ＣＥ細胞である。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）ｉＰＳＣへリプログラミングするために使用される、ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞、
（ｉｉ）前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞、若しくは前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞、又は
（ｉｉｉ）前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞から分化した細胞、若しくは前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞から分化した細胞、
は、変異ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の影響を緩和するために遺伝的に修復される。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、ＩＰＳ細胞へのリプログラミング前に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、ｉＰＳ細胞へのリプログラミング後に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、幹細胞又はｉＰＳ細胞の分化前に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、幹細胞又はｉＰＳ細胞の分化後に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、遺伝子導入療法によって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子導入療法によって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、ＣＲｉＳＰＲ遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子編集によって行われる。
別の態様では、ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的な遺伝的又はエピジェネティックな変化を有する対象における眼の疾患を治療又は予防する方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載のＣＹＰ４Ｖ２自家細胞組成物のいずれかを対象に投与することを含み、前記細胞組成物は、幹細胞由来の、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体又は光受容体前駆細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、及び／又は対象の他の眼細胞を含む。
いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、ｉＰＣ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳ細胞は、転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣのうち１又は複数を使用してリプログラミングされる。いくつかの実施形態では、前記遺伝的に修復された細胞は、遺伝子修復を行う前と比較した、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；及び／又は細胞構造、細胞形態、細胞生存率、又は細胞機能の改善、の１又は複数を実証する。
いくつかの実施形態では、投与される細胞の量は、１回の投与で約１，０００〜約１億個の細胞である。いくつかの実施形態では、前記投与は、注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜下注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、硝子体内注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜への直接注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、角膜注射によるものである。いくつかの実施形態では、投与は、前記対象の眼の網膜下の場所、後部、又は角膜に細胞を効果的に送達するその他の任意の投与方法による。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の注射によって前記細胞が投与される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、シート、マトリックス、足場、又は組織の一部として投与される。
いくつかの実施形態では、前記ＲＰＥ細胞は、天然及び／又は合成の足場を使用して投与され、機能的なＲＰＥ単層を生成する。いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒト対象である。
眼疾患に対する遺伝的に修復された自家細胞療法
別の態様では、
（ａ）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞、又は
変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された幹細胞、又は
（ｂ）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された幹細胞から分化した細胞、又は
変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞から分化した細胞、
を含む細胞組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、前記対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞は、ｉＰＳ細胞である。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳ細胞は、前記対象の任意の組織の任意の細胞からリプログラムされる。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳ細胞は、皮膚細胞、血液細胞、尿細胞、有毛細胞、線維芽細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腎上皮細胞、毛包、又は真皮乳頭細胞からリプログラミングされる。いくつかの実施形態では、前記対象から単離された幹細胞は、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である。
いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、眼の発達又は機能に関与する、及び／又は前記遺伝子の変異が眼疾患を引き起こすか眼疾患を引き起こす危険因子である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、神経の発達又は機能に関与する、及び／又は前記遺伝子の変異が神経変性疾患を引き起こすか神経変性疾患を引き起こす危険因子である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、シトクロムＰ４５０遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、表４に示す遺伝子である。
いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、
変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、又は
不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、
を含む。
いくつかの実施形態では、前記幹細胞から分化した細胞は、任意の種類の細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞から分化した細胞は、眼細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞から分化した細胞は、ＲＰＥ細胞、ＰＲＣ、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、ＣＥＣ、ＣＥ細胞、又は視神経細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞から分化された細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又はｉＰＳ−ＣＥ細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞から分化された細胞は、ニューロンである。
いくつかの実施形態では、
（ｉ）ｉＰＳＣへリプログラミングするために使用される、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞、
（ｉｉ）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された幹細胞、又は
変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞、又は
（ｉｉｉ）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された幹細胞から分化した細胞、又は
変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞、
は、変異又は欠陥を有する遺伝子の影響を緩和するために遺伝的に修復される。
いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、ｉＰＳ細胞へのリプログラミング前に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、ｉＰＳ細胞へのリプログラミング後に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、幹細胞又はｉＰＳ細胞の分化前に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、幹細胞又はｉＰＳ細胞の分化後に行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、遺伝子導入療法によって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子導入療法によって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、遺伝子編集療法によって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子修復は、ＣＲｉＳＰＲ遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子編集療法によって行われる。
別の態様では、表４に記載の、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象において疾患を治療又は予防する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、本明細書に記載の自家細胞組成物を対象に投与することを含み、前記細胞組成物は、前記対象の幹細胞由来の、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体又は光受容体前駆細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、ニューロン、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、及び／又は他の眼細胞を含んでおり、前記細胞組成物中で前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子は遺伝的に修復済みである。
さらに別の態様では、対象を自家治療する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、
（ｉ）眼疾患に罹患した対象からの細胞を準備すること、
（ｉｉ）前記対象からの前記細胞に多能性を誘導してｉＰＳＣを生成すること、
（ｉｉｉ）前記対象に由来する前記ｉＰＳＣにおいて、表４に示される変異又は欠陥を有する遺伝子の１又は複数の変異を遺伝的に修復すること、
（ｉｖ）前記ｉＰＳＣを眼細胞に分化させること、
（ｖ）工程（ｉｉｉ）の代わりに、遺伝子導入療法によって前記ｉＰＳ−眼細胞を遺伝的に修復すること、及び
（ｖｉ）前記ｉＰＳ−眼細胞を前記対象に導入し、それにより、前記眼疾患を有する前記対象を自家治療すること、
を含む。
いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、ｉＰＣ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記ｉＰＳ細胞は、転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣのうち１又は複数を使用してリプログラミングされる。いくつかの実施形態では、前記遺伝的に修復された細胞は、遺伝子修復を行う前と比較した、前記細胞内の非欠陥標的遺伝子核酸配列の増加；前記細胞内の前記標的遺伝子にコードされる機能的ポリペプチドの量の増加；前記細胞における細胞構造、細胞形態、又は細胞機能の改善；及び／又は細胞内の生化学的機能の改善若しくは正常化、の１又は複数を表す。いくつかの実施形態では、投与される細胞の量は、１回の投与で約１，０００〜約１億個の細胞である。
いくつかの実施形態では、前記投与は、注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜下注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、硝子体内注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜への直接注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、角膜注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、前記対象の眼の網膜下の場所、後部、又は角膜に細胞を効果的に送達するその他の任意の投与方法による。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の注射によって前記細胞が投与される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、シート、マトリックス、足場、又は組織の一部として投与される。いくつかの実施形態では、前記ＲＰＥ細胞は、天然及び／又は合成の足場を使用して投与され、機能的なＲＰＥ単層を生成する。いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒト対象である。
いくつかの実施形態では、前記疾患は、前記対象の遺伝的又はエピジェネティックな変化又は危険因子に関連している。いくつかの実施形態では、前記疾患は、光受容体変性、網膜色素上皮細胞変性、網膜変性、角膜変性、及び／又は脈絡膜障害である。いくつかの実施形態では、前記疾患は、遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）である。いくつかの実施形態では、前記疾患は、又は網膜色素変性症（ＲＰ）である。いくつかの実施形態では、前記疾患は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィーとしても知られる）である。いくつかの実施形態では、前記疾患は、神経変性に関連している。いくつかの実施形態では、前記疾患は、角膜ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、前記対象は、ＢＣＤに罹患しているかＢＣＤを発症するリスクがある。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、線維芽細胞、血液細胞、又は眼細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、尿、毛、又は毛包から得られる。いくつかの実施形態では、前記眼細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、又は光受容体細胞（ＰＲＣ）である。
いくつかの実施形態では、前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、変異、挿入、一塩基多型、不適当なメチル化、不適当な脱メチル化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、変異である。いくつかの実施形態では、前記対象からの前記ｉＰＳ−眼細胞における前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、遺伝子編集を使用して遺伝的に修復済みである。いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮテクノロジー、又はＣＲＩＳＰＲテクノロジーを利用している。いくつかの実施形態では、前記対象からの前記ｉＰＳＣ−眼細胞における前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、遺伝子導入を使用して遺伝的に修復済みである。いくつかの実施形態では、前記遺伝子導入法は、組換えＡＡＶベクター又は別のウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、移植される前記細胞に前記標的遺伝子の健全なコピー（例えば、ｃＤＮＡ）を送達する。
いくつかの実施形態では、前記投与工程は、疾患症状の発現前又は疾患症状の発現後に行われる。いくつかの実施形態では、投与は、眼又はニューロンを含む別の臓器若しくは組織に対するものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜下注射又は硝子体内注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜への直接注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、角膜注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、前記対象の眼の網膜下の場所、後部、又は角膜に細胞を効果的に送達するその他の任意の投与方法による。
いくつかの実施形態では、前記方法は、投与又は移植の前に、前記細胞の遺伝子型分析を行って、表４に示す１又は複数の遺伝子の遺伝的又はエピジェネティックな変化の有無を確認することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、変異である。いくつかの実施形態では、前記変異は、前記ＣＹＰ４Ｖ２核酸分子内にある。いくつかの実施形態では、前記方法は、投与前に、前記対象の眼を評価して、損傷した又は維持されている光受容体、網膜細胞、又は角膜細胞の領域及び程度を特定すること、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、前記方法は、投与後に、前記対象をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記モニタリングには、非侵襲的網膜イメージング、角膜検査、視野測定、ＥＲＧ、ＯＣＴ、視力検査、及び／又は機能検査が含まれる。いくつかの実施形態では、前記モニタリングは、免疫応答について前記対象を評価することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、投与後に、前記対象の眼を評価して、損傷した又は維持されている光受容体、網膜細胞、又は角膜細胞の領域及び程度を特定すること、をさらに含む。
細胞療法−ＲＮＰに関する請求
ＲＮＰに関する請求
別の態様では、
（ａ）標的遺伝子（「標的遺伝子」）中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある核酸配列を（「標的配列」を）標的とするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、及び（ｂ）機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、を、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）又はタンパク質ＲＮＡ複合体内に含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、（ｃ）前記標的遺伝子又はその一部の修正又は置換のための、前記標的遺伝子の野生型配列又は機能的配列の全部又は一部を含むドナー核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、眼の発達又は機能に関与する、及び／又は前記標的遺伝子の変異は眼疾患を引き起こすか眼疾患を引き起こす危険因子である。いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、神経の発達又は機能に関与する、及び／又は前記標的遺伝子の変異は神経変性疾患を引き起こすか神経変性疾患を引き起こす危険因子である。
いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、シトクロムＰ４５０遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、変異若しくは欠陥を有する、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、表４に記載の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記ドナー核酸配列は、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）又はベクター中に提供される。
いくつかの実施形態では、
（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、（ｉ）標的遺伝子内又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列と、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の相補的な領域に対応する配列と、を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及び（ｉｉ）前記ｃｒＲＮＡの対応する領域に相補的な領域と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と相互作用する配列と、を含むｔｒａｃｒＲＮＡ、を含み、
（ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣａｓ９を含む。
いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメントは、約２０塩基、約１９塩基、約２１塩基、約１９〜２１塩基、約１８〜２２塩基、又は約１６〜２４塩基である。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、異なる核酸分子内にある。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）において組み合わされている。いくつかの実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、約８８〜１５０ｂｐである。
いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｄ１１３５Ｅ）、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ、ＳｐＣａｓ９ＥＱＲ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｎｏｎｉａｅ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、マイコプラズマ・カニス（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、及びエンテロコッカス・ファエカリス（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から選択されるＣａｓ９オーソログ又は変異体Ｃａｓ９を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、標的遺伝子中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列を含むｃｒＲＮＡを含み、（ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣｐｆ１を含む。いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメントは、約２０塩基、約２１塩基、約２２塩基、約２３塩基、約２４塩基、約１９〜２５塩基、約１８〜２６塩基、又は約１６〜２８塩基である。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であるＣａｓ９又はＣｐｆ１は、１、２、３又はそれ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端及び／又はＣ末端にさらに含む、及び／又は、非限定的な例としてＧＦＰ又はＥＧＦＰが挙げられる選択マーカーをさらに含む。
いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメントは、前記標的配列に１００％相補的であるか、標的配列に対応させると１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡ配列は、前記プロトスペーサーエレメントの直前に、前記ｃｒＲＮＡ配列に所望により追加されたＧヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡは、化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、ドナー核酸配列は、ｓｓＯＤＮで提供されるドナー核酸配列の場合、約１ｋｂ、約８００ｂｐ、約６００ｂｐ、約５００ｂｐ、約４００ｂｐ、約３００ｂｐ、約２８０ｂｐ、約２６０ｂｐ、約２４０ｂｐ、約２２０ｂｐ、又は約２００ｂｐ以下であり、ベクターで提供されるドナー核酸配列の場合、約３０ｋｂ、約２５ｋｂ、約２０ｋｂ、約１５ｋｂ、約１０ｋｂ、約９ｋｂ、約８ｋｂ、約７ｋｂ、約６ｋｂ、約５ｋｂ、約４．５ｋｂ、約４ｋｂ、約３．５ｋｂ、約３ｋｂ、約２．５ｋｂ、約２ｋｂ、約１．５ｋｂ、約１ｋｂ、約０．５ｋｂ、約０．２ｋｂ、又は約０．１ｋｂ以下である。いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子の野生型バージョンは、酵素をコードする。
いくつかの実施形態では、前記標的遺伝子は、
変異若しくは欠陥を有する、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、又は
不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、
を含む。
いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、及び／又は前記ドナー核酸配列を含む、１又は複数の成分は、当該成分に転写及び／又は翻訳できるベクター、ＤＮＡ、及び／又はｍＲＮＡに別々に及び／又は追加的に提供されている。一態様では、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む医薬製剤が提供される。
別の態様では、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる対象の疾患を治療又は予防する方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを前記対象に投与することによってそのような遺伝子を破壊、修正、又は置換することを含む。
別の態様では、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる対象の眼疾患を治療する又はこれに関連する危険因子を緩和する方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを前記対象に投与することによってそのような遺伝子を破壊、修正、又は置換することを含む。
別の態様では、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる対象の神経変性疾患を治療する又はこれに関連する危険因子を緩和する方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを前記対象に投与することによってそのような遺伝子を破壊、修正、又は置換することを含む。
別の態様では、変異若しくは欠陥を有するシトクロムＰ４５０遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードするシトクロムＰ４５０遺伝子、によって引き起こされる対象の疾患を治療する又はこれに関連する危険因子を緩和する方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを前記対象に投与することによってそのような遺伝子を破壊、修正、又は置換することを含む。
いくつかの実施形態では、破壊、修正、又は置換される、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、表４に示す遺伝子の変異若しくは欠陥があるバージョン、又は表４に示す遺伝子の不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードするバージョンである。いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、線維芽細胞、血液、ＲＰＥ、光受容体、網膜、角膜、脈絡膜、眼、視神経、ニューロン、若しくは幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の種類の細胞に存在する。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、線維芽細胞、血液、ＲＰＥ、光受容体、網膜、角膜、脈絡膜、眼、視神経、ニューロン、若しくは幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の種類の細胞に送達される。いくつかの実施形態では、送達は、エレクトロポレーションにより、若しくは脂質媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入、若しくはインジェクション、又はそれらの組み合わせにより行われる。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、及び／又は前記ドナー核酸配列を含む、１又は複数の成分は、リボ核タンパク質又はタンパク質−ＲＮＡ複合体、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される送達システムを介して前記対象又は前記細胞に投与される。
いくつかの実施形態では、前記治療は、対象に対してインビボで行われる。いくつかの実施形態では、前記治療は、インビトロで、線維芽細胞、血液、ＲＰＥ、光受容体、網膜、角膜、脈絡膜、眼、視神経、ニューロン、若しくは幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の種類の細胞に対して行われる。いくつかの実施形態では、前記治療された細胞は、インビボで対象に移植される、又は前記治療された細胞が幹細胞である場合、該幹細胞は移植のための所望の種類の細胞に分化させられ、その後分化した細胞はインビボで対象に移植される。
いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、置換される。いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子において、１又は複数の変異が修正又は置換される。いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、破壊される。
いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子において、１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１０００、又は１００１〜１００００塩基対のヌクレオチド又は変異が破壊、修正、又は置換される。いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の領域が、破壊、修正、又は置換される。いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の約１０、８、６、４、２、又は１ｋｂ未満である領域が、破壊、修正、又は置換される。
いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失によって破壊、修正、又は置換される。いくつかの実施形態では、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、片方又は両方のアレルにおいて破壊、修正、又は置換される。いくつかの実施形態では、２以上の異なるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、２以上の異なるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、及び／又は２以上の異なるドナー核酸配列を使用して、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子における、１又は複数の変異若しくは欠陥を破壊、修正、又は置換する。
いくつかの実施形態では、前記対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、前記対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、前記方法は、眼の発達又は機能を改善するか、眼、網膜、又は角膜の変性を予防する。いくつかの実施形態では、前記方法は、神経学的発達又は機能を改善するか、神経変性を予防する。いくつかの実施形態では、前記方法は、 Ｐ４５０酵素の発現又は機能を改善する。
いくつかの実施形態では、前記ドナー核酸配列に基づく相同組換修復は、前記標的遺伝子のイントロン及び／又はエクソンを生じた。いくつかの実施形態では、前記ドナー核酸配列に基づく相同組換修復は、前記標的遺伝子のスプライスアクセプターを生じた。そのような方法は、さらに（ｃ）変異又は変化された標的遺伝子又はその一部の生成のための、変異又は変化を有する表４に示す標的遺伝子の全部又は一部を含むドナー核酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子によって引き起こされる疾患の細胞疾患モデルを、そのような遺伝子に変異を作製することによって、作製する方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載の前記組成物のいずれかを介してそのような遺伝子の健康なバージョンを細胞へ送達することを含む。いくつかの実施形態では、送達は、エレクトロポレーションにより、若しくは脂質媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入、若しくはインジェクション、又はそれらの組み合わせにより行われる。いくつかの実施形態では、前記細胞は、線維芽細胞、血液、ＲＰＥ、光受容体、網膜、角膜、脈絡膜、眼、視神経、ニューロン、若しくは幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の種類の細胞である。
さらに別の態様では、表４に示す変異又は欠陥を有する遺伝子を有する細胞を含む組成物が提供される。
別の態様では、本願の請求項のいずれか一項に記載の組成物を含む、変異又は欠陥を有する、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、又はＣＹＰ４６Ａの遺伝子を有する細胞を含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、前記ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、前記プロトスペーサーエレメント配列は、配列番号４８〜５２からなる群から選択されるか、配列番号４８〜５２の一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を標的とするために、ＮＧＧをプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とするＣａｓタンパク質と共に使用される。いくつかの実施形態では、前記ドナー核酸配列は、配列番号５６及び５７から選択されるか、配列番号５６及び５７のいずれか又はその相補的な配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正、破壊、又は置換するために使用される。
遺伝子治療に関する請求
コドン最適化配列に関する請求
一態様では、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする配列番号２の核酸配列又は前記配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸分子が提供される。
別の態様では、本明細書に記載の核酸分子と、その核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の制御配列と、を含む発現カセットが提供される。さらに別の態様では、本明細書に記載の核酸分子又は本明細書に記載の発現カセットを含むベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、組換え単純ヘルペスウイルスベクター、組換えセンダイウイルスベクター、及び組換えレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター又はプラスミドである。いくつかの実施形態では、前記ベクターはプラスミド又は非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記非ウイルスベクターは、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、リポソーム、デンドリマー、及びナノ粒子からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の任意の前記核酸分子及び／又は本明細書に記載の任意の前記組成物を含む。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、細菌細胞、大腸菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖ２７細胞、Ａ５４９細胞、Ｋ５６２細胞、Ｂ５０細胞、ＷＩ３８細胞、Ｈｅｐ Ｇ２細胞、又はＢＨＫ細胞である。
別の態様では、本明細書に記載の任意の核酸分子、本明細書に記載の任意の発現カセット、又は本明細書に記載の任意のベクターは、そのような核酸分子によってコードされる産物を発現するために、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、ＲＰＥ細胞、光受容体又は光受容体前駆体（ＰＲＣ）、網膜細胞、角膜細胞、眼細胞、ニューロン、神経細胞、血液細胞、上皮細胞、体細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の細胞において使用される。
ＥＦＳ及び／又はＳＰＡに関する請求
別の態様では、ポリペプチドをコードする核酸分子、干渉ＲＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチド、に作動可能に連結した伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター及び／又はスモールポリアデニル化（ポリＡ）シグナル（ＳＰＡ）を含む自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、前記ＥＦＳプロモーターは、配列番号３５の少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなり、前記ＳＰＡは、配列番号３６の少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、前記ｓｃＡＡＶベクターは、前記核酸分子によってコードされる産物が細胞内で発現されるように、細胞に送達される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、脳細胞、ニューロン、神経細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の細胞である。
一態様では、遺伝子治療において、ウイルスベクターに対する免疫応答を低下させて形質導入効率を維持し、及び／又は同じ遺伝疾患の様々な患者に対する治療効果を最大化する方法が提供される。そのような方法は、
（ａ）遺伝子治療のための標的細胞型において充分な形質導入効率を持つ複数の組換えウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）のプールを確立すること（前記ウイルスベクタープールは、前記疾患に関連する標的細胞（例えば、ＢＣＤに対するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療におけるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系）において充分な形質導入効率を有することが確認された抗原領域変異若しくは他の変異を有するバリアント、又は前記ウイルスベクターのカプシドのバリアント、を作製することにより拡大することができる。）；
（ｂ）遺伝子治療を必要とする対象における様々なウイルスベクター血清型及び／又はカプシド変異又はバリアントに対する既存の中和抗ウイルスベクター抗体（ＮＡｂ）を検出し、及び／又は上記対象に由来する患者特異的細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）において様々なウイルスベクターを試験及び比較すること；
（ｃ）前記ウイルスベクターのプールから、充分な形質導入効率を有し、対象の既存のＮＡｂとの最も低い交差反応性を有するウイルスベクター、及び／又は前記対象の患者特異的細胞における最良の表現型レスキュー結果を有するウイルスベクターを選択することであって、
該ウイルスベクターのプールは、様々な血清型及び／又はカプシド改変ウイルスベクター（例えば、カプシド変異体ＡＡＶ及び／又はカプシドタンパク質バリアントＡＡＶを含むがこれらに限定されない）を含む、
前記選択すること；
（ｄ）（ｃ）から選択された前記ウイルスベクターを前記対象への投与に使用すること；及び
（ｅ）前記対象が遺伝子治療の投与を必要とするたびに、上記（ｂ）〜（ｄ）（既存のＮＡｂに関連する部分のみ）を繰り返すこと（例えば、限定されるものではないが、同じ眼若しくは反対側の眼、又は別の臓器へのフォローアップ投与）、
を含む。
別の態様では、有効量のベクター及び医薬的に許容される担体を含む、対象の疾患を治療又は予防するための組成物が提供される。通常、前記ベクターは、制御配列に作動可能に連結された、非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、前記疾患は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィーとしても知られる）である。いくつかの実施形態では、前記疾患は、前記対象の遺伝的又はエピジェネティックな変化に関連している。いくつかの実施形態では、前記疾患は、光受容体変性、網膜色素上皮細胞変性、網膜変性、角膜変性、又は脈絡膜変性である。いくつかの実施形態では、前記網膜変性は、網膜色素変性症（ＲＰ）である。いくつかの実施形態では、前記網膜変性は、遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）である。いくつかの実施形態では、前記疾患は、ＢＣＤである。いくつかの実施形態では、前記疾患は、角膜ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、前記対象は、ＢＣＤに罹患しているかＢＣＤを発症するリスクがある。
一態様では、制御配列に作動可能に連結された、非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含むベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶゲノム又はその誘導体、及び／又はＡＡＶカプシドタンパク質又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、キメラＡＡＶ、シャッフルＡＡＶ、又はカプシド改変ＡＡＶである。
いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶゲノム又はＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶの別の天然由来の血清型、分離株、若しくはグレード（Ｇｌａｄｅ）、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドのいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／１２、ＡＡＶ２／１０、及びＡＡＶ２／９）である。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、ハイブリッドＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ／８、又はＡＡＶ−ＤＪ／９）である。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、定向進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）及び／又は合理的設計法（ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）（例えば、ＡＡＶ ７ｍ８又はＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）を通じて開発される。
いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、１又は複数のカプシド変異（例えば、Ｙ−Ｆ、Ｋ−Ｒ、Ｔ−Ａ、Ｓ−Ａ及び／又はＴ−Ｖ変異（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、及びＴ４９１Ｖからの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ２、又は異なるＡＡＶ血清型における対応する変異（例えば、ＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）及びＡＡＶ２（Ｙ−Ｆを４つ（ｑｕａｄＹ−Ｆ）＋Ｔ−Ｖ））））を含む。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ｒｈ１０、及びＳｈＨ１０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ７ｍ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＳｈＨ１０、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ又はそれらのハイブリッド、誘導体、若しくはバリアントからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶベクター又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、プラスミド又は非ウイルスベクター（例えば、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、リポソーム、デンドリマー、及びナノ粒子）である。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、
（ｉ）ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）、
（ｉｉ）ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のバリアント（例えば、アミノ酸の変化及び／又はスプライスバリアント）（例えば、配列番号５）、
（ｉｉｉ）機能性ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の１又は複数の断片（例えば、配列番号６）、
（ｉｖ）他の種の１又は複数のＣＹＰ４Ｖ２オーソログからの配列の全て又は一部、
（ｖ）非限定的な例として他のＣＹＰ４タンパク質及びＣＹＰ４６Ａ１が挙げられる、１又は複数の他のＰ４５０タンパク質からの配列の全て又は一部、
（ｖｉ）患者の細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）の表４に挙げられている１又は複数の遺伝子の１又は複数の生化学的異常を改善、治療、又は阻止できるポリペプチド、及び／又は
（ｖｉｉ）上記の組み合わせ、
を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４、５、又は６に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、及びＣＹＰ４６Ａ１（配列番号４〜１８）及びそれらの誘導体、ハイブリッド、バリアント及び／又は断片からなる群から選択されるアミノ酸配列の全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ウマ、ウサギ、及びミバエのＣＹＰ４Ｖ２（又はＣＹＰ４Ｖ２のオーソログ）（配列番号１９〜２９）及びそれらの誘導体、ハイブリッド、バリアント及び／その断片からなる群から選択されるアミノ酸配列の全部又は一部を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列にコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４〜２９からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、ＦｘｘＧｘｘｘＣｘＧ及びＥｘｘＲ（配列番号３０及び３１）の配列エレメントを含む。いくつかの実施形態では、非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、患者細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）の表４に挙げられている１又は複数の前記遺伝子の１又は複数の生化学的異常を改善、治療、又は阻止できる化合物又は薬剤である。
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、配列番号４、５、又は６に示すアミノ酸配列を含む又は配列番号４、５、又は６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも７５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも７６％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記制御配列はプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＲＰＥ細胞特異的プロモーター、網膜細胞特異的プロモーター、角膜細胞特異的プロモーター、眼細胞特異的プロモーター、又は構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、哺乳動物βアクチンプロモーター又はウイルスプロモーターである。
いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（ハイブリッドＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧＳプロモーター、ＣＢプロモーター又はＣＢＡプロモーターとしても知られる））、ニワトリβアクチンプロモーター、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、ＣＢＳＢプロモーター、又はＣＢｈプロモーター、その他のβアクチンプロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター）、伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター、ＶＭＤ２（卵黄状黄斑ジストロフィー２；ＢＥＳＴ１としても知られる）プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、又はそれらのハイブリッド若しくは誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（ハイブリッドＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧＳプロモーター、ＣＢプロモーター又はＣＢＡプロモーターとしても知られる））、伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター、伸長因子１α短（ＥＦ−１α）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドである。いくつかの実施形態では、前記制御配列はエンハンサーを含む。
いくつかの実施形態では、前記エンハンサーは、非限定的な例としてＷＰＲＥエンハンサー、ＨＰＲＥエンハンサー、ＣＴＥエンハンサー又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドが挙げられるウイルスエンハンサーである。いくつかの実施形態では、前記制御配列はポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）、スモールポリＡシグナル（ＳＰＡ）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨポリＡ）、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドである。いくつかの実施形態では、前記制御配列はコザック配列（配列番号３７又は３８）を含む。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、担体と、特定の投与経路に適した追加の成分とで製剤化されている。
別の態様では、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む宿主細胞が提供される。
別の態様では、ベクターを前記対象に投与することを含み、前記ベクターは、制御配列に作動可能に連結した、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含む、対象における眼の疾患を治療又は予防する方法が提供される。
一態様では、ベクターを眼細胞へ送達することを含み、前記ベクターは、制御配列に作動可能に連結したヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含む、眼細胞の機能障害、ジストロフィー、障害、変性、萎縮及び／又は死滅を予防、阻止、進行遅延、又は改善するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、前記疾患は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィー、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性網膜症、Ｂｉｅｔｔｉ網膜ジストロフィーとしても知られる）である。いくつかの実施形態では、前記対象は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異によって引き起こされる臨床的に定義される他の眼科的状態（例えば、遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、又は角膜ジストロフィー）を患っている。いくつかの実施形態では、前記眼の疾患は、光受容体変性、網膜色素上皮細胞変性、網膜変性、角膜ジストロフィー、又はＢＣＤ角膜変性である。
いくつかの実施形態では、前記ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、組換え単純ヘルペスウイルスベクター、組換えセンダイウイルスベクター、及び組換えレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは、ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２のいずれかの血清型、又はＡＡＶのその他の天然由来の血清型、分離株、若しくはグレード（Ｇｌａｄｅ）、又はそれらのハイブリッド、バリアント、若しくは誘導体からなる群から選択されるＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクター５′ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶのその他の天然由来の血清型、分離株、若しくはグレード（Ｇｌａｄｅ）、又はそれらの変異体、キメラ、バリアント、又は融合体のいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクター３′ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶのその他の天然由来の血清型、分離株、若しくはグレード（Ｇｌａｄｅ）、又はそれらの変異体、キメラ、バリアント、又は融合体のいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、キメラＡＡＶ、シャッフルＡＡＶ、又はカプシド改変ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／１２、ＡＡＶ２／１０、及びＡＡＶ２／９）である。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、ハイブリッドＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ／８、又はＡＡＶ−ＤＪ／９）。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、定向進化法及び／又は合理的設計法（例えば、ＡＡＶ ７ｍ８又はＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）を通じて開発される。
いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶは、１又は複数のカプシド変異（例えば、Ｙ−Ｆ、Ｋ−Ｒ、Ｔ−Ａ、Ｓ−Ａ及び／又はＴ−Ｖ変異（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、及びＴ４９１Ｖからの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ２、又は異なるＡＡＶ血清型における対応する変異（例えば、ＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）及びＡＡＶ２（Ｙ−Ｆを４つ（ｑｕａｄＹ−Ｆ）＋Ｔ−Ｖ））））を含む。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ｒｈ１０、及びＳｈＨ１０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ７ｍ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＳｈＨ１０、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ又はそれらのハイブリッド、誘導体、若しくはバリアントからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶベクター又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、前記ベクターはプラスミド又は非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記非ウイルスベクターは、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、リポソーム、デンドリマー、及びナノ粒子からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、
（ｉ）ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）、
（ｉｉ）ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のバリアント（例えば、アミノ酸の変化及び／又はスプライスバリアント）（例えば、配列番号５）、
（ｉｉｉ）機能性ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の１又は複数の断片（例えば、配列番号６）、
（ｉｖ）他の種の１又は複数のＣＹＰ４Ｖ２オーソログからの配列の全て又は一部、
（ｖ）非限定的な例として他のＣＹＰ４タンパク質及びＣＹＰ４６Ａ１が挙げられる、１又は複数の他のＰ４５０タンパク質からの配列の全て又は一部、
（ｖｉ）患者の細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）の表４に挙げられている１又は複数の遺伝子の１又は複数の生化学的異常を改善、治療、又は阻止できるポリペプチド、及び／又は
（ｖｉｉ）上記の組み合わせ
を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４、５、又は６に示すアミノ酸配列の全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、及びＣＹＰ４６Ａ１（配列番号４〜１８）及びそれらの誘導体、ハイブリッド、バリアント及び／又は断片からなる群から選択されるアミノ酸配列の全部又は一部を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ウマ、ウサギ、及びミバエのＣＹＰ４Ｖ２（又はＣＹＰ４Ｖ２のオーソログ）（配列番号１９〜２９）及びそれらの誘導体、ハイブリッド、バリアント及び／その断片からなる群から選択されるアミノ酸配列の全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸配列にコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４〜２９からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、ＦｘｘＧｘｘｘＣｘＧ及びＥｘｘＲ（配列番号３０及び３１）の配列エレメントを含む。いくつかの実施形態では、非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、患者細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）の表４に挙げられている１又は複数の前記遺伝子の１又は複数の生化学的異常を改善、治療、又は阻止できる化合物又は薬剤である。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、請求項９１〜９７のいずれか一項に記載の非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、配列番号４、５、又は６に示すアミノ酸配列を含む又は配列番号４、５、又は６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する非変異又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、前記機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１、２、又は３のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、前記制御配列はプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＲＰＥ細胞特異的プロモーター、網膜細胞特異的プロモーター、角膜細胞特異的プロモーター、又は眼細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、哺乳動物βアクチンプロモーター又はウイルスプロモーターである。
いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（ハイブリッドＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧＳプロモーター、ＣＢプロモーター又はＣＢＡプロモーターとしても知られる））、ニワトリβアクチンプロモーター、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、ＣＢＳＢプロモーター、又はＣＢｈプロモーター、その他のβアクチンプロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター）、伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター、伸長因子１α短（ＥＦ−１α）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター、ＶＭＤ２（卵黄状黄斑ジストロフィー２；ＢＥＳＴ１としても知られる）プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、又はそれらのハイブリッド若しくは誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（ハイブリッドＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧＳプロモーター、ＣＢプロモーター又はＣＢＡプロモーターとしても知られる））、伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター、伸長因子１α短（ＥＦ−１α）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドである。
いくつかの実施形態では、前記制御配列はエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、前記エンハンサーは、非限定的な例としてＷＰＲＥエンハンサー、ＨＰＲＥエンハンサー、ＣＴＥエンハンサー、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドが挙げられる、ウイルスエンハンサーである。いくつかの実施形態では、前記制御配列はポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）、スモールポリＡシグナル（ＳＰＡ）、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨポリＡ）、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドである。いくつかの実施形態では、前記制御配列はコザック配列（配列番号３７又は３８）を含む。
いくつかの実施形態では、インビトロ治療のために、細胞あたり約１×１０３ＧＣ〜約１×１０６ＧＣ（ＧＣ：ゲノムコピー、ゲノムを含むＡＡＶ粒子を測定する（ベクターゲノム（ｖｇ）又はゲノム粒子（ｇｐ）としても知られる））の量（ＭＯＩ：感染多重度）で前記標的細胞への感染が行われる。いくつかの実施形態では、対象の眼へのインビボ投与のために、１回の投与は、約１×１０６ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣのオーダー（例えば、約１×１０１１ＧＣ〜約１×１０１２ＧＣの高用量範囲、約１×１０１０ＧＣ〜約１×１０１１ＧＣの中用量範囲、約１×１０９ＧＣ〜約１×１０１０ＧＣの低用量範囲、約１×１０６ＧＣ〜約１×１０９ＧＣの超低用量範囲、及び約１×１０１２ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣの超高用量範囲）で、又はこれらの範囲内の用量であってかつ所望の効果を提供するのに充分な任意の用量で実施することができる。
いくつかの実施形態では、前記投与工程は、疾患症状の発現前又は疾患症状の発現後に行われる。いくつかの実施形態では、前記投与は、眼に対するものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜下注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、硝子体内注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜への直接注射によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、前記対象の網膜下の場所、眼の後部、角膜又はＲＰＥ細胞、光受容器細胞又は角膜上皮細胞へ前記ベクターを効果的に送達するその他の任意の投与方法による。
いくつかの実施形態では、前記投与は、角膜送達によるものである。いくつかの実施形態では、前記眼への投与は、血流を介した送達によって達成される。いくつかの実施形態では、前記投与は、点眼によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、水晶体送達によるものである。いくつかの実施形態では、前記投与は、網膜下腔、角膜、水晶体、又は硝子体に行われる。いくつかの実施形態では、前記眼細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、網膜細胞、角膜細胞、水晶体細胞、神経節細胞、視神経細胞、及び／又は脈絡膜細胞、並びに幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、及び／又は組織特異的幹細胞が挙げられるがこれらに限定されない）に由来するこれらの種類の細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＢＣＤに罹患した又はＢＣＤを発症するリスクがある対象を特定することをさらに含んでもよい。
Ｃａｓをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターにおけるＥＦＳ及び／又はＳＰＡの使用に関する請求
一態様では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）をコードする核酸分子に作動可能に連結した、伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター及び／又はスモールポリアデニル化（ポリＡ）シグナル（ＳＰＡ）を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、前記ＥＦＳプロモーターは、配列番号３５の少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなり、前記ＳＰＡは、配列番号３６の少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの実施形態では、前記ＥＦＳプロモーター及び／又は前記ＳＰＡに作動可能に連結された前記核酸配列にコードされる前記Ｃａｓは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である。
本明細書に記載のｒＡＡＶを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、細菌細胞、大腸菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は体細胞又は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、脳細胞、ニューロン、神経細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、組織特異的細胞、幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の細胞である。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶベクターは、前記核酸分子によってコードされるＣａｓが細胞内で発現されるように、宿主細胞に送達される。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、請求項１３１〜１３４のいずれか一項に記載のいずれかの細胞を含む。
本発明のその他の特徴及び利点は、発明を実施するための形態、図面の簡単な説明、及び実施例、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及びその他の参考文献は、その全体が参照により援用される。
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の図及び図面でさらに説明される。
細胞系特許：
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ細胞系（ａ）ＢＣＤ患者の皮膚生検試料の線維芽細胞から作製されたｉＰＳ細胞 （ｉ）患者１（Ｐ１）ｉＰＳ細胞（ｉｉ）患者２（Ｐ２）ｉＰＳ細胞（ｉｉｉ）Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、及びＳＳＥＡ−４マーカーによるＰ１及びＰ２ｉＰＳ細胞系の特性評価（ｉｖ）Ｎａｎｏｇ及びＴｒａ−１−６０マーカーによるＰ１及びＰ２ｉＰＳ細胞系の特性評価 （ｂ）血液試料の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＢＣＤ患者及び健康な対照から作製されたｉＰＳ細胞：（ｉ）ｉＰＳ細胞系の位相コントラスト画像（ｉｉ）ｉＰＳ細胞系のＡＰ染色結果（ｃ）正常なヒト核型を示すとみられるＢＣＤ患者由来のｉＰＳ細胞核型画像 ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系（ａ）ＲＰＥ特有の形態（六角形、色素沈着、及び単層）を示すＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系の明視野画像：（ｉ）Ｐ１ ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞（ｉｉ）Ｐ２ ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞（ｂ）ＲＰＥ特異的マーカーであるＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、及びＭＩＴＦの存在を示す、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のＲＰＥマーカーの結果。
ｉＰＳ−ＲＰＥ試料におけるＣＹＰ４Ｖ２発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果。ＷＴ（対照）。ＷＴ ＡＶＥ（対照の平均）。Ｐ１（ＢＣＤ患者１）。Ｐ１−ＡＡＶ８（ＡＡＶ８．ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖにより処置したＰ１試料、ＭＯＩ＝１．５×１０ｅ４ＧＣ／細胞）
ｉＰＳ−ＲＰＥ試料におけるＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果。ＷＴ（対照）。ＷＴ ＡＶＥ（対照の平均）。Ｐ１及びＰ２（ＢＣＤ患者１及び患者２）。Ｐ１−ＡＡＶ２（ＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐで処置したＰ１試料、ＭＯＩ＝２×１０ｅ４ＧＣ／細胞）。Ｐ２−ＡＡＶ２（ＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐで処置したＰ２試料、ＭＯＩ＝２×１０ｅ４ＧＣ／細胞）。Ｐ２−ｓｃＡＡＶ１（ｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐにより処置したＰ２試料、ＭＯＩ＝２×１０ｅ４ＧＣ／細胞）
青色光に暴露されていないｉＰＳ−ＲＰＥ試料の細胞生存画像。ＷＴ（対照）。Ｐ１及びＰ２（ＢＣＤ患者１及び患者２）。赤色（死細胞／病気の細胞）、緑色（生細胞／健康な細胞）。 赤色のみ 赤色及び緑色 青色光に１時間暴露後のｉＰＳ−ＲＰＥ試料の細胞生存画像。ＷＴ（対照）。Ｐ１及びＰ２（ＢＣＤ患者１及び患者２）。赤色（死細胞／病気の細胞）；緑色（生細胞／健常な細胞）。 赤色のみ 赤色及び緑色
遺伝子治療：
例示的なＣＹＰ４Ｖ２発現カセット及び組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの模式図及び注釈（ａ）一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターにパッケージ化されたＣＹＰ４Ｖ２発現カセット（エンハンサー付き）（ｂ）一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターにパッケージ化されたＣＹＰ４Ｖ２発現カセット（エンハンサーなし）（ｃ）自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）又はｓｓＡＡＶベクターにパッケージ化されたＣＹＰ４Ｖ２発現カセット注釈： ＣＹＰ４Ｖ２発現カセット（ＡＡＶ ＩＴＲに隣接して示される）は、任意のＡＡＶ血清型又はそのハイブリッド若しくはバリアントからのカプシドとともにｒＡＡＶベクターにパッケージ化することができる。 ＩＴＲ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（末端逆位反復配列）（ＡＡＶ２ ＩＴＲ又は他のＡＡＶ血清型のＩＴＲである可能性がある）。例示的なＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を配列番号４２及び配列番号４３に示す。 ＣＹＰ４Ｖ２：ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又はその機能的バリアントをコードするｃＤＮＡ、例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードするＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ（配列番号１）若しくはＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ（配列番号２）、又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号５）をコードするＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ（配列番号３）。 コザック配列（配列番号３７又は配列番号３８に示す配列）は、ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ配列の直前に挿入される。 ＣＡＧ：ハイブリッドＣＡＧプロモーター（例示的な配列を配列番号３２に示す）。非限定的な例としてＣＭＶプロモーター（例示的な配列を配列番号４０に示す）又はＥＦ−１αプロモーター（例示的な配列を配列番号４１に示す）が挙げられる、本明細書に記載の他のプロモーターを使用してもよい。 ＷＰＲＥ：ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）（例示的な配列を配列番号３３に示す）。 ｂＧＨポリＡ：ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（例示的な配列を配列番号３４に示す）。ＳＶ４０後期ポリＡシグナル（例示的な配列を配列番号３９に示す）など、代替のポリＡシグナルを使用してもよい。 ＥＦＳ：ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １α ｓｈｏｒｔ（ＥＦＳ）コアプロモーター（伸長因子１α短（ＥＦＳ）コアプロモーター）。例示的な配列を配列番号３５に示す。 ＳＰＡ：スモールポリＡシグナル。例示的な配列を配列番号３６に示す。 変異体／切断型ＩＴＲ：ｓｃＡＡＶベクターで使用される２つのＩＴＲの１つは、変異体／切断型ＩＴＲ（ＩＴＲ＊として表示）である。例示的な配列を配列番号４４に示す。 ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットでは、エンハンサーはオプショナルで存在する。 青色光に１時間暴露後のＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料の細胞生存画像（ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置なし ｖｓ． ＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ又はｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによる処置（ＭＯＩ＝１×１０ｅ５ＧＣ／細胞））。Ｐ１及びＰ２（ＢＣＤ患者１及び患者２）。赤色（死細胞／病気の細胞）；緑色（生細胞／健常な細胞）。 赤色のみ 赤色及び緑色 青色光に１時間暴露後のＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料の細胞生存画像（ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置なし ｖｓ． ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ、又はＡＡＶ８．ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖによる処置（ＭＯＩ＝１×１０ｅ５ＧＣ／細胞））。Ｐ１（ＢＣＤ患者１）。赤色（死細胞／病気の細胞）；緑色（生細胞／健常な細胞）。 赤色のみ 赤色及び緑色 青色光に１時間暴露後のＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料の細胞生存画像（ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置なし ｖｓ． ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、又はｓｃＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによる処置（ＭＯＩ＝１×１０ｅ４ＧＣ／細胞））。Ｐ２（ＢＣＤ患者２）。赤色（死細胞／病気の細胞）；緑色（生細胞／健常な細胞）。 赤色のみ 赤色及び緑色 青色光に１時間暴露後のＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料の細胞生存画像（ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置なし ｖｓ． ｓｃＡＡＶ９．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによる処置（ＭＯＩ＝１×１０ｅ５ＧＣ／細胞））。Ｐ１（ＢＣＤ患者１）。赤色（死細胞／病気の細胞）；緑色（生細胞／健常な細胞）。 赤色のみ 赤色及び緑色細胞療法： 図１２は、ＣＹＰ４Ｖ２配列の領域、及びｇＲＮＡ活性アッセイ用のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異に対する設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とプライマー（オレンジ色の矢印）の位置を示す図である。 図１３は、インビトロの調査又はアッセイを示す。レーン１：アンプリコン＋Ｃａｓ９；レーン２：アンプリコン＋ｇ１＋Ｃａｓ９；レーン３：アンプリコン＋ｇ２＋Ｃａｓ９；レーン４：アンプリコン＋ｇ３＋Ｃａｓ９；レーン５：アンプリコン＋ｇ４＋Ｃａｓ９；レーン６：アンプリコン＋ｇ５＋Ｃａｓ９；レーン７：アンプリコンのみ；Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡマーカー。
図１４は、調査又はアッセイで使用されるＤＮＡの起点を確認する配列比較である。上：未処置アンプリコン；中：ｇ２処置アンプリコンの断片；下：変異部位を示すＣＹＰ４Ｖ２遺伝子座。
図１５は、ｇＲＮＡベクター構造を示す図である。 図１６は、ｇＲＮＡ（例としてｇ１を使用）、Ｃａｓ９、及びＰｕｒｏＲ共発現プラスミドｐＸ４５９−ｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏのベクターマップを示す図である。 図１７は、ｐＸ４５９−ｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−ＰｕｒｏプラスミドのＵ６プロモーターに対するｇＲＮＡの位置（例としてｇ１を使用）を示す図である。Ｕ６プロモーター及びｇＲＮＡの間の「Ｇ」ヌクレオチドは、Ｕ６プロモーターによって促進される転写効率を高めるためのものである。別のプロモーターを使用する場合、又はｇＲＮＡが「Ｇ」ヌクレオチドで始まる場合、これはオプショナルであり必要とは限らない。
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「１つ（の）」（「ａ」又は「ａｎ」）は、それが使用される文脈に応じて１又は複数を意味し得ることを理解されたい。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」に言及する場合、「少なくとも１つの細胞」又は「複数の細胞」を意味し得る。
用語「約」若しくは「およそ」又は記号「≒」は、所与の値又は状態の±１０％（端点を含む）の範囲内を指す。文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書で提示される全ての数値は、「約」という用語によって修飾され得る。
「ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２」という用語は、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを指す。
「ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療」という用語は、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞及び／又は対象への導入を指す。本開示の詳細な説明を参照のこと。
「有効量」、「有効投与量」、又は「治療有効投与量」という用語は、治療を必要とする対象に投与した場合に、その治療を行うのに充分及び／又は適切な化合物（例えば、ベクター）及び／又は細胞の量を指す。有効量は、使用される治療薬の特定の活性、患者の病状の重症度、並びに対象の年齢、体調、その他の病状の存在、及び栄養状態に応じて異なるであろう。さらに、患者が受けている可能性のあるその他の薬物療法及び／又は治療は、投与する治療薬の有効量の決定に影響を与えるであろう。さらなる詳細については、本明細書の記載を参照のこと。
「治療」又は「治療する」という用語は、本明細書に開示される組成物（例えば、導入遺伝子を含むＡＡＶ、及び／又は細胞）の以下を含む目的のための対象への投与を指す：
１）疾患又は状態に対して予防又は保護する、つまり、臨床症状を発症させないこと、
２）疾患又は状態を阻害する、すなわち、臨床症状の発現を阻止、減速、改善、又は抑制すること、
３）疾患又は状態を緩和する、すなわち、臨床症状を軽減すること、及び／又は
４）罹患細胞、組織、及び／又は臓器の機能喪失を置換及び／又は回復させること。
いくつかの実施形態では、「治療」又は「治療する」という用語は、疾患又は状態を緩和すること、つまり、臨床症状を軽減することを指す。いくつかの実施形態では、「治療」又は「治療する」という用語は、上記に代えて又は上記に加えて、治療を必要とする対象の予防的治療を指す。予防的治療は、病気に苦しむリスクのある対象に適切な用量の治療薬を提供することにより達成することができ、それにより病気の発症を実質的に回避することができる。１又は複数の最終的に誘導されるイベントは不明又は潜在的であるか、１又は複数のイベントの発生後しばらくの間患者において確認されない可能性があるため、「予防」及び「抑制」を常に区別できるわけではないことを当業者は理解するであろう。したがって、本明細書で使用される「予防」という用語は、「治療」の要素として、本明細書で定義される「予防」及び「抑制」の両方を包含することが意図されている。
「対象」という用語は、動物、例えば哺乳動物（ヒトなど）を指す。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療、前臨床、及び獣医学の用途に有用であり得る。いくつかの実施形態では、前記対象は哺乳動物であり、いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。
「バリアント」とは、生物活性タンパク質の治療的及び／又は生物学的活性の少なくとも一部を保持する基準となる生物活性タンパク質と配列相同性を有するタンパク質である。例えば、バリアントタンパク質は、基準となる生物活性タンパク質に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。「生物活性タンパク質」という用語には、例えば、部位特異的変異誘発、挿入、又は偶然の変異によるなど、意図的に改変されたタンパク質が含まれる。「バリアント」には、治療的及び／又は生物学的活性の少なくとも一部を保持する天然又は非天然の生物活性タンパク質の切断型である「断片」が含まれる。
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、ポリヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドの全ての形態を指すために本明細書で使用される。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドには、天然、合成、及び意図的に修飾又は改変されたポリヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、若しくは三本鎖、線形若しくは円形であり得、任意の長さであり得る。特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向の配列を提示する慣例に従って本明細書に記載され得る。
「配列バリアント」という用語は、１又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換により、天然又は元の配列と比較して改変された遺伝子又はポリペプチドを意味する。挿入は、遺伝子又はタンパク質の一方又は両方の末端に位置してもよく、及び／又はヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の内部領域内に配置してもよい。欠失バリアントでは、本明細書に記載の遺伝子又はポリペプチドの１又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基が除去される。置換バリアントでは、遺伝子又はポリペプチドの１又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基が除去され、代替残基に置換される。一態様では、置換は本質的に保存的であり、この種類の保存的置換は当技術分野で周知である。
本明細書で使用される場合、「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、インビボで対象に適用してもよく、又はインビトロで細胞に適用してもよい。
本明細書で使用される場合、プラスミドはベクターの一種である。
本明細書で使用される用語「遺伝的に修復された」又は「遺伝子修復」とは、もともと遺伝子の遺伝的欠陥（例えば、変異又は病的変化）を有する細胞であって、その遺伝的欠陥が、細胞のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおける遺伝子修正又は破壊（本明細書では「遺伝子編集」、「遺伝子編集療法」、又は「遺伝子修正」と定義）、又は欠陥遺伝子に相当する機能的タンパク質を発現する細胞への外因性核酸分子による遺伝子導入又は補充（本明細書では「遺伝子導入療法」又は「遺伝子治療」と定義される）のいずれかにより修復されている細胞をいう。
本明細書で使用される「パーセント配列同一性」又は「配列同一性」という用語は、次のように決定及び計算されるものとする。（パーセント）配列同一性の計算では、２つの配列が整列（アラインメント）され、２つの配列間のヌクレオチド又はアミノ酸残基の完全な一致の数が決定される。完全な一致の数は、整列領域の長さ（つまり、整列したヌクレオチド又はアミノ酸残基の数）で除算され、１００を掛けてパーセント配列同一性値とする（そして、次に大きい整数に切り上げられる（例えば、６５．０１％は６６％に切り上げられ、本明細書の目的では６６％と見なされる）。整列領域の長さは、片方又は両方の配列の一部であり得、短い方の配列の正味の全長（ギャップを適用しない）のサイズまでであり得ることが理解されよう。完全な一致を決定し、２つのタンパク質コード化ヌクレオチド配列間の配列同一性を計算するには、アライメント用の２つの配列を提出し配列同一性を計算する前に、非コード化ヌクレオチド配列（例えば、限定されるものではないが、イントロン、ＵＴＲ、コザック配列、プロモーター、エンハンサー、又は他の制御配列）が削除される。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）及びＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂにおいて入手可能：ヌクレオチドのアラインメントにはebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.htmL、タンパク質のアラインメントにはebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)を用い、またデフォルトのパラメーター（ヌクレオチド配列用：
Ｍａｔｒｉｘ：ＥＤＮＡＦＵＬＬ．
Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ：１０．
Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ Ｐｅｎａｌｔｙ：０．５．
Ｏｕｔｐｕｔ ｆｏｒｍａｔ：ｐａｉｒ．
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：ｆａｌｓｅ．
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ：１０．
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ Ｐｅｎａｌｔｙ：０．５．
タンパク質配列用：
Ｍａｔｒｉｘ：ＥＢＬＯＳＵＭ６２．
Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ：１０．
Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ Ｐｅｎａｌｔｙ：０．５．
Ｏｕｔｐｕｔ ｆｏｒｍａｔ：ｐａｉｒ．
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：ｆａｌｓｅ．
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ：１０．．
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ Ｐｅｎａｌｔｙ：０．５．）
を用いて、２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作成するＰａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して、２つの配列間のヌクレオチド又はアミノ酸残基の完全な一致の数を決定する２つの配列のアラインメントを実行することができる。
「アデノ随伴ウイルスベクター」という用語は、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２血清型、又はＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質に対してカプシドタンパク質配列相同性を有する他のウイルス又は血清型などの任意のＡＡＶ血清型に由来する核酸を指す。「組換えアデノ随伴ウイルス」又は「ｒＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ ＩＴＲが片側又は両側に隣接した目的の核酸分子をカプセル化したＡＡＶタンパク質シェルで構成される感染性の複製欠損ウイルスを指す。本明細書で使用される特定のＡＡＶ血清型への言及は、そのＡＡＶ血清型の少なくとも１つのカプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。例えば、用語「ＡＡＶ２」は、少なくとも１つのＡＡＶ血清型２カプシドタンパク質を有するＡＡＶを指す。
「ＣＹＰ４Ｖ２」という用語は、シトクロムＰ４５０ ４Ｖ２又はシトクロムＰ４５０、ファミリー４、サブファミリーＶ、ポリペプチド２（場合によりＣＹＰ４ＡＨ１と称する）、及び他の種におけるそのオーソログを指す。ＣＹＰ４Ｖ２の変異はＢＣＤ（例えば、Li et al., Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004を参照）及び網膜色素変性症（例えば、Wang et al., PLOS ONE 7:e33673, 2012を参照）と関連している。全長ゲノムヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の長さは約２２，０５３ｂｐであり、例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上（genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CYP4V2&keywords=CYP4V2）で確認できる。本明細書で使用される「ｈＣＹＰ４Ｖ２」という用語は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子又はタンパク質を指す。ｈＣＹＰ４Ｖ２及びＣＹＰ４Ｖ２は、遺伝的又はエピジェネティックな変化を含む遺伝子又はタンパク質、又は遺伝的又はエピジェネティックな変化を含まない遺伝子又はタンパク質を指し得ることが理解されるであろう。
本明細書で使用される「機能的ＣＹＰ４Ｖ２」という用語は、発現すると、個体（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２分子に遺伝的又はエピジェネティックな変化を有する個体）に対して治療的利益（例えば、標的細胞内の異常な脂肪酸レベル（ＤＨＡレベルなど）を改善又はレスキュー（救済）する）を提供するのに有効なタンパク質を産生するタンパク質又はヌクレオチド分子を指す。機能的ＣＹＰ４Ｖ２分子は、野生型ｈＣＹＰ４Ｖ２配列若しくはその天然に存在するバリアント（例えば、病的変化を含まないバリアントなどの多型バリアント）、又は最適化された配列に相当し得る。いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２分子は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２と同様のオーソロジーを共有する別の種（例えば、げっ歯類、ウサギ、犬、豚、又は非ヒト霊長類などの別の哺乳類）のＣＹＰ４Ｖ２分子である。例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２配列のオーソログはマウスｍＣｙｐ４ｖ３配列である。いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２分子は別のＰ４５０分子である（例えば、ＣＹＰ４タンパク質）。
「眼細胞」という用語は、任意の眼の細胞又は眼機能に関連する細胞を指し、非限定的な例として、網膜細胞、網膜双極細胞、光受容体細胞又は光受容体前駆細胞（桿体及び／又は錐体を含み、「ＰＲＣ（ｐｈｏｔｏｒｅｃｐｔｏｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」と総称される）、神経節細胞、網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（ＲＰＥ））細胞、脈絡膜上皮（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（ＣＥ））細胞、角膜上皮細胞（ｃｏｒｎｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｅｌｌ（ＣＥＣ））、脈絡膜細胞、角膜細胞、又は視神経細胞が挙げられる。
「機能喪失（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｌｏｓｓ）」又は「機能不全（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）」という用語は、正常な非罹患細胞、又は他方の眼若しくはより早い時点における同じ眼と比較した、細胞機能（例えば、光受容体機能、光受容体細胞機能、網膜色素上皮細胞機能、水晶体機能、脈絡膜機能、又は角膜機能）の低減又は喪失を指す。本明細書で使用される「変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、「萎縮（ａｔｒｏｐｈｙ）」、「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、「疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）」、及び／又は「ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）」という用語は、機能喪失と同義的に使用することができる。「機能増進」という用語は、罹患している眼（同じ眼疾患を有する）、より早い時点での同じ眼、同じ眼の未治療部分、又は同じ患者の反対側の眼と比較して、機能（例えば、光受容体、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、脈絡膜細胞、又は角膜細胞の機能）を改善する、又は機能的な光受容体若しくは光受容体細胞（例えば、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、脈絡膜細胞、又は角膜細胞）の数又は割合を増やすことを意味する。
「導入遺伝子」という用語は、細胞又は生物に導入されることを意図した又は導入されたドナー核酸を指す。導入遺伝子には、表４に示す遺伝子又はｃＤＮＡなど、任意の遺伝子が含まれる。
「医薬的に許容可能な製剤」、「生理学的に許容可能な製剤」、及び「医薬的に許容可能な担体」という用語は、インビボ送達、インビトロ送達又は接触において、１又は複数の投与経路に適した、気体、液体、固体、又はそれらの混合物であってもよい生物学的に許容可能な製剤を意味し、他の疾患の治療（例えば、他の眼疾患の遺伝子治療又は細胞療法）に使用される製剤又は担体を含んでもよい。「医薬的に許容される」又は「生理学的に許容される」組成物は、生物学的又はその他の点で望ましくないものではない物質であり、例えば、このような物質は、実質的に望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与可能である。したがって、そのような医薬組成物は、例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスベクター、又はナノ粒子を細胞又は対象に投与する際に使用され得る。そのような組成物としては、限定されるものではないが、医薬品投与、又はインビボ若しくはインビトロでの接触又は送達に適合しうる、溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、エマルジョン（例えば、水中油又は油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散媒、懸濁媒体、コーティング、等張剤、及び吸収促進剤又は吸収遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁液には、懸濁化剤、潤滑剤、及び増粘剤が含まれてもよい。そのような医薬的に許容される担体には、錠剤（コーティング又は非コーティング）、カプセル（ハード又はソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が含まれる。補助的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、及び免疫抑制剤）を組成物に組み込んでもよい。医薬組成物は、本明細書に記載の又は当業者に周知の、特定の投与又は送達経路に適合するように製剤化してもよい。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
「ｃｒＲＮＡ」という用語はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを指し、これはプロトスペーサーエレメントと、ｔｒａｃｒＲＮＡに相補的な追加のヌクレオチドと、の両方を含む。
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という用語はｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡを指し、これはｃｒＲＮＡにハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質に結合し、複合体を活性化して、ゲノム配列内の特定の部位に二本鎖切断を生じる。
「ｓｇＲＮＡ」という用語はシングルガイドＲＮＡを指し、これはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ（これらはＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓの天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいては別個の分子である）を一つのＲＮＡコンストラクト中に結合したものである。
用語「ＰＡＭ」は「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）を指し、これは切断部位としてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼにより認識される、ゲノムのいずれかの鎖における短い配列である。ＰＡＭはヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）によって異なる。プロトスペーサーエレメント配列は通常、ＰＡＭ部位のすぐ上流にある。
「プロトスペーサーエレメント」（「ガイドＲＮＡ」、「ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、又はｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、ｇ５などとも称される）という用語は、ゲノムＤＮＡ標的配列に相補的である、ｃｒＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ）の一部を指す。
ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸；２２：６（ω−３）又はＣ２２：６ ｎ３としても知られる多価不飽和オメガ３脂肪酸
ＡＡ：アラキドン酸；２０：４（ω−６）若しくはＣ２０：４ ｎ６、又はＡＲＡとしても知られる多価不飽和オメガ−６脂肪酸
ＰＢＳ（＋）：カルシウム及びマグネシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
ＰＢＳ（−）：カルシウム又はマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
ＢＣＤ細胞疾患モデルのための方法及び組成物
適切なＢＣＤ疾患モデルを開発し、ＢＣＤの分子レベルの表現型を確認することは、ＢＣＤに関連したＢＣＤ用薬剤及び治療オプションの研究、開発、及び試験にとって重要である。これはＣＹＰ４Ｖ２機能の研究にとっても重要である。本明細書の背景技術のセクションで概説したように、ＢＣＤの臨床表現型は８０年前から特性化、確立、研究されており、ＢＣＤを生じる遺伝子変異は１０年以上にわたって同定されてきた。しかし、臨床表現型（例えば、ＢＣＤ患者の網膜の結晶様沈着物）とその原因となるＣＹＰ４Ｖ２変異との間にはまだギャップがある。
ＢＣＤに関する以前の研究では、線維芽細胞、リンパ球、及び血清などにおいて、異常な脂肪酸レベルがＢＣＤ患者に認められている。例えば、Lee et al., The Metabolism of Fatty Acids in Human Bietti Crystalline Dystrophy, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jul;42(8):1707-14では、研究者はパルスチェイス法を使用して、ＢＣＤ患者の線維芽細胞及びリンパ球の異常を研究した。ＢＣＤ患者及び正常対照の線維芽細胞及びリンパ球が、［（１４）Ｃ］１８：３ｎ−３又は［（１４）Ｃ］１８：２ｎ−６と共にインキュベートされた。ＢＣＤ患者の線維芽細胞では、１８：３ｎ−３の多価不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ（ＰＵＦＡ））への変換が正常な被験者よりも低かったが、１８：２ｎ−６にはこれが当てはまらなかった。別の研究（Lai et al., Alterations in Serum Fatty Acid Concentrations and Desaturase Activities in Bietti Crystalline Dystrophy Unaffected by CYP4V2 Genotypes, Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51:1092-7）では、研究者はＧＣ−ＭＳを使用して、ＢＣＤ患者及び対照の血清試料中の血清脂肪酸濃度を分析した。この研究により、ＢＣＤ患者の血清中のオクタデカン酸（１８：０）の濃度は対照被験者よりも高く、オクタデカジエン酸（１８：１ｎ−９）の濃度は対照被験者よりも低いことが判明した。さらに、ＢＣＤの一価不飽和脂肪酸の総濃度は、対照よりも有意に低かった。ＢＣＤ患者試料は研究対象として使用されていない別の研究（Nakano et al., CYP4V2 in Bietti’s Crystalline Dystrophy:Ocular Localization, Metabolism of omega-3-Polyunsaturated Fatty Acids, and Functional Deficit of the p.H331P Variant, Mol Pharmacol 82:679-686, 2012）の結果では、ＣＹＰ４Ｖ２酵素がオメガ−３−ＰＵＦＡに対するオメガヒドロキシラーゼ活性を有することが示唆された。
ＢＣＤ患者の線維芽細胞及び血清に見られる異常な脂肪酸レベルが、ＢＣＤの原因となる細胞であるＢＣＤ患者のＲＰＥ細胞に実際に存在するかどうかを確認することは重要である。したがって、ＢＣＤ疾患の病態及びＣＹＰ４Ｖ２機能の理解を深め、治療オプションの有効性を評価するために、ＢＣＤ患者のＲＰＥ細胞を直接調べることを可能とするＢＣＤ疾患モデルが望まれる。しかしながら、ＲＰＥの位置及びＢＣＤの希少性を考慮すると、ＢＣＤ患者からネイティブなＲＰＥ細胞を得ることは実際的ではない。
本開示は、ＢＣＤ細胞モデル及びＢＣＤ細胞モデルを生成する方法を提供する。ＢＣＤ細胞モデルは、ＢＣＤ患者特異的幹細胞（非限定的な例として、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、体性（又は成人）幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる）及びＢＣＤ患者の任意の幹細胞に由来する、眼細胞（非限定的な例として、ＲＰＥ細胞、光受容体（桿体又は錐体）細胞、光受容体前駆細胞、角膜上皮細胞、水晶体細胞及び／又は脈絡膜細胞が挙げられる）からなる。患者特異的幹細胞に加えて、ＢＣＤを有しない個体の細胞に人工ＣＹＰ４Ｖ２変異を作製することにより、ＢＣＤ細胞モデルを生成することも可能であり、そのような細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、若しくは他の幹細胞、又は幹細胞にリプログラミング可能な任意の細胞若しくは任意の眼細胞（幹細胞由来又は非由来のいずれであってもよい）であり得る。
人工多能性幹細胞技術は、動物モデルに代わる疾患モデリングの代替手段を提供する。ただし、全ての疾患がｉＰＳＣを使用してモデル化に成功しているわけではない（Urbach, A., Bar-Nur, O., Daley, G. Q. & Benvenisty, N. Differential Modeling of Fragile X Syndrome by Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 6, 407-411 (2010)）。さらに、ＢＣＤに関連する報告された脂肪酸同化を考慮すると、ＢＣＤの患者特異的ｉＰＳ細胞又は患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞がｉＰＳ技術によって作製可能かどうかは不明であった。
Ａ．多能性の誘導
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法は、当技術分野で公知である。実質的に全ての種類の体細胞をｉＰＳＣリプログラミングの細胞源として使用することができる。簡潔には、ｉＰＳＣは、特定のタンパク質のセット（例えば、特定のタンパク質のセットをコードする核酸、又はタンパク質の直接送達による）を細胞に導入することで作製できる。１つの例示的な非限定的方法としては、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及び／又はｃ−ＭＹＣ（例えば、「山中因子」）のうちの１又は複数をコードする１又は複数の導入遺伝子を導入することによる方法が挙げられることを当業者は理解するであろう。ある実施形態では、リプログラミングでは４つの転写因子の全てを使用する。ある実施形態では、１つ、２つ、又は３つの転写因子を使用できる。Li et al., Stem Cells, 2009;27:2992-3000。Zhu et al., Cell Stem Cell 2010;7:651-655。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、リプログラミングタンパク質の直接送達によって作製してもよい。Kim et al., Cell Stem Cell. 2009;4(6):472-6。実施例セクションでは、非統合的な（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）方法、例えばセンダイウイルス（実施例１）又はエピソーム法（実施例２）を使用してｉＰＳＣを製造する方法を示している。しかしながら、ｉＰＳＣを製造するいかなる方法であっても本開示の範囲内であると想定される。
様々な方法（例えば、小分子を使用した、又は使用しない、センダイウイルス、エピソーム法）を使用してｉＰＳＣを作製することができる。実施例セクションを参照のこと。また、例えば、Hubbard et al., J. Vis. Exp., 2014, 92:52009を参照。また、多くの異なる細胞型からｉＰＳＣを作製する方法が当技術分野で公知である。例えば、Hayashi et al., 2012, PLoS One, 7(9):e45435；Poon et al. 2015, PLoS One, 10(7):e0131288；Lamba et al. 2010, PLoS One, 5(1):e8763を参照。通常、ｉＰＳＣは、非限定的な例としてＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＡＰ及び／又はＮＡＮＯＧが挙げられる、少なくとも１つのマーカーを検出可能なレベルで発現する。
本明細書に記載のＢＣＤ細胞モデルの生成には、任意の種類の幹細胞を使用可能であり、非限定的な例として、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞が挙げられる。本明細書に記載の方法で使用される幹細胞は、多能性、複能性、又は全能性幹細胞であり得る。
本明細書で使用される「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、少なくとも外胚葉細胞、内胚葉細胞、及び中胚葉細胞の１つに発達可能な細胞を指す。一実施形態では、「多能性」という用語は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）及び複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）の細胞を指す。本明細書で使用される「全能性」細胞という用語は、細胞の全ての系統に発達可能な細胞を指す。本明細書で使用される「複能性」という用語は、最終分化していない細胞を指す。本明細書の開示の多能性細胞は、任意の幹細胞であってもよく、当技術分野で公知の誘導、脱分化、及び核移植法を使用して、線維芽細胞などの非多能性細胞から産生されてもよい。本明細書に記載の多能性細胞は、幹細胞であっても非多能性細胞から産生された細胞であっても、ＢＣＤ又はＣＹＰ４Ｖ２変異を有する対象からのものであってもよく、対照として使用する若しくは人工ＣＹＰ４Ｖ２変異を作製するための、ＢＣＤを有しない健康な個体からのものであってもよい。
実質的にあらゆる種類の細胞をｉＰＳ細胞にリプログラミングすることができる。本明細書の「細胞の起源」と題されたサブセクションの記載を参照。
Ｂ．ｉＰＳＣの分化
ＢＣＤ患者のｉＰＳ細胞を、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞（又は別の種類の眼細胞（例えば、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、又はｉＰＳ−ＰＲＣ））に分化させた。ｉＰＳＣをＲＰＥ細胞又は別の種類の眼細胞（例えば、ＣＥＣやＰＲＣ）に分化させる方法は公知である。例えば、実施例セクション；Hayashi et al., 2012, PLoS One, 7(9):e45435、Songstad, et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science December 2015, Vol.56, 8258-8267、及びLamba et al., PLoS One. 2010 Jan 20;5(1):e8763を参照。例えば、細胞からリプログラミングされた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造し、さらに、例えばＲＰＥ細胞（本明細書では「ｉＰＳ−ＲＰＥ」と称する）、角膜上皮細胞（本明細書では「ｉＰＳ−ＣＥＣ」と称する）、光受容体細胞（又は光受容体前駆細胞、本明細書では「ｉＰＳ−ＰＲＣ」と称する）、又はｉＰＳ−脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞（「ｉＰＳ−ＣＥ」と称する）にさらに分化させることができる。
分化した細胞、例えばｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を、健康な対照のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞と比較して、その生化学的欠陥／異常を評価するために、生化学的機能（本明細書及び実施例セクションに記載の通り）について試験した。
本明細書に記載の通り製造されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系は、ＲＰＥ細胞の指標となる形態（例えば、色素沈着及び六角形）、及び／又は１又は複数のバイオマーカーを発現する。ＲＰＥ細胞（及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）のバイオマーカーは公知であり、非限定的な例として、ＲＬＢＰ１ （ＣＲＡＬＢＰとしても知られる）、ＲＰＥ６５、ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ−１、ＭＩＴＦ、ＶＩＮＣＵＬＩＮ、ＬＲＡＴ、ＲＤＨ５、ＰＡＸ６、ＭＥＲＴＫ、ＴＹＲ及び／又はＺＯ−１の１又は複数が挙げられ、ＲＰＥの分化が生じたことを判断又は確認するために使用することができる。同様に、ＣＥＣ（及びｉＰＳ−ＣＥＣ）並びにＰＲＣ（及びｉＰＳ−ＰＲＣ）のバイオマーカーは公知であり、例えば、角膜上皮細胞についてはサイトケラチン１２及びサイトケラチン３；並びに光受容体についてはＣｒｘ、桿体及び錐体についてはリカバリン、桿体についてはＮｒｌが挙げられる。
実施例セクションに記載のｉＰＳリプログラミング法及びＲＰＥ分化法により、ＢＣＤ患者特異的なｉＰＳ細胞及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の作製に成功した。
Ｃ．ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞における、生化学的欠陥／異常を特定するための生化学アッセイ、及びＲＰＥ萎縮を評価するための細胞生存率アッセイ
一連の生化学アッセイが開発され、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の表現型を評価及び決定するために使用された。
まず、脂肪酸のより完全なリストを本開示の生化学アッセイに含めた。先行研究では、ＢＣＤ患者の異常な血清脂肪酸レベルが特定されており、試料を次の脂肪酸について試験している：１６：０、１６：１、１８：０、１８：１ｎ−９、１８：２ｎ−６、１８：３ｎ−３、２０：３ｎ−６、２０：４ｎ−６、２２：５ｎ−３、２２：６ｎ−３、２４：０、及び２４：１。この研究により、ＢＣＤ患者の血清中のオクタデカン酸（１８：０）の濃度は対照被験者よりも高く、オクタデカジエン酸（１８：１ｎ−９）の濃度は対照被験者よりも低いことが判明した。ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞に同じ脂肪酸異常が存在するかどうか、そして他の脂肪酸にさらに異常があるかどうかを判断するために、ＬＣ−ＭＳを使用して、より多くの脂肪酸を包含する生化学アッセイを開発した（表２を参照）。
さらに、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞が脂肪酸に加えて他の異常を有するかどうかを判断するために、セラミド（Ｃｅｒ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、並びにスフィンゴシン及びスフィンガニン（ＳＯＳＡ）を含む他の脂質種を、ＢＣＤ疾患モデルの表現型を分析し、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の生化学的機能を決定するアッセイに含めた。ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の試験に使用される生化学アッセイに含まれる様々な種及び化合物のリストについては、表２を参照。
驚くべきことに、試験結果（実施例セクションを参照）より、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞が、ＢＣＤ患者の血清に見られるものとは異なる脂肪酸異常プロファイルを有していることがわかった。
眼は、人体における光を感知する器官である。ＢＣＤはＲＰＥ萎縮から始まり、それが光受容体の死滅と視力喪失を引き起こす。ＲＰＥの重要な機能は光吸収である（Strauss, 2005, The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev 85:845-81）。環境光への暴露は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）や網膜色素変性症（ＲＰ）などのヒト網膜変性症の発生及び進行に影響を与える可能性がある。眼疾患モデルにおける光暴露の使用は、網膜変性の研究に適したモデルシステムである。青色光暴露を含む光暴露は、網膜研究で広く使用されている（Dual roles of polyunsaturated fatty acids in retinal physiology and pathophysiology associated with retinal degeneration, Masaki Tanito & Robert Anderson (2009)Clinical Lipidology, 4:6, 821-827. Seko, et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2001 Jan;239 (1):47-52. Blue light-induced apoptosis in cultured retinal pigment epithelium cells of the rat. Narimatsu, et al., Exp Eye Res. 2015 Mar;132:48-51. Blue light-induced inflammatory marker expression in the retinal pigment epithelium-choroid of mice and the protective effect of a yellow intraocular lens material in vivo）。青色光は、太陽光や人工照明（例えば、オフィス照明）などの環境光、並びにテレビ、モニター、スマートフォン、ノートブック、及びタブレットなどの電子ディスプレイデバイスに見られる（Moon, et al., Blue light effect on retinal pigment epithelial cells by display devices, Integr Biol (Camb). 2017, 22;9(5):436-443. doi:10.1039/c7ib00032d）。
本研究では、細胞生存率アッセイにより、ＢＣＤ細胞モデルでＲＰＥ萎縮が発見された。（青色）光への暴露は、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ試料において、対照試料よりも著しく高い細胞死を引き起こした。ＢＣＤの臨床表現型（すなわち、ＲＰＥ萎縮）は、ＢＣＤ細胞モデルでは明らかである。ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２は、ＢＣＤ細胞モデルでＲＰＥ萎縮のレスキュー（救済）に有効性を示した。
Ｄ．ＢＣＤ細胞モデルの用途
ＢＣＤに関連する細胞レベルの表現型の評価に加えて、ＢＣＤ細胞モデルは、疾患モデルの他の用途（非限定的な例として、薬物スクリーニング、治療薬又はデバイスの開発、投与量範囲の決定、安全性及び毒性試験、ＢＣＤ又はＣＹＰ４Ｖ２に関連する他の状態のための様々な製剤の試験、又はＣＹＰ４Ｖ２の機能と用途の研究（非限定的な例として、例えばＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療など、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を含む又は発現する薬物の開発及びスクリーニングなど）が挙げられる）にも使用可能である。さらに、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ（及び非限定的な例としてｉＰＳ−光受容体細胞、ｉＰＳ−角膜細胞が挙げられる他のＢＣＤ患者特異的幹細胞由来の眼細胞）は、非改変形態で又は遺伝子修復（例えば、本明細書に記載の遺伝子導入又は遺伝子編集による）後、細胞療法として使用してもよい。実施例セクションでは、ＢＣＤ細胞モデルの用途の非限定的な例を示す。
Ｅ．化合物スクリーニング法
重要なことに、本明細書に記載のｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞系は、ヒト細胞疾患モデル（例えば、ＢＣＤ、網膜色素変性症、ＩＲＤ）を提供することができる。このようなｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳＣ−ＣＥＣ細胞、又はｉＰＳＣ−ＰＲＣ細胞は、「ｉＰＳＣ−眼細胞」と総称することができ、ＢＣＤ患者、網膜色素変性症患者、又は別の種類の遺伝性網膜疾患を有する患者の診断、予後診断、並びに疾患発症、重症度、及び進行率の予測に使用することができる。例えば、このようなｉＰＳＣ−眼細胞系は、ＣＹＰ４Ｖ２核酸の遺伝的又はエピジェネティックな変化に関連する疾患（例えば、ＢＣＤ）の治療又は予防に治療効果がある可能性のある化合物の試験化合物のスクリーニングにも使用することができる。
本明細書に記載の多能性細胞、特にＣＹＰ４Ｖ２に遺伝的又はエピジェネティックな変化を有する対象や眼疾患（例えば、ＢＣＤ）を有する対象から産生された多能性細胞は、眼疾患（例えば、ＢＣＤ）の治療、診断、予後診断、又は予防の治療的候補である化合物を同定する方法の研究ツールとして使用できる。前記試験化合物は任意の種類の化合物であり得ることが理解されよう。それらは自然起源のものであってもよく、化学合成によって作製されたものであってもよい。それらは、構造的に定義された化学化合物、特徴付けられていない化合物若しくは物質、又は化合物の混合物のライブラリであってもよい。試験化合物は、限定されるものではないが、核酸又はそのアナログ、ポリペプチド又はそのアナログ、抗体、化学物質、及び小分子であり得ることを当業者は理解するであろう。
本明細書に記載の細胞は、試験化合物の存在下又は非存在下で、動物モデル（例えば、動物モデルの眼）において、成長及び機能する能力、及びその腫瘍を形成する傾向の有無について評価することができる。非限定的な例としてＰＣＲ技術、イムノアッセイ、及び／又は脂質／脂肪酸代謝分析が挙げられる多くの方法を使用して、細胞を評価することができる。
細胞療法の方法及び組成物
本明細書で説明されるように、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療は、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の生化学的異常の修正に有効性を実証した。しかし、インビボで機能するための遺伝子治療の前提条件は、対象の治療中の眼にＲＰＥ及び光受容体細胞がある程度残存していることである。ＲＰＥ細胞又は光受容体細胞が眼にほとんど又は全く残存していない後期ＢＣＤ患者の場合、代替療法として、又は治療オプションとして、細胞療法を遺伝子治療と組み合わせて使用してもよい。
細胞療法では、新しい細胞を移植して、死滅した細胞又は変性した細胞と置き換える。ＢＣＤの場合、新しい細胞は、対象においてどの種類の細胞が変性を示し、置換を要するかによって、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞（錐体及び／又は桿体）、光受容体前駆細胞、脈絡膜細胞、角膜上皮細胞、水晶体細胞、又は他の種類の眼細胞であり得る。本明細書の以下の記載及び実施例では、方法及びプロセスを説明するためにｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を使用した。これらは他の種類の眼細胞に適用してもよい。
ＢＣＤ、及び非限定的な例として遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、黄斑変性（加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含む）が挙げられる他の種類の眼疾患の細胞療法は、以下のように分類できる。
（１）同種（アロジェニック）移植：
一実施形態では、ＢＣＤの細胞療法として、健康なドナー由来の胚性幹細胞（ＥＳＣ）又はｉＰＳＣに由来する、ＲＰＥ細胞、ＰＲＣ、ＣＥＣ、ＣＥ細胞、及び他の眼細胞を同種（アロジェニック）移植に使用することができる。これには、健康な個体（すなわち、ＣＹＰ４Ｖ２変異を持たない個体）由来の健康なＥＳＣ又はｉＰＳＣをＲＰＥ細胞に分化させ、そのようなＥＳＣ−ＲＰＥ細胞をＢＣＤ患者の眼に移植することが含まれる。ｉＰＳＣのリプログラミング、及びＥＳＣ又はｉＰＳＣをＲＰＥに分化させる方法は、本明細書の実施例セクションで提示される。以前の研究では、胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来のＲＰＥ細胞が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療に使用された。Schwartz et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science April 2016, Vol.57, ORSFc1-ORSFc9を参照。同種移植片（ａｌｌｏ−ｇｒａｆｔ）又は同種（アロジェニック）移植の長所は、複数の患者を治療するために１つの共通の供給源を使用できるため、自家移植よりも安価であることである。しかし、宿主である対象による免疫拒絶がその有効性及び持続期間に大きな影響を与える可能性があるなど、重大な短所がある。さらに、重度の全身性副作用に至る可能性のある長期の免疫抑制剤使用が必要である。最後に、ＥＳＣの使用は倫理的な懸念を引き起こす可能性がある。
（２）遺伝子修復を伴わない自家（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）移植：
一実施形態では、自家細胞をＢＣＤの細胞療法に使用してもよい。そのような自家供給源の１つは、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ細胞及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞であり、これらをＢＣＤ患者の眼に移植してもよい。ＢＣＤは比較的発症が遅い疾患である。ＢＣＤ患者の症状は、通常、１０歳代、２０歳代、さらには３０歳代に発症する。さらに、ｉＰＳリプログラミングのプロセスには、ｉＰＳ細胞及びｉＰＳ細胞由来の細胞に対してある程度の「時計のリセット」効果がある。したがって、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞及び他のｉＰＳ−眼細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２変異の遺伝子修復がなくても、ＢＣＤ患者への移植の細胞療法として使用できる。ｉＰＳのリプログラミング方法及びＲＰＥの分化方法は、本明細書の実施例セクションで提示されている。予防的に、ｉＰＳのリプログラミング及びＲＰＥ分化のプロセスにおいて、何らかの疾患の原因となる変異が生成したかどうかについて、全ゲノムシークエンシングを実行して、ｉＰＳ細胞又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のゲノムＤＮＡと供給源細胞（例えば、線維芽細胞又は血液細胞）のゲノムＤＮＡとを比較してもよい。
（３）ＢＣＤ並びに他の種類のＩＲＤ及びＲＰの細胞療法のための遺伝的に修復された患者の自家細胞
本開示は、細胞療法のために遺伝的に修復された自家細胞を生成するための方法及び組成物を提供する。本明細書で使用される「遺伝的に修復された」又は「遺伝子修復」という表現は、患者のゲノムの遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮなどを使用した染色体上での直接的編集）によるか、通常ゲノムに組み込まれない、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の健康なコピー（ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他の形態）の患者細胞への遺伝子導入（例えば、本明細書に記載のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療）による、ＣＹＰ４Ｖ２変異の修正、又は患者の細胞内の欠陥ｍＲＮＡを修正又は補償することを指す。
遺伝子変異によって引き起こされる疾患として、ＢＣＤ又は別のＩＲＤ若しくはＲＰの細胞療法で使用する自家細胞は、理想的には、その遺伝的欠陥（すなわち、ＣＹＰ４Ｖ２変異）及び／又は機能不全のＣＹＰ４Ｖ２タンパク質が移植前に修正されている。一実施形態では、本明細書に説明されるように、そのような遺伝子修復は、非限定的な例として機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードし発現する核酸配列のＡＡＶ媒介遺伝子導入療法が挙げられる、遺伝子導入療法により達成してもよい。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子導入療法の組成物及び方法を本明細書に提示する。発明の詳細な説明及び実施例セクションを参照のこと。ＢＣＤ患者特異的な供給源細胞、ｉＰＳ細胞又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２（本明細書に提示）により処理してもよく、その後ｉＰＳリプログラミング及び／又はＲＰＥ分化（該当する場合）、並びに生化学的機能の改善の検証（本明細書に提示）が行い、同一患者の眼に移植してもよい。別の実施形態では、そのような遺伝子修復は、遺伝子編集、例えば、ＢＣＤ患者の細胞のゲノム又はＲＮＡのＣＹＰ４Ｖ２変異を修正することにより達成してもよい。細胞療法の一環としてインビトロで適用されることに加えて、そのような遺伝子編集は遺伝子治療としてインビボで直接適用してもよい。そのような遺伝子編集は、患者の供給源細胞（例えば、線維芽細胞又は血球）、ｉＰＳ、ｉＰＳ−ＲＰＥ、又は他の種類のｉＰＳ−眼細胞に対して実施してもよい。患者特異的ｉＰＳ及びｉＰＳ−ＲＰＥを作製するためのｉＰＳリプログラミング及びＲＰＥ分化は、遺伝子修復（遺伝子導入療法又は遺伝子編集など）の前に実施してもよく、後に実施してもよい。
本開示は、遺伝子編集を通じてＣＹＰ４Ｖ２変異を修正する組成物及び方法を提供する。実施例セクションの記載は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトを使用して、ＢＣＤ患者の間で最も一般的な変異であるｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正する組成物と方法を示す。また、他の遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｒｐ１、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー）及び他のＩＲＤ変異（例えば、限定されるものではないが、表１にある他のＣＹＰ４Ｖ２変異）に、当技術分野で公知の方法と組み合わせて適用してもよい。
ＢＣＤ患者の中で最も一般的なＣＹＰ４Ｖ２変異はｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣである（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のイントロン６の終端から８塩基で始まる場所における、１７塩基の欠失と２塩基（ＧＣ）の挿入を指し、ＩＶＳ６−８ ｄｅｌ／ｉｎｓＧＣとも称される。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を含むヒトＣＹＰ４Ｖ２ゲノムＤＮＡ領域の配列を示す配列番号４６、及び対応する野生型配列を示す配列番号４７を参照。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を、ヒトＣＹＰ４Ｖ２イントロン６−エクソン７接合部を示す以下の配列に示す。イントロン６配列を小文字で、エクソン７配列を大文字で示す。１７ｂｐの欠失及びＧＣの挿入を括弧内に示す）：ｃａａ ａｃａ ｇａａ ｇｃａ ｔｇｔ ｇａｔ ｔａｔ ｃａｔ ｔｃａ ａａ （ｔｃａ ｔａｃ ａｇＧ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＴ）（ＧＣ）ＧＡＡ ＣＧＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＡ）（配列番号４６）。これにより、エクソン７のスキップが起こると予想される。（Xiao et al., Biochem Biophys Res Commun. 409:181-6, 2011、Meng et al., 2014, Mol. Vis., 20:1806-14、Wada et al., Am J Ophthalmol. 139:894-9, 2005、Jiao et al., European Journal of Human Genetics (2017)25, 461-471）。最近の研究では、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異の年代は、中国人では１，０４０〜８，２００世代、日本人では３００〜１１００世代であると推定された。Jiao et al., European Journal of Human Genetics (2017)25, 461-471．
本明細書に記載されるように、細胞療法（ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ又はｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙとしても知られる）を使用して、対象の眼疾患を治療又は予防することができる。本明細書に記載されるように、ＢＣＤ、特定のＲＰ、ＩＲＤ、及び本明細書で言及される他の眼疾患は、ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の遺伝的又はエピジェネティックな変化に関連する。
細胞療法は、一般に、細胞を含む組成物を対象（例えば、患者の組織又は器官（例えば、眼））に注入、埋込、移植、又はその他の方法で送達することを含む。本明細書に記載の方法は、眼疾患を有する対象の遺伝的に修復された自家細胞療法を可能にする特有なものである。
本明細書では、眼疾患（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の遺伝的又はエピジェネティックな変化に関連する）を有する対象から細胞を得ることと、例えば遺伝子編集、又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸配列の送達（遺伝子導入など）を介した修復を用いる、ＣＹＰ４Ｖ２核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡなど）内の変異を修復することと、を含む方法を説明する。細胞は、対象（例えば、対象の眼）への投与の前に、多能性とし（例えば、ｉＰＳＣ作製のために多能性を誘導することにより）、１又は複数の眼細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＰＲＣ）に分化させてもよい。前記細胞の遺伝的修復は、多能性化の前でも後でも、又は眼細胞に分化した後でもよいことが理解されよう。
Ａ．細胞の起源
いくつかの例では、本明細書に記載の細胞療法の方法において自家細胞（例えば、対象（例えば、患者）特異的細胞）を使用してもよい。例えば、線維芽細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの細胞を対象から入手し、実施例セクションに記載されているようにｉＰＳＣを作製するために使用してもよい。実質的にいかなる種類の細胞を使用してもｉＰＳＣを作製できるため、いかなる種類の細胞を供給源細胞として使用してもよい。いくつかの例では、尿から得られた細胞（例えば、Zhou et al., 2012, Nat. Protoc., 7:2080-9を参照）又は毛包若しくは真皮乳頭細胞（例えば、Muchkaeva et al., 2014, Acta Naturae, 6:45-53を参照）を用いてｉＰＳＣを作製することができる。
Ｂ．多能性の誘導
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法は、当技術分野で公知である。簡潔に述べると、ｉＰＳＣは、特定のタンパク質のセット（例えば、特定のタンパク質のセットをコードする核酸）を細胞に導入することで作製できる。１つの例示的な非限定的方法では、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ（例えば、「山中因子」）をコードする１又は複数の導入遺伝子を導入することによる方法が挙げられることを当業者は理解するであろう。ある実施形態では、リプログラミングでは４つの転写因子の全てを使用する。ある実施形態では、１つ、２つ、又は３つの転写因子を使用してもよい。Li et al., Stem Cells, 2009;27:2992-3000. Zhu et al., Cell Stem Cell 2010;7:651-655。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、リプログラミングタンパク質の直接送達によって作製してもよい。Kim et al., Cell Stem Cell. 2009;4(6):472-6。実施例セクションでは、非統合的な方法、例えばセンダイウイルス（実施例１）又はエピソーム法（実施例２）を使用してｉＰＳＣを製造する方法を示す。しかしながら、本開示の範囲内においてｉＰＳＣを製造するあらゆる方法が想定される。
様々な方法（例えば、小分子を使用した、又は使用しない、センダイウイルス、エピソーム法）を使用してｉＰＳＣを作製することができる。実施例セクションを参照のこと。また、例えば、Hubbard et al., J. Vis. Exp., 2014, 92:52009を参照。また、多くの異なる細胞型からｉＰＳＣを作製する方法が当技術分野で公知である。例えば、Hayashi et al., 2012, PLoS One, 7(9):e45435；Poon et al. 2015, PLoS One, 10(7):e0131288；Lamba et al. 2010, PLoS One, 5(1):e8763を参照。通常、ｉＰＳＣは、非限定的な例としてＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＡＰ及び／又はＮＡＮＯＧが挙げられる、少なくとも１つのマーカーを検出可能なレベルで発現する。
本明細書に記載の細胞療法には、任意の種類の幹細胞を使用可能であり、非限定的な例として、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞が挙げられる。本明細書に記載の方法で使用される幹細胞は、多能性、複能性、又は全能性幹細胞であり得る。
本明細書で使用される「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、少なくとも外胚葉細胞、内胚葉細胞、及び中胚葉細胞の１つに発達可能な細胞を指す。一実施形態では、「多能性」という用語は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）及び複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）の細胞を指す。本明細書で使用される「全能性」細胞という用語は、細胞の全ての系統に発達可能な細胞を指す。本明細書で使用される「複能性」という用語は、最終分化していない細胞を指す。本発明の多能性細胞は、任意の幹細胞であってもよく、又は当技術分野で公知の誘導、脱分化、及び核移植法を使用して、線維芽細胞などの非多能性細胞から産生されてもよい。本明細書に記載の多能性細胞は、幹細胞であっても非多能性細胞から産生された細胞であっても、ＢＣＤ又はＣＹＰ４Ｖ２変異を有する対象からのものであってもよく、又は健康な個体からのものであってもよい。
ｉＰＳＣは、次の１又は複数によって特徴付けられる：
ａ．ｉＰＳＣの固有の形態；
ｂ．Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇ、及びＡＰなどの１又は複数の多能性マーカー；
ｃ．所望の細胞種類（例えば、ＲＰＥ細胞）に分化する能力；及び／又は
ｄ．テラトーマアッセイ。
ｉＰＳＣの特性評価及び多能性の検証に上記のすべてが必要なわけではない(例えば、テラトーマ；Buta et al., 2013, Stem Cell Res., 11(1):552-562を参照）。
Ｃ．遺伝子編集
本明細書に記載の方法において、多数の遺伝子編集技術を使用して、対象のＣＹＰ４Ｖ２核酸に存在する遺伝的又はエピジェネティックな変化を修復することができる。遺伝子編集は、クラスター化規則的間隔占有短鎖パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ；ＣＲＩＳＰＲ）技術（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号、８，８８９，４１８号、８，９９９，６４１号及び米国出願公開第２０１４／００６８７９７号を参照）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）技術（例えば、Li et al., 2011, Nucleic Acids Res., 39(14):6315-25を参照）、又はジンクフィンガーヌクレアーゼ技術（例えば、Wright et al., 2005, The Plant J., 44:693-705を参照）などの、任意の数の技術を使用して実施することができる。
ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて遺伝子編集を行うには、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがよく使用されるが、他のヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１などの他のＣａｓヌクレアーゼ、又は非Ｃａｓヌクレアーゼ）を使用してもよい）を１又は複数のベクターに組み込み、本明細書に記載されるように対象に投与してもよい。単に例として、本明細書に記載の細胞（例えば、ｉＰＳＣへのリプログラミング前の対象の細胞；ＲＰＥ、角膜上皮細胞、若しくは光受容体細胞への分化前の対象のｉＰＳＣ；又はＲＰＥ、角膜上皮細胞、若しくは光受容体細胞への分化後の対象のｉＰＳＣ（本明細書では「ｉＰＳＣｓ−ＲＰＥ」、「ｉＰＳＣ−ＣＥＣ」、又は「ｉＰＳＣ−ＰＲＣ」と称する））は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）、及び少なくとも１つのドナー鋳型核酸を含む及び／又はコードする１又は複数のコンストラクト（例えば、ベクター、ＲＮＰ、ｍＲＮＡ）で形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔ）又はトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子修復がノックアウトによって達成される場合は、ドナーの鋳型核酸は必要ない。
同様に、ＴＡＬＥＮ技術を使用して遺伝子編集を行うために、ＴＡＬＥＮをコードする核酸（例えば、二量体転写因子／ヌクレアーゼ）をベクターに組み込み、本明細書に記載されるように対象に投与してもよい。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して遺伝子編集を行うには、カスタムＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、各サブユニットがジンクフィンガードメイン及びＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含むヘテロダイマー）をコードする核酸を１又は複数のベクターに組み込み、本明細書に記載されるように対象に投与する。
これらの各技術を実施するために必要な成分は市販されており、特定の標的配列に合わせてカスタマイズすることができる。例えば、Caribou Biosciences、GenScript, CRISPR Therapeutics、Editas Medicine、Cellectis Bioresearch、Life Technologies、Sangamo BioSciences、又はSigma Aldrich Chemical Co.を参照。
適切な状況下では、対象のＣＹＰ４Ｖ２核酸の遺伝的又はエピジェネティックな変化が修復され、その結果、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質が発現されるように遺伝子編集が生じ得る。ＣＹＰ４Ｖ２核酸（ＣＹＰ４Ｖ２ ｍＲＮＡなど）の存在が回復する、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の存在が回復する、又はＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能が回復すると、ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列が修復されたことになる。同様に、「修復（した／された）（ｒｅｐａｉｒｅｄ）」又は「修正（した／された）（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）」という用語は、野生型配列又は本明細書に記載の別の非変異体配列に対して影響（例えば、遺伝的又はエピジェネティックな変化）を受けた配列を元の状態に戻すことを指し得る。
遺伝子編集を用いて、１又は複数の変異を細胞に導入することが望ましい場合がある（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２核酸）。これは、疾患の細胞モデル（例えば、ＢＣＤ）を作製可能な方法である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に対して遺伝子編集を実施して、人工ＣＹＰ４Ｖ２変異を含む細胞系を作製し、ＲＰＥ細胞に分化させてもよい。または、ＣＹＰ４Ｖ２変異ｉＰＳ又はＣＹＰ４Ｖ２変異ＲＰＥ細胞系を作製するために、健康な対象（例えば、非ＢＣＤの対象）のｉＰＳ細胞系又はＲＰＥ細胞系（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞系）に対して遺伝子編集を実施してもよい。
いくつかの例では、遺伝子編集工程が完了した後、細胞をスクリーニングして（例えば、全ゲノムシークエンシングを用いて）、標的変異が修復されたこと及び重要なオフターゲット編集が発生していないことを確認することが望ましい。
ＣＲＩＳＰＲ、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９として知られるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）とガイドＲＮＡとで構成され、部位特異的ＤＮＡ切断を生成し、これが内在性の細胞メカニズムによって修復される。こうしたアプローチにより生じ得る結果には、切断部位での挿入又は欠失（インデル）が生じる変異原性の非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＨＥＪ））を介した特定部位の変異、及び外因的に導入されたドナー鋳型を用いた相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＨＲ））によるゲノム配列の正確な変更が含まれる。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとも称する）及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される２つのＲＮＡで構成されている。ｃｒＲＮＡの長さは通常約２０ヌクレオチド（ｎｔ）である。ｃｒＲＮＡは、ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対によって標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを誘導して前記標的ゲノムＤＮＡを切断させる。
遺伝子編集により最も一般的なＣＹＰ４Ｖ２変異を遺伝的に修復するために、様々なＣＹＰ４Ｖ２変異ＣＲＩＳＰＲ修正コンストラクトを開発した（実施例を参照）。ＣＲＩＳＰＲが用いられた理由は、ＴＡＬＥＮやジンクフィンガーヌクレアーゼなどの他の形式の遺伝子編集よりも、実施が容易であり編集効率が高いためである。ＣＲＩＳＰＲコンストラクトには、ＢＣＤ患者細胞系のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異の修正に容易に使用できる最適化されたインビトロ検証済みｇＲＮＡ配列及び様々なコンストラクトのオプションが含まれており、限定されるものではないが、ＢＣＤに対する自家細胞療法を含む細胞療法に使用できる遺伝的に修復された細胞が得られる。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法には、ヌクレアーゼであるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）及びＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの使用が関係する。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの役割は、標的配列に相補的（又は特異的）なＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡに含まれるプロトスペーサーエレメントを介してＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが標的とする配列にＣａｓを誘導することである。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣｒｆ１）が標的配列に結合し、標的配列の近くで切断を行うには、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在も必要となる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓの結合シグナルとして機能する短いＤＮＡの区間（通常２〜６ヌクレオチド）である。異なるＣａｓは、異なるＰＡＭ及び切断パターンを有しうる。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の場合、標準ＰＡＭ配列はＮＧＧである。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）の場合、ＰＡＭ配列はＮＧＲＲＴ又はＮＧＲＲＮである。ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ））及びトレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｔｄ））の場合、ＰＡＭ配列はそれぞれＮＮＮＮＧＡＴＴ及びＮＡＡＡＡＣである。改変された又は変異したＣａｓでは、ＰＡＭ配列が変わることもある。例えば、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント（Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７Ｒ）のＰＡＭ配列はＮＧＡＮ又はＮＧＮＧである。ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲバリアント（Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７Ｒ）のＰＡＭ配列はＮＧＡＧである。ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアント（Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｅ、及びＴ１３３７Ｒ）のＰＡＭ配列はＮＧＣＧである。Ｃｐｆ１の場合、ＰＡＭ配列はＴＴＴＮである。通常、Ｃａｓは二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するが、変更されたＣａｓは一本鎖切断を生成したり（例えば、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ Ｄ１０Ａ））、切断を生成しない（ｄＣａｓ９）こともある。Ｃａｓ９はＰＡＭ部位の３ｎｔ上流で平滑末端を生成するが、Ｃｐｆ１はジグザグ状に切断し、ＰＡＭから１８〜２３塩基離れた５ヌクレオチドの５’オーバーハングを生成する。
Ｃａｓ９のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは通常、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、修正、破壊、又は置換の対象となる遺伝子内又はこれに近い標的配列に相補的（又は特異的）に設計されたプロトスペーサーエレメント配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡの相補領域に対応する配列を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの対応する領域に相補的な領域と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と相互作用する配列とを含む。Ｃｐｆ１にはｔｒａｃｒＲＮＡは必要ではない。
プロトスペーサーエレメントの長さは、通常約２０ヌクレオチドである。より長い又はより短いプロトスペーサーエレメント配列（約１６〜２４ｎｔ）を使用してもよい。プロトスペーサーエレメントは、標的配列と１００％相補的であっても、標的配列とのミスマッチを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、プロトスペーサーエレメント配列の開始部分に所望により「Ｇ」ヌクレオチドを追加してもよい。
ＤＮＡ分子はＣａｓによって切断された後、２つの方法のいずれかによって修復されうる。エラープロ―ン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復は、遺伝子によってコードされたタンパク質機能を破壊する可能性のあるインデル変異を引き起こし得る。ＮＨＥＪを使用すると、細胞系に人為的な変異を作製しうる。いくつかの実施形態では、内因性ＣＹＰ４Ｖ２変異のない細胞系（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又はＡＲＰＥ−１９細胞系）のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に変異（例えば、エクソン又はスプライスアクセプター領域のインデル）を作製するために使用し、それにより疾患細胞モデル（例えば、ＢＣＤ細胞モデル）を作製してもよい。さらに、２つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを一緒に使用して、標的遺伝子の標的領域又は標的遺伝子全体をノックアウトし、ノックアウトモデルを作製してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、優性遺伝病の治療において、遺伝子を破壊（又はサイレンシング）又は欠損させるためにＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子サイレンシングが使用される。遺伝子サイレンシング中、細胞は壊れたＤＮＡを修復しようとするが、ＮＨＥＪはしばしば遺伝子を破壊するエラーを伴って修復を行い、これにより遺伝子を効果的にサイレンシングする。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪはまた、例えば、特に変異が１ヌクレオチドの変更又は約１０ヌクレオチド以下の変更である場合、変異の修正をもたらすこともある。または、ドナー核酸配列が利用可能な場合、ＤＮＡ切断は、標的遺伝子の修正又は置換のために相同組換修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ（ＨＤＲ））によって修復可能である。ドナー核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ又は一本鎖オリゴＤＮＡヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ））又はベクターの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、ｓｓＯＤＮで提供されるドナー核酸配列の場合、ドナー核酸配列は、約１ｋｂ、約８００ｂｐ、約６００ｂｐ、約５００ｂｐ、約４００ｂｐ、約３００ｂｐ、約２８０ｂｐ、約２６０ｂｐ、約２４０ｂｐ、約２２０ｂｐ、又は約２００ｂｐ以下である。いくつかの実施形態では、ドナー核酸配列は、ベクターで提供されるドナー核酸配列の場合、約２５ｋｂ、約２０ｋｂ、約１５ｋｂ、約１０ｋｂ、約９ｋｂ、約８ｋｂ、約７ｋｂ、約６ｋｂ、約５ｋｂ、約４．５ｋｂ、約４ｋｂ、約３．５ｋｂ、又は約３ｋｂ以下である。いくつかの実施形態では、ドナー核酸配列は対称的である。いくつかの実施形態では、ドナー核酸配列は非対称的である。いくつかの実施形態では、ドナー核酸配列の長さは、ＨＲＤ率が高くなるように調整してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集で使用されるＣａｓが標的とするＰＡＭがドナー核酸配列にも存在する場合、ＰＡＭがドナー核酸配列に存在しないように変異させる（異なるヌクレオチドに変更する）ことにより、ドナー鋳型又はドナー鋳型によって修復されたＤＮＡ配列がＣａｓによって切断及び破壊されることを防いでもよい。ＨＤＲは、変異又は欠陥を有する遺伝子又はその一部を修正又は置換することに加えて、内因性ＣＹＰ４Ｖ２変異のない細胞系（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又はＡＲＰＥ−１９細胞系）のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に人工変異（例えば、エクソン又はスプライスアクセプター領域に変異を挿入）を作製するために使用し、それにより疾患細胞モデル（例えば、ＢＣＤ細胞モデル）を作製してもよい。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法で使用されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ及びＣａｓは、ベクター（例えば、プラスミド（例えば、ｐＸ３３０、ｐＸ４５８、ｐＸ４５９）、組換えＡＡＶベクター、又は組換えレンチウイルスベクター）、又はそのような成分をコードするｍＲＮＡ及び／又はＲＮＡ、及びタンパク質の形態として提供してもよい。
ドナー鋳型は、ＨＤＲに使用するために、ｓｓＤＮＡ（例えば、ｓｓＯＤＮ）で提供されるか、ＨＤＲで使用するためのプラスミド又は他の種類のベクター（例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２又はＡＡＶ６））にクローニングされ得る。
様々な組成物及び方法を使用して、オンターゲット編集又は修復効率を改善し、及び／又は潜在的なオフターゲットを低下させることができる。例えば、様々なＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）、若しくは様々な種のＣａｓ（例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＮＭＣａｓ９）、又はバリアント（ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ）を、標的配列のための利用可能なＰＡＭ選択肢を広げるために使用し、特異性を向上させてもよい。標的配列領域にＳｐＣａｓ９のためのＮＧＧ ＰＡＭ部位はないがＡＴリッチの場合、代わりにＣｐｆ１が考慮され得る。Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ）は、標的ＤＮＡに一本鎖切断のみを生成するため、二本鎖切断を生成するには対になる２つのペアとなるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが必要である。ＤＳＢを生じるのに充分な近さで２つのオフターゲットニックが生成される可能性は低いため、上記の要件によって標的特異性が劇的に向上する。さらに、非対称ドナー鋳型によりＨＤＲ率が向上する場合がある。触媒的に不活性なｄＣａｓ９は標的ＤＮＡを切断しないが、Ｃａｓ９切断に通常伴う如何なるエラープローン修復も行わずに、配列置換を達成できる。Richardson et al., Nature Biotechnology34, 339-344 (2016)を参照。
標的遺伝子修正を達成し、その間にオフターゲット編集を回避又は最小限にすることが遺伝子編集の２つの目的である。先行研究により、非限定的な例としてＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮが挙げられる遺伝子編集技術によって引き起こされるオフターゲット変異が明らかになった。Tsai et al, Nature Biotechnology33, 187-197 (2015)、Wang et al., Nature Biotechnology33, 175-178 (2015)、Wu, W.H. et al. CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Mol. Ther. 24, 1388-1394 (2016)を参照。インビボ又は細胞療法で使用される遺伝子編集（例えば、まずインビトロで細胞を移植後インビボで細胞を移植）の場合、オフターゲット編集は病気の原因となったり腫瘍形成を誘発したりすることから、第２の目的であるオフターゲット編集の回避又は最小限化は標的遺伝子修正の達成と同じくらい重要である。全てのオフターゲット編集がコンピューターソフトウェア又はアルゴリズムによって予測可能なわけではないことに注意しなければならない。
したがって、ＣＹＰ４Ｖ２変異ＣＲＩＳＰＲ遺伝子修正コンストラクトの開発及び検証には、慎重な設計、検証、及び改善を要した：
（１）ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を含む変異ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列に基づいて、複数のｇＲＮＡ候補を生成した。
（２）以下の基準により上位５つのｇＲＮＡを選択した（配列番号４８〜配列番号５２、表５及び図１２を参照）：
ａ．ｇＲＮＡ切断部位が改変部位に近接していること、及び
ｂ．ｇＲＮＡのオフターゲットプロファイル。
（３）上位５つのｇＲＮＡの活性を、ホモ接合ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有するＢＣＤ患者のゲノムＤＮＡで検証した（図１３を参照）。
（４）（２）及び（３）に基づいて、３つのｇＲＮＡを選択した。３つのｇＲＮＡのそれぞれを、ピューロマイシンを使用したトランスフェクト細胞選択のために、Ｃａｓ９及びピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）をコードする核酸配列とともにｐＸ４５９プラスミドにクローニングした（図１５及び１８を参照）。
（５）ＨＤＲドナー核酸配列を提供する２つのドナー鋳型（順方向相補的及び逆方向相補的の両方）を作製した。ドナー鋳型配列を含むｓｓＯＤＮはＩＤＴによって合成された（配列番号５６及び配列番号５７を参照）。
（６）プラスミドコンストラクトに加えて、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトを開発した。ＲＮＰコンストラクトは、他のコンストラクトに比べて特定の利点を提供する。詳細な説明は以下及び実施例セクションで説明する。
（７）ＣＹＰ４Ｖ２ ＣＲＩＳＰＲ修正コンストラクトは、ホモ接合ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有するＢＣＤ患者由来のｉＰＳ細胞で検証される。
（８）非改変細胞、及びＣＹＰ４Ｖ２変異ＣＲＩＳＰＲ修正コンストラクトによって遺伝的に修復されたｉＰＳ細胞で全ゲノムシークエンシングを実施し、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異の修正を確認し、オフターゲット編集を評価する。
ｉＰＳＣでのトランスフェクションの最適条件を決定し、トランスフェクトされた細胞を選択する方法が提供される。詳細な説明については、実施例セクションを参照。これらのコンストラクトは、インビトロにおけるＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ細胞だけでなく、インビトロでの供給源細胞（例えば、線維芽細胞又はＰＢＭＣ）、ｉＰＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、若しくはｉＰＳ−ＣＥＣ細胞、又はＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ細胞由来の他の眼細胞の治療に使用することもでき、さらには、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有する患者においてインビボでも使用できることが想定される。一実施形態では、前記コンストラクトの成分は直接使用してもよい。いくつかの実施形態では、前記コンストラクトの成分を変更するか、異なるベクターにクローニングして、インビボでの形質導入効率を高めたり、標的細胞型に対する特異性を高めたり、他の目的を達成したりしてもよい。例えば、Ｃａｓ９をＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ Ｄ１０Ａ）に変更してもよい。Ｃａｓ９ニッカーゼは、当該エンドヌクレアーゼが二本鎖切断ではなく一本鎖ニックを作製することを可能にする変異を有する。対向する２つのｇＲＮＡ配列をＳｐＣａｓ９ニッカーゼとペアリングさせることは、不要なインデルの形成を防ぐ遺伝子編集の効率的な方法である。プラスミドに加えて、ＣＲＩＳＰＲ成分をパッケージ化するために使用される他の一般的なベクターとしては、レンチウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。ＡＡＶベクターを使用する場合、ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９よりもおよそ１ｋｂ短く、ＡＡＶパッケージングの制約にさらに柔軟に対応できるため、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９オーソログ（ＳａＣａｓ９）をエンドヌクレアーゼとして使用してもよい。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトに様々な改善を加えた。ＩＶＴ ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（ｄｕｐｌｅｘ）の代わりに、合成ｓｇＲＮＡを使用した。合成ｇＲＮＡはＩＶＴ ｓｇＲＮＡよりも純度が高いため、ｓｇＲＮＡの不純物によって引き起こされるオフターゲット編集のリスクが低くなる。さらに、ｓｇＲＮＡを細胞内分解から保護するためにｓｇＲＮＡに化学修飾を適用すると、編集効率を向上することができる。詳細については実施例を参照。
本明細書に記載のプラスミドコンストラクト及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトに加えて、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むｍＲＮＡコンストラクトも使用できると考えられる。
ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ細胞にＣＹＰ４Ｖ２変異ＣＲＩＳＰＲ修正コンストラクトをトランスフェクトした後、トランスフェクト細胞をピューロマイシンを使用して選択する。ＧＦＰなどの他のマーカーを前記コンストラクトに組み込み、ピューロマイシンの代わりに、又はピューロマイシンに加えてマーカーとして使用してもよいことを理解されたい。選択に続いて、単一細胞クローニングが実施され、その後、単一細胞クローンからいくつかの細胞がシークエンシングのために収集される。シークエンシングの結果、オンターゲット遺伝子編集の成功が確認され、病気の原因となる遺伝子編集が認められなければ、同じクローンの残りの細胞を、目的の眼細胞種類、例えばｉＰＳ−ＲＰＥ細胞に分化させるために用いる。
Ｄ．ｉＰＳＣの分化
遺伝的に修復されたＢＣＤ患者のｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞又は別の種類の眼細胞（例えば、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、又はｉＰＳ−ＰＲＣ）に分化されられる。ｉＰＳＣをＲＰＥ細胞又は別の種類の眼細胞（例えば、ＣＥＣ及びＰＲＣ）に分化させる方法は公知である。例えば、Hayashi et al., 2012, PLoS One, 7(9):e45435、Songstad, et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science December 2015, Vol.56, 8258-8267、及びLamba et al., PLoS One 2010 Jan 20;5(1):e8763を参照。例えば、細胞からリプログラミングされた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造し、さらに、例えばＲＰＥ細胞（本明細書では「ｉＰＳ−ＲＰＥ」と称する）、角膜上皮細胞（本明細書では「ｉＰＳ−ＣＥＣ」と称する）、光受容体細胞（又は光受容体前駆細胞、本明細書では「ｉＰＳ−ＰＲＣ」と称する）、又はｉＰＳ−脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞（「ｉＰＳ−ＣＥ」と称する）にさらに分化させてもよい。
分化した細胞、例えばｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を、遺伝子修復のない患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞と比較して、生化学的機能が改善されていることを確認するために、生化学的機能（本明細書及び実施例セクションに記載の通り）について試験する。
本明細書に記載の通り製造されたｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞系は、ＲＰＥ細胞の指標となる形態（例えば、色素沈着及び六角形）を示す、及び／又は１又は複数のバイオマーカーを発現する。ＲＰＥ細胞（及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）のバイオマーカーは公知であり、非限定的な例として、ＲＬＢＰ１（ＣＲＡＬＢＰとしても知られる）、ＲＰＥ６５、ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ−１、ＭＩＴＦ、ＶＩＮＣＵＬＩＮ、ＬＲＡＴ、ＲＤＨ５、ＰＡＸ６、ＭＥＲＴＫ、ＴＹＲ及び／又はＺＯ−１の１又は複数が挙げられ、ＲＰＥの分化が生じたことを判断又は確認するために使用することができる。同様に、ＣＥＣ（及びｉＰＳ−ＣＥＣ）並びにＰＲＣ（及びｉＰＳ−ＰＲＣ）のバイオマーカーは公知であり、例えば、角膜上皮細胞についてはサイトケラチン１２及びサイトケラチン３；並びに光受容体についてはＣｒｘ、桿体及び錐体についてはリカバリン、及び桿体についてはＮｒｌが挙げられる。
Ｅ．投与／送達
遺伝的に修復されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞が由来する患者への自家移植に使用してもよい。ＣＹＰ４Ｖ２変異によるＢＣＤ又は別の眼科疾患を有する患者は、本明細書で提供される細胞療法の方法で治療することができる。同様に、この方法を使用して、１又は複数の遺伝子変異によって引き起こされる他の眼疾患に対して遺伝的に修復された自家細胞療法を提供してもよい。
細胞を投与又は送達する方法は公知であり、細胞を眼に投与又は送達する方法は公知である。例えば、Wert et al., J Vis Exp. 2012;(69):4286、国際公開第２０１６／１７９４９６号、Schwartz et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science April 2016, Vol.57, ORSFc1-ORSFc9を参照。一実施形態では、眼細胞は、細胞懸濁液、例えばＲＰＥ細胞の懸濁液の注入により移植してもよい。別の実施形態では、細胞は、シート又は足場の一部として、例えば、極性を持った機能的なＲＰＥ単層を生成するために、天然及び／又は合成の足場を使用したインビトロ組織として移植してもよい。
眼に投与される細胞の治療有効量は、当業者に知られており、移植される細胞の種類、移植される細胞の成熟度、移植後の分裂が予想されるかどうか、置換の標的となる領域のサイズ又は細胞の数、及び治療される対象（例えば、治療対象の年齢、性別、体重、疾患進行度、及び状態）、投与経路、並びに必要なレジメンによって変わり得る。眼細胞療法で使用される細胞の治療有効量は、１回の投与で約１×１０３細胞から約１×１０８細胞の範囲内でありうる。
ｉＰＳＣ細胞系は個々の対象に対して作製することができる一方、共通のＨＬＡハプロタイプを有する（又はＨＬＡハプロタイプが遺伝子操作されている）ｉＰＳＣの細胞バンクを作製してもよい。これは、患者集団の大部分と免疫学的マッチングを達成するように設計される。例えば、Turner et al., Cell Stem Cell, 13:382-384, 2013を参照。さらに、対象の遺伝子型に関係なく免疫学的にサイレントなｉＰＳＣ細胞系を作製してもよい（例えば、Riolobos et al., Mol. Ther., 21:1232-41, 2013を参照）。これらの方法と組み合わせると、患者特異的ｉＰＳ細胞及びｉＰＳ−眼細胞は、厳密な自家移植という意味で使用できるだけでなく、他の患者への移植にも使用できる。
典型的には、細胞療法の投与工程は、疾患症状の発現後又は対象が網膜変性若しくは角膜ジストロフィーの兆候を示した後、必要に応じて行われる。一実施形態では、本明細書で提供される眼細胞療法は、眼疾患（例えば、ＢＣＤ）の治療に独立して使用してもよい。別の実施形態では、本明細書で提供される眼細胞療法は、非限定的な例として本明細書で提供されるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子導入療法及び／又はＣＹＰ４Ｖ２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法が挙げられる１又は複数の他の治療オプションと組み合わせて使用してもよい。
同様に、投与は１回又は複数回（例えば、数週間、数ヶ月、又は数年にわたって）であり得、同じ眼に適用しても反対側の眼に適用してもよい。さらに、１又は複数の種類の細胞を、単回又は別々の投与として投与してもよい。
治療後の評価では、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療のセクションに記載されている方法を使用してもよい。これには、非限定的な例として、視力、視野、暗順応、視覚機能及び／又は光干渉断層法（ＯＣＴ、例えば、スペクトラルドメイン（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ）−ＯＣＴ（ＳＤ−ＯＣＴ））、及びＥＲＧによって測定される視覚機能などの眼科検査が挙げられる。
眼細胞療法及び遺伝子治療におけるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰの使用方法
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）と複合したガイドＲＮＡを含む遺伝子編集リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される２つのＲＮＡで構成されている。一実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別々の核酸分子として提供される。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に組み合わせてもよい。ｓｇＲＮＡは、長さが約１００ヌクレオチド（ｎｔ）であり得、所望により、又は必要に応じてより短い又はより長いこともある。５’末端の２０ｎｔ（ｃｒＲＮＡ）は、ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対によって標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを誘導して前記標的ゲノムＤＮＡを切断させ、残りの二本鎖構造はＣａｓ９認識のために３’側にある。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰは、従来のＣａｓ９／ｇＲＮＡコンストラクト（例えば、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の核酸配列を組み込んだプラスミドコンストラクト）と比較して、長所と短所を有する。例えば、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣａｓ９タンパク質はインタクトな複合体として標的細胞に送達することができ、ＣＲＩＳＰＲ成分を発現するための細胞自体の転写機構の必要性を克服する。その結果、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰはトランスフェクション後すぐに編集できる。ＣＲＩＳＰＲ成分は細胞からより速く枯渇するため、オフターゲット編集の機会を減らすことができる。さらに、プラスミドによって引き起こされる組込み変異誘発の機会を低減し得る。これらの利点を考えると、ＲＮＰはインビボの遺伝子編集においても有利になり得る。一方、ＲＮＰはタンパク質の分解により細胞から迅速に消失するため、発現が細胞内でより長く続くプラスミドコンストラクトよりもオンターゲット編集効率が低くなる可能性がある。
上記の仮説を評価し、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトが眼細胞療法及び遺伝子治療に望まれる遺伝子編集の両方の目的を達成できるかどうかを証明するために、２セットのコンストラクトを設計した。１つのコンストラクトはプラスミドコンストラクトで、もう１つはＲＮＰコンストラクトである。両コンストラクトは、トランスフェクションにて同じＢＣＤ患者のｉＰＳ細胞を使用し、その後、シークエンスを行って各コンストラクトのオンターゲット遺伝子修復及びオフターゲット編集を分析する。オフターゲット編集は、同じ患者の未改変の線維芽細胞からのゲノムＤＮＡと比較することにより決定される。プラスミドコンストラクトとＲＮＰコンストラクトの両方の結果を比較してもよい。
ＲＮＰの詳細な説明、ＲＮＰを形成する方法、及びＲＮＰコンストラクトを使用してＢＣＤ患者の遺伝的に修復された細胞（ｉＰＳ細胞及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）を作製する方法は、実施例セクションに示す。
同様のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトを使用して、ＢＣＤの他の変異並びに他のＲＰ及びＩＲＤの変異を修正又は不活性化しうることに留意されたい。一態様では、本明細書で使用されるｃｒＲＮＡ配列は、異なる標的変異配列を特異的に標的とする別のｃｒＲＮＡ配列に変更される。別の態様では、ＲＮＰコンストラクトにおけるガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡを改変して、遺伝子編集効率を高めてもよい。Hendel et al, Nat Biotechnol. 2015 Sep;33(9):985-989を参照。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、エレクトロポレーションを使用してトランスフェクトしてもよい。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、リポフェクション又はヌクレオフェクションを使用してトランスフェクトしてもよい。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、マイクロインジェクションを介して送達してもよい。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、インビトロで患者の細胞を遺伝的に修復及び治療することに加えて、インビボで遺伝子変異によって引き起こされる眼疾患の治療に使用してもよく、インビボでの適用には、他の種類のＣＲＩＳＰＲコンストラクト（例えば、ＣＲＩＳＰＲ成分をコードするプラスミド及び／又はｍＲＮＡ）よりも利点がある。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、インビトロで転写されたＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡと比較して、より高い効力、より低いオフターゲットリスク、及び／又はより低い毒性若しくは自然免疫応答活性化能を有する。一実施形態では、変異体ＤＮＡ配列の領域を標的とするガイドＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質からなるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトを、対象の眼に直接注射してもよい（例えば、網膜下注射、硝子体内注射、又は角膜注射）。別の実施形態では、インビボでの脳細胞の編集効率の向上が示されている（Staahl et al., Nat Biotechnol. 2017 May;35(5):431-434）、複数のＳＶ４０核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＮＬＳ））を有するＣａｓ９の改変バリアントを使用して、眼細胞で高い編集効率を達成してもよい。１又は複数のＮＬＳ（Ｎ末端及び／又はＣ末端）を持つＣａｓ９タンパク質は、ＩＤＴやＦｅｌｄａｎなどの様々なＣＲＯで市販されている。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは「そのままの状態」で送達される。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、送達時に医薬的に許容される担体とともに製剤化される。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、パッケージ化された形式、例えばナノ粒子で送達される。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰの成分（例えば、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質）の比率は、インビトロ又はインビボでの治療前に、インビトロで患者の細胞系（例えば、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ細胞又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）で異なる比率について試験することで調整及び最適化できることが理解される。前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、独立して使用してもよく、非限定的な例としてＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ若しくはｃｒＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、又はそれらの組み合わせをコードするプラスミド又はベクター；Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ；ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド；別のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクト；又はこれらの組み合わせ若しくはハイブリッドが挙げられる別のＣＲＩＳＰＲコンストラクトと組み合わせて使用してもよい。さらに、前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトを使用して、１又は複数の眼疾患に関連する１又は複数の変異を修正又は不活性化してもよい。
遺伝子治療及び細胞療法の併用治療
本開示は、非限定的な例としてＣＹＰ４Ｖ２遺伝子導入療法及びＣＹＰ４Ｖ２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法が挙げられる、ＣＹＰ４Ｖ２変異により引き起こされるＢＣＤ及び他の眼疾患の複数の治療オプションを提供する。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子導入療法もＣＹＰ４Ｖ２遺伝子編集療法も、インビボ、インビトロ、又はインビボ及びインビトロの両方で使用することができる。インビボで適用する場合、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子導入療法及び／又はＣＹＰ４Ｖ２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法は、遺伝子治療として、ＢＣＤに罹患した残りの眼細胞を治療することができる。患者細胞又は患者由来細胞にインビトロで適用する場合、細胞療法として、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子導入療法及び／又はＣＹＰ４Ｖ２ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法で治療された細胞を患者に移植して、死滅した又は変性した眼細胞を置き換えることができる。重要なことに、本明細書で提供される遺伝子治療及び細胞療法の組成物及び方法は、遺伝子治療又は細胞療法を単独で使用することでは達成できない追加的利益を患者に提供するために、組み合わせることができる。「併用療法」は、適格な患者のベースを広げうる。例えば、光受容体細胞又はＲＰＥ細胞が全く又はほとんど残っていない後期の患者では、遺伝子治療は初期の患者ほど効果的ではない。この場合、細胞療法は新しい細胞（例えば、ＲＰＥ又は光受容体細胞）を提供することにより有益となりうるが、遺伝子治療は、残りのＲＰＥ又は光受容体細胞を救済（レスキュー）することにより、及び／又は眼細胞の状態に影響を与える脈絡膜細胞の健康状態を改善することにより、細胞療法の効果を改善することができる。遺伝子治療及び細胞療法それぞれの「救済（レスキュー）」効果及び「置換」効果の組み合わせは、遺伝子治療又は細胞療法のいずれか一方と比べて、組み合わせ治療において改善をもたらす。この組み合わせ治療法は、１又は複数の遺伝子変異によって引き起こされる他の眼疾患にも適用されうる。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の方法及び組成物
本開示は、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子を含む様々な組成物、並びに眼細胞及び／又は眼疾患を治療するためにそれを利用する様々な方法に関する。一実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は治療目的に直接使用できる。いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子が使用される。いくつかの実施形態では、１又は複数の制御配列と作動可能に連結された機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする上記核酸分子を含む発現カセットを使用して、核酸分子の産物の発現を指示及び制御する。いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子及び標的細胞への送達を強化するための１又は複数の制御配列を含むＣＹＰ４Ｖ２発現カセットをパッケージ化し、上記ＣＹＰ４Ｖ２コードする核酸分子の産物及び発現カセットの所望の発現を達成するためにベクターを使用する。
いくつかの実施形態では、前記ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、前記ベクターはプラスミドである。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、別の種類のウイルス又は非ウイルスベクターである。前記治療方法は、有効量（又は有効濃度）の前記ベクターを対象の眼及び／又は標的細胞に投与又は送達することを含む。一実施形態では、治療はインビボで直接適用される。別の実施形態では、治療は、標的細胞（例えば、眼細胞）におけるエクスビボでの治療、及び治療された標的細胞を対象（例えば、対象の眼）に移植することを含む。治療方法は、ＣＹＰ４Ｖ２変異に関連する眼疾患及びその他の状態を対象としている。一実施形態では、前記眼疾患は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ）である。
Ａ．機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質、及び機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸
ＣＹＰ４Ｖ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー４、サブファミリーＶ、ポリペプチド２、（ＭＩＭ ６０８６１４）、同義語：ＣＹＰ４ＡＨ１）は、シトクロムＰ４５０スーパーファミリー（Ｐ４５０）のタンパク質の１つであり、シトクロムＰ４５０サブファミリー４（ＣＹＰ４）のメンバーである。シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は、オキシダーゼ酵素としての役割で知られる重要なヘム含有タンパク質である。Ｐ４５０という用語は、酵素が還元状態にあり、一酸化炭素と複合体を形成しているときの酵素の吸収極大波長（４５０ｎｍ）の分光光度ピークに由来する。それらは、生体異物及び内因性化合物、例えばステロイド、脂肪酸などの代謝に関与している。ＣＹＰ酵素は、動物、植物、菌類、原生生物、細菌、古細菌、さらにはウイルスなど、あらゆる生物界で特定されている。ただし、それらは遍在しているわけではなく、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）では見出されていない。
Ｐ４５０タンパク質は構造上重要な要素を共有している。例えば、Ｐ４５０タンパク質は、署名配列要素ＦＸＸＧＸＸＸＣＸＧ（配列番号３０）によって識別可能であり、システインは、ヘム鉄に対する軸配位子として機能する。Ｐ４５０タンパク質の中での配列の同一性は比較的低いが、それらの一般的なトポグラフィー及び構造の折り畳みは高度に保存されている。保存されたコアは、「ミアンダ形（ｍｅａｎｄｅｒ）（つづら折り状）」と称されるコイル、４ヘリックスバンドル、ヘリックスＪ及びヘリックスＫ、並びに２セットのβシートで構成されている。これらは、ヘム結合ループ（ヘム鉄の５番目のリガンドとして機能する完全に保存されたシステインを有する）、プロトン移動溝、及びヘリックスＫにおける保存されたＥＸＸＲモチーフ（配列番号３１）を構成する。Ｐ４５０タンパク質は、主にミトコンドリアの内膜又は細胞の小胞体にある膜結合タンパク質である。
構造的な類似性に加えて、Ｐ４５０タンパク質は機能的な類似性も共有している。Ｐ４５０酵素によって触媒される最も一般的な反応は、モノオキシゲナーゼ反応であり、例えば、酸素の１つの原子を有機基質（ＲＨ）の脂肪族の部分に挿入し、残りの１つの酸素原子は水に還元される：
ＲＨ＋Ｏ２＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→ＲＯＨ＋Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤＰ＋。
多くのヒドロキシル化反応（ヒドロキシル基の挿入）はＰ４５０酵素を使用する。多くのＰ４５０酵素は、基質としてステロイド及び／又は脂肪酸を有する。
ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９９７２３５．３）は５２５個のアミノ酸を有する（アミノ酸配列を配列番号４に示す）。病的バリアント（すなわち、変異）（ＢＣＤ患者間のＣＹＰ４Ｖ２変異の選択リストについては、本明細書の表１を参照）及び非病的（すなわち、機能的）バリアントなどの、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のバリアントが存在する。
一態様では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）である。他の態様において、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、非限定的な例として配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられるヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能的バリアント又は断片である。
機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、別の機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のバリアントであってもよい。以下は、本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸を変化させて、同等の又は改善された第２世代分子を作製することに基づく検討である。例えば、タンパク質構造中、一定のアミノ酸は、基質分子上の結合部位などの構造との相互作用的結合能力を大きく失うことなく（例えば、脂肪酸結合部位など）、他のアミノ酸と置換されてもよい。タンパク質の生物学的機能活性を決定するのはタンパク質の相互作用能力と性質であるため、特定のアミノ酸置換はタンパク質配列、及びその基礎となるＤＮＡ又はＲＮＡコード配列で行ってもよく、それでも同様の特性を持つタンパク質が生成する。したがって、本明細書で検討されるように、生物学的有用性又は活性を大きく喪失することなく、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のアミノ酸配列、又はその遺伝子若しくはコード領域のＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列に様々な変更を加えることができると考えられる。例えば、配列番号５は、配列番号４に示すヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質配列から１つのアミノ酸変化を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質バリアントのアミノ酸配列である。
様々な手法、アルゴリズム、ソフトウェア、及びツールを使用して、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質、例えばヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能的誘導体、バリアント、及び／又は断片を設計又は改変することができる。例えば、様々なポリペプチド又は変化の構造及び機能は、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析法、又はコンピューターモデリング（ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬサーバー、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ Ｖｉｅｗｅｒ、Ｐｏｌｙｐｈｅｎ−２、ＰＲＯＶＥＡＮ、ＳＩＦＴ、Ｃｏｎｄｅｌ、ＭｕｔａｔｉｏｎＡｓｓｅｓｓｏｒ、及びＦａｔＨＭＭなど）によってモデル化、決定、又は予測してもよい。
機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の断片であるか、断片に由来する場合もある。例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）及びそのバリアント（配列番号５）はいずれも、Ｎ末端から約１３番目のアミノ酸残基と約３５番目の残基の間に膜貫通ドメインを有する。ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）の骨格は約３６〜５２５ａａの間に位置している。従って、機能的ＣＹＰ４Ｖ２は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質から最初の約３５個のアミノ酸を欠失させて（配列番号６）これを別の膜貫通ドメイン配列で置換したものに由来していてもよい。機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の別の供給源としては、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のスプライスバリアントが挙げられる。
ＣＹＰ４Ｖ２の予測される膜貫通セグメントはＮ末端近くにあり、ＣＹＰ４５０ファミリーに典型的な球状構造ドメインがそれに続く。ＣＹＰ４Ｖ２の球状ドメインには、１８のヘリックス及びβ構造セグメントが含まれている。ヘム基はタンパク質の表面近くに位置し、タンパク質内部に向けてＩヘリックスが、表面的にＬヘリックスが、配位している。Li et al., Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004。ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は脂肪酸代謝において顕著に活性がある。他の多くのＰ４５０酵素も脂肪酸代謝に関与している。ＣＹＰ４Ｖ２は、ほぼ全ての組織及び臓器で遍在的に発現している。ＣＹＰ４Ｖ２の発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、網膜、網膜色素上皮、角膜、及びリンパ球で認められた（Li et al., Am J Hum Genet. 74:817-826, 2004）。しかし、他のほとんどのＰ４５０酵素は眼細胞には存在しない。例えば、ＣＹＰ４Ｖ２及びＣＹＰ１Ｂ１は、ＡＲＰＥ−１９細胞系で高レベルで発現する唯一のＰ４５０酵素であった。ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、及びＣＹＰ３Ａ４は低レベルでのみ転写され（ＣＹＰ４Ｖ２ ｍＲＮＡ発現の５％）、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、及びＣＹＰ４Ｆ１２の転写産物は検出されなかった（Nakano, et al., Mol Pharmacol 2012;82:679-686）。ＣＹＰ４Ｖ２変異の症状は眼に限定されており（眼ではＣＹＰ４Ｖ２はＣＹＰ１Ｂ１以外に発現する唯一の主要なＰ４５０酵素であり、発現する唯一のＰ４５０サブファミリー４（ＣＹＰ４）酵素である）、ＣＹＰ４Ｖ２が他のＰ４５０酵素と共に存在する臓器では示されない、という事実は、他のＰ４５０酵素、特にＣＹＰ４酵素がＣＹＰ４Ｖ２の機能の全て又は一部を置換するために使われうることを示唆している。実際、ＣＹＰ４サブファミリーは、限定されるものではないが、ＰＵＦＡのヒドロキシラーゼなど、脂肪酸代謝における共通の役割を共有することがわかっている。Hardwick, Biochem. Pharmacol., 75(12):2263-75；Fer et al., J. Lipid Res., 49(11):2379-89；Nakano et al., Mol. Pharmacol., 2012, 82:679-686を参照。ヒトＣＹＰ４タンパク質のタンパク質配列を、配列番号８〜１８に示す。
ＣＹＰ４サブファミリーの他のタンパク質と基質及び機能を共有していることに加えて、コンピューター解析により、ＣＹＰ４Ｖ２はＣＹＰ４６Ａ（配列番号７）の祖先の複製から形成され、さらに複製されてＣＹＰ４ファミリー全体が生成したことが明らかになった。Pan et al., Int. J. Mol. Sci., 2016, 17(7)pii:E1020. doi:10.3390/ijms17071020。
さらに、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のオーソログ、例えばマウスのＣｙｐ４ｖ３）は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ウマ、ウサギ、及びミバエを含む多くの種で保存されている（配列番号１９〜２９）。ヒト遺伝子ＣＹＰ４Ｖ２を持つオーソログは、１９６の生物で見出されている。
機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、限定されるものではないが、以下を含むか、以下から設計された、改変された、又は由来するものであってもよい：
（ｉ）ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）、
（ｉｉ）ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質のバリアント（例えば、アミノ酸の変化及び／又はスプライスバリアント）（例えば、配列番号５）、
（ｉｉｉ）機能性ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の１又は複数の断片（例えば、配列番号６）、
（ｉｖ）他の種のＣＹＰ４Ｖ２（又はオーソログ）タンパク質、
（ｖ）別のＣＹＰ４タンパク質又はＣＹＰ４６Ａ１、
（ｖｉ）患者の細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）の表２に挙げられている１又は複数の化合物の１又は複数の生化学的異常を改善、治療、又は阻止できるポリペプチド、及び／又は
（ｖｉｉ）上記の（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれか１又は複数の誘導体、ハイブリッド、又はバリアント。
本開示の組成物及び方法は、上記の任意の機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現するために使用できると考えられる。一実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４、５、又は６に示すアミノ酸配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、及びＣＹＰ４６Ａ（配列番号４〜１８）、及びチンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ウマ、ウサギ、及びミバエのＣＹＰ４Ｖ２（配列番号１９〜２９）、並びにそれらの誘導体、ハイブリッド、バリアント及び／又はそれらの断片、からなる群から選択されるアミノ酸配列の全て又は一部を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４〜２９からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）。一実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、ＦｘｘＧｘｘｘＣｘＧ及びＥｘｘＲの配列要素（配列番号３０及び３１）を含むポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、患者細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）の１又は複数の生化学的異常を改善、治療、又は阻止できる化合物又は薬剤である。
一実施形態では、他の疾患のタンパク質ベースの薬物と同様に、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をＢＣＤの治療に直接使用してもよい。別の実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子を、標的細胞で機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現するために使用する。一実施形態では、前記核酸分子はＲＮＡである。別の実施形態では、前記核酸分子は長期発現のためのＤＮＡであり、非限定的な例として相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が挙げられる。ｃＤＮＡは、ポジティブセンスであってもネガティブセンスであっても、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、前記機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸は、１又は複数の制御配列と作動可能に連結されてＣＹＰ４Ｖ２発現カセットを形成する。いくつかの実施形態では、そのような発現カセットは、送達及び／又は発現効率を高めるためにベクターにパッケージ化されている。
コドンは３つのヌクレオチドのセットで構成され、特定のアミノ酸をコードするか、翻訳の終了をもたらす（すなわち、停止コドン）。アミノ酸の大部分（通常はメチオニンを除くすべて）は、複数のコドンによってコードされている。したがって、異なる核酸配列を使用して同じタンパク質を発現させることができる。同じタンパク質配列をコードする２つの核酸分子間の配列同一性は、０％〜９９％以上の範囲内であり得る。例えば、核酸配列（配列番号１）と別の核酸配列（配列番号２）は、両方ともヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードするが、７７％の配列同一性のみを共有する。
核酸配列のコドン最適化は、コードされたアミノ酸配列を変更せずにタンパク質発現を改善及び／又は安定化しうる。コドンの最適化は、核酸配列に存在するコドンを、同じアミノ酸をコードする好ましいコドン、例えば、哺乳類の発現に好ましいコドンに置き換える。様々な戦略及びパラメーターをコドン最適化に使用可能であり、非限定的な例として、コドン使用バイアス、ＧＣ含有量、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ｍＲＮＡ二次構造、クリプティックスプライシング（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）部位、未熟なＰｏｌｙＡ部位、内部カイ部位及びリボソーム結合部位、ネガティブＣｐＧアイランド、ＲＮＡ不安定性モチーフ（ＡＲＥ）、反復配列（直接反復、逆反復、及び二組反復（ｄｙａｄ ｒｅｐｅａｔ））、及びクローニングに干渉する可能性のある制限部位が挙げられる。コドン最適化の方法は、当技術分野で知られており、例えば米国特許第６，１１４，１４８号及び米国特許公開第２０１１００８１７０８号を参照。所与のアミノ酸配列のコドン最適化核酸配列又はポリペプチドをコードする核酸配列は、本明細書に記載の方法及び／又はオンラインソフトウェアなどの様々なコドン最適化ソフトウェアの使用により作成できる。
使用されるコドン最適化の方法、構成、アルゴリズム、又はソフトウェアに応じて、同じタンパク質をコードする異なるコドン最適化核酸配列を作成できることが理解されよう。しかし、コドンの最適化は、野生型の未改変核酸配列と比較して常に発現の改善をもたらすとは限らない。Alexeyev MF, Winkler HH:Gene synthesis, bacterial expression and purification of the Rickettsia prowazekii ATP/ADP translocase. Biochim Biophys Acta. 1999, 1419:299-306. 10.1016/S0005-2736(99)00078-4； Curran KA, Leavitt JM, Karim AS, Alper HS:Metabolic engineering of muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Metab Eng. 2013, 15:55-66； Agashe D, Martinez-Gomez NC, Drummond DA, Marx CJ:Good codons, Bad transcript:large reductions in gene expression and fitness arising from synonymous mutations in a Key enzyme. Mol Biol Evol. 2013, 30 (3):549-560. 10.1093/molbev/mss273. doi:10.1093/molbev/mss273を参照。
ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードするコドン最適化核酸配列（配列番号２）が本明細書で提示される。配列番号１及び配列番号２はいずれも、同じヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードする。コドン最適化核酸配列（配列番号２）は、配列番号１に示される核酸配列のコドン適応指数（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ（ＣＡＩ））０．９４よりも改善されたＣＡＩ０．９５をを有する。ＣＡＩ１．０は、所望の発現生物において完全であると見なされる。本開示は、配列番号２に示すｃＤＮＡ配列に代表されるように、あらゆるＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又は該ｃＤＮＡに対応する若しくは由来する他の核酸配列を含む、あらゆるタイプのコドン最適化核酸配列の形態をカバーすることが理解されるであろう。また、前記核酸配列は、本明細書で提示される配列の一本鎖の形態であっても二本鎖の形態であってもよく、及び／又は同配列に対するポジティブセンスであっても、ネガティブセンスであっても、アンチセンスであっても、相補的センスであってもよいことが理解されるであろう。
コドンの最適化に加えて、他の方法を使用して翻訳のパフォーマンスを向上させてもよい。たとえば、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列又はシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を使用して、翻訳開始の効率を高めてもよい。異なる終止コドン（例えば、ＴＧＡ）を使用して、翻訳終結の効率を高めてもよい。ＯＲＦ配列に加えて、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸配列は、タンパク質発現を改善するためにＵＴＲ及び／又は１又は複数のイントロンなどの１又は複数の非コード配列も含んでいてもよい。発現を増強するために、コザック配列（例示的な配列を配列番号３６に示す）がＣＹＰ４Ｖ２をコードするｃＤＮＡの直前に挿入されてもよい。
本明細書で検討されるように、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能的バリアント及び／又は断片を利用できると考えられる。ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）の機能的バリアント（配列番号５）をコードする核酸配列を、配列番号３に提示する。
いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２核酸分子は、非限定的な例として配列番号４〜３０が挙げられる、任意の機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、又は配列番号４〜３０に示す配列のいずれかと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２核酸分子は、配列番号１、２、又は３のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。
本明細書に記載のベクター（例えば、ウイルス又は非ウイルスベクター）及びＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、典型的には１又は複数のＣＹＰ４Ｖ２核酸分子又はその断片を含む。核酸分子は、多くの形態をとることができ、非限定的な例として、ＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ）、二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、プラス鎖又はマイナス鎖核酸、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び／又はＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）が挙げられることが理解されるであろう。核酸分子は、１又は複数のヌクレオチドアナログ又は骨格改変を含んでいてもよい。そして、ｃＤＮＡは、逆転写酵素によって触媒される反応でｍＲＮＡ鋳型から合成可能であり、又はコードすることを意図したタンパク質（非限定的な例としてコドン最適化ｃＤＮＡ）に基づいて設計及び合成可能であり、又は別の核酸分子から変異誘発により合成可能であることが理解されるであろう。また、ｃＤＮＡはエクソンのみを含んでいてもよく、エクソンに他の配列、例えば非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／又はイントロンを含んでいてもよいことも理解されるであろう。いくつかの例では、本明細書に記載のベクター及びＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又はその機能的バリアント若しくは断片をコードする配列を有する核酸分子を含んでいてもよい。
適切な核酸配列は、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする任意の核酸配列であってよい。該核酸配列は、ＵＴＲ、イントロン又はコザック配列などの非コード要素を含んでいても含んでいなくてもよい。野生型配列又は合成若しくは改変配列（例えば、コドン最適化配列）を含んでいてもよい。機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に記載のように作製してもよく、当技術分野で公知の他の方法によって作製してもよい。
ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする配列番号１に示す配列を有する核酸分子を、本明細書では「ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ」と称する。ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする配列番号２に示すコドン最適化配列を有する核酸分子を、本明細書では「ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ」と称する。ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能的バリアントをコードする配列番号３に示す配列を有する核酸分子を、本明細書では「ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ」と称する。いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、２、又は３のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有する。
機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質及びそのような機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の方法により合成又は単離、精製、及び検出することができる。さらに、タンパク質合成又は単離、精製、及び検出は、Ｗｕｘｉ Ａｐｐｔｅｃ（上海、中国）及びＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）などのＣＲＯでも商業的に提供されている。核酸分子の合成又は単離、精製クローニング、及び検出は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル）を含むＣＲＯでも商業的に提供されている。
ポリペプチドは（例えば、組換えタンパク質発現又は化学合成を介して）合成したものであっても単離したものであってもよい。本明細書で使用される「精製された」ポリペプチドは、天然では共に存在している細胞成分から分離又は精製されたポリペプチドである。典型的には、ポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％）の割合で、当該ポリペプチドが天然では共に存在しているポリペプチド及び天然分子が除去されている場合、「精製された」と見なされる。化学的に合成されるポリペプチドは、本来、天然では共に存在する成分から分離されているため、合成ポリペプチドは「精製」されている。
ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲルろ過、及びハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法によって、天然源（例えば、生体試料）から精製することができる。ポリペプチドは、例えば、発現ベクターで核酸を発現させることにより精製することもできる。さらに、精製されたポリペプチドを、化学合成により得ることもできる。ポリペプチドの純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析などの適切な方法を使用して測定することができる。
ポリペプチドは通常、抗体を使用して検出される。抗体を使用してポリペプチドを検出するための技術としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光法が挙げられる。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。ポリペプチド又はポリペプチドの一部に対して特異的な結合親和性を有する抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して作製することができる。抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して、マイクロタイタープレートなどの固体支持体に付着させることができる。ポリペプチドの存在下で、抗体−ポリペプチド複合体が形成される。
「単離された」核酸分子とは、典型的には、天然には当該単離された核酸分子が由来する生物のゲノム中において当該核酸の一端又は両端に隣接している配列、を有しない核酸分子を指す（例えば、ｃＤＮＡ又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたゲノムＤＮＡ断片）。そのような単離された核酸分子は、通常、操作の簡便さ、タンパク質の発現、融合タンパク質の生成、又は他の目的で（非限定的な例として、ベクター（例えば、ウイルス又は非ウイルスベクター）へのパッケージングなど）、通常、コンストラクト（例えば、遺伝子治療で使用するためのクローニングコンストラクト又は発現コンストラクト）に導入される。
核酸は、当技術分野における常用技術を使用して単離され得る。例えば、核酸は、非限定的な例として組換え核酸技術、部位特異的変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／又は他の遺伝子工学的方法が挙げられる任意の方法を使用して単離することができる。一般的なＰＣＲ技術は、例えば、PCR Primer:A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。組換え核酸技術としては、例えば、制限酵素消化及びライゲーションが挙げられ、これらを使用して核酸を単離することができる。変異誘発プロトコルは、例えば、In Vitro Mutagenesis Protocols, Braman, ed., Humana Press, 2002に記載されている。
単離された核酸は、単一の核酸分子として、又は一連のオリゴヌクレオチドとして化学的に合成することもできる。
核酸を含むコンストラクトは、当技術分野で公知である。クローニングコンストラクト及び発現コンストラクトなどのコンストラクトは、商業的にオーダーメイドすることができ、当技術分野における常用組換えＤＮＡ技術によって作製することもできる。コンストラクトは、発現させる核酸に作動可能に連結された制御配列を有してもよく、さらに選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列などの配列を含んでもよい。制御配列は本明細書で検討されている。核酸を含むコンストラクトは、キメラ又は融合ポリペプチド（すなわち、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかであってもよい異種ポリペプチドに作動可能に連結されたポリペプチド）をコードしていてもよい。代表的な異種ポリペプチドとしては、コードされたポリペプチドの精製又は検出に使用できるものが挙げられる（例えば、６ｘＨｉｓタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＣＦＰ、Ｆｃ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＲＦＰ、Ｓｔｒｅｐ、ＶＳＶ、ＧＦＰ、及びＹＦＰ）。
核酸配列を運搬するコンストラクトは宿主細胞に導入することができる。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸が導入される特定の細胞を指し、コンストラクトを保有する当該細胞の子孫も含む。宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、又は昆虫細胞、酵母、若しくは哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｖ２７細胞、Ａ５４９細胞、Ｋ５６２細胞、Ｂ５０細胞、ＷＩ３８細胞、及びＢＨＫ細胞など）中の細胞であり得る。その他の宿主細胞としては、限定されるものではないが、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−光受容体細胞、ＥＳ−ＲＰＥ細胞、ＡＲＰＥ−１９細胞、角膜細胞、光受容体細胞、脈絡膜細胞、視神経細胞、その他の種類の本明細書で検討される眼細胞、神経細胞、上皮細胞、血液細胞、線維芽細胞、リンパ球、及び幹細胞由来細胞が挙げられる。インビボ及びインビトロのいずれにおいても、宿主細胞に核酸、ベクター、又は核酸導入遺伝子を保有する発現カセットを導入するための多くの方法が当業者に周知であり、非限定的な例として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換、ヒートショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、及びウイルス媒介核酸移動が挙げられる。
核酸は、適切なオリゴヌクレオチド対（例えば、プライマー）を用いて、任意の数の増幅技術を使用して検出できる（例えば、PCR Primer:A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny並びに米国特許番号第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、及び第４，９６５，１８８号を参照）。当初のＰＣＲに対する多くの改変が開発されており、核酸の検出に使用することができる。核酸はハイブリダイゼーションによっても検出できる。核酸間のハイブリダイゼーションの詳細については、Sambrook et al.で検討されている（1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、セクション７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５７、１１．７〜１１．８、及び１１．４５−１１．５７）。Sambrook et al.は、約１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブの適切なサザンブロット条件（セクション１１．４５〜１１．４６）及び約１００ヌクレオチド超のオリゴヌクレオチドプローブのサザンブロット条件（セクション９．４７〜９．５４を参照）を開示している。
Ｂ．ベクター
いくつかの実施形態では、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又はその断片をコードする核酸分子は、ベクターにより、治療を必要とする眼細胞に送達される。眼細胞への送達のために、治療用ベクターは、標的細胞への核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の送達において非毒性かつ効率的であることが望ましい。遺伝子治療ベクターは当技術分野で公知であり、ウイルスベクターであっても非ウイルスベクターであってもよい。
細胞への核酸のインビボ導入のためのアプローチの１つとして、核酸分子、例えばｃＤＮＡなどのウイルスベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクターによる細胞の感染には、標的細胞の大部分が核酸分子を受け取ることができるという利点がある。さらに、例えばウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡによってウイルスベクター内にコードされる分子は、核酸分子を含むウイルスベクターを取り込んだ細胞で効率的に発現される。
使用できるウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルス（ＨＶ）ベクター、パピローマウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ベクター、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが挙げられる。プラスミドを使用して、核酸分子を標的細胞に送達することもできる。いくつかの例では、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターなどの組換えウイルスベクターである。宿主細胞（例えば、対象の細胞）のゲノムに組み込まれるか、組み込まれる傾向のあるベクターもあれば、宿主細胞のゲノムへ組み込まれないか、組み込まれにくい傾向のあるベクターもある（例えば、染色体外発現）ことを、当業者は理解するであろう。
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、遺伝子治療アプローチで一般的に使用されている。ＡＡＶはパルボウイルスファミリーに属し、それぞれ一本鎖ＤＮＡを含んでいる。ｒＡＡＶベクターは現在、哺乳類細胞への遺伝子導入のための最も安全で効率的なプラットフォームであると考えられている（Salganik et al, 2015, Microbiol. Spectr., 3(4):doi:10.1128/microbiolspec.MDNA3-0052-2014）。これまでに、１２のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１２）及び１００超のバリアントが、ヒト及び非ヒト霊長類の組織試料（例えば、Gao et al., 2005, Curr. Gene Ther., 5:285-97を参照）及び他の種から分離されている。本明細書に記載の方法では、天然に存在するＡＡＶ種類及び改変されたＡＡＶ種類のいずれも使用することができる。
野生型ＡＡＶは、３つのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成されるカプシド内に囲まれた線形の一本鎖ＤＮＡゲノムを含んでいる。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）では、野生型ＡＡＶゲノムのｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、典型的に、パッケージングに必要なＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子発現カセットに置き換えられる。本明細書において、「ｒＡＡＶベクター」という用語は、１又は複数のＡＡＶウイルスの１又は複数のカプシド要素、又は１又は複数のＡＡＶウイルスに由来する１又は複数のカプシド要素を含む組換えＡＡＶベクターを指す。
ＡＡＶ及び他のウイルスベクター媒介遺伝子治療の利点にもかかわらず、全てのウイルスベクター及びすべてのＡＡＶ型が特定の疾患の治療に適しているわけではない。ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を使用した遺伝子治療が直面する２つの大きな課題：第一に、治療の標的となる細胞型において、ＡＡＶベクターによる充分な形質導入効率が望まれる。第二に、ウイルスベクターによって引き起こされる潜在的な免疫反応を考慮する必要がある。Madsen et al., Adeno-associated virus serotype 2 induces cell-mediated immune responses directed against multiple epitopes of the capsid protein VP1. J Gen Virol 90, 2622-2633 (2009)、Mingozzi et al., CD8(+)T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med 13, 419-422 (2007)を参照。他のほとんどの臓器や組織と比較して、眼は他の多くの臓器に比べて免疫的に有利な臓器と見なされており、眼におけるＡＡＶを介した遺伝子治療における免疫応答は免疫抑制剤の使用により調節できるが、眼のＡＡＶ伝達における中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＮＡＢ））などの免疫応答の役割は、大型動物では不明である。さらに、硝子体内ＡＡＶ投与は、網膜下投与よりも免疫系との相互作用の影響を受けやすい。したがって、潜在的な副作用を回避し、ウイルスベクターの形質導入／発現効率が、例えば対象中既に存在しているＮＡＢなどの免疫反応によって実質的に低下しないようにするため、及び／又はｒＡＡＶベクターの用量を低減させるために、眼の遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、免疫応答を最小限とするか全く引き起こさないようにする。
これらの課題に対処するためには、ＡＡＶベクターの設計及び選択に関連する様々な組成及び方法を使用することができる。ＢＣＤの治療のためにＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療を使用する場合、治療の標的となる細胞が主にＲＰＥ細胞である場合、ＲＰＥ細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが望ましい。ＢＣＤ患者の角膜細胞を治療する場合、角膜細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが望ましい。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが使用される。いくつかの実施形態では、角膜細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが使用される。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ及び光受容体細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが使用される。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ、光受容体、及び脈絡膜細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが使用される。いくつかの実施形態では、網膜細胞に充分な形質導入効率を持つベクターが使用される。いくつかの実施形態では、眼細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが使用される。いくつかの実施形態では、眼細胞及び／又は血液細胞で充分な形質導入効率を持つベクターが使用される。潜在的な免疫応答（例えば、遺伝子治療ベクターに対するＮＡＢ及び細胞ベースの免疫応答）に対処するために、様々なＡＡＶ血清型及びバリアント、改変ＡＡＶベクター、及び／又は免疫抑制プロトコルを使用することができる。
本明細書で使用されるｒＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１２のいずれか、又はヒト若しくは他の種から単離された他の野生型ＡＡＶバリアント（非限定的な例としてＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２が挙げられる））に基づく又は由来するものであってもよく、改変ＡＡＶに基づく又は由来するものであってもよい。改変ＡＡＶは、改変様々な方法で作製することができ、限定されるものではないが、偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／１２、ＡＡＶ８／２）、キメラＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ）、カプシド改変ＡＡＶ（例えば、カプシド変異体ＡＡＶ（例えば、Ｙ−Ｆ、Ｋ−Ｒ、Ｔ−Ａ、Ｓ−Ａ及び／又はＴ−Ｖ変異を有するＡＡＶ、並びにＡＡＶ−ＤＪのカプシド変異体ＡＡＶであるＡＡＶ−ＤＪ／８又はＡＡＶ−ＤＪ／９））、カプシドバリアントＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ ７ｍ８及び誘導体）、祖先ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）、天然に存在するＡＡＶ又はバリアントのゲノム及び／又はカプシドへの任意の変化を含む組換えＡＡＶ、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。改変ＡＡＶに言及するとき、限定されるものではないが、人工、修飾、合成、再構築、改変、進化、設計、誘導、又は強化されたＡＡＶ、若しくは合理的設計法及び／又は定向進化法及び／又はＤＮＡシャッフリングによって作製されたＡＡＶ、又はＡＡＶバリアントなどを含む様々な方法があることが理解されるだろう。改変ＡＡＶの使用には、未改変ＡＡＶとくらべていくつか利点があり、限定されるものではないが、より高い形質導入効率、より高い組織特異性又は細胞特異性、より少ない免疫反応、及び／又は特定の種類の投与（例えば、硝子体内注射、又は血流による送達）により適していることなどが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される改変ＡＡＶベクターは、偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ＡＡＶである。ＡＡＶシュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）とは、異なるウイルス血清型からのカプシドとゲノムとの混合を指す。これらの血清型はスラッシュ（／）を使用して示されており、ＡＡＶ２／５は、血清型５のカプシドにパッケージ化された血清型２のゲノム（例えば、ＩＴＲ）を含むウイルスを示す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／１０、又はＡＡＶ２／１２ベクターである。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される改変ＡＡＶベクターは、異なるＡＡＶ血清型（異なる種から単離された異なるＡＡＶ血清型を含む）に由来するキメラ（ハイブリッド又はシャッフルとも称される）ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ／８又はＡＡＶ−ＤＪ／９である。ＡＡＶ−ＤＪは、ＤＮＡシャッフリング法により８つの血清型のＡＡＶハイブリッドのライブラリから生成されたＡＡＶバリアントである。Grimm, D. et al. (2008). J. Virol. 82:5887-5911。これは眼細胞などの広範な種類の細胞を効率的に形質導入することができる。さらに、キメラＡＡＶは、天然のＡＡＶよりも免疫中和を回避する能力が高いため、より大量の治療的導入遺伝子を効率的に送達できる。ハイブリッドＡＡＶはさらに改変してもよい。例えば、ＡＡＶ−ＤＪ／８及びＡＡＶ−ＤＪ／９は、ＡＡＶ−ＤＪのヘパリン結合ドメイン（ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＨＢＤ））に点変異を作製することによって作製された。Grimm, D. et al. (2008). J. Virol. 82:5887-5911。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される改変ＡＡＶは、カプシド変異体ＡＡＶである。これには、ＡＡＶカプシドタンパク質に１又は複数の変異（例えば、点変異）を作製することが含まれる。カプシド変異体ＡＡＶは、未改変ＡＡＶよりも利点を有しうる。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質の表面露出チロシン（Ｙ）残基の点変異は、リン酸化及びそれに続くユビキチン化を回避し、インビトロ及びインビボのいずれにおいてもより高い形質導入効率をもたらす簡単で効果的な方法として報告された（Zhong et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(22):7827-32:Markusic et al., Mol Ther. 2010;18(12):2048-56、Li et al., Hum Gene Ther. 2010 Nov;21(11):1527-1543）。例えば、７つのＡＡＶ２カプシドチロシン残基（Ｙ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、及びＹ７３０）のそれぞれのフェニルアラニン残基置換による部位特異的変異誘発は、インビトロのヒト細胞及びインビボのマウス肝細胞において、ＥＧＦＲ−ＰＴＫリン酸化及びユビキチン−プロテアソーム経路を回避することにより、ベクター形質導入及び導入遺伝子発現の増加をもたらす（Zhong et al., Virology. 2008 Nov 25;381(2):194-202）。また、特定のチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びリジン（Ｋ）残基でのＡＡＶカプシドの点変異が、インビトロでもインビボでも有意な形質導入の改善につながる可能性があることが報告されている（Gabriel et al., Hum Gene Ther Methods. 2013;24(2):80-93、Sen et al., Hum Gene Ther Methods. 2013;24(2):104-16、Sen et al., Sci Rep. 2013;3:1832、Wu et al., J Virol. 2006;80(22):11393-7）。カプシド変異を改変ＡＡＶに対して行って、別の改変ＡＡＶを作製してもよい。例えば、ＡＡＶ−ＤＪ／８及びＡＡＶ−ＤＪ／９は、ハイブリッドＡＡＶであるＡＡＶ−ＤＪのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）に点変異を作製することによって作製された。Grimm, D. et al. (2008). J. Virol. 82:5887-5911。カプシドの変異によれば、ＡＡＶにＮＡＢを回避し、免疫応答を低下させることもできる。さらに、特定のカプシド変異により、ＡＡＶは硝子体内送達により適したものにすることができる。Kay et al., PLoS One, 8:e62097, 2013。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＡＡＶベクターは、１又は複数のカプシド変異を有する改変ＡＡＶであり、カプシド変異としては、限定されるものではないが、チロシンからフェニルアラニン（Ｙ−Ｆ）、スレオニンからバリン（Ｔ−Ｖ）、リジンからアルギニン（Ｋ−Ｒ）、スレオニンからアラニン（Ｔ−Ａ）、セリンからアラニン（Ｓ−Ａ）、及び／又は、ＡＡＶのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）及び／又は抗原性領域（非限定的な例として４５９位、４９３位及び５５１位が挙げられる）に影響を与えるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、及びＴ４９１Ｖのうちの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ２である（番号（４４４など）はＡＡＶカプシドの点変異の位置を示す）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｙ２６３Ｆ及びＹ７１９Ｆのうちの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｙ４４７Ｆ、Ｙ７３３Ｆ、及びＴ４９４Ｖのうち１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ８である。ある実施形態では、ＡＡＶベクターはＹ７３１Ｆのカプシド変異体を有するＡＡＶ１である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｙ４４５Ｆ及びＹ７３１Ｆのうちの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｙ７３１Ｆのカプシド変異を有するＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｋ１３７Ｒ、Ｔ２５１Ａ、及びＳ５０３Ａのうちの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ／８又はＡＡＶ−ＤＪ／９である。
いくつかの実施形態では、改変ＡＡＶベクターは、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶである。バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、非天然カプシドタンパク質は、異種配列（例えば、異なる選択されたＡＡＶ血清型、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、又は非ウイルス源から得られた配列）と組み合わせた選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、改変ＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質ＧＨループにアミノ酸（例えば、約５アミノ酸〜約１１アミノ酸）の１又は複数の挿入を含む。バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、非バリアントＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）による網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の感染性を増加させる可能性がある。いくつかの実施形態では、改変ＡＡＶは、導入遺伝子を血液眼関門（ＢＯＢ）全体に送達できるものであり、これにより血流を介した送達に適するものになり、眼の遺伝子治療に使用される従来の投与（例えば、網膜下注射又は硝子体内注射）に対する代替の投与経路／送達経路が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶは、ＡＡＶ ７ｍ８又はその誘導体若しくはバリアントである（Dalkara et al., Science Translation Medicine, 5:189ra76, 2013、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３４４１３、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３９０１５、米国特許出願第１４／２１４，０１１号、及び米国特許出願第１３／８９９，４８１号）。いくつかの実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を有するＡＡＶは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂである。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ウイルス進化系統の再構築を通じて再構築又は合成することができる。このような再構築により、先祖、古代、又は親のＡＡＶを作製しうる。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ａｎｃ８０（ＡＡＶ１、２、８、及び９の祖先）又はその誘導体である。Zinn et al., Cell Rep. 2015 Aug 11;12(6):1056-68。
いくつかの実施形態では、１又は複数のＡＡＶ及び／又は他のウイルスベクターは、例えば「定向進化法」及び／又は「合理的設計法」などの当技術分野で公知の技術によって改変できる（例えば、硝子体内送達、標的細胞型（例えば、ＲＰＥ細胞）における増強された形質導入、又は血流による送達のために最適化される）。例えば、Asuri et al., Mol Ther. 20:329-338, 2012 and Yang et al., Methods Mol Biol. 709:127-139, 2011を参照。改変ＡＡＶ又は他のウイルスベクターは、例えば、「改変された」、「ハイブリッド」、「進化した」、「強化された」、又は「設計された」ベクターと説明されうる。このような改変は、例えば、ベクターターゲティング（例えば、硝子体内送達又は血流を介した送達に対する適合性の改善）、形質導入効率を改善し、及び／又は免疫反応を低下させ、例えば、必要とされる用量をより低減することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０（ＥＰ ２０１００１７８９４０）又はＳｈＨ１０である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（米国特許公開第２０１５００７９０３８号）である。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、本明細書に記載されている複数の戦略の組み合わせから作製及び／又は選択することができる。例えば、ＡＡＶ−ＤＪ／８及びＡＡＶ−ＤＪ／９は、ハイブリッドＡＡＶであるＡＡＶ−ＤＪのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）に点変異を作製することによって作製された。
いくつかのＡＡＶが他のいくつかのＡＡＶよりも硝子体内送達により適している可能性があることは当技術分野で公知である。硝子体内送達のためのそのようなＡＡＶの多くは、変異によるＡＡＶカプシドタンパク質の改変を伴う（例えば、ＡＡＶ２（Ｙ−Ｆを４つ（ｑｕａｄＹ−Ｆ）＋Ｔ−Ｖ）（Kay et al., PLoS One. 2013 Apr 26;8(4)）又はバリアントＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ ７ｍ８）。さらに、例えばＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂなど、血流を介した送達に適したＡＡＶが存在する。しかし、それらの使用は、硝子体内送達又は血流を介した送達に限定されず、例えば、網膜下投与及び他の投与経路用のＡＡＶベクターとして使用することもできる。
いくつかの実施形態では、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）が使用される。野生型ＡＡＶは一本鎖ＤＮＡゲノムを持っている。ＡＡＶの欠点の１つは、その一本鎖ＤＮＡゲノムにある。一本鎖ＡＡＶゲノムは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して相補鎖を合成するため、導入遺伝子の発現は遅延し、二本鎖ＤＮＡほどロバストではない。我々は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療のために、従来の一本鎖ＡＡＶベクターで律速となる第二鎖合成を回避し、ロバストな導入遺伝子発現を促進するｓｃＡＡＶ設計を開発した（図７を参照）。ｓｃＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２は、宿主細胞ＤＮＡ合成を不要とする分子内自己相補的ＣＹＰ４Ｖ２ ＤＮＡ構造を備えており、形質導入時のより高速かつロバストな発現を実現する。しかしながら、ｓｃＡＡＶの自己相補的構造は、ｓｃＡＡＶベクターのパッケージングの制限を、ｓｓＡＡＶの約４．７〜５．０ｋｂからｓｃＡＡＶの約２．４〜２．５ｋｂに低減する。したがって、ｓｃＡＡＶ設計には、より短い長さの制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリＡシグナル）が必要である。発現カセットがベクターパッケージングの制限を超えないようにし、また使用するｃＤＮＡやその他の制御配列の長さに応じて、エンハンサーなどのいくつかのオプショナルな制御配列をｓｃＡＡＶコンストラクトから除外する必要がある。ｓｃＡＡＶ設計の２つのＩＴＲの１つは、切断型ＩＴＲであり、末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ（ＴＲＳ））に変異を有する。ｓｃＡＡＶの構造、精製、及び生産に関する詳細な検討については、McCarthy, Molecular Therapy, Volume 16, Issue 10, p1648-1656, October 2008を参照。
他の多くのベクター設計も利用可能である。例えば、デュアルベクターシステム（例えば、ＡＡＶベースのデュアルベクターシステム、例えば、トランススプライシング又はハイブリッドデュアルＡＡＶベクター）を使用して、核酸配列（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列）を発現させることができる。例えば、Colella, et al., Gene Ther. 21, 450-456, 2014を参照。例えば、デュアルベクターシステムは、
（ｉ）ポリヌクレオチドの各末端（５’及び３’末端）に末端逆位反復配列を有し、前記末端逆位反復配列間に、目的の核酸配列によってコードされるタンパク質のＮ末端部分をコードする部分的コード配列に作動可能に連結された適切なプロモーターを有する、第１のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、及び
ｉｉ）ポリヌクレオチドの各末端（５’及び３’末端）に末端逆位反復配列を有し、前記末端逆位反復配列間に、目的の核酸配列によってコードされるタンパク質のＣ末端部分をコードする部分的コード配列と、それに続くポリアデニル化（ｐＡ）シグナル配列と、を有する第２のＡＡＶベクターポリヌクレオチド、
を含んでいてもよい。
ｓｃＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ｓｃＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ｓｃＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）を含む、様々なｒＡＡＶベクターが本研究用に設計及び生成された（図７の模式図及び注釈を参照）。それらは、様々なベクター設計のｒＡＡＶベクターをＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療に使用できることを実証する。さらに、複数のｒＡＡＶベクターを選択肢に含めることは、患者集団内の特定のＡＡＶ種類に対する既存の中和抗体及び他の個々の免疫応答を考慮すると、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療における潜在的な免疫応答を減らすことに有用となり得る。また、同一の眼への引き続く投与や同じ対象の反対側の眼への投与が望ましい場合、より多くのオプションが提供されるであろう。
ウイルス送達ベクターを作製する方法（ヘルパーフリーシステムを使用する作製など）は、当技術分野で公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１００５５号、米国特許第６４５８５８７号、及び米国特許第６４２８９８８号（Ｂ１）を参照。遺伝子治療で使用される様々なベクター（非限定的な例としてＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスベクターなど）の作製については、契約研究機関（ＣＲＯ）及び契約製造機関（ＣＭＯ）、例えばＶｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ（ペンシルベニア州マルバーン）及びＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．，（カリフォルニア州サンディエゴ）によっても商業的に利用可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において有用な組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型カプシドタンパク質又はその断片をコードする核酸分子；ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び目的の核酸分子（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列を有する）を少なくとも含むミニ遺伝子；及び目的の核酸を前記ＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージ化するのに充分なヘルパー機能、を含む宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を培養することにより作製することができる。核酸をＡＡＶカプシドにパッケージ化するために宿主細胞で培養する必要がある成分は、シス又はトランスで宿主細胞に提供することができる。または、必要な成分（例えば、目的の核酸分子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／又はヘルパー機能）の１又は複数を、１又は複数の前記必要な成分を含むように改変された安定な宿主細胞によって提供することができる。これらの成分はいずれも、適切な血清型の中から選択することができる。例えば、ｒＡＡＶベクターは、
（ａ）２つのＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、目的の遺伝子（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするｃＤＮＡ）及び他の所望の制御配列で構成される、クローニングされた組換えＡＡＶゲノムを含むプラスミド（ＡＡＶ ｃｉｓプラスミド）、
（ｂ）ＡＡＶウイルスＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子をトランスで発現する別個のコンストラクト、及び
（ｃ）アデノウイルス感染、又はアデノウイルスヘルパー因子を提供する第三のプラスミドをプロデューサー細胞にトランスフェクトすることにより提供されるアデノウイルスヘルパー因子、
をプロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３細胞）にコトランスフェクトすることにより作製される。ＨＥＫ２９３細胞の他、非限定的な例としてＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｂ５０細胞、ＷＩ３８細胞、及びＢＨＫ細胞などが挙げられる他の細胞系をｒＡＡＶベクターの作製に使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ウイルス送達ベクターは、ｒＡＡＶ２ウイルス、ｒＡＡＶ２／５ウイルス、ｒＡＡＶ２／８ウイルス、ｒＡＡＶ２／１ウイルス、ｒＡＡＶ２／４ウイルス、ｒＡＡＶ２／６ウイルス、ｒＡＡＶ２／９ウイルス、ｒＡＡＶ２／１２ウイルス、又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及び／又はＡＡＶ１２ウイルスの１又は複数からのカプシド要素を持つｒＡＡＶウイルスである。一実施形態では、ウイルス送達ベクターは、非限定的な例としてＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、又はＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）が挙げられる１又は複数のＹ−Ｆ変異を有するｒＡＡＶウイルスである。
いくつかの実施形態では、前記ウイルス送達ベクターは一本鎖ｒＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ウイルスである。いくつかの実施形態では、前記ウイルス送達ベクターは、自己相補的ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ウイルスである。
ＡＡＶベクターに加えて、他のウイルスベクターをＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療に使用してもよい。例えば、アデノウイルスベクターも遺伝子送達に有用であることが実証されている。例えば、Mori et al., 2002. IOVS, 43:1610-1615には、導入遺伝子（緑色蛍光タンパク質）がＣＭＶプロモーターによって駆動される、Ｅ−１が欠失し、部分的にＥ−３が欠失した５型Ａｄであるアデノウイルスベクターの使用が記載されている。１０７〜１０８個のウイルス粒子の注入により発現レベルのピークが得られ、網膜下注入では硝子体内注入よりも高いレベルの発現が得られた。
いくつかの実施形態では、前記送達ベクターは、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又はその機能的バリアント若しくは断片をコードする核酸分子を含むプラスミドである。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療には非ウイルスベクターも使用可能である。非ウイルスベクターの例としては、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、デンドリマー、リポソーム（例えば、カチオン性又はアニオン性リポソーム）、ポリマー（例えば、ポリプレックス）、脂質ポリマー系、及びナノ粒子（例えば、無機又は合成ナノ粒子）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Farjo et al., 2006, PLoS 1:e38では効率的な非ウイルス性眼遺伝子導入が実証されており、ここでは、眼組織への非ウイルス性遺伝子導入のシステムとして、圧縮されたＤＮＡナノ粒子が使用されている。概念実証として、ＣＭＶ最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーター及びエンハンサーによって転写調節される強化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡをコードするｐＺＥＥＧＦＰ５．１（５，１４７ｂｐ）発現コンストラクトが使用された。プラスミドＤＮＡを、公知の方法を使用してＣＫ３０ＰＥＧ１０Ｋ（Ｎ末端に、マレイミド連結部分を介して１０ｋＤａポリエチレングリコールと連結しているシステインを有する、３０−ｍｅｒリジンペプチド）と混合することにより、ＤＮＡナノ粒子が作製された。ナノ粒子は、生理食塩水中のＤＮＡが４ｍｇ／ｍＬとなるまで濃縮された。圧縮されたＤＮＡは、硝子体腔に０．６μｇの用量で送達された。ＰＣＲ及び顕微鏡検査により、水晶体、網膜、及び色素上皮／脈絡膜／強膜におけるＧＦＰの発現が観察された。
さらに、眼遺伝子導入方法に関する多くの特許が発行されており、非限定的な例として、ヒアルロン酸媒介アデノウイルス形質導入の方法を提供する米国特許第７，１４４，８７０号、レンチウイルスベクター及び眼遺伝子送達を媒介するためのそれらの使用を提供する米国特許第７，１２２，１８１号及び米国特許第６，５５５，１０７号、単純ヘルペスウイルスベクター及び眼遺伝子送達を媒介するためのそれらの使用を提供する米国特許第６，１０６，８２６号、及びＤＮＡ発現ベクター及び眼遺伝子送達を媒介するためのその使用を提供する米国特許第５，７７０，５８０号が挙げられる。
様々なベクターからＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用するのに適したベクターをスクリーニング及び選択する方法は、本明細書の実施例セクションで提示される。実施例では、様々なＡＡＶベクターを使用してかかる方法を説明している。そのような方法は、当業者が様々な種類のベクターを比較及び選択するために（ウイルス ｖｓ． 非ウイルスベクター、アデノウイルス ｖｓ． ＡＡＶ、レンチウイルス ｖｓ． ＡＡＶ、ＨＳＶ ｖｓ． ＡＡＶなど）使用してもよいことは理解されるだろう。
Ｃ．ＣＹＰ４Ｖ２発現カセット及び制御配列
本開示はまた、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸配列（例えば、配列番号１、２、又は３の核酸配列）及びＣＹＰ４Ｖ２をコードする核酸配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む発現カセットを提供する。機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子に加えて、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用される発現カセットの他の重要な要素には、前記核酸分子の発現を調節するための１又は複数の制御配列が含まれる。いくつかの実施形態では、前記発現カセットは、送達、形質導入、及び／又は発現の効率の向上のために、送達ベクター（例えば、両側にＡＡＶ ＩＴＲが存在するｒＡＡＶベクター）にパッケージ化されている。本明細書に記載の方法では、任意のＡＡＶ ＩＴＲを使用することができる。本明細書の実施例に記載されるｓｓＡＡＶベクターは、それぞれ約１４１ｂｐの２つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含む（例示的な配列を配列番号４０に示す）。実施例に記載されたｓｃＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、そのうちの１つは切断型である（例示的な配列を配列番号４１に示す）。ＡＡＶ２ ＩＴＲの長さは通常、使用される親ベクターに応じて約１３２ｂｐ〜約１６７ｂｐである。
本明細書で使用される「制御配列」という用語は、核酸配列の複製又は発現（転写又は翻訳）に制御効果を及ぼす、又は、その他の方法で核酸配列の発現を指示する、影響を及ぼす、及び／又は制御することができる任意の遺伝的要素（例えば、ポリヌクレオチド配列）を指す。一般的な発現制御配列としては、プロモーター、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル、エンハンサー、上流制御ドメイン、イントロン、ＵＴＲ、応答要素又は誘導要素、複製起点、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写開始配列、終止配列、スプライシングやポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列などのＲＮＡプロセシング配列、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を高める配列、又はコードされたタンパク質の分泌を高める配列が挙げられる。制御配列は、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、又はウイルス起源のものであっても、その誘導体、ハイブリッド、又はバリアントであっても、合成物であってもよく、ベクターは異なる起源の制御配列の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、制御配列は、発現を制御しているコーディング配列（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子）に対して、異種（例えば、異なる起源又は異なる遺伝子、例えば、非ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子由来）であっても同種（例えば、同じ遺伝子、例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子由来）であってもよい。本明細書で使用される「作動可能に連結された」という表現は、核酸コード配列の発現を指示する、影響を及ぼす、又は制御するように、プロモーター及び／又は他の制御配列が核酸コード配列に対して配置されることを意味する。制御配列は、同じベクターにおいて、又は異なるベクターにおいて、配列をコードする核酸と「作動可能に連結」することができる。核酸コード配列に作動可能に連結された１又は複数の制御配列は、連続的であってもよく、及び／又は核酸コード配列の発現を指示する、影響を及ぼす、又は制御するためにトランスに又は遠隔的に作用してもよい。制御配列の中で、プロモーターは必須であり、エンハンサー、イントロン、ターミネーターなどの他の制御配列は有用ではあるがオプショナルである。
様々なプロモーター配列を使用して、核酸コード配列の発現を促進することができる。実質的にすべての組織及びほとんどの細胞型で発現を誘導する構成的プロモーターもあれば、より調節されているプロモーターもある。制御されたプロモーターは、特定の組織又は細胞でのみ作用する（すなわち、組織又は細胞特異的プロモーター）、又は発達中の特定の時間でのみ作用する（すなわち、発達段階特異的プロモーター）ことがあり、環境条件又は化学物質、酸素レベル、熱、若しくは光などの外部刺激（すなわち、誘導性プロモーター）に条件付けられていてもよい。
いくつかの例では、構成的（又は遍在的）プロモーターを使用することが望ましい場合がある。例示的な構成的プロモーターとしては、非限定的に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 Sep;22(9):1143-1153、Norman et al., PLoS ONE 5(8):e12413, Aug 2010）、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ＣＭＶ／ニワトリβアクチン／ウサギβグロビン由来のハイブリッドＣＡＧ（ＣＡＧＧＳ、ＣＢＡ、又はＣＢとしても知られる）プロモーター（Miyazaki J, Takaki S, Araki K, Tashiro F, Tominaga A, Takatsu K, Yamamura K. 1989. Expression vector system based on the chicken β-actin promoter directs efficient production of interleukin-5. Gene 79:269-277、Acland, G. M. et al. MoI Then, 2005, 12:1072-1082）、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）プロモーター（約９５３ｂｐ、Mah, et al. 2003, Hum. Gene Ther. 14:143-152、Haire, et al. 2006 IOVS, 2006, 47:3745-3753を参照）、ＣＢｈプロモーター（約８００ｂｐ、Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 Sep;22(9):1143-1153を参照）、ヒトβ−アクチンプロモーター（ＡＣＴＢ）（Norman et al., PLoS ONE 5(8):e12413, Aug 2010）、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター（Gill et al., Gene Ther. 2001;8(20):1539-1546、Norman et al., PLoS ONE 5(8):e12413, Aug 2010を参照）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ、ヒト又はマウス）プロモーター（Norman et al., PLoS ONE 5(8):e12413, Aug 2010）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター（Norman et al., PLoS ONE 5(8):e12413, Aug 2010）、ＧＵＳＢ（β−グルクロニダーゼ）プロモーター、ＧＵＳＢ最小プロモーター（ｈＧＢｐ）（Husain, Gene Therapy (2009)16, 927-932）、ＵＣＯＥプロモーター、伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ））プロモーターが挙げられる。様々なプロモーターの一般的な比較と検討については、例えば、Powell, Discov Med. 2015 Jan;19(102):49-57を参照。いくつかの場合、「構成的」又は「遍在的」プロモーターは、選択された細胞型でサイレンシングされる傾向にあったり、発現強度を差異的に促進したりすることが理解されるべきである。例えば、McCown et al., Brain Res. 1996;713(1-2):99-107、Gray et al., Hum Gene Ther. 2011;22:1143-1153を参照。
いくつかの例では、特定の種類の細胞又は組織における核酸コード配列の発現を指示する細胞特異的又は組織特異的プロモーターを使用することが望ましい。本開示に基づいて、細胞特異的又は組織特異的プロモーターは、眼細胞、眼組織、又はリンパ球に特異的であってもよいことが理解されよう。眼細胞の種類としては、網膜細胞、網膜双極細胞、光受容体細胞、桿体細胞及び錐体細胞、神経節細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、脈絡膜細胞、又は角膜上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本明細書に記載される細胞特異的プロモーターは、網膜特異的プロモーター（例えば、ＲＰＥ特異的、光受容体特異的（例えば、錐体特異的及び／又は桿体特異的）及び／又は脈絡膜特異的）又は角膜特異的プロモーターであってもよい。例示的な眼細胞特異的プロモーターとしては、限定されるものではないが、ロドプシンキナーゼ１（ＧＲＫ１）としても知られるヒトＧタンパク質共役型受容体タンパク質キナーゼ１プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３２７５８０）、ＧＲＫ１プロモーターの２９２ｎｔ断片（１７９３位−２０８７位）（Beltran et al., Gene Therapy 17:1162-74, 2010を参照）、ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質近位（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｘｉｍａｌ（ＩＲＢＰ））プロモーター、ｈＩＲＢＰプロモーターの２３５ｎｔ断片、ＲＰＧＲ近位プロモーター、赤オプシンプロモーター、赤緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、マウスオプシンプロモーター（長型及び短型の両方、Le et al., Molecular Vision 2006;12:389-398、Beltran et al., Gene Therapy 17:1 162-74, 2010）、ロドプシン（Ｒｈｏ）プロモーター（Mussolino et al., Gene Therapy, 18:637-45, 2011）、錐体トランスデューシンのαサブユニット（Morrissey et al., BMC Dev, Biol, 11:3, 2011）、βホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター、網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター（Nicord et al., J. Gene Vied. 9:1015-23, 2007）、ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（Lambard et al., PLoS One, 5:el3025, 2010）、ＲＰＥ６５プロモーター（Li et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, December 2002, Vol.43, 3640）、網膜変性スロー／ペリフェリン２（Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈＺ）プロモーター（Cai et al., Exp Eye Res, 91:186-94, 2010）、ＶＭＤ２プロモーター（ＢＥＳＴ１としても知られる卵黄状黄斑ジストロフィー２、Kachi et al., Human Gene Therapy, 20:31-9, 2009）、ＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２プロモーター（錐体トランスデューシンαプロモーターに融合したｈＩＲＢＰエンハンサー）、網膜変性スロー（ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｌｏｗ（Ｒｄｓ））プロモーター、ｈＰＤＥ６ｂプロモーター、又はＶＥｃａｄプロモーター（ＶＥ−カドヘリン／カドヘリン５（ＣＤＨ５）／ＣＤ１４４プロモーター）が含まれる。本明細書で提示される理論的根拠及び議論に基づいて、本明細書で提供される例示的なプロモーターのいずれかの代わりに、又はそれに加えて、当技術分野で他のプロモーターを使用できることは理解されるであろう。
例示的な誘導性プロモーターとしては、限定されないが、カルシウム感受性プロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター、Gene Ther. 2013 Mar;20(3):248-54を参照）、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＸ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６誘導系、ラパマイシン誘導系、多数の市販の誘導性プロモーター、及び特定の生理学的状態（例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、又は複製中の細胞のみ）によって制御される誘導性プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記誘導性プロモーターは、特定の眼細胞型に厳密に制御され、特異的である。
プロモーターは、別のプロモーター及び／又は別の制御配列のハイブリッド、切断／短縮型若しくは改変型バージョンであるか、別のプロモーター及び／又は別の制御配列由来のものであってもよい。例えば、ＣＡＧプロモーターはＣＭＶ最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）エンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、及びウサギβグロビン遺伝子のハイブリッドであり、ｓｍＣＢＡプロモーターはＣＢＡプロモーターの切断型である。プロモーターは、他の要素、例えばイントロン、エクソン及び／又はエンハンサー、例えばＣＡＧプロモーターを含んでいてもよい。発現カセットで複数のプロモーターを一緒に使用してもよい。
いくつかの例では、プロモーターにより生じる発現よりも発現を増加及び／又は安定化するためにエンハンサー配列を使用することが望ましい場合がある。代表的なエンハンサー配列としては、限定されるものではないが、転写後制御因子（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥとしても知られる）、又はＢ型肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＨＰＲＥ又はＨＢＶＰＲＥとしても知られる、Donello et al., J Virol. 1998 Jun;72(6):5085-92、Sun et al., DNA Cell Biol. 2009 May;28(5):233-240）、又は様々な短縮、変異体、若しくは改変型ＷＰＲＥ、例えば、ＷＰＲＥの最小γ及びα要素を含む約２４７ｂｐまでの短縮型ＷＰＲＥ（Choi et al., Mol Brain. 2014;7:17、Donello et al., J Virol. 1998 Jun;72(6):5085-5092、Zanta-Boussif et al., Gene Therapy (2009)16, 605-619）、又は１ＲＢＰエンハンサー（Nicord et al., J. Gene Vied. 9:1015-23, 2007）、構成的輸送要素（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＴＥ））エンハンサー（例えば、Ｍａｓｏｎ−ＰｆｉｚｅｒサルウイルスＣＴＥ又は鳥白血病ウイルスＣＴＥ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）エンハンサー、免疫グロブリン遺伝子又はＳＶ４０エンハンサーに由来するもの、又はマウス近位プロモーターで同定されたシス作用性要素、イントロン制御配列（例えば、ＳＶ−４０に由来するＳＤ−ＳＡと称されるミニイントロンスプライスドナー／スプライスアクセプター）、単一の遺伝子転写物から複数のポリペプチドを生産するために使用できる内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、複数のポリペプチド鎖を含むタンパク質、又は２つの異なるタンパク質；ＲＰＥ、光受容体、及び神経節細胞での導入遺伝子発現をサポートするポリオウイルスの内部リボソーム進入配列であってもよい）が挙げられる。
転写産物のポリアデニル化は、核輸送、翻訳、ｍＲＮＡの安定性にとって重要である。したがって、転写産物ポリアデニル化の効率は、導入遺伝子の発現にとって重要である。代表的なポリＡシグナル配列としては、限定されるものではないが、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリＡ）シグナル、スモールポリＡ、又はヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨポリＡ）が挙げられる。いくつかの例では、ポリＡシグナルの効率を上げるために、上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を使用してもよい（例えば、ＳＶ４０後期２×ＵＳＥ、ＨＩＶ−１ ＵＳＥ（ヒト免疫不全ウイルス１）、ＧＨＶ ＵＳＥ（地リス肝炎ウイルス）、アデノウイルス（Ｌ３）ＵＳＥ（アデノウイルス）、ｈＴＨＧＢ ＵＳＥ（ヒトプロトロンビン）、又はｈＣ２ ＵＳＥ（ヒトＣ２補体遺伝子））（Schambach A, Galla M, Maetzig T, Loew R, Baum C. Improving transcriptional termination of self-inactivating gamma-retroviral and lentiviral vectors. Mol Ther. 2007;15(6):1167-1173）。
プロモーター配列と同様に、発現カセットで使用される他の制御配列は、制御配列のハイブリッド、切断／短縮型、改変型、又はその他の派生バージョンであってもよい。例えば、短縮型ＷＰＲＥ、ＳＶ４０後期２×ＵＳＥ、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡである。本明細書に記載の要素に加えて、発現カセットは、他の制御配列、例えばイントロン、ＵＴＲ、及びリンカー配列を含んでいてもよい。スプライス部位（すなわち、２つのイントロンが隣接するエクソン）が含まれると、発現カセットからのタンパク質の遺伝子発現を増加させるのに有用であることが実証されている。
制御配列又はハイブリッド制御配列が複数のバージョンを有し、複数の名称を有することが一般的であることは、当技術分野で公知である。例えば、様々なプロモーター、エンハンサー、及びポリＡシグナルには多くのバージョンがあり、非限定的な例として、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＷＰＲＥエンハンサー、及びＳＶ４０ポリＡシグナルが挙げられる。ＣＡＧプロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＣＢプロモーター、又はＣＡＧＧＳプロモーターを含むがこれらに限定されない複数の代替名称を有する。また、制御配列を短縮、改変、又は他の配列と組み合わせて、誘導体又はバリアントを作製することもでき、例えば、ＣＡＧ（ＣＢＡ、ＣＢ、又はＣＡＧＧＳとしても知られる）プロモーターは、ＣＭＶ最初期エンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、及びウサギβグロビン遺伝子のハイブリッドであり、ｓｍＣＢＡプロモーターは、切断型ＣＡＧプロモーターであり、ＣＢＳＢプロモーターは短縮型ＣＡＧプロモーターであって、ＣＭＶ最初期エンハンサーの５’末端で約１５２ｂｐ異なるものであることも当技術分野で公知である。さらに、制御配列は別称で称されることもあり、例えば、ＨＰＲＥ又はＷＰＲＥなどの転写後制御エレメントはエンハンサーとも称される。本明細書に記載の制御配列は、そのような制御配列のすべてのバリエーション、誘導体、及び／又はハイブリッドを想定している。制御配列に関して本明細書で提供される任意の例示的な配列は本質的に例示的なものであり、そのような制御配列の定義又は範囲を例示的な配列に示されるものに限定するものではない。
いくつかの実施形態では、目的の発現特異性を達成するために（例えば、オフターゲット導入遺伝子発現の抑制）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）技術を発現カセットの設計に使用してもよい。単に例として、限定されるものではないが、神経節細胞及び網膜細胞における、発現カセットに媒介されるＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の合成を阻害するために、ｍｉＲ１８１（神経節細胞及び網膜内でのみ発現されることが示されているｍｉＲＮＡ）の標的配列をＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡの直下に付加してもよい。同様に、特定の細胞型における、発現カセットに媒介されるＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の発現を抑制して、標的組織又は細胞特異的発現を達成するために、特定の細胞型でのみ発現されるｍｉＲＮＡの標的配列を使用してもよい。
Ｄ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療のための効率的な発現カセット及びデリバリーベクターの設計
ＣＹＰ４Ｖ２発現カセット及び送達ベクターの設計方法及びこれらの研究のための様々な設計に関する詳細な検討は、本明細書の実施例セクションで提示される。
眼疾患の治療におけるＥＦＳプロモーター及び／又はスモールポリＡシグナル（ＳＰＡ）の使用
本明細書で検討されるように、遺伝子送達ベクターにはパッケージングサイズの制限がある。例えば、一本鎖ＡＡＶベクターのパッケージング制限は約４．７〜５．０ｋｂで、これを超えると、形質導入及び発現効率が大幅に低下する。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）の場合、パッケージングの制限は約２．４〜２．５ｋｂへと半減する。したがって、ベクター媒介遺伝子送達及び遺伝子治療にとって、サイズは重要である。二本鎖自己相補的ベクターの場合、導入遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）用に充分なスペースを確保するために、小さなサイズの制御配列を使用することが望ましく、場合によっては重要である。このサイズ制限のため、大きなプロモーターもｓｃＡＡＶでの使用には適していない。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の場合、ｃＤＮＡのサイズが約１５７８ｂｐで、ＡＡＶ ＩＴＲ（変異あり）が約２５８ｂｐであるとすると、制御配列に残されているのは約５００〜６００ｂｐだけである。ＣＹＰ４Ｖ２はほぼ遍在的に発現されるため、いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２導入遺伝子発現を駆動するためには構成的プロモーターを使用することが望ましい。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ設計で使用した約１．７ｋｂの構成的ＣＡＧプロモーター、約９５３ｂｐの短縮型ＣＢＡプロモーター（ｓｍＣＢＡ）、又は約８００ｂｐのＣＢｈプロモーター、又は約６００ｂｐであるＣＭＶプロモーターなど他の多くの構成的プロモーターのためのスペースはない。その代わりに、ｓｃＡＡＶ設計用に短い長さのＥＦＳプロモーターを使用することができる（例示的な配列を配列番号３４に示す）。同様のサイズ制限は、ポリＡシグナルなど他の制御配列にも当てはまる。ｂＧＨポリＡは約２２５ｂｐ、ＳＶ４０ポリＡは約２４０ｂｐ、ＳＶ４０後期ポリＡは約１２０ｂｐである。それらのいずれも、プロモーターを含む制御配列のために残された約５００ｂｐの長さの大部分を占めるだろう。したがって、ｓｃＡＡＶ設計のために、約５４ｂｐ（例示的な配列を配列番号３５に示す）にすぎないスモールポリＡシグナル（ＳＰＡ）が使用された。
ＥＦＳプロモーター及びＳＰＡを使用する設計は約３００ｂｐを占有するにすぎず、ＡＡＶ ＩＴＲとともに合計で約６００ｂｐを占有する。それにより、ｓｃＡＡＶ用に設計される発現カセット内の所望のタンパク質及び他の配列をコードする核酸配列のためには約１．８〜１．９ｋｂの残りのパッケージングスペースが残され、ｓｓＡＡＶ用に設計される発現カセット内の所望のタンパク質及び他の配列をコードする核酸配列のためには約４．１〜４．４ｋｂの残りのパッケージングスペースが残される。その結果、非限定的な例としてＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ｓｍＣＢＡプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ｂＧＨポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、及びＳＶ４０後期ポリＡが挙げられるより大きなプロモーター及びポリＡシグナル配列を使用する場合と比較して、ＥＦＳプロモーター及びＳＰＡを含むｒＡＡＶベクターには、より大きなサイズのｃＤＮＡ及び／又は他の配列をパッケージ化することができる。
ＥＦＳプロモーター及びそのＳＰＡを含む発現カセットの模式図を図４ｂに示す。図７ｂに示すコンストラクトには、ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡが含まれている。ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡは、他の導入遺伝子の発現に使用される発現カセットのために、別の目的遺伝子に置き換えてもよい。
本研究では、核酸コード配列を駆動して眼疾患を治療するための、発現カセット及び送達ベクターでのＥＦＳプロモーター及びＳＰＡの使用について試験を行った。ＥＦＳプロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ、及びＳＰＡを含むｓｃＡＡＶ２／１ベクター（ｓｃＡＡＶ１．ＥＦＳ．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ．ＳＰＡと称される）を作製した。ｓｃＡＡＶ１−ＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＳＰＡを、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞に適用した。ｓｃＡＡＶ１−ＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＳＰＡは、ＥＦＳプロモーター及びＳＰＡの長さが短いにもかかわらず、わずか４日間でＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞で高速かつロバストな作用を示した（表３を参照）。これは、ＥＦＳプロモーター及び／又はＳＰＡが、眼の遺伝子治療のためのｓｃＡＡＶシステムで非常に有用な小さなサイズの制御配列であることを示している。さらに、ｓｃＡＡＶベクターのロバストな発現により、ｓｃＡＡＶ設計が、網膜下送達に加えて他の投与経路（例えば、硝子体内送達）にも適したものになる。
ＥＦＳプロモーター及び／又はＳＰＡの使用は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療又はｓｃＡＡＶコンストラクトでの使用に限定されない。導入遺伝子のサイズ及び／又はｓｃＡＡＶの設計において、高速で充分なタンパク質発現を行うためには短い長さのプロモーター及びポリＡシグナルを使用する必要がある、他の遺伝子に関係する遺伝子治療に使用することができる。
Ｅ．治療オプション、対象の選択及び投与
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療は、様々な方法で適用することができる。いくつかの例では、治療は、ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットを含む送達ベクターを、治療の標的となる対象の細胞、組織又は臓器（例えば、ＲＰＥ、光受容体、脈絡膜、角膜、リンパ球、網膜、又は眼）へ効果的に送達することにより、インビボで対象（例えば、ＢＣＤ患者）に適用してもよい。いくつかの例では、治療は、標的細胞（例えば、患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、患者のｉＰＳ−光受容体細胞、ｉＰＳ−光受容体前駆細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ、リンパ球）にインビトロで適用してもよい。次に、治療した細胞を、必要としている対象（例えば、ＢＣＤ患者）に移植してもよい。いくつかの例では、治療は、インビボ及びインビトロの両方のアプローチを組み合わせて適用してもよい。いくつかの例では、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療は単独で使用してもよい。いくつかの例では、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療は、別の治療オプションとともに使用してもよい。
本治療方法の候補となる対象としては、ＢＣＤと診断された対象が挙げられる。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異によって引き起こされる臨床的に定義される他の眼科的状態（例えば、遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、又は角膜ジストロフィー）を患っている対象も、本明細書に記載の方法を使用して治療することができる。ＢＣＤ、ＩＲＤ、ＲＰ、角膜ジストロフィー、又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異によって引き起こされる別の眼科的状態の診断は、当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。本明細書に記載の方法には、対象を特定すること（例えば、ＢＣＤ若しくはＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異によって引き起こされる別の眼科的状態を有する、又はＢＣＤ若しくはＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異によって引き起こされる別の眼科的状態を有する疑いがある（例えば、状態の症状の存在に基づいており、他の明白な原因がない）、子供、青年、又は成人など）、及び対象からゲノムＤＮＡを含む試料を取得し、公知の分子生物学的方法を使用してＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異の存在を検出すること、が含まれてもよい。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子には、ＢＣＤを引き起こす多数の変異が確認されており、遺伝子の１１個のエクソンのそれぞれに少なくとも１つの変異が確認されている。ＢＣＤ患者の中で最も一般的なＣＹＰ４Ｖ２変異は、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のイントロン６の終端から８塩基で始まる場所における、１７塩基の欠失と２塩基（ＧＣ）の挿入を指し、ＩＶＳ６−８ ｄｅｌ／ｉｎｓＧＣとも称される。この挿入−欠失変異はイントロン６−エクソン７接合部にあり、１７ｂｐの欠失にはエクソン７スプライス−アクセプター部位が含まれ、エクソン７をコードする６２アミノ酸のインフレーム欠失が生じる）であり、結果的にエクソン７の欠失が生じるものであることが遺伝子型分析により示されている。（Xiao et al., Biochem Biophys Res Commun. 409:181-6, 2011、Meng et al., 2014, Mol. Vis., 20:1806-14、Wada et al., Am J Ophthalmol. 139:894-9, 2005、Jiao et al., European Journal of Human Genetics (2017)25, 461-471）。非限定的な例としてミスセンス、スプライス部位、フレームシフト、欠失、挿入、インデル（挿入欠失）、ナンセンス、多型（例えば、一塩基多型）、及び早期終結などが挙げられる、ＢＣＤに関連する様々な種類のＣＹＰ４Ｖ２変異が発見された。ヒトＢＣＤ患者の間で選択されたＣＹＰ４Ｖ２変異の概要を、表１に示しており、これらは様々な出版物やオンラインデータベース、例えばＬＯＶＤ（databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2、World Wide Web）、ＯＭＩＭ （omim.org/allelicVariant/608614、World Wide Web）、及びＣｌｉｎＶａｒ（ｎcbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=608614[MIM]、World Wide Weｂ）で確認できる。
表１のヒトＣＹＰ４Ｖ２変異は網羅的ではないことに留意されたい。将来、より多くのＣＹＰ４Ｖ２変異が同定される可能性がある。参照配列に対するすべての変化が変異であるとは限らないことが理解されよう。いくつかの変化は非病的である。遺伝的変化が病的、すなわち変異であるかどうかを確認する方法は当技術分野で公知であり、非限定的な例として、以前に臨床的に同定された公知の変異と当該変異とを比較すること、及び／又は、対応する機能の変化が存在するかどうかを決定することが挙げられる。例えば、遺伝的変化が病的変化（すなわち、変異）であるかどうかを確認する方法の１つとして、本明細書に記載のように対象由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系の生化学的機能を試験し、健康な対照のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系のものと比較して、異常があるかどうかを評価することが挙げられる。
本明細書に記載の方法を使用して治療できるＢＣＤ又はＣＹＰ４Ｖ２変異による別の眼科的状態の患者は、ある程度の光受容体及び視覚機能（例えば、視力、視野、視覚機能、及び／又は光干渉断層法（ＯＣＴ、例えば、スペクトラルドメイン（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ）−ＯＣＴ（ＳＤ−ＯＣＴ））により測定される）を維持していることが好ましい。
投与前に、最終製品は臨床グレードの基準を満たすために一連の工程（例えば、超精製）を経る。臨床グレードの製品は、非限定的な例としてＮＩＨ遺伝子治療リソースプログラム（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＧＴＲＰ））及び契約製造機関（ＣＭＯ）の施設が挙げられる様々なＧＭＰ施設を通じて商業的に入手可能である。
投与の前に、対象は、対象が投与を受けるＡＡＶベクター型に対する既存の中和抗体（ＮＡｂ）について試験されてもよい。一実施形態では、対象がそのようなＡＡＶ型に対して既にＮＡｂを持っている場合、免疫反応を低下させ、ＡＡＶベクターによる充分な形質導入効率を維持するために、対象の既存のＮＡｂとの交差反応性が低い代替のＡＡＶベクター、又は改変されたカプシド構造を備えたＡＡＶベクターを、かかる対象への投与に使用してもよい。免疫応答を最小化する他の方法は当技術分野で公知であり、非限定的な例として、治療前、治療中及び／又は治療後に免疫抑制剤及び免疫抑制プロトコルを適用することが挙げられる。
ウイルス若しくは非ウイルスベクター、又はそれらの組み合わせ（例えば、ハイブリッドベクター）を、１又は複数の物理的手段を使用して対象の眼細胞に送達することができる。本明細書で使用する眼細胞としては、限定されず、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞、角膜上皮細胞、網膜細胞、網膜双極細胞、桿体細胞、錐体細胞、神経節細胞、脈絡膜細胞及び／又は水晶体細胞が挙げられる。加えて、又は代わりに、標的細胞の近く、近くの細胞、又は標的細胞と接触可能な細胞にベクターを送達してもよく、非限定的な例として、脳細胞、視神経細胞、又は血液細胞が挙げられる。
インビトロでの治療では、治療の標的となる細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）にベクターを効果的に送達する任意の方法又は方法及び／又は薬剤の組み合わせを使用することができる。インビトロでの治療は、１回又は複数回の感染を介して行うことができる。いくつかの例では、ベクターを培養細胞に直接適用して、細胞をトランスフェクト又は形質導入する。いくつかの例では、細胞における送達及び／又はトランスフェクション／形質導入効率を高める他の方法を使用することができ、非限定的な例として、複数回のトランスフェクション／形質導入、エレクトロポレーション、マグネトフェクション、又はソノポレーションが挙げられる。ベクター又は発現カセットで細胞を感染／トランスフェクトする際に使用される方法及び薬剤は当技術分野で公知であり、非限定的な例として、本明細書の実施例セクションに記載されるものが挙げられる。
インビトロで治療された細胞はその後対象の目に移植してもよい。例えば、ＢＣＤ患者の遺伝的に修復されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は、網膜下注射によって患者に移植できる。眼への細胞移植に使用される方法、薬剤、及びデバイスは、当技術分野で公知である。例えば、Wert et al., J Vis Exp. 2012;(69):4286、WO 2016/179496、Schwartz et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science April 2016, Vol.57, ORSFc1-ORSFc9を参照。
インビボの治療の場合、ベクター及び／又は発現カセットは、（例えば、治療の標的細胞への送達のために治療を必要とする対象の眼への投与を通じて）インビボでの治療の標的細胞に送達することができる。インビボでの標的眼細胞に対する核酸分子、発現カセット、ベクターの送達方法は当技術分野で公知である。例えば、眼への投与では、治療の標的となる細胞に応じて、網膜、網膜下腔、脈絡膜、又は一般的に眼の後部、角膜、水晶体、若しくは硝子体にベクターを効果的に送達する任意の方法（若しくは方法及び／又は薬剤の組み合わせ）を使用することができる。投与は、非限定的な例として注射（例えば、網膜下注射、硝子体内注射、直接網膜注射、眼の後方脈絡膜上腔への直接注射）、点眼などが挙げられる任意の適切な手段により行うことができ、他の送達手法と組み合わせて適用してもよい（例えば、角膜上皮への電動式送達）。ＣＹＰ４Ｖ２核酸、発現カセット、及び／又は送達ベクターは、例えばＤＮＡ粒子衝突（例えば、遺伝子銃による）、流体力学的遺伝子導入、点眼、エレクトロポレーション、マグネトフェクション、又はソノポレーションを用いて細胞に導入してもよい。眼への投与及び送達方法並びに手法は、当技術分野で公知である。単に例として、これに限定されるものではないが、例えば、Wert et al., J Vis Exp. 2012;(69):4286、国際公開２０１６／１７９４９６号、Mohan et al., Prog Retin Eye Res. 2012 Jan;31(1):43-64を参照。
網膜下注射を用いたＲＰＥ細胞への従来の送達に加えて、本明細書で検討される方法の１つの態様としては、眼疾患の治療又は予防のための核酸分子（例えば、非変異ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列を有する）の硝子体内送達が挙げられる。いくつかのベクター（例えば、ＡＡＶ２（Ｙ−Ｆを４つ（ｑｕａｄＹ−Ｆ）＋Ｔ−Ｖ）及びＡＡＶ ７ｍ８など）は、硝子体内投与による網膜への効率的な形質導入に特に有用である。加えて、ＡＡＶ又は他のウイルスベクターは、例えば、「定向進化法」及び「合理的設計法」を含む当技術分野で公知の技術によって改変して、従来の網膜下注射以外による１又は複数の細胞型又は組織への遺伝子送達（例えば、硝子体内注射）用ベクターとしての適合性を改善又は最適化することができる。ｓｃＡＡＶベクターは、迅速かつロバストな発現プロファイルを有するため、網膜下送達の他に硝子体内送達にも使用することができる。ＣＹＰ４Ｖ２はほぼ遍在的に分布しつつ網膜に特に高い発現を示すため、ＣＹＰ４Ｖ２の遺伝的及びエピジェネティックな改変は、１又は複数のベクターの硝子体内投与による修復に特に適している。現在の遺伝子治療法は、一般にベクターの網膜下投与を必要とする。よって、本開示の材料及び方法により達成される技術的進歩の１つは、ＣＹＰ４Ｖ２の核酸配列の遺伝的又はエピジェネティックな変化に関連する眼の疾患を治療及び予防するための、核酸配列（例えば、野生型若しくは非変異体核酸配列、又は遺伝子編集ポリペプチドをコードする核酸配列）及び／又はポリペプチドの硝子体内送達である。
いくつかの技術及び薬剤を使用して、投与又は送達プロセスを促進してもよい。非限定的な例として、送達媒体（例えば、針）へのベクターの付着が回避されるような潤滑剤の使用が挙げられる。さらに、投与又は送達のプロセス前、プロセス中及び／又はプロセス後に免疫抑制剤を使用すると、感染又は形質導入の効率を高めることができる。
ベクターは、様々な医薬的及び／又は生理学的に許容される賦形剤、希釈剤、及び／又は担体を使用して、対象の眼細胞への送達用に製剤化することができる。眼への投与に適した賦形剤、希釈剤、及び／又は担体（医薬的に許容される担体とも称される）の例には、無菌のパイロジェンフリーの水、及び無菌のパイロジェンフリーの緩衝生理食塩水（例えば、適切な生理学的レベルのｐＨを維持するためにリン酸塩又はＨＥＰＥＳなどの他の緩衝液で緩衝された生理食塩水）、等張性塩化ナトリウム溶液、平衡塩類溶液、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、及びさまざまな種類の湿潤剤が挙げられる。いくつかの例では、前記製剤は、他の薬剤（ｍｅｄｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ）、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ）、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、及び希釈剤を含んでいてもよい。いくつかの例では、前記製剤は、長期保存のためにＤＢＰＳ、グリセロール、又はＴｗｅｅｎ２０を含んでいてもよい。
最も効果的な投与手段及び治療上有効な投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、ベクター、そのカプシド構造、ベクターデザイン（例えば、ｓｓＡＡＶ ｖｓ． ｓｃＡＡＶ）、発現カセットの組成、ベクターの発現レベル、プロモーター、他の制御配列又は核酸分子、ベクター力価、標的細胞型、標的発現レベル、標的とする面積又は細胞の数、及び治療対象（例えば、治療対象の年齢、性別、体重、疾患進行度及び状態、並びに潜在的な免疫反応）、投与経路、治療の標的となる細胞の位置（例えば、網膜 ｖｓ． 角膜）、野生型の細胞及び／又は組織における関連遺伝子の性質及び発現レベル、及び必要なレジメンによっても変わり得る。治療有効用量は、疾患モデル（例えば、ＢＣＤ細胞モデル（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系））又は動物モデルで決定及び評価し、臨床試験で確認又は改良することができる。インビトロでの細胞の治療では、投与量は通常ＭＯＩとして表され、その後、治療される細胞の数をＭＯＩに乗じる。ＭＯＩは通常、細胞あたり約１×１０３ＧＣから約１×１０６ＧＣの範囲内であるか、又は細胞あたり約１００〜約１０，０００ＧＣの感染性ＭＯＩ（ＧＣ：ゲノムコピー、ゲノムを含むＡＡＶ粒子の測定（ベクターゲノム（ｖｇ）又はゲノム粒子（ｇｐ）としても知られる）である。インビボ治療の場合、上記の要因に加えて、実際の投与量は、投与中の各患者に固有の個々の状況（例えば、以下で説明する先天性脈絡膜欠如の症例の患者６の網膜下投与中の投与量の減少など）によっても影響を受ける可能性がある。よって、インビボでの１回の投与の治療上有効な用量は、約１×１０６〜２×１０１３ＧＣのオーダー（例えば、約１×１０１１ＧＣ〜約１×１０１２ＧＣの高用量範囲、約１×１０１０ＧＣ〜約１×１０１１ＧＣの中用量範囲、約１×１０９ＧＣ〜約１×１０１０ＧＣの低用量範囲、約１×１０６ＧＣ〜約１×１０９ＧＣの超低用量範囲、及び約１×１０１２ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣの超高用量範囲）で、又はこれらの範囲内の用量であってかつ所望の効果を提供するのに充分な任意の用量であってよい。一実施形態では、前記組成物は、約１×１０６〜約２×１０１３ＧＣの用量で投与される。別の実施形態では、インビボ投与量は、治療の標的となる細胞数に標的ＭＯＩを乗じて決定される（例えば、細胞あたり１×１０３ＧＣ〜約１×１０６ＧＣ）。眼への任意の１回の投与におけるｒＡＡＶベクターを含む薬剤の体積は、約１μＬ（０．００１ｍＬ）〜約１０００μＬ（１ｍＬ）の範囲内であり得る。
本明細書に記載の組成物は、単回投与用として製剤化しても複数回投与用として製剤化してもよい。同様に、投与は１回であっても複数回（例えば、数週間、数ヶ月、又は数年にわたって）であってもよく、同一の眼に適用しても反対側の眼に適用してもよい。複数回の投与の場合、同一の又は異なるＡＡＶ血清型、及び／又は同一の又は異なる投与経路を検討することができる。異なる組織及び細胞の治療に投与を適用（例えば、ＲＰＥを標的として１回投与し、角膜を標的としてさらに投与）することもできる。
遺伝子治療（眼遺伝子治療など）で使用するためのウイルスベクターの作製、ＧＭＰの産生、精製、製剤化及び投与の方法は、当業者に公知であり、ウイルスベクターの調製方法は、以下のＬＣＡ−２の様々なグループの遺伝子治療研究で実証されているように、多数の企業及び方法のうち任意のものによって実施することができる。本明細書で提供される発現カセットは、以下に列挙される例示的なウイルスベクターのいずれに挿入してもよい。または、以下に示す例に基づいてウイルスベクターを作製してもよい。Bainbridge et al., 2008. N Engl J Med. 358:2231-9、Maguire et al., 2008. N Engl J Med. 358:2240-8、Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008 Oct;19(10):979-990を参照。
例えば、Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅの研究では、血清型２の組換えアデノ随伴ウイルスベクターであるｔｇＡＡＧ７６ベクターが遺伝子送達に使用された。前記ベクターには、他の箇所で説明したように、ヒトＲＰＥ６５プロモーターによって駆動され、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位によって終結するヒトＲＰＥ６５コード配列が含まれる。前記ベクターは、Ｂ５０パッケージング細胞系、ｔｇＡＡＧ７６ベクターゲノムを含むアデノウイルス−アデノ随伴ウイルスハイブリッドシャトルベクター、及びアデノウイルス５ヘルパーウイルスを使用して、ＧＭＰ（適正製造基準）ガイドラインに従ってＴａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって生産された。前記ベクターは、１×１０１１ベクター粒子／ｍＬの力価で緩衝生理食塩水に満たし、１ｍＬのアリコートで−７０℃で凍結された。
Ｍａｇｕｉｒｅは、ＬＣＡ２のイヌモデルでＡＡＶ２．ＲＰＥ６５の単回網膜下注射後に視覚機能の長期的かつ持続的な（＞７．５年、観察継続中）回復をもたらすことが実証されているＲＰＥ６５ ｃＤＮＡを含む複製欠損ＡＡＶベクターである、組換えＡＡＶ２．ｈＲＰＥ６５ｖ２ウイルスベクターを使用した。ＡＡＶ２．ＲＰＥ６５の作製に使用されるシスプラスミドには、カナマイシン耐性遺伝子が含まれている。このウイルスはＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによってＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクション後に製造され、微小溶液操作、ろ過、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、密度勾配超遠心分離、及びＰＢＳ内での透析ろ過によって単離及び精製された。この組み合わせにより、空のカプシドと残留塩化セシウムが効率的に除去されるなど、ＡＡＶベクター生成物の最適な純度を得ることができる。生成物の一部にＰＦ６８ ＮＦプリルポロキサマー１８８（ＰＦ６８、ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）を添加して、製品接触面に対するベクターのその後の損失を防止した。精製されたウイルスは、ＰＦ６８を使用したものも使用していないものも、滅菌６０ｍＬシリンジ及びシリンジフィルターを使用して０．２２μｍフィルターを通過させ、使用時まで滅菌チューブ内で凍結保存（−８０℃）した。プルロニックＦ−６８ ＮＦプリルポロキサマー１８８を添加した１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水中のＡＡＶ２．ｈＲＰＥ６５ｖ２の１．５×１０１０ベクターゲノムの注入が、網膜下腔投与として行われた。
Ｈａｕｓｗｉｒｔｈが使用したウイルスベクターは、ヒトＲＰＥ６５遺伝子を担持するように改変された組換えアデノ随伴ウイルス血清型２（ｒＡＡＶ２）ベクター（ｒＡＡＶ２−ＣＢＳＢ−ｈＲＰＥ６５）であり、ＲＰＥ６５欠乏症の動物モデルで視力を回復することが以前に実証されていた。ＲＰＥ６５−ＬＣＡウイルスベクターは、網膜下注射により送達された（１５０μＬで５．９６×１０１０ベクターゲノム）。
治療薬（例えば、タンパク質、核酸分子、発現カセット、遺伝子治療ベクター、細胞）の、非限定的な例として眼への、投与の方法及びプロトコル、並びに他の手順及びプロトコル（非限定的な例として免疫試験、眼科検査、及び免疫抑制剤）は当技術分野で公知である。例えば、以下は、ＭａｃＬａｒｅｎが先天性脈絡膜欠如の治療に使用したＡＡＶベクターの網膜下注射の例である。緩衝塩類溶液（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国テキサス州フォートワース）を用いて、４１Ｇテフロンカニューレ（ＤＯＲＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢＶ、ザイドラント、オランダ）を用いて網膜を剥離する手術が最初に行われた。網膜の標的領域が下層の網膜色素上皮から剥離されると、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１の１×１０１０ゲノム粒子を含む固定容量（０．１ｍＬ）が、最初の５人の患者において作製された網膜下腔に新しいシリンジを介して注入された。患者６では、減量された最大６×１０９個のゲノム粒子が注入された。ベクターは同じ網膜切開を介してゆっくりと注入され、剥離をさらに拡大させた。手術は最初の５人の患者では合併症はなかったが、患者６では、網膜の末梢黄斑からの剥離が困難であったため、中心窩に近い点から剥離を誘発する必要があり、乳頭黄斑束の明らかな伸展が生じた。視力６／７・５の患者のこの重要な構造の伸展関連の損傷に関する懸念のため、２番目の工程ではより少量のベクター（最大０．０６ｍＬ）が注入された。全ての患者で、注射器に残っている余剰のベクターは、カニューレを通してポリプロピレンバイアルに排出され、その後凍結された。この余剰ベクターは、ヒト由来のＨＴ１０８０細胞系の形質導入後、ウェスタンブロットで効力について後で試験された。患者は、１０日間のプレドニゾロンの経口投与のコースで治療された。これは、１ｍｇ／ｋｇ（７０〜１００ｍｇ）で７日間、手術の２日前から開始され、その後、４０ｍｇで１日、２０ｍｇで１日、及び１０ｍｇで１日へと減量された。手術前、術後１週間、及び術後５〜６週間の時点で免疫学的検査のために血液試料が採取された。MacLaren et al., Lancet. 2014 March 29;383(9923):1129-1137を参照。
Ｈａｕｓｗｉｒｔｈの研究では、投与は以下のように行われた。軽度の静脈内鎮静後、手術を行う眼に球後麻酔を施し、標準的な滅菌方法で準備し、ドレープをかけた。標準の３ポート２３ゲージの中心部及び末梢硝子体切除術を実施した。右側の強膜切開上の結膜は、Ｗｅｓｔｃｏｔｔハサミ及び０．３鉗子で切断された。止血は、イレーサー（ｅｒａｓｅｒ）付き焼灼器によって維持された。網膜下カニューレを簡単に眼に挿入できるように、２０ゲージＭＶＲブレードで強膜切開を拡大した。ベクターを３９ゲージの注入カニューレ（Ｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、ミネソタ州オファロン）に引き込み、網膜下腔に導入した。手順の最後に、強膜切開部位を７．０バイクリル（Ｖｉｃｒｙｌ）縫合糸で固定し、結膜を断続縫合で閉じた。結膜下に抗生物質及びステロイドを投与した。手術後２０日間、局所の抗生物質とステロイドを使用した。Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008 Oct;19(10):979-990を参照。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療のインビトロ治療では、治療後の評価において、患者の細胞の細胞形態及び／又は生化学的機能障害を比較してもよい。例えば、細胞の形態及び／又は生化学的機能が治療後に改善したかどうかを評価するために、治療前及び治療後の、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞（又は該当する場合はｉＰＳ−ＰＲＣ又はｉＰＳ−ＣＥＣ細胞）において異常が示された化合物のレベルを比較してもよい。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療のインビボ治療では、治療後の評価において、網膜及び角膜の疾患に関する当技術分野で公知の眼及び網膜検査（及び該当する場合は角膜検査）を使用してもよい。その非限定的な例として、暗順応、コントラスト感度、視野検査、視力検査、色覚検査、ＥＲＧ、ＯＣＴ、眼底イメージング、角膜検査、可動性などの機能検査などが挙げられる。有効性は、視力の改善、疾患の進行停止、又は網膜変性若しくは視力喪失の進行が予想より遅いこと、のいずれかによって検証することができる。
ウイルスベクター媒介遺伝子治療の１つの課題は、遺伝子治療を受けている対象の免疫応答である。対象に従来関連していたリスクに加えて、免疫応答は、ウイルスベクターの形質導入効率を大幅に低下させる、及び／又は長期の導入遺伝子の発現を確立し難くする可能性がある。Mingozzi F, Meulenberg JJ, Hui DJ, Basner-Tschakarjan E, Hasbrouck NC, Edmonson SA, Hutnick NA, Betts MR, Kastelein JJ, Stroes ES, High KA, AAV-1-mediated gene transfer to skeletal muscle in humans results in dose-dependent activation of capsid-specific T cells. Blood. 2009 Sep 3;114(10):2077-86。
おそらく、眼の固有な免疫学的環境のために、眼の遺伝子治療における様々な組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス）の免疫学的効果はかなり良性であるようである。それにもかかわらず、アデノウイルスの眼内投与後に、重要な細胞性免疫応答が発生する可能性がある。しかし、ＡＡＶもレンチウイルスも、細胞媒介性反応を誘発しないため、慢性的な眼の（網膜の）疾患の治療のための有望なベクターである。J Bennett, Immune response following intraocular delivery of recombinant viral vectors, Gene Therapy (2003)10, 977-982. doi:10.1038/sj.gt.3302030。しかし一方で、以前の研究では、ＡＡＶベクターの硝子体内投与により、非ヒト霊長類の硝子体液及び血清のいずれにおいても抗ＡＡＶ抗体レベルが増加することが示された。さらに、サルの血清における既存の中和抗体力価の存在は、ＡＡＶの硝子体内投与後の弱い導入遺伝子発現、減衰した導入遺伝子発現、又は導入遺伝子の無発現と強く相関した。Kotterman et al., Antibody Neutralization Poses a Barrier to Intravitreal Adeno-Associated Viral Vector Gene Delivery to Non-Human Primates, Gene Ther. 2015 February;22(2):116-126。したがって、眼遺伝子治療の免疫応答、特に中和抗体（ＮＡｂｓ）の免疫応答を低下させて、所望の形質導入効率及び／又は長期の導入遺伝子発現を維持することが望ましい。
歴史的に、遺伝子治療分野の企業の一般的な慣行として、１つの血清型のＡＡＶベクターを使用していた。通常、動物研究及び／又は他の遺伝子治療の臨床試験において、良好な形質導入効率及び大量の安全性データを備えたベクター型を使用する。例えば、ＡＡＶ２は、臨床試験で眼の遺伝子治療に最も一般的に使用されるＡＡＶ血清型である。しかし、免疫系、例えば、既存の抗ＡＡＶ抗体における個人差により、ある患者にとって最適な血清型が別の患者にとって常に最適とは限らない。例えば、特定のＡＡＶ血清型に対する既存の抗ＡＡＶ中和抗体の普及は、国や集団によって異なる。さらに、免疫反応は形質導入効率を著しく低下させる可能性があり、適用される遺伝子治療の有効性を低下させたり、より高用量の投与を必要とさせたりする可能性がある。
本明細書では、ウイルスベクター媒介遺伝子治療において、ウイルスベクターに対する免疫応答を低下させて形質導入効率を維持し、ウイルスベクター及び／又は免疫抑制剤の用量を低下させ、及び／又は同じ遺伝疾患の様々な患者に対する治療効果を最大化する方法であって、
（ａ）前記遺伝子治療のための標的細胞型において充分な形質導入効率を持つ複数の組換えウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）のプールを確立することであって、
前記ウイルスベクターのプールは、抗原領域変異若しくは他の変異を有するバリアント又は前記ウイルスベクターのカプシドのバリアントを、前記疾患に関連する標的細胞（例えば、ＢＣＤに対するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療におけるｉＰＳ−ＲＰＥ又はＲＰＥ細胞系）において上記変異又はバリアントが充分な形質導入効率を有することが確認された後で作製することにより、拡大することができる、
前記確立すること；
（ｂ）遺伝子治療を必要とする対象における様々なウイルスベクター血清型及び／又はカプシド変異又はバリアントに対する既存の中和抗ウイルスベクター抗体（ＮＡｂ）を検出し、及び／又は上記対象に由来する患者特異的疾患標的細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）において様々なウイルスベクターを試験及び比較すること。
（ｃ）前記ウイルスベクターのプールから、
（ｉ）前記疾患標的細胞における充分な形質導入効率、
（ｉｉ）前記対象の既存のＮＡｂとの低い交差反応性、及び／又は
（ｉｉｉ）前記対象の患者特異的疾患標的細胞（例えば、ＢＣＤのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療における患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ又はＲＰＥ細胞系）における良好な表現型レスキュー結果、
を有するウイルスベクターを選択することであって、
上記ウイルスベクターのプールは、様々な血清型及び／又はカプシド改変ウイルスベクター（例えば、カプシド変異体ＡＡＶ及び／又はカプシドタンパク質バリアントＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない）を含む、
前記選択すること；
（ｄ）（ｃ）から選択された前記ウイルスベクターを前記対象への投与に使用すること；及び
（ｅ）前記対象が遺伝子治療の投与を必要とするたびに、上記（ｂ）〜（ｄ）（既存のＮＡｂに関連する部分のみ）を繰り返すこと（例えば、限定されるものではないが、同じ臓器（例えば、眼又は反対側の眼）又は別の臓器へのフォローアップ投与）、
を含む、方法が提供される。
この方法の潜在的な利点としては、免疫抑制剤の使用量の低減、ｒＡＡＶベクターの用量の低減、より高い形質導入効率、及びより長期の導入遺伝子発現、及び／又はより高い割合の患者が遺伝子治療に適格となることが挙げられる。
この方法は、他のウイルスベクターと関連させて使用してもよいことが理解されよう。さらに、この方法は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子又は別の遺伝子に関係しているか否かに関わらず、あらゆる種類の眼遺伝子治療及び非眼遺伝子治療で使用することができる。
既存の抗ＡＡＶ抗体を検出する方法は、当技術分野で公知である。抗ＡＡＶ抗体には、中和抗体と非中和抗体の両方が含まれることは留意するべきである。既存の抗ＡＡＶ中和抗体及びＡＡＶに対する他の免疫応答を検出する方法は、当技術分野で公知である。Melvin Y Rincon et al., JMIR Res Protoc. 2016 Apr-Jun;5(2):e102、Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008 Oct;19(10):979-990。効果は中和抗体で最も顕著であるが、非中和抗体であっても免疫系によるベクターのクリアランスを引き起こす可能性がある。非中和抗体はＥＬＩＳＡで検出することができる。Boutin S, Monteilhet V, Veron P, Leborgne C, Benveniste O, Montus MF, Masurier C, Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV)types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population:implications for gene therapy using AAV vectors. Hum Gene Ther. 2010 Jun;21(6):704-12。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、物の方法及び組成が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で提供される用語の定義に加えて、分子生物学における一般的な用語の定義は、
Glossary of Genetics:Classical and Molecular, Rieger et al., 1991, 5th Ed, Springer-Verlag、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds., 1998 Supplement, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.、Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino et al., Eds., 1999 Supplement, John Wiley & Sons, Inc.、及び、Current Protocols in Neuroscience, Crawley et al., Eds., 1999 Supplement, John Wiley & Sons, Incにおいて確認できる。
代表的な方法及び材料を本明細書に記載する。当技術分野で公知の他の適切な方法及び材料も使用することができる。当該方法及び材料は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらは本発明の範囲も特許請求の範囲も限定するものではない。
本研究は、希少な網膜疾患を患う患者とその家族によって設立され、主導されているバイオテクノロジー企業であるＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（「ＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎＢｉｏ」）によって開始、設計、組織、及び出資された。希少疾患患者は、人類の遺伝的変異の避けられない確率を背負っているが、多くの場合、社会から無視され、公共のリソースにより十分支援されていない。患者主導のバイオテクノロジー企業として、ＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎＢｉｏは、患者が力を合わせ、希少疾患やその他の困難な疾患の科学的及び医学的研究開発を推進するためにより積極的な役割を果たすために、「患者による、患者のための」アプローチを適用している。
ＢＣＤと診断され、様々な両アレルのＣＹＰ４Ｖ２変異（ホモ接合ＣＹＰ４Ｖ２変異又は複合ヘテロ接合ＣＹＰ４Ｖ２変異など）を有する患者がこの研究に参加した。特に、１人の患者（本明細書では患者１、Ｐ１、又はＲＢ００１と称する）は、ホモ接合ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有する。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異は、６２アミノ酸をコードするエクソン７のインフレーム欠失をもたらす。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異は、ＢＣＤ患者の中で最も一般的な変異である。患者２（Ｐ２又はＲＢ００２）は複合ヘテロ接合ＣＹＰ４Ｖ２変異を有し、各変異は単一のヌクレオチド変化であり、５２５アミノ酸長のＣＹＰ４Ｖ２タンパク質に１つのアミノ酸変化のみが生じる。
インフォームドコンセントが得られた。手順はヘルシンキ宣言のガイドラインに従っており、倫理審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）によって承認された。
ＢＣＤヒト細胞疾患モデルの例
臨床的には、ＢＣＤはＲＰＥ萎縮と関連しており、これが光受容体の死滅と視力喪失を引き起こす。したがって、ＢＣＤを研究し、ＢＣＤの治療法を開発するには、ヒトＲＰＥモデルを作製して使用することが重要である。
（実施例１−ＢＣＤ患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製及び特性評価）
本研究では、ＢＣＤ患者からｉＰＳＣを生成するために、遺伝子挿入のない（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ）方法が使用された。ｉＰＳＣのリプログラミングに使用される従来の技術（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス）は、標的細胞のゲノムに組み込まれる。結果として得られるｉＰＳＣと、それらのｉＰＳＣから分化した細胞には外来ＤＮＡが含まれ、細胞療法や創薬アプリケーションでの使用には安全でなく、問題となる可能性がある。さらに、組込みはゲノムの重要な領域で発生する可能性があり、無関係な発生プロセスの問題を引き起こす。従来のリプログラミング法と比較して、遺伝子挿入のないリプログラミング法では、検出可能なベクター又は導入遺伝子を含まないｉＰＳＣが生成されるため、細胞療法や創薬アプリケーションにより適している。
本研究では、ＢＣＤ患者からｉＰＳＣを作製するために、遺伝子挿入のない２つの異なるリプログラミング法（１つはセンダイウイルスを用い、もう１つはエピソームベクターを用いる）を使用した。皮膚試料（皮膚線維芽細胞）と血液試料（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））の２種類の試料を使用した。どちらの方法でも、皮膚試料、血液試料、又は他の試料（尿や毛の試料など）からＢＣＤ患者特異的ｉＰＳＣを作製することができる。
Ａ．皮膚試料からのｉＰＳＣリプログラミング
ＢＣＤ患者に対して皮膚生検を行い、生検によりヒト線維芽細胞を得た。次に、ＢＣＤ患者特異的線維芽細胞を、宿主ゲノムを変更するリスクのないフットプリントフリー（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ−ｆｒｅｅ）ＲＮＡウイルスであるセンダイウイルスを使用して、ｉＰＳ細胞系へリプログラミングした。非限定的な例としてレンチウイルスが挙げられる他のベクターもｉＰＳの再プログラミングに使用可能であるが、宿主細胞のゲノムに組み込まれるリスクがある。ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ細胞の写真については、図１を参照。健康な個体の線維芽細胞も同様にリプログラミングされ、野生型（又は対照）ｉＰＳ細胞系を作製した。
ｉＰＳＣを生成するために、５×１０４個の線維芽細胞を播種し、細胞が接着して（約１２時間）約７０％〜８０％コンフルエントとなるまで１２ウェルプレートで培養した。培地を除去し、前記細胞に、５００μＬの線維芽細胞培地で、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ（ＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標−ｉＰＳ ２．０センダイウイルスリプログラミングキット、Ａ１６５１７、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を発現するセンダイウイルスを、５：５：３：５のＭＯＩでトランスフェクトした。前記細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、ウイルス含有培地を除去し、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地と交換した（ノックアウトＤＭＥＭ、１５％ノックアウト血清代替物、１Ｌ−グルタミン、１非必須アミノ酸、１ペニシリン−ストレプトマイシン、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））。トランスフェクトされた細胞を、培地を毎日交換しながら約７日間インキュベートした。
トランスフェクトされた細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンに暴露し（例えば、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ、３７℃で４分間）、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を含むＫＯ−ＤＭＥＭ培地２ｍＬに再懸濁した。次に、前記細胞をマイトマイシン−Ｃ処置したＭＥＦフィーダー層に播種し、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。２４時間後、及びその後の毎日、培地を除去し、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地（ＲＯＣＫ阻害剤なし）で置き換えた。継代後７日〜１４日でコロニーを認めた。各ｉＰＳコロニーは、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を含むＫＯ−ＤＭＥＭ培地で短時間処置した後、約１００〜１５０個の細胞の塊に顕微解剖し、その後、３７℃、５％ＣＯ２でＫＯ−ＤＭＥＭ培地でさらに１週間培養した。
ｉＰＳＣの特性評価は、以下の多能性マーカーの一次抗体を使用して行った。
ＯＣＴ４ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−９０８１ Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙ、
ＳＯＸ２ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２４５６１０ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、
ＴＲＡ−１−６０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ） ＭＡＢ４３８１、
Ｍｏｕｓｅ， ＩｇＭ、ＳＳＥＡ４ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）
ＭＡＢ４３０４ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、
Ｎａｎｏｇ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ１９９７ Ｇｏａｔ ｐｏｌｙ。
典型的なマーカーを使用した特性評価として、細胞を洗浄、ブロックし（例えば、３％血清及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを用いて）、一次抗体（１：２００）に暴露し、室温で２〜３時間インキュベートした。前記細胞を再度洗浄し、二次抗体に暴露し、室温で６０分間インキュベートした。次に、細胞を核対比染色した（例えば、１：１００００ Ｄａｐｉ含有ＰＢＳＴを使用）。
ＢＣＤ患者の線維芽細胞から作製されたｉＰＳＣ、並びにＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４、Ｎａｎｏｇ、及びＴｒａ−１−６０マーカーによる特性評価については、図１（ａ）を参照。
Ｂ．血液試料からのｉＰＳＣリプログラミング
皮膚生検試料に加えて、ｉＰＳＣを、ＢＣＤ患者及び健康な対照の血液試料からも作製した。前記ｉＰＳＣは、エピソーム法を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から作製された。プロトコルは以下の通りである。
Ｔ細胞活性化：
ａ）凍結ＰＢＭＣを解凍し、製造元のプロトコルに従って磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ヒトＴアクチベーター、ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１３２Ｄ）を使用して、約５０万個の生細胞をＴ細胞活性化に付した。
ｂ）次に、活性化されたＴ細胞を血液細胞培地で１０〜１４日間増殖した。
リプログラミング：
ａ）ｉＰＳＣ系統を生成するために、活性化されたＴ細胞を磁気ビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）から分離し、製造業者の指示に従ってネオントランスフェクションシステム（カタログ番号ＭＰＫ１００９６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してエピソームｉＰＳＣリプログラミングベクター（カタログ番号Ａ１４７０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）でエレクトロポレーションした。
ｂ）２セットのエレクトロポレーションされた細胞を、ＣＦ１ ＭＥＦフィーダー（カタログ番号：ＡＳＦ−１２１３、Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ、米国カリフォルニア州ミルピタス）で前培養した２セットの３５ｍｍディッシュに播種した。前記細胞に、ヒトｉＰＳＣ増殖培地を毎日与えた。
ｃ）２〜３週間後、ヒトＥＳＣ様ｉＰＳＣコロニーを選択し、拡大培養のためにマトリゲルコーティングした２４ウェルプレートに移した。
ｄ）その後、患者特異的ヒトｉＰＳＣ系統を増殖させ、ヒトｉＰＳＣフィーダーフリー増殖培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、カタログ番号０５８５０、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、バンクーバー、カナダ）でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２７７）で、凍結保存前に充分な細胞数が得られるまで２〜３回継代した。
アルカリホスファターゼ：
ａ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色のため、ｉＰＳＣを固定した後アルカリホスファターゼ染色溶液（ナフトール／ファストレッドバイオレット、Ｓｉｇｍａ）で染色した。
ｂ）細胞の画像は、オリンパス顕微鏡（ＩＸ５１、オリンパス、東京、日本）を使用してキャプチャされる。
ＢＣＤ患者及び健康な対照の血液試料の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から作製されたｉＰＳＣの位相コントラスト画像、及びＡＰ染色結果については、図１（ｂ）を参照。
正常なヒト核型を示すと考えられるＢＣＤ患者由来のｉＰＳＣ核型画像については、図１（ｃ）を参照。
（実施例２−ＢＣＤ患者のｉＰＳＣの網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞への分化）
ｉＰＳＣ分化は、ＢＣＤ患者及び健康な対照の全てのｉＰＳＣ系統について、３〜６継代目で開始した。分化では、ｉＰＳコロニーを、１：５０希釈マトリゲル（ＣＯＲＮＩＮＧ、３５６２３０）で前処置６ウェル培養ディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州コーニング）で、ノックアウト（ＫＯ）ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０８２９０１８）、１５％ノックアウト（ＫＯ）血清代替物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０８２９０２８）、１％非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１１４００５０）、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３５０５００６１）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０３７８０１６）、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ０６３６）からなる分化培地で、コンフルエントになるまで最初の１４日間培養した。分化の１５日目から２８日目に、分化培地に１００ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビン−Ａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１２０−１４）を添加した。２９日目から、分化が完了するまでアクチビン−Ａを除去した。８〜１０週間後、形成された色素性クラスターを手作業で選び出し、マトリゲルコーテイングディッシュに播種した。これらの細胞を、ＭＥＭ（α改変、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ−４５２６）ベースのＲＰＥ培地で維持した。この培地は、Ｎ１サプリメント（５００ｍＬの培地あたり５ｍＬ）、タウリン（５００ｍＬの培地あたり１２５ｍｇ）、ヒドロコルチゾン（５００ｍＬの培地あたり１０μｇ）、及びトリヨードサイロニン（５００ｍＬの培地あたり０．００６５μｇ）（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、並びに２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン−ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸、及び５％ウシ胎児血清（全てＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含む。細胞をさらに６〜８週間培養して、機能アッセイ用の機能性単層を形成させた。
ＢＣＤ患者のｉＰＳＣから分化させたＲＰＥ細胞を光学顕微鏡下で観察し、明確なＲＰＥ色素及び六角形の細胞形状が観察された（図２を参照）。形態学的な区別に加えて、ＢＣＤ患者からのｉＰＳ由来のＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ特異的マーカーである、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、及びＭＩＴＦの存在によっても検証された。ＲＰＥ特異的マーカーであるＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、及びＭＩＴＦの存在を示す、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のＲＰＥマーカーの結果については、図２（ｂ）を参照。
ｉＰＳＣをＲＰＥ細胞に分化するためには複数のプロトコルを使用することができる。ここで説明するＲＰＥ分化プロトコルは、通常３か月以上かかる延長プロトコルである。他のプロトコルでは、２か月未満など短期間である。短いプロトコルでも延長プロトコルでもｉＰＳＣをＲＰＥ細胞に分化可能であるが、異なるプロトコルで生成されたｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞の間で腫瘍形成のリスクが異なる可能性がある。ｉＰＳＣ分化に関連する腫瘍形成のリスクは、プロトコル終了時に未分化又は完全に分化していないｉＰＳ細胞の一部に起因し、延長プロトコルの場合はｉＰＳＣは完全に分化して成熟ＲＰＥ細胞となるため、腫瘍形成を発生させない原因となる可能性が高い。生化学及びその他のアッセイ並びに機能研究のために作製されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系の純度を確保し、細胞療法（非限定的な例として、自家移植）のためのｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞の安全性をサポートするために、より長期のプロトコルを使用した。
（実施例３−ＢＣＤ細胞モデル及びＣＹＰ４Ｖ２機能研究のための生化学的、細胞生存率及びその他のアッセイ）
脂質アッセイ：
ＢＣＤ及びＣＹＰ４Ｖ２酵素の機能に関する以前の研究では、脂肪酸に焦点が当てられてきた。本研究では、脂肪酸だけでなく、セラミド（Ｃｅｒ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、及びスフィンゴシン／スフィンガニン（ＳＯＳＡ）を含むより多くの脂質アッセイを使用して、ＢＣＤ疾患モデルの生化学的異常／表現型を分析し、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の生化学的機能を分析した。
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、セラミド（Ｃｅｒ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、及びスフィンゴシン／スフィンガニン（ＳＯＳＡ）の生化学アッセイを、関連するアッセイ及びプロトコルに基づいて、コロンビア大学のバイオマーカーコア研究所（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（米国ニューヨーク州ニューヨーク）で実施した。
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、セラミド、スフィンゴシン、及びスフィンガニンは、クロロホルム：メタノールを用いて抽出した。簡潔には、約１００万個のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を１５０μＬの水でホモジェナイズした。１００μＬのホモジネートを、内部標準（パルミチン酸−Ｄ３１、Ｃ１２セラミド、Ｃ２５セラミド、Ｃ１７スフィンゴシン、Ｃ１７スフィンガニン）を含む３ｍＬのクロロホルム：メタノール（ｖ：ｖ＝２：１）と混合した。試料を充分にボルテックスし、０．５ｍＬの水を加えて相分離させた。混合物を再度ボルテックスし、４℃で１０分間、３，０００ｇで遠心分離した。パスツールピペットを使用して、下部の有機相を２番目の清潔なガラス管に移した。２ｍＬのクロロホルムを残りの水相に加え、ボルテックスで混合し、再度遠心分離して残りの脂質を抽出した。下部の有機相をプールし、窒素下で３７℃で蒸発させた。抽出した脂質を５０μＬのメタノール：アセトニトリル（ｖ：ｖ＝１：１）で再構成し、注入のためＬＣオートサンプラーバイアルに移した。スフィンゴミエリンは他の脂質と同様にクロロホルム：メタノールでも抽出したが、スフィンゴミエリンのサンプル調製用には２μＬの細胞ホモジネートのみを配置した。全てのアッセイは、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ ＭＳ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）で実施した。ＦＦＡは、１００ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｃ１８カラムで溶出した。セラミド、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴミエリンを１００ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌカラムで分離した。ＦＦＡはネガティブＳＩＲ法を使用しモニタリングし、その他はポジティブＭＲＭ取得によってモニタリングした。
生化学アッセイで試験した化合物のリストを、以下の表２に提示する。いくつかの化合物は、本研究の標準品として使用するために購入した（表２に注釈付き。Ｎｕ−Ｃｈｅｋ：Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ、Ｉｎｃ．、米国ミネソタ州エリシアン；Ｃａｙｍａｎ：Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ミシガン州アナーバー）。他の化合物は、コロンビア大学のバイオマーカーコア研究所（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（米国ニューヨーク州ニューヨーク）で入手可能な既存の標準品を使用した。全てのＦＦＡは単一のＭＳで検出したが、他の種類の化合物はＭＳ／ＭＳで検出した。
ヒドロキシ脂肪酸アッセイ：
さらに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、１６−ＨＥＰＥ、１７−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥ、１９−ＨＥＰＥ、２０−ＨＥＰＥ、１７−ＨＤＨＡ、１８−ＨＤＨＡ、１９−ＨＤＨＡ、２０−ＨＤＨＡ、２１−ＨＤＨＡ、２２−ＨＤＨＡ、１９（２０）−ＥｐＤＰＡ（正式名称：（±）１９，２０−エポキシ−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサペンタエン酸；（±）１９，２０ ＥＤＰ、（±）１９，２０−エポキシドコサペンタエン酸、（±）１９，２０−エポキシ−ＤＰＡ、（±）１９，２０−ＥｐＤＰＥとしても知られる）、及び１９（２０）−ＤｉＨＤＰＡ （正式名称：（±）１９，２０−ジヒドロキシ−４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ−ドコサペンタエン酸；（±）１９，２０−ＤｉＨＤｏＰＥとしても知られる）を含む、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のヒドロキシ脂肪酸を検出した。
ＨＤＨＡ化合物はＤＨＡのヒドロキシ代謝産物であり、ＨＥＰＥ化合物はＥＰＡのヒドロキシ代謝産物である。１９（２０）−ＥｐＤＰＡは、ＤＨＡのω−３二重結合のエポキシ化を介して誘導されるＤＨＡエポキシゲナーゼ代謝産物である。１９（２０）−ＤｉＨＤＰＡはＤＨＡの代謝物でもある。ＤＨＡは重要な脂肪酸であり、脳と網膜において最も豊富なω−３脂肪酸である。以前の研究では、ＣＹＰ４Ｖ２はω−３脂肪酸、特にＤＨＡのヒドロキシラーゼであることが示された。
材料：ヒドロキシ脂肪酸標準品（±）１８−ＨＥＰＥ（品目番号３２８４０）、（±）２０−ＨＤＨＡ（品目番号３３７５０）、（±）１９（２０）−ＥｐＤＰＡ（品目番号１０１７５）、及び（±）１９（２０）−ＤｉＨＤＰＡ（品目番号１０００７００１）は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（米国ミシガン州アナーバー）から購入した。内部標準重水素化パルミチン酸（Ｃ１６−Ｄ３１脂肪酸）は、Ｃ／Ｄ／Ｎ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｉｎｃ．（＃Ｄ−２００２、ケベック、カナダ）から購入した。
上記のＬＣ−ＭＳ又はＬＣ−ＭＳ／ＭＳの方法に加えて、研究で試験した化学種及び化合物は、他の方法を使用して検出及び／又は定量化することもできることを理解されたい。例えば、メチル化処理をしたＦＦＡのＧＣ−ＭＳ又はＧＣ−ＭＳ／ＭＳ法が挙げられる。Ｃｅｒ及びＳＭの場合、ＦＩＡ−ＭＳ／ＭＳ又はＧＣ−ＭＳ／ＭＳを使用することができる。
細胞生存率アッセイ：
青色光暴露：ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を３．５ｃｍディッシュ及び４ウェルチャンバーディッシュに播種した。２か月後、１０μｇ／ｍＬグルコースを含むＰＢＳ（＋）内で１時間、１．５ｍＷ／ｃｍ２で、細胞を４３０±２０ｎｍ（青色）の光に暴露した。全ての細胞系で同じ播種密度を用いた。青色光に暴露後、処置した細胞に新しいＲＰＥ培地を供給し、５％ＣＯ２及び３７℃のインキュベーターに一晩回収した。
１時間の他に、より短い又はより長い光暴露時間を用いてもよい（例えば、暴露なし、３０分、４５分、７５分、９０分、又は１２０分など）。同様に、異なる波長又はより広いスペクトルの暴露光を使用してもよい。さらに、異なる培養日数（例えば、ＲＰＥ培地で２か月、３か月、４か月、５か月、又は６か月）のｉＰＳ−ＲＰＥ試料を使用してもよい（例えば加齢の影響を調べるため）。
細胞生存率アッセイ：生細胞／健康な細胞は、細胞透過性色素Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｃ３０９９、米国）で、最終濃度３μｍｏｌ／ｍＬのＰＢＳ（＋）（各３．５ｃｍディッシュに１ｍＬ又は各チャンバーに２００μＬ）で室温で１時間標識した。死細胞／病気の細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｐ３５６６、米国）で、最終濃度２μｇ／ｍＬのＰＢＳ（＋）（各３．５ｃｍディッシュに１ｍＬ又は各チャンバーに２００μＬ）で室温で１時間標識した。ＰＩはＤＮＡ結合性であり、生細胞に浸透しないため、集団の死細胞を検出するために一般的に使用される。次にＰＢＳ（−）で洗浄した後、細胞の蛍光レベルを観察し、２０倍の倍率で倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｓ２Ｒ）で写真を撮影した。ＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）によって写真を処理した後に死細胞／生細胞比を計算した。
生化学アッセイ及び細胞生存率試験に加えて、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞でＲＰＥ機能試験を実施してもよい（食作用活性、経上皮耐性など）。
ＣＹＰ４Ｖ２発現：
対照及びＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２発現レベルを検出及び比較するための実験を行った。細胞系でのＣＹＰ４Ｖ２発現は、抗ＣＹＰ４Ｖ２抗体（ウェスタンブロット）又は定量的ＰＣＲのいずれかによって評価できる。
ＣＹＰ４Ｖ２ウェスタンブロット：各ｉＰＳ−ＲＰＥ試料からの４５μｇの全細胞タンパク質を約７．５％ＳＤＳページゲルで泳動した後、膜に湿式転写した。前記膜を、ＰＢＳＴ中の５％ＢＳＡで室温で１時間ブロックした後、５％ＢＳＡ中に１：１０００の濃度で含まれる一次抗体（ウサギで作製された抗ＣＹＰ４Ｖ２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：ＳＡＢ １４１０５６５、米国）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで約３×１０分間、洗浄を行った。次いで、前記膜を、５％ＢＳＡ中に１：３０００の濃度で含まれる二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号：ｓｃ−２００４、米国）と共に４℃で４時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３×１０分間、最終洗浄を行った。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
ＣＹＰ４Ｖ２ウェスタンブロットでは、対照のｉＰＳ−ＲＰＥ試料でＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の発現が検出されたが、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ試料では検出されなかった。ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２による処置後、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ試料でＣＹＰ４Ｖ２タンパク質が検出された。
リアルタイムＰＣＲ及び相対ｍＲＮＡ定量化：健康な対照（ＷＴ）の試料、ＢＣＤ患者の試料、ＢＣＤ患者のＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２で処置したｉＰＳ−ＲＰＥ試料を採取し、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解した。製造業者の指示に従って、全ＲＮＡを単離した。次に、ゲノムＤＮＡの混入を防ぐためにＤＮａｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）処置を行った。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットによって逆転写反応を実施し、ランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを生成した。Ｍａｘｉｍａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＲＯＸ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してリアルタイムＰＣＲ法を実施し、遺伝子発現レベル（３８サイクル）を定量化した。それぞれＣＹＰ４Ｖ２エクソン７領域及びＣＹＰ４Ｖ２ｏｐに特異的なプライマーを使用した。ハウスキーピング遺伝子としてアクチンを使用した。
結果：ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞試料におけるＣＹＰ４Ｖ２及びＣＹＰ４Ｖ２ｏｐの発現を試験するために、定量的ＰＣＲを実施した。ＣＹＰ４Ｖ２及びＣＹＰ４Ｖ２ｏｐの転写レベルは、それぞれ患者試料及び対照試料によって正規化した。ＣＹＰ４Ｖ２の場合、全ての非患者対照試料は、同レベルのＣＹＰ４Ｖ２発現を示し、これは患者試料のＣＹＰ４Ｖ２発現レベルよりも数百倍高かった。ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置後、患者試料のＣＹＰ４Ｖ２発現レベルは、非患者対照試料に匹敵するレベルまで１００倍以上増加した（図３）。ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐの場合、ＡＡＶで処置した試料は全て、未処置の試料と比較してはるかに高い発現レベルを示した（図４）。これらの結果は、ＡＡＶベクターがＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡをＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞に送達することができ、発現カセットが前記遺伝子を発現することができたことを示している。
（実施例４−ＢＣＤ細胞モデルの表現型及びＣＹＰ４Ｖ２機能に関する知見）
脂質検査結果：
ＢＣＤ細胞モデル（例えば、ＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）に生化学的欠陥／異常（すなわち、表現型）が存在するかどうか及びどのような欠陥／以上であるかを判断するために、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の脂肪酸、セラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴシナ、スフィンガニン、及びヒドロキシ脂肪酸を、健康な対照に由来するｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のものと比較して検出及び定量するために、実施例３に記載した生化学アッセイを使用した。
試験の前に、細胞を以下のように採取した。ＢＣＤ患者由来の約１００万個のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、プラスチック製セルリフターでディッシュから剥離し、１ｍＬピペットを使用して１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。エッペンドルフチューブは、試験前に−８０℃の冷凍庫に入れておいた。健康な対照ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞も同じ方法で採取した。生化学アッセイの結果を以下の表３に示す。

表３の脚注：
ＷＴ：野生型対照ｉＰＳ−ＲＰＥ。Ｐ１：患者１のｉＰＳ−ＲＰＥ。Ｐ２：患者２のｉＰＳ−ＲＰＥ。
患者の未処置試料及びＡＡＶ処置試料は培養日及びクローン系統で一致させた。
Ｐ１ ＡＡＶ２．ｏｐ及びＰ２ ＡＡＶ２．ｏｐの試料をＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐで処置し（１日、ＭＯＩ：５×１０４ＧＣ／細胞）、処置後１０日で回収した。
Ｐ２ ＡＡＶ２ｔｒｉｐ．ｏｐ試料をＡＡＶ２ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ）．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐで処置し（１日、ＭＯＩ：５×１０４ＧＣ／細胞）、処置後１０日で回収した。
Ｐ２ ＡＡＶ８．ｆｖ試料をＡＡＶ８．ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖで処置し（１日、ＭＯＩ：２×１０５ＧＣ／細胞）、処置後１０日で回収した。
Ｐ２ ｓｃＡＡＶ１．ｏｐ試料をｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐで処置し（１日、ＭＯＩ：２×１０５ＧＣ／細胞）、処置後４日で回収した。
結果は、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞試料は、対照とは異なる脂肪酸プロファイルを有することを示した。特に、ＢＣＤ患者の試料は、ＤＨＡ（２２：６ ｎ３）及びオメガ３（ω−３又はｎ３）脂肪酸の合計（Ｃ１８：３ ｎ３α、Ｃ２０：５ ｎ３ ＥＰＡ、Ｃ２２：６ ｎ３ ＤＨＡ、及びＣ２２：５ ｎ３ ＤＰＡの合計）が、対照よりもはるかに高いレベルである。これは、ＣＹＰ４Ｖ２がオメガ３脂肪酸代謝に影響するという以前の研究からの示唆を裏付けた。
驚くべきことに、ｎ３脂肪酸レベルの異常に加えて、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞ではＣ２０：４ ｎ６（アラキドン酸又はＡＡ）もより高いレベルを示した。ＢＣＤに関連する以前の研究では、ＡＡの異常なレベルは報告されていない。
興味深いことに、ｎ３脂肪酸（ＤＨＡを含む）及びｎ６脂肪酸（ＡＡを含む）の異常は、ＢＣＤ患者の血清中の脂肪酸レベルを試験した以前の研究では見出されなかった。ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞及び血清における異なる脂肪酸プロファイルは、ＣＹＰ４Ｖ２の機能が非網膜細胞又は非ＲＰＥ細胞における他のＣＹＰ４酵素によって置換されるという仮説を支持している。それらのＣＹＰ４酵素の多くは、ＣＹＰ４Ｖ２とともに他の臓器及び組織で発現され、ＣＹＰ４Ｖ２はＲＰＥ細胞で比較的高い発現レベルを持つ唯一のＣＹＰ４酵素である。
脂肪酸に加えて、ＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は他の化合物又は化合物クラスについての表現型も有する場合がある。非限定的な例としてコルチコステロイド、スフィンゴ脂質、及びリン脂質（スフィンゴミエリン、セラミド、スフィンゴシン、及びスフィンガニンなど）が挙げられる他の化合物クラスに関する表現型、並びに脂質シグナル伝達に関する表現型をスクリーニングするための実験が行われる。さらに、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞で同位体追跡実験及びプロテオーム解析（例えば、質量分析に基づくプロテオーム解析）が実施される。
さらに、以前の研究では、ＣＹＰ４Ｖ２はω−３脂肪酸（ＤＨＡ及びＥＰＡ）ヒドロキシラーゼであることが見出された。興味深いことに、実施例３に記載されたヒドロキシ−ＤＨＡ又はヒドロキシ−ＥＰＡは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおいて、健康な対照及びＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のいずれでも検出されなかった。ＣＹＰ４Ｖ２の酵素機能が生細胞と以前の研究で行われた生細胞外の化学反応とでは異なるか、又はヒドロキシ脂肪酸が生細胞内で他の化合物や形態に迅速に変換される中間体であるか、又はヒドロキシ脂肪酸が試料に非常に大量の細胞が含まれている場合にのみ検出できる微量レベルである可能性がある。
細胞生存率アッセイの結果：
臨床的には、ＢＣＤはＲＰＥ萎縮と関連しており、それが光受容体の死滅と視力喪失を引き起こす。細胞生存率アッセイ（上記の実施例３に記載）により、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞試料におけるＲＰＥ萎縮が明らかとなった。対照のｉＰＳ−ＲＰＥ試料とＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ試料との細胞生存率の比較については、図５及び図６を参照（図５−青色光への暴露なし、図６−青色光への１時間暴露後）。
重要なことに、これらの画像は以下を明らかにした。
（１）光への暴露後、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料（Ｐ１及びＰ２）で有意なレベルの細胞死が示され、対照（ＷＴ１及びＷＴ２）の細胞死よりもはるかに高かった（図６を参照）。例えば、ＷＴ２ ｉＰＳ−ＲＰＥの３．０％と比較して、Ｐ１ ｉＰＳ−ＲＰＥの死細胞／生細胞比は２０．８７％であった。ＢＣＤの臨床的表現型であるＲＰＥ萎縮は、ＢＣＤ細胞モデルで明らかであった。
（２）ＢＣＤ Ｐ１及びＰ２ ｉＰＳ−ＲＰＥ試料間で、異なるレベルのＲＰＥ萎縮が観察された。Ｐ１ ｉＰＳ−ＲＰＥは、Ｐ２ ｉＰＳ−ＲＰＥよりも高い細胞死レベルを示した。
（３）青色光への暴露なしでも、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ試料（Ｐ１）はＲＰＥ萎縮を示した（図５）。
ＢＣＤ患者は、病気の発症年齢と進行が大きく異なる。ＢＣＤの発症範囲は、１０代前半〜２０歳代、又は２０歳より後であり、２０歳代〜５０歳代で法的失明に至る。さらに、同じＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＢＣＤの兄弟姉妹である患者でも、病気の発症年齢及び進行に実質的な違いを有する可能性がある。以前は、これらの違いについて説明されていなかった。異なるＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ試料間のＲＰＥ萎縮レベルの違いは、ＢＣＤ患者間の病気の発症及び進行の違いに関する細胞レベルでの指針を提供する。
本研究では、ＢＣＤ細胞モデルに、ＢＣＤの臨床表現型（すなわちＲＰＥ萎縮）など、複数の表現型（生化学的（脂質など）異常などの分子レベルの表現型、及び細胞生存率などの細胞レベルの表現型のいずれも）が見つかった。
（実施例５−薬剤候補及び投与量範囲のスクリーニングのための、ＢＣＤ及びＣＹＰ４Ｖ２機能の研究のための、細胞療法における、並びに患者特異的応答の研究のための、ＢＣＤ対象からのｉＰＳ細胞及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の使用）
ＢＣＤ疾患のヒト細胞モデルとして、ＢＣＤ患者のｉＰＳ細胞及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞には幅広い用途があり、非限定的な例として、ＢＣＤ及びＣＹＰ４Ｖ２機能の研究（例えば、上記実施例３及び実施例４を参照）、ＢＣＤ及び関連疾患の薬物候補及び投与量範囲のスクリーニング（本明細書実施例を参照）が挙げられる。
ＢＣＤ細胞モデル（例えば、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系又は人工的に作製されたＣＹＰ４Ｖ２変異を有するｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系）を使用する方法及び例は、本明細書の実施例に詳細に記載されており、これらは遺伝子治療及び細胞療法におけるＢＣＤ細胞モデルの使用に関係する。遺伝子治療の試験に加えて、また細胞療法の細胞基盤として、このようなＢＣＤ細胞モデルは、ＢＣＤ、ＩＲＤ、又はＲＰを治療するための、他の治療薬（例えば、薬物候補）及びその投与量、製剤及びベクター（ウイルス又は非ウイルスベクター）、又はデバイス若しくは送達メカニズムの有効性及び／又は安全性を、本明細書の実施例に詳細に記載の方法又は類似の方法でスクリーニング及び試験するために使用することができる。
前記ＢＣＤ細胞モデルの使用において、治療薬による治療前及び治療後において、上記実施例３、実施例４、及び本明細書の他の実施例に記載の様々な種及びＲＰＥ萎縮における化合物のレベルを比較して、これらの化合物のレベルの異常、及びＢＣＤ細胞モデルのＲＰＥ萎縮が治療後に改善するかどうかを評価することによって、治療薬の有効性を評価することができる。同様に、治療薬の異なる用量、製剤（例えば、化学化合物、医薬品有効成分、遺伝子治療用のベクター型及び／又はカプシド、又は遺伝子編集用のベクター型の製剤）又は重要なコンストラクト（例えば、遺伝子治療の発現カセットにおけるプロモーター又は他の制御配列）を、ＢＣＤ細胞モデルを使用して比較することができる。さらに、ＢＣＤ細胞モデルを使用して、医療機器又は医療方法の有効性を試験することもできる。これには、眼細胞への治療薬の送達、又は形質導入若しくはトランスフェクション効率の改善が含まれるがこれらに限定されない。治療した細胞を、未治療の細胞又は化合物への暴露の前の同じ細胞と比較することができることは理解されよう。有効な投与量範囲を決定するために様々な投与量を使用することができる（細胞あたり、細胞１００万個あたり、又は細胞５０万個あたりなどで測定）。健康な対照のＲＰＥ細胞又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のデータと比較した、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞（治療後 ｖｓ． 治療なし）における、上記実施例３及び実施例４で述べた脂肪酸及び他の化合物の様々な化合物並びにＲＰＥ萎縮のレベルに関するデータは、治療効果及び有効な用量範囲を評価するために用いることができる。
さらに、ＢＣＤ患者特異的なｉＰＳ細胞系、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系、及び他のｉＰＳ由来細胞系を使用して、治療薬、用量、又はデバイスに対するそのような患者の個々の応答を評価してもよい。患者特異的なｉＰＳ細胞、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、及び他のｉＰＳ由来細胞は、各患者に特異的な形質を持ち、その非限定的な例としては、免疫応答（例えば、細胞内免疫、ＲＰＥ免疫）、遺伝子型（例えば、異なる応答を引き起こす可能性のある患者間で異なる変異）が挙げられる。そのような適応により、個別の治療薬（例えば、様々なＡＡＶベクター血清型又はカプシド変異）、又は同じ疾患の異なる患者に合わせた最適な用量を開発及びスクリーニングすることができる。このアプローチは、他の疾患（非限定的な例として、他の眼疾患）に使用することができる。
ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥによりＢＣＤ患者の個人差が明らかとなったため、これは個別の最適な投与量を評価し、個別化医療を開発するために使用することができる。例えば、以下の遺伝子治療の例で見られるように、同じ用量の１×１０ｅ５ ＭＯＩでも、ＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐはＰ１とＰ２のｉＰＳ−ＲＰＥの間で異なるレスキューレベル（すなわち、異なる有効性レベル）のＲＰＥ萎縮を達成した。これは、ＢＣＤ細胞モデルが動物モデルより優れている点である。
ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞（すなわち、ＢＣＤ細胞モデル）を使用して、インビトロでのＢＣＤ細胞モデルで決定された最適用量レベル（例えば、インビトロでの遺伝子治療においてＭＯＩとして示される）にインビボ治療の標的となる眼細胞（例えば、ＲＰＥ細胞）の推定数を乗じて、インビボで使用するための遺伝子治療ベクターの用量レベル（例えば、ＧＣ又はｇｐ）を得ることにより、インビボ治療における治療有効量を評価及び提案することができる。このようなベクターの用量レベルを乗数によって調整することによって（例えば、１〜１０（例えば、網膜下注射の場合は１〜５、硝子体内注射の場合は５〜１０；適用される前記乗数に影響を与える他の要因としては、標的領域のサイズ及び治療される対象（例えば、治療対象の年齢、体重、疾患進行度、及び状態、並びに潜在的な免疫反応（すなわち、既存のＮＡｂ））、治療の標的となる細胞の位置と密度が挙げられる）、インビボ治療の治療有効用量範囲が提案され、これは臨床試験で確認又はさらに改良することができる。この方法を使用して、個々の患者のインビボでの治療に合わせた個別の最適用量を評価又は提案することもできる。
（実施例６−人工的に作製されたＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＢＣＤ細胞モデル）
ＢＣＤは希少疾患であるため、患者の試料を入手するのは困難である。この困難を克服するために、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術を使用して、胚性幹（ＥＳ）細胞系やＢＣＤを有しない対象からのｉＰＳ細胞などの非ＢＣＤ患者細胞のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に人為的な変異を作製することによって、ＢＣＤ細胞モデルを作製することができる。
例えば、本明細書に示す実施例のように、ＳｐＣａｓ９タンパク質と組み合わせて、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ４、又はｓｇＲＮＡ５を使用して（ｓｇ＄ＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ４、及びｓｇＲＮＡ５のそれぞれのプロトスペーサーエレメント配列については、それぞれ配列番号４８〜配列番号５２を参照；ＩＶＴ ｓｇＲＮＡの付加配列については、配列番号５５及び配列番号５９を参照）、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を含むＢＣＤ患者のゲノムＤＮＡのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の領域に切断を作製した。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異は、ＢＣＤ患者の中で最も一般的なＣＹＰ４Ｖ２変異である。なかでも、ｓｇＲＮＡ３、ｓｇＲＮＡ４、及びｓｇＲＮＡ５はｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異配列に特異的ではないため、健康な細胞（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２変異を有しないＥＳ又はｉＰＳＣ）のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を引き起こす可能性がある。特に、トランスフェクション後、ｓｇＲＮＡ４及びＣａｓ９はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のエクソン７にＤＳＢを作製する可能性があり、これは、細胞内で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってＤＮＡが修復される際に、（片方又は両方のアレルにおいて）エクソン７の変異を引き起こす可能性がある。例えば、ＮＨＥＪによって作製されたインデルエラーは、フレームシフト変異を引き起こす可能性がある。その結果、一部の細胞は人工的に作製されたＣＹＰ４Ｖ２変異を有し、ＢＣＤ細胞疾患モデルとして使用したり、ＢＣＤ細胞モデルの作製に使用したりすることができる（例えば、ＥＳ又はｉＰＳ細胞をＲＰＥ細胞に分化させて、ＣＹＰ４Ｖ２変異を含むＥＳ−ＲＰＥ又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を作製する）。同様に、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の異なる領域でＤＳＢを作製するように設計された２組のｇＲＮＡを使用して、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子内に大きな欠失又はノックアウト変異を作製したり、細胞内のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子全体をノックアウトしたりして、ＣＹＰ４Ｖ２変異を含むＢＣＤ細胞モデルを作製することもできる。ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して標的配列を切断及び／又は修正する方法、及び結果を検証する方法に関するより詳細な検討は、実施例及び本明細書の開示に記載されている。
人工的に作製されたＣＹＰ４Ｖ２変異を有するこれらのＢＣＤ細胞モデルは、ＢＣＤ及びＣＹＰ４Ｖ２機能の研究、並びに本明細書で説明する関連する利用方法（非限定的な例として、薬物候補の試験及び比較、用量範囲の決定、及び医療機器又は送達方法の試験など）において、ＢＣＤ患者固有の細胞モデルを模倣するために使用可能である。
同様の方法を使用して、表４に示す１又は複数の遺伝子の変異又は遺伝的欠陥に関連するものなどの眼疾患又は他の疾患の、人為的に作製された変異を有する細胞疾患モデルを作製することもできる。
（実施例７−眼疾患のための同質遺伝子対照の生成及び使用）
疾患及び／又は特定の変異又は欠陥を有する遺伝子の意義を研究する際の同質遺伝子対照として、変異が修正された同質遺伝子の患者特異的ｉＰＳ細胞系及び／又はそれに由来する他の細胞系（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＲＰＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、又は他のｉＰＳ−眼細胞）を使用することができる。ＥＳ又は別の個体に由来する従来の対照（例えば、細胞系（ＥＳ−ＲＰＲ又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系など））は、疾患関連遺伝子の違いに加えて、患者からの遺伝的違いを含む個人差を有する。本実施例は、対象間の個人差及びこれから生じる「バックグラウンドノイズ」を排除する方法を提供する。前記方法は、患者から変異が修正された同質遺伝子対照を作製し使用して、変異を有する同じ患者の細胞系と比較することを含む。患者特異的疾患モデルと、同じ患者由来の変異が修正された同質遺伝子対照と、には個人差がないため、それらを分析及び比較して、表現型、生化学的異常、及び患者の変異又は欠陥を有する遺伝子に関連する他の構造的及び機能的欠陥を正確に特定することができる。非限定的な例としてＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮが挙げられる遺伝子編集技術を使用することにより、変異が修正された同質遺伝子対照を作製することができる。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用して、ＢＣＤ患者の間で最も一般的な変異であるｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正し、それによってＢＣＤ患者から同質遺伝子対照を生成する方法の具体例を、本明細書の実施例で提示する。同じアプローチを使用して、他の眼疾患の同質遺伝子対照を作製してもよい。同質遺伝子対照は、従来の対照に比べて大きな利点があり、繊細な表現型の眼疾患（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ））の研究に不可欠となり得る。さらに、遺伝的危険因子、変異、又は修正された遺伝子のそれぞれ１つを有する同質遺伝子対照を作製して、そのような同質遺伝子対照を疾患モデルと比較して、眼疾患及び他の疾患における関連リスク因子、変異、又は遺伝子（表４に示す１又は複数の遺伝子の変異又は遺伝的欠陥に関連するものなど）の影響を決定することによって、眼疾患における複数の遺伝的危険因子、変異、及び／又は複数の遺伝子の影響の違いを比較及び特定するために同質遺伝子対照を使用することもできる。
同質遺伝子対照を患者特異的細胞疾患モデルと比較して、表現型、生化学的異常、及び遺伝子変異及び／又は関連する欠陥タンパク質に関連する他の構造的及び機能的欠陥を特定してもよい。患者の細胞系と対照と間の生化学的異常／表現型を識別するためのバイオアッセイの方法の具体的な非限定的な例及び検討は、本明細書の上記実施例３及び実施例４に記載されており、非限定的な例としてリピドミクス、プロテオミクス、及び同位体追跡が挙げられる。
（ＢＣＤヒト細胞疾患モデルに関する検討）
ＢＣＤは希少疾患であることを考慮すると、生検によりＢＣＤ患者からヒトＲＰＥ細胞を示す疾患を得ることは実用的ではない。実用可能なＢＣＤヒト疾患モデルが欠如していたことから、ＢＣＤに関する以前の研究では、非ＢＣＤ疾患の原因細胞（例えば、眼の一部ではない線維芽細胞やリンパ球）及びＢＣＤ患者の血清を研究対象として使用するにすぎなかった。これらの研究の結果は、脂肪酸同化作用に集中していた。
本明細書に記載の研究では、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ細胞系が成功裏に作製され、インビトロでＢＣＤ疾患の表現型を有する患者特異的ＢＣＤ疾患ＲＰＥ細胞を作製するために利用された。ＢＣＤ表現型は、ＢＣＤに影響を受ける主要な細胞型であるＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞で直接同定された。本研究より前には、ＢＣＤに関連する脂肪酸同化作用を一因として、ｉＰＳ細胞系及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系が首尾よく作製できるかどうかは不明であった。
生化学的検査により、ＢＣＤ患者からのｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は、以前のＢＣＤ研究で報告されていないものを含め、健康な対照のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の脂肪酸と比較して異常なレベルの脂肪酸を有することが示された。ＢＣＤ疾患特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞のインビトロ表現型は、ＣＹＰ４Ｖ２によって制御される経路、及び及びＢＣＤの病因に対するより多くの洞察を提供し、ＢＣＤの病因及びＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能に対する貴重な洞察を提供し、さらに、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系を、実行可能でロバストなＢＣＤヒト疾患モデルとして使用できることを支持する。
ＢＣＤ患者からのｉＰＳ細胞系、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系、及び他のｉＰＳ−眼細胞系には、薬物スクリーニング、新規治療薬の開発、用量範囲の決定、細胞療法での使用など、さらなる用途がある。
ＢＣＤ患者特異的なｉＰＳ細胞系、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系、及び他のｉＰＳ−眼細胞系に加えて、ＥＳ細胞又は非ＢＣＤ個体のｉＰＳ細胞に由来する他の細胞系（非限定的な例としてＥＳ細胞系、ｉＰＳ細胞系、及びＲＰＥ細胞系が挙げられる）に、遺伝子編集により病的ＣＹＰ４Ｖ２変異を人工的に作製することでＢＣＤヒト疾患細胞モデルを開発してもよい。
さらに、眼疾患の同質遺伝子対照を生成する方法が提供される。同質遺伝子対照は、患者特異的疾患モデルと個人差がない。したがって、同質遺伝子対照には、従来の対照よりも眼疾患の研究において利点がある。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療
（実施例８−ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質及び機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするｃＤＮＡ）
本研究では３つのｃＤＮＡを使用した。配列番号１に示す配列を有するｃＤＮＡ（本明細書ではＣＹＰ４Ｖ２ｓｔと称する）及び配列番号２に示す配列を有するｃＤＮＡ（本明細書ではＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）はいずれもヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（アミノ酸配列を配列番号４に示す、ＮＰ＿９９７２３５．３）をコードする。配列番号３に示す配列を有するｃＤＮＡ（本明細書ではＣＹＰ４Ｖ２ｆｖと称する）は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能的バリアント（アミノ酸配列を配列番号５に示す）をコードする。
配列番号５は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）の機能的バリアントのアミノ酸配列である。両方のタンパク質（配列番号４及び配列番号５）は、本明細書で定義される機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質である。配列番号５に示す機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４に示すヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質からの１つのアミノ酸変化を有する。機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号５）をコードする配列番号３に示すｃＤＮＡは、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードする配列番号１に示すｃＤＮＡと２つのヌクレオチドの違いを有する。配列番号２に示すコドン最適化ｃＤＮＡ及び配列番号１に示すｃＤＮＡは両方とも、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードし、７７％の配列同一性を有する。
配列番号５の機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ−ｏｐ）を本明細書で示す。このｃＤＮＡは、ＣＹＰ４Ｖ２ ｆｖ−ｏｐ配列が配列番号１及び配列番号３の間の１つ又は２つのヌクレオチドの違いを保持すること以外は、ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐのｃＤＮＡ配列（配列番号２）を含むものである。
ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ及びＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ−ｏｐに加えて、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする他のコドン最適化ｃＤＮＡ又は核酸配列（例えば、配列番号４〜２９のいずれか）は、本開示に記載の方法により作製することができる。ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号５又は配列番号６〜配列番号２９のいずれか）をコードするコドン最適化核酸分子は、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系（又は人工的に作製されたＣＹＰ４Ｖ２変異を含むＲＰＥ細胞）で試験して、その発現効率及びＢＣＤを治療するためのレスキュー機能を決定及び／又は確認してもよい。そのような試験としては、限定されないが、タンパク質発現（例えば、コードする機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質に特異的なウェスタンブロット）、関連遺伝子発現を検出するＰＣＲ、及び／又は本明細書で提示する組成（例えば、発現カセット及び／又はベクター内で）若しくは方法によりＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系における生化学的異常及びＲＰＥ萎縮をレスキューする有効性が挙げられる。
（実施例９−ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療のための効率的な発現カセット及びデリバリーベクターの設計）
本明細書に記載されるように、発現カセット及び送達ベクターは様々な要素を含む。結果は、設計によって大きく異なる場合がある。非限定的な例として以下に記載されるもの及びそれらの多数の組み合わせが挙げられる重要な要素のそれぞれに多くのオプションがあることを考慮すると、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療を成功させるには、効率的な発現カセット及び送達ベクターの慎重な設計が必要である。さらに、設計プロセスでは、疾患の表現型及び特性（例えば、治療の標的となる細胞／組織の種類）及び安全性（例えば、毒性、免疫応答）を考慮する必要がある。最後に、妥当な疾患モデルで設計を試験及び検証する必要がある。
（ａ）送達ベクターの種類、
（ｂ）ベクターの血清型及びカプシドの設計／選択、
（ｃ）さらなるベクター設計（ｓｓＡＡＶ ｖｓ． ｓｃＡＡＶなど）、
（ｄ）ｃＤＮＡ設計、
（ｅ）プロモーター設計／選択、
（ｆ）ポリＡシグナル設計／選択、及び
（ｇ）その他の制御配列、例えばエンハンサー、ジャンクション／リンカー配列。
（ａ）については、標的細胞（例えば、ヒトＲＰＥ）で高い形質導入効率を達成するために、ウイルスベクターが選択された。様々な種類のウイルスベクターの中で、ＡＡＶベクターは、その安全性プロファイル、及びＣＹＰ４Ｖ２をコードする核酸（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ）のサイズがＡＡＶベクターのパッケージング制限に適合することから選択された。例えば、ＨＳＶベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルス又はアデノウイルスベクターなど、より大きなパッケージング制限のあるベクターもＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療に使用できる。ウイルスベクターに加えて、非ウイルスベクター、例えばナノ粒子（非限定的な例として、リポソームナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソームプロタミン／ＤＮＡリポプレックス（ＬＰＤ）が挙げられる）も、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療に使用することができる。
（ｂ）については、ＲＰＥ細胞はＢＣＤのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療での治療の標的となる主要な細胞型であるため、ＲＰＥ細胞で充分な形質導入効率を持つＡＡＶ血清型が好ましい。さらに、次の要因が考慮された。ＣＹＰ４Ｖ２の発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、網膜、ＲＰＥ、角膜、及びリンパ球など様々なヒト組織及び臓器で広く観察され、ＢＣＤはＲＰＥに加えて、脈絡膜、光受容体、及び一部の患者では角膜にも影響を及ぼすこと、過去にＢＣＤ患者の皮膚線維芽細胞、リンパ球、及び血清でも異常が報告されていることから、ＲＰＥ細胞で形質導入効率の良いＡＡＶ血清型及びカプシド構造に加えて、ＲＰＥ細胞のみでのＡＡＶ形質導入に制限されず、他の細胞／組織、例えば光受容体、脈絡膜、及び／又は角膜を形質導入することができるＡＡＶ血清型及びカプシド構造を設計及び／又は選択することができる。結果として、広範囲のＡＡＶ血清型及びカプシド構造が適するものとなり、これらを使用することができる。ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、及びカプシド変異体ＡＡＶベクター（ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ））を研究のために選択した。形質導入効率に加えて、他に考慮された要因は、様々なＡＡＶ血清型に対する一般的集団の既存のＮＡＢ、及び患者間のその他の潜在的な個人差（非限定的な例として、他の種類の免疫応答（例えば、細胞内免疫又はＲＰＥ免疫）又は遺伝子型の違いによるもの（例えば、異なる変異）など）である。本設計では、潜在的な免疫応答を低下させ、様々な患者に対する治療効果を最大化するために、ＮＡＢとの低い交差反応性を共有する種類を含む複数のＡＡＶ型を使用及び試験した。
（ｃ）については、全長ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡは１５７８ｂｐ（開始コドン及び停止コドンを含む）であるため、ｓｓＡＡＶ及びｓｃＡＡＶのいずれの設計もＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療に使用することができる。ｓｓＡＡＶ及びｓｃＡＡＶの設計には、それぞれ、本明細書に記載のように独自の長所と短所がある。ｓｓＡＡＶと比較して、ｓｃＡＡＶ設計は発現が迅速でありＤＮＡ安定性が高い。ただし、パッケージングの制限（約２．４ｋｂ〜２．５ｋｂ）から、よりサイズが大きく、潜在的に活性の高い制御配列（例えば、プロモーター、ＰｏｌｙＡシグナル）の使用は制限される。さらに、使用するプロモーターのサイズに応じて、ｓｃＡＡＶ設計では、オプショナルな制御配列（例えば、エンハンサー）を短くしたり、省略したりする必要がある場合がある。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用するために、ｓｓＡＡＶベクター及びｓｃＡＡＶベクターの両方を設計及び作製した。ＡＡＶ２ゲノム（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号４２及び配列番号４３））及び上記（ｂ）に記載された各ＡＡＶ型からのカプシドを含む様々な偽型ＡＡＶを作製した。ｓｃＡＡＶについては、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲのうちの１つが切断された／変異したものであった（配列番号４４）。
（ｄ）については、本明細書に記載されるように、機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は複数存在する。さらに、多くの核酸配列が同じタンパク質をコードし得る。本研究では３つのｃＤＮＡを作製した。１つ目は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１、ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔと称する）、２つ目は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（配列番号２、ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）、３つ目は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能的バリアント（配列番号５）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３、ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖと称する）である。ｃＤＮＡ開始コドンの前にコザック配列（例示的な配列を配列番号３７又は配列番号３８に示す）が挿入された。
（ｅ）については、（ｂ）の理論的根拠と同様に、プロモーターは標的細胞（例えば、治療の標的細胞型がＲＰＥの場合はＲＰＥ細胞、標的細胞型が角膜細胞の場合は角膜細胞）の発現を促進するためにうまく機能する必要がある。プロモーターは、遺伝子治療ベクターの発現カセットの主要な要素である。最適なプロモーター選択により、標的特異性及び遺伝子発現を高めることができる。治療の対象となる細胞型又は組織型に応じて、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用されるプロモーターは、構成的プロモーターであっても細胞特異的プロモーターであってもよい（例えば、ＲＰＥ細胞に特異的なプロモーター、ＲＰＥ及び光受容体の両方に特異的なプロモーター、ＲＰＥ細胞及び脈絡膜細胞に特異的なプロモーター、ＲＰＥ、光受容体細胞、及び脈絡膜細胞に特異的なプロモーター、角膜細胞に特異的なプロモーター、ＲＰＥ、光受容体細胞、脈絡膜、及び角膜細胞に特異的なプロモーター、又は眼細胞に特異的なプロモーター）。ＣＹＰ４Ｖ２はほぼ遍在的に発現しており、複数の細胞型がＢＣＤで影響を受ける（主要なものはＲＰＥであり、他の細胞型には、例えば、角膜、網膜、リンパ球が含まれる）ので、この設計では、複数の組織型及び細胞型における発現カセット及び送達ベクターの効果を広げるために、構成的プロモーターを選択した。ｓｓＡＡＶベクターで使用される発現カセットには、強力な構成的プロモーターである、長さ約１．７ｋｂであるＣＡＧプロモーターを使用した（例示的な配列を配列番号３２に示す）。ＣＡＧプロモーター（ＣＢＡ、ＣＡＧＧＳ、又はＣＢプロモーターとしても知られる）は強力な合成プロモーターである。ＣＡＧプロモーターは、次の制御要素で構成されている：
（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、
（Ａ）ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーター領域と１番目のエクソン、及びニワトリのβアクチン遺伝子とウサギのβグロビン遺伝子からのキメライントロン、並びに
（Ｇ）ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプター。
ＣＡＧプロモーターは、哺乳動物細胞で発現を駆動するために最も一般的に使用される構成的プロモーターであるＣＭＶプロモーター（例示的な配列を配列番号４０に示す）よりも強力で持続的な活性を有するため使用された。ｓｃＡＡＶベクターで使用される発現カセットには、ｓｃＡＡＶのパッケージングサイズの制限により、はるかに短い構成的プロモーターである伸長因子１α短（ＥＦＳ）プロモーターを使用した（例示的な配列を配列番号３５に示す）。ＥＦＳプロモーターは、ＥＦ−１αプロモーター（約１．２Ｋｂ、例示的な配列を配列番号４１に示す）の小型化バージョンである。ＥＦ−１αプロモーターは、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）に由来する構成的プロモーターである。ＥＦＳプロモーターは、ｓｓＡＡＶの発現カセット設計にも使用できる。ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、及びＥＦＳプロモーターに加えて、他の構成的プロモーターを使用してもよく、非限定的な例として、ＣＭＶプロモーターなどの別のウイルスプロモーター；ｓｍＣＢＡプロモータープロモーター、ＣＢＳＢプロモーター、又はＣＢｈプロモーターなどのＣＡＧ（ＣＢＡ、ＣＡＧＧＳ、又はＣＢプロモーターとしても知られる）の誘導体又はバリアント；その他のβアクチンプロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター）；ＥＦ−１αプロモーターの誘導体又はバリアント；ＰＧＫプロモーター；ＵＢＣプロモーター；ＧＵＳＢプロモーター；ＵＣＯＥプロモーター；又は本明細書に記載の他のプロモーターが挙げられる。さらに、ＲＰＥにおける発現を駆動するために、細胞特異的プロモーターを用いることもでき、非限定的な例として、本明細書に記載の眼細胞特異的プロモーター、例えばＶＭＤ２（ＢＥＳＴ１としても知られる）プロモーター又はＲＰＥ６５プロモーターが挙げられる。
（ｆ）については、ｓｓＡＡＶで使用される発現カセット設計には、ｂＧＨポリＡ（例示的な配列を配列番号３４に示す）を使用し、ｓｃＡＡＶで使用される発現カセット設計には、より短いポリＡシグナルであるスモールポリＡ（ＳＰＡ）（例示的な配列を配列番号３６に示す）を使用した。ＳＰＡはｓｓＡＡＶの発現カセットでも使用することができる。代わりに、他のｐｏｌｙＡシグナル（誘導体又はバリアントを含む）も使用可能であり、非限定的な例として、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル（例示的な配列を配列番号３９に示す）、又は本明細書に記載の他のポリＡシグナル（非限定的な例として、上流エンハンサー（ＵＳＥ）と組み合わせて使用されるポリＡシグナルなど）が挙げられる。
（ｇ）について、ｓｓＡＡＶで使用される発現カセットでは、ＷＰＲＥエンハンサーを使用した（例示的な配列を配列番号３３に示す）。ｓｃＡＡＶで使用される発現カセットの設計では、サイズ制限があるため、エンハンサーは含めなかった。エンハンサーは、ｓｓＡＡＶでのＣＹＰ４Ｖ２発現カセットでもｓｃＡＡＶのＣＹＰ４Ｖ２発現カセットでもオプショナルであることに留意されたい。一方、ｓｃＡＡＶ ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットに、小型プロモーター及びポリＡシグナルと組み合わせて、短い長さのエンハンサー配列（例えば、ＷＰＲＥの最小γ及びα要素を含む短いＷＰＲＥ）を含めることが可能であることにも留意されたい。ＷＰＲＥに加えて、ＨＰＲＥエンハンサー又はＣＴＥエンハンサーなど、本明細書に記載の他のエンハンサーを使用してもよい。
いくつかの例では、ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、プロモーター（例えば、ＣＡＧ（ＣＢＡ、ＣＡＧＧＳ、ＣＢとしても知られる）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ｓｍＣＢＡプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター 、ＶＭＤ２プロモーター、又はＲＰＥ６５プロモーター）、エンハンサー配列（例えば、ＷＰＲＥエンハンサー、ＨＰＲＥエンハンサー、又は短縮型ＷＰＲＥ若しくはＨＰＲＥエンハンサー）と所望により結合している機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又はその機能的バリアント若しくは断片をコードするｃＤＮＡ）、及びポリＡシグナル（例えば、ｂＧＨポリＡ、ＳＰＡ、ＳＶ４０ポリＡ、又はそれらの断片又は誘導体（ＳＶ４０後期ポリＡなど））、並びに他の制御配列（例えば、コザック配列）を含む。例示的な配列については、配列番号１〜４１を参照。
（ｉ）配列（ＳＥＱ）セクションで提示される様々な制御配列の例示的な配列は本質的に例示的なものであり、同じ又は類似の機能を達成可能なこれらの制御配列の様々なバージョンがあること、及び（ｉｉ）使用可能なこれらの配列の様々なバリアント、断片、及び／又は誘導体（切断型ＣＡＧプロモーター、短縮型ＷＰＲＥエンハンサー、ＳＶ４０後期ポリＡなど）があることを理解されたい。
上記の設計アプローチに基づいて、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用する、以下を含む複数のＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ、ＣＹＰ４Ｖ２発現カセット、及びｒＡＡＶベクターを作製した。
（１）配列番号１、配列番号２、及び配列番号３にそれぞれ示す３つのＣＹＰ４Ｖ２。ｃＤＮＡ、ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ（配列番号１）及びＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ（配列番号２）はいずれもヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質（配列番号４）をコードする。ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ（配列番号３）は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の機能的バリアント（配列番号５）をコードする。
（２）２つのＣＹＰ４Ｖ２発現カセット（ＣＹＰ４Ｖ２は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質又は機能的ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸配列を表す。模式図は図７を参照）
（ｉ）ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ
（ｉｉ）ＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２−ＳＰＡ
（３）上記のＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ及びＣＹＰ４Ｖ２発現カセットを６つの異なるＡＡＶベクター（ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、及びＡＡＶ９）にパッケージングし、ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ及び発現カセットを含む以下のｒＡＡＶベクターを作製した。これらにはｓｓＡＡＶ及びｓｃＡＡＶベクターコンストラクトの両方を含む。
（ｉ）組換えＡＡＶ２／２−ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ（本明細書ではＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）、
（ｉｉ）組換えＡＡＶ２／２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）−ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ（本明細書ではＡＡＶ２ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ）．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ又はＡＡＶ２ｔｒｉ．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）、
（ｉｉｉ）組換えＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ（本明細書ではＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）、
（ｉｖ）組換えＡＡＶ２／５−ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ（本明細書ではＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔと称する）、
（ｖ）組換えＡＡＶ２／８−ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ（本明細書ではＡＡＶ８．ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖと称する）、
（ｖｉ）組換え自己相補的ＡＡＶ２／１−ＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＳＰＡ（本明細書ではｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）、
（ｖｉｉ）組換え自己相補的ＡＡＶ２／５−ＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＳＰＡ（本明細書ではｓｃＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）、及び
（ｖｉｉｉ）組換え自己相補的ＡＡＶ２／９−ＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ−ＳＰＡ（本明細書ではｓｃＡＡＶ９．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐと称する）。
ｒＡＡＶベクターにパッケージングする際、発現カセットは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号４２及び配列番号４３）に隣接させた。ｓｃＡＡＶの場合、ＡＡＶ２ ＩＴＲの１つは切断されている／変異している（配列番号４４）。非ＡＡＶ２ ＩＴＲなどの非ＡＡＶ２ゲノムも発現カセットをパッケージングするために使用できることは理解されるであろう。ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡの直前にはコザック配列（配列番号３７又は配列番号３８）が挿入された。これらの発現カセットの設計を示す模式図については、図７を参照。ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡは異なる発現カセットにパッケージングしてもよいこと、またＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは異なるＡＡＶベクターにパッケージングしてもよいことは理解されよう。例えば、ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ ｃＤＮＡは、ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ発現カセットにおいてもＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２−ＳＰＡ発現カセットにおいても使用できる。ＣＡＧ−ＣＹＰ４Ｖ２−ＷＰＲＥ−ｂＧＨポリＡ発現カセット又はＥＦＳ−ＣＹＰ４Ｖ２−ＳＰＡ発現カセットは、いかなる適切なＡＡＶベクターにもパッケージング可能であり、非限定的な例としてＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８ （Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ４、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、及び他のベクターが挙げられる。組換えｓｃＡＡＶベクターを作製するために、ｓｃＡＡＶ設計を任意の適切なＡＡＶベクター（例えば、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ２、ｓｃＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ｓｃＡＡＶ５、ｓｃＡＡＶ８、ｓｃＡＡＶ８ （Ｙ７３３Ｆ）、ｓｃＡＡＶ３、ｓｃＡＡＶ４、ｓｃＡＡＶ６、ｓｃＡＡＶ７、ｓｃＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１２など）で使用してもよい。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療のために他のベクター（例えば、レンチウイルスベクター又はプラスミド）を設計する際にも、同様の設計プロセスを使用できることが理解されよう。ベクターの種類に応じて、上記の特定の要素は必須ではないこともあり、また状況に応じて調整される必要がある場合もある（例えば、プロモーター配列）。
本明細書で規定されるｃＤＮＡ、制御配列、ＡＡＶ型及び設計に加えて、ＣＹＰ４Ｖ２発現カセット及び送達ベクターの各主要要素の他の設計オプションを使用することもできる。標的細胞型における様々なＡＡＶ型の形質導入効率及び様々なプロモーターの強度を比較する方法の例は本明細書の実施例セクションに記載されている。発現カセット及び送達ベクターにおける他の主要な要素の設計オプションを評価及び比較するために同様の方法を用いることもできる（例えば、ｃＤＮＡ、エンハンサー、ポリＡシグナル、ｓｓＡＡＶ ｖｓ． ｓｃＡＡＶ、ＡＡＶ ｖｓ． ＨＳＶなど）。さらに、本明細書で提示されるように、ＣＹＰ４Ｖ２発現カセット及び送達ベクターの効率は、ＢＣＤ細胞モデル（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）での試験を通じて、本明細書に記載の方法、及び／又は、生化学的異常、ＲＰＥ機能若しくは萎縮を評価する他の方法を用いて評価及び比較することができる。
上述のＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ、発現カセット、及び送達ベクターを、ＢＣＤ患者特異的ヒトｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系で試験した。結果を以下の実施例で示し検討する。
さらに、様々な制御因子配列間（非限定的な例として、ＩＴＲとプロモーターとの間、エンハンサーとポリＡシグナルとの間、又はポリＡシグナルとＩＴＲとの間）又は制御配列とｃＤＮＡとの間（非限定的な例として、プロモーターとｃＤＮＡとの間、ｃＤＮＡとエンハンサーとの間、又はｃＤＮＡとポリＡシグナルとの間）のジャンクション／リンカー配列も、標的遺伝子（ＣＹＰ４Ｖ２など）の発現を制御する役割を果たしている可能性がある。本研究で使用した異なるＣＹＰ４Ｖ２発現カセットの配列（ＩＴＲ及びジャンクション／リンカー配列を含む）を、後述の実施例１１に挙げる。
本実施例で検討される特定の制御配列及びＩＴＲ配列の例示的な配列を、以下に提示する。
（実施例１０−ＢＣＤ細胞モデルを使用して、ＡＡＶ血清型とキャプシド構造、プロモーターと他の制御配列活性、及びｃＤＮＡ発現量、並びにＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療におけるベクターの全体的な有効性及び投与量を試験、比較、スクリーニングし、様々な患者毎に個別化された最適なベクター及び投与量を評価する方法）
ＢＣＤ細胞モデル（例えば、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系、又は人工的に作製されたＣＹＰ４Ｖ２変異を含むＥＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＲＰＥ、若しくはＲＰＥ細胞系）は、薬物及び用量のスクリーニングに使用することができる。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の様々な構成要素と投与量を試験、比較、及びスクリーニングするために、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ試料を使用した（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットとＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡにおける、ベクター型（ＡＡＶ血清型やカプシド構造など）、プロモーター、エンハンサー、ポリＡシグナル、及び他の配列、並びにベクターの全体的な有効性及び投与量など）。表現型レスキューを用いて、有効性を試験及び比較した。
様々な血清型のベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）、カプシド（例えば、カプシド変異を有するＡＡＶ（ＡＡＶ２ ｖｓ． ＡＡＶ２ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ）など）、又は構造（例えば、ｓｃＡＡＶ ｖｓ． ｓｓＡＡＶ）を、同じ発現カセットを持つ異なるベクターを使用して比較して、試験することができる。例えば、ＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ＡＡＶ２ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ）．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、及びＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐは全て同じ発現カセットを持っているが、ＡＡＶ血清型／カプシドが異なる。ｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ｓｃＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、及びｓｃＡＡＶ９．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐは全て同じ発現カセットを共有しているが、ＡＡＶ血清型は異なる。表現型レスキュー結果を使用して、ＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡをＢＣＤ患者ＲＰＥ細胞に伝達及び送達する際の、ＡＡＶ血清型／カプシド（例えば、ＡＡＶ２ ｖｓ． ＡＡＶ２ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ） ｖｓ． ＡＡＶ５）及び構造（例えば、ｓｃＡＡＶ５ ｖｓ． ｓｓＡＡＶ５）の効率の違いを試験及び比較することができる。
（試験及び比較された要素以外は）同じコンストラクトのｒＡＡＶベクターの表現型レスキュー効力を試験することにより、同じ方法を使用して、異なる発現カセット、ｃＤＮＡ、又は制御配列若しくは他の配列（例えば、ジャンクション／リンカー配列）の活性レベルを試験及び比較することができる。
さらに、実施例に記載の通り、治療有効用量範囲（細胞あたりのＭＯＩで測定）を評価するために、同じベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐなど））の異なる用量（例えば、１×１０ｅ４及び１×１０ｅ５）を同じ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ試料に適用してもよい。
さらに、ＢＣＤ細胞モデルが個人差を示した場合、これを使用して、各患者に個別化した最適な投与量及びベクターコンストラクトを個別に評価及び発見することもできる。
より関連のある検討については、本明細書の関連する実施例及び開示を参照。
（実施例１１−機能的なＣＹＰ４Ｖ２をコードする核酸配列及び発現カセットを保有する様々な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの作製）
ＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ＡＡＶ２ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ）．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ、ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ＡＡＶ８．ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ、及びｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐを含む、本研究用に設計された様々なＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクター（本明細書の実施例を参照）は、Ｖｅｃｔｏｒ ＢｉｏＬａｂｓ（米国ペンシルベニア州マルバーン）に特注した。Ｖｅｃｔｏｒ ＢｉｏＬａｂｓの組換えＡＡＶベクターはヘルパーフリーである。製造プロセスは以下を含む：
（１）関連するＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ（すなわち、ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ、ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、又はＣＹＰ４Ｖ２ｆｖ）及びＣＹＰ４Ｖ２発現カセットの制御配列を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ含有プラスミドであるｐＡＡＶシスプラスミドをクローニングすること、
（２）Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ Ｍｅｇａ Ｐｒｅｐキットを使用した、ｐＡＡＶシスプラスミド及び補充プラスミド（関連するＡＡＶ Ｒｅｐ−Ｃａｐ遺伝子を保有するプラスミド、及びアデノウイルスから分離されたヘルパー遺伝子を提供するプラスミド）の大規模な調製、
（３）上記の３つのプラスミドのＨＥＫ２９３細胞のプレートへの大規模なコトランスフェクション、
（４）トランスフェクションの２日後、細胞ペレットを回収し、３サイクルの凍結／解凍を使用してウイルスを放出した。ＣｓＣｌ勾配超遠心分離を使用してＡＡＶウイルスを精製した後、脱塩した。さらに、
（５）リアルタイムＰＣＲを使用してウイルス力価（ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ）を決定した。
精製したｒＡＡＶベクターは、使用するまで−８０℃で保存した。
本研究用の様々なＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターにパッケージングされた様々なＣＹＰ４Ｖ２発現カセット（ＩＴＲ及びジャンクション／リンカー配列を含む）の配列を以下に示す。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療におけるＣＹＰ４Ｖ２ｓｔとＣＹＰ４Ｖ２ｏｐとのｃＤＮＡの有効性の違いを評価するために、同じプロモーター（ＣＡＧ）、エンハンサー（ＷＰＲＥ）、及びポリＡ（ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡ）並びに同じジャンクション／リンカー配列を持ち、１つはＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ ｃＤＮＡ（ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ（配列番号６１））を保有し、もう１つはＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ ｃＤＮＡ（ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ（新規）（配列番号６３））を保有する、２つのＡＡＶ５ベクターを、本明細書に記載の細胞生存率アッセイを用いて、ＢＣＤ患者由来ｉＰＳ−ＲＰＥでのＲＰＥ萎縮のレスキューの有効性について比較する。
配列番号６０及び配列番号６３で使用される異なるジャンクション／リンカー配列がＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ又は発現カセットの発現に影響を及ぼすかどうかを評価するため、同じプロモーター（ＣＡＧ）、エンハンサー（ＷＰＲＥ）、及びポリＡ（ｂＧＨ−ポリＡ）並びに同じＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ（ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ（配列番号２））を有するがジャンクション／リンカー配列は異なる２つのＡＡＶ５ベクター（ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ（配列番号６０）及びＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ（新規）（配列番号６３））を、本明細書に記載の細胞生存率アッセイを用いて、ＢＣＤ患者由来ｉＰＳ−ＲＰＥでのＲＰＥ萎縮のレスキューの有効性について比較する。
本明細書で提示される発現カセット配列に含まれるＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡの代わりに、異なるＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ（配列番号１、２、３、又はその他）を、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療での使用目的で、本明細書に記載の任意のＣＹＰ４Ｖ２発現カセットで使用できることを理解されたい。本明細書に記載の各ＣＹＰ４Ｖ２発現カセットは、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用するための、本研究で使用したもの（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９）とは異なるものを含む様々な血清型／カプシドのｒＡＡＶベクターにパッケージングすることができることを理解されたい。そして、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用するために、本研究で使用したｓｃＡＡＶベクターにパッケージングされたＣＹＰ４Ｖ２発現カセットを、ｓｃＡＡＶコンストラクトで使用される変異体ＡＡＶ ＩＴＲをｓｓＡＡＶコンストラクトで使用される非変異体ＡＡＶ ＩＴＲに変更した後、ｓｓＡＡＶベクターにパッケージングしてもよい。さらに、本明細書に記載のＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡ又は発現カセット（ＡＡＶ ＩＴＲを有するもの、又は有しないもの）を、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で使用するために、他のウイルスベクター（すなわち、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はその他のウイルスベクターなどの非ＡＡＶベクター）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド、ナノ粒子、又は脂質ベースのナノ粒子（例えば、リポソーム−プロタミン−ＤＮＡ複合体（ＬＰＤ））にパッケージングしてもよい。
（実施例１２−ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２によるＢＣＤ患者由来ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の治療）
無血清ＲＰＥ培地中で、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞に上記の様々なＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターを感染させた。１日後、ウイルス含有培地を新鮮な血清含有ＲＰＥ培地と交換してＲＰＥ培養を続けた。異なる用量の治療効果を評価するために、異なる感染多重度（ＭＯＩ）、ゲノムコピー（ＧＣ）／細胞）を試験した。
（実施例１３−ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の効果を評価するためのアッセイ）
ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２感染後、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を、試験のために細胞を収集する前に、ｓｃＡＡＶの場合は少なくとも４日間、ｓｓＡＡＶの場合は少なくとも１０日間ＲＰＥ培地で培養した。その後、前述の通り、細胞採取プロトコル及び試料調製プロトコルを行った。
ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置ＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞において、脂肪酸、セラミド（Ｃｅｒ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、及びスフィンゴシンとスフィンガニン（ＳＯＳＡ）を検出するための本明細書の実施例に記載されている生化学的試験を実施した。その後、ＬＣ−ＭＳを使用して同じ生化学的試験プロトコルを実施した。上記の表３は、健康な対照のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞；ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置なしのＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、及びＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置後のＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞における結果を示す。
結果は、ＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の表現型（例えば、対照と比較した異常な脂肪酸レベル（例えば、ＤＨＡ、ＡＡ、及びｎ３脂肪酸の合計））がＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療によって改善又は修正されたことを示した。これにより、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系におけるＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の有効性が証明された。ＢＣＤは主にＲＰＥ変性によって引き起こされるため、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系におけるＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の有効性は、ＢＣＤ患者に対するＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の有効性を証明した。
重要なことに、ｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによる処置により、非常に短い期間（処置後わずか４日）で最も顕著な改善が達成された。これは、ｓｃＡＡＶが相補ＤＮＡ鎖を合成するための細胞機構を必要としないため、速効性であることを証明している。同じ理由で、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置と試験用の細胞収集との間の時間枠が長くなると（特にｓｓＡＡＶベクターにパッケージングされたＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の場合）、結果が大幅に改善されることが予想される。
ヒトＲＰＥ細胞でｓｃＡＡＶベクターによって達成された迅速且つロバストな結果は、ｓｃＡＡＶベクターがＲＰＥ又は網膜変性の早期発症疾患及び／又は後期段階のヒト患者のレスキューに特に有用となり得ることを証明した。さらに、ｓｃＡＡＶベクターのロバストな発現プロファイルにより、網膜への送達のための硝子体内投与にも適するものとなっている。
ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２によるＲＰＥ萎縮のレスキュー
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料を１時間青色光に暴露し、次いで翌日、本明細書で前述したように試料で細胞生存率アッセイを実施した。
ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置を行った場合と行っていない場合の患者ｉＰＳ−ＲＰＥ試料を比較した細胞生存画像を、本明細書の図面に示す。
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料において、ＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ及びｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによる処置はいずれも、未処置の患者試料と比較して、ＲＰＥ萎縮のレスキューを示した（図８、ＭＯＩ＝１×１０ｅ５ＧＣ／細胞）。興味深いことに、１×１０ｅ５ ＭＯＩでのＡＡＶ２．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ及びｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによるレスキュー効果は、Ｐ１ ｉＰＳ−ＲＰＥよりもＰ２ ｉＰＳ−ＲＰＥでの方が高くなっている。これは、ＢＣＤを治療するためのＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の使用に最適な投与量は、患者間の個人差によって異なる可能性があり、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥは、様々な患者の個別化した最適投与量を評価するのに役立つツールであることを示唆している。
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料において、ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔ、及びＡＡＶ８．ＣＹＰ４Ｖ２ｆｖによる処置はいずれも、未処置の患者試料と比較して、ＲＰＥ萎縮をレスキューした（図９、ＭＯＩ＝１×１０ｅ５）。
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料において、ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、ｓｃＡＡＶ１．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ、及びｓｃＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによる処置はいずれも、未処置の患者試料と比較して、ＲＰＥ萎縮をレスキューした（図１０、ＭＯＩ＝１×１０ｅ４）。
ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ試料において、ｓｃＡＡＶ９．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐによる処置は、未処置の患者試料と比較して、ＲＰＥ萎縮をレスキューした（図１１、ＭＯＩ＝１×１０ｅ５、処置後２週間）。
重要なことに、Ｐ２試料での低用量（ＭＯＩ＝１×１０ｅ４）でのＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置は、Ｐ１試料での同じベクターによる高用量（ＭＯＩ＝１×１０ｅ５ＧＣ／細胞）の処置と同様又はより良い結果を達成した。これは、細胞レベルで、ＲＰＥ萎縮のレスキューにおいて同じ又は同様の効果を達成するために、異なる患者は異なる投与量を必要とする可能性があることを実証した。言い換えれば、同じ病気の全ての患者に対する１つのベクターと１つの同様の用量レベルは、遺伝子治療のための医学的又は経済的に最も効率的なアプローチではない可能性がある。ＢＣＤ細胞モデル及び他の眼疾患の同様の細胞モデルは、個別化した最適な用量に関する指針を提供することができる。
他のＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターも試験され、ＡＡＶ２ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ）．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ処置（ＭＯＩ＝１×１０ｅ４）及び異なるＭＯＩレベル（１×１０ｅ４ＧＣ／細胞及び１×１０ｅ５ＧＣ／細胞）でのＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｏｐ（新規）（配列番号６３）処置したものを含む、ＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ試料でＲＰＥ萎縮の改善が示された。
さらに、ｉＰＳ−ＲＰＥ試料の死細胞数及び生細胞数をカウントするために、ＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）によって細胞生存画像を画像処理した。各試料の４つの異なる領域／画像を使用してカウントし、同じ試料の複数の画像の死細胞／生細胞比を平均化した。死細胞／生細胞比は、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置がＢＣＤ患者由来ｉＰＳ−ＲＰＥのＲＰＥ細胞萎縮をレスキューしたことを実証した。例えば、ＷＴ２の死細胞／生細胞比は３．０％、Ｐ１（ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置なし）では２０．８７％、ＡＡＶ５．ＣＹＰ４Ｖ２ｓｔで処置されたＰ１では９．６９％である。他のＡＡＶ．ＣＹＰ４２ベクターによる処置も、ＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ試料の死細胞／生細胞比を低下させた。
これらの結果により、
（１）様々なＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクター、発現カセット、及びＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡがＢＣＤのＲＰＥ萎縮をレスキューしたこと、
（２）自己相補的なＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）はレスキュー効果の達成が速いこと、及び
（３）有効性は異なる用量レベルで達成される可能性があること
が実証された。
（実施例１４−ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターの安全性、及び臨床上の使用のためのＧＭＰ製造）
過去の研究では、ＣＹＰ４Ｖ２は人間の臓器でほぼ遍在的に発現され、眼のなかでは網膜で高発現レベルであることが示されてきた。さらに、他の疾患の遺伝子治療研究及び臨床試験において、ＡＡＶベクターの安全性が確立されている。したがって、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターは遺伝子治療で安全に使用できると予想することは妥当である。
本研究では、様々なＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターを使用して、高用量（例えば、１×１０ｅ５ ＭＯＩ）でヒトｉＰＳ−ＲＰＥ試料を処置した。上記実施例で説明したように、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２がＢＣＤ患者由来ｉＰＳ−ＲＰＥ試料のＲＰＥ萎縮をレスキューしたことを除いて、未処置試料とＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置試料との間で細胞死に関する重要な違いは観察されなかった。これにより、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターの安全性が実証され、毒性の顕著な証拠なしに、形質導入されたＣＹＰ４Ｖ２をコードする遺伝子の高レベルの発現を達成できることが実証された。
細胞系での試験に加えて、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療の安全性は、マウス、ラット、又は非ヒト霊長類などの動物において、及び／又はヒト臨床試験によっても試験することができる。
ヒトの臨床使用のための組換えＡＡＶベクターを生産するための様々な製造方法及びプラットフォームが利用可能である。例えば、限定されるものではないが、ｒＡＡＶベクターのＧＭＰ製造では、２プラスミドトランスフェクション法又は３プラスミドトランスフェクション法を使用可能であり、ＨＥＫ２９３、Ａ４５９、又は２９３Ｔなどの哺乳類細胞系、又はバキュロウイルス／Ｓｆ９細胞プラットフォームなどの昆虫細胞系を使用可能であり、接着細胞培養又は浮遊細胞培養を使用可能である。さらに、非限定的な例として、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースの生産システム、使い捨てバイオリアクター（例えば、ｉＣＥＬＬｉｓ）、ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ容器、ローラーボトル、カラムクロマトグラフィーなどの様々な方法、プロセス、及び／又はプラットフォームを使用して、収量又は力価を増加したり、純度を向上させたり、コンタミネーションの可能性を回避したりすることができる。これらのｒＡＡＶベクターの臨床上の生産方法、プロセス、技術、及びプラットフォームは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｌｏｎｚａ（米国）、Ｃｏｂｒａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（イギリス）、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＮＣＨ；米国オハイオ州）、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＣＨＯＰ；米国）、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（中国及び米国）などの受託製造機関（ＣＭＯ）又は学術ＧＭＰ施設を介して利用可能である。ヒト臨床使用のためのＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターは、本明細書に記載の方法、プロセス、技術、プラットフォーム、及びＧＭＰ施設の任意の１又は複数、及び／又は当技術分野で公知又は将来開発される他のものを使用して製造することができる。
（実施例１５−ＢＣＤを治療するための被験者選択及びインビボでのＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２投与）
ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ヒト臨床試験の被験者の例示的な適格基準は以下の通りである。
選択基準
被験者は、以下の選択基準の全てを満たしている場合、研究参加に適格である。
１．研究への参加についてインフォームドコンセントを提供する意思があり、提供が可能である。
２．１８歳以上である。
３．両アレルＣＹＰ４Ｖ２変異の遺伝的に確認された診断を有する。
４．研究対象の眼の黄斑部に臨床的に視認可能な活動性の疾患を有する。
５．研究対象の眼における最高矯正視力（ｂｅｓｔ ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｖｉｓｕａｌ ａｃｕｉｔｙ（ＢＣＶＡ））がＥＴＤＲＳ視力検査表で３４〜７３文字である（２０／４０スネレン視力以下２０／２００スネレン視力以上）。
除外基準
被験者は、以下の除外基準のいずれかに該当する場合、研究参加に不適格である。
１．対象の眼に弱視の既往歴がある。
２．ＡＡＶで治療した場合、３か月間、バリア避妊法を使用する意思がない。
３．最初の来院前３か月以内に研究対象の眼で眼内手術が行われた。
４．治験責任医師の意見で、研究へ参加することで被験者を危険にさらしたり、研究の結果や被験者の研究参加能力に影響を与えたりする可能性のある他の重大な眼又は眼以外の疾患／障害がある。これには、以下の被験者が含まれるが、これに限定されない：
・経口コルチコステロイド（プレドニゾロン／プレドニゾンなど）が禁忌である。
・臨床的に重要な白内障を有する。
・治験責任医師の臨床的意見では、手術（例えば、網膜下手術）の適切な候補者ではない。
５．過去１２週間に治験薬に関する別の研究に参加した、又は以前に遺伝子／細胞ベースの治療を受けた。
ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２を使用してＢＣＤを治療する場合、患者は遺伝的又は分子的に確認されたＢＣＤの診断、つまり、遺伝子検査（単一遺伝子検査、又は医学的に必要な場合は複数遺伝子パネル検査）による両アレルＣＹＰ４Ｖ２変異の確認を受ける必要がある。ＢＣＤは遺伝性網膜障害（ＩＲＤ）、網膜変性（ＲＤ）、又は網膜色素変性症（ＲＰ）と診断されることがあるため、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２は、遺伝的に確認された両アレルＣＹＰ４Ｖ２変異を有するＩＲＤ、ＲＤ、又はＲＰの患者の治療にも使用しうる。
インビボでのＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２治療の場合、患者は光干渉断層法（ＯＣＴ）及び／又は検眼鏡検査で判定される生存網膜細胞を持っている必要がある。患者には、治療対象の眼ではいくらかの視力が残っていることが好ましい（例えば、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が２０／２００（小数では０．１）以上）。
インビボでＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターを標的細胞（例えば、網膜細胞又は角膜細胞）に送達するためには様々な手段／投与経路を使用することができ、限定されるものではないが、網膜への投与は、網膜下注射、硝子体内注射（ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ ７ｍ８、又はそれらの誘導体などの硝子体内送達に適したＡＡＶベクターを使用）を介して行ってもよく、血流を介した送達（例えば、ＡＡＶ９又はＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂなどの血液網膜関門を貫通できるＡＡＶベクターを使用）を介して行ってもよい。さらに、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターは、投与方法として硝子体内に埋め込むためのデバイスにカプセル化してもよい。
遺伝子治療に関連する外科的／投与方法、並びに送達／形質導入効率を改善するいくつかの技術（例えば、内境界膜（ＩＬＭ）剥離及び硝子体切除術（ＶＩＴ））は、当技術分野で公知である。免疫応答を最小限に抑えるために、ＡＡＶ投与前、投与時及び／又は投与後に免疫抑制剤（コルチコステロイドなど）を使用してもよい。
インビボで患者を治療することに加えて、細胞療法として標的細胞（例えば、ＢＣＤ患者のｉＰＳ由来のＲＰＥ細胞、網膜細胞、角膜上皮細胞、又は角膜細胞）をインビトロで治療し、その後そのような細胞を患者に移植するためにＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療（ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療など）を使用してもよい。ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターを使用してＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を治療する方法は、本明細書の実施例及び開示で提供される。網膜や角膜などへの細胞移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）の方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＥＳ−ＲＰＥ細胞を網膜に移植するためのものと同じ又は類似の方法及び外科技術を使用して、ＢＣＤ患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を移植することができる。
治療有効用量は、疾患モデル（例えば、ＢＣＤ細胞モデル（例えば、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系））又は動物モデルで決定及び評価し、臨床試験で確認又は改良することができる。インビトロでの細胞の治療では、投与量は通常ＭＯＩとして表され、その後、治療される細胞の数をＭＯＩに乗じる。ＭＯＩは通常、細胞あたり約１×１０３ＧＣから約１×１０６ＧＣの範囲内であるか、又は細胞あたり約１００〜約１０，０００ＧＣの感染性ＭＯＩ（ＧＣ：ゲノムコピー、ゲノムを含むＡＡＶ粒子（ベクターゲノム（ｖｇ）又はゲノム粒子（ｇｐ）としても知られる）を測定する）の範囲内である。インビボ治療では、用量を決定するために、投与経路、標的とする領域の面積又は細胞の数、及び治療対象（例えば、治療対象の年齢、体重、疾患進行度、及び状態、並びに潜在的な免疫反応）、並びに治療の対象となる細胞の位置（例えば、網膜 ｖｓ． 角膜）などの代表的な臨床的要因を考慮する必要がある。さらに、使用するＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクターの形質導入効率及びレスキューの有効性も考慮する必要がある。最後に、可能であれば、患者間の細胞レベルでの最適用量の個人差も考慮する必要があり、これは患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞で評価することができる。よって、インビボでの眼への１回の局所投与の治療上有効な用量は、約１×１０６ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣのオーダー（例えば、約１×１０１１ＧＣ〜約１×１０１２ＧＣの高用量範囲、約１×１０１０ＧＣ〜約１×１０１１ＧＣの中用量範囲、約１×１０９ＧＣ〜約１×１０１０ＧＣの低用量範囲、約１×１０６ＧＣ〜約１×１０９ＧＣの超低用量範囲、及び約１×１０１２ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣの超高用量範囲）、又はこれらの範囲内であって所望の効果を提供するのに充分な任意の用量であってよい。一実施形態では、組成物は、約１×１０６ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣの用量で投与される。別の実施形態では、インビボ投与量は、治療の標的となる細胞数に標的ＭＯＩ（例えば、細胞あたり約１×１０３ＧＣ〜約１×１０６ＧＣ）を乗じて決定される。眼への任意の１回の局所投与におけるｒＡＡＶベクターを含む薬剤の体積は、約１μＬ（０．００１ｍＬ）〜約１０００μＬ（１ｍＬ）の範囲内であり得る。血流を介した送達による治療は、はるかに高い用量を必要とし、体重１ｋｇあたり約１×１０６〜約２×１０１４ＧＣの範囲内となりえる。
詳細については「Ｅ．治療オプション、対象の選択及び投与」及び本明細書の他の開示を参照。
（実施例１６−治療後の評価）
ＢＣＤの臨床症状は、例えば、視力の低下、視野の制限、夜間失明、暗順応、コントラスト感度及び色覚の低下、網膜の変化（及び一部の患者では角膜）、網膜電図（ＥＲＧ）の反応低下などの他の多くの種類のＩＲＤ、ＲＤ、及びＲＰの臨床症状と類似しているため、関連する評価基準を使用してＢＣＤ患者の治療前後の病状及び進行を評価することによって治療結果を評価することができる。これらの評価基準並びに関連する検査及び試験は、網膜疾患及び角膜疾患について当技術分野で公知である。例えば、限定されるものではないが、最高矯正視力（視力チャートを使用）は、ＢＣＤ遺伝子治療の主要評価項目として使用することができ、また次の１又は複数を副次的評価項目として使用することができる：微小視野測定（感度の変化）、眼底自発蛍光（ＡＦ）（ＡＦの変化）、光干渉断層法（ＯＣＴ）（楕円体領域及び網膜の厚さ）、コントラスト感度（Ｐｅｌｌｉ−Ｒｏｂｓｏｎチャート）、色覚（Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ−Ｍｕｎｓｅｌｌ １００ヒューテスト）、及びＥＲＧ（ＥＲＧの変更）。さらに、モビリティテストなどの機能テストを主要評価項目又は副次的評価項目として使用してもよい。評価は、治療後の異なる時点、例えば、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、及び１２か月の時点で実施することができる。結果は療結果を評価するために使用することができる。有効性は、次のいずれかとして示すことができる：主要評価項目及び副次的評価項目の１又は複数の改善、病気の進行停止、又は網膜変性若しくは視力喪失の予想より遅い進行（必要であれば、自然経過の研究からデータを使用）。
（実施例１７：免疫応答を低減し遺伝子治療の個人差に対処する方法）
ウイルスベクター媒介遺伝子治療は、細胞性、局所性、又は全身性の免疫応答を引き起こし、安全性のリスクを生じる可能性がある。免疫反応はまた、形質導入効率を低下させ、それによりウイルスベクター媒介遺伝子治療の治療効果を低下させる可能性がある。免疫応答は、リンパ液又は血液中の抗原又は病原体を認識する「体液性応答」（すなわち抗体媒介性応答）、及び／又は細胞性免疫の形で発生する可能性がある。免疫応答を最小限に抑えるために、遺伝子治療の投与に伴ってコルチコステロイドなどの免疫抑制剤がよく使用される。免疫抑制剤は、眼圧上昇、白内障、その他の有害事象（例えば、免疫抑制剤の長期使用は癌のリスクを高める可能性がある）などの影響をひきおこす。免疫応答に加えて、例えば、異なる種類のベクター（異なる血清型又は異なるカプシド変異／構造など）に対する応答、又は同じ用量の同じベクターに対する応答などにおける、他の患者間の個人差が存在する。
ウイルスベクター媒介遺伝子治療において、ウイルスベクターに対する免疫応答を低下させ、形質導入効率を維持し、ウイルスベクター及び／又は免疫抑制剤の用量を低下させ、及び／又は同じ遺伝疾患の様々な患者に対する治療効果を最大化する方法であって、
（ａ）前記遺伝子治療のための標的細胞型において充分な形質導入効率を持つ複数の組換えウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）のプールを確立すること（ウイルスベクターのプールは、抗原領域変異若しくは他の変異を有するバリアント又は前記ウイルスベクターのカプシドのバリアントを、前記疾患に関連する標的細胞（例えば、ＢＣＤに対するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療におけるｉＰＳ−ＲＰＥ又はＲＰＥ細胞系）において上記変異又はバリアントが充分な形質導入効率を有することが確認された後で作製することにより拡大できる）、
（ｂ）遺伝子治療を必要とする対象における様々なウイルスベクター血清型及び／又はカプシド変異又はバリアントに対する既存の中和抗ウイルスベクター抗体（ＮＡｂ）を検出し、及び／又は上記対象に由来する患者特異的疾患標的細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）において様々なウイルスベクターを試験及び比較すること、
（ｃ）前記ウイルスベクターのプールから、
（ｉ）前記疾患標的細胞における充分な形質導入効率、
（ｉｉ）前記対象の既存のＮＡｂとの低い交差反応性、及び／又は
（ｉｉｉ）前記対象の患者特異的疾患標的細胞（例えば、ＢＣＤのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療における患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ又はＲＰＥ細胞系）における良好な表現型レスキュー結果、
を有するウイルスベクターを選択することであって、
上記ウイルスベクターのプールは、様々な血清型及び／又はカプシド改変ウイルスベクター（例えば、カプシド変異体ＡＡＶ及び／又はカプシドタンパク質バリアントＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない）を含む、
前記選択すること、
（ｄ）（ｃ）から選択された前記ウイルスベクターを前記対象への投与に使用すること、及び
（ｅ）前記対象が遺伝子治療の投与を必要とするたびに、上記（ｂ）〜（ｄ）（既存のＮＡｂに関連する部分のみ）を繰り返すこと（例えば、限定されるものではないが、同じ臓器（例えば、眼又は反対側の眼）又は別の臓器へのフォローアップ投与）、
を含む、
方法。
具体的には、５つの異なるＡＡＶ（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９）血清型及びカプシド変異ＡＡＶ（ＡＡＶ２．ｔｒｉ（Ｙ−Ｆ））を含む様々なｒＡＡＶベクターを作製し、本研究で異なる患者の細胞系間の違いを評価するために試験した。
（実施例１８：網膜疾患の迅速なレスキューにおけるｓｃＡＡＶの使用、及び眼疾患の治療におけるｓｃＡＡＶ又はＡＡＶベクターにおけるＥＦＳ及び／又はＳＰＡの使用）
上記の実施例１３で実証されているように、ｓｃＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２処置は、非常に短い時間（わずか４日間）で、ＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞における生化学的表現型の強力なレスキューを達成した。さらに、ｓｃＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２は、ＡＡＶ処置の２週間後にＢＣＤ患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系でＲＰＥ萎縮のレスキューを示した（図１１を参照）。ｓｃＡＡＶベクターにおけるＥＦＳプロモーター（例示的な配列を配列番号３５に示す）及びＳＰＡ（例示的な配列を配列番号３６に示す）によって駆動される、ヒトｉＰＳ−ＲＰＥ細胞における迅速かつロバストな発現は、ＥＦＳプロモーター及び／又はＳＰＡがヒト眼細胞における導入遺伝子発現の促進及びヒト眼疾患の治療に適していることを実証した。ＥＦＳプロモーター及びＳＰＡを備えたｓｃＡＡＶベクターによって達成された迅速なレスキューにより、ｓｃＡＡＶベクターは急速に進行する疾患又は進行した疾患段階の患者の治療に特に有用になる。
さらに、本研究により、ヒト網膜細胞におけるｓｃＡＡＶ設計の迅速かつロバストな発現が証明された。これによりｓｃＡＡＶを介した遺伝子治療は、早期発症の網膜疾患患者の治療や、迅速なレスキューを必要とする後期患者の治療に特に役立つものとなる。
（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療についての検討）
ＢＣＤは希少な、失明に至る疾患であり、現在承認された治療法は存在しない。ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系の使用を含む臨床研究において、本研究では、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の表現型をレスキューするための様々なＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２ベクター及び発現カセットの設計の有効性が、脂肪酸及び脂質アッセイによる評価により証明された。さらに、異なる用量（ＭＯＩ）で試験を実施した。これは、インビボでの治療の用量範囲を決定するための指針となる。最後に、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療に関連する毒性の有意な証拠は認められていない。
細胞療法及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法の例
（実施例１９−細胞療法におけるＢＣＤ被験者からのｉＰＳＣ、ｉＰＳ−ＲＰＥ、又はｉＰＳ−眼細胞の使用）
ＢＣＤは比較的発症が遅い疾患である。ＢＣＤ患者の症状は、通常、１０歳代、２０歳代、さらには３０歳代に発症する。さらに、ｉＰＳのリプログラミングプロセスには、「時計のリセット」効果がある。したがって、ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞及び他のｉＰＳ−眼細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２変異の遺伝子修復を行わなくても、ＢＣＤ患者へ移植するための細胞療法として使用することができる。
または、ＢＣＤ患者に由来する、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ、及び／又は他のｉＰＳ−眼細胞は、細胞療法の移植前に遺伝的に修復することもできる。遺伝子修復は、上記実施例で説明したＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療により達成してもよく、遺伝子編集によって達成してもよい。遺伝子編集の詳細については、本明細書の実施例を参照。
（実施例２０−眼細胞療法のための遺伝的に修復された患者の自家細胞）
患者特異的ｉＰＳＣ由来細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、又はｉＰＳ−眼細胞）を、眼疾患（非限定的な例として、網膜疾患及び角膜疾患）の細胞療法における移植のための自家細胞の供給源として使用することができる。ＥＳ細胞（例えば、ＥＳ−ＲＰＥ細胞、ＥＳ−ＣＥＣ又はＥＳ−ＰＲＣ、及びそのようなＥＳ由来細胞で構成された組織）又は別の個人のｉＰＳ細胞などの、同種（アロジェニックな）起源から作製された細胞と比較して、そのような患者特異的ｉＰＳ由来の自家細胞及びそのような細胞から作られた組織は、通常、患者の免疫抑制をほとんど又はまったく必要とせず、ＥＳ及びＥＳ由来細胞の使用に関連する倫理的問題もない。
しかしながら、患者を供給源とする細胞（例えば、線維芽細胞又は血液細胞）から作製されたｉＰＳＣ及びそのような患者特異的ｉＰＳＣに由来する細胞及び組織（例えば、患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞及びｉＰＳ−眼細胞）は、依然として病気を引き起こす変異及び関連した表現型を有している。健康な患者由来の細胞及び／又は組織を作製するには、遺伝子編集技術により病的変異を遺伝的に修復又は修正してもよい（非限定的な例として、患者の細胞の標的変異を修正するように設計可能な、クラスター化規則的間隔占有短鎖パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）が挙げられる）。これらの遺伝的に修復された健康なｉＰＳＣは、その後、患者の病的変異をもはや含まない様々な細胞型（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、又は他のｉＰＳ−眼細胞）を作製するために使用することができる。
さらに、この概念実証研究は、これらの遺伝子修正ｉＰＳＣ及び／又は遺伝子修正ｉＰＳ由来細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）がもはや、患者からの（未修正の）ｉＰＳ由来細胞で見られるような表現型（例えば、リピドミクス及び／又はプロテオミクスなどのバイオアッセイによって評価される異常な生化学的プロファイル）を有しないことを実証する。したがって、これらの遺伝子修正された細胞は、細胞療法で置換細胞として使用可能な、再生可能かつ遺伝的に修復された自家細胞の供給源として機能する。遺伝子修正された患者の自家細胞に関する組成物及び方法は、本明細書及び以下の実施例で詳細に説明されている。
遺伝的に修復された患者細胞の別の種類として、上述のように遺伝子補充療法（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療）で治療された、患者のｉＰＳＣ又はｉＰＳ由来細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ及びｉＰＳ−眼細胞、ｉＰＳ−ニューロン細胞）が挙げられる。遺伝子治療処置後、患者特異的細胞は、変異遺伝子の健全なコピー（例ｃＤＮＡなど）を保有し、及び／又は健全な導入遺伝子によってコードされる機能的タンパク質を発現する。さらに、遺伝子治療で処置された患者特異的細胞は、未処置の患者細胞で見られる生化学的プロファイル又はその他の表現型の改善又は正常化を示した。よって、そうした細胞を、細胞療法の置換細胞として使用するために、遺伝的に修復された自家細胞の供給源として使用することができる（例えば、ＢＣＤの細胞療法で使用するための遺伝的に修復された患者自家細胞として、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で処置された、ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、及びｉＰＳ−眼細胞）。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療で処置されたＢＣＤ患者特異的細胞に関する組成及び方法は、上記実施例で詳細に説明されている。以下の説明は、ゲノムＤＮＡの変異を修正することによる遺伝子修復の種類に焦点を当てている。
遺伝子変異に関連する眼及び網膜の変性疾患に対する自家細胞置換は、移植前に、遺伝子編集を介して変異を遺伝的に修正することにより、又は変異の結果を（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療など、疾患遺伝子に関連する導入遺伝子の健全なコピーの送達を介して）修復又は軽減することにより、患者の病的変異を修復する能力によって決まる。本明細書では、最も一般的なＣＹＰ４Ｖ２変異（ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ）を有するＢＣＤ患者の患者特異的ｉＰＳＣを作製し、この変異を修正するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集成分（ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ及びドナー鋳型）及び様々なコンストラクト（プラスミド及びＲＮＰ）を開発した。本明細書では遺伝子編集の手段としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が使用されているが、同じ又は同様の結果を達成するために、他のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｃｐｆ１など）及び他の遺伝子編集技術（非限定的な例としてＴＡＬＥＮ）、並びにＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１などの新しい及び将来の遺伝子編集技術を使用することができることが予想される。また、ｉＰＳＣだけでなく、ｉＰＳＣを作製するために使用される元の供給源細胞、及びｉＰＳＣから作製された細胞でも、そのような細胞の病的変異を修正するために遺伝子編集を適用できることが予想される。
ｉＰＳ由来の細胞系は患者特異的に作製されるが、細胞療法への応用はそうである必要はない。ｉＰＳＣベースの細胞療法の広範な使用を制限する重要な要因は、ヒト個人間の免疫学的な違いである。この問題を解決するアプローチは複数ある。例えば、１つのアプローチは、患者集団の大部分と免疫学的マッチングを達成するように設計された、一般的なＨＬＡハプロタイプを持つ限られた数の系統を含む多数の細胞バンクを開発することである。このような細胞バンクは、選択されたハプロタイプを有する患者からｉＰＳＣを生成するか、ＨＬＡ遺伝子型の遺伝子操作によって作製することができる。別のアプローチとしては、患者の遺伝子型に関係なく免疫学的にサイレントな細胞型を作製することが挙げられる。
遺伝的に修復された患者特異的の自家細胞を作製する方法、細胞内の遺伝子修復の効果を評価する方法、及び細胞療法でそれらを使用する方法について、以下説明する。本明細書で提供される例は、ＢＣＤ患者の間で最も一般的な変異である、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有するＢＣＤ患者からの遺伝的に修復された患者自家細胞の作製に関連している。ＣＹＰ４Ｖ２に異なる変異を有する患者から、又は眼疾患に関連する別の遺伝子に変異がある患者から、又は他の種類の疾患に関連する遺伝子に変異がある患者から（非限定的な例として、表４に記載の任意の遺伝子）、遺伝的に修復された患者の自家細胞を作製するために、同じ方法を使用することもできる。
ＣＹＰ４Ｖ２変異を伴う疾患であるＢＣＤを例として用い、ＢＣＤ患者の特定の変異を保有する患者特異的細胞からｉＰＳＣを作製した。患者特異的ｉＰＳＣに、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、及びドナー相同鋳型をトランスフェクトする。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のコピーは、変異の修正及び野生型アレルへの変換を示す。修正されたｉＰＳＣは、さらに遺伝子修正されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を生成するために使用される。次に、遺伝子修正されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を、もはや表現型（例えば、異常な生化学的プロファイル（脂肪酸プロファイルなど））を持たないことを確認するために試験する。これらの遺伝的に修復された患者の自家細胞は、ＢＣＤの自家細胞療法として、同じ患者に（直接（例えば、細胞懸濁液）、又は層、シート、マトリックス、足場、又は組織の一部などの他の形態で）移植することができる。
（ｉ）ＢＣＤ患者特異的ｉＰＳＣ系統の作製：
本明細書に記載されるように、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子にホモ接合性のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有するＢＣＤ患者からの患者特異的細胞からｉＰＳＣを作製した。患者特異的ｉＰＳＣを生成する方法については、実施例１を参照。シークエンシングによってＢＣＤ患者の変異を特定した。
（ｉｉ）変異を標的とするＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集成分及びコンストラクトの設計、 スクリーニング及び選択：
詳細な説明については、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法に関する本明細書の実施例を参照。
（オフターゲット編集を最小限に抑え、変異部位で直接中心となっている標的配列に対する特異性を最大化するためにＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを選択した。患者特異的ＣＹＰ４Ｖ２変異を含む領域に対して高い特異性を持つ複数のｇＲＮＡをスクリーニングした。候補ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ切断の媒介に関与するＣａｓ９エンドヌクレアーゼも含む発現ベクターに個別に挿入し、２９３細胞系にトランスフェクトした。患者のゲノムＤＮＡをＣＹＰ４Ｖ２領域のプライマーを使用したＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物のＤＮＡ切断活性を分析した。どのｇＲＮＡ候補が変異部位に対して比較的高い活性を持っているかを評価するために調査分析を行った。切断効率が最も高いｇＲＮＡを遺伝子編集に使用する。）
（ｉｉｉ）ｉＰＳＣでの遺伝子編集：
詳細な説明については、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法に関する実施例を参照。
ＢＣＤのような遺伝的劣性疾患の場合、１つのアレル又は変異の遺伝子修正で充分である。細胞が有する複数の変異を修正するために、異なる変異を標的とする複数のＣＲＩＳＰＲコンストラクトを使用することができる。
（ｉｖ）遺伝子修正ｉＰＳＣからのｉＰＳ−ＲＰＥ細胞又は他のｉＰＳ−眼細胞の作製：
オフターゲット編集を伴わず、又は最小限のオフターゲット編集を伴って病的変異が正確に修正されたことをシークエンシングにより確認した後、遺伝子編集によって修正されたｉＰＳＣを、分化させて、本明細書に記載の関連疾患の影響を受けるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞又はその他の種類のｉＰＳ−眼細胞（例えば、ＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又はｉＰＳ−ＣＥ細胞）を作製するために使用した。次に、ＢＣＤ患者に由来する修正されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を、同じＲＰＥとしての細胞運命の確認（例えば、明確なＲＰＥ形態（例えば、色素及び／又は六角形）及び／又はＲＰＥ特異的マーカー）に供する。
（ｖ）表現型を持たないことを確認するためのバイオアッセイ
これらの遺伝子修正ｉＰＳＣ及び／又は遺伝子補正ｉＰＳ由来細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）が、患者の（修正されていない）ｉＰＳ由来細胞に見られるような表現型を持たないことを確認するために、バイオアッセイを使用する。バイオアッセイは、特定の疾患に関連する患者細胞の細胞レベル及び／又は分子レベルの表現型を同定及び評価することができるいかなる種類の生物学的アッセイであってもよい。例えば、非限定的な例として、リピドミクス、プロテオミクス、タンパク質発現、及び／又は他の生化学的試験が挙げられる。ＢＣＤでは、バイオアッセイとしては、本明細書の実施例に記載のように、脂肪酸及びセラミド試験が挙げられる。結果は、ＢＣＤ患者由来のこれらの遺伝子修正ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は、ＢＣＤ患者由来の未修正ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞で見られるような関連する生化学的欠陥／機能障害をもはや有しないことを示す。これは、遺伝子修正ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞が表現型を含まないため、細胞療法に適した置換細胞の供給源であることを証明している。
（ｖｉ）移植：
これらの遺伝的に修復された患者の自家細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ、及び他のｉＰＳ−眼細胞）は、ＢＣＤの細胞療法として、（直接又は層、シート、マトリックス、足場、又は組織の一部として）同じ患者へ移植することができる。
（実施例２１−眼疾患に対するＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法の具体例）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡが正しく設計されている場合は非常に特異的であるが、特にＣＲＩＳＰＲは臨床用に開発されているため、特異性及びオフターゲット編集は依然として大きな懸念事項である。以下の実施例では、眼疾患の治療に使用するための高いオンターゲット特異性及び低いオフターゲット編集リスクを備えたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法コンストラクトを開発する方法を詳細に説明する。また、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異は、全ての公知のＣＹＰ４Ｖ２変異及び他の遺伝性眼疾患の中で修正することが最も困難な変異の１つである。ほとんどのＣＹＰ４Ｖ２変異は単一ヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失（表１：ＢＣＤ患者における選択されたＣＹＰ４Ｖ２変異を参照）であるが、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異は１７ｂｐの欠失と２ｂｐの挿入を伴い、イントロンとエクソンの両方に関係する。
最も一般的な病的ＣＹＰ４Ｖ２変異（ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異）を修正するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法コンストラクトのいくつかのセットを設計及び構築した。以下は、変異を修正してＢＣＤを治療するための、これらのＣＲＩＳＰＲ ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子編集コンストラクトの設計、組成物、及び使用方法に関する詳細な説明である。
（ａ）変異の分析
ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異は、イントロンとエクソンの両方に関係し、欠失と挿入の両方を含み、スプライスアクセプター部位に影響を与える。
ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異とは、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のイントロン６の終端から８塩基で始まる場所における、１７塩基の欠失と２塩基（ＧＣ）の挿入を指し、ＩＶＳ６−８ ｄｅｌ／ｉｎｓＧＣとも称される。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を含むヒトＣＹＰ４Ｖ２ゲノムＤＮＡ領域の配列を示す配列番号４６、及び対応する野生型配列を示す配列番号４７を参照。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を、ヒトＣＹＰ４Ｖ２イントロン６−エクソン７接合部を示す以下の配列に示す。Ｉｎｔｒｏｎ６配列を小文字で、エクソン７配列を大文字で示す。１７ｂｐの欠失及びＧＣの挿入を括弧内に示す：ｃａａ ａｃａ ｇａａ ｇｃａ ｔｇｔ ｇａｔ ｔａｔ ｃａｔ ｔｃａ ａａ （ｔｃａ ｔａｃ ａｇＧ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＴ）（ＧＣ）ＧＡＡ ＣＧＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＡ）は、エクソン７のスキップに至ると予測される。野生型ＣＹＰ４Ｖ２は、以下の配列を有し：ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＣＡ ＡＡ（Ｔ ＣＡＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＧＣ Ｔ）ＧＡ ＡＣＧ ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＧＡ（配列番号４７）、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異ＣＹＰ４Ｖ２は、以下の配列を有する：ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＣＡ ＡＡ（Ｇ Ｃ）ＧＡ ＡＣＧ ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＧＡ（配列番号４６）。野生型配列の括弧で囲まれたヌクレオチドは欠失する１７ヌクレオチドであり、変異体配列の括弧で囲まれたヌクレオチドは１７塩基対の欠失に続いて挿入される２ヌクレオチドである。
ＣＲＩＳＰＲを使用して良好な修復率を実現するには、Ｃａｓで作製された、変異配列に可能な限り近い切断が望ましい。ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を含むＣＹＰ４Ｖ２ゲノムＤＮＡの領域には、複数のＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ部位（ＮＧＧ）がある。したがって、通常のＳｐＣａｓ９を使用してこの変異を修正可能である。または、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異及び／又は他の変異を修正するために、他の種のＣａｓ９、変異Ｃａｓ９、又は異なるＰＡＭ（例えば、Ｃｐｆ１では、変異配列に存在するＴＴＴＮ）を有する他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１など）を使用してもよい。
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ設計及び選択
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異領域に存在する様々なＰＡＭ部位に基づいて、複数の関連するプロトスペーサーエレメント配列（本明細書ではｇＲＮＡと称する；典型的には２０ｎｔの長さであるが、異なる長さ（例えばＣａｓ９との使用では１７ｎｔ〜２２ｎｔ）であってもよい）を、ＤｅｓｋＧｅｎソフトウェアを使用してスクリーニングした。次の基準を使用して、５つのｇＲＮＡ候補を選択した：
ａ）ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９切断部位が標的修正部位へ近接していること、及び
ｂ）ｇＲＮＡの予測されるオフターゲットプロファイル
（表５及び図１２を参照、ｇＲＮＡ配列については、配列番号４８〜配列番号５２を参照）。
各ｇＲＮＡ候補に対応するＰＡＭ部位は太字で強調表示されている。混乱を避けるために述べると、ＰＡＭ配列はｇＲＮＡ（プロトスペーサーエレメント）配列の一部ではない。
（ｃ）患者ゲノムＤＮＡを使用したｇＲＮＡ検証
ｇＲＮＡを選択及び検証するために、ホモ接合ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有するＢＣＤ患者（Ｐ１）のゲノムＤＮＡを使用した。プライマーを使用して、変異部位及び様々な標的部位を含むＣＹＰ４Ｖ２の領域に隣接するＤＮＡアンプリコンを準備した（表６及び図１２を参照）。ＤＮＡアンプリコン、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって準備されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（それぞれｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ４、又はｇＲＮＡ５のいずれかを含む）、及びＳｐＣａｓ９タンパク質を混合し、３７℃で１時間インキュベートした。活性型ｓｇＲＮＡはＣａｓ９タンパク質を媒介して、アンプリコンに二本鎖切断を作製し、様々な断片パターンを表示した（表７）。反応物をロードし、ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲルで分離した（図１３）。
断片がアンプリコンにたしかに由来することを確認するために、未処置のアンプリコンのＤＮＡ試料（図１６、上のパネル）及びｇ２処置の最小断片（図１６、中央のパネル）をサンガー法シークエンシングに供した（図１４）。５つのｇＲＮＡは全て、予測された切断活性を示した。
変異を含む患者のゲノムＤＮＡの検証に加えて、又はその代わりに、非限定的な例として体細胞、幹細胞、ｉＰＳＣ、又は幹細胞由来の細胞が挙げられる患者の細胞でｇＲＮＡの活性を検証してもよい。
（ｄ）ｇＲＮＡ発現ベクターの構築
最も高い活性及び最も高いオフターゲットスコアを持つ３つのｇＲＮＡ（ｇ１、ｇ２、ｇ３）を、各活性ｇＲＮＡの二本鎖オリゴカセットを挿入することにより、ｐＸ−Ｕ６−ＣＢｈ−Ｃａｓ９−Ｐｕｒｏ ｇＲＮＡ発現ベクターにクローニングした。各カセットは、ｇ１、ｇ２、及びｇ３のｇＲＮＡ配列の１つに基づいて合成した。発現ベクターのコンストラクト及びｇＲＮＡの挿入部位を示す模式図を図１５及び図１６に示す。Ｕ６プロモーターに続くＩＶＴ ｓｇＲＮＡ配列全体（配列番号５５（プロトスペーサーエレメント配列やオプショナルな「Ｇ」は含まない））を示すより詳細な図（例としてｇ１を使用）については、図１７を参照。各プロトスペーサーエレメント（ｇＲＮＡ）配列の先頭に挿入される「Ｇ」ヌクレオチド（配列番号５９）はオプショナルである。これは主にＵ６プロモーターの転写効率を高めることを目的とする。プロトスペーサーエレメント配列が「Ｇ」残基で始まる場合、又はＵＴプロモーター以外のプロモーター（例えば、Ｈ１プロモーター）が使用される場合は、これは必要ない。制限酵素消化及びシークエンシングの両方によって全てのｇＲＮＡコンストラクトを検証した。
トップｇＲＮＡ（ｇ１、ｇ２、又はｇ３）をそれぞれ発現し、ｈＳｐＣａｓ９及びピューロマイシン耐性遺伝子を共発現する３つのプラスミド（すなわちｐＸ４５９−ｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏ）を開発し（図１５及び図１６）、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異の遺伝子修正のためのコンストラクトの１つとした（下記表８参照）。
ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質及び／又は選択マーカー（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、及び／又はＧＦＰ、ＥＧＦＰ又はＲＦＰ）は、１つのプラスミドにパッケージングしてもよく、別のプラスミドにパッケージングしてもよいことは理解されよう。また、複数のｇＲＮＡを使用する場合（複数の変異を修正するため、又は同じ変異を修正するため（例えばＣａｓ９ニッカーゼで使用するｇＲＮＡのペアリング））、これらは同じベクターにパッケージングしてもよく別々のベクターにパッケージングしてもよい。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集成分（ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質）、及び／又は選択マーカーをパッケージングするためには、本明細書に記載のプラスミドベクターに加えて、他の様々なベクターを使用することができる（非限定的な例として、ｐＸ４５８プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及び／又はレンチウイルスベクターが挙げられる）。ＣＲＩＳＰＲ成分をコードするＤＮＡコンストラクトに加えて、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、及び／又は選択マーカーは直接使用してもよく、ｍＲＮＡコンストラクト又はＲＮＰコンストラクトで使用してもよい。
（ｅ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰの構築及び検証
ベクターのＤＮＡコンストラクト（例えば、上記のｐＸ４５９プラスミド）に加えて、ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、及びｇ５のそれぞれについてＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）コンストラクトが開発された（表５及び表８を参照）。各ＲＮＰコンストラクトは、
（ｉ）関連するプロトスペーサーエレメントを含むキメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（表５及び表８、及び本明細書の詳細な説明を参照）、及び
（ｉｉ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するＳｐＣａｓ９タンパク質
を含む。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の標的部位での様々なＲＮＰコンストラクト（ｓｇＲＮＡ１：Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ２：Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ３：Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ４：Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ５：Ｃａｓ９）の切断活性を、上記段落（ｃ）で説明した通り、患者のゲノムＤＮＡで検証した（図１２、図１３、図１４を参照）。
ｓｇＲＮＡの長さは典型的には約１００ｎｔであるが、長さは変わることがあり、１７ｎｔ〜２２ｎｔのプロトスペーサーエレメント配列を含む。ｓｇＲＮＡはＩＶＴに由来するものであっても合成であってもよい。ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、及びｇ５に対応するＩＶＴ ｓｇＲＮＡを生成し、上記のように検証した。以下に説明するように、ｇ１及びｇ２に対応する合成ｓｇＲＮＡは、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国カリフォルニア州シリコンバレー）に特注した。
ｓｇＲＮＡの代わりに、ｃｒＲＮＡ（例示的配列を配列番号５３に示す）とｔｒａｃｒＲＮＡ（例示的配列を配列番号５４に示す）との複合体（ｄｕｐｌｅｘ）をＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と一緒に使用して、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ複合体（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ９）を形成してもよい。Ｃｐｆ１タンパク質を使用する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要ではない。
ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡは、細胞内ＲＮＡ分解から保護するために化学的に修飾してもよい。例えば、化学修飾された合成ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルアナログ、及びｇＲＮＡの５’末端と３’末端の３塩基に３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国カリフォルニア州シリコンバレー）。所望により利用可能な化学修飾を有する、所定のプロトスペーサーエレメント配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、又はｇ５（配列番号４８〜配列番号５２を参照））に基づく合成ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国カリフォルニア州シリコンバレー）やＩＤＴから市販されている。
（ｆ）ドナー鋳型の構築
相同組換修復（ＨＤＲ）では、標的遺伝子の変異配列を修正するために必要なドナー核酸配列を提供するために、ドナー鋳型を使用する。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態で、ＨＤＲの２つの別個のドナー鋳型を作製した。１つ目の、ＣＰＹ４Ｖ２ドナー鋳型１又はＣＹＰ４Ｖ２ ｓｓＯＤＮ １と称されるもの（配列番号５６）は、１７ｂｐの修正を含み、以下の配列を有する：５’−ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＡＧ ＣＡＴ ＡＴＴ ＴＴＡ ＴＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ＴＴＡ ＡＣＴ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＡＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＣＣＡ ＡＡＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＧＡ ＴＴＡ ＴＣＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＣＡ ＴＡＣ ＡＧＧ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＧＧ ＣＣＡ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＧＡ ＡＣＧ ＣＣＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＣＴ ＴＴ−３’。一方、ＣＹＰ４Ｖ２ドナー鋳型２又はＣＹＰ４Ｖ２ ｓｓＯＤＮ ２（配列番号５７）と称される２つ目のドナー鋳型は、ＣＹＰ４Ｖ２ドナー鋳型１の逆相補鎖である。
標的ＣＹＰ４Ｖ２（ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ）変異を修正するための相同組換修復（ＨＤＲ）を起こすために、上記の任意のｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ（ｇ１、ｇ２、ｇ３、ｇ４、又はｇ５）及びＣａｓ９タンパク質と共に、上記いずれのドナー鋳型を使用してもよい。
本明細書で提供されるドナー鋳型は、長さが２００ｎｔである。様々な長さのドナー鋳型を使用することができる。ドナー鋳型は、標的部位に対して対称であっても非対称であってもよい。ドナー鋳型は、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＯＤＮ、又はドナー核酸配列を含む又はコードするベクター（プラスミド又はＡＡＶベクターなど）によって提供することができる。ドナー鋳型が、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのプロトスペーサーエレメント及びＣａｓタンパク質の標的となるＰＡＭ配列に相補的なインタクトな（無傷の）配列を持っている場合、このドナー鋳型が細胞内のＣａｓタンパク質（Ｃａｓ９など）によって分解されるのを防ぐため、ドナー鋳型に変異を加えてもよい（例えば、ドナー鋳型のＣａｓ９ ＰＡＭ「ＮＧＧ」を変異させて、これを「ＮＧＴ」又は別の非ＰＡＭ配列に変更する）。ただし、ドナー鋳型によって導入される意図したＰＡＭ変異がコーディング領域内にある場合は、それがサイレント変異であることを保証するために注意を払う必要がある。
ドナー鋳型は合成的に作製することができ、商業的に入手可能である。例えば、特定の配列のオリゴＤＮＡを特注してもよい（Ｕｌｔｒａｍｅｒ（登録商標）ＤＮＡオリゴヌクレオチド、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、米国アイオワ州コーラルビル）。
（ｇ）Ｃａｓタンパク質及び選択マーカー
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）（Ｃａｓ９又はＣｐｆ１など）は市販されており、非限定的な例として、プラスミドによってコードされたもの、又はＲＮＰコンストラクトで使用する組換えタンパク質が挙げられる。Ｃａｓタンパク質には、１つ、２つ、又はそれ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）がさらに含まれていてもよく（例えば、カタログ番号１０７４１８２、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、米国アイオワ州コーラルビル；カタログ番号Ａ０３４ａ−ａ−１０００、Ｆｅｌｄａｎ（カナダケベック州）；Ｃｐｆ１：カタログ番号１０７６１５８（ＩＤＴ））、選択マーカーと融合されていてもよい（例えば、ＥＧＦＰと融合したＳｐＣａｓ９タンパク質、カタログ番号ＰＲ−１３７２１１−Ｅ（Ｎｏｖａｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国マサチューセッツ州ウーバン）。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集コンストラクトをインビトロで細胞にトランスフェクトする場合、トランスフェクション率を評価したり、次の工程の処置用に細胞を選択する補助としたりするために、選択マーカーを使用してもよい。非限定的な例として蛍光（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ）及び／又はピューロマイシンが挙げられる様々な選択マーカーを前記プロセスにおいて使用することができる。選択マーカーは、ＣＲＩＳＰＲコンストラクトの任意の成分と統合されていてもよく、トランスフェクションのプロセスで個別に提供してもよい。例えば、トランスフェクションされた細胞のイメージング及びマニュアルソート又はＦＡＣＳソートを簡便に行うために、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）又はＣａｓ９タンパク質（Ｎｏｖａｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＰＲ−１３７２１１−Ｅ）に蛍光標識を組み合わせてもよい。ピューロマイシンを使用して選択するために、ＣＲＩＳＰＲコンストラクトと同時トランスフェクトされるベクター中にピューロマイシン耐性遺伝子を含めてもよい。ピューロマイシンを使用した選択については、実施例で説明している。ピューロマイシンなどの抗生物質選択マーカー、又は蛍光標識など様々な種類の選択マーカーが市販で入手可能であり、ＣＲＩＳＰＲ成分（例えば、Ｃａｓ９タンパク質又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）に統合してもよく、別々に（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現する発現プラスミド）提供してもよい（非限定的な例として、ＩＤＴ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｏｖａｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、及びＩｎｖｉｖｏＧｅｎが挙げられる）。
（ｈ）コンストラクト及び推奨されるプロトコル
以下の表（表８）は、３つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、及びｇＲＮＡ３）のそれぞれについて作製されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集コンストラクト（プラスミド及びＲＮＰ）を示す。これには、３つのｇＲＮＡプラスミドコンストラクト又はそれぞれのｓｇＲＮＡ、２つのドナー鋳型（順方向相補的及び逆方向相補的）、及びＳｐＣａｓ９タンパク質が含まれる。
１ ＢＣＤ患者の間で最も一般的なＣＹＰ４Ｖ２変異であるｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正するためのコンストラクト。他のＣＹＰ４Ｖ２変異を修正するためのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ及びコンストラクトを、本明細書に記載の方法により設計及び検証することもできる。プラスミド及びＲＮＰコンストラクトのほか、他のコンストラクト（非限定的な例としてｍＲＮＡ及びウイルスベクター）を使用して１又は複数のＣＲＩＳＰＲ成分を提供／発現することもできる。
２ ＣＲＩＳＰＲ成分（ｓｇＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９タンパク質）、及び選択マーカーとしてのピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性遺伝子をコードするｐＸ４５９プラスミド。ＤＮＡコンストラクト及びｓｇＲＮＡをコードする配列を示す図１７を参照（例としてｇ１を使用している。ベクターコンストラクト及びマップについては図１５及び図１６を使用）。各ｓｇＲＮＡ配列は、
（ａ）２０ｎｔのプロトスペーサーエレメント（ｇ１、ｇ２、ｇ３についてはそれぞれ配列番号４８、配列番号４９、又は配列番号５０）、及び
（ｂ）８２ｎｔの配列（配列番号５５（配列はプラスミドＤＮＡに含まれるＤＮＡの形式で示される。ＲＮＡ配列については、ＤＮＡ配列の「Ｔ」を「Ｕ」に置換する。）
を含む。ｐＸ４５９ベクターは、Ｕ６プロモーターにより駆動される転写効率を増強するために、ヒトＵ６プロモーター配列の直後、プロトスペーサーエレメント配列の前に、「Ｇ」ヌクレオチド（配列番号５９及び図１７）を含む。これはＩＶＴにより得られたｓｇＲＮＡにも含まれる。ＣＲＩＳＰＲ成分（ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質）は他のベクターにクローニングすることもできる（非限定的な例として、レンチウイルスベクター又はＡＡＶベクターなどのウイルスベクターが挙げられる）。ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、別々のベクターにクローニングしてもよく、１つのベクターにクローニングしてもよい。
３ 様々なプロトスペーサーエレメントに基づくｓｇＲＮＡ（ＣＹＰ４Ｖ２ ｇ１、ＣＹＰ４Ｖ２ ｇ２、又はＣＹＰ４Ｖ２ ｇ３；表５、及びそれぞれ配列番号４８、配列番号４９、又は配列番号５０を参照）。ＩＶＴ ｓｇＲＮＡについては、上記の説明を参照。ＩＶＴ ｓｇＲＮＡに加えて、化学修飾された合成ｓｇＲＮＡをＳｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国カリフォルニア州シリコンバレー）に注文した。ｓｇＲＮＡに代えて、ｃｒＲＮＡ（ＣＹＰ４Ｖ２ ｇ１、ＣＹＰ４Ｖ２ ｇ２、又はＣＹＰ４Ｖ２ ｇ３の２０ｎｔプロトスペーサー配列、及びｃｒＲＮＡの残りの配列（例示的な配列を配列番号５３に示す）を含む）とｔｒａｃｒＲＮＡ（例示的な配列を配列番号５４に示す）との複合体（ｄｕｐｌｅｘ）を使用してもよい。
４ 相同組換修復（ＨＤＲ）のドナー鋳型。異なる長さのドナー鋳型を使用してもよく、異なる形で構築してもよい（非限定的な例として、ｓｓＯＤＮや、ベクター内（例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ＡＡＶ２又はＡＡＶ６など））が挙げられる）。
各試薬の濃度は約１０００（ｎｇ／μＬ）である。
以下のプロトコルは、エレクトロポレーション及びヌクレオフェクションによってＣＹＰ４Ｖ２変異ＣＲＩＳＰＲ遺伝子修復コンストラクトを患者ｉＰＳＣに送達するためのものである。他の方法（非限定的な例として、リポフェクション、ウイルスベクター形質導入（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６を使用してドナー鋳型を送達））、又はマイクロジェクションが挙げられる）を使用してもよい。第１１継代目〜第１４継代目のＰ１ ｉＰＳＣを使用する。
プロトコル番号１（プラスミドを用いたエレクトロポレーション）：
１．Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の説明書に従って、約１００万個の細胞に対して、２．５μｇ（２．５μＬのストック）のｐＸ４５９．ｇＲＮＡ（品目番号１、２、又は３；ｇＲＮＡは組み合わせないこと）及び２．５μｇ（２．５μＬのストック）のｓｓＯＤＮ（品目番号７又は８）を含む混合物を使用する。
２．エレクトロポレーション（ＥＰ）条件を適用する：
ａ）１１００Ｖ、３０ｍｓ、１パルス又は
ｂ）１２００Ｖ、３０ｍｓ、１パルス。
３．ＥＰ後、細胞をＲｏｃｋ阻害剤（１０μＭ）と共に６ウェルプレートの３ウェルに均等に分割する。
４．播種の２日後、表９に示すようにピューロマイシンを添加する。
５．ピューロマイシンを添加してから２日後に、使用済みの培地をピューロマイシンを含まない新鮮な培地と交換する。
６．２週間培養を維持して、コロニーを選択する。

プロトコル番号２（ＲＮＰを用いたエレクトロポレーション）：
１．氷入りバケツを使用する。１つのｓｇＲＮＡ（品目番号４、５、又は６；ｇＲＮＡは組み合わせないこと）、１つのｓｓＯＤＮドナー鋳型（品目番号７又は８）、ＳｐＣａｓ９タンパク質（品目番号９）、及びＣａｓ９−Ｐｕｒｏ発現ベクターを氷上で解凍する。Ｃａｓ９−Ｐｕｒｏ発現ベクターは、選択マーカーとして使用される。これはｐＸ４５９−ｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏプラスミドであり、ｇＲＮＡにクローニングしなかったことを除いて、図１５に示す構造を有する。
２．１．７ｍＬエッペンドルフチューブ及び６ウェルプレートに明確にラベルを付ける。サンプル毎に１本のエッペンドルフチューブ及び１個のウェルを準備する。各ウェルに３ｍＬの培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＴｅＳＲ−Ｅ８（カタログ番号０５９４０））を加える。
３．２５ｍＬのＰＢＳ入りの１０ｃｍディッシュを１個準備して、Ｎｅｏｎ（登録商標）チップを洗浄する。
４．エレクトロポレーションされた細胞を入れるための６ウェルプレートを準備する。各ウェルに３ｍＬの培地を加える。
５．各エッペンドルフチューブに、４μｇ（４μＬのストック）ｓｇＲＮＡ（品目番号４、５、又は６）及び１０μｇ（１０μＬのストック）のＳｐＣａｓ９タンパク質（品目番号９）を追加し、チューブを室温で少なくとも１０分間置く。
６．５μｇ（５μＬのストック）のｓｓＯＤＮ（品目番号７又は８）及び２．５μｇ（２．５μＬのストック）のＣａｓ９−Ｐｕｒｏ発現ベクターを各チューブに追加する。
７．適切なＮｅｏｎ（登録商標）ＥＰバッファーＲで細胞を再懸濁し、最終密度１×１０７細胞／ｍＬとする。
８．１０５μＬの細胞懸濁液を分注し、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ混合物とともに各エッペンドルフチューブに加える。
９．３ｍＬのＢｕｆｆｅｒ Ｅ２をＮｅｏｎ（登録商標）ピペットに添加し、Ｎｅｏｎ（登録商標）ピペットをＮｅｏｎ（登録商標）ピペットステーションに置く。
１０．１００μＬのＮｅｏｎ（登録商標）チップを使用する。各エッペンドルフチューブから１００μＬのＥＰ混合液を吸引し、Ｎｅｏｎ（登録商標）ピペットに挿入する。
１１．上記表９のＥＰ条件のうちの１つを適用し、上記のプロトコル番号１の工程３〜６を行う。
注記：ｉＰＳＣがうまく増殖しない場合は、コンディショニング培地を推奨する。使用済み培地（ピューロマイシンを含まない）を収集し、ろ過して細胞破片を取り除く。使用済み培地と新鮮培地を比率１：１で混合する。遺伝子編集プロセス全体を通してフィーダーフリー条件でヒトｉＰＳＣを培養するには、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５４２７７）及びＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＴｅＳＲ−Ｅ８（カタログ番号０５９４０）の使用が推奨される。ＥＰ後に細胞をプレーティングする際に、４８時間培地にＲＯＣＫ阻害剤（最終濃度１０μＭ）を加えると、細胞の生存率を維持するのに役立つ。
プロトコル番号３（ＲＮＰを用いたヌクレオフェクション）：
１．Ｌｏｎｚａ ４Ｄ−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、パラメーター設定：Ｌｏｎｚａプログラム、ＤＳ−１５０
２．ＲＮＰ（ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ）及びｓｓＯＤＮを別々に準備し（最大１０μＬに容量を調整）、使用前に混合する。表１０を参照。
（１）ｇＲＮＡ１＋ＣＹＰ４Ｖ２フォワードｓｓＯＤＮ
（２）ｇＲＮＡ２＋ＣＹＰ４Ｖ２フォワードｓｓＯＤＮ
（３）ｇＲＮＡ１＋ＣＹＰ４Ｖ２リバースｓｓＯＤＮ
（４）ｇＲＮＡ２＋ＣＹＰ４Ｖ２リバースｓｓＯＤＮ
３．細胞を採取しカウントする：５×１０５ｉＰＳ細胞
４．３〜５回静かに上下にピペッティングして、ＲＮＰ＋ｓｓＯＤＮ（１０μＬ）と共に細胞を懸濁する。
５．２０μＬのＬｏｎｚａキットバッファーを細胞懸濁液に添加し、ヌクレオフェクション前のインキュベーション時間を最小限にする。
６．混合物（３０μＬ）をＬｏｎｚａキットウェルにロードする。インピーダンスを確認する。
７．設定パラメーター（ＤＳ１５０）を使用して細胞をエレクトロポレーションする。
８．７０μＬのｍＴｅＳＲ（ＲＯＣＫ阻害剤を含む）をキットのウェルに直接添加して、エレクトロポレーションした細胞を静かに再懸濁する。
９．６ウェルプレートの１つのウェルで細胞を継代培地中に播種する。
１０．エレクトロポレーションの２４時間後に細胞の生存率を観察し、培地を培養培地に交換する。
注記：このプロトコルでは選択マーカーは使用しない。ヌクレオフェクション後生存している細胞を単一細胞増殖のために選択する。Ｌｏｎｚａ ＤＳ−１５０プログラムの他、ＣＢ−１５０などの他のパラメーターを使用してもよい。
（実施例２２−遺伝的に修復された患者細胞系の作製、並びに遺伝的に修復された患者細胞系の作製及び眼細胞療法におけるＲＮＰの使用）
ＣＲＩＳＰＲ ｇ１又はＣＲＩＳＰＲ ｇ２（品目番号１又は２）を含む発現プラスミドコンストラクトと、ｓｇＲＮＡ１又はｓｇＲＮＡ２（品目番号４又は５、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ、米国カリフォルニア州シリコンバレー）及びＳｐＣａｓ９（品目番号９、カタログ番号Ａ０３４ａ−ａ−１０００、Ｆｅｌｄａｎ（ケベック、カナダ）又はＳｙｎｔｈｅｇｏ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ２ＮＬＳ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）））を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトとを、ＣＹＰ４Ｖ２ドナー鋳型（品目番号７又は８、ｓｓＯＤＮ、Ｕｌｔｒａｍｅｒ（登録商標）ＤＮＡオリゴヌクレオチド、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、米国アイオワ州コーラルビル）と併せてそれぞれ使用して、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有する患者ｉＰＳＣをトランスフェクトする。
相同組換修復（ＨＤＲ）による遺伝子修正の評価：
トランスフェクション後、ＣＹＰ４Ｖ２領域の遺伝子修正を評価するために、選択した細胞を収集して、ＰＣＲ、及び引き続くｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を含む標的アンプリコンのシークエンシングに供する。トランスフェクトされた細胞のディープシーケンシングにより、リードに１７ｂｐの「ＴＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＣＴ」の挿入及び「ＧＣ」の欠失を伴う変異の正確な修正が含まれており、野生型配列（配列番号４７）へと変異が修正されていることが分かった。変異の修正は、トランスフェクトされていないいずれの対照ｉＰＳＣでも見られない。この結果は、トランスフェクトされた細胞間のＨＤＲ頻度の指標としても機能する。
オフターゲット編集が最小限である、又はオフターゲット編集を伴わないｉＰＳクローンの取得：
ＨＤＲを評価した後、ｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を有する患者のｉＰＳＣでトランスフェクションを再度行う。トランスフェクトした細胞を、単一細胞クローニング及び単一細胞増殖する。次に、オンターゲットＨＤＲが確認されたクローン細胞系を、シークエンシングによってオフターゲット編集について評価する。臨床応用には、全ゲノムシークエンシング（カバー率６０倍）を使用して、同じ患者における編集された細胞系とトランスフェクトされていない細胞系とを比較する。ゲノムに公知の実質的な悪影響がない、オフターゲット編集が最小限である、又はオフターゲット編集を伴わない、編集されたクローナルｉＰＳ細胞系が選択される。
遺伝的に修正されたｉＰＳを目的の種類の細胞に分化
次いで、選択したｉＰＳクローン細胞系をｉＰＳ−ＲＰＥ細胞に分化させる（本明細書の実施例を参照）。選択したｉＰＳクローン細胞系は、細胞療法での使用が望まれる他の種類の細胞に分化させることができる（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又は他のｉＰＳ−眼細胞）。
遺伝学的に修復されたｉＰＳ又はｉＰＳ由来の細胞が表現型を有しないことを確認するためのバイオアッセイ
遺伝的に修正された（又は遺伝的に修復された）ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞の生化学的機能を試験し（本明細書の実施例を参照）、未治療の患者ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞で見られるような表現型を持たないことを確認する。遺伝的に修復された患者のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞ではＣＹＰ４Ｖ２の発現が検出される。
コードするＣＲＩＳＰＲ成分（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及び／又はドナー鋳型）の持続的な発現をもたらすプラスミド又は他のベクターコンストラクト（ＡＡＶ、レンチウイルスなど）とは異なり、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクトは、オンとオフが迅速である。ＲＮＰコンストラクトの成分は、トランスフェクトされた細胞で比較的急速に分解される。したがって、ＲＮＰコンストラクトを使用すると、プラスミドや他のコンストラクトと比較して、オフターゲット編集のリスクが低くなる。これにより、ＲＮＰコンストラクトは、例えば、移植に適した遺伝的に修復された患者細胞の作製や、インビボ治療（例えば、インビボ遺伝子修正のために、ＲＮＰコンストラクトを対象の目に注入する）などの、臨床応用に特に適したものになる。本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰコンストラクト及び方法は、ＢＣＤの治療の他、表４に示す変異又は欠陥を有する遺伝子に関連する疾患などの他の疾患の治療にも使用することができる。
（実施例２３：眼細胞療法における遺伝子修復細胞の使用）
遺伝的に修復されたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、又は他のｉＰＳ−眼細胞は、眼細胞療法として患者の目に移植することができる。例えば、ＢＣＤ患者の死滅又は変性したＲＰＥ細胞、光受容体細胞、又は他の眼細胞の自己置換細胞として使用してもよい。遺伝的に修復された細胞は、直接移植してもよく（例えば、細胞懸濁液）、他の方法で移植してもよい（非限定的な例として、層、シート、マトリックス、足場、又は組織の一部など）。移植に使用される遺伝的に修復された細胞の量は、置換の対象となる細胞型、置換細胞を必要とする領域のサイズ、及び治療対象（例えば、治療対象の年齢、性別、体重、疾患の進行度、及び状態）、投与経路、移植の場所（網膜 ｖｓ． 角膜など）、移植の形態（例えば、細胞懸濁液 ｖｓ． 層；シート、マトリックス、足場又は組織の一部として、など）、及び必要なレジメンによって異なる。特定の細胞型（例えば、ＲＰＥ細胞、光受容体、ＣＥＣ、又はＣＥ細胞）の片眼への１回の移植における細胞量は、約１，０００個〜約１，０００万個の細胞の範囲内であってよい。
必要に応じて、細胞は臨床使用のためにＧＭＰ施設で製造してもよい。細胞療法製品のＧＭＰ施設は、例えば、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の細胞療法統合サービス（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ベイラー医科大学のＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＥＬＬｆｏｒＣＵＲＥ、ニューヨーク幹細胞財団（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、及びＬｏｎｚａなどの研究機関、受託製造機関（ＣＭＯ）、及び受託研究機関（ＣＲＯ）において商業的に利用可能である。
患者特異的自家投与では、網膜変性疾患（加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などのＲＰＥ変性の影響を受けた網膜変性疾患など）の同種（アロジェニック）眼細胞療法（胚性幹細胞由来ＲＰＥ（ＥＳ−ＲＰＥ）移植など）で使用されるものと同じ投与／送達方法を使用することができる。そのような投与／外科的方法は当技術分野で公知である。
（実施例２４−眼疾患の遺伝子治療と細胞療法との併用治療）
本開示では、ＢＣＤの遺伝子治療及び細胞療法で使用するための組成物及び方法を記載してきた。眼疾患の場合、遺伝子治療及び細胞療法にはそれぞれ長所と短所がある。一方で、遺伝子治療は、患者に遺伝子治療を受けてレスキューされるまだ多くの網膜（又は眼）細胞が残っている初期〜中期段階でより効果を発揮する。ただし、遺伝子治療は、関連する眼細胞（例えば、ＲＰＥやＰＲＣ）が残っていない後期段階の患者ではうまく機能しないか、全く効果を発揮しない可能性がある。一方、細胞療法は、患者の目における死滅細胞又は変性細胞を置換する置換細胞を提供し、特に後期患者及び優性遺伝疾患において、遺伝子治療よりも有益である。しかし、細胞療法では、生存していれば患者の残存視力を維持させたり置換細胞の統合に役立ったりする、患者の眼に残存する「元の」細胞をレスキューすることができない。
遺伝子治療及び細胞療法の限界を克服し、患者に最大の利益をもたらすために、ＢＣＤに対して、遺伝子治療と細胞療法との併用治療法が開発された。この併用治療法は、他の眼疾患にも使用可能である。そのような方法は、
（ａ）遺伝子治療（例えば、ＡＡＶ．ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子修正療法）をインビボで患者の眼に適用すること、及び
（ｂ）遺伝的に修復された患者特異的自家ｉＰＳ−眼細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥ細胞、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又は疾患の影響を受けたその他の種類の眼細胞）のインビトロでの作製及びこれらの細胞を患者の眼に移植すること、
を含み、
（ａ）及び（ｂ）は、順次（最初に（ａ）次に（ｂ）、又は最初に（ｂ）次に（ａ））適用してもよく、同時に（例えば、１回の投与で遺伝子治療ベクター及び細胞を注入する）適用してもよい。（ａ）又は（ｂ）のそれぞれは、同じ眼に１又は複数回適用できる。疾患、病期、及び患者の個々の状況に応じて、（ａ）と（ｂ）とは同じ種類の眼細胞を標的としてもよく、異なる種類の眼細胞を標的化してもよい。例えば、ＢＣＤの場合、ユビキタスプロモーターによって駆動される遺伝子治療用ベクターは、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、及びその他の網膜細胞でＣＹＰ４Ｖ２発現をもたらしうるが、細胞療法は再生ＲＰＥ細胞及び／又は光受容体の提供に焦点を当ててもよい。
この場合、細胞療法は新しい細胞（例えば、ＲＰＥ又は光受容体細胞）を提供することにより有益となるが、遺伝子治療は残りのＲＰＥ又は光受容体細胞をレスキューすることにより、及び／又は眼細胞の状態に影響を与える脈絡膜細胞の健康状態を改善することにより、細胞療法の効果を改善することができる。遺伝子治療及び細胞療法のそれぞれの「レスキュー（救済）」効果及び「置換」効果の組み合わせにより、併用治療は、遺伝子治療又は細胞療法のいずれか一方と比べて優れたものとなっている。この併用治療は、１又は複数の遺伝子変異によって引き起こされる眼疾患及びその他の疾患（非限定的な例として、表４に示す変異又は欠陥を有する遺伝子に関連する疾患）に適用することができる。
前記方法及び物の組成は、多くの異なる態様と併せて本明細書に記載されているが、様々な態様の前述の説明は例示的に説明することを意図し、前記方法及び物の組成の範囲を限定するものではないことを理解されたい。その他の態様、利点、及び変更も、以下の特許請求の範囲内にある。
本明細書は、生成物の作製に組み合わせて使用可能な方法及び組成、並びに前記方法及び組成による生成物を開示する。これら及び他の材料が本明細書に開示されており、これらの方法及び組成の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されていることが理解される。すなわち、これらの組成及び方法の様々な個々の及び集合的な組み合わせ並びに変更への具体的な言及は明示的に開示されていない可能性もあるが、それぞれ本明細書で具体的に意図及び説明される。例えば、特定の物の組成又は特定の方法が開示及び考察され、多くの組成物や方法が説明されている場合、特に反対の指示がない限り、その組成及び方法のありとあらゆる組み合わせ及び変更が具体的に想定されている。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に想定され、開示されている。
配列表

Claims (334)

  1. ヒト対象の眼疾患を治療又は予防するための組成物であって、
    前記組成物は発現カセットを含むベクターを含み、
    前記発現カセットは、１又は複数の制御配列に作動可能に連結された、機能的又は非変異ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含み、
    前記疾患は、眼細胞の機能障害、ジストロフィー、障害、変性、萎縮及び／又は死滅に関連している、
    組成物。
  2. 眼細胞の機能障害、ジストロフィー、障害、変性、萎縮及び／又は死滅を予防、阻止、進行遅延、治療、又は改善するための組成物であって、
    前記組成物は発現カセットを含むベクターを含み、
    前記発現カセットは、１又は複数の制御配列に作動可能に連結された、機能的又は非変異ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含む、
    組成物 。
    疾患：
  3. 前記眼疾患又は眼細胞変性は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に両アレル変異を有する遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）又は網膜色素変性症（ＲＰ）である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
  4. 前記疾患、又は前記眼細胞変性は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィーとしても知られる）に関連する、請求項１、請求項２、又は請求項３に記載の組成物。
  5. 前記ベクターはウイルスベクター、プラスミド、又は非ウイルスベクターである、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ベクターは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）である、請求項５又は請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ｒＡＡＶにおけるＡＡＶゲノム又はＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はその他のＡＡＶの血清型、分離株、若しくはグレード（Ｇｌａｄｅ）、又はそれらの誘導体、バリアント、若しくはハイブリッドのいずれか１つに由来する、請求項５、請求項６、又は請求項７に記載の組成物。
  9. 前記ｒＡＡＶは、偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ８／１、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／１２、及びＡＡＶ２／１０）又はハイブリッドＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ／８、又はＡＡＶ−ＤＪ／９）である、請求項５〜請求項８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ｒＡＡＶは、１又は複数のカプシド変異（例えば、Ｙ−Ｆ、Ｋ−Ｒ、Ｔ−Ａ、Ｓ−Ａ及び／又はＴ−Ｖ変異（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、及びＴ４９１Ｖからの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ２、又は異なるＡＡＶ血清型における対応する変異（例えば、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ−Ｆを４つ（ｑｕａｄＹ−Ｆ）＋Ｔ−Ｖ）、又はＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ））））を含む、請求項５〜請求項９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記ｒＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ｒｈ１０、及び／又はＳｈＨ１０からなる群から選択される又は由来する、請求項５〜請求項１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ４、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ７ｍ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＳｈＨ１０、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、又はそれらのハイブリッド、誘導体、若しくはバリアントからなる群から選択される又は由来する、請求項５〜請求項１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶベクター又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項５〜請求項１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記ベクターは、プラスミド、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、リポソーム（例えば、カチオン性又はアニオン性リポソーム）、デンドリマー、ナノ粒子、ポリマー（例えば、ポリプレックス）、脂質ポリマー系、固体脂質ナノ粒子、又はリポソームプロタミン／ＤＮＡリポプレックス（ＬＰＤ）である、請求項５に記載の組成物。
  15. 前記核酸配列にコードされる前記機能的又は非変異ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４〜６からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも７５％の配列同一性を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記核酸分子は、配列番号４、５、及び６から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするコドン最適化配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記制御配列は、プロモーターを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記プロモーターは、ＲＰＥ細胞特異的プロモーター、網膜細胞特異的プロモーター、角膜細胞特異的プロモーター、眼細胞特異的プロモーター、又は構成的プロモーターである、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記プロモーターは、βアクチンプロモーター若しくはウイルスプロモーター又はそれらのハイブリッドである、請求項２０に記載の組成物。
  23. 前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（ハイブリッドＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧＳプロモーター、ＣＢプロモーター又はＣＢＡプロモーターとしても知られる））、ニワトリβアクチンプロモーター、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、ＣＢＳＢプロモーター、又はＣＢｈプロモーター、その他のβアクチンプロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター）、伸長因子１α短（ＥＦＳ：ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｓｈｏｒｔ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター、ＶＭＤ２（卵黄状黄斑ジストロフィー２、ＢＥＳＴ１としても知られる）プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、又はそれらのハイブリッド、バリアント、若しくは誘導体からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
  24. 前記制御配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）、スモールポリＡシグナル（ＳＰＡ）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨポリＡ）、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、又はそれらの誘導体、ハイブリッド、若しくはバリアントからなる群から選択されるポリＡシグナルである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記制御配列は、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記制御配列は、エンハンサーを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記エンハンサーは、非限定的な例としてＷＰＲＥエンハンサー、ＨＰＲＥエンハンサー、ＣＴＥエンハンサー又はそれらの誘導体、ハイブリッド、若しくはバリアントが挙げられるウイルスエンハンサーである、請求項２６に記載の組成物。
  28. 配列番号６０〜６４に示すＣＹＰ４Ｖ２発現カセット配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸分子を含む、ＢＣＤを治療若しくは予防するための組成物、又はＢＣＤを治療若しくは予防するための組成物を製造するための組成物。
  29. 医薬的に許容される担体と、特定の投与経路に適した追加の成分とで製剤化されている、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 発現カセットを含むベクターを対象に投与することを含み、
    前記発現カセットは１又は複数の制御配列に作動可能に連結された機能的又は非変異ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含み、
    前記疾患は、眼細胞の機能障害、ジストロフィー、障害、変性、萎縮及び／又は死滅に関連している、
    ヒト対象の眼疾患を治療又は予防するための方法。
  31. 発現カセットを含むベクターを前記眼細胞へ送達することを含み、
    前記発現カセットは１又は複数の制御配列に作動可能に連結された機能的又は非変異ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする核酸分子又はその非病原性バリアントを含む、
    眼細胞の機能障害、ジストロフィー、障害、変性、萎縮及び／又は死滅を予防、阻止、進行遅延、治療、又は改善するための方法。
  32. 前記眼細胞は、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞、及び／又は脈絡膜上皮細胞である、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
  33. 前記眼疾患又は眼細胞変性は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に両アレル変異を有する遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）又は網膜色素変性症（ＲＰ）である、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
  34. 前記疾患又は前記眼細胞変性は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィーとしても知られる）に関連する、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
  35. 前記ベクターはウイルスベクター、プラスミド、又は非ウイルスベクターである、請求項３０〜請求項３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ベクターは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶゲノム又はその誘導体、及び／又はＡＡＶカプシドタンパク質又はその誘導体若しくはバリアントを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ｒＡＡＶは、キメラＡＡＶ、シャッフルＡＡＶ、又はカプシド改変ＡＡＶである、請求項３７又は請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ｒＡＡＶにおけるＡＡＶゲノム又はＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はその他のＡＡＶの血清型、分離株、若しくはグレード（Ｇｌａｄｅ）、又はそれらの誘導体、バリアント、若しくはハイブリッドのいずれか１つに由来する、請求項３６、請求項３７、請求項３８、又は請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ｒＡＡＶは、偽型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ８／１、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／１２、及びＡＡＶ２／１０）又はハイブリッドＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ／８、又はＡＡＶ−ＤＪ／９）である、請求項３７〜請求項４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ｒＡＡＶは、１又は複数のカプシド変異（例えば、Ｙ−Ｆ、Ｋ−Ｒ、Ｔ−Ａ、Ｓ−Ａ及び／又はＴ−Ｖ変異（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、及びＴ４９１Ｖからの１又は複数のカプシド変異を有するＡＡＶ２、又は異なるＡＡＶ血清型における対応する変異（例えば、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２（Ｙ−Ｆを４つ（ｑｕａｄＹ−Ｆ）＋Ｔ−Ｖ）、又はＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ））））を含む、請求項３７〜請求項４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ｒＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ｒｈ１０、及び／又はＳｈＨ１０からなる群から選択される又は由来する、請求項３７〜請求項４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ４、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１２、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ７ｍ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＳｈＨ１０、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、又はそれらのハイブリッド、誘導体、若しくはバリアントからなる群から選択される又は由来する、請求項３７〜請求項４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶベクター又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項３７〜請求項４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ベクターは、プラスミド、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、リポソーム（例えば、カチオン性又はアニオン性リポソーム）、デンドリマー、ナノ粒子、ポリマー（例えば、ポリプレックス）、脂質ポリマー系、固体脂質ナノ粒子、又はリポソームプロタミン／ＤＮＡリポプレックス（ＬＰＤ）である、請求項３０〜請求項３４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記核酸配列にコードされる前記機能的又は非変異ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質は、配列番号４〜６からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するポリペプチドを含む、請求項３０〜請求項４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項３０〜請求項４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項３０〜請求項４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記核酸分子は、配列番号１、２、又は３に示す配列を含む、請求項３０〜請求項４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記核酸分子は、配列番号４、５、及び６から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするコドン最適化配列を含む、請求項３０〜請求項５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記制御配列は、プロモーターを含む、請求項３０〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記プロモーターは、ＲＰＥ細胞特異的プロモーター、網膜細胞特異的プロモーター、角膜細胞特異的プロモーター、眼細胞特異的プロモーター、又は構成的プロモーターである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記プロモーターは、βアクチンプロモーター若しくはウイルスプロモーター又はそれらのハイブリッドである、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（ハイブリッドＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧＳプロモーター、ＣＢプロモーター又はＣＢＡプロモーターとしても知られる））、ニワトリβアクチンプロモーター、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、ＣＢＳＢプロモーター、又はＣＢｈプロモーター、その他のβアクチンプロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター）、伸長因子１α短（ＥＦＳ：ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｓｈｏｒｔ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター、ＶＭＤ２（卵黄状黄斑ジストロフィー２、ＢＥＳＴ１としても知られる）プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、又はそれらのハイブリッド、バリアント、若しくは誘導体からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
  56. 前記制御配列は、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む、請求項３０〜請求項５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）、スモールポリＡシグナル（ＳＰＡ）、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨポリＡ）、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、又はそれらの誘導体、ハイブリッド、若しくはバリアントである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記制御配列は、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む、請求項３０〜請求項５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記制御配列は、エンハンサーを含む、請求項３０〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記エンハンサーは、ＷＰＲＥエンハンサー、ＨＰＲＥエンハンサー、ＣＴＥエンハンサー又はそれらの誘導体、ハイブリッド、若しくはバリアントが挙げられるがこれらに限定されないウイルスエンハンサーである、請求項５９に記載の方法。
  61. 配列番号６０〜６４に示すＣＹＰ４Ｖ２発現カセット配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸分子を含むベクターを投与することを含む、ＢＣＤを治療又は予防するための方法。
  62. 前記組成物は、医薬的に許容される担体と、特定の投与経路に適した追加の成分とで製剤化されている、請求項３０〜請求項６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 配列番号６０〜６４に示すＣＹＰ４Ｖ２発現カセット配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸分子を含む組成物であって、ＢＣＤを治療又は予防するためのベクターの製造に使用する組成物。
  64. インビトロ治療のために、細胞あたり約１×１０３ＧＣ〜約１×１０６ＧＣ（ＧＣ：ゲノムコピー；ゲノムを含むＡＡＶ粒子を測定する）の量（ＭＯＩ：感染多重度）で前記標的細胞の感染が行われる、請求項３０〜請求項６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 対象の眼へのインビボ投与のために、１回の投与は、約１×１０６ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣのオーダー（例えば、約１×１０１１ＧＣ〜約１×１０１２ＧＣの高用量範囲、約１×１０１０ＧＣ〜約１×１０１１ＧＣの中用量範囲、約１×１０９ＧＣ〜約１×１０１０ＧＣの低用量範囲、約１×１０６ＧＣ〜約１×１０９ＧＣの超低用量範囲、及び約１×１０１２ＧＣ〜約２×１０１３ＧＣの超高用量範囲）で、又はこれらの範囲内の用量であってかつ所望の効果を提供するのに充分な任意の用量で実施できる、請求項３０〜請求項６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記投与工程は、疾患症状の発現前又は疾患症状の発現後に行われる、請求項３０〜請求項６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記投与及び／又は標的化送達は、眼及び／又は眼細胞に対するものである、請求項３０〜請求項６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記投与は、網膜下注射、硝子体内注射によるか、又は前記ベクターを封入したデバイスを硝子体内に埋め込むことによるものである、請求項３０〜請求項６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記投与は、前記ベクターを対象の網膜下、眼の後部、角膜、網膜、脈絡膜、ＲＰＥ細胞、光受容体若しくは角膜上皮細胞、又はＣＥ細胞に効果的に送達するその他の任意の投与方法によるものである、請求項３０〜請求項６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記眼への投与は、血流を介した送達によって達成される、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記眼細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、網膜細胞、角膜細胞、水晶体細胞、神経節細胞、視神経細胞、及び／又は脈絡膜細胞、並びに幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞及び／又は組織特異的幹細胞が挙げられるがこれらに限定されない）に由来するこれらの種類の細胞からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記ベクターは、医薬的に許容される担体と、特定の投与経路に適した追加の成分とで製剤化されている、請求項３０〜請求項７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. ＢＣＤを有する、ＢＣＤを発症するリスクがある、又は両アレルＣＹＰ４Ｖ２変異を有する対象を同定することをさらに含む、請求項３０〜請求項７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. １又は複数の制御配列に作動可能に連結された、ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする配列番号２の核酸配列又は配列番号２の前記核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸分子を含むベクターを前記対象の眼細胞に送達することを含む、ヒト対象のクリスタリン網膜症（ＢＣＤ）を治療又は予防する方法。
  75. 前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記制御配列は、プロモーターである、請求項７４及び請求項７５に記載の方法。
  77. ヒトＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードする配列番号２の核酸配列又は配列番号２の前記核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸分子。
  78. 請求項７７に記載の核酸分子と、該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の制御配列とを含む発現カセット。
  79. 請求項７７の核酸分子又は請求項７８の発現カセットを含むベクター。
  80. ウイルスベクターであるか、又は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、組換え単純ヘルペスウイルスベクター、組換えバキュロウイルスベクター、組換えセンダイウイルスベクター、及び組換えレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項７９に記載のベクター。
  81. プラスミド又は非ウイルスベクターである、請求項７９に記載のベクター。
  82. 前記非ウイルスベクターは、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、リポソーム（例えば、カチオン性又はアニオン性リポソーム）、デンドリマー、ナノ粒子、ポリマー（例えば、ポリプレックス）、脂質ポリマー系、固体脂質ナノ粒子、又はリポソームプロタミン／ＤＮＡリポプレックス（ＬＰＤ）からなる群から選択される、請求項８１に記載のベクター。
  83. 請求項７７に記載の核酸分子及び／又は請求項７９〜請求項８２のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
  84. ウイルスベクター媒介遺伝子治療において、ウイルスベクターに対する免疫応答を低下させ、形質導入効率を維持し、ウイルスベクター及び／又は免疫抑制剤の用量を低下させ、及び／又は同じ遺伝疾患の様々な患者に対する治療効果を最大化する方法であって、
    （ａ）抗原領域変異若しくは他の変異を有するバリアント又は前記ウイルスベクターのカプシドのバリアントを作製することによる、前記遺伝子治療のための標的細胞型において充分な形質導入効率を持つ複数の組換えウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）のプールの確立を、前記疾患に関連する標的細胞（例えば、ＢＣＤに対するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療におけるｉＰＳ−ＲＰＥ又はＲＰＥ細胞系）において上記変異又はバリアントが充分な形質導入効率を有することが確認された後で行うこと、
    （ｂ）遺伝子治療を必要とする対象における様々なウイルスベクター血清型及び／又はカプシド変異又はバリアントに対する既存の中和抗ウイルスベクター抗体（ＮＡｂ）を検出し、及び／又は上記対象に由来する患者特異的疾患標的細胞（例えば、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞）において様々なウイルスベクターを試験及び比較すること、
    （ｃ）前記ウイルスベクターのプールから、
    （ｉ）前記疾患標的細胞における充分な形質導入効率、
    （ｉｉ）前記対象の既存のＮＡｂとの低い交差反応性、及び／又は
    （ｉｉｉ）前記対象の患者特異的疾患標的細胞（例えば、ＢＣＤのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子治療における患者特異的ｉＰＳ−ＲＰＥ又はＲＰＥ細胞系）における良好な表現型レスキュー結果、
    を有するウイルスベクターを選択することであって、
    上記ウイルスベクターのプールは、様々な血清型及び／又はカプシド改変ウイルスベクター（例えば、カプシド変異体ＡＡＶ及び／又はカプシドタンパク質バリアントＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない）を含む、
    前記選択すること、
    （ｄ）（ｃ）から選択された前記ウイルスベクターを前記対象への投与に使用すること、及び
    （ｅ）前記対象が遺伝子治療の投与を必要とするたびに、上記（ｂ）〜（ｄ）（既存のＮＡｂに関連する部分のみ）を繰り返すこと（例えば、限定されるものではないが、同じ臓器（例えば、眼又は反対側の眼）又は別の臓器へのフォローアップ投与）、
    を含む、
    方法。
  85. ヒト網膜疾患の治療又は予防にＡＡＶベクター媒介遺伝子治療を使用する方法であって、前記ＡＡＶベクターは、治療用導入遺伝子に作動可能に連結されたＥＦＳプロモーター（配列番号３５）及び／又はスモールポリＡ（配列番号３６）を含む核酸分子、又は配列番号３５との間で少なくとも９０％の配列同一性を有するか、若しくは配列番号３６との間で少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸分子、を含む、方法。
  86. 前記ＡＡＶベクターは、一本鎖ＡＡＶである、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項８５に記載の方法。
  88. 標的遺伝子に１又は複数の変異を含む、
    （ａ）対象から提供された幹細胞、若しくは対象から提供された細胞からリプログラミングされた幹細胞、又は
    （２）対象から提供された幹細胞に由来する細胞、若しくは対象から提供された細胞からリプログラミングされた幹細胞に由来する細胞、
    を含む、細胞系の組成物を含む細胞疾患モデル。
  89. 前記幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項８８に記載の組成物。
  90. 前記幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、体性（又は成体）幹細胞、組織特異的幹細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項８８に記載の組成物。
  91. 前記対象から提供される細胞は、体細胞である、請求項８８に記載の組成物。
  92. 前記対象から提供される細胞は、皮膚細胞、線維芽細胞、又は血液細胞である、請求項８８に記載の組成物。
  93. 対象から提供される前記細胞は、皮膚線維芽細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項８８又は請求項９２に記載の組成物。
  94. 対象から提供される前記細胞は、尿細胞、腎上皮細胞、毛包、又は真皮乳頭細胞である、請求項８８に記載の組成物。
  95. 幹細胞に由来する前記細胞は、眼細胞である、請求項８８に記載の組成物。
  96. 前記眼細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞（ＰＲＣ、例えば、桿体細胞、錐体細胞、及び光受容体前駆細胞）、網膜細胞、角膜細胞、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、視神経細胞、水晶体細胞、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、視神経細胞、又は脈絡膜細胞である、請求項９５に記載の組成物。
  97. 前記幹細胞に由来する細胞は、ニューロン細胞である、請求項８８に記載の組成物。
  98. 前記変異は、前記対象にとって内因性である、請求項８８に記載の組成物。
  99. 前記変異は、遺伝子編集又は遺伝子操作を介して人工的に導入される、請求項８８又は請求項９８に記載の組成物。
  100. 前記細胞系は、前記対象にとって内因性及び／又は外因性である複数の変異を含む、請求項８８に記載の組成物。
  101. 前記対象は、哺乳動物である、請求項８８に記載の組成物。
  102. 前記対象は、ヒトである、請求項８８に記載の組成物。
  103. 前記標的遺伝子は、表４に示す遺伝子を含む、請求項８８に記載の組成物。
  104. 前記標的遺伝子は、
    変異若しくは欠陥を有する、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、又は
    不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子
    を含む、請求項８８に記載の組成物。
  105. 前記標的遺伝子は、ＣＹＰ４Ｖ２である、請求項８８に記載の組成物。
  106. 前記細胞系は、ｉＰＳ細胞を含む、請求項１０５に記載の組成物。
  107. 前記細胞系は、ｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を含む、請求項１０５に記載の組成物。
  108. 前記細胞系は、ｉＰＳ−光受容体（ｉＰＳ−ＰＲＣ）細胞、ｉＰＳ−角膜上皮細胞（ｉＰＳ−ＣＥＣ）、ｉＰＳ−脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、ｉＰＳ−角膜細胞、ｉＰＳ−脈絡膜細胞、ｉＰＳ−視神経細胞、ｉＰＳ−眼細胞、又はｉＰＳ−ニューロン細胞を含む、請求項１０５に記載の組成物。
  109. 前記細胞系におけるＣＹＰ４Ｖ２変異は対象にとって内因性である、請求項８８又は請求項１０５〜請求項１０８のいずれか一項に記載の組成物。
  110. 前記対象は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のオーソログに病的変異を有する、請求項８８又は請求項１０９に記載の組成物。
  111. 前記対象は、表１に示す少なくとも１つのホモ接合性変異又は複合した２つのヘテロ接合性変異を有する、請求項８８又は請求項１０９に記載の組成物。
  112. 前記対象は、遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）又は網膜色素変性症（ＲＰ）を有する、請求項８８に記載の組成物。
  113. 前記対象は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ；Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィー、Ｂｉｅｔｔｉ結晶性網膜症、Ｂｉｅｔｔｉ網膜ジストロフィーとしても知られる）を有するか、又はＢＣＤを発症するリスクがある、請求項８８に記載の組成物。
  114. 前記細胞系は、前記対象にとって外因性であり、遺伝子編集又は遺伝子操作を介して人工的に導入される少なくとも１つのＣＹＰ４Ｖ２変異を含む、請求項８８又は請求項１０５に記載の組成物。
  115. 前記細胞系は、
    ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、組織特異的幹細胞、若しくは成体幹細胞、又は
    ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、組織特異的幹細胞、若しくは成体幹細胞に由来する、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、角膜上皮細胞、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞若しくは脈絡膜細胞、
    を含む、請求項８８又は請求項１１４に記載の組成物。
  116. ＢＣＤ患者の細胞若しくは細胞系に由来する、又は人工的に作製された両アレルＣＹＰ４Ｖ２変異を有する細胞若しくは細胞系に由来する、ｉＰＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞系又はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞若しくはｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系を含む、ＢＣＤヒト細胞モデル組成物又はＣＹＰ４Ｖ２機能不全細胞モデル組成物。
  117. 前記細胞系は、健康な対照の対応する細胞系と比較して、以下の化合物群の１又は複数の化合物について異常な生化学的プロファイルを有するか、異常なＲＰＥ機能、又はより高い細胞萎縮、細胞変性、若しくは細胞死レベルを有する、請求項８８又は請求項１０５〜請求項１１６のいずれか一項に記載の組成物。
    （ｉ）脂肪酸、
    （ｉｉ）セラミド、
    （ｉｉｉ）スフィンゴミエリン、
    （ｉｖ）スフィンゴシン、
    （ｖ）スフィンガニン、
    （ｖｉ）ヒドロキシ脂肪酸、
    （ｖｉｉ）コルチコステロイド、又は
    （ｖｉｉｉ）タンパク質（ＣＹＰ４Ｖ２以外）
  118. 前記細胞系は、健康な対照の対応する細胞系と比較して、表２に示す１又は複数の化合物について異常な生化学的プロファイルを有する、請求項８８又は請求項１０５〜請求項１１７のいずれか一項に記載の組成物。
  119. 患者の細胞系（又はその疾患を引き起こす遺伝子の外因性変異を含む、遺伝子編集又は遺伝子操作された細胞系）と健康な対照とにおける細胞生存率レベルを評価及び比較することを含む、疾患細胞モデルにおける異常又は表現型を発見する方法。
  120. 患者の細胞系（又はその疾患を引き起こす遺伝子の外因性変異を含む、遺伝子編集又は遺伝子操作された細胞系）と健康な対照とにおけるＲＰＥ機能レベル（例えば、食作用活性、経上皮耐性）を評価及び比較することを含み、
    前記細胞系はＲＰＥ細胞系である（幹細胞由来のＲＰＥ細胞系でもよい）、
    疾患細胞モデルにおける異常又は表現型を発見する方法。
  121. 細胞系間の比較が、光への暴露なしで行われる、請求項１１９又は請求項１２０に記載の方法。
  122. 細胞系間の比較が、光への暴露後に行われる、請求項１１９又は請求項１２０に記載の方法。
  123. 細胞系間の比較が、青色光への暴露後に行われる、請求項１１９、請求項１２０、又は請求項１２２に記載の方法。
  124. 細胞生存率が、死細胞／生細胞比、病気の細胞／健康な細胞の比若しくはこれらに類似の比；又は死細胞／全体の細胞若しくは生細胞／全体の細胞の百分率によって測定される、請求項１１９、請求項１２１、請求項１２２、又は請求項１２３に記載の方法。
  125. 患者の細胞系（又はその疾患を引き起こす遺伝子の外因性変異を含む、遺伝子編集又は遺伝子操作された細胞系）と健康な対照との間で、１又は複数の化合物のレベルを評価及び比較することを含み、
    前記１又は複数の化合物は以下の群から選択される、
    疾患細胞モデルにおける異常又は表現型を発見する方法。
    （ｉ）脂肪酸、
    （ｉｉ）セラミド、
    （ｉｉｉ）スフィンゴミエリン、
    （ｉｖ）スフィンゴシン、
    （ｖ）スフィンガニン、
    （ｖｉ）ヒドロキシ脂肪酸、
    （ｖｉｉ）コルチコステロイド、及び／又は
    （ｖｉｉｉ）タンパク質
  126. 評価される化合物のうち１又は複数は、表２に示されている、請求項１２５に記載の方法。
  127. 化合物レベルの識別及び／又は評価が、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳ、及び／又はＦＩＡ−ＭＳ／ＭＳを使用して実施される、請求項１２５又は請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記疾患細胞モデルは、表４に示される変異又は欠陥を有する遺伝子を少なくとも１つ含む、請求項１１９、請求項１２０、又は請求項１２５の方法。
  129. 前記疾患細胞モデルは、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、又はＣＹＰ４６Ａの遺伝子の中からの、変異又は欠陥を有する遺伝子を含む、請求項１１９、請求項１２０、又は請求項１２５の方法。
  130. ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系に由来する細胞、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系に由来する細胞を、試験薬に接触させることと、
    上記試験薬による接触前と比較した、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；及び／又は細胞構造、細胞形態若しくは細胞機能の改善、又は細胞生存率の改善、について前記細胞を評価することと、
    を含み、
    上記試験薬による処理前と比較した、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；及び／又は細胞構造、細胞形態、細胞機能、又は細胞生存率の改善、は、試験薬がＢＣＤに対して治療効果を有することの指標となり、
    細胞系間の比較は、光への暴露後及び／又は光への暴露なしで行うことができる、
    ＢＣＤに対する治療効果について試験薬をスクリーニングする方法。
  131. 前記試験薬は、核酸又はそのアナログ、核酸配列を含む又はポリペプチドをコードするベクター、ポリペプチド又はそのアナログ、抗体、化学物質、小分子、及び／又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、機能アッセイ、細胞生存率アッセイ、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価される、請求項１３０に記載の方法。
  133. ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料を、様々な製剤、ベクター、又はコンストラクトに製剤化又はパッケージングされた試験薬に接触させることと、
    上記試験薬による処理前と比較した、及び／又は同じ試験薬ではあるものの異なる製剤、ベクター、又はコンストラクトに製剤化又はパッケージングされた試験薬で処理された細胞試料と比較した、表２に記載の１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；細胞構造、細胞形態、細胞機能、又は細胞生存率の改善；及び／又は細胞耐性若しくは細胞死、について前記細胞試料を評価することによって、上記製剤、ベクター、又はコンストラクトの効率又は有効性を決定及び比較することと、
    を含み、
    前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、細胞生存率アッセイ、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価され、
    細胞系間の比較は、光への暴露後及び／又は光への暴露なしで行うことができる、
    ＢＣＤの試験薬を含む製剤、ベクター、又はコンストラクトの有効性又は効率をスクリーニングする方法。
  134. ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの複数の細胞試料を、細胞試料ごとに異なる用量で、試験薬に接触させることと、
    上記試験薬による処理前と比較した、及び／又は同じ試験薬ではあるものの異なる用量の試験薬で処理された細胞試料と比較した、表２に記載の１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；細胞構造、細胞形態、細胞生存率若しくは細胞機能の改善；及び／又は細胞耐性若しくは細胞死、について前記細胞試料を評価することによって、異なる用量の有効性及び安全性を決定及び比較し、それにより適切な用量範囲を決定することと、
    を含み、
    前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、機能アッセイ、細胞生存率アッセイ、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価され、
    細胞系間の比較は、光への暴露後及び／又は光への暴露なしで行うことができる、
    ＢＣＤのための試験薬の効果的かつ安全な投与量範囲をスクリーニングする方法。
  135. 網膜又は網膜細胞に治療薬を送達するための送達デバイス又は送達方法の有効性又は効率をスクリーニング又は評価する方法であって、
    （ｉ）ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの細胞試料を、前記送達デバイス又は送達方法を使用せずに、試験薬に接触させることと、
    （ｉｉ）ＢＣＤ患者由来のｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの別個の細胞試料、又は人工の遺伝子編集若しくは遺伝子操作の結果として変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含んでいるｉＰＳ−ＲＰＥ細胞系からの別個の細胞試料を、前記送達デバイス又は送達方法を使用して、（ｉ）と同じ用量の前記試験薬に接触させることと、
    （ｉｉｉ）上記試験薬による処理前と比較した、及び／又は同じ用量の同じ試験薬による処理であって前記送達デバイス又は送達方法を使用していない処理と比較した、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内のＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；細胞構造、細胞形態若しくは細胞機能の改善；細胞耐性若しくは細胞死；及び／又は前記細胞内の前記試験薬のレベル、について（ｉ）及び（ｉｉ）からの前記細胞試料を評価及び比較することによって、上記送達デバイス又は送達方法の有効性又は効率を決定及び比較することと、
    を含み、
    前記細胞は、ＰＣＲ技術、イムノアッセイ、シークエンシング、生化学アッセイ、機能アッセイ、細胞生存率、顕微鏡検査、又はそれらの組み合わせを用いて評価され、
    細胞系間の比較は、光への暴露後及び／又は光への暴露なしで行うことができる、
    方法。
  136. 前記網膜細胞は、ＲＰＥ細胞である、請求項１３５に記載の方法。
  137. 本願の遺伝子編集療法に係る請求項又はＲＮＰに係る請求項のいずれか１つによって患者の細胞系の変異を遺伝的に修正することを含む、同質遺伝子対照を生成する方法。
  138. インビトロで患者特異的ｉＰＳ−眼細胞モデルで決定された最適用量レベル（例えば、インビトロでの遺伝子治療のＭＯＩとして示される）に、インビボ治療の標的となる眼細胞（例えば、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、又はＲＰＥ細胞と光受容体細胞）の推定数を乗じることにより、インビボで使用するための遺伝子治療ベクターの用量レベル（例えば、ＧＣ又はｇｐ）を得ること、
    を含み、
    上記ベクターの用量レベルが、乗数（例えば、１〜１０（例えば、網膜下注射の場合は１〜５、硝子体内注射の場合は５〜１０）；適用される前記乗数に影響を与える他の要因としては、標的領域のサイズ及び治療される対象（例えば、治療対象の年齢、体重、並びに疾患進行度、及び状態、並びに潜在的な免疫反応（すなわち、既存のＮＡｂ）、治療の標的となる眼細胞の位置と密度）が挙げられる）によって調整されることによって、インビボ治療の治療有効用量範囲を提案し、該治療有効用量範囲は臨床試験で確認又はさらに改良可能である、
    患者特異的ｉＰＳ−眼細胞を使用して、インビボでの治療の治療有効量を評価及び提案する方法。
  139. 前記方法は、個々の患者のインビボでの治療に使用される個別化した最適用量を評価又は提案するために使用される、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記疾患は、遺伝性網膜障害（ＩＲＤ）又は網膜色素変性症（ＲＰ）である、請求項１３８又は請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記疾患はＢＣＤであり、
    前記ｉＰＳ−眼細胞はｉＰＳ−ＲＰＥ細胞であり、
    インビボでの治療の標的となる前記眼細胞はＲＰＥ細胞である、
    請求項１３８又は請求項１３９に記載の方法。
  142. （ａ）ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の核酸配列、又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の隣接１００ｂｐ以内の核酸配列を（「標的配列」を）標的とするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、及び
    （ｂ）機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）
    を含む組成物。
  143. （ｃ）ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子又はその一部の修正、破壊、又は置換のための、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の野生型配列又は機能的配列の全部又は一部を含むドナー核酸配列、をさらに含む、請求項１４２に記載の組成物。
  144. 前記組成物の１又は複数の成分は、該成分をコードするＤＮＡ分子、該成分をコードするｍＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、及び／又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）、又はタンパク質−ＲＮＡ複合体の形態で提供される、請求項１４２又は請求項１４３に記載の組成物。
  145. 前記組成物の２以上の成分は、別々の分子にある又は１つの分子若しくは１つの複合体に組み合わされているか、別々のベクターにある又は１つのベクターに組み合わされているか、１又は複数の核酸複合体にあるか、１又は複数のＲＮＰ複合体にある、請求項１４２又は請求項１４３に記載の組成物。
  146. 前記ドナー核酸配列は、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）又はベクター中に提供される、請求項１４３に記載の組成物。
  147. 前記ベクターがプラスミド、組換えＡＡＶベクター、組換えレンチウイルスベクター、及び／又はそれらの組み合わせである、請求項１４２〜請求項１４６のいずれか一項に記載の組成物。
  148. 請求項１４２〜請求項１４７のいずれか一項に記載の組成物を含む病的ＣＹＰ４Ｖ２変異を有する細胞を含む組成物。
  149. （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、
    （ｉ）標的遺伝子（「標的遺伝子」）中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列、及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の相補的な領域に対応する配列、を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
    （ｉｉ）前記ｃｒＲＮＡの対応する領域に相補的な領域、及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と相互作用する配列、を含むｔｒａｃｒＲＮＡと、
    を含み、
    （ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣａｓ９を含む、
    請求項１４２〜請求項１４８のいずれか一項に記載の組成物。
  150. 前記プロトスペーサーエレメントは、約２０塩基、約１９塩基、約２１塩基、約１９〜２１塩基、約１８〜２２塩基、又は約１６〜２４塩基である、請求項１４９に記載の組成物。
  151. 前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、別々の分子内にある、請求項１４９又は請求項１５０に記載の組成物。
  152. 前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）において組み合わされている、請求項１４９又は請求項１５０に記載の組成物。
  153. 前記ｓｇＲＮＡは、約８８〜１５０ｂｐである、請求項１５２に記載の組成物。
  154. 前記Ｃａｓ９が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｄ１１３５Ｅ）、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ、ＳｐＣａｓ９ＥＱＲ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｎｏｎｉａｅ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、及びエンテロコッカス・ファエカリス（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から選択されるＣａｓ９オーソログ又は変異体Ｃａｓ９を含む、請求項１４９〜請求項１５３のいずれか一項に記載の組成物。
  155. （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、標的遺伝子中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列を含むｃｒＲＮＡを含み、
    （ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣｐｆ１を含む、
    請求項１４２〜請求項１４８のいずれか一項に記載の組成物。
  156. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であるＣａｓ９又はＣｐｆ１は、１、２、３又はそれ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端及び／又はＣ末端にさらに含む、及び／又は、非限定的な例としてＧＦＰ又はＥＧＦＰが挙げられる選択マーカーをさらに含む、請求項１４２〜請求項１５５のいずれか一項に記載の組成物。
  157. 前記プロトスペーサーエレメント配列は、配列番号４８〜５２からなる群から選択されるか、配列番号４８〜５２のいずれか一つとの間で少なくとも８５％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を標的とするために、ＮＧＧをプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とするＣａｓタンパク質と共に使用される、請求項１４２に記載の組成物。
  158. 前記ドナー核酸配列は、配列番号５６及び５７からなる群から選択されるか、配列番号５６及び５７のいずれか又はその相補的な配列との間で少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正、破壊、又は置換するために使用される、請求項１４２、請求項１４３、又は請求項１５７に記載の組成物。
  159. 変異したＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を持つ対象又は細胞におけるＢＣＤを治療又は予防する方法であって、
    （ｉ）シークエンシングによって前記対象又は細胞における病的変異を特定すること、
    （ｉｉ）前記変異に関与する最初のヌクレオチドの上流約１００ｂｐから、前記変異に関与する最後のヌクレオチドの下流約１００ｂｐまでに及ぶ領域内のＣａｓ関連ＰＡＭ部位を見つけること、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で特定された各ＰＡＭ部位に関連するＣＹＰ４Ｖ２配列を標的とする様々なプロトスペーサーエレメント配列を特定すること、
    （ｉｖ）（ｉｉｉ）で特定されたプロトスペーサーエレメント配列を含む各ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの活性レベルと、オフターゲット編集のプロファイルとを、前記プロトスペーサーエレメント配列及びＰＡＭについて評価すること、
    （ｖ）（ｉｖ）に基づいて１又は複数のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ設計を選択すること、
    （ｖｉ）標的ＣＹＰ４Ｖ２変異を修正、破壊、又は置換するための相同組換修復（ＨＤＲ）に基づく１又は複数のドナー核酸配列を設計すること、
    （ｖｉｉ）組成物に関する請求項１〜請求項１８で提供される、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、Ｃａｓ、及びドナー核酸配列を構築すること、
    （ｖｉｉｉ）所望により、活性レベル及び／又はオフターゲット編集プロファイルを評価するために、前記対象から単離された細胞；前記対象由来のｉＰＳ細胞、若しくは前記対象由来の幹細胞から分化した細胞；又は前記対象から単離されたゲノムＤＮＡ、における（ｖｉｉ）の成分を検証し、さらに選択すること、及び
    （ｉｘ）リボ核タンパク質又はタンパク質−ＲＮＡ複合体、ベクター、タンパク質、核酸分子、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される送達システムによって、前記対象又は前記細胞に（ｖｉｉｉ）の成分を投与することであって、前記送達は、エレクトロポレーションにより、若しくは、脂質媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入若しくはインジェクション、又はそれらの組み合わせによって行われる、前記投与すること、
    を含む、変異したＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を持つ対象又は細胞におけるＢＣＤを治療又は予防する方法。
  160. （ｉ）配列番号４８〜５２の１つから選択されるか、配列番号４８〜５２の配列の１つとの間で少なくとも８０％の配列同一性を有するプロトスペーサーエレメント配列を含む、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、
    （ｉｉ）配列番号５６及び５７の１つから選択されるか、配列番号５６及び５７の１つ又はその相補的な配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するドナー核酸配列、及び
    （ｉｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質（例示的な配列を配列番号５８に示す）（所望により、１、２、３又はそれ以上のＮＬＳ、非限定的な例としてＧＦＰ又はＥＧＦＰが挙げられる選択マーカーを含む）、
    を含む、インビボで対象における又はインビトロで細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正又は置換するための遺伝子編集組成物。
  161. 前記プロトスペーサーエレメント配列の前に所望によるヌクレオチドＧ（配列番号５９）が付加される、請求項１６０に記載の組成物。
  162. 前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（例示的な配列（ただし、５’プロトスペーサーエレメント配列は含めていない）を配列番号５３に示す）、及びｔｒａｃｒＲＮＡ（例示的な配列を配列番号５４に示す）を含み、
    前記プロトスペーサーエレメント配列は前記ｃｒＲＮＡに含まれる、
    請求項１６０又は請求項１６１に記載の組成物。
  163. 前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、前記プロトスペーサーエレメント配列を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（例示的なｓｇＲＮＡ配列（ただし、５’プロトスペーサーエレメント配列は含めていない）を配列番号５５に示す）を含む、請求項１６０〜請求項１６２のいずれか一項に記載の組成物。
  164. （ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の１又は複数の成分は、当該成分をコードするＤＮＡ分子、当該成分をコードするｍＲＮＡ分子、核酸分子、ベクター、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、又はタンパク質−ＲＮＡ複合体、及び／又はそれらの組み合わせの形態で提供される、請求項１６０〜請求項１６３のいずれか一項に記載の組成物。
  165. 対象における眼の疾患を治療又は予防する方法であって、
    前記疾患はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の病的な遺伝的又はエピジェネティックな変化と関連しており、
    前記方法は、前記対象に細胞組成物を投与することを含み、
    前記細胞組成物は、幹細胞由来の、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体又は光受容体前駆細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、及び／又はその他の眼細胞若しくはその他の細胞を含む、
    対象における眼の疾患を治療又は予防する方法。
  166. 前記幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、ｉＰＣ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記幹細胞は、ＢＣＤを有しない又は病的ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を有しない１又は複数の対象からのものであるか、又はＢＣＤを有しない又は病的ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を有しない１又は複数の対象に由来するものである、請求項１６５に記載の方法。
  168. 前記幹細胞は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する１又は複数の対象からのものであるか、又はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する１又は複数の対象に由来するものである、請求項１６５に記載の方法。
  169. 前記対象は、ヒト対象である、請求項１６５〜請求項１６８のいずれか一項に記載の方法。
  170. （ａ）ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞、若しくはＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞、又は
    （２）ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞から分化した細胞、若しくはＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞から分化した細胞、
    を含む細胞組成物。
  171. 前記対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞は、ｉＰＣ細胞である、請求項１７０に記載の組成物。
  172. 前記ｉＰＳ細胞は、前記対象の体細胞からリプログラミングされる、請求項１７０に記載の組成物。
  173. 前記ｉＰＳ細胞は、皮膚細胞、血液細胞、尿細胞、有毛細胞、線維芽細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腎上皮細胞、毛包、又は真皮乳頭細胞からリプログラミングされる、請求項１７０に記載の組成物。
  174. 前記対象から単離された幹細胞は、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である、請求項１７０記載の組成物。
  175. 前記幹細胞から分化した細胞は、眼細胞である、請求項１７０に記載の組成物。
  176. 前記幹細胞から分化した細胞は、ＲＰＥ細胞、ＰＲＣ、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、ＣＥＣ、又はＣＥ細胞である、請求項１７０又は請求項１７５に記載の組成物。
  177. 前記幹細胞から分化した細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又はｉＰＳ−ＣＥ細胞である、請求項１７０に記載の組成物。
  178. （ｉ）ｉＰＳＣへリプログラミングするために使用される、前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞、
    （ｉｉ）前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞、若しくは前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞、又は
    （ｉｉｉ）前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された幹細胞から分化した細胞、若しくは前記ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的変異を有する対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞から分化した細胞、
    は、変異ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の影響を緩和するために遺伝的に修復される、請求項１７０に記載の組成物。
  179. 遺伝子修復は、遺伝子導入療法によって行われる、請求項１７８に記載の組成物。
  180. 遺伝子修復は、遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子導入療法によって行われる、請求項１７８に記載の組成物。
  181. 遺伝子修復は、遺伝子編集療法によって行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  182. 遺伝子修復は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子編集療法によって行われる、請求項１８１に記載の組成物。
  183. ＣＹＰ４Ｖ２自家細胞組成物に関連する請求項のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含み、
    前記細胞組成物は、前記対象の幹細胞由来の、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体又は光受容体前駆細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、及び／又はその他の眼細胞若しくはその他の細胞を含む遺伝的に修復された細胞を含む、
    ＢＣＤに罹患したかＣＹＰ４Ｖ２遺伝子に病的な遺伝的又はエピジェネティックな変化を有する対象における眼の疾患を治療又は予防する方法。
  184. 前記幹細胞は、ｉＰＣ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である、請求項１８３に記載の方法。
  185. 前記ｉＰＳ細胞は、転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣのうち１又は複数を使用してリプログラミングされる、請求項１８４に記載の方法。
  186. 前記遺伝的に修復された細胞は、遺伝子修復を行う前と比較した場合の、表２に示す１又は複数の化合物のレベルの正常化；前記細胞内の非欠陥ＣＹＰ４Ｖ２核酸配列の増加；前記細胞内の機能的ＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドの量の増加；及び／又は細胞構造、細胞形態、細胞生存率、又は細胞機能の改善、の１又は複数を示す、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  187. 投与される細胞の量は、１回の投与で約１，０００〜約１０００万個の細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  188. 投与は注射、網膜下注射、又は硝子体内注射による、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  189. 投与は、前記対象の眼の網膜下の場所、後部、又は角膜に細胞を効果的に送達するその他の任意の投与方法による、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  190. 細胞懸濁液の注射によって前記細胞が投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記細胞は、シート、マトリックス、足場、組織、又は三次元（３Ｄ）網膜構造の一部として投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  192. 前記ＲＰＥ細胞は、天然及び／又は合成の足場を使用して投与され、機能的なＲＰＥ単層を生成する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  193. 前記対象はヒト対象である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  194. （ａ）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞、又は、
    変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全又は部分的な機能又は活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された幹細胞、又は
    （２）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された幹細胞から分化した細胞、又は
    変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞から分化した細胞、
    を含む細胞組成物。
  195. 前記対象から単離された細胞からリプログラミングされた幹細胞は、ｉＰＳ細胞である、請求項１９４に記載の組成物。
  196. 前記ｉＰＳ細胞は、前記対象の体細胞からリプログラミングされる、請求項１９５に記載の組成物。
  197. 前記ｉＰＳ細胞は、皮膚細胞、血液細胞、尿細胞、有毛細胞、線維芽細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腎上皮細胞、毛包、又は真皮乳頭細胞からリプログラミングされる、請求項１９５又は請求項１９６に記載の組成物。
  198. 前記対象から単離された幹細胞は、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である、請求項１９４記載の組成物。
  199. 前記遺伝子は眼の発達又は機能に関与する、及び／又は前記遺伝子の変異が眼疾患を引き起こすか眼疾患を引き起こす危険因子である、請求項１９４に記載の組成物。
  200. 前記遺伝子は神経の発達又は機能に関与する、及び／又は前記遺伝子の変異が神経変性疾患を引き起こすか神経変性疾患を引き起こす危険因子である、請求項１９４に記載の組成物。
  201. 前記遺伝子は、シトクロムＰ４５０遺伝子である、請求項１９４に記載の組成物。
  202. 前記遺伝子は表４に示す１つの遺伝子である、請求項１９４に記載の組成物。
  203. 前記遺伝子は、
    変異若しくは欠陥を有する、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、又は
    不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、
    を含む、請求項１９４に記載の組成物。
  204. 前記幹細胞から分化した細胞は、任意の種類の細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  205. 前記幹細胞から分化した細胞は、眼細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  206. 前記幹細胞から分化した細胞は、ＲＰＥ細胞、ＰＲＣ、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、ＣＥＣ、ＣＥ細胞、又は視神経細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  207. 前記幹細胞から分化した細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又はｉＰＳ−ＣＥ細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  208. 前記幹細胞から分化した細胞は、ニューロンである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  209. （ｉ）ｉＰＳＣへリプログラミングするために使用される、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された前記細胞、
    （ｉｉ）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された前記幹細胞、又は
    変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞、又は
    （ｉｉｉ）変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された幹細胞から分化した前記細胞、又は
    変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象から単離された細胞からリプログラミングされたｉＰＳ細胞、
    は、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子の影響を緩和するために遺伝的に修復される、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  210. 遺伝子修復は、遺伝子導入療法によって行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  211. 遺伝子修復は、遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子導入療法によって行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  212. 遺伝子修復は、遺伝子編集療法を介して行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  213. 遺伝子修復は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集療法に関する請求項のいずれか一項に記載の任意の組成物又は方法を使用することにより、遺伝子編集療法によって行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  214. 自家細胞組成物に関連する請求項のいずれか一項に記載の細胞組成物を対象に投与することを含み、
    前記細胞組成物は、前記対象の幹細胞由来の、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体又は光受容体前駆細胞（ＰＲＣ）、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、ニューロン、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、及び／又は他の眼細胞若しくは他の細胞を含む、遺伝的に修復された細胞を含み、
    前記細胞組成物の変異又は欠陥を有する遺伝子が遺伝的に修復済みである、
    表４に記載の、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、によって引き起こされる疾患に罹患した対象における疾患を治療又は予防する方法。
  215. （ｉ）眼疾患に罹患した対象からの細胞を準備すること、
    （ｉｉ）前記対象からの前記細胞に多能性を誘導してｉＰＳＣを生成すること、
    （ｉｉｉ）遺伝子編集療法により、前記対象に由来する前記ｉＰＳＣにおける、表４に示され変異又は欠陥を有する遺伝子の１又は複数の変異を遺伝的に修復すること、
    （ｉｖ）必要に応じて、置換移植のために前記ｉＰＳＣを眼細胞又は他の細胞に分化させること、
    （ｖ）工程（ｉｉｉ）の代わりに、遺伝子導入療法によって前記ｉＰＳ由来細胞を遺伝的に修復すること、
    （ｖｉ）前記ｉＰＳ由来細胞を前記対象に導入し、それにより、変異又は欠陥を有する遺伝子（「標的遺伝子」）に関連する疾患を有する前記対象を自家治療すること、
    を含む、対象を自家治療する方法。
  216. 前記幹細胞は、ｉＰＣ細胞、ＭＳＣ、成体幹細胞、又は組織特異的幹細胞である、請求項２１４又は請求項２１５に記載の方法。
  217. 前記ｉＰＳ細胞は、転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣのうち１又は複数を使用してリプログラミングされる、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記遺伝的に修復された細胞は、遺伝子修復を行う前と比較して、前記細胞内の非欠陥標的遺伝子核酸配列の増加；前記細胞内の前記標的遺伝子にコードされる機能的ポリペプチドの量の増加；前記細胞における細胞構造、細胞形態、細胞生存率、若しくは細胞機能の改善、及び／又は生化学的機能の改善若しくは正常化、のうち１又は複数を示す、請求項２１４又は請求項２１５に記載の方法。
  219. 投与される細胞の量は、１回の投与で約１，０００〜約１０００万個の細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  220. 前記投与は注射、網膜下注射、又は硝子体内注射による、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  221. 前記投与は、前記対象の眼の網膜下の場所、後部、若しくは角膜、又は前記置換細胞を必要とする組織若しくは臓器に細胞を効果的に送達するその他の任意の投与方法による、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  222. 細胞懸濁液の注射によって前記細胞が投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  223. 前記細胞は、シート、マトリックス、足場、組織、又は三次元（３Ｄ）網膜構造の一部として投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  224. 前記ＲＰＥ細胞は、天然及び／又は合成の足場を使用して投与され、機能的なＲＰＥ単層を生成する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  225. 前記対象はヒト対象である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  226. 前記疾患は、表４に示す１つ以上の遺伝子における前記対象の遺伝的又はエピジェネティックな変化又は危険因子に関連している、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  227. 前記疾患は、光受容体変性、網膜色素上皮細胞変性、網膜変性、角膜変性、及び／又は脈絡膜障害である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  228. 前記疾患は、遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  229. 前記疾患は、網膜色素変性症（ＲＰ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  230. 前記疾患は、クリスタリン網膜症（ＢＣＤ；Ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィーとしても知られる）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  231. 前記疾患は、神経変性に関連している、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  232. 前記疾患は、角膜ジストロフィーである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  233. 前記対象は、ＢＣＤに罹患しているかＢＣＤを発症するリスクがある、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  234. 前記細胞は、線維芽細胞、血液細胞、又は眼細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  235. 前記細胞は、尿、毛、又は毛包から得られる、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  236. 前記眼細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、角膜上皮細胞（ＣＥＣ）、脈絡膜内皮（ＣＥ）細胞、又は光受容体細胞（ＰＲＣ）である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  237. 前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、変異、挿入、一塩基多型、不適当なメチル化、不適当な脱メチル化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  238. 前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、変異である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  239. 前記対象からの前記ｉＰＳ−眼細胞における前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、遺伝子編集療法を使用して遺伝的に修復済みである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  240. 前記遺伝子編集療法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮテクノロジー、又はＣＲＩＳＰＲテクノロジーを利用している、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  241. 前記対象からの前記ｉＰＳＣ−眼細胞における前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、遺伝子導入療法を使用して遺伝的に修復済みである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  242. 前記遺伝子導入療法は、組換えＡＡＶベクター又は別のウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、移植される前記細胞に前記標的遺伝子の健全なコピー（例えば、ｃＤＮＡ）を送達する、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  243. 前記投与工程は、疾患症状の発現前又は疾患症状の発現後に行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  244. 投与は、眼、又はニューロンを含む別の臓器若しくは組織に対するものである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  245. 投与は、注射、網膜下注射若しくは硝子体内注射、又は網膜への直接注射によるものである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  246. 投与は、前記対象の眼の網膜下の場所、後部、若しくは角膜、又は置換細胞を必要とする組織若しくは臓器に細胞を効果的に送達するその他の任意の投与方法による、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  247. 投与又は移植の前に、前記細胞の遺伝子型分析を行って、表４に示す１又は複数の遺伝子の遺伝的又はエピジェネティックな変化の有無を確認すること、をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  248. 前記遺伝的又はエピジェネティックな変化は、変異である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  249. 前記変異は、前記ＣＹＰ４Ｖ２核酸分子に存在する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  250. 投与前に、前記対象の眼を評価して、損傷した又は維持されている光受容体、網膜細胞、又は角膜細胞の領域及び程度を特定すること、をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  251. 投与後に、前記対象をモニタリングすることをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  252. 前記モニタリングには、非侵襲的網膜イメージング、角膜検査、暗順応、コントラスト感度、視野測定、ＥＲＧ、ＯＣＴ、視力検査、及び／又は機能検査を実施することが含まれる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  253. 前記モニタリングは、免疫応答について前記対象を評価することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  254. 投与後に、前記対象の眼を評価して、損傷した又は維持されている光受容体、網膜細胞、又は角膜細胞の領域及び程度を特定すること、をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  255. （ａ）標的遺伝子（「標的遺伝子」）中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列を（「標的配列」を）標的とするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、及び
    （ｂ）機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質
    を、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）又はタンパク質ＲＮＡ複合体内に含む組成物。
  256. （ｃ）前記標的遺伝子又はその一部の修正又は置換のための、前記標的遺伝子の野生型配列又は機能的配列の全部又は一部を含むドナー核酸配列をさらに含む、請求項２５５に記載の組成物。
  257. 前記標的遺伝子は眼の発達又は機能に関与する、及び／又は前記標的遺伝子の変異が眼疾患を引き起こすか眼疾患を引き起こす危険因子である、請求項２５５又は請求項２５６に記載の組成物。
  258. 前記標的遺伝子は神経の発達又は機能に関与する、及び／又は前記標的遺伝子の変異が神経変性疾患を引き起こすか神経変性疾患を引き起こす危険因子である、請求項２５５又は請求項２５６に記載の組成物。
  259. 前記標的遺伝子は、シトクロムＰ４５０遺伝子である、請求項２５５又は請求項２５６に記載の組成物。
  260. 前記標的遺伝子は、変異若しくは欠陥を有する、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、表４に記載の少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項２５５又は請求項２５６に記載の組成物。
  261. 前記ドナー核酸配列は、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）又はベクターに含まれて提供される、請求項２５６に記載の組成物。
  262. （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、（ｉ）標的遺伝子中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列と、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の相補的な領域に対応する配列と、を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及び（ｉｉ）前記ｃｒＲＮＡの対応する領域に相補的な領域と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と相互作用する配列と、を含むｔｒａｃｒＲＮＡ、を含み、
    （ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣａｓ９を含む、請求項２５５〜請求項２６１のいずれか一項に記載の組成物。
  263. 前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、異なる核酸分子内にある、請求項２６１又は請求項２６２に記載の組成物。
  264. 前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に組み合わされる、請求項２６１又は請求項２６２に記載の組成物。
  265. 前記Ｃａｓ９が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｄ１１３５Ｅ）、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ、ＳｐＣａｓ９ＥＱＲ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｎｏｎｉａｅ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、及びエンテロコッカス・ファエカリス（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から選択されるＣａｓ９オーソログ又は変異体Ｃａｓ９を含む、請求項２６１〜請求項２６４のいずれか一項に記載の組成物。
  266. （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、標的遺伝子中又は標的遺伝子の隣接１００ｂｐ以内にある標的配列に相補的であるプロトスペーサーエレメント配列を含むｃｒＲＮＡを含み、
    （ｂ）前記機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＣｐｆ１を含む、
    請求項２５５〜請求項２６５のいずれか一項に記載の組成物。
  267. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であるＣａｓ９又はＣｐｆ１は、１、２、３又はそれ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をＮ末端及び／又はＣ末端にさらに含む、及び／又は非限定的な例としてＧＦＰ又はＥＧＦＰが挙げられる選択マーカーをさらに含む、請求項２５５〜請求項２６６のいずれか一項に記載の組成物。
  268. 前記プロトスペーサーエレメントは、前記標的配列に１００％相補的であるか、標的配列に対応させると１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドミスマッチを含む、請求項２５５〜請求項２６７のいずれか一項に記載の組成物。
  269. 前記ｃｒＲＮＡ配列は、前記プロトスペーサーエレメントの直前に、前記ｃｒＲＮＡ配列に所望により追加されたＧヌクレオチドをさらに含む、請求項２５５又は請求項２５６に記載の組成物。
  270. 前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡは、化学修飾されている、請求項２５５〜請求項２６９のいずれか一項に記載の組成物。
  271. 前記標的遺伝子の野生型バージョンは、酵素をコードする、請求項２５５〜請求項２７０のいずれか一項に記載の組成物。
  272. 前記標的遺伝子は、
    変異若しくは欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子、又は
    不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、若しくはＣＹＰ４６Ａの遺伝子を含む、請求項２５５又は請求項２５６に記載の組成物。
  273. 前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、及び／又は前記ドナー核酸配列を含む１又は複数の成分は、当該成分に転写及び／又は翻訳できるベクター、ＤＮＡ、及び／又はｍＲＮＡに別々に及び／又は追加的に提供されている、請求項２５５〜請求項２７２のいずれか一項に記載の組成物。
  274. 請求項２５５又は請求項２７３に記載の組成物を含む医薬的に許容可能な製剤。
  275. 請求項２５５〜請求項２７４のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子によって引き起こされる対象の疾患を治療する方法。
  276. 請求項２５５〜請求項１５７のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子によって引き起こされる対象の眼疾患を治療する又は関連する危険因子を緩和する方法。
  277. 請求項２５５、請求項２５６、又は請求項２５８〜請求項２７６のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子によって引き起こされる対象の神経変性疾患を治療する又は関連する危険因子を緩和する方法。
  278. 請求項２５５〜請求項２７７のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、変異若しくは欠陥を有するシトクロムＰ４５０遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードするシトクロムＰ４５０遺伝子によって引き起こされる対象の疾患を治療する又は関連する危険因子を緩和する方法。
  279. 破壊、修正、若しくは置換される、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、表４に示す少なくとも１つの遺伝子の変異若しくは欠陥があるバージョン、又は表４に示す少なくとも１つの遺伝子の不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードするバージョンである、請求項２７８に記載の方法。
  280. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、線維芽細胞、血液、ＲＰＥ、光受容体、網膜、角膜、脈絡膜、眼、視神経、ニューロン、若しくは幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の種類の細胞に存在する、請求項２７８に記載の方法。
  281. 前記組成物は、線維芽細胞、血液、ＲＰＥ、光受容体、網膜、角膜、脈絡膜、眼、視神経、ニューロン、若しくは幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の種類の細胞に送達される、請求項２７８又は請求項２７９に記載の方法。
  282. 送達は、エレクトロポレーションにより、若しくは脂質媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入、若しくはインジェクション、又はそれらの組み合わせにより行われる、請求項２８１に記載の方法。
  283. 前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、及び／又は前記ドナー核酸配列を含む１又は複数の成分は、リボ核タンパク質又はタンパク質−ＲＮＡ複合体、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、ウイロソーム、核酸複合体、及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される送達システムを介して前記対象又は前記細胞に投与される、請求項２７８〜請求項２８２のいずれか一項に記載の方法。
  284. 前記治療はインビボで対象に対して行われる、請求項２７８〜請求項２８３のいずれか一項に記載の方法。
  285. 前記治療は、インビトロで、線維芽細胞、血液、ＲＰＥ、光受容体、網膜、角膜、脈絡膜、眼、視神経、ニューロン、若しくは幹細胞、又は幹細胞に由来する任意の種類の細胞に対して行われる、請求項２７８〜請求項２８３のいずれか一項に記載の方法。
  286. 前記治療した細胞は、インビボで対象に移植される、又は前記治療した細胞が幹細胞である場合、該幹細胞は移植のための所望の種類の細胞に分化させられ、その後分化した細胞はインビボで対象に移植される、請求項２８５に記載の方法。
  287. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、置換される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  288. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子において、１又は複数の変異が修正又は置換される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  289. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、破壊される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  290. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子において、１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１０００、又は１００１〜１００００塩基対のヌクレオチド又は変異が破壊、修正、又は置換される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  291. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の領域が、破壊、修正、又は置換される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  292. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の約１０、８、６、４、２、又は１ｋｂ未満である領域が、破壊、修正、又は置換される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  293. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失によって破壊、修正、又は置換される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  294. 前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、片方又は両方のアレルにおいて破壊、修正、又は置換される、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  295. ２以上の異なるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、２以上の異なるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び／又は２以上の異なるドナー核酸配列を使用して、前記変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子において、１又は複数の変異若しくは欠陥を破壊、修正、又は置換する、請求項２７８〜請求項２８０のいずれか一項に記載の方法。
  296. 前記対象は、哺乳動物である、請求項２７８に記載の方法。
  297. 前記対象は、ヒトである、請求項２７８に記載の方法。
  298. 前記方法は、眼の発達又は機能を改善するか、眼、網膜、又は角膜の変性を予防する、請求項２７８に記載の方法。
  299. 前記方法は、神経学的発達又は機能を改善するか、神経変性を予防する、請求項２７８に記載の方法。
  300. Ｐ４５０酵素の発現又は機能を改善する、請求項２７８に記載の方法。
  301. さらに（ｃ）変異又は変化された標的遺伝子又はその一部の生成のための、変異又は変化を有する表４に示す少なくとも１つの標的遺伝子の全部又は一部を含むドナー核酸配列を含む、請求項２５５、請求項２５７、請求項２５８、又は請求項２５９のいずれか一項に記載の組成物。
  302. 変異又は欠陥を有する表４に示す遺伝子を有する細胞を含む組成物。
  303. 本願の請求項のいずれか一項に記載の組成物を含む、変異又は欠陥を有するＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＭＹＯ７Ａ、ＤＦＮＢ３１、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＣＬＲＮ１、ＡＣＯ２、ＡＦＧ３Ｌ２、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、Ｃ１２ｏｒｆ６５、ＣＩＳＤ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＦ２、ＬＴＢＰ２、ＭＴＰＡＰ、ＭＹＯＣ、ＮＤＵＦＳ１、ＮＲ２Ｆ１、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＸ６、ＰＤＧＦ、ＰＩＴＸ２、ＰＯＬＧ、ＳＰＧ７、ＴＥＫ、ＴＸＮＲＤ２、ＷＦＳ１、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ−１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＧＲ、ＭＥＲＴＫ、ＭＴ−ＮＤ４、ＦＡＭ４７Ｅ、ＧＢＡ、ＧＣＨ１、ＨＴＲＡ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＳＮＣＡ、ＳＹＮＪ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、又はＣＹＰ４６Ａの遺伝子を有する細胞を含む組成物。
  304. 前記ベクターは、ＡＡＶベクターである、請求項３０３に記載の組成物。
  305. 前記プロトスペーサーエレメント配列は、配列番号４８〜５２からなる群から選択されるか、配列番号４８〜５２の一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を標的とするために、ＮＧＧをプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とするＣａｓタンパク質と共に使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  306. 前記ドナー核酸配列は、配列番号５６及び５７からなる群から選択されるか、配列番号５６及び５７のいずれか又はその相補的な配列との間で少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のｃ．８０２−８＿８１０ｄｅｌ１７ｉｎｓＧＣ変異を修正、破壊、又は置換するために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  307. 対象に（ｉ）遺伝子編集療法組成物又は遺伝子導入療法組成物を含む、前記対象における既存の疾患細胞を標的とする組成物と、（ｉｉ）置換細胞を含む細胞組成物と、の組み合わせを投与すること、を含む、変異若しくは欠陥を有する遺伝子、又は不完全若しくは部分的な機能若しくは活性を有するタンパク質をコードする遺伝子によって引き起こされる対象の疾患を治療する方法。
  308. 前記対象は、ヒトである、請求項３０７に記載の方法。
  309. 前記疾患は、前記対象の細胞に変性を引き起す、請求項３０７に記載の方法。
  310. 前記変性は、ＲＰＥ細胞、ＲＰＣ、ＣＥＣ、ＣＥ細胞、網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、視神経細胞、眼細胞、ニューロン、神経細胞、脳細胞、肝細胞、肺細胞、及び心臓細胞で起こる、請求項３０７及び請求項３０８に記載の方法。
  311. 前記疾患は、表４に示す少なくとも１つの遺伝子によって引き起こされる、請求項３０７に記載の方法。
  312. 前記遺伝子編集療法組成物は、遺伝子編集療法に関するいずれか一項の請求項に記載の組成物である、請求項３０７に記載の方法。
  313. 前記遺伝子導入療法組成物は、遺伝子導入療法に関するいずれか一項の請求項に記載の組成物である、請求項３０７に記載の方法。
  314. 前記細胞組成物は、細胞療法に関する請求項又は自家細胞療法に関する請求項のいずれか一項に記載の組成物を含む、請求項３０７に記載の方法。
  315. 前記細胞組成物は、治療される対象に対して同種（アロジェニック）である、請求項３０７に記載の方法。
  316. 前記細胞組成物は、治療される前記対象にとって自家性である、請求項３０７に記載の方法。
  317. 前記細胞組成物は、前記対象への投与前に遺伝的に修復される、請求項３０７又は請求項３１４に記載の方法。
  318. 前記遺伝子修復は、遺伝子編集療法によるものである、請求項３０７又は請求項３１７に記載の方法。
  319. 前記遺伝子編集療法は、遺伝子編集療法に関する請求項のいずれか一項に記載されるものによるものである、請求項３０７又は請求項３１８に記載の方法。
  320. 前記遺伝子編集療法は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰに関する請求項のいずれか一項に記載されるものによるものである、請求項３０７、請求項３１８、又は請求項３１９に記載の方法。
  321. 前記遺伝子修復は、遺伝子導入療法によるものである、請求項３０７又は請求項３１７に記載の方法。
  322. 前記遺伝子導入療法は、遺伝子導入療法又は遺伝子治療に関する請求項のいずれか一項に記載されるものによるものである、請求項３０７又は請求項３２１に記載の方法。
  323. 前記（ｉ）及び（ｉｉ）の組成物は、１回の投与で両方が投与される、請求項３０７に記載の方法。
  324. 前記（ｉ）及び（ｉｉ）の組成物は、別々に投与又は別々の投与回で投与される、請求項３０７に記載の方法。
  325. 前記置換細胞は、幹細胞に由来する、請求項３０７に記載の方法。
  326. 前記置換細胞は、ｉＰＳ細胞に由来する、請求項３０７及び請求項３２５に記載の方法。
  327. 前記ｉＰＳ細胞は、治療される対象と同じ対象に由来する、請求項３０７又は請求項３２６に記載の方法。
  328. 前記置換細胞は、ｉＰＳ−ＲＰＥ、ｉＰＳ−ＰＲＣ、ｉＰＳ−ＣＥＣ、又はｉＰＳ−ＣＥ細胞である、請求項３０７又は請求項３２６に記載の方法。
  329. 前記置換細胞は、ｉＰＳ−眼細胞である、請求項３０７又は請求項３２６に記載の方法。
  330. 前記置換細胞は、ｉＰＳ−ニューロン細胞である、請求項３０７又は請求項３２６に記載の方法。
  331. 前記対象における眼の発達又は機能を改善するか、眼、網膜、又は角膜の変性を予防する、請求項３０７に記載の方法。
  332. 前記対象における神経学的発達又は機能を改善するか、神経変性を予防する、請求項３０７に記載の方法。
  333. 前記対象におけるＰ４５０酵素の発現又は機能を改善する、請求項３０７に記載の方法。
  334. 前記対象は、眼、網膜、角膜、脈絡膜、又は神経の変性を患っている、請求項３０７〜請求項３３２のいずれか一項に記載の方法。
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